CN107189992B - 一种肝素前体合酶及其应用 - Google Patents

一种肝素前体合酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肝素前体合酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明将大肠杆菌K5来源的肝素前体合酶KfiC、KfiA在枯草芽孢杆菌中进行三种方式的改造，即两个合酶直接融合；两个合酶通过柔性linker连接；将KfiC、KfiA中关键区域置换多杀巴斯德杆菌来源的PmHS合酶的关键区域，从而得到了三种肝素前体合酶，并获得了肝素前体产量提高、分子量减小的结果。本发明为食品级微生物高效生产制备肝素前体奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。

Description

一种肝素前体合酶及其应用
技术领域
本发明涉及一种肝素前体合酶及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
肝素(Heparin)属于一类高度硫酸化的糖胺聚糖(GAGs)，具有独特的生理功能。肝素作为一种抗凝血和抗血栓药物，在深部静脉血栓形成、肾透析和留置导管分流术、及术后血栓控制等医疗措施中使用。其结构复杂，具有生物活性多样等特点，因此研发肝素成为近年来多糖药物研究的热点。当前，肝素获得主要依赖动物组织提取，但是随着对肝素需求的不断增加，仅依赖动物组织制备无法满足需求，同时，疯牛病的发生以及2008年以来发生的肝素污染事件，使人们对从动物体内获得肝素的安全性提出了质疑。为此，采用安全有效的化学酶法合成肝素成为人们寻求新肝素来源的途径。
肝素前体(Heparosan)，结构式[-GlcUA-β(1,4)-GlcNAc-α(1,4)-]n(GlcUA是葡萄糖醛酸，GlcNAc是葡萄糖乙酰胺，是合成肝素的前体，也是合成过程中最重要的模板)，其未被硫酸化且未将葡萄糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸，heparosan具有与肝素类似的多糖骨架，因此，可作为肝素的生物合成骨架。根据文献报道，已知的可以产heparosan的微生物有大肠杆菌E.coli K5和多杀巴斯德杆菌Pasteurella multocida D型，其中E.coli K5产生的heparosan的分子量为10-20kDa，更接近肝素的分子量大小。K5基因簇中具有编码乙酰葡萄糖胺转移酶KfiA和编码葡萄糖醛酸转移酶KfiC的基因(即kfiA和kfiC)，它们分别将尿苷二磷酸(UDP)前体形式存在的单糖，即UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcUA)、UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)交替连接形成肝素前体多糖链，因此这两种酶需要共同作用，名称上将其统称为肝素前体合酶。不同的是，P.multocida来源的肝素前体合酶PmHS虽然为双功能糖基转移酶，即同时具有转运UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的作用，且蛋白较小(652个氨基酸)，但PmHS合成的肝素前体分子量在200-300kDa，分子量过大，与动物来源的天然肝素相差甚远，尤其是如今市场上，低分子量肝素或超低分子量肝素因具有更长的半衰期和更良好的生物皮下利用率而更加受到关注，因此不利于下游硫酸化修饰获得商品化肝素药品。尽管E.coli K5避免了这一问题，但其来源的两个独立的糖基转移酶KfiC和KfiA，它们附着在细胞膜上的位置、距离不一定为最佳，这一因素可能会影响聚合速率与效率，
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明采用linker连接两酶或进行融合使其作为整体，调节酶之间的作用距离。
本发明的第一个目的是提供一种肝素前体合酶，所述合酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述合酶的基因，包括(a)、(b)、(c)：
(a)在SEQ ID NO.6所示序列基础上，将S102-L315区域的碱基序列替换为SEQ IDNO.5所示序列中的S237-L450区域，I394-F599区域的碱基序列替换为SEQ ID NO.4所示序列中的I2-F207区域；
(b)将SEQ ID NO.5所示序列与SEQ ID NO.4所示序列通过柔性linker(GGGGS)2连接；
(c)将SEQ ID NO.5所示序列的终止密码子端与SEQ ID NO.4所示序列的起始密码子端连接，且SEQ ID NO.4所示序列的起始密码子ATG去掉。
本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体或细胞。
本发明的第四个目的是提供获得所述肝素前体合酶的方法，所述方法是将大肠杆菌K5来源的肝素前体合酶KfiC和KfiA进行融合，或将多杀巴斯德杆菌来源的肝素前体合酶中两段关键区域分别替换为KfiC和KfiA中的关键区域。
在本发明的一种实施方式中，所述多杀巴斯德杆菌来源的肝素前体合酶中两段关键区域分别是S102-L315区域和I394-F599区域。
