CN110643586B

CN110643586B - 一种肝素骨架合酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN110643586B
Application number: CN201910979457.4A
Authority: CN
Inventors: 生举正; 凌沛学; 王田田; 邓建群
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2039-10-15
Also published as: CN110643586A

Abstract

本发明涉及一种肝素骨架合酶及其编码基因与应用。本发明中的肝素骨架合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于卡氏杆菌，是一种催化糖基转移的功能酶。本发明中的肝素骨架合酶突变体，是将上述肝素骨架合酶的氨基酸序列中第56位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明中的肝素骨架合酶是一种全新来源的肝素骨架合酶，具备乙酰氨基葡萄糖的转移酶活性，并且可以利用底物GlcA‑pNP和UDP‑GlcNA有效的合成肝素二糖骨架，为进一步合成肝素糖链奠定了基础。

Description

一种肝素骨架合酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种肝素骨架合酶及其编码基因与应用，具体涉及来源于卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)的肝素骨架合酶、其高活性突变体及其编码基因与在肝素骨架合成中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)是由己糖醛酸或己糖和己糖胺组成的重复二糖单元，有规则的排列而形成的一种聚阴离子的直链多糖。糖胺聚糖分布广泛且种类繁多，主要包括透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素，肝素，硫酸角质素等。近些年来，人们从细菌，海洋生物中提取分离得到了类糖胺聚糖，几乎所有的糖胺聚糖中都含有-NAc、-COOH、-OH、-SO₃H等集团，这些集团对糖胺聚糖的生物活性起着至关重要的作用。

肝素(Heparin，简称HP)，是一种重要的糖胺聚糖，是由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位所构成的。它因首先从肝脏中发现而得名，肝素的临床用途十分广泛，除抗凝作用的多种运用外，还可用于治疗心绞痛、肾病综合征、严重烧伤、类风湿性关节炎等，其需求量在国际上常年处于生物技术药物领域的前列。

肝素有着巨大的药用价值，肝素的制备方法主要分为传统合成和生物合成。动物体来源的肝素是传统制备肝素的主要来源，主要是猪和牛的小肠中提取，但由于动物体来源的肝素屡发的肝素污染事件引发人们的担忧。天然肝素的基本单元的结构，数目各不相同，提取方法的不同也会导致不同的化学修饰，导致最后得到的肝素产物结构，构型，分子量各有异同，最终引起最终产物活性不均一，并且难以进行完善的质量监控。使肝素的品质和安全性都难以得到保障。除此之外，由动物衍生物中提取肝素难以得到肝素低聚物。

与化学合成法相比，通过肝素骨架合酶利用化学酶法合成糖链具有步骤相对简单，效率高等优点。目前为止，已确证具有N-乙酰氨基葡糖转移酶活性的微生物来源的肝素骨架合酶(N-Acetyl-D-glucosaminyltransferase)只有一种，是来源于大肠杆菌K5中的KfiA，不但限制了该酶家族酶学特性的理论研究，也限制了化学酶法合成肝素体系的规模化应用。

卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)在1950年首次被发现，包括鸭巴斯杆菌，输卵管炎放线杆菌和类溶血性巴氏杆菌类。搜索数据库并未见来源于该菌的糖胺聚糖骨架合酶基因被报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种肝素骨架合酶及其编码基因与应用，具体为一种来源于卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)中的肝素骨架合成酶GaGlcNAc-T及其突变体GaGlcNAc-T(N56D)与该酶在肝素骨架合成中的应用。

术语说明：

GlcA-pNP：中文全称为4-硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸，其作用是作为肝素寡糖合成的起始底物；

UDP-GlcNAc：中文全称为UDP-N-乙酰氨基葡萄糖，其作用是为肝素寡糖的合成提供乙酰葡萄糖胺供体；

UDP-GlcNTFA：中文全称为UDP-N-三氟乙酰氨基葡萄糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性提供叠氮乙酰氨基半乳糖供体；

UDP-GalNAz：中文全称为UDP-N-叠氮乙酰氨基半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性提供三氟乙酰氨基葡萄糖供体；

UDP-GalNAc：中文全称为UDP-N-乙酰氨基半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性提供乙酰氨基半乳糖糖供体；

UDP-Glc：中文全称为UDP-N-葡萄糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性提供葡萄糖供体；

UDP-Gal：中文全称为UDP-N-半乳糖，其作用是测定肝素骨架合酶的底物特异性提供半乳糖供体。

本发明技术方案如下：

一种肝素骨架合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中，所述肝素骨架合酶来源于卡氏杆菌(Gallibacterium anatis)，是一种催化糖基转移的功能酶。

