CN108611356A - 一种内切β-1,4-甘露聚糖酶编码基因及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的内切β‑1,4‑甘露聚糖酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该内切β‑1,4‑甘露聚糖酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的内切β‑1,4‑甘露聚糖酶，能高效降解魔芋多糖(又称魔芋葡甘聚糖)。本发明提供的内切β‑1,4‑甘露聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

Description

一种内切β-1,4-甘露聚糖酶编码基因及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种内切β-1,4-甘露聚糖酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该内切β-1,4-甘露聚糖酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发明提供的内切β-1,4-甘露聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及寡糖制备等领域。

背景技术

蒟蒻(Amorphophalluskonjac)，俗称魔芋，天南星科魔芋属多年生草本植物。魔芋中主要成分为魔芋多糖(又称魔芋葡甘露聚糖)，由葡萄糖与甘露糖组成。魔芋葡甘露聚糖通过β-1,4吡喃糖苷键将β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按1∶1.6或1∶1.69的摩尔比连接而成，每19个糖残基上有一个乙酰基团存在，其特殊的结构使其虽具有多种生物学功能。但是其在水中为胶体，粘度大、溶解度小，在后续加工利用上带来不便；其在各种食品中添加量小，影响了其生物活性。目前我国魔芋产业多停留在魔芋初级食品开发层面，亟需高值化加工技术，对魔芋主要成分魔芋葡甘露聚糖的深加工是魔芋下游产业的主要方向。

将魔芋多糖降解成魔芋寡糖，即魔芋葡甘露寡糖(Konjacoligo-glucomannan，KOGM)，其分子量小，在水中可溶，易于吸收，将会克服魔芋多糖在加工利用中问题。与魔芋多糖相比，魔芋寡糖具有优良的性能，具有改善食品品质，保鲜食品，改善人体肠道菌群，增强免疫力，调节血糖、血脂以及肠道解毒等生物活性。生理功能试验表明，葡甘露低聚糖除了具有低热量、稳定、安全无毒等良好的理化特性外，还具有促进以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖,改善肠道内菌群结构；减慢肠道粘膜分泌的β-糖苷酶的扩散速度，不升高血糖，提高机体抗氧化能力等功能。

目前尚无大量工业生产魔芋葡甘低聚糖的报道，其生产尚停留在实验室研究期间，获得葡甘低聚糖的方法主要有以下几种：(1)从天然原料(魔芋)中提取，但提取工艺复杂，且产率极低；(2)通过人工化学合成的方法获得，但此法步骤繁琐，成本太高；(3)利用酸水解魔芋葡甘露聚糖的方法获得，但这样生产的低聚糖性质不稳定，副产品多，不易得到特定的低聚糖；(4)利用物理方法降解得到，但此方法要利用现代化的生产设备，实验设备要求太高，不利于大量生产；(5)利用酶解葡甘露聚糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解葡甘露聚糖的方法生产葡甘露低聚糖是一条相对简单，容易研究的生产方法。

β-1,4-D-甘露聚糖水解酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78)是一类从甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主链内部随机切割β-1,4-D-甘露聚糖糖苷键的水解酶，简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，是降解葡甘露聚糖制备葡甘露寡糖的有效工具。国内外对甘露聚糖酶的研究多集中于微生物，其中细菌特别是革兰氏阳性菌包括芽孢杆菌(Bacillus)和梭菌(Clostridium)、真菌中曲霉(Aspergillus)和里氏木霉(Trichoderma reesei)、放线菌中链霉菌(Streptomyces)研究较多。革兰氏阴性菌如弧菌(Cellvibrio)也有报道。此外，类芽孢杆菌属的菌株具有芽孢杆菌属的某些共性，能产生耐热抗逆的芽孢，有利于酶制剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。目前国内外已有很多研究对该菌属多种菌株进行过生理活性及抗菌活性的研究，对甘露聚糖酶基因的报道却非常少，且已报道的内切β-1,4-甘露聚糖酶对魔芋多糖的降解活性均较弱，不适于大规模应用。因此，寻找一种能够高效、稳定降解魔芋多糖的甘露聚糖酶是降低葡甘露寡糖生产成本的有利途径。而由于β-1,4-甘露聚糖酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提高β-1,4-甘露聚糖酶产量的一种有效措施。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)的内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman在魔芋多糖降解中的应用。

本发明所提供的内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman，来源于土壤中分离纯化的多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa，从中扩增出的内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman编码基因(命名为ppman)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：