在本发明的一种实施方式中，所述KfiC和KfiA中的关键区域分别是S237-L450区域和I2-F207区域。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌K5来源的kfiA基因序列如SEQ IDNO.4所示；所述大肠杆菌K5来源的kfiC基因序列如SEQ ID NO.5所示；所述多杀巴斯德杆菌来源的肝素前体合酶基因序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第五个目的是提供一种重组表达所述肝素前体合酶的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168为宿主，以组成型启动子P43启动编码肝素前体合酶基因的表达。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以pP43NMK为表达载体。
本发明还提供了一种应用所述重组菌发酵生产肝素前体的方法，是将重组菌接种至发酵培养基中，在37℃下培养48h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基以蔗糖为碳源。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的组成成为分：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，3.9g/L硫酸钾，1.5g/L硫酸镁，50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0。
本发明还提供了所述合酶及含有该合酶的细胞株系在生产肝素前体中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌通过重组型质粒游离表达(a)或(b)或(c)所示合酶基因。
有益效果：本发明利用三种不同的基因工程操作手段将单独表达肝素前体的两个合酶改造为一个完整的合酶，具有较大的应用优势。首先，本发明过程中使用的宿主为食品级，可满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险；其次，由于较单独表达的KfiC和KfiA在作用空间距离上有一定变化，经改造后形成的肝素前体合酶合成肝素前体的效率更高，在摇瓶上产量最高为1.87g/L，较原始合酶提高18.35％，且分子量均有所减小，范围在46.04～53.87kDa，这对于产生小分子肝素前体具有有利影响。
附图说明
图1所示为摇瓶中原大肠杆菌K5来源的肝素前体合酶KfiC和KfiA共表达情况下以及三种合酶分别表达在第48h时所产肝素前体的产量比较；EH，B.subtilis EH；C(GS)2A，B.subtilis C(GS)2A；pmCA，B.subtilis pmCA；HCA，B.subtilis HCA。
具体实施方式
肝素前体发酵产物分子量检测分析方法：采用高效体积排阻色谱-多角度激光散射进行分析，选择示差折光检测器RI，使用凝胶色谱柱Ultrahydrogel Linear进行分析。流动相选择0.1M硝酸钠进行洗脱，流速为0.5mL/min，柱子温度设定为50℃，进样量为20μL，每个样品洗脱时间为20min，利用软件进行平均分子质量的计算。
实施例涉及的核苷酸序列信息：
(1)SEQ ID NO.1序列信息为KfiC、KfiA关键区域置换PmHS合酶关键区域所形成的新酶氨基酸序列；
(2)SEQ ID NO.2序列信息为KfiC与KfiA通过linker(GGGGS)2融合后所形成的新酶氨基酸序列；
(3)SEQ ID NO.3序列信息为KfiC与KfiA通过开放阅读框相连，且KfiC、KfiA分别去除终止密码子和起始密码子所形成的新酶氨基酸序列；
(4)SEQ ID NO.4序列信息为来源于大肠杆菌K5(E.coli O10:K5:H4，E.coli K5)的α-糖基转移酶编码基因kfiA编码序列；
(5)SEQ ID NO.5序列信息为来源于大肠杆菌K5(E.coli O10:K5:H4，E.coli K5)的β-糖基转移酶编码基因kfiC编码序列；
(6)SEQ ID NO.6序列信息为来源于多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida Dtype)的肝素前体合酶heparosan synthase B编码基因hssB编码序列；
实施例1大肠杆菌K5肝素前体合酶KfiC和KfiA共表达重组质粒的构建
α-糖基转移酶编码基因kfiA和β-糖基转移酶编码基因kfiC来源于大肠杆菌K5(E.coli O10:K5:H4，E.coli K5)，E.coli K5菌株接种于5mL LB液体培养基，在37℃200rpm培养16h。收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取E.coli K5菌株的基因组DNA。
分别设计引物KfiA-F1/KfiA-R1、KfiC-F1/KfiC-R1，以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取目标基因。
引物序列信息：5’-3’方向
KfiA-F1:GGTAAGAGAGGAATGTACACATGATTGTTGCAAATATGTC