一种肝素骨架合酶突变体，是将上述肝素骨架合酶的氨基酸序列中第56位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

一种重组载体，是在质粒载体上插入上述肝素骨架合酶的编码基因或者上述肝素骨架合酶突变体的编码基因。

根据本发明优选的，所述质粒载体为pET28a(+)。

本发明中，含有肝素骨架合酶编码基因或者含有肝素骨架合酶突变体编码基因的重组载体由南京金斯瑞公司合成。

一种重组菌株，是将上述重组载体转化入宿主细胞中获得的。

根据本发明优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌；进一步优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述肝素骨架合酶或者肝素骨架合酶突变体在合成肝素骨架中的应用，所述应用的步骤如下：将含有上述肝素骨架合酶编码基因或者含有上述肝素骨架合酶突变体编码基因的重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组菌株，然后进行细胞内诱导表达，纯化得肝素骨架合酶或者肝素骨架合酶突变体，将UDP-GlcNAc作为供体，GlcA-pNP作为起始受体，肝素骨架合酶或者肝素骨架合酶突变体催化反应生成结构为GlcNAc-GlcA-pNP的肝素骨架。

根据本发明优选的，所述催化反应的反应温度为30～40℃；进一步优选的，所述催化反应的反应温度为35～37℃。

根据本发明优选的，所述催化反应的反应时间为2～10h；进一步优选的，所述催化反应的反应时间为4h。

根据本发明优选的，所述催化反应的反应体系pH值为6.0～8.5；进一步优选的，所述催化反应的反应体系pH值为6.5。

本发明中未详细描述的实验操作均可按照本技术领域的常规实验操作进行。

有益效果

本发明公开的肝素骨架合酶GaGlcNAc-T，是一种全新来源的肝素骨架合酶，具备乙酰氨基葡萄糖的转移酶活性，可以利用底物GlcA-pNP和UDP-GlcNAc有效的合成肝素二糖骨架，而且肝素骨架合酶GaGlcNAc-T对其天然底物UDP-GlcNAc具有较强的底物特异性，为进一步合成肝素糖链奠定了基础。将肝素骨架合酶GaGlcNAc-T的氨基酸序列中第56位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，构建得到肝素骨架合酶突变体GaGlcNAc-T(N56D)，可以显著提高其转移酶活性。

附图说明

图1是肝素骨架合酶GaGlcNAc-T及其突变体GaGlcNAc-T(N56D)在重组大肠杆菌中可溶性表达目的蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图中，A为GaGlcNAc-T的SDS-PAGE检测结果图，B为GaGlcNAc-T(N56D)的SDS-PAGE检测结果图；

图2是以UDP-GlcNAc为供体底物，GlcA-pNP为起始受体底物时GaGlcNAc-T及GaGlcNAc-T(N56D)转换率柱状图；图中，纵坐标为转换率；

图3是肝素二糖GlcNAc-GlcA-pNP的质谱分析图谱；

图4是不同pH下肝素骨架合酶GaGlcNAc-T体外催化合成肝素骨架的相对得率曲线图；图中，纵坐标为反应产物的相对得率(以最佳反应组为100％)；

图5是不同金属离子条件下肝素骨架合酶GaGlcNAc-T体外催化合成肝素骨架的相对得率柱状图；图中，纵坐标为反应产物的相对得率(以最佳反应组为100％)；

图6、不同反应温度下肝素骨架合酶GaGlcNAc-T体外催化合成肝素骨架的相对得率曲线图；图中：纵坐标为反应产物的相对得率(以最佳反应组为100％)。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图，对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。除非特殊说明，本发明中所运用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。

发明人通过使用Blast序列比对进行生物信息学数据库搜索，发现卡氏杆菌(Gallibacteriumanatis)ATCC43329中一段基因形成的氨基酸序列与之前已经报道的肝素骨架合酶KfiA的氨基酸序列有69％的同源性，因此推测这段基因表达的蛋白产物可能具有肝素骨架合酶活性，在大肠杆菌表达系统中表达该蛋白，并将这段基因命名为GaGlcNAc-T，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其表达蛋白产物命名为GaGlcNAc-T，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明所采用的底物糖类试剂均购自于sigma公司和生工。所采用的HPLC检测方法均使用YMC的氨基柱，液相系统为日本岛津液相，紫外检测系统为SPD-20A。检测GaGlcNAc-T催化产物通过色谱柱分离后各组分在310nm和254nm的紫外吸收，HPLC流动相条件见表1：