1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-631位氨基酸残基序列，其中1-623位为具有内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman活性的氨基酸序列，624-631位为酶切位点及His-Tag的氨基酸序列；

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-631或1-623位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性不变的氨基酸序列。

本发明的内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶Ppman的方法，是将内切β-1,4-甘露聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切β-1,4-甘露聚糖酶。

上述内切β-1,4-甘露聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性的核苷酸序列；

所述的重组表达内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。

用于重组表达内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichiacoli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明的内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的基因序列是通过PCR技术从多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)中克隆得到。该基因编码区长1896bp，属于糖苷水解酶GH(glycoside hydrolase)26家族。

本发明提供的内切β-1,4-甘露聚糖酶在降解魔芋多糖中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：

1)在断裂魔芋多糖的糖苷键，获得单糖或葡甘露寡糖中的应用；

2)在断裂甘露聚糖的糖苷键，获得单糖或甘露寡糖中的应用；

3)与其他葡甘露聚糖酶混合后，在协同断裂葡甘露聚糖糖苷键方面应用。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman，可以高效降解魔芋多糖，以魔芋多糖为底物时，在25℃、pH8.0的条件下具有最佳酶活性，比活为65U/mg。解决了现有β-1,4-葡寡糖生产成本高的难题，具有重要的实用价值，可应用于大规模的工业化生产。

本发明的内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及葡甘露寡糖的制备等领域。

附图说明

图1：内切β-1,4-甘露聚糖酶基因ppman琼脂糖凝胶电泳检测。

图2：内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman表达及纯化的SDS-PAGE图。各泳道加入的样品分别是：泳道1-Ppman未诱导菌体总沉淀，泳道2-Ppman诱导后菌体总沉淀，泳道3-Ppman破菌上清，泳道4-Ppman上柱三次流穿液，泳道5-40mM咪唑洗脱流穿液，泳道6-80mM咪唑洗脱流穿液，泳道7-250mM咪唑洗脱流穿液，泳道8-蛋白分子量标准。

图3：pH值对内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的影响曲线。

图4：温度对内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的影响曲线。

图5：内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman对魔芋多糖降解产物的MALDI-TOF-MS图谱。

具体实施方式

序列表

SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

长度：1896核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.1

ATGGAATCAACTAACTTGGTCACCGATGTTGAAGGGCGAACGTTGATGAATGCAAGTCAAGATTCATCCACTAACGACAATTCCTCTTCTATCGTCGTCAGCTCCAAAGATGCAATTCTTCAAGGTTACGGTGTAGAAAAACGGGATACACCCTATACCGGCGATACGCTTTATAAAGGCGATGGCTATGTATCCTTCTTTTATGACTACGACCCAAATTCCGGCAAGTCCGACGGGACGGCCACGTTTAAAGTGAACGTGCCCACAGCAGGTCTTTATAGACTGAGCCTCGGCTACTACATTCCGGCGGGCACTGGCTCCAAGGATACCAGCATCGAGGTCAATGGCACAATGTCTGAGAACATAACGCTGGCTGCTCCTCCGAAAGGTGCGGCAGTGAACGAGAAAATATTAACCAAGATCATGCTGAATGCCGGCACAAACGAGCTTACTTTTGCAAGAGGCTGGGGATATTACGGGATCGAATACGTGAAGGTTGAATTCGCCAATCTGCCTGCTGCAATTAGCAAAATGGAAGCCGAAGACGGAGTCATTACTGGTGAGGTCAAGATCGAAGCTGCTGATACAGGCTATTCGGGTAGCGGTTACGCCGCCTTCAAAAGCACAGGTTCGTTAACCTTTGCCTATAATGCACCTTCAAGCGGGCTTTACAATCTTGCAATCGGTTACAGTAACCCCAATGGAGACAAAAAGACCCAATTGGTGGTCAACGGCCAGACCAGCGAAATATCACTGCCGACAACAGCAAGCTACACAGAGGTATCCGGCGGTAAACTGATGCTGAATTCGGGAAACAATATCTTACAGTTCAATGTCGACTCGGACCAATATCATATCGACTACGTCAAGCTATCAGCAGTGTCCCCCCCGAAACTGCATCAAATTGAGAAAAAGCCAGTAAACCCGAATGCGACTGCGGAAACCACGGCACTCATGGGTTATCTCGTGGATAGTTACGGCAGCCACATTCTTTCCGGTCAGCACACTTTGGAGGATGCACAGTGGATTAAAGACCAAACTGGAAAGTATCCTGCCATGTTATCAATGGACATGATGGATTATTCCCCCTCTCGCATCGAGCATGGCGCCACCTCAACTGAGGTGGAAAAGGCAATTCAATGGGCCCAAGAAGGTGGACTTGTCACATTCGCATGGCACTGGAATGCTCCTAAGGGACTGTATGATATTCCCGGTAAAGAATGGTGGCGCGGGTTTTACACGGACGCTACTACATTCGACGTTCAATATGCACTTAGTCATCCCGAGTCGGAAGAGTATCAGCTTATCCTAAGGGATATCGATGCCATTGCTGCTCAGTTGAAACGCCTCCAAGACGCTCACGTTCCGGTGCTGTGGAGACCGCTGCACGAGGCGGAGGGCAAATGGTTCTGGTGGGGCGCCCAAGGTCCAGACTCCGCCAAGCAGCTGTACCGTATCATGTACGACCGCCTAACACACTACCATCACCTGAACAACCTGATCTGGGTATGGAACTCCGAGAGTCCCGACTGGTATCCAGAGGATGATGTCGTCGATATTGTAAGTGTGGATATCTACAACCAGGCGGCTAATTATAGCCCAAGTATTGGCAAGTACGACAGTTTGGTAAATCTCGTGCAGGGTAAGAAGCTGGTTGGTCTGTCTGAAAACGGCCCGATTAGCGATCCCGAATTGCTTCAAACATATTCAGCGCATTGGCTCTTTTTCACTACGTGGACGGGCGACTTCATCCGCAATGGAAAATATAACTCCCTGGATCATCTCATAAAAGTGTTCAACAGCGATTACGTGATCACGAGGGATGAGCTTCCTCAAGACCTGCTTACTTCGTCCAAAAATGAAGCGGAGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

