CN102392033A - β-1,4-内切木聚糖酶(Aor Xyn11A)基因的克隆及重组酶的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的新型木聚糖酶基因序列的克隆方法，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。生物信息学分析表明该木聚糖酶属于糖苷水解酶第11家族，命名为Aor Xyn11A，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，相应的基因命名为Aor xyn11A。本发明还公开了Aor Xyn11A工程菌的构建以及重组Aor Xyn11A的高效表达和纯化的方法，制备的重组Aor Xyn11A的最适作用温度和pH分别为50℃和5.5，在pH 4.5-7.5、40℃以下稳定，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一种糖苷水解酶11家族的木聚糖酶基因序列的克隆，木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
纤维素、半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要成分，而木聚糖是植物半纤维素的重要组成部分，它是继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是降解木聚糖的一组酶的总称，由于木聚糖的来源不同，其结构的复杂性也不同，它的完全降解需要多种水解酶的参与共同作用完成，如内切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、葡糖糖醛酸酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖酶等。其中最重要的是β-1，4-内切木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8)，它能从木聚糖主链的内部随机切割木糖苷键，将其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖，是半纤维素类资源转化和利用不可缺少的生物催化剂。大多数微生物木聚糖酶都是单亚基蛋白，不同微生物来源的木聚糖酶等电点各不相同，大多数β-1，4-内切型木聚糖酶的最适pH值为4.0～7.0，pH稳定范围为3.0～10.0；最适反应温度在40℃～75℃之间。通常真菌木聚糖酶比细菌木聚糖酶的温度稳定性差，而且真菌木聚糖酶的最适pH值更偏酸性。
木聚糖酶在各方面的应用很广泛，比如在饲料工业、造纸工业、生物能源、食品与医药工业等方面。现在国内外对木聚糖酶的研究主要集中在两个方面，一方面是研究如何提高木聚糖酶的表达水平，以期在工业生产中推广应用。另一方面是对木聚糖酶进行基因改造，改善其酶学性质，使之更适合工业应用要求。但就国内外相关文献或专利报道来看，微生物木聚糖酶发酵酶活性普遍不高，导致了生产成本很高，从而阻碍了该酶在众多领域中的广泛应用。为了提高木聚糖酶的发酵产率和酶活性，早期的研究工作主要集中在产酶菌种的筛选、诱变、产酶诱导，酶的分离纯化及性质，酶水解底物方式及应用等方面。进入90年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究工作逐步转向酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关木聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但有关来源于米曲霉木聚糖酶基因的克隆和表达等的研究未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株新型木聚糖酶基因序列克隆，木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法。生物信息学分析表明，来源于A.oryzae CICC 40186菌株的一种新型壳聚糖酶属于糖苷水解酶第11家 族，命名为Aor Xyn11A，其相应的基因命名为Aorxyn11A。Aor Xyn11A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。
本发明的技术方案：一种源自A.oryzae CICC 40186菌株新型Aor Xyn11A基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1。
A.oryzae菌株从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买。
所述的由完整mRNA序列推导的Aor Xyn11A氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
所述的重组Aor Xyn11A的活性测定方法：
于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4.6、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液配制的质量浓度为0.5％的桦木木聚糖溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应20min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个壳聚糖酶活性单位(U)。
所述的Aorxyn11A完整mRNA序列的克隆和表达方法：
(1)Aor xyn11A 3′端mRNA序列的克隆：首先对Aspergillus terreus(GenBank XP_001216082.1)、Aspergillus clavatus(GenBank XP_001273773.1)、Aspergillus fumigatus(GenBank XP_748354.1)和Aspergillus niger(GenBank AAM08362.1)GH11的木聚糖酶序列进行同源比对，找出两段7个氨基酸的保守序列；再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物XynF1和XynF2。
XynF1：5’-TACTA(C/T)TCCTTCTGGAC(C/T)GA-3’
XynF2：5’-GGCAACTTTGTCGG(C/T)GG(G/A)A-3’
提取A.oryzae CICC 40186的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增。将两轮PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-xyn11A3′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aor xyn11A 3′端mRNA序列。
(2)Aor xyn11A 5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aor xyn11A 3′端mRNA序列，设计两条反向引物XynR1和XynR2。
XynR1：TCCGGAGTAGGTGATTGCTCT
XynR2：CCATCCTTTCCCGCCGACGA
按照TaKaRa 5′-Full RACE Kit说明书进行5′-RACE。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn11A5′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aor xyn11A 5′端mRNA序列。
(3)Aor xyn11A的生物信息学分析：将Aor xyn11A的5′和3′端mRNA序列进行拼接，得到自转录起始位点至poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上对开放阅读框架(Open Reading Frame)进行分析，进而推导出Aor Xyn11A的氨基酸序列；进行信号肽预测。
(4)含编码Aor Xyn11A成熟肽基因的表达质粒的构建：基于上述得到的Aor xyn11A完整mRNA序列以及预测的信号肽序列，设计一条正向引物XynF3和一条反向引物XynR3。
XynF3：5′-GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC-3′，含EcoR I酶切位点
XynR3：5′-GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3′，含Not I酶切位点
按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)使用说明书进行RT-PCR。以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和XynF3为引物进行第一轮PCR；以XynF3和XynR3为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn11A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
将测序结果正确的pUCm-T-xynA与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-xyn11A(图2)，并对重组质粒进行序列测定。