KfiA-R1:CCGCTCGAGTTACCCTTCCACATTATACA
KfiC-F1:CGGGGTACCATGAACGCAGAATATATAAATTTAG
KfiC-R1:GTGTACATTCCTCTCTTACCCTATTGTTCAATTATTCCTG
在kfiC上下游引物两端分别引入KpnI限制性酶切位点和RBS序列，在kfiA上下游引物两端分别引入RBS序列和XhoI限制性酶切位点。PCR扩增获取的kfiC和kfiA片段后通过RBS重叠区域将两片段进行融合PCR，获得片段KpnI-kfiC-RBS-kfiA-XhoI，并与质粒pP43-D(公开于Efficient biosynthesis of polysaccharides chondroitin and heparosanbymetabolically engineered Bacillus subtilis，Carbohydrate Polymers，2016，Jinpengand Zhang Linpei)同时进行KpnI/XhoI双酶切，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μL：1μL双切的载体，4μL双切的目的片段，5μL Solution I连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，重组质粒pP43NMK-kfiC-RBS-kfiA构建成功。重组质粒转化Bacillus subtilis 168，以5μg/ml的卡那霉素平板进行筛选整合重组子，并对重组菌株进行PCR验证和测序验证，对成功转化pP43NMK-kfiC-RBS-kfiA的枯草芽孢杆菌菌株命名为B.subtilis EH。
实施例2大肠杆菌K5肝素前体合酶KfiC和KfiA通过柔性linker(GGGGS)2连接的构建
以上述重组质粒pP43NMK-kfiC-RBS-kfiA为模板，分别设计引物KfiA-F2/KfiA-R1、KfiC-F1/KfiC-R2，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取目标基因。
引物序列信息：5’-3’方向
KfiA-F2:
GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGATGATTGTTGCAAATATGTC
KfiC-R2:
CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTTGTTCAATTATTCCTGATA
在kfiC上下游引物两端分别引入KpnI限制性酶切位点和(GGGGS)2linker序列，并去掉kfiC的终止密码子。在kfiA上下游引物两端分别引入(GGGGS)2linker序列和XhoI限制性酶切位点。PCR扩增获取的kfiC和kfiA片段后通过(GGGGS)2linker重叠区域将两片段进行融合PCR，获得片段KpnI-kfiC-(GGGGS)2-kfiA-XhoI，并与质粒pP43NMK-kfiC-kfiA同时进行KpnI/XhoI双酶切，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μL：1μL双切的载体，4μL双切的目的片段，5μL Solution I连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，重组质粒pP43NMK-kfiC-(GGGGS)2-kfiA构建成功。重组质粒转化B.subtilis 168，以5μg/mL的卡那霉素平板进行筛选整合重组子，并对重组菌株进行PCR验证和测序验证，对成功转化pP43NMK-kfiC-(GGGGS)2-kfiA的枯草芽孢杆菌菌株命名为B.subtilis C(GS)2A。
实施例3大肠杆菌K5肝素前体合酶KfiC和KfiA融合的构建
以重组质粒pP43NMK-kfiC-RBS-kfiA为模板，分别设计引物KfiA-F3/KfiA-R1、KfiC-F1/KfiC-R3，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取目标基因。
引物序列信息：5’-3’方向
KfiA-F3:
AGATGTATCAGGAATAATTGAACAAATTGTTGCAAATATGTCATC
KfiC-R3:TTGTTCAATTATTCCTGATA
在kfiC上下游引物两端分别引入KpnI限制性酶切位点和kfiA自起始密码子ATG后(不含ATG)的20bp序列，并去掉kfiC的终止密码子。在kfiA下游引物5’端引入XhoI限制性酶切位点。PCR扩增获取的kfiC和kfiA片段后通过20bp重叠区域将两片段进行融合PCR，获得片段KpnI-kfiC-kfiA-XhoI，并与质粒pP43NMK-kfiC-kfiA同时进行KpnI/XhoI双酶切，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μL：1μL双切的载体，4μL双切的目的片段，5μL Solution I连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，重组质粒pP43NMK-kfiC-kfiA构建成功。重组质粒转化B.subtilis 168，以5μg/mL的卡那霉素平板进行筛选整合重组子，并对重组菌株进行PCR验证和测序验证，对成功转化pP43NMK-kfiC-kfiA的枯草芽孢杆菌菌株命名为B.subtilis HCA。