长度：631氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID NO.2

MESTNLVTDVEGRTLMNASQDSSTNDNSSSIVVSSKDAILQGYGVEKRDTPYTGDTLYKGDGYVSFFYDYDPNSGKSDGTATFKVNVPTAGLYRLSLGYYIPAGTGSKDTSIEVNGTMSENITLAAPPKGAAVNEKILTKIMLNAGTNELTFARGWGYYGIEYVKVEFANLPAAISKMEAEDGVITGEVKIEAADTGYSGSGYAAFKSTGSLTFAYNAPSSGLYNLAIGYSNPNGDKKTQLVVNGQTSEISLPTTASYTEVSGGKLMLNSGNNILQFNVDSDQYHIDYVKLSAVSPPKLHQIEKKPVNPNATAETTALMGYLVDSYGSHILSGQHTLEDAQWIKDQTGKYPAMLSMDMMDYSPSRIEHGATSTEVEKAIQWAQEGGLVTFAWHWNAPKGLYDIPGKEWWRGFYTDATTFDVQYALSHPESEEYQLILRDIDAIAAQLKRLQDAHVPVLWRPLHEAEGKWFWWGAQGPDSAKQLYRIMYDRLTHYHHLNNLIWVWNSESPDWYPEDDVVDIVSVDIYNQAANYSPSIGKYDSLVNLVQGKKLVGLSENGPISDPELLQTYSAHWLFFTTWTGDFIRNGKYNSLDHLIKVFNSDYVITRDELPQDLLTSSKNEAELEHHHHHH

实施例1内切β-1,4-甘露聚糖酶全长基因克隆

参照基因组DNA纯化试剂盒(Thermo，LOT 00105781)操作步骤提取多粘类芽孢杆菌的基因组DNA。对The National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中内切β-1,4-甘露聚糖酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物ppman-F:5’-CGGACGCATATGGAATCARCTMMCTTGGTCAC-3’；ppman-R:5’-GACGAGCTCGAGCTCCGCTTYATTYTTGGABRAAGTA-3’，以提取的多粘类芽孢杆菌的基因组DNA为模板，扩增编码内切β-1,4-甘露聚糖酶成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR反应条件为：94℃2min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pET21a上后测序。

实施例2内切β-1,4-甘露聚糖酶基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。

获得的内切β-1,4-甘露聚糖酶基因(命名为ppman)编码区长1896bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。ppman编码631个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示，蛋白质理论分子量为70.11kDa，预测等电点为4.97。ppman编码的氨基酸包含两个碳水化合物结合模块CBM(Carbohydrate Binding Module)35和一个GH26家族结构域，其结构域特征与GH26家族成员更为相似，由此表明ppman为GH26家族的一名成员。

