CN114763518A - 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用 - Google Patents

发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114763518A
CN114763518A CN202111062175.1A CN202111062175A CN114763518A CN 114763518 A CN114763518 A CN 114763518A CN 202111062175 A CN202111062175 A CN 202111062175A CN 114763518 A CN114763518 A CN 114763518A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sulfotransferase
2ost
plasmids
gene
heparin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111062175.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114763518B (zh
Inventor
康振
张永淋
王阳
李江华
堵国城
陈坚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN202111062175.1A priority Critical patent/CN114763518B/zh
Priority to PCT/CN2022/081299 priority patent/WO2023035584A1/zh
Publication of CN114763518A publication Critical patent/CN114763518A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114763518B publication Critical patent/CN114763518B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01022—UDP-glucose 6-dehydrogenase (1.1.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01017—Glucuronosyltransferase (2.4.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07004—Sulfate adenylyltransferase (2.7.7.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
    • C12Y208/02—Sulfotransferases (2.8.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03017—Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase (5.1.3.17)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用，属于生物工程技术领域。本发明首先将肝素合成途径中的外源基因肝素前体合酶基因kfiC，α4‑N‑乙酰氨基葡糖转移酶酶基因kfiA和UDP‑葡萄糖脱氢酶编码基因tuaD分别整合到毕赤酵母和酿酒酵母基因组中，初步构建了肝素前体合成途径，之后分别在毕赤酵母和酿酒酵母中表达筛选并优化N‑脱乙酰磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5‑变构酶、磺酸乙酰肝素2‑磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6‑磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素3‑磺酸转移酶，得到合成不同磺酸化程度的磺酸乙酰肝素的生产菌株。本发明首次实现了利用微生物发酵碳源合成不同磺酸化程度的肝素。