(8)GS115/xyn11A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K-xyn11A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn11A；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定木聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，得到电泳纯的重组木聚糖酶。
本发明的有益效果：本发明提供了一种A.oryzae CICC 40186菌株新型木聚糖酶基因序列克隆，木聚糖酶工程菌的构建以及重组木聚糖酶的高效表达和纯化的方法，并对序列进行生物信息学分析。生物信息学分析表明来源于A.oryzae CICC 40186的一种新型木聚糖酶属于糖苷水解酶的第11家族，命名为Aor Xyn11A，其相应的基因命名为Aorxyn11A。Aor Xyn11A 具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。
附图说明
图1：重组质粒pPIC9K-xyn11A的构建示意图
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1 Aor xyn11A 3′端mRNA序列的克隆
以Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和XynF1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃90s)，72℃10min；以M13 Primer M4和XynF2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃90s)，72℃10min。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn11A3′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
实施例2 Aor xyn11A 5′端mRNA序列的克隆
以5′-Full RACE Kit的Outer Primer和XynR1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；以Inner Primer和XynR2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn11A 5′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
实施例3含编码Aor Xyn11A成熟肽基因的表达质粒的构建
以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以XynF3和M13 Primer M4为引物进行第一轮PCR，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃60s)，72℃10min；以XynF3和XynR3为引物进行第二轮PCR，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃45s)，72℃10min。将第二轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-xyn11A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-xyn11A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pPIC9K-xyn11A，并对重组质粒进行序列测定。
实施例4 GS115/xyn11A的构建、表达、产物纯化及活性测定
用Sal I对pPIC9K-xyn11A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn11A。该基因工程菌用1.0％甲醇诱导表达96h，采用DNS法测得发酵液中重组壳聚糖酶活性达155U/mL。发酵液经离心后的上清液为重组Aor Xyn11A粗酶液，该粗酶液经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组Aor Xyn11A的分子量为23kDa。该重组Aor Xyn11A的最适作用温度50℃，最适作用pH 5.5，该酶在pH 4.5-7.5、40℃以下稳定。
Claims (4)
1.一种来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株糖苷水解酶第11家族(GH11)的新型木聚糖酶基因(Aor xyn11A)，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.由权利要求1所述的壳聚糖酶基因(Aor xyn11A)编码的新型壳聚糖酶(Aor Xyn11A)，其完整的氨基酸序列对应于序列表中的为SEQ ID NO：2。
3.Aor xyn11A基因序列的获取方法：
(1)Aor xyn11A 3′端mRNA序列的克隆：首先对Aspergillus terreus、Aspergillus clavatus、Aspergillus fumigatus和Aspergillus niger的木聚糖酶序列进行同源比对，找出两段7个氨基酸的保守序列，再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物XynF1和XynF2；
XynF1：5’-TACTA(C/T)TCCTTCTGGAC(C/T)GA-3’
XynF2：5’-GGCAACTTTGTCGG(C/T)GG(G/A)A-3’
以A.oryzae CICC 40186总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和XynF1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃90s)，72℃10min；以M13 Primer M4和XynF1为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃90s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Aor xyn11A 3′端mRNA序列；
(2)Aor xyn11A 5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aor xyn11A 3′端mRNA序列，设计两条反向引物XynR1和XynR2；
XynR1：TCCGGAGTAGGTGATTGCTCT
XynR2：CCATCCTTTCCCGCCGACGA
以反转录合成的cDNA第一条链为模板、Outer Primer和XynR1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；以InnerPrimer和XynR2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；目的条带经克隆、测序，得到Aor xyn11A 5′端mRNA序列；
4.Aor Xyn11A工程菌的构建和表达方法：
(1)含编码Aor Xyn11A成熟肽基因的表达质粒的构建：以M13 Primer M4和XynF3为引物进行第一轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃60s；72℃10min)；以XynF3和XynR3为引物第二轮PCR(94℃2min；30个循环，94℃30s，53℃30s，72℃45s；72℃10min)；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序正确的pUCm-T-xyn11A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-xyn11A，并对重组质粒进行测序鉴定；
(2)GS115/xyn11A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K-xyn11A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/xyn11A；该工程菌用1.0％甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组壳聚糖酶活性达155U/mL。发酵液经离心后的上清液为重组Aor Xyn11A粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组壳聚糖酶分子量为23kDa；该重组壳聚糖酶最适作用温度50℃，最适作用pH 5.5，该酶在pH 4.5～7.5、40℃以下稳定。
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|---|---|---|---|---|
| CN102787080A (zh) * | 2012-08-06 | 2012-11-21 | 广西大学 | 一株曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用 |
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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