实施例3ppman基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入NdeI和XhoI酶切位点。将PCR清洁产物ppman和表达载体pET21a分别用NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经清洁回收后，用T₄DNA连接酶连接(连接体系：(5μLT₄DNA Ligase 0.5μL，10×T₄DNA LigaseBuffer 0.5μL，pET21a 2μL，PCR产物2μL)，连接条件：室温过夜连接。)。取5μL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶NdeI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序。测序结果表明，在pET21a的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 1所示的ppman基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质粒命名为pET21a-ppman。

将pET21a-ppman转化E.coli BL21(DE3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的活性测定及酶学性质分析

(1)内切β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的活力测定

以450μL 0.5％(w/v)的魔芋多糖为底物，加入50μL重组酶Ppman，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

(2)pH对重组酶Ppman的影响

在25℃的条件下，分别以450μL 0.5％(w/v)，pH3.0-10.0(pH3.0Gly-HCl，pH4.0-5.0HAc-NaAc，pH6.0-7.0Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.0Tris-HCl，pH9.0-10.0Gly-NaOH)的魔芋多糖为底物，加入50μL重组酶Ppman，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以灭活的酶作为对照，以活性最高的值为100％，测定在各个反应pH下酶的相对活性。根据酶在不同pH下的相对活性绘制曲线，确定酶的最适反应pH。结果如图3所示，Ppman的最适反应pH为8.0，随着pH的升高或降低，Ppman的活性均降低。

(3)温度对重组酶Ppman的影响

在pH8.0的条件下，以450μL0.5％(w/v)魔芋多糖为底物，分别在25-85℃下加入50μL重组酶Ppman，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以灭活的酶为对照，以反应最高酶活力为100％计算相对酶活，根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线。结果如图4所示，Ppman的最适反应温度为25℃。

在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得Ppman的比活为65U/mg。(4)重组酶Ppman的底物特异性

选取魔芋葡甘露聚糖、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、田菁胶、刺云豆胶、葫芦巴胶、黄原胶、卡拉胶8种底物考察重组酶Ppman的底物特异性。将50μL重组酶Ppman分别加入到450μL0.5％(w/v)的不同底物中，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组酶Ppman对各底物的降解活性，以降解魔芋葡甘露聚糖的比活力为100％。结果如表1所示，重组酶Ppman对魔芋葡甘露聚糖表现出最高的活性，对几种半乳甘露聚糖的底物也有活性，但对其它几种底物未检测到活性。

表1 β-1,4-甘露聚糖酶Ppman的底物特异性

实施例5重组酶Ppman降解魔芋葡甘露聚糖产物分析

将0.5％(w/v)魔芋多糖与重组酶Ppman按9:1(体积比)的比例混合后，在25℃条件下反应2h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析。如图5所示，Ppman对魔芋多糖的降解可以生成多种聚合度的低聚糖，DP＝2-12。因此，Ppman可用于葡甘露低聚糖的制备以及与魔芋多糖降解相关方面的研究，包括农业、食品、饲料添加、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种内切β-1,4-甘露聚糖酶编码基因及其制备与应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1896

<212> DNA

<213> 多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1896)