Description

发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用
技术领域
本发明涉及发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
肝素(Heparin)是一种酸性、带负电荷且具有一定生物活性的长链线性多糖，由糖醛酸(GlcUA)和D-氨基葡萄糖(GlcNAc)经α-1,4、β-1,4糖苷键连接并经变构化、磺酸化修饰而成，硫酸乙酰肝素(HS)和肝素的复杂结构决定着其复杂的生物学功能。1937年，肝素首次作为抗凝血药物应用于临床研究，是八十年以来使用最广泛最有效的抗凝抗血栓之一。由于HS和肝素参与多种生物学功能的调控，在正常的生理条件下，HS和肝素广泛存在于细胞表面和细胞外基质，在体内则主要是HS与多种蛋白配体相互作用并发挥相应的生物活性。HS和肝素不仅是反应中的催化剂，更是接触系统和补体系统的关键调节剂，HS和肝素通过介导细胞信号转导和细胞间通讯的关键过程发挥作用，进而调节包括细胞发育在内的不同生物学活动，如病原体感染、细胞增殖和炎症反应。
NDST1是一种兼具脱乙酰和磺酸化修饰活性的双功能酶，能够将肝素前体的N-乙酰氨基葡萄糖残基的乙酰基脱掉形成氨糖(GlcNH2)，并对其进行磺酸化修饰生成N-脱乙酰基-磺酸化氨糖(GlcNS)。C5差向异构酶(C5-epi)能够使N-磺酸化肝素前体糖链骨架的D-GlcA异构化转变成为IdoA。C5的异构化在体内是不可逆反应，然而在体外酶法修饰中却是可逆反应。C5-epi转化GlcA为IdoA的同时也逆向将IdoA转化为GlcA。IdoA在肝素的抗凝血活性中扮演着极为重要的角色。2-O-ST是C5异构化后的磺酸化修饰酶，能够将多糖链的IdoA2-OH进行磺酸化修饰为Ido2S。值得注意的是，在人工构建的催化修饰体系中C5-epi和2-O-ST展现了一种相辅相成的关系：C5-epi的修饰作用能够促进2-O-ST的修饰，保证2-O-磺酸化程度的正常进行，同时2-OST也将转变C5-epi的可逆反应为不可逆。6-O-磺酸基团对抗凝血活性有重要修饰意义，含有6-O-磺酸基团、3-O-磺酸基团的产物仍对凝血酶和Xa因子具有部分抑制作用，而缺失6-O-磺酸基团的产物则完全失去了抗凝血活性。虽然6-O磺酸化转移酶有3种同工酶，但它们底物选择性上存在的差异较小，虽然6-O-ST-1更倾向选择修饰2-O-磺酸化的产物，但仅使用6-O-ST-1则难以保证6-O-磺酸化的比例，因此常选择多种同工酶混合进行催化修饰。肝素糖链骨架的3-O-磺酸基团决定了肝素产物是否具有抗凝血活性，在肝素功能活性的赋予上发挥了重要作用。
目前商品化的肝素主要来自于猪、牛等哺乳动物，但由于牛源肝素的活性要低于猪源肝素、20世纪90年代的疯牛病爆发等原因，猪小肠粘膜仍然是天然肝素的主要提取来源。虽然其他哺乳动物如羊、骆驼等也被尝试用于提取天然肝素。动物源肝素的结构和磺酸化程度容易受到环境因素、动物品种的影响而产生变异性，难以保持不同批次产物的统一性。动物组织来源的肝素作为临床上广泛使用的药物一直面临结构不稳定、成分复杂的问题。为了得到结构均一性较好、生物安全的肝素，利用微生物进行肝素的合成可以有效避免上述问题。目前国内外虽然有以肝素前体为底物合成肝素寡糖，但没有在微生物细胞中直接以葡萄糖、甘油、甲醇等碳源进行肝素合成的报道。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是现有的肝素成分复杂、结构不均一，常规酶法催化合成肝素过程是以动物源肝素或肝素前体物质为底物进行磺酸化修饰，操作过程繁琐且低效。
[技术方案]
本发明是在毕赤酵母中以葡萄糖或甘油为碳源实现肝素的一步法发酵合成，实现胞内产量为1.8g/L。为实现上述发明目的，肝素生产的基因工程菌的构建方法，本发明所采用的技术方案如下：
第一部分：毕赤酵母生产肝素基因工程菌的构建：
本发明的第一个目的是提供一种产肝素的基因工程菌，所述基因工程以酵母为宿主，在基因组中整合表达或利用质粒表达编码(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的核苷酸序列，其中：
(a)肝素前体合酶(KfiA、KfiC)、DP-葡萄糖脱氢酶(tuaD)；
(b)肝素前体合酶(KfiA、KfiC)、DP-葡萄糖脱氢酶(tuaD)、N－脱乙酰/N－磺酸转移酶(NDST1)及ATP磺酸化酶(MET13)；
(c)肝素前体合酶(KfiA、KfiC)、DP-葡萄糖脱氢酶(tuaD)、N－脱乙酰/N－磺酸转移酶(NDST1)、葡萄糖醛酸C5-变构酶(C5 epi)、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶(2-OST)及ATP磺酸化酶(MET13)；
(d)肝素前体合酶(KfiA、KfiC)、DP-葡萄糖脱氢酶(tuaD)、N－脱乙酰/N－磺酸转移酶(NDST1)、葡萄糖醛酸C5-变构酶(C5 epi)、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶(2-OST)、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶(6-OST)及ATP磺酸化酶(MET13)；
(e)肝素前体合酶(KfiA、KfiC)、DP-葡萄糖脱氢酶(tuaD)、N－脱乙酰/N－磺酸转移酶(NDST1)、葡萄糖醛酸C5-变构酶(C5-epi)、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶(2-OST)、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶(6-OST)、磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶(3-OST)及ATP磺酸化酶(MET13)。
在一种实施方式中，所述KfiA、KfiC分别是编码肝素前体合酶的基因，所述tuaD是编码UDP-葡萄糖脱氢酶(Genbank登录号为NP_391438.1)的基因。
在一种实施方式中，外源基因kfiA、kfiC、tuaD、NDST1、C5 epi、2-OST、6-OST、3-OST、MET13的核苷酸序列来源及其Genbank号如下表所示：
表1肝素合成相关途径基因来源及其Genbank号
Figure BDA0003257089530000021
Figure BDA0003257089530000031
在一种实施方式中，所述酵母为毕赤酵母或酿酒酵母及其突变或诱变菌株。
在一种实施方式中，所述酵母为毕赤酵母GS115或酿酒酵母S-CA。
在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于：pGAPZB、pAO815、pRS303、pRS304或pRS303。
本发明的第二个目的是提供构建所述生产肝素的基因工程菌的方法，所述方法将编码(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的核苷酸序列连接到毕赤酵母或酿酒酵母的基因组上。
在一种实施方式中，生产肝素的毕赤酵母的构建方法包括如下步骤：
(1)将KfiA、KfiC、tuaD基因利用Gibson组装连接到pGAPZB载体上，构建成pGAPZB-KfiA-T2A-KfiC-T2A2-tuaD质粒，其中T2A序列为：GAAGGTCGTGGTTCTCTTCTGACTTGTGGTGATGTTGAAGAAAACCCAGGTCCA，T2A2的序列为：GGATCCGGAGAAGGTCGTGGATCCCTACTTACTTGCGGTGACGTAGAGGAAAACCCTGGTCCG；
(2)将步骤(1)构建的pGAPZB-KfiA-T2A-KfiC-T2A2-tuaD线性化后转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，筛选阳性克隆，菌株命名为GS115/ACD；
(3)扩增潮霉素基因，将pGAPZB质粒上的博来霉素抗性基因替换为潮霉素基因，得到改造后的质粒命名为pGAPHyg，从S.cerevisiae基因组上扩增MET13基因，通过一步克隆组装连接到pGAPHyg载体上，构建成pGAPHyg-MET13质粒；分别扩增优化后的基因序列NDST1、C5-epi，将扩增产物利用Gibson组装依次连接到pGAPHyg-MET13载体上得到重组质粒pGAPHyg-NDST1-T2A-T2A2-MET13和pGAPHyg-NDST1-T2A-C5 epi-T2A2-MET13；
(4)将步骤(3)的质粒pGAPHyg-NDST1-T2A-T2A2-MET13和pGAPHyg-NDST1-T2A-C5epi-T2A2-MET13分别线性化后转化至GS115/ACD的感受态细胞，筛选阳性克隆，菌株分别命名为GS115/ACDNM、GS115/ACDNCM；
(5)分别以优化后的基因序列2-OST、6-OST、3-OST为模板，分别进行PCR扩增三个基因，利用Gibson组装依次连接到pAO815载体上，分别构建成pAO815-2OST、pAO815-2OST-6OST和pAO815-2OST-6OST-3OST质粒；
(6)制备重组菌株GS115/ACDNCM的感受态细胞，将获得的pAO815-2OST、pAO815-2OST-6OST和pAO815-2OST-6OST-3OST质粒分别用快切酶SalI线性化后分别整合到上述重组菌GS115/ACDNCM基因组中，用MD平板筛选获得阳性克隆，将得到新的菌株命名为GS115/ACDNC2M、GS115/ACDNC26M、GS115/ACDNC263M。
(7)将所获得重组酵母菌株GS115/ACD，GS115/ACDNM，GS115/ACDNCM、GS115/ACDNC2M、GS115/ACDNC26M、GS115/ACDNC263M分别在3-L发酵罐中发酵培养进行肝素的合成。
第二部分：酿酒酵母生产肝素基因工程菌的构建：
(1)以合成的基因tuaD，kfiA，kfiC为模板，分别进行PCR扩增三个基因，利用Gibson组装连接到pRS305载体上，构建成pRS305-kfiA-T2A-kfiC-T2A2-tuaD质粒，其中，T2A和T2A2序列设计在引物上；
(2)制备S.cerevisiae CEN.PK2-1C单倍体酿酒酵母感受态细胞，将上述获得的质粒pRS305-kfiA-T2A-kfiC-T2A2-tuaD电转化到感受态细胞中，通过亮氨酸缺陷平板筛选阳性克隆，得到整合了基因tuaD，kfiA和kfiC的菌株命名为S.c-ACD；
(3)扩增ATP磺酸化酶MET13，以在毕赤酵母中优化后的基因序列NDST1，C5 epi为模板，分别扩增NDST1、C5-epi，利用Gibson组装将三个基因依次连接到pRS303载体上，分别构建成pRS303-NDST1-T2A-MET13、pRS303-NDST1-T2A-C5 epi-P2A-MET13质粒；
(4)制备酿酒酵母S.c-DAC菌株感受态，将上述质粒RS303-NDST1-T2A-MET13、pRS303-NDST1-T2A-C5 epi-P2A-MET13线性化后分别转入S.c-DAC感受态细胞中，用色氨酸缺陷平板筛选获得阳性克隆，得到新的菌株分别命名为S.c-ACDNM和S.c-ACDNCM；
(5)以在毕赤酵母中优化后的基因序列2-OST、6-OST、3-OST为模板，分别组装到酿酒酵母游离表达载体pRS304上，构建成pRS304-2OST，pRS304-2OST-T2A-6OST，pRS304-2OST-T2A-6OST-T2A2-3OST质粒；
(6)制备酿酒酵母S.c-ACDNCM菌株感受态，将上述质粒pRS304-2OST，pRS304-2OST-T2A-6OST，pRS304-2OST-T2A-6OST-T2A2-3OST线性化后分别转入感受态细胞中，利用色氨酸缺陷平板筛选获得阳性克隆，得到新的菌株分别命名为S.c-ACDNC2M、S.c-ACDNC26M、S.c-ACDNC263M；
(7)将所获得酿酒酵母菌株S.c-DAC、S.c-DACMNC、S.c-DACMNC2、S.c-DACMNC6、S.c-DACMNC3和S.c-DACNC263分别在3-L发酵罐中发酵培养进行肝素的合成。
在一种实施方式中，所述缺陷型培养基平板(g/L)：酵母无机氮源培养基6.7，葡萄糖20，根据需要添加组氨酸、色氨酸、亮氨酸及尿嘧啶，使其在培养基中终浓度为50mg/mL，准备固体培养基时添加琼脂粉20g/L。
在一种实施方式中，所述发酵培养基组成为(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖40，MnSO4 2；磷酸钾缓冲液100mmol/L，pH6.0，100×氨基酸混合液10ml/L。
在一种实施方式中，所述发酵条件为：2vvm通气量、300-900rpm保证溶氧不低于30％，pH恒定维持在6，发酵48h后恒速流加无菌500g/L葡萄糖溶液，保证残糖维持在2-3g/L。
本发明的第三个目的是提供所述菌株在生产肝素或其衍生产品方面的应用。
本发明还要求保护含有所述基因工程菌的组合物。
在一种实施方式中，所述组合物包括但不限于细胞保护剂。
[有益效果]
1、本发明首先将肝素(Heparin)合成途径中的外源基因肝素前体合酶基因kfiC，α4-N-乙酰氨基葡糖转移酶酶基因kfiA和UDP-葡萄糖脱氢酶编码基因tuaD分别整合到毕赤酵母和酿酒酵母基因组中，初步构建了肝素前体(Heparin precursor)合成途径，之后分别在毕赤酵母和酿酒酵母中表达筛选并优化N-脱乙酰磺酸转移酶(NDST)、葡萄糖醛酸C5-变构酶(C5 epi)、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶(2-OST)、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶(6-OST)、磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶(3-OST)，将得到的高活性NDST1、C5 epi、2-OST、6-OST和3-OST序列分别或同时整合到上述产肝素菌株中得到合成不同磺酸化程度的磺酸乙酰肝素的生产菌株。本发明首次实现了利用微生物发酵碳源合成不同磺酸化程度的肝素。本发明的基因工程菌GS115/DAC肝素前体产量1.5g/L，分子量300kDa，GS115/DACNC脱乙酰肝素产量140mg/L，GS115/DACMNC2(2-OST)肝素产量50mg/L，GS115/DACMNC6(6-OST)肝素产量56mg/L，GS115/DACMNC3(3-OST)肝素产量60mg/L和GS115/DACMNC263肝素产量30mg/L，S.c-DACMNC肝素前体产量1.8g/L，S.c-DACMNC2(2-OST)肝素产量57mg/L，S.c-DACMNC6(6-OST)肝素产量59mg/L，S.c-DACMNC3(3-OST)肝素产量63mg/L和S.c-DACNC263肝素产量39mg/L。