表1检测肝素寡糖所使用HPLC分析方法

实施例1.肝素骨架合酶GaGlcNAc-T的制备

(1)表达菌株的构建

将含有肝素骨架合酶编码基因(SEQ ID NO.1)的重组载体pET28a-His-GaGlcNAc-T(南京金斯瑞公司合成)转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建重组菌株，在卡那霉素(100μg/mL)的LB平板上培养12h，筛选转化子(进行阴性对照实验)，活化获得GaGlcNAc-T阳性转化子；所述肝素骨架合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

将含有肝素骨架合酶突变体编码基因(SEQ ID NO.3)的重组载体pET28a-His-GaGlcNAc-T(N56D)(南京金斯瑞公司合成)转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建重组菌株，并且按照上述方法得到GaGlcNAc-T(N56D)阳性转化子；所述肝素骨架合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中肝素骨架合酶突变体编码基因(SEQ ID NO.3)是根据肝素骨架合酶突变体氨基酸序列(SEQ ID NO.4)经优化后人工合成得到的。

(2)GaGlcNAc-T及GaGlcNAc-T(N56D)的重组蛋白的表达和纯化

将GaGlcNAc-T阳性转化子和GaGlcNAc-T(N56D)阳性转化子的单菌落分别在30mL灭过菌的LB液体培养基中活化培养(37℃，225r/min)。将过夜活化培养的菌液按照1:100的体积比接入到LB液体培养基中扩大培养，按照1:1000的体积比加入卡那霉素(100μg/mL)，37℃，225r/min震荡培养大约3个小时至OD₆₀₀约为0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.2mM)，于20℃，225r/min条件下诱导16-18h。然后8000rpm离心30min收集菌体并用平衡缓冲液重悬，冰上超声破碎(工作3s，间歇5s，振幅33％，能量1500KJ，4℃)30min，将破碎后菌体10000rpm离心20min(4℃)两次，弃去沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤。运用镍柱通过组氨酸标签进行纯化，上样后用平衡缓冲液洗涤，然后用洗涤缓冲液洗掉多余的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液洗脱得到目的蛋白。纯化得到的蛋白质保存在20％甘油中，每管分装存于-80℃冰箱。

其中，平衡缓冲液的组分为：5mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl，pH7.35；

洗涤缓冲液的组分为：35mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl，pH7.05；

洗脱缓冲液的组分为：200mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl，pH7.05。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对纯化后的重组蛋白的表达情况进行鉴定(如图1所示)，GaGlcNAc-T阳性转化子和GaGlcNAc-T(N56D)阳性转化子重组表达后，经蛋白纯化，条带单一，且目的蛋白的分子量与肝素骨架合酶GaGlcNAc-T的理论值一致，为32KDa。

实施例2.肝素骨架合酶GaGlcNAc-T的活性验证

(1)肝素骨架合酶GaGlcNAc-T的GlcNAc转移酶活性验证

用商业化GlcA-pNP(终浓度为0.2mM)作为受体底物，UDP-GlcNAc(终浓度为0.3mM)作为供体底物，以实施例1制备得到的肝素骨架合酶GaGlcNAc-T和肝素骨架合酶突变体GaGlcNAc-T(N56D)为蛋白酶进行反应，反应体系如表2所示；该反应置于37℃水浴锅中反应4h，沸水加热5min使蛋白酶失活从而终止反应，反应液用0.22μm的滤膜过滤后按照表1所述方法进行HPLC检测，单糖受体的pNP基团在紫外310nm检测波长下有特异性吸收，流动相流速为0.5mL/min。

表2.GaGlcNAc-T的GlcNAc转移酶活性验证反应体系

检测结果见图2，肝素骨架合酶GaGlcNAc-T及其突变体GaGlcNAc-T(N56D)具有GlcNAc转移酶活性，能将GlcNAc基团转移到GlcA-pNP的非还原端，生成肝素二糖GlcNAc-GlcA-pNP，且突变体GaGlcNAc-T(N56D)的活性更强。

(2)肝素二糖GlcNAc-GlcA-pNP的质谱确证

为了确证上述活性反应的产物结构为GlcNAc-GlcA-pNP，随后进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。反应以较大规模进行以获得足够的二糖产物。产物通过P2柱进行纯化，然后在Thermo LCQ-Deca上进行MS分析。MS的所有样品都是通过溶解在50％甲醇中制备的。MS实验在负离子模式下进行，喷雾电压为5kV，毛细管温度为275℃。

质谱分析结果如图3所示，MS图谱中得到了与GlcNAc-GlcA-pNP(M_w＝518.14)脱去一个质子后分子量相符合的峰(517.48)，并且其二倍峰(1035.24)同时被检测到，证明产物GlcNAc-GlcA-pNP的生成。