<400> 1

atggaatcaa ctaacttggt caccgatgtt gaagggcgaa cgttgatgaa tgcaagtcaa 60

gattcatcca ctaacgacaa ttcctcttct atcgtcgtca gctccaaaga tgcaattctt 120

caaggttacg gtgtagaaaa acgggataca ccctataccg gcgatacgct ttataaaggc 180

gatggctatg tatccttctt ttatgactac gacccaaatt ccggcaagtc cgacgggacg 240

gccacgttta aagtgaacgt gcccacagca ggtctttata gactgagcct cggctactac 300

attccggcgg gcactggctc caaggatacc agcatcgagg tcaatggcac aatgtctgag 360

aacataacgc tggctgctcc tccgaaaggt gcggcagtga acgagaaaat attaaccaag 420

atcatgctga atgccggcac aaacgagctt acttttgcaa gaggctgggg atattacggg 480

atcgaatacg tgaaggttga attcgccaat ctgcctgctg caattagcaa aatggaagcc 540

gaagacggag tcattactgg tgaggtcaag atcgaagctg ctgatacagg ctattcgggt 600

agcggttacg ccgccttcaa aagcacaggt tcgttaacct ttgcctataa tgcaccttca 660

agcgggcttt acaatcttgc aatcggttac agtaacccca atggagacaa aaagacccaa 720

ttggtggtca acggccagac cagcgaaata tcactgccga caacagcaag ctacacagag 780

gtatccggcg gtaaactgat gctgaattcg ggaaacaata tcttacagtt caatgtcgac 840

tcggaccaat atcatatcga ctacgtcaag ctatcagcag tgtccccccc gaaactgcat 900

caaattgaga aaaagccagt aaacccgaat gcgactgcgg aaaccacggc actcatgggt 960

tatctcgtgg atagttacgg cagccacatt ctttccggtc agcacacttt ggaggatgca 1020

cagtggatta aagaccaaac tggaaagtat cctgccatgt tatcaatgga catgatggat 1080

tattccccct ctcgcatcga gcatggcgcc acctcaactg aggtggaaaa ggcaattcaa 1140

tgggcccaag aaggtggact tgtcacattc gcatggcact ggaatgctcc taagggactg 1200

tatgatattc ccggtaaaga atggtggcgc gggttttaca cggacgctac tacattcgac 1260

gttcaatatg cacttagtca tcccgagtcg gaagagtatc agcttatcct aagggatatc 1320

gatgccattg ctgctcagtt gaaacgcctc caagacgctc acgttccggt gctgtggaga 1380

ccgctgcacg aggcggaggg caaatggttc tggtggggcg cccaaggtcc agactccgcc 1440

aagcagctgt accgtatcat gtacgaccgc ctaacacact accatcacct gaacaacctg 1500

atctgggtat ggaactccga gagtcccgac tggtatccag aggatgatgt cgtcgatatt 1560

gtaagtgtgg atatctacaa ccaggcggct aattatagcc caagtattgg caagtacgac 1620

agtttggtaa atctcgtgca gggtaagaag ctggttggtc tgtctgaaaa cggcccgatt 1680

agcgatcccg aattgcttca aacatattca gcgcattggc tctttttcac tacgtggacg 1740

ggcgacttca tccgcaatgg aaaatataac tccctggatc atctcataaa agtgttcaac 1800

agcgattacg tgatcacgag ggatgagctt cctcaagacc tgcttacttc gtccaaaaat 1860

gaagcggagc tcgagcacca ccaccaccac cactga 1896

<210> 2

<211> 631

<212> PRT

<213> 多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(631)

<400> 2

Met Glu Ser Thr Asn Leu Val Thr Asp Val Glu Gly Arg Thr Leu Met

1 5 10 15

Asn Ala Ser Gln Asp Ser Ser Thr Asn Asp Asn Ser Ser Ser Ile Val

20 25 30

Val Ser Ser Lys Asp Ala Ile Leu Gln Gly Tyr Gly Val Glu Lys Arg

35 40 45

Asp Thr Pro Tyr Thr Gly Asp Thr Leu Tyr Lys Gly Asp Gly Tyr Val

50 55 60

Ser Phe Phe Tyr Asp Tyr Asp Pro Asn Ser Gly Lys Ser Asp Gly Thr

65 70 75 80

Ala Thr Phe Lys Val Asn Val Pro Thr Ala Gly Leu Tyr Arg Leu Ser

85 90 95

Leu Gly Tyr Tyr Ile Pro Ala Gly Thr Gly Ser Lys Asp Thr Ser Ile

100 105 110

Glu Val Asn Gly Thr Met Ser Glu Asn Ile Thr Leu Ala Ala Pro Pro

115 120 125

Lys Gly Ala Ala Val Asn Glu Lys Ile Leu Thr Lys Ile Met Leu Asn

130 135 140

Ala Gly Thr Asn Glu Leu Thr Phe Ala Arg Gly Trp Gly Tyr Tyr Gly

145 150 155 160

Ile Glu Tyr Val Lys Val Glu Phe Ala Asn Leu Pro Ala Ala Ile Ser

165 170 175

Lys Met Glu Ala Glu Asp Gly Val Ile Thr Gly Glu Val Lys Ile Glu

180 185 190

Ala Ala Asp Thr Gly Tyr Ser Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Phe Lys Ser

