CN104498420A - 一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明将α-糖基转移酶编码基因和β-糖基转移酶编码基因整合于枯草芽孢杆菌基因组上表达，同时，对枯草芽孢杆菌中UDP-GlcA和UDP-GlcNAc合成途径的基因，进行模块化组装表达分析，通过控制不同的UDP-GlcA和UDP-GlcNAc浓度，实现枯草芽孢杆菌产不同分子量范围的肝素前体。本发明为食品级微生物高效生产制备肝素前体奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
肝素(Heparin)和硫酸乙酰肝素(HS)属于一类高度硫酸化的糖胺聚糖(GAGs)，糖胺聚糖是一类由重复的二糖单元组成的不分支的带负电荷的多糖，由于其独特的生理功能，糖胺聚糖组成了一类具有巨大治疗应用潜力的化合物。肝素作为一种抗凝血和抗血栓药物，在深部静脉血栓形成、肾透析和留置导管分流术、及术后血栓控制等医疗措施中使用。同时还具有抗血脂，抗炎、抗肿瘤、抑制细菌粘附等作用，自1918年被发现后被广泛应用于临床作为抗凝血药物。其结构复杂、生物活性多样等特点，研发以肝素和硫酸乙酰肝素为骨架的新药已成为近年来多糖药物研究的热点。
肝素前体(Heparosan)，又称N-Acetylheparosan，结构式为[-GlcUA-β(1,4)-GlcNAc-α(1,4)-]n(其中GlcUA是葡萄糖醛酸，GlcNAc是葡萄糖乙酰胺，是合成肝素和硫酸乙酰肝素共同的前体，也是它们合成过程中最重要的模板)，其未被硫酸化且未将葡萄糖醛酸异构化为艾杜糖醛，Heparosan具有与肝素类似的多糖骨架。因此，可作为肝素、硫酸乙酰肝素或者其他类似多糖的生物合成骨架。根据文献报道，已知的可以产heparosan的微生物有大肠杆菌K5和巴斯德菌D型，巴斯德菌D型产生的heparosan的分子质量为200～300kDa，而大肠杆菌产生的heparosan的分子量为3～150kDa，其分子质量更接近于肝素的分子量大小。近年以来，heparosan作为前体合成肝素以及硫酸乙酰肝素得到人们的广泛关注。
当前，肝素获得的方法有化学合成、酶法合成和动物组织提取法。酶法合成法和化学合成法尽管何以获得高纯度且特定结构的肝素，但由于其前体化合物极其昂贵，不可能满足大规模的使用需求。而目前医药级别的肝素均是从动物组织中提取得到，如从猪肠膜和牛肺组织中制备。但是随着全球对肝素的需求的不断增加，仅依赖动物组织来制备，无法满足需求，与此同时，疯牛病的发生以及2007年以来发生的硫酸软骨素及肝素污染事件，使人们对从动物体内获得肝素的安全性提出了质疑。为此，采用安全有效的方法合成肝素和硫酸乙酰肝素已成为需要首要解决的问题。这就迫切需求人们开始寻求新的肝素来源。
合成Heparosan的细菌酶有2类：大肠杆菌K5的KfiA和KfiC，巴斯德菌D型PmHS1、PmHS2。利用以尿苷二磷酸(UDP)前体形式存在的单糖，即UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcUA)、UDP-N-乙酰氨基葡糖(UDP-N-GlcNAc)相互交替合成肝素前体多糖链。基于食品安全和医疗卫生越来越高的要求，本发明应用食品安全级的枯草芽孢杆菌发酵生产heparosan。本发明通过对heparosan的两个前体物质的合成途径进行模块化调控表达，进而引起胞内两个前体物UDP-GlcNAc和UDP-GlcA浓度的变化，最终引起heparosan产量的变化，且易于调控前体物质的浓度来控制聚合物分子量，合成特定的heparosan聚合体。该发明操作过程简单，易于实现工业化大规模生产制备heparosan。
发明内容
本发明提供了一种产肝素前体的的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌中表达编码α-糖基转移酶的基因和编码β-糖基转移酶的基因，构建枯草芽孢杆菌代谢合成肝素前体的途径。
所述重组枯草芽孢杆菌，还可以以模块化组装调控方式，分别对胞内肝素前体的两个前体物UDP-N-乙酰氨基葡糖(UDP-N-GlcNAc)和UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcUA)的合成途径基因进行调控，提高肝素前体的产量，或实现不同分子量范围的Heparosan的生产。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。
在本发明的一种实施方式中，编码所述α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因是来源于大肠杆菌K5(E.coli O10:K5:H4，E.coliK5)的KfiA和KfiC；KfiA的的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；KfiC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的另一种实施方式中，编码所述α-糖基转移和β-糖基转移酶的基因是来源于巴斯德菌D型(Pasteurella type D)的基因PmHS1和PmHS2。
在本发明的一种实施方式中，所述UDP-N-GlcNAc的合成途径包括编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，编码变位酶的基因glmM；所述UDP-GlcUA的合成途径包括编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，编码尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB。
在本发明的一种实施方式中，表达两个前体物UDP-N-乙酰氨基葡糖和UDP-葡糖醛酸的合成途径基因以调控肝素前体的合成，包括表达基因glmU，或glmU及glmM，或tuaD，或tuaD及gtaB。
在本发明的一种实施方式中，所述UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、磷酸葡萄糖变位酶和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶可以来源于巴斯德菌属(Pasteurella type D)、大肠杆菌(Escherichia coli)或芽孢杆菌(Bacillus)。
在本发明的一种实施方式中，编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB、磷酸葡萄糖变位酶的基因glmM和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3-6所示。