实施例4多杀巴斯德杆菌来源的肝素前体合酶关键区域置换的构建
通过BLAST比对找出KfiC、KfiA分别与hssB基因同源的部分，KfiC中为S237-L450，KfiA中为I2-F207。用S237-L450、I2-F207分别置换hssB中的S102-L315和I394-F599部分，则hssB剩余区域M1-T101，Y316-P393和R600-L643分别命名为区域1，区域2，区域3。
以重组质粒pP43NMK-kfiC-RBS-kfiA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，通过KfiC-F4/KfiC-R4扩增KfiC中的S237-L450，通过KfiA-F4/KfiA-R4扩增KfiA中的I2-F207。以提取的P.multocida基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，通过PmHS-F1/PmHS-R1，PmHS-F2/PmHS-R2，PmHS-F3/PmHS-R3分别扩增获得区域1，区域2，区域3。
引物序列信息：5’-3’方向
KfiA-F4:TGTCCAATCCTAAGATTCCTATTGTTGCAAATATGTCATC
KfiA-R4:AAATGTGTTCCAAAGTCCTT
KfiC-F4:TAGAAAAAGATAAGCAAACATCAGAAATAACTGATATATA
KfiC-R4:CAATGGCTGCAGTAATCTTA
PmHS-F1:CGGGGTACCATGAAGGGAAAAAAAGAGAT
PmHS-R1:TGTTTGCTTATCTTTTTCTA
PmHS-F2:TAAGATTACTGCAGCCATTGTACTACAACACAATGAGAGA
PmHS-R2:AGGAATCTTAGGATTGGACA
PmHS-F3:AAGGACTTTGGAACACATTTCGAGACAATGATGAGCAACA
PmHS-R3:CCGCTCGAGTTATAAAAAATAAAAAGGTA
在KfiC的S237-L450区域和KfiA的I2-F207区域上下游引物两端分别引入和hssB重叠的20bp碱基。在hssB区域1上游引物5’端和区域3下游引物5’端分别引入KpnI、XhoI限制性酶切位点。PCR扩增获取的5个片段通过重叠区域进行融合，并与质粒pP43NMK-kfiC-kfiA同时进行KpnI/XhoI双酶切，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μL：1μL双切的载体，4μL双切的目的片段，5μL Solution I连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，重组质粒pP43NMK-hssBCA构建成功。重组质粒转化B.subtilis 168，以5μg/mL的卡那霉素平板进行筛选整合重组子，并对重组菌株进行PCR验证和测序验证，对成功转化pP43NMK-hssBCA的枯草芽孢杆菌菌株命名为B.subtilis pmCA。
实施例5重组枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵
分别挑取上述构建的4株重组枯草芽孢杆菌，单菌落接种于LB培养基，置于200rpm37℃过夜培养。按体积比为10％的接种量转接于25mL发酵培养基中(250mL摇瓶)，发酵培养基为：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，硫酸钾3.9g/L，硫酸镁1.5g/L，50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0，50μg/mL卡那霉素，置于200rpm37℃培养48h。
摇瓶发酵过程中第48h肝素前体的含量采用Bitter-Muir硫酸咔唑法测定，在比色管中加入1mL硼砂硫酸试剂和200μL经一定倍数稀释后的肝素前体样品，混匀后在沸水中煮15min后，冷却至室温，再加入50μL咔唑试剂，混匀后再在沸水中煮15min，冷却至室温，并在530nm处测定吸光值。利用纯化肝素前体样品绘制标准曲线，根据标准曲线计算产量。
根据附图1，较对照菌株B.subtilis EH(两个合酶分开表达)的产量1.58g/L，经过改造的三种肝素前体合酶，在摇瓶上均有产量且有所提高，证明获得的合酶均保持原有功能。其中B.subtilis pmCA产量为1.65g/L(产量基本相近)，B.subtilis HCA产量为1.76g/L(增长11.39％)，而B.subtilis C(GS)2A产量最高，为1.87g/L，提高幅度最大，为18.35％。根据三种不同改造方式，比较三种合酶在结构上的特点，推测以KfiC、KfiA中关键区域置换多杀巴斯德杆菌来源的肝素前体合酶的关键区域，也可产生该多糖，证明这两段区域是合成产物的主要功能区域，但仅有此关键区域的作用还不够，或与多杀巴斯德杆菌来源的合酶其它区域不匹配导致合成效果不佳。而对于C(GS)2A和HCA，在KfiC、KfiA中间加上具有10个氨基酸的柔性linker产量较将KfiC、KfiA首尾相连的方式高，证明两个合酶在作用过程中，距离、角度等因素会对产量有一定影响。