195 200 205

Thr Gly Ser Leu Thr Phe Ala Tyr Asn Ala Pro Ser Ser Gly Leu Tyr

210 215 220

Asn Leu Ala Ile Gly Tyr Ser Asn Pro Asn Gly Asp Lys Lys Thr Gln

225 230 235 240

Leu Val Val Asn Gly Gln Thr Ser Glu Ile Ser Leu Pro Thr Thr Ala

245 250 255

Ser Tyr Thr Glu Val Ser Gly Gly Lys Leu Met Leu Asn Ser Gly Asn

260 265 270

Asn Ile Leu Gln Phe Asn Val Asp Ser Asp Gln Tyr His Ile Asp Tyr

275 280 285

Val Lys Leu Ser Ala Val Ser Pro Pro Lys Leu His Gln Ile Glu Lys

290 295 300

Lys Pro Val Asn Pro Asn Ala Thr Ala Glu Thr Thr Ala Leu Met Gly

305 310 315 320

Tyr Leu Val Asp Ser Tyr Gly Ser His Ile Leu Ser Gly Gln His Thr

325 330 335

Leu Glu Asp Ala Gln Trp Ile Lys Asp Gln Thr Gly Lys Tyr Pro Ala

340 345 350

Met Leu Ser Met Asp Met Met Asp Tyr Ser Pro Ser Arg Ile Glu His

355 360 365

Gly Ala Thr Ser Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Gln Trp Ala Gln Glu

370 375 380

Gly Gly Leu Val Thr Phe Ala Trp His Trp Asn Ala Pro Lys Gly Leu

385 390 395 400

Tyr Asp Ile Pro Gly Lys Glu Trp Trp Arg Gly Phe Tyr Thr Asp Ala

405 410 415

Thr Thr Phe Asp Val Gln Tyr Ala Leu Ser His Pro Glu Ser Glu Glu

420 425 430

Tyr Gln Leu Ile Leu Arg Asp Ile Asp Ala Ile Ala Ala Gln Leu Lys

435 440 445

Arg Leu Gln Asp Ala His Val Pro Val Leu Trp Arg Pro Leu His Glu

450 455 460

Ala Glu Gly Lys Trp Phe Trp Trp Gly Ala Gln Gly Pro Asp Ser Ala

465 470 475 480

Lys Gln Leu Tyr Arg Ile Met Tyr Asp Arg Leu Thr His Tyr His His

485 490 495

Leu Asn Asn Leu Ile Trp Val Trp Asn Ser Glu Ser Pro Asp Trp Tyr

500 505 510

Pro Glu Asp Asp Val Val Asp Ile Val Ser Val Asp Ile Tyr Asn Gln

515 520 525

Ala Ala Asn Tyr Ser Pro Ser Ile Gly Lys Tyr Asp Ser Leu Val Asn

530 535 540

Leu Val Gln Gly Lys Lys Leu Val Gly Leu Ser Glu Asn Gly Pro Ile

545 550 555 560

Ser Asp Pro Glu Leu Leu Gln Thr Tyr Ser Ala His Trp Leu Phe Phe

565 570 575

Thr Thr Trp Thr Gly Asp Phe Ile Arg Asn Gly Lys Tyr Asn Ser Leu

580 585 590

Asp His Leu Ile Lys Val Phe Asn Ser Asp Tyr Val Ile Thr Arg Asp

595 600 605

Glu Leu Pro Gln Asp Leu Leu Thr Ser Ser Lys Asn Glu Ala Glu Leu

610 615 620

Glu His His His His His His

625 630

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(32)

<400> 3

cggacgcata tggaatcarc tmmcttggtc ac 32

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(37)

<400> 4

gacgagctcg agctccgctt yattyttgga braagta 37

Claims (6)

1.一种内切β-1,4-甘露聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性的核苷酸序列；

4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解葡甘露聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

2.一种权利要求1所述的内切β-1,4-甘露聚糖酶基因编码的内切β-1,4-甘露聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-631位氨基酸残基序列；

2)对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性的氨基酸序列。

3.一种权利要求2所述的内切β-1,4-甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于：将内切β-1,4-甘露聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切β-1,4-甘露聚糖酶；

上述内切β-1,4-甘露聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性的核苷酸序列；

4)所述的重组表达内切β-1,4-甘露聚糖酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞，即用于重组表达内切β-1,4-甘露聚糖酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coliBL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lacticacid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等)，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)中的一种。

5.一种权利要求2所述的内切β-1,4-甘露聚糖酶在降解魔芋多糖中的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种：

1)在断裂魔芋多糖的糖苷键，获得单糖或葡甘露寡糖中的应用；

2)在断裂甘露聚糖的糖苷键，获得单糖或甘露寡糖中的应用；

3)与其他葡甘露聚糖酶混合后，在协同断裂葡甘露聚糖糖苷键方面的应用。