在本发明的一种实施方式中，编码α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因重组整合在基因组上进行诱导表达，启动子为木糖诱导型启动子Pxly。
在本发明的一种实施方式中，以表达载体pP43NMK表达UDP-N-乙酰氨基葡糖(UDP-N-GlcNAc)和UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcUA)合成途径的基因，启动子为组成型强启动子P43。
本发明还提供了一种构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法，是以表达载体pP43NMK重组表达UDP-N-乙酰氨基葡糖或UDP-葡糖醛酸合成途径的基因，并在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达编码α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体表达glmU，或glmU和glmM；KfiA和KfiC整合在枯草芽孢杆菌基因组上串联表达，启动子为木糖诱导型强启动子Pxyl。
在本发明的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体表达tuaD，或tuaD和gtaB，KfiA和KfiC整合在枯草芽孢杆菌基因组上串联表达，启动子为木糖诱导型强启动子Pxyl。
本发明还提供了一种应用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产肝素前体的方法，盐培养基：酵母粉20g/L，蔗糖/葡萄糖50g/L，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L，在37℃下，发酵48h获得平均分子量在40kDa至120kDa之间不同分布范围的Heparosan。
在本发明的一种实施方式中，碳源采用蔗糖。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组上整合表达KfiA和KfiC，并过表达UDP-GlcNAc途径基因，产物平均分子量最高达到120000道尔顿。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌在基因组上整合表达KfiA和KfiC，并过表达UDP-GlcUA途径基因，产物平均分子量约在50000-80000道尔顿之间。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌仅在基因组上整合表达KfiA和KfiC，产物的平均分子量约为40000道尔顿。
本发明利用枯草芽孢杆菌产Heparosan，与其他产Heparosan菌相比，具有非常大的应用优势。首先，本发明过程中使用的宿主为食品级，完全满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险，不会对产物的医用食品安全带来隐患；其次，枯草芽孢杆菌培养成本简单，生产强度大，同时通过分别调控Heparosan两个前体物UDP-GlcNAc和UDP-GlcA浓度的变化，可以获得产分子量范围差异和产量不同的Heparosan生产菌株。基于应用分析，本发明方法在工业上用于制备特定分子量范围的Heparosan具有潜在而非常广泛的价值。
附图说明
图1所示为模块化重组UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA合成途径基因顺序示意图。
图2所示为含有不同组合基因重组质粒的枯草芽孢杆菌对Heparosan的产量影响：1，ZHHER168；2，ZHHER168/pP43NMK/tuaD；3,ZHHER168/pP43NMK/tuaD-gtaB；4，ZHHER168/pP43NMK/glmU；5，ZHHER168/pP43NMK/glmU-glmM。
图3所示为含有不同组合基因重组质粒的枯草芽孢杆菌对Heparosan的分子量影响：1，ZHHER168；2，ZHHER168/pP43NMK/tuaD；3,ZHHER168/pP43NMK/tuaD-gtaB；4，ZHHER168/pP43NMK/glmU；5，ZHHER168/pP43NMK/glmU-glmM。
具体实施方式
Heparosan发酵产物分子量检测分析方法：使用安捷伦公司的高效液相色谱仪1260进行分析，选择示差检测器RID，使用凝胶色谱柱Ultrahydrogel Linear进行分析。流动相选择0.1M硝酸钠进行洗脱，柱子温度设定为40摄氏度，进样量40μL，每个样品洗脱时间25min，使用中国食品药品检定研究院出产的右旋糖酐作为标准品，利用GPC软件进行平均分子质量的计算。
序列表所示为本发明所述核苷酸序列信息：
(1)SEQ ID NO.1序列信息为来源于大肠杆菌K5(E.coli O10:K5:H4，E.coliK5)的α-糖基转移酶编码基因KfiA编码序列；
(2)SEQ ID NO.2序列信息为来源于大肠杆菌K5(E.coli O10:K5:H4，E.coliK5)的α-糖基转移酶编码基因KfiC编码序列；
(3)SEQ ID NO.3序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶基因tuaD编码序列；
(4)SEQ ID NO.4序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB编码序列；
(5)SEQ ID NO.5序列信息为枯草芽孢杆菌来源的变位酶的基因glmM的编码序列；
(6)SEQ ID NO.6序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU的编码序列；
(7)SEQ ID NO.7序列信息为枯草芽孢杆菌组成型启动子P43的基因序列；
(8)SEQ ID NO.8序列信息为枯草芽孢杆菌诱导型启动子Pxyl的基因序列。
实施例1整合重组质粒pAX01-KfiA-KfiC构建
α-糖基转移酶编码基因KfiA和β-糖基转移酶编码基因KfiC来源于大肠杆菌K5(E.coliO10:K5:H4，E.coli K5)，E.coli K5菌株接种于5ml LB液体培养基，在37℃200rpm培养16h。收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取E.coli K5菌株的基因组DNA。
根据已公布的基因组信息序列，分别设计引物KfiA-F/R、KfiC-F/R，以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取目标基因。
引物序列信息：5’-3’方向
KfiA-F:CGGGATCCATGATTGTTGCAAATATGTCATCATAC