实施例3肝素骨架合酶GaGlcNAc-T的性质研究

(1)酶的体外反应最适反应pH测定

反应体系如表2所示，以实施例1制备得到的肝素骨架合酶GaGlcNAc-T为蛋白酶，除缓冲液pH外其他都不变，将Tris-HCl缓冲液换成不同pH值的Tris-HCl/PBS/MES缓冲液，分别设置3.0，4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，10共计9个pH梯度点，每个梯度三组平行。其余处理条件同实施例2。

结果如图4所示，结果表明肝素骨架合酶GaGlcNAc-T在广泛的pH范围内(6.0-8.5)具有活性，反应的最适pH为6.5。

(2)酶的体外反应最适金属离子的测定

反应体系如表2所示，以实施例1制备得到的肝素骨架合酶GaGlcNAc-T为蛋白酶，除金属离子外其他都不变，同时将Mn²⁺换成相同浓度的离子Mg²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺，Fe²⁺，K⁺，Ba²⁺，Zn² ⁺进行反应，每种离子三个平行实验组，设置空白对照(W/O)。其余处理条件同实施例2。

结果如图5所示，结果说明，肝素骨架合酶GaGlcNAc-T在Mn²⁺存在的情况下活性最佳，不加任何离子时反应程度较弱。

(3)反应温度对酶活影响的研究

反应体系如表2所示，以实施例1制备得到的肝素骨架合酶GaGlcNAc-T为蛋白酶，反应温度设置4℃，10℃，20℃，25℃，30℃，37℃，45℃，55℃共8个温度梯度点进行反应，每个温度梯度三组平行实验，反应体系在最佳pH值且添加离子为最适离子。测定反应温度对酶活力的影响。

结果如图6所示，表明肝素骨架合酶GaGlcNAc-T在30-40℃之间催化合成二糖的相对得率均在70％以上，肝素骨架合酶GaGlcNAc-T反应的最适温度应为35～37℃。

实施例4肝素骨架合酶GaGlcNAc-T的供体特异性研究

为了确定肝素骨架合酶GaGlcNAc-T的底物特异性，使用商业化GlcA-pNP作为受体，UDP-GlcNAc和其他种类结构类似的各种UDP-糖作为供体(UDP-GalNAc，UDP-Glc，UDP-Gal，UDP-GlcNTFA，UDP-GalNAz，UDP-GlcNAz)，按照表2的体系进行反应。所有反应均在37℃水浴中进行4小时。最后反应产物按照表1所述的方法通过HPLC分析。

结果如表3所示，表明当受体是单糖GlcA-pNP时，在实验组所有的单糖供体中，肝素骨架合酶GaGlcNAc-T除了其天然底物UDP-GlcNAc外，还可以以UDP-GlcNTFA、UDP-GalNAc为底物，但反应程度较弱，说明本发明中的肝素骨架合酶GaGlcNAc-T对天然底物UDP-GlcNAc具有较强的底物特异性。

表3.GaGlcNAc底物特异性分析结果

注：N.D.代表该底物不能被GaGlcNAc-T催化。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种肝素骨架合酶及其编码基因与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> Gallibacterium anatis