表1摇瓶中原大肠杆菌K5来源的肝素前体合酶KfiC和KfiA共表达情况下以及三种合酶分别表达在第48h时所产肝素前体的分子量比较
a数量平均分子量(Mn)；b质量平均分子量(Mw)；c聚合度(Ip＝Mw/Mn).
同时采用HPSEC-MALLS测定第48h肝素前体的质量平均分子量(Mw)，数量平均分子量(Mn)和分散系数Ip。表1显示对照菌B.subtilis EH摇瓶上所产肝素前体的Mw为56.48kDa。而重组菌B.subtilis pmCA、B.subtilis C(GS)2A和B.subtilis HCA在摇瓶上所产肝素前体的Mw分别为53.87kDa、46.04kDa和49.39kDa，均比对照菌的产物分子量低，而B.subtilisC(GS)2A效果最好，产物分子量及分散度均最低，说明糖链长度更集中，产物更均一。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种肝素前体合酶及其应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 643
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Gly Lys Lys Glu Met Thr Gln Ile Gln Ile Ala Lys Asn Pro
1 5 10 15
Pro Gln His Glu Lys Glu Asn Glu Leu Asn Thr Phe Gln Asn Lys Ile
20 25 30
Asp Ser Leu Lys Thr Thr Leu Asn Lys Asp Ile Ile Ser Gln Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Ala Lys Gln Asp Ser Lys His Pro Leu Ser Ala Ser Leu Glu
50 55 60
Asn Glu Asn Lys Leu Leu Leu Lys Gln Leu Gln Leu Val Leu Gln Glu
65 70 75 80
Phe Glu Lys Ile Tyr Thr Tyr Asn Gln Ala Leu Glu Ala Lys Leu Glu
85 90 95
Lys Asp Lys Gln Thr Ser Glu Ile Thr Asp Ile Tyr Pro Asn Lys Ile
100 105 110
Ile Leu Gln Gly Ile Lys Phe Asp Lys Lys Lys Asn Val Tyr Gly Lys
115 120 125
Asp Leu Val Ser Ile Ile Met Ser Val Phe Asn Ser Glu Asp Thr Ile
130 135 140
Ala Tyr Ser Leu His Ser Leu Leu Asn Gln Thr Tyr Glu Asn Ile Glu
145 150 155 160
Ile Leu Val Cys Asp Asp Cys Ser Ser Asp Lys Ser Leu Glu Ile Ile
165 170 175
Lys Ser Ile Ala Tyr Ser Ser Ser Arg Val Lys Val Tyr Ser Ser Arg
180 185 190
Lys Asn Gln Gly Pro Tyr Asn Ile Arg Asn Glu Leu Ile Lys Lys Ala
195 200 205
His Gly Asn Phe Ile Thr Phe Gln Asp Ala Asp Asp Leu Ser His Pro
210 215 220
Glu Arg Ile Gln Arg Gln Val Glu Val Leu Arg Asn Asn Lys Ala Val
225 230 235 240
Ile Cys Met Ala Asn Trp Ile Arg Val Ala Ser Asn Gly Lys Ile Gln
245 250 255
Phe Phe Tyr Asp Asp Lys Ala Thr Arg Met Ser Val Val Ser Ser Met
260 265 270
Ile Lys Lys Asp Ile Phe Ala Thr Val Gly Gly Tyr Arg Gln Ser Leu
275 280 285
Ile Gly Ala Asp Thr Glu Phe Tyr Glu Thr Val Ile Met Arg Tyr Gly
290 295 300
Arg Glu Ser Ile Val Arg Leu Leu Gln Pro Leu Tyr Tyr Asn Thr Met
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ser Leu Phe Thr Asp Met Val Glu Trp Ile Asp Asn His
325 330 335
Asn Ile Ile Gln Lys Met Ser Asp Thr Arg Gln His Tyr Ala Thr Leu
340 345 350
Phe Gln Ala Met His Asn Glu Thr Ala Ser His Asp Phe Lys Asn Leu
355 360 365