KfiA-R:TCCCCGCGGACTTCGGGTACCTTACCCTTCCACATTATACAC
KfiC-F:CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAACGCAGAATATATAAATTTAG
KfiC-R:TCCCCGCGGCTATTGTTCAATTATTCCTGATA
在KfiA上下游引物两端分别引入BamHI和KpnI、SacII限制性酶切位点。PCR扩增获取的KfiA片段和质粒pAX01分别采用BamHI和SacII进行双酶切，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，重组质粒pAX01-KfiA构建成功。在KfiC引物上下游引入KpnI和SacII限制性酶切位点，PCR扩增获得KfiC后，与pAX01-KfiA质粒分别进行KpnI和SacII双酶切，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，重组质粒pAX01-KfiA-KfiC构建成功。
重组质粒pAX01-KfiA-KfiC转化Bacillus subtilis 168，以20μg/ml的红霉素平板进行筛选整合重组子，并对重组菌株进行PCR验证和测序验证，对成功整合Pxyl-KfiA-KfiC的枯草芽孢杆菌菌株命名为ZHHER168。
实施例2重组质粒pP43NMK/tuaD，pP43NMK/tuaD-gtaB的构建
Bacillus subtilis 168菌株接种于5 ml LB培养基，37℃，200 rpm培养16 h。收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取兽疫链球菌株的基因组DNA。根据已公布的Bacillus subtilis168基因组信息序列，分别设计引物tuaD-F/tuaD-R、gtaB-F/gtaB-R。在上游引物tuaD-F的5端引入KpnI限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物tuaD-R的5端引入XhoI和SacI限制性酶切位点；在上游引物gtaB-F的5端引入SacI限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物gtaB-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点。
引物信息如下：
tuaD-F：
5′-CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGG-3′
tuaD-R：
5′-CCGCTCGAGCGGTACATTCGAGCTCTTATAAATTGACGCTTCCCAAG-3′
gtaB-F：
5′-CGGGGTACCGAGCTCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAGTACGTAAAGC-3′
gtaB-R：
5′-CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTAGATTTCTTCTTTGTTTAGTAAACC-3′
以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，分别扩增获取tuaD、gtaB基因。
质粒pP43NMK采用KpnI和XhoI双酶切，同时PCR扩增获得的tuaD基因产物也采用KpnI和XhoI双酶切，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目标条带，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μlSolution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，pP43NMK/tuaD质粒构建成功。
同理，按上述操作将重组质粒pP43NMK/tuaD进行SacI和XhoI双酶切，gtaB片段PCR产物也进行SacI和XhoI双酶切。回收的两个片段进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，结果比对正确，pP43NMK/tuaD-gtaB质粒构建成功。
上述构建的2个重组质粒分别转化ZHHER168宿主，获得2个重组枯草芽孢杆菌菌株：ZHHER168/pP43NMK/tuaD；ZHHER168/pP43NMK/tuaD-gtaB。
实施例3重组质粒pP43NMK/glmU，pP43NMK/glmU-glmM的构建
根据已公布的Bacillus subtilis 168基因组信息序列，分别设计引物glmU-F/glmU-R、glmM-F/glmM-R。在上游引物glmU-F的5端引入KpnI限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物glmU-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点，后续几个基因均采用SpeI和XbaI同尾酶进行连接；在上游引物glmM-F的5端引入SpeI限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物glmM-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点。
引物信息如下：
glmU-F：5′-CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG-3′
glmU-R：5′-CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCAC-3′
glmM-F：
5′-GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGGGCAAGTATTTTGGAACAGACGG-3′
glmM-R：
5′-CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCTAATCCCATTTCTGACCGGAC-3′
以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，分别扩增获取glmU、glmM基因。