2、本发明的毕赤酵母和酿酒酵母基因工程菌通过代谢甘油，甲醇或者葡萄糖直接合成肝素，实现了特定结构的不同磺酸化程度的肝素在微生物中的合成，肝素分子量为12-60kDa。所述不同磺酸化程度的肝素包含：30-80％未发生磺酸化(GlcA-GlcNAc)二糖基团，包含10-54％的N-磺酸化(GlcA-GlcNS)，16-65％的2-磺酸化(IdoA2S-GlcNS)二糖基团，12-84％的6-磺酸化(IdoA2S-GlcNS6S)二糖基团，10-43％的(GlcA-GlcNS6S)二糖基团，9-37％的(IdoA2S-GlcNAc6S)，8-41％的(GlcA-GlcNS)二糖基团，6-35％的(IdoA2S-GlcNAc)二糖基团。
3、本发明利用微生物细胞直接合成肝素，与传统组织提取法获得的肝素相比，产品结构均一，无潜在致病因子，产品结构使用LC-MS鉴定二糖结构，产品的质量及安全性得以保证。
4、本发明利用微生物直接合成肝素，与其他体外酶法催化合成肝素相比，简化了操作的繁琐性，避免了体外进行酶的提取纯化及后催化过程，显著的提高了生产效率，降低了成本。
附图说明
图1是基因工程菌株酵母生产肝素的代谢网络示意图。
图2是GS115/DAC生产肝素前体的LC-MS图。
图3是GS115/DACMNC263生产肝素的LC-MS图。
图4是S.c-DAC是生产肝素前体的LC-MS图
图5是S.c-DACNC263生产肝素的LC-MS图。
图6是GS115/ACDNC263M和S.c-ACDNC263M抗凝血活性图。
具体实施方式
本发明利用合成生物学技术和基因工程手段，分别以毕赤酵母GS115和酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1C为出发菌株，在酵母细胞内异源表达了肝素合成途径相关基因。
材料：
1.毕赤酵母GS115和酿酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2-1C为实验室保存或购买。
2.PrimeSTAR DNA聚合酶、磷酸化酶、DNAMarker、Solution I、AvrII等酶类试剂购自TaKaRa(大连)。
3.ClonExpress一步法定向克隆试剂盒购自Vazyme Biotech(南京)。
4.胶回收试剂盒，EcoRI，NotI，KpnI、SalI、AvrII等快切酶购自Thermo fisherScientific公司。
5.质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
6.各种分析纯试剂购自国药集团。
7.LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20。
8.LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
9.YPD培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。
10.BMGY培养基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，K2HPO4 3，KH2PO4 11.8，YNB 13.4，生物素4×10-4，甘油10mL。
11.BMMY培养基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，K2HPO4 3，KH2PO4 11.8，YNB 13.4，生物素4×10-4，甲醇5mL(用于重组毕赤酵母的诱导培养)。
12.毕赤酵母基因工程菌的发酵培养基每升含有：甘油40g，K2SO4 18g，MgSO4·7H2O 14.9g，KOH 4.13g，85％H3PO4 26.7mL，CaSO4·2H2O 0.93g，4.35mL PTM1微量元素溶液；其中，PTM1微量元素溶液每升含有：CuSO4·5H2O 6g，KI 0.09g，MnSO4·H2O 3g，H3BO30.02g，MoNa2O4·2H2O 0.2g，CoCl2·6H2O 0.5g，ZnCl2 20g，FeSO4·7H2O 65g，生物素0.2g，H2SO4 5.0mL。
13.酿酒酵母基因工程菌的发酵培养基每升含有：酵母粉10g；蛋白胨20g；葡萄糖40g；磷酸钾缓冲液100mmol，pH6.0，MnSO4 2g，100×氨基酸混合液10mL。其中，100×氨基酸混合液为：0.5g/L组氨酸、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L谷氨酰胺、0.5g/L蛋氨酸、0.5g/L赖氨酸、0.5g/L亮氨酸和0.5g/L异亮氨酸溶于100mL水中，过滤除菌。
14.实施例中设计的引物具体如表2所示。
表2引物序列表
Figure BDA0003257089530000071
Figure BDA0003257089530000081
实施例1：构建pGAPZB-KfiA-T2A-KfiC-T2A2-tuaD质粒和菌株GS115/ACD
(1)以酵母密码子优化的KfiA(SEQ ID NO.1)、KfiC(SEQ ID NO.2)、tuaD(SEQ IDNO.3)序列为模板，使用引物ptuaD-F/ptuaD-R，pkfiA-F/pkfiA-R，pkfiC-F/pkfiC-R分别扩增三个基因，利用Gibson组装连接到pGAPZB载体上，构建成pGAPZB-KfiA-T2A-KfiC-T2A2-tuaD质粒，其中T2A序列为：GAAGGTCGTGGTTCTCTTCTGACTTGTGGTGATGTTGAAGAAAACCCAGGTCCA，T2A2的序列为：GGATCCGGAGAAGGTCGTGGATCCCTACTTACTTGCGGTGACGTAGAGGAAAACCCTGGTCCG。
(2)将步骤(1)构建的pGAPZB-KfiA-T2A-KfiC-T2A2-tuaD使用快切酶AvrII线性化后转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，通过博来霉素抗性平板筛选阳性克隆，得到整合了基因kfiC、kfiA和tuaD的菌株，命名为GS115/ACD。
实施例2：构建pGAPHyg质粒
使用引物Hygr-F/Hygr-R扩增潮霉素基因获得Hyg片段，通过Gibson组装将pGAPZB质粒上的博来霉素抗性基因替换为潮霉素基因，将得到改造后的质粒命名为pGAPHyg。
实施例3：构建pGAPHyg-NDST1-T2A-T2A2-MET13、pGAPHyg-NDST1-T2A-C5 epi-T2A2-MET13质粒和菌株GS115/ACDNM、GS115/ACDNCM
(1)使用引物pMET13-F/pMET13-R从S.cerevisiae基因组上扩增MET13基因，通过一步克隆组装连接到pGAPHyg载体上，构建成pGAPHyg-MET13质粒；以引物pNDST-F/pNDST-R，pC5 epi-F/pC5 epi-R分别扩增优化后的基因序列NDST1(SEQ ID NO.4)、C5 epi(SEQ IDNO.5)，将扩增产物利用Gibson组装依次连接到pGAPHyg-MET13载体上得到重组质粒pGAPHyg-NDST1-T2A-T2A2-MET13和pGAPHyg-NDST1-T2A-C5 epi-T2A2-MET13：
(2)将步骤(1)的质粒pGAPHyg-NDST-T2A-T2A2-MET13和pGAPHyg-NDST1-T2A-C5epi-T2A2-MET13分别线性化后转化至GS115/ACD的感受态细胞，通过潮霉素抗性平板筛选阳性克隆，菌株分别命名为GS115/ACDNM、GS115/ACDNCM。
实施例4：构建pAO815-2OST，pAO815-2OST-6OST和pAO815-2OST-6OST-3OST质粒和菌株GS115/ACDNC2M、GS115/ACDNC26M、GS115/ACDNC263M
(1)分别以酵母优化后的基因序列2-OST(SEQ ID NO.6)、6-OST(SEQ ID NO.7)、3-OST(SEQ ID NO.8)为模板，以引物p2OST-F/p2OST-R，p6OST-F/p6OST-R，p3OST-F/p3OST-R，分别进行PCR扩增三个基因，利用Gibson组装依次连接到pAO815载体上，分别构建成pAO815-2OST，pAO815-2OST-6OST和pAO815-2OST-6OST-3OST质粒；
(2)制备重组菌株GS115/ACDNCM的感受态细胞，将获得的pAO815-2OST，pAO815-2OST-6OST和pAO815-2OST-6OST-3OST质粒分别用快切酶SalI线性化后整合到上述重组菌基因组中，用MD平板筛选获得阳性克隆，将得到新的菌株命名为GS115/ACDNC2M、GS115/ACDNC26M、GS115/ACDNC263M。
实施例5：毕赤酵母工程菌发酵产肝素及肝素类似物
将所获得重组酵母菌株GS115/ACD，GS115/ACDNM，GS115/ACDNC2M，GS115/ACDNC26M，GS115/ACDNC263M在3-L发酵罐中发酵培养进行肝素的合成。首先分区划线得到单菌落，挑取单菌落接种于5ml YPD液体培养基中，在30℃220rpm条件下培养16-18h，然后按10％接种量转接至三瓶50mLYPD液体培养基中，于30℃220rpm培养24h左右，然后按15％接种于含有1L发酵培养基的3-L发酵罐中，控制发酵温度为28℃，pH为5.5，通气量为4.0vvm，搅拌转速和溶氧相关联，控制溶氧在30％，搅拌转速在300-1000rpm。待发酵培养基中的甘油被消耗殆尽继续饥饿培养2-3h后，以恒速流加方式进行50％(v/v)甘油(含12mL/LPTM1)补料，补料速率为20mL·h-1·L-1，补料结束后继续饥饿培养2h，进入甲醇诱导阶段，转速不变。含12mL·L-1PTM1的甲醇用于流加诱导并且终浓度控制在18g/L，甲醇流加速率和培养基中甲醇终浓度由甲醇检测器实时在线控制。
实施例6：使用LC-MS检测细胞中的肝素：
(1)收集发酵结束后的菌体，使用去离子水洗涤菌体两遍后重悬菌体，采用高压匀浆破壁后离心得到胞内上清。将胞内上清置于65℃烘箱中加热沉淀部分蛋白，离心后去除沉淀，向上清中加入3倍预冷的无水乙醇沉淀肝素，搅拌均匀后离心得到沉淀。离心得到沉淀烘干后复溶于于20mM Tris-HCl(pH8.0)中即为肝素样品。产物使用HiPrep Q HP 16/10柱纯化。柱体积(CV)：20mL；流速：3mL·min-1；检测波长：210nm；平衡液：超纯水；洗脱液：含1mol·L-1NaCl的水溶液液；洗脱梯度：0-100mmol·mL-1NaCl，3CV(柱体积)；上样量：100mg肝素产物；分离程序：平衡-上样-清洗(冲洗样品中杂质)-洗脱-平衡，为一个循环。
(2)取600μl肝素样品，加入5μl肝素裂解酶I和III，置于37℃水浴锅中处理12h。将裂解后的溶液置于沸水加热10min使蛋白失活变性，离心后取上清进行LC-MS检测。
(3)LC-MS检测使用Acquity UPLC BEH Amide色谱柱(1.7μm，2.1×100mm，Waters,MA,USA)。洗脱液A为乙腈，洗脱液B为超纯水，使用氨水将pH值调节至10.4。所用的洗脱梯度设定如下：0-2分钟，5％B；2-3分钟，5-30％B；3-6分钟，30-60％B；6-8分钟，60％B。柱温保持在40℃，流速为0.2mL/min。在负离子模式下对m/z 100-800的质量范围进行扫描监测。肝素的二糖分子在负离子模式下质荷比应含有以下离子流：m/z：378.3，m/z：416.3，m/z：496.4，m/z：458.05，m/z：577.6。
发酵结束后，将细胞使用高压匀浆仪破碎细胞，离心取上清使用乙醇沉淀法醇沉两次，之后使用50mM Tris-HCl(pH7.4)重悬产物，使用硫酸咔唑法测得GS115/DAC肝素前体产量4g/L。其余菌株产物使用LC-MS检测，结果见表3。
表3毕赤酵母各个菌株不同位置磺酸化二糖组成
Figure BDA0003257089530000101
Figure BDA0003257089530000102
实施例7：构建成pRS305-kfiA-T2A-kfiC-T2A2-tuaD及酿酒酵母S.c-ACD的构建
(1)以合成的基因tuaD，kfiA，kfiC为模板，以引物sctuaD-F/sctuaD-R，sckfiC-F/sckfiC-R，sckfiA-F/sckfiA-R，分别进行PCR扩增三个基因，利用Gibson组装连接到pRS305载体上，构建成pRS305-kfiA-T2A-kfiC-T2A2-tuaD质粒，其中，T2A和T2A2序列设计在引物上；
(2)制备S.cerevisiae CEN.PK2-1C单倍体酿酒酵母感受态细胞，将上述获得的质粒pRS305-kfiA-T2A-kfiC-T2A2-tuaD电转化到感受态细胞中，通过亮氨酸缺陷平板筛选阳性克隆，得到整合了基因tuaD、kfiA和kfiC的菌株命名为S.c-ACD。
实施例8：构建成pRS303-NDST1-T2A-MET13、pRS303-NDST1-T2A-C5 epi-P2A-MET13及酿酒酵母S.c-ACDNM、S.c-ACDNCM的构建
(1)扩增ATP磺酸化酶MET13，以在酵母中优化后的基因序列NDST1，C5 epi为模板，分别以引物scNDST-F/scNDST-R，scC5epi-F/scC5epi-R，scMET13-F/scMET13-R进行PCR扩增两个基因，利用Gibson组装依次连接到pRS303载体上，分别构建成pRS303-NDST1-T2A-MET13、pRS303-NDST1-T2A-C5 epi-P2A-MET13质粒。
(2)制备酿酒酵母S.c-DAC菌株感受态，将上述质粒RS303-NDST1-T2A-MET13、pRS303-NDST1-T2A-C5 epi-P2A-MET13线性化后分别转入S.c-DAC感受态细胞中，用色氨酸缺陷平板筛选获得阳性克隆，得到新的菌株分别命名为S.c-ACDNM和S.c-ACDNCM。
实施例9：构建成pRS304-2OST，pRS304-2OST-T2A-6OST，pRS304-2OST-T2A-6OST-T2A2-3OST及酿酒酵母S.c-DACMNC6，S.c-DACMNC3和S.c-DACNC263的构建
(1)以在酵母中优化后的基因序列2-OST、6-OST、3-OST为模板，以引物sc2OST-F/sc2OST-R，sc6OST-F/sc6OST-R，sc3OST-F/sc3OST-R分别组装到酿酒酵母游离表达载体pRS304上，构建成pRS304-2OST，pRS304-2OST-T2A-6OST，pRS304-2OST-T2A-6OST-T2A2-3OST质粒。
(2)制备酿酒酵母S.c-ACDNCM菌株感受态，将上述质粒pRS304-2OST，pRS304-2OST-T2A-6OST，pRS304-2OST-T2A-6OST-T2A2-3OST线性化后分别转入感受态细胞中，色氨酸缺陷平板筛选获得阳性克隆，得到新的菌株分别命名为S.c-ACDNC2M，S.c-ACDNC26M，S.c-ACDNC263M。