<400> 1

atgattattg ctaatatggc aacttttcca acaaggaagg atattgttat aaaggttatt 60

caatctttac ataaacaagt agatttactg aacctttgtt tgaatgaatt tacatctatt 120

cctaaagaat atgctaagtt ctctaaattg aatcctatta ttcctaataa agattataag 180

gatgtaggta aatttataca tcctatagta ttagatgctt cttatatctt agttgatgat 240

gacattattt atcctcctaa ttatgtagca catctacaat atttttatga aaaatttaaa 300

aacttgaata ttgttgtcgg tacgcacggc gttatatatt ccgatattta caatggttca 360

tttaaagcaa gaaaagtttt ttcatttaga caggccttag ataaagtaag agtggtaaat 420

caattaggta caggaactgt ttttttgaaa ggttatcaat taccctcatt atcttatatg 480

gagggttcac aaaaatatgt tgatgtgaga tttagtaaat atttatatga gaataatata 540

tctttattgt gtgttcctag agaggctaac tggcaaaaag aaataacagt agaggattca 600

atcttctcca gttttactaa aaaatggcca agtgaaatta ttaaagaagt acaagtcata 660

tcaggatact caaaattaaa attttctgta gtaaaacaaa ttgaattaga tgaattaatt 720

tcttat 726

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> Gallibacterium anatis

<400> 2

Met Ile Ile Ala Asn Met Ala Thr Phe Pro Thr Arg Lys Asp Ile Val

1 5 10 15

Ile Lys Val Ile Gln Ser Leu His Lys Gln Val Asp Leu Leu Asn Leu

20 25 30

Cys Leu Asn Glu Phe Thr Ser Ile Pro Lys Glu Tyr Ala Lys Phe Ser

35 40 45

Lys Leu Asn Pro Ile Ile Pro Asn Lys Asp Tyr Lys Asp Val Gly Lys

50 55 60

Phe Ile His Pro Ile Val Leu Asp Ala Ser Tyr Ile Leu Val Asp Asp

65 70 75 80

Asp Ile Ile Tyr Pro Pro Asn Tyr Val Ala His Leu Gln Tyr Phe Tyr

85 90 95

Glu Lys Phe Lys Asn Leu Asn Ile Val Val Gly Thr His Gly Val Ile

100 105 110

Tyr Ser Asp Ile Tyr Asn Gly Ser Phe Lys Ala Arg Lys Val Phe Ser

115 120 125

Phe Arg Gln Ala Leu Asp Lys Val Arg Val Val Asn Gln Leu Gly Thr

130 135 140

Gly Thr Val Phe Leu Lys Gly Tyr Gln Leu Pro Ser Leu Ser Tyr Met

145 150 155 160

Glu Gly Ser Gln Lys Tyr Val Asp Val Arg Phe Ser Lys Tyr Leu Tyr

165 170 175

Glu Asn Asn Ile Ser Leu Leu Cys Val Pro Arg Glu Ala Asn Trp Gln

180 185 190

Lys Glu Ile Thr Val Glu Asp Ser Ile Phe Ser Ser Phe Thr Lys Lys

195 200 205

Trp Pro Ser Glu Ile Ile Lys Glu Val Gln Val Ile Ser Gly Tyr Ser

210 215 220

Lys Leu Lys Phe Ser Val Val Lys Gln Ile Glu Leu Asp Glu Leu Ile

225 230 235 240

Ser Tyr

<210> 3

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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ccgaaagaat atgcgaagtt tagcaaactg aacccgatca ttccggataa ggactacaaa 180

gatgtgggca agtttatcca cccgattgtt ctggacgcga gctacatcct ggtggacgat 240

gacatcattt acccgccgaa ctatgttgcg cacctgcagt acttctacga gaagttcaag 300

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ttcaaggcgc gtaaagtttt cagctttcgt caggcgctgg acaaagtgcg tgtggttaac 420

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<213> 人工序列

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85 90 95

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Phe Arg Gln Ala Leu Asp Lys Val Arg Val Val Asn Gln Leu Gly Thr

130 135 140

Gly Thr Val Phe Leu Lys Gly Tyr Gln Leu Pro Ser Leu Ser Tyr Met

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Glu Gly Ser Gln Lys Tyr Val Asp Val Arg Phe Ser Lys Tyr Leu Tyr

165 170 175

Glu Asn Asn Ile Ser Leu Leu Cys Val Pro Arg Glu Ala Asn Trp Gln

180 185 190

Lys Glu Ile Thr Val Glu Asp Ser Ile Phe Ser Ser Phe Thr Lys Lys

195 200 205

Trp Pro Ser Glu Ile Ile Lys Glu Val Gln Val Ile Ser Gly Tyr Ser

210 215 220

Lys Leu Lys Phe Ser Val Val Lys Gln Ile Glu Leu Asp Glu Leu Ile

225 230 235 240

Ser Tyr

Claims

1.一种肝素骨架合酶突变体，其特征在于，所述肝素骨架合酶突变体是将如SEQ IDNO.2所示的肝素骨架合酶的氨基酸序列中第56位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，所述肝素骨架合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述肝素骨架合酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体是在质粒载体上插入权利要求1所述的肝素骨架合酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述质粒载体为pET28a(+)。

4.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是将权利要求2所述的重组载体转化入宿主细胞中获得的。

5.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.权利要求1所述的肝素骨架合酶突变体在合成肝素骨架中的应用，其特征在于，所述应用的步骤如下：将含有权利要求1所述的肝素骨架合酶突变体编码基因的重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组菌株，然后进行细胞内诱导表达，纯化得肝素骨架合酶突变体，将UDP-GlcNAc作为供体，GlcA-pNP作为起始受体，肝素骨架合酶突变体催化反应生成结构为GlcNAc-GlcA-pNP的肝素骨架。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化反应的反应温度为30～40℃。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化反应的反应时间为2～10h。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化反应的反应体系pH值为6.0～8.5。