Phe Gln Phe Pro Arg Ile Tyr Asp Ala Leu Pro Val Pro Gln Glu Met
370 375 380
Ser Lys Leu Ser Asn Pro Lys Ile Pro Ile Val Ala Asn Met Ser Ser
385 390 395 400
Tyr Pro Pro Arg Lys Lys Glu Leu Val His Ser Ile Gln Ser Leu His
405 410 415
Ala Gln Val Asp Lys Ile Asn Leu Cys Leu Asn Glu Phe Glu Glu Ile
420 425 430
Pro Glu Glu Leu Asp Gly Phe Ser Lys Leu Asn Pro Val Ile Pro Asp
435 440 445
Lys Asp Tyr Lys Asp Val Gly Lys Phe Ile Phe Pro Cys Ala Lys Asn
450 455 460
Asp Met Ile Val Leu Thr Asp Asp Asp Ile Ile Tyr Pro Pro Asp Tyr
465 470 475 480
Val Glu Lys Met Leu Asn Phe Tyr Asn Ser Phe Ala Ile Phe Asn Cys
485 490 495
Ile Val Gly Ile His Gly Cys Ile Tyr Ile Asp Ala Phe Asp Gly Asp
500 505 510
Gln Ser Lys Arg Lys Val Phe Ser Phe Thr Gln Gly Leu Leu Arg Pro
515 520 525
Arg Val Val Asn Gln Leu Gly Thr Gly Thr Val Phe Leu Lys Ala Asp
530 535 540
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545 550 555 560
Val Arg Phe Ser Arg Tyr Met Leu Glu Asn Glu Ile Gly Met Ile Cys
565 570 575
Val Pro Arg Glu Lys Asn Trp Leu Arg Glu Val Ser Ser Gly Ser Met
580 585 590
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595 600 605
Leu Ile Met Glu Asn Gly Pro Trp Gly Tyr Ser Ser Ile Tyr Pro Leu
610 615 620
Val Lys Asn His Pro Lys Phe Thr Asp Leu Ile Pro Cys Leu Pro Phe
625 630 635 640
Tyr Phe Leu
<210> 2
<211> 768
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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1 5 10 15
Thr Asn Ile Gly Ala Leu Asp Phe Leu Leu Ser Ile His Lys Glu Lys
20 25 30
Val Asp Leu Gln His Lys Asn Ser Pro Leu Lys Gly Asn Asp Asn Leu
35 40 45
Ile His Lys Arg Ile Asn Glu Tyr Asp Asn Val Leu Glu Leu Ser Lys
50 55 60
Asn Val Ser Ala Gln Asn Ser Gly Asn Glu Phe Ser Tyr Leu Leu Gly
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Leu Arg Lys Val Gly Met Leu Asp Thr Tyr Ile Lys
85 90 95
Ile Val Cys Tyr Leu Thr Ile Gln Ser Arg Tyr Phe Lys Asn Gly Glu
100 105 110
Arg Val Lys Leu Phe Glu His Ile Ser Asn Ala Leu Arg Tyr Ser Arg
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Ser Asp Phe Leu Ile Asn Leu Ile Phe Glu Arg Tyr Ile Glu Tyr Ile
130 135 140
Asn His Leu Lys Leu Ser Pro Lys Gln Lys Asp Phe Tyr Phe Cys Thr
145 150 155 160
Lys Phe Ser Lys Phe His Asp Tyr Thr Lys Asn Gly Tyr Lys Tyr Leu
165 170 175
Ala Phe Asp Asn Gln Ala Asp Ala Gly Tyr Gly Leu Thr Leu Leu Leu
180 185 190