实施例10：酿酒酵母工程菌发酵产肝素及肝素类似物
将所获得酿酒酵母菌株S.c-ACD，S.c-ACDNCM，S.c-ACDNC2M，S.c-ACDNC26M，S.c-ACDNC263M在3-L发酵罐中发酵培养进行肝素及其类似物的合成。
首先分区划线得到单菌落，挑取单菌落接种于50ml YPD液体培养基中，在30℃220rpm条件下培养16-18h至菌体OD600达到6左右，以初始OD600＝0.4转接于新鲜的250mlYPD液体培养基中，于30℃220rpm培养12h左右至菌体OD600在12左右，然后按15％接种于含有1L发酵培养基的3-L发酵罐中，控制发酵温度为30℃，pH为6，通气量为2vvm，搅拌转速和溶氧相关联，控制溶氧在30％，搅拌转速在300-900rpm。每隔6h取样测定葡萄糖浓度，并根据葡萄糖的消耗速度及时调整葡萄糖的流加量，使葡萄糖浓度稳定在1-2g/L。发酵周期为96h。其中，调节pH的酸液为10％的磷酸，碱液为20％的氨水。
发酵结束后，将细胞使用高压匀浆仪破碎细胞，离心取上清使用乙醇沉淀法醇沉两次，之后使用50mM Tris-HCl(pH7.4)重悬产物，使用硫酸咔唑法测得S.c-ACD肝素前体产量2.8g/L。根据实施例6中的方法使用LC-MS测定基因工程菌S.c-ACD，S.c-ACDNCM，S.c-ACDNC2M，S.c-ACDNC26M，S.c-ACDNC263M不同位置磺酸化所占比例，二糖组成如表4所示。
表4酿酒酵母各个菌株不同位置磺酸化二糖组成
Figure BDA0003257089530000111
Figure BDA0003257089530000112
Figure BDA0003257089530000121
实施例11：酵母生产肝素抗凝血活性测定
对实施例6和10中菌株GS115/ACDNC263M和S.c-ACDNC263M所获得的产物进行抗凝血活性测定，FXa因子和human ATIII使用含有1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的PBS稀释至60nM和0.65pM。显色底物S-2765(对于FXa分析)和S-2238(对凝血酶测定)溶于水制备成1mg/mL原液。测试用的寡糖用PBS稀释成浓度为100nM。首先将60μL ATIII和15μL寡糖溶液涡旋混匀，室温条件下孵肓2min后加入90μL Fxa溶液，室温条件下孵育4min，最后分别加入30μL显色底物S-2765和S-2238。在405nm条件下测量反应混合物的吸光度，将不同的样品浓度对初始反应速率作图计算测试寡糖的IC50，结果如图6所示。抗Xa/抗IIa比率为0.70-2.56。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用
<130> BAA190962A
<160> 49
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgattgttg caaatatgtc atcataccca cctcgaaaaa aagagttggt gcattctata 60
caaagtttac atgctcaagt agataaaatt aatctttgcc tgaatgagtt tgaagaaatt 120
cctgaggaat tagatggttt ttcaaaatta aatccagtta ttccagataa agattataag 180
gatgtgggca aatttatatt tccttgcgct aaaaatgata tgatcgtact tacagatgat 240
gatattattt accctcccga ttatgtagaa aaaatgctca atttttataa ttcctttgca 300
atattcaatt gcattgttgg gattcatggc tgtatataca tagatgcatt tgatggagat 360
cagtctaaaa gaaaagtatt ttcatttact caagggctat tgcgaccgag agttgtaaat 420
caattaggta cagggactgt ttttcttaag gcagatcaat taccatcttt aaaatatatg 480
gatggttctc aacgattcgt cgatgttaga ttttctcgct atatgttaga gaatgaaatt 540
ggtatgatat gtgttcccag agaaaaaaac tggctaagag aggtctcatc aggttcaatg 600
gaaggacttt ggaacacatt tacaaaaaaa tggcctttag acatcataaa agaaacacaa 660
gcaatcgcag gatattcaaa acttaacctc gaattagtgt ataatgtgga agggtaa 717
<210> 2
<211> 1563
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaacgcag aatatataaa tttagttgaa cgtaaaaaga aattagggac aaatattggt 60
gctcttgatt ttttattatc aattcataag gagaaagttg atcttcaaca taaaaactcg 120
cctttaaaag gtaacgataa ccttattcac aaaagaataa acgaatacga caatgtactt 180
gaactatcta agaatgtatc agctcagaat tctggcaatg agttttctta tttattggga 240
tatgcagatt ctcttagaaa agttggtatg ttggatactt atattaaaat tgtttgttat 300
ctaacaattc aatctcgtta ttttaaaaat ggcgaacgag ttaagctttt tgaacatata 360
agtaacgctc tacggtattc aaggagtgat tttctcatta atcttatttt tgaacgatat 420
atcgaatata taaaccatct aaaattgtcg cccaaacaaa aagattttta tttttgtacg 480
aagttttcaa aatttcatga ttatactaaa aatggatata aatatttagc atttgataat 540
caagccgatg cagggtatgg cctgacttta ttattaaatg caaacgatga tatgcaagat 600
agttataatc tactccctga gcaagaactt tttatttgta atgctgtaat agataatatg 660
aatatttata ggagtcaatt taacaaatgt ctacgaaaat acgatttatc agaaataact 720
gatatatacc caaataaaat tatattgcaa ggaattaagt tcgataagaa aaaaaatgtt 780
tatggaaaag atcttgttag tataataatg tcagtattca attcagaaga tactattgca 840
tactcattac attcattgtt gaatcaaaca tatgaaaata ttgaaattct cgtgtgcgat 900
gattgttcat cggacaaaag ccttgaaata attaagagca tagcttattc tgattcaaga 960
gtgaaagtat atagctcacg aaaaaaccaa ggcccttata atataagaaa tgagctaata 1020
aaaaaagcac acggtaattt catcaccttt caagatgcag atgatctttc tcatccggag 1080
agaatacaaa gacaagttga ggttcttcgc aataataagg ctgtaatctg tatggctaac 1140
tggatccgtg ttgcgtcaaa tggaaaaatt caattcttct atgatgataa agccacaaga 1200
atgtctgttg tatcgtcaat gataaaaaaa gatatttttg cgacagttgg tggctataga 1260
caatctttaa ttggtgcaga tacggagttt tatgaaacag taataatgcg ttatgggcga 1320
gaaagtattg taagattact gcagccattg atattggggt tatggggaga ctccggactt 1380
accaggaata aaggaacaga agctctacct gatggatata tatcacaatc tcgaagagaa 1440
tatagtgata tcgcggcaag acaacgagtg ttagggaaaa gtatcgtaag tgataaagat 1500
gtacgtggtt tattatctcg ctatggtttg tttaaagatg tatcaggaat aattgaacaa 1560
taa 1563
<210> 3
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaagaaaa ttgctgttat tggtactggt tatgttggtt tggtttctgg tacatgtttt 60
gcagaaatcg gtaataaggt tgtttgttgt gatatcgatg aatctaagat cagatcattg 120
aaaaatggtg ttattccaat ctatgaacca ggtttggctg atttggttga aaagaatgtt 180
ttggatcaaa gattgacttt tacaaacgat atcccatctg ctatcagagc atcagatatc 240
atctatattg ctgttggtac tccaatgtca aaaacaggtg aagcagattt gacttatgtt 300
aaagctgcag ctaagacaat cggtgaacat ttgaacggtt acaaagttat tgttaataag 360
tcaactgttc cagttggtac tggtaaattg gttcaatcta tcgttcaaaa agcatctaag 420
ggtagatact cattcgatgt tgtttctaac ccagaatttt tgagagaagg ttctgctatt 480
catgatacta tgaatatgga aagagcagtt attggttcta catcacataa agcagctgca 540
atcatcgaag aattgcatca accattccat gctccagtta ttaaaactaa tttggaatca 600
gcagaaatga tcaagtacgc tgcaaacgca tttttggcaa caaaaatttc ttttattaac 660
gatatcgcta atatttgtga aagagttggt gctgatgttt caaaagttgc agatggtgtt 720
ggtttggatt ctagaatcgg tagaaagttc ttgaaggctg gtatcggttt tggtggttca 780
tgttttccaa aagatactac agcattgttg caaatcgcta agtctgcagg ttaccctttt 840
aaattgattg aagctgttat tgaaacaaat gaaaagcaaa gagttcatat cgttgataaa 900
ttgttgactg ttatgggttc agttaagggt agaacaatct ctgttttggg tttggctttt 960
aaaccaaaca caaacgatgt tagatcagct ccagcattgg atatcatccc aatgttgcaa 1020
caattaggtg ctcatgttaa agcatatgat ccaattgcta ttccagaagc atctgcaatc 1080
ttgggtgaac aagttgaata ctacactgat gtttacgctg caatggaaga tactgatgca 1140
tgtttgatct tgacagattg gccagaagtt aaggaaatgg aattggttaa ggttaagaca 1200
ttgttgaagc aaccagttat tatcgatggt agaaatttgt tttcattaga agaaatgcaa 1260
gctgcaggtt atatctatca ttcaattggt agaccagctg ttagaggtac tgaaccatct 1320
gataaatact ttccaggttt gccattagaa gaattggcaa aagatttggg ttctgttaat 1380
ttgtaa 1386
<210> 4
<211> 2526
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgagaggtt tggaaccttc tgctgatgct cctgagccag attgtggaga tccaccacca 60
gttgctccat ctagattgtt gcctttgaag ccagttcaag ctgctactcc ttctagaact 120
gatccattgg ttttggtttt cgttgaatct ttgtactctc aattgggtca agaagttgtt 180
gctattttgg agtcttctag attcaagtat agaactgaga ttgctcctgg taaaggagat 240
atgccaactt tgactgataa gggtagaggt agatttgctt tgatcatcta cgaaaacatc 300
cttaagtatg ttaacttgga tgcttggaat agagagttgt tggataagta ctgtgttgct 360
tacggtgttg gtatcatcgg tttctttaag gctaacgaaa attctttgtt gtctgctcaa 420
ttgaagggtt ttccattgtt cttgcattct aacttgggtt tgaaggattg ttctattaat 480
cctaagtctc cattgttgta cgttactaga ccttctgaag ttgagaaagg tgttttgcca 540
ggagaggatt ggactgtttt ccaatctaac cattctactt atgaacctgt tttgttggct 600