质粒pP43NMK采用KpnI和XhoI双酶切，同时PCR扩增获得的glmU基因产物也采用KpnI和XhoI双酶切，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目标条带，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μlSolution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，pP43NMK/glmU质粒构建成功。在pP43NMK/glmU质粒基础上，按上述操作分别进行glmM、glmS和pgi基因的组装：pP43NMK/glmU质粒采用XbaI和XhoI进行双酶切，而glmM片段的PCR产物采用SpeI和XhoI双酶切，此步采用一对同尾酶进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，结果比对正确，pP43NMK/glmU-glmM质粒构建成功。
上述所有质粒进行测序比对，结果正确。分别转化ZHHER168菌株，获得2个重组枯草芽孢杆菌菌株：ZHHER168/pP43NMK/glmU，ZHHER168/pP43NMK/glmU-glmM。
实施例4重组枯草芽孢杆菌菌株的摇瓶发酵
挑取上述构建的5个重组菌株：ZHHER168、ZHHER168/pP43NMK/tuaD、ZHHER168/pP43NMK/tuaD-gtaB、ZHHER168/pP43NMK/glmU、ZHHER168/pP43NMK/glmU-glmM，单克隆接种于5ml LB培养基，置于200rpm 37℃过夜培养。16h后接种于250ml三角摇瓶(装液量25ml)中，发酵培养基为无机盐培养基：2％酵母粉，5％蔗糖，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L。按10％的接种量转接于摇瓶，置于200rpm 37℃培养，在接种后第2h添加2g/L的木糖进行诱导KfiA和KfiC基因表达，发酵培养48h。
发酵液中肝素前体的收集，10000rpm下室温离心10min。发酵液上清转移置另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇充分混匀沉淀发酵液中的肝素前体。室温下静置1h，再10000rpm下室温离心20min，去除干净液体，沉淀加入发酵液等体积的1M NaCl溶液充分溶解，适当稀释后，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法检测肝素前体的含量。
从附图2看出，表达UDP-GlcNAc途径的合成从基因，肝素前体的产量逐渐提高，说明提高UDP-GlcNAc的浓度有助于肝素前体的合成，重组菌株ZHHER168/pP43NMK/glmU-glmM的产量最高，达到2.56g/L。而表达UDP-GlcUA途径的合成基因，随着表达基因的增多，肝素前体的产量有提高，重组菌株ZHHER168/pP43NMK/tuaD-gtaB产量达到1.94g/L。
肝素前体产物的平均分子量测定结果显示，过表达UDP-GlcNAc途径基因，提高UDP-GlcNAc的浓度，产物平均分子量逐步增大，平均分子量最高达到120000道尔顿。而提高UDP-GlcUA的浓度，产物平均分子量约在50000-80000道尔顿之间，而不表达前体基因的情况下，产物的平均分子量约为40000道尔顿，因此，前体途径基因的表达对肝素前体的合成产物的平均分子量有较大的影响。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种产肝素前体的的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是在枯草芽孢杆菌中表达编码α-糖基转移酶的基因和编码β-糖基转移酶的基因，构建合成肝素前体的途径。
2.根据权利要求1所述的的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为Bacillussubtilis 168。
3.根据权利要求1所述的的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述α-糖基转移和β-糖基转移酶的基因来源于巴斯德菌D型。
4.根据权利要求1-3任一所述的的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因重组整合在枯草芽孢杆菌基因组上，置于木糖诱导型启动子Pxly下诱导表达。
5.根据权利要求1-3任一所述的的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，还分别表达了UDP-N-乙酰氨基葡糖或UDP-葡糖醛酸的合成途径的基因，调控肝素前体的合成。
6.根据权利要求5所述的的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述UDP-N-乙酰氨基葡糖的合成途径包括编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，编码变位酶的基因glmM；所述UDP-葡糖醛酸的合成途径包括编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB；上述基因来源于巴斯德菌属(Pasteurella type D)、大肠杆菌(Escherichia coli)或芽孢杆菌(Bacillus)。
7.根据权利要求6所述的的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述分别表达了UDP-N-乙酰氨基葡糖或UDP-葡糖醛酸的合成途径的基因，包括以pP43NMK为表达载体表达基因glmU，或glmU及glmM，或tuaD，或tuaD及gtaB。
8.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌在发酵生产肝素前体中的应用方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是以pP43NMK为表达载体表达编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，或glmU及编码变位酶的基因glmM；并在基因组上以木糖诱导型强启动子Pxyl整合串联表达编码α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是以pP43NMK为表达载体表达编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，或tuaD及编码UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB，并在基因组上以木糖诱导型强启动子Pxyl整合串联表达编码α-糖基转移酶和β-糖基转移酶的基因。
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