Asn Ala Asn Asp Asp Met Gln Asp Ser Tyr Asn Leu Leu Pro Glu Gln
195 200 205
Glu Leu Phe Ile Cys Asn Ala Val Ile Asp Asn Met Asn Ile Tyr Arg
210 215 220
Ser Gln Phe Asn Lys Cys Leu Arg Lys Tyr Asp Leu Ser Glu Ile Thr
225 230 235 240
Asp Ile Tyr Pro Asn Lys Ile Ile Leu Gln Gly Ile Lys Phe Asp Lys
245 250 255
Lys Lys Asn Val Tyr Gly Lys Asp Leu Val Ser Ile Ile Met Ser Val
260 265 270
Phe Asn Ser Glu Asp Thr Ile Ala Tyr Ser Leu His Ser Leu Leu Asn
275 280 285
Gln Thr Tyr Glu Asn Ile Glu Ile Leu Val Cys Asp Asp Cys Ser Ser
290 295 300
Asp Lys Ser Leu Glu Ile Ile Lys Ser Ile Ala Tyr Ser Ser Ser Arg
305 310 315 320
Val Lys Val Tyr Ser Ser Arg Lys Asn Gln Gly Pro Tyr Asn Ile Arg
325 330 335
Asn Glu Leu Ile Lys Lys Ala His Gly Asn Phe Ile Thr Phe Gln Asp
340 345 350
Ala Asp Asp Leu Ser His Pro Glu Arg Ile Gln Arg Gln Val Glu Val
355 360 365
Leu Arg Asn Asn Lys Ala Val Ile Cys Met Ala Asn Trp Ile Arg Val
370 375 380
Ala Ser Asn Gly Lys Ile Gln Phe Phe Tyr Asp Asp Lys Ala Thr Arg
385 390 395 400
Met Ser Val Val Ser Ser Met Ile Lys Lys Asp Ile Phe Ala Thr Val
405 410 415
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420 425 430
Thr Val Ile Met Arg Tyr Gly Arg Glu Ser Ile Val Arg Leu Leu Gln
435 440 445
Pro Leu Ile Leu Gly Leu Trp Gly Asp Ser Gly Leu Thr Arg Asn Lys
450 455 460
Gly Thr Glu Ala Leu Pro Asp Gly Tyr Ile Ser Gln Ser Arg Arg Glu
465 470 475 480
Tyr Ser Asp Ile Ala Ala Arg Gln Arg Val Leu Gly Lys Ser Ile Val
485 490 495
Ser Asp Lys Asp Val Arg Gly Leu Leu Ser Arg Tyr Gly Leu Phe Lys
500 505 510
Asp Val Ser Gly Ile Ile Glu Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
515 520 525
Gly Ser Met Ile Val Ala Asn Met Ser Ser Tyr Pro Pro Arg Lys Lys
530 535 540
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Asn Leu Cys Leu Asn Glu Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Leu Asp Gly
565 570 575
Phe Ser Lys Leu Asn Pro Val Ile Pro Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Val
580 585 590
Gly Lys Phe Ile Phe Pro Cys Ala Lys Asn Asp Met Ile Val Leu Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Thr Asn Ile Gly Ala Leu Asp Phe Leu Leu Ser Ile His Lys Glu Lys
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Val Asp Leu Gln His Lys Asn Ser Pro Leu Lys Gly Asn Asp Asn Leu
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Ile His Lys Arg Ile Asn Glu Tyr Asp Asn Val Leu Glu Leu Ser Lys