aagaccagat cttctgagtc tattccacac ttgggtgctg atgctggttt gcatgctgct 660
ttgcacgcta ctgttgttca agatttgggt ttgcatgatg gtattcaaag agttttgttc 720
ggtaacaatt tgaacttctg gttgcacaag ttggtttttg ttgatgctgt tgctttcttg 780
actggtaaaa gattgtcttt gcctttggat agatacatct tggttgatat cgatgatatc 840
ttcgttggta aagaaggtac tagaatgaag gttgaggatg ttaaagcttt gttcgatact 900
caaaacgaat tgagagctca tatcccaaac ttcactttca atttgggtta ctctggtaaa 960
tttttccaca ctggtactaa tgctgaagat gctggagatg atttgttgtt gtcttacgtt 1020
aaggagtttt ggtggttccc tcatatgtgg tctcacatgc aaccacattt gtttcacaac 1080
caatctgttt tggctgaaca aatggctttg aataagaaat tcgctgttga gcatggtatt 1140
cctactgata tgggttatgc tgttgctcct catcactctg gtgtttaccc agttcacgtt 1200
caattgtatg aagcttggaa acaagtttgg tctattagag ttacttctac tgaagagtac 1260
cctcatttga agccagctag atatagaaga ggttttattc acaacggtat tatggttttg 1320
cctagacaaa cttgtggttt gtttactcat actattttct acaacgaata cccaggtggt 1380
tcttctgagt tggataagat tattaacggt ggtgaattgt ttttgactgt tttgttgaac 1440
ccaatctcta ttttcatgac tcacttgtct aactacggta acgatagatt gggtttgtac 1500
acttttaagc atttggttag attcttgcac tcttggacta acttgagatt gcaaactttg 1560
cctccagttc aattggctca aaagtacttc caaattttct ctgaagagaa ggatcctttg 1620
tggcaagatc catgtgaaga taagagacat aaggatatct ggtctaagga gaaaacttgt 1680
gatagattcc ctaagttgtt gatcattggt ccacaaaaga ctggtactac tgctttgtac 1740
ttgtttttgg gtatgcaccc tgatttgtct tctaactatc catcttctga aactttcgaa 1800
gagatccaat ttttcaacgg tcataactac cacaagggta tcgattggta catggagttt 1860
ttccctatcc catctaacac tacttctgat ttctacttcg aaaagtctgc taactacttc 1920
gattctgagg ttgctcctag aagagctgct gctttgttgc caaaggctaa ggttttgact 1980
atcttgatta atcctgctga tagagcttac tcttggtatc aacatcaaag agctcacgat 2040
gatccagttg ctttgaagta cactttccat gaagttatta ctgctggttc tgatgcttct 2100
tctaagttga gagctttgca aaacagatgt ttggttcctg gttggtacgc tactcatatt 2160
gaaagatggt tgtctgctta tcacgctaac caaatcttgg ttttggatgg taaattgttg 2220
agaactgagc cagctaaggt tatggatatg gttcaaaagt tcttgggtgt tactaacact 2280
atcgattacc ataagacttt ggctttcgat cctaagaaag gtttctggtg tcaattgttg 2340
gaaggtggta aaactaagtg tttgggtaaa tctaagggta gaaaataccc agagatggat 2400
ttggattcta gagctttctt gaaggattac tacagagatc acaacatcga attgtctaag 2460
ttgttgtaca agatgggtca aactttgcca acttggttga gagaggattt gcaaaatact 2520
agataa 2526
<210> 5
<211> 1758
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgagatgtt tggctgctgg tgttcattac aagactttga tcgttatctg tgctttgttg 60
tctttgttga ctgttttgtt gtggaacaaa tgtacttctg aaaaggcttt gagattcttg 120
ccacaacatc ctcaaccacc tccatctcca aaaattgatt ctcacccaca acaacctcaa 180
cctccagagc ctccacctgt tgttggtggt gttagatacg aagagatcga ttgtttgatt 240
aatgatgatg ctactattaa gggtagaaga gaaggttctg aggtttacat gccattctct 300
tggatggaaa agtacttcga ggtttacggt aaagttgttc aatacgatgg ttacgataga 360
ttcgaatttt ctcattctta ttctaaagtt tacgctcaaa gagagcaata tcaccctaac 420
ggtgttttta tgtctttcga aggttacaat gttgaggtta gagatcgtgt taagtgtatt 480
tctggtgttg aaggtgttcc attgtctact caatggggtc ctcaaggtta cttctacgct 540
atccaaatcg ctcaatacgg tttgtctcat tactctaaga acttgactga aagaccacct 600
cacgttgagg tttatgatac tgctgaagag agagattcta gatcttctgc ttggactgtt 660
ccaaaaggtt gttctttgac tagagtttac gataagacta gagctacttc tgttagagaa 720
ttttctgctc cagaaaactc tgagggtgtt tctttgcctt tgggtaacac taaggatttt 780
atcatctctt tcgatttgaa gtttacttct aacggttctg tttctgttat tttggaaact 840
actgagaaag gtccaccttt cgttatccat tacgttacta ctactcaatt gatcttgttg 900
aaggatagag atatcactta cggtattggt ccaagaacta cttggactac tgttactaga 960
gatttgttga ctgatttgag aaagggtatc ggtttgtcta acactaaggc tgttaaagct 1020
actaagacta tgcctagaag agttgttaag ttggttgttc atggtactgg tactatcgat 1080
aacatcacta tctctactac ttctcacatg gctgctttct atgctgcttc tgattggttg 1140
gttagaaatc aagatgaaag aggtggttgg ccaattatgg ttactagaaa attgggtgaa 1200
ggttttagag ctttggagcc tggttggtac tctgctatgg ctcaaggtca agctatgtct 1260
actttggtta gagcttattt gatgactaag gatgatagat acttgaaggc tgctttgaga 1320
gctactggtc cattcaagtt gccttctgag caacacggtg ttaaggctgt ttttatgaac 1380
aagtacgatt ggtatgaaga gtacccaact attccttctt ctttcgtttt gaacggtttt 1440
atctactctt tgatcggttt gttcgatttg gctcaaactg ctggtgaaaa gttgggtaga 1500
gatgctggtc aattgtactc taagggtatg gagtctttga aggttatgtt gccattgtat 1560
gatactggtt ctggtactat ctacgatttg agacatttca tcttgggtac tgctcctaac 1620
ttggctagat gggattatca tactactcac attaaccaat tgcaattgtt gggtactatc 1680
gataactctc caatttttag agattctgtt aagagatgga agtcttactt gaaaggtggt 1740
agagctaagc acaattaa 1758
<210> 6
<211> 897
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggatggtc ctagacaaga agttgctttg gatgaagaag atgatgttgt tattatttac 60
aacagagttc ctaagactgc ttctacttct ttcactaata ttgcttatga tttgtgtgct 120
aagaacagat accatgtttt gcatattaac actactaaga acaacccagt tatgtctttg 180
caagatcaag ttagatttgt taagaacgtt acttcttgga aggaaatgaa gccaggtttt 240
taccatggtc atgtttctta cttggatttt gctaagtttg gtgttaagaa gaagccaatt 300
tacattaacg ttattagaga tcctattgaa agattggttt cttactatta cttcttgaga 360
tttggtgatg attatagacc tggtttgaga agaagaaagc aaggtgataa gaagactttt 420
gatgaatgtg ttgctgctgg tggttctgat tgtgctcctg aaaaattgtg gttgcaaatt 480
ccattttttt gtggtcattc ttctgaatgt tggaatgttg gttctagatg ggctttggaa 540
caagctaaat ataatttgat taatgaatac tttttggttg gtgttactga agaattggaa 600
gattttatta tgttgttgga agctgctttg ccaagattct tcagaggtgc tactgaattg 660
tacagaactg gtaaaaaatc tcatttgaga aaaactactg aaaaaaaatt gccaactaaa 720
gaaactattg ctaaattgca acaatctgaa atttggaaaa tggaaaatga attctacgaa 780
ttcgctttgg aacaattcca attcgttaga gctcatgctg ttagagaaaa agatggtgaa 840
ttgtatattt tggctcaaaa tttcttctat gaaaaaattt atcctaaatc taattaa 897
<210> 7
<211> 1002
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggctttcg atatgaaagg tgaagatgtt attgtttttt tgcatattca aaagactggt 60
ggtactactt tcggtagaca tttggttcaa aatgttagat tggaagttcc ttgtgattgt 120
agacctggtc aaaaaaaatg tacttgttat agacctaata gaagagaaac ttggttgttc 180
tctagattct ctactggttg gtcttgtggt ttgcatgctg attggactga attgactaac 240
tgtgttccag gtgttttggg tagaagagaa tctgctccaa acagaactcc aagaaagttt 300
tactacatta ctttgttgag agatccagtt tctagatact tgtctgaatg gagacatgtt 360
caaagaggtg ctacttggaa aacttctttg catatgtgtg atggtagaac tcctactcca 420
gaagaattgc catcttgtta cgaaggtact gattggtctg gttgtacttt gcaagaattc 480
atggattgtc catacaactt ggctaacaac agacaagtta gaatgttggc tgatttgtct 540
ttggttggtt gttataatat gtctttcatt ccagaaaaca aaagagctca aattttgttg 600
gaatctgcta agaagaactt gaaggatatg gctttttttg gtttgactga atttcaaaga 660
aaaactcaat acttgtttga aagaactttt aacttgaagt ttattagacc atttatgcaa 720
tacaactcta ctagagctgg tggtgttgaa gttgataatg atactattag aagaattgaa 780
gaattgaatg atttggatat gcaattgtac gattacgcta aagatttgtt tcaacaaaga 840
taccaatata agagacaatt ggaaagaatg gaacaaagaa ttaagaatag agaagaaaga 900
ttgttgcata gatctaatga agctttgcca aaagaagaaa ctgaagaaca aggtagattg 960
ccaactgaag attacatgtc tcatattatt gaaaagtggt aa 1002
<210> 8
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgaagggtg gtactagagc tttgttggaa atgttgtctt tgcatccaga tgttgctgct 60
gctgaaaacg aagttcattt ttttgattgg gaagaacatt actctcaagg tttgggttgg 120
tacttgactc aaatgccatt ttcttctcca catcaattga ctgttgaaaa gactccagct 180
tactttactt ctcctaaagt tcctgaaaga attcattcta tgaatcctac tattagattg 240
ttgttgattt tgagagatcc ttctgaaaga gttttgtctg attatactca agttttgtac 300
aaccatttgc aaaagcataa gccataccca ccaattgaag atttgttgat gagagatggt 360
agattgaact tggattacaa ggctttgaac agatctttgt atcatgctca tatgttgaat 420
tggttgagat tcttcccttt gggtcatatt catattgttg atggtgatag attgattaga 480
gatcctttcc ctgaaattca aaaagttgaa agattcttga agttgtctcc acaaattaac 540
gcttctaatt tctatttcaa taagactaag ggtttctatt gtttgagaga ttctggtaag 600
gatagatgtt tgcatgaatc taaaggtaga gctcatcctc aagttgatcc taaattgttg 660
gataaattgc atgaatattt tcatgaacct aataaaaaat tttttaaatt ggttggtaga 720
acttttgatt ggcattaa 738
<210> 9
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caattgaaca actataggaa gccaccatga aaaaaatagc tgtcattgga acaggttatg 60
t 61
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gacatatttg caacaatcat tccggatcct tataaattga cgcttcccaa gtctttagcc 60
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaagcgtcaa tttataagga tccggaatga ttgttgcaaa tatgtcatca taccc 55
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tatattctgc gttcattccg gatccccctt ccacattata cactaattcg aggttaag 58
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
attagtgtat aatgtggaag ggggatccgg aatgaacgca gaatatataa atttagttga 60
acg 63
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
agtgcccaac ttgaactgag ctattgttca attattcctg atacatcttt aaacaaacca 60
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gaacaactat ttcgaaacga ggaattcatg aaaatcgaag aaggtaaact ggtaatctgg 60
<210> 16
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cggaccaggg ttttcctcta cgtcaccgca agtaagtagg gatcctctag tattttgcaa 60
atcttctctc aaccaagtag 80
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gagaagattt gcaaaatact agataaactt caagaggatg tcagaatgcc 50
<210> 18
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gtttttgttc tagaaagctg gcggccgctt aattatgttt agctctagaa cctttcaaat 60
aagatttcc 69
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aggttctaga gctaaacata atatgaagat cacagaaaaa ttagagcaac atagaca 57
<210> 20
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tttgttctag aaagctggcg gccgcttatt ataggcttag taggatggaa tggatttgat 60
c 61
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aagtgagacc ttcgtttgtg cggatccgac atggaggccc agaataccct ccttgacag 59
<210> 22
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
catgttggtc tccagcttgc atgccagtat agcgaccagc attcacatac gattga 56
<210> 23
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gaacaactat ttcgaaacga ggaattcgcc accatggatg gtcctagaca agaagttgct 60
ttg 63
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gttctagaaa gctggcggcc gcaatttttt catagaagaa attttg 46
<210> 25
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cgaacttctc tctgttaaag caagcaggag acgtggaaga aaaccccggt cctgctttcg 60
atatgaaagg tgaagatg 78
<210> 26
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gttctagaaa gctggcggcc gcccactttt caataatatg agacatgtaa tc 52
<210> 27
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gaacaactat ttcgaaacga ggaattcgcc accatgaagg gtggtactag agctttgttg 60
g 61
<210> 28
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gttctagaaa gctggcggcc gcatgccaat caaaagttct accaacc 47
<210> 29
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gttttaatta caaatctaga actagtggcc accttataaa ttgacgcttc ccaagtcttt 60
agcc 64
<210> 30
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ctagaactag cgcggccgct gatcagccac catgaaaaaa atagctgtca ttggaacag 59
<210> 31
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ctcccttacc cattccggat ccttgttcaa ttattcctga tacatcttta aacaaacc 58
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gtggaagggg gatccggaat gaacgcagaa tatataaatt tagttg 46
<210> 33
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ggattctaga actagtggat cccccggcca ccatgattgt tgcaaatatg tcatcatacc 60
cacc 64
<210> 34
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
ctaaatttat atattctgcg ttcattccgg atcccccttc cacattatac actaattcga 60
ggtta 65
<210> 35
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
taagttttaa ttacaaatct agaactagtg gccaccatgc ctgctttggc ttgtttgaga 60
agattgtgta gacatttgtc tc 82
<210> 36
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ttgaagttta tctagtattt tgcaaatctt ctctcaacca agtag 45
<210> 37
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ctaattattc gaaacgagga agccaccatg aaggctattc aatttccaag aagatcttct 60
tctg 64
<210> 38
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gtttttgttc tagaaagctg gcggccgctt aattatgttt agctctagaa cctttcaaat 60
aagatttcc 69
<210> 39
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ctttgatttg ttgaagcttg caggagatgt ggagagtaac cccggaccta tgaagatcac 60
agaaaaatta g 71
<210> 40
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ataagcttga tatcgaattc cttataggct tagtaggatg gaatggattt gatcatctg 59
<210> 41
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
taagttttaa ttacaaatct agaactagtg gccaccatgg atggtcctag acaagaagtt 60
gctttg 66
<210> 42
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt aattagattt aggataaatt ttttcataga 60
agaaattttg 70
<210> 43
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
cgaacttctc tctgttaaag caagcaggag acgtggaaga aaaccccggt cctgctttcg 60
atatgaaagg tgaagatg 78
<210> 44
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cgtgaatgta agcgtgacat aactaattac atgagctttc gatatgaaag gtgaagatg 59
<210> 45
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
agttttaaaa caccagaact tagtttcgaa tgaagggtgg tactagagct ttgttgg 57
<210> 46
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
cgtgacataa ctaattacat gactcgaggt atgccaatca aaagttctac caacc 55
<210> 47
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ggatccggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagacgtgga agaaaacccc 60
ggtcct 66
<210> 48
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gaaggtcgtg gttctcttct gacttgtggt gatgttgaag aaaacccagg tcca 54
<210> 49
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ggatccggag aaggtcgtgg atccctactt acttgcggtg acgtagagga aaaccctggt 60
ccg 63