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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<212> DNA
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<212> DNA
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aaaaaagcac acggtaattt catcaccttt caagatgcag atgatctttc tcatccggag 1080
agaatacaaa gacaagttga ggttcttcgc aataataagg ctgtaatctg tatggctaac 1140
tggatccgtg ttgcgtcaaa tggaaaaatt caattcttct atgatgataa agccacaaga 1200
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caatctttaa ttggtgcaga tacggagttt tatgaaacag taataatgcg ttatgggcga 1320
gaaagtattg taagattact gcagccattg atattggggt tatggggaga ctccggactt 1380
accaggaata aaggaacaga agctctacct gatggatata tatcacaatc tcgaagagaa 1440
tatagtgata tcgcggcaag acaacgagtg ttagggaaaa gtatcgtaag tgataaagat 1500
gtacgtggtt tattatctcg ctatggtttg tttaaagatg tatcaggaat aattgaacaa 1560
tag 1563
<210> 6
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<212> DNA
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<400> 24
ccgctcgagt tataaaaaat aaaaaggta 29

Claims (10)

1.一种肝素前体合酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.2、或SEQID NO.3所示。
2.一种编码权利要求1所述肝素前体合酶的基因，其特征在于，是(a)或(b)或(c)：
(a)将SEQ ID NO.6所示序列S102-L315区域的碱基序列替换为SEQ ID NO.5所示序列中的S237-L450区域，I394-F599区域的碱基序列替换为SEQ ID NO.4所示序列中的I2-F207区域；
(b)将SEQ ID NO.5所示序列与SEQ ID NO.4所示序列通过柔性linker(GGGGS)2连接；
(c)将SEQ ID NO.5所示序列的终止密码子端与SEQ ID NO.4所示序列的起始密码子端连接，且将SEQ ID NO.5所示序列的终止密码子和SEQ ID NO.4所示序列的起始密码子ATG去掉。
3.含有权利要求2所述基因的载体或细胞。
4.一种获得权利要求1所述肝素前体合酶的方法，其特征在于，对大肠杆菌K5来源的肝素前体合酶KfiC和KfiA进行融合，或将多杀巴斯德杆菌来源的肝素前体合酶中两段关键区域分别替换为KfiC和KfiA中的关键区域；所述多杀巴斯德杆菌来源的肝素前体合酶中两段关键区域分别是S102-L315区域和I394-F599区域；所述KfiC和KfiA中的关键区域分别是S237-L450区域和I2-F207区域。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌K5来源的KfiA基因序列如SEQ ID NO.4所示；所述大肠杆菌K5来源的KfiC基因序列如SEQ ID NO.5所示；所述多杀巴斯德杆菌来源的肝素前体合酶基因序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种产肝素前体合酶的重组菌，其特征在于，重组表达权利要求1所述的肝素前体合酶。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168为宿主，以pP43NMK为表达载体，以组成型启动子P43启动编码肝素前体合酶基因的表达。
8.一种应用权利要求6或7所述重组菌发酵生产肝素前体的方法，其特征在于，将所述重组菌接种至发酵培养基，在37℃下培养24～60h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分包括：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，3.9g/L硫酸钾，1.5g/L硫酸镁，50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0。
10.权利要求1所述合酶及含有该合酶的细胞株系在生产肝素前体中的应用。
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