Claims (10)

1.一种产肝素的基因工程菌，其特征在于，以酵母为宿主，在基因组中整合表达或利用质粒表达编码(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的核苷酸序列，其中：
(a)：肝素前体合酶、DP-葡萄糖脱氢酶；
(b)：肝素前体合酶、DP-葡萄糖脱氢酶、N－脱乙酰/N－磺酸转移酶及ATP磺酸化酶；
(c)：肝素前体合酶、DP-葡萄糖脱氢酶、N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶及ATP磺酸化酶；
(d)：肝素前体合酶、DP-葡萄糖脱氢酶、N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶及ATP磺酸化酶；
(e)：肝素前体合酶、DP-葡萄糖脱氢酶、N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶及ATP磺酸化酶。
2.根据权利要求1所述的一种产肝素的基因工程菌，其特征在于，肝素前体合酶来源于大肠杆菌，DP-葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌，N－脱乙酰/N－磺酸转移酶来源于人，葡萄糖醛酸C5-变构酶来源于斑马鱼，磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶来源于鸡，磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶来源于鸡，磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶来源于小鼠，ATP磺酸化酶来源于酿酒酵母。
3.根据权利要求1所述的一种产肝素的基因工程菌，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母或酿酒酵母及其突变或诱变菌株。
4.根据权利要求3所述的一种产肝素的基因工程菌，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母GS115或酿酒酵母S-CA。
5.根据权利要求1所述的一种产肝素的基因工程菌，其特征在于，所述质粒包括但不限于：pGAPZB、pAO815、pRS303、pRS304或pRS303。
6.产肝素的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，构建过程如下：
(1)将编码肝素前体合酶的基因、编码DP-葡萄糖脱氢酶的基因利用Gibson组装连接到pGAPZB载体上；
(2)将步骤(1)构建的重组载体线性化后转化至毕赤酵母感受态细胞中，筛选阳性克隆；
(3)扩增潮霉素基因，将pGAPZB质粒上的博来霉素抗性基因替换为潮霉素基因，得到改造后的质粒命名为pGAPHyg，将编码ATP磺酸化酶的基因组装连接到pGAPHyg载体上，构建成pGAPHyg-MET13；将编码N－脱乙酰/N－磺酸转移酶的基因、将编码葡萄糖醛酸C5-变构酶的基因利用Gibson组装依次连接到pGAPHyg-MET13载体上得到重组质粒pGAPHyg-NDST1-T2A-T2A2-MET13和pGAPHyg-NDST1-T2A-C5 epi-T2A2-MET13；
(4)将步骤(3)的质粒pGAPHyg-NDST1-T2A-T2A2-MET13和pGAPHyg-NDST1-T2A-C5epi-T2A2-MET13分别线性化后转化至步骤(2)得到的阳性克隆的感受态细胞中，筛选阳性克隆，菌株分别命名为GS115/ACDNM、GS115/ACDNCM；
(5)将编码磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶的基因、编码磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶的基因、编码磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶的基因利用Gibson组装依次连接到pAO815载体上，分别构建成pAO815-2OST、pAO815-2OST-6OST和pAO815-2OST-6OST-3OST质粒；
(6)制备重组菌株GS115/ACDNCM的感受态细胞，将获得的pAO815-2OST、pAO815-2OST-6OST和pAO815-2OST-6OST-3OST质粒分别用快切酶SalI线性化后分别整合到上述重组菌GS115/ACDNCM基因组中，筛选获得阳性克隆。
7.产肝素的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，构建过程如下：
(1)将编码肝素前体合酶的基因、编码DP-葡萄糖脱氢酶的基因利用Gibson组装连接到pRS305载体上，构建成pRS305-kfiA-T2A-kfiC-T2A2-tuaD质粒；
(2)制备酿酒酵母CEN.PK2-1C单倍体酿酒酵母感受态细胞，将步骤(1)获得的质粒pRS305-kfiA-T2A-kfiC-T2A2-tuaD转化到感受态细胞中，得到整合了基因tuaD、kfiA和kfiC基因的菌株S.c-ACD；
(3)将编码ATP磺酸化酶的基因、编码N－脱乙酰/N－磺酸转移酶的基因、编码葡萄糖醛酸C5-变构酶的基因，利用Gibson组装依次连接到pRS303载体上，分别得到pRS303-NDST1-T2A-MET13、pRS303-NDST1-T2A-C5 epi-P2A-MET13质粒；
(4)制备酿酒酵母S.c-DAC菌株感受态，将上述质粒RS303-NDST1-T2A-MET13、pRS303-NDST1-T2A-C5 epi-P2A-MET13线性化后分别转入S.c-DAC感受态细胞中，筛选获得阳性克隆，命名为S.c-ACDNM和S.c-ACDNCM；
(5)将编码磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶的基因、编码磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶的基因、编码磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶的基因组装到酿酒酵母游离表达载体pRS304上，构建成pRS304-2OST，pRS304-2OST-T2A-6OST，pRS304-2OST-T2A-6OST-T2A2-3OST质粒；
(6)制备酿酒酵母S.c-ACDNCM菌株感受态，将上述质粒pRS304-2OST，pRS304-2OST-T2A-6OST，pRS304-2OST-T2A-6OST-T2A2-3OST线性化后分别转入感受态细胞中，筛选获得阳性克隆。
8.构建产肝素的毕赤酵母基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将编码肝素前体合酶的基因、编码DP-葡萄糖脱氢酶的基因利用Gibson组装连接到pGAPZB载体上；
(2)将步骤(1)构建的重组载体线性化后转化至毕赤酵母感受态细胞中，筛选阳性克隆；
(3)扩增潮霉素基因，将pGAPZB质粒上的博来霉素抗性基因替换为潮霉素基因，得到改造后的质粒命名为pGAPHyg，将编码ATP磺酸化酶的基因组装连接到pGAPHyg载体上，构建成pGAPHyg-MET13；将编码N－脱乙酰/N－磺酸转移酶的基因、将编码葡萄糖醛酸C5-变构酶的基因利用Gibson组装依次连接到pGAPHyg-MET13载体上得到重组质粒pGAPHyg-NDST1-T2A-T2A2-MET13和pGAPHyg-NDST1-T2A-C5 epi-T2A2-MET13；
(4)将步骤(3)的质粒pGAPHyg-NDST1-T2A-T2A2-MET13和pGAPHyg-NDST1-T2A-C5epi-T2A2-MET13分别线性化后转化至步骤(2)得到的阳性克隆的感受态细胞中，筛选阳性克隆，菌株分别命名为GS115/ACDNM、GS115/ACDNCM；
(5)将编码磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶的基因、编码磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶的基因、编码磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶的基因利用Gibson组装依次连接到pAO815载体上，分别构建成pAO815-2OST、pAO815-2OST-6OST和pAO815-2OST-6OST-3OST质粒；
(6)制备重组菌株GS115/ACDNCM的感受态细胞，将获得的pAO815-2OST、pAO815-2OST-6OST和pAO815-2OST-6OST-3OST质粒分别用快切酶SalI线性化后分别整合到上述重组菌GS115/ACDNCM基因组中，筛选获得阳性克隆。
9.构建产肝素的酿酒酵母基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将编码肝素前体合酶的基因、编码DP-葡萄糖脱氢酶的基因利用Gibson组装连接到pRS305载体上，构建成pRS305-kfiA-T2A-kfiC-T2A2-tuaD质粒；
(2)制备酿酒酵母CEN.PK2-1C单倍体酿酒酵母感受态细胞，将步骤(1)获得的质粒pRS305-kfiA-T2A-kfiC-T2A2-tuaD转化到感受态细胞中，得到整合了基因tuaD、kfiA和kfiC基因的菌株S.c-ACD；
(3)将编码ATP磺酸化酶的基因、编码N－脱乙酰/N－磺酸转移酶的基因、编码葡萄糖醛酸C5-变构酶的基因，利用Gibson组装依次连接到pRS303载体上，分别得到pRS303-NDST1-T2A-MET13、pRS303-NDST1-T2A-C5 epi-P2A-MET13质粒；
(4)制备酿酒酵母S.c-DAC菌株感受态，将上述质粒RS303-NDST1-T2A-MET13、pRS303-NDST1-T2A-C5 epi-P2A-MET13线性化后分别转入S.c-DAC感受态细胞中，筛选获得阳性克隆，命名为S.c-ACDNM和S.c-ACDNCM；
(5)将编码磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶的基因、编码磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶的基因、编码磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶的基因组装到酿酒酵母游离表达载体pRS304上，构建成pRS304-2OST，pRS304-2OST-T2A-6OST，pRS304-2OST-T2A-6OST-T2A2-3OST质粒；
(6)制备酿酒酵母S.c-ACDNCM菌株感受态，将上述质粒pRS304-2OST，pRS304-2OST-T2A-6OST，pRS304-2OST-T2A-6OST-T2A2-3OST线性化后分别转入感受态细胞中，筛选获得阳性克隆。
10.权利要求1～7任一所述的基因工程菌在制备含肝素或其衍生产品的食品、药品、保健品中的应用。
CN202111062175.1A 2021-09-10 2021-09-10 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用 Active CN114763518B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111062175.1A CN114763518B (zh) 2021-09-10 2021-09-10 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用
PCT/CN2022/081299 WO2023035584A1 (zh) 2021-09-10 2022-03-17 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111062175.1A CN114763518B (zh) 2021-09-10 2021-09-10 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114763518A true CN114763518A (zh) 2022-07-19
CN114763518B CN114763518B (zh) 2023-04-28

Family

ID=82364845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111062175.1A Active CN114763518B (zh) 2021-09-10 2021-09-10 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114763518B (zh)
WO (1) WO2023035584A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023036103A1 (zh) * 2021-09-10 2023-03-16 江南大学 制备不同分子量肝素的磺酸化修饰体系构建及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004017910A2 (en) * 2002-08-23 2004-03-04 Neose Technologies, Inc. Total synthesis of heparin
CN104498420A (zh) * 2014-12-04 2015-04-08 江南大学 一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用
US20180298411A1 (en) * 2015-12-28 2018-10-18 Ajinomoto Co., Inc. Method of Producing Heparan Sulfate Having Anticoagulant Activity
CN112708569A (zh) * 2019-10-24 2021-04-27 华熙生物科技股份有限公司 发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040197868A1 (en) * 2001-05-08 2004-10-07 Deangelis Paul L. Heparin/heparosan synthase from P. multocida, soluble and single action catalysts thereof and methods of making and using same
EP3054005B1 (en) * 2013-10-02 2019-11-20 Ajinomoto Co., Inc. Heparosan-producing bacterium and heparosan manufacturing method
CN106754598B (zh) * 2016-12-14 2020-03-06 江南大学 一种高产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN107384990B (zh) * 2017-07-21 2020-05-08 江南大学 一种体外酶法催化肝素前体制备肝素的方法
CN109321508B (zh) * 2018-10-12 2022-12-27 北京化工大学 产heparosan的基因工程菌及其应用
WO2020219937A1 (en) * 2019-04-25 2020-10-29 University Of Utah Research Foundation E-coli strains for the production of heparosan and heparosan oligosaccharides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004017910A2 (en) * 2002-08-23 2004-03-04 Neose Technologies, Inc. Total synthesis of heparin
CN104498420A (zh) * 2014-12-04 2015-04-08 江南大学 一种产肝素前体的重组枯草芽孢杆菌及其应用
US20180298411A1 (en) * 2015-12-28 2018-10-18 Ajinomoto Co., Inc. Method of Producing Heparan Sulfate Having Anticoagulant Activity
CN112708569A (zh) * 2019-10-24 2021-04-27 华熙生物科技股份有限公司 发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ENGLAENDER, JA: "Expression and secretion of glycosylated heparin biosynthetic enzymes using Komagataella pastoris", 《APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》 *
XIANXUAN ZHOU: "Expression of heparan sulfate sulfotransferases in Kluyveromyces lactis and preparation of 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate", 《GLYCOBIOLOGY》 *
夏亚穆等: "肝素和硫酸乙酰肝素前体Heparosan的合成研究进展", 《化学与生物工程》 *
王畅等: "基于修饰Heparosan合成肝素的研究进展", 《生物技术进展》 *
金学荣 等: "基于合成生物学策略实现糖胺聚糖的微生物合成", 《中国科学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023036103A1 (zh) * 2021-09-10 2023-03-16 江南大学 制备不同分子量肝素的磺酸化修饰体系构建及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023035584A1 (zh) 2023-03-16
CN114763518B (zh) 2023-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112877272B (zh) 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法
CN107604023A (zh) 岩藻糖基转移酶及其应用
AU2019409833A1 (en) Production of 3-fucosyllactose and lactose converting alpha-1,3-fucosyltransferase enzymes
CN113832125B (zh) 一种烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用
WO2021122708A1 (en) Lactose converting alpha-1,2-fucosyltransferase enzymes
CN114763518B (zh) 发酵生产肝素的酵母工程菌的构建及其应用
WO1997020061A1 (en) Synthesis of hyaluronic acid
Taran et al. Enzymatic transglycosylation of natural and modified nucleosides by immobilized thermostable nucleoside phosphorylases from Geobacillus stearothermophilus
CN111926002B (zh) TrpE的突变体及其在产L-色氨酸的基因工程菌中的应用
CN112708569B (zh) 发酵生产硫酸软骨素的酵母工程菌及其应用
CN111996155A (zh) 一种提高l-组氨酸产生菌生产能力的方法
CN115335514A (zh) 罗汉果甙的生物合成
WO2023036103A1 (zh) 制备不同分子量肝素的磺酸化修饰体系构建及其应用
CN114990174B (zh) 一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法
JPWO2004009830A1 (ja) Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
US20110287488A1 (en) Novel n-acetylglucosamine-2-epimerase and method for producing cmp-neuraminic acid using the same
CN111534498B (zh) 歧化比活和aa-2g产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
JP3833584B2 (ja) Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法
CN115404226A (zh) 一种蔗糖合成酶及其在催化糖基化反应中的应用
CN114958790B (zh) 肝素骨架合酶及其突变体与应用
CN113528482B (zh) 高活性肝素骨架合酶PmHS2突变体及其应用
CN113564139B (zh) 巴氏杆菌肝素骨架合酶BtHS1及其突变体与应用
EP4198139A1 (en) Methods of production of heparosan, heparan sulfate and heparin in yeast
RU2338786C2 (ru) Способ получения 6-о-альфа-d-глюкопиранозил-d-сорбита
CN116622665A (zh) 一种生物催化生成o-糖苷的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Kang Zhen

Inventor after: Tang Chuangen

Inventor after: Chen Jian

Inventor after: Zhang Yonglin

Inventor after: Du Guocheng

Inventor after: Li Jianghua

Inventor after: Wang Yang

Inventor after: Zhang Teng

Inventor after: Wang Jing

Inventor after: Meng Jundong

Inventor before: Kang Zhen

Inventor before: Zhang Yonglin

Inventor before: Wang Yang

Inventor before: Li Jianghua

Inventor before: Du Guocheng

Inventor before: Chen Jian

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20220719

Assignee: NANJING HANXIN PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Assignor: Jiangnan University

Contract record no.: X2023980051870

Denomination of invention: Construction and Application of Yeast Engineering Bacteria for Fermented Production of Heparin

Granted publication date: 20230428

License type: Exclusive License

Record date: 20231213

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract