CN110208533A - Pkal-介导的病症的评估、测定和治疗 - Google Patents

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Abstract

本申请的名称是PKAL‑介导的病症的评估、测定和治疗。本发明提供检测结合血浆激肽释放酶、因子XII或两者的血浆蛋白酶C1抑制剂(C1‑INH)的测定方法，及其用于鉴别处于pKal‑介导的或缓激肽‑介导的病症的风险或患有pKal‑介导的或缓激肽‑介导的病症的受试者的用途。提供的方法允许分析患有血浆激肽释放酶‑介导的血管性水肿(KMA)的患者或可用于评估和治疗的pKal介导的其他疾病的患者。

Description

PKAL-介导的病症的评估、测定和治疗
本申请为申请日是2014年1月17日、申请号是2014800169573(PCT/US2014/012090)、发明名称为“PKAL-介导的病症的评估、测定和治疗”的中国申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年1月20日提交的美国临时申请号61/754,600的申请日的权益。该参考申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
血浆激肽释放酶(pKal)是循环中主要产生的缓激肽的酶。经接触系统发生pKal的激活，这已经与遗传性血管性水肿(HAE)相关的疾病病理学联系起来。缓激肽是疼痛、炎症、水肿和血管生成的关键介体。
血浆蛋白酶C1抑制剂(也称为C1-抑制剂或C1-INH)是蛋白酶抑制剂，其属于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族。其主要功能是抑制补体系统，以防止自发激活。I和II型遗传性血管性水肿由C1-INH的遗传缺陷引起，这导致缓激肽过量产生。
发明内容
为了研究C1-INH，当前可用的功能诊断测定采用激活的C1s的抑制，因而采用补体系统的抑制。本公开是基于新诊断测定的开发，其应用对PKal、FXII或两者的抑制，从而应用PKal-介导的信号传导途径。令人惊讶的，本文描述的诊断测定成功区分了100％的患有I和II型HAE的患者与对照患者。
因此，本公开的一个方面特征在于方法，其包括：
(a)使含血浆蛋白酶C1抑制剂(C1-INH)的样品与捕获试剂接触，和(b)测量与捕获试剂结合的样品中C1-INH的水平。捕获试剂包括：i)活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段，ii)活性形式的血浆激肽释放酶或其C1-INH-结合片段或iii)i)和ii)的组合。例如，捕获试剂可以是活性形式的因子XII、活性形式的血浆激肽释放酶或其组合。用于本文所述测定的任何捕获试剂均可固定在基质上。
在一些实施方式中，与捕获剂结合的C1-INH的水平利用结合C1-INH的检测剂例如结合C1-INH的抗体测量。在一些实施方式中，与捕获剂结合的C1-INH的水平通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量。
含C1-INH的样品(例如血液样品或血浆样品)可获自受试者。在一些实例中，受试者具有pKal-介导的病症的症状，其可以是水肿、肿胀的复发性发作；肿胀，其中所述肿胀完全或主要是外周的；荨麻疹；在没有感染的迹象的情况下发红、疼痛和肿胀；或非组胺-介导的水肿。在其他实例中，受试者耐受抗组胺疗法、皮质类固醇疗法或两者。在再其他的实例中，在收集样品时，受试者没有pKal介导的病症的症状、没有pKal介导的病症的症状的历史或没有pKal介导的病症的历史。
在一些实施方式中，本文所述的方法进一步包括：如果样品中与捕获试剂结合的C1-INH的水平与参考值相比降低，则将所述受试者鉴别为处于Kal-介导的病症的风险或患有Kal-介导的病症。pKal-介导的病症可以是组胺依赖性特发性血管性水肿、类风湿性关节炎、克罗恩病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、败血症性休克、烧伤、脑缺血性/再灌注损伤、脑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、黄斑性水肿、血管炎、动脉或静脉血栓形成、与心室辅助设备或支架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素-诱导的血小板减少症、血栓栓塞病和伴随不稳定的心绞痛的冠心病、水肿、眼病、痛风、肠疾病(intestinal bowel disease)、口腔粘膜炎、神经病痛、炎性疼痛、椎管狭窄退行性脊柱病、术后肠梗阻(post operativeileus)、主动脉瘤、骨关节炎、遗传性血管性水肿(HAE)、肺栓塞、中风、头部创伤或瘤周脑水肿、脓毒症、急性大脑中动脉(MCA)缺血性事件(中风)、再狭窄、系统性红斑狼疮肾炎、自身免疫疾病、炎性疾病、心血管疾病、神经疾病、与蛋白质错折叠相关的疾病、与血管生成相关的疾病、高血压肾病和糖尿病性肾病、变应性疾病和呼吸疾病或组织损伤。在一些实例中，pKal-介导的病症是HAE。
如果所述受试者被鉴定为处于Kal-介导的病症(例如HAE)的风险或患有Kal-介导的病症(例如HAE)，本文所述的方法可进一步包括向受试者施用有效量的治疗剂，其中治疗剂选自激肽释放酶结合剂；缓激肽B2受体拮抗剂和C1-INH取代剂。在一些例子中，治疗剂是DX-88、DX-2930或EPIKAL-2。
本公开另外的方面特征在于治疗患有pKal-介导的病症(例如HAE)的受试者(例如人患者)的方法，方法包括向受试者施用有效量治疗剂，其是激肽释放酶结合剂、缓激肽B2受体拮抗剂或C1-INH取代剂。待通过该方法治疗的受试者具有与参考值相比降低水平的能够结合捕获试剂的C1-INH。捕获试剂包括：i)活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段；ii)活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段或iii)i)和ii)的组合。受试者的C1-INH水平可通过本文所述的任何测定方法测定。
在一些实例中，治疗剂是DX-88、DX-2930或EPIKAL-2。
还包括在本公开范围内的是药物组合物，其用于治疗患有pKal-介导的病症(例如HAE)和具有与参考值相比降低水平的能够结合捕获试剂的C1-INH的受试者(例如人患者)。药物组合物包括用于治疗病症的治疗剂，其可以是激肽释放酶结合剂、缓激肽B2受体拮抗剂或C1-INH取代剂；和药学上可接受的载体。本公开还提供本文所述的药物组合物在制备用于治疗pKal-介导的病症诸如HAE的药物中的用途。在另外的方面中，本公开提供试剂盒，其用于检测能够结合捕获试剂的血浆蛋白酶C1抑制剂(C1-INH)。试剂盒可包括：a)捕获试剂，其包括：
i)活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段；
ii)活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段；或
iii)i)和ii)的组合；和
b)结合C1-INH的检测试剂，和任选的c)C1-INH。
在一些实施方式中，捕获试剂——其可以是FXIIa、活性形式的PKal或其组合——被固定在基质上。在一些实施方式中，检测试剂是抗-C1-INH抗体。
此外，本公开提供评估对受试者(例如人HAE患者)中pKal-介导的病症的治疗的方法，包括：(a)在治疗前和治疗后或在治疗过程中，测量从受试者收集的样品中能够抑制血浆激肽释放酶、因子XII或两者的血浆蛋白酶C1抑制剂(C1-INH)的水平，和(b)基于C1-INH的水平评估治疗的效力，其中治疗后或在治疗过程中C1-INH水平下降指示治疗对受试者有效。
在一些实施方式中，治疗涉及激肽释放酶结合剂、缓激肽B2受体拮抗剂(angatonist)或C1-INH取代剂。例如，治疗涉及DX-88、DX-2930或EPIKAL-2。可选地，或另外，从受试者收集的样品是血液样品或血浆样品。
在一些实施方式中，C1-INH的水平可通过本文所述的测定方法测量。例如，C1-INH的水平可通过如下方法测量，所述方法包括：(a)使从受试者收集的样品与捕获试剂(例如固定在基质上的)接触，和(b)测量与捕获试剂结合的样品中的C1-INH的水平，所述捕获试剂可包括：i)活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段，ii)活性形式的血浆激肽释放酶或其C1-INH-结合片段或iii)i)和ii)的组合。在一些实例中，捕获试剂包括活性形式的因子XII、活性形式的血浆激肽释放酶或其组合。在本文所述的任何测定中，C1-INH的水平可利用结合C1-INH的检测剂，例如结合C1-INH的抗体，测量。在一些实例中，C1-INH的水平通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量。
以下实施方式也在本公开的范围内。
本公开提供方评估(例如鉴别)受试者，例如处于pKal-介导的或缓激肽-介导的病症的风险的受试者或遭受(例如患有)pKal-介导的或缓激肽-介导的病症的受试者的方法。提供的方法允许分析具有血浆激肽释放酶-介导的血管性水肿(KMA)或可用于评估和治疗的pKal介导的其他疾病的患者。
本发明的实施方式提供生物标记物及其在鉴别和治疗患者例如遭受通过血浆激肽释放酶产生的缓激肽引起的水肿的患者中的用途。本文公开的方法、组合物和设备可以各种方式使用。例如，pKal标记物的水平可用于鉴定与升高的接触系统激活相关的病症。初始筛选之后可用血浆激肽释放酶抑制剂(例如DX-88、EPI-KAL2或DX-2930)进行体外或体内测试，例如在疾病的临床前模型中。本文公开的标记物也可用作药物动力学生物标记物或以其它方式用于监测受试者对激肽释放酶抑制剂的应答。本文公开的标记物可用于伴随诊断，以能够治疗由血浆激肽释放酶介导的疾病，在pKal介导的或缓激肽介导的病症的预防性疗法期间控制剂量，所述病症例如HAE、非组胺-依赖性特发性血管性水肿、类风湿性关节炎、克罗恩病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、败血症性休克、烧伤、脑缺血性/再灌注损伤、脑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、黄斑性水肿、血管炎、与心室辅助设备相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素-诱导的血小板减少症、血栓栓塞病和伴随不稳定的心绞痛的冠心病。
在一个方面中，本发明提供评估受试者的方法，例如处于pKal-介导的病症、缓激肽-介导的病症例如抗-组胺耐受性水肿或HAE的风险的受试者，包括：a)获得包括受试者组织的样品，例如血液、血浆或眼泪；b)使所述样品，例如在体外，与一种或多种捕获试剂在足以在C1-INH和所述一种或多种捕获试剂之间形成复合物的条件下接触，其中，所述捕获试剂包括以下之一或两者：i)包括活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段的部分；或ii)包括活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段的部分；和c)评估CI-INH与所述捕获试剂的结合水平。
在一些实施方式中，所述评估包括将CI-INH与所述捕获试剂的所述测定的结合水平与参考的相比较，其中，满足预定标准的水平，例如如果其处于或低于参考，指示病症易于用pKal抑制剂治疗。参考可以是，例如没有患pKal-介导的病症的人中的水平，例如不具有HAE或本文所述的其他病症的人或不具有这样的病症的症状的历史的人中的水平。
在一些实施方式中，pKal-介导的病症选自：HAE、非组胺-依赖性特发性血管性水肿、类风湿性关节炎、克罗恩病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、败血症性休克、烧伤、脑缺血性/再灌注损伤、脑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、黄斑性水肿、血管炎、动脉或静脉血栓形成、与心室辅助设备或支架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素-诱导的血小板减少症、血栓栓塞病和伴随不稳定的心绞痛的冠心病、水肿、眼病、痛风、肠疾病、口腔粘膜炎、神经病痛、炎性疼痛、椎管狭窄退行性脊柱病、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨关节炎、遗传性血管性水肿、肺栓塞、中风、头部创伤或瘤周脑水肿、脓毒症、急性大脑中动脉(MCA)缺血性事件(中风)、再狭窄(例如血管成形术之后)、系统性红斑狼疮肾炎、自身免疫疾病、炎性疾病、心血管疾病、神经疾病、与蛋白质错折叠相关的疾病、与血管生成相关的疾病、高血压肾病和糖尿病性肾病、变应性疾病和呼吸疾病(例如过敏症、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、急性呼吸窘迫综合症、囊性纤维化、持续性鼻炎)和组织损伤(例如烧伤或化学损伤)。
在一些实施方式中，评估所述受试者对pKal-介导的病症的易感性。在某些实施方式中，所述受试者具有例如与pKal-介导的病症例如水肿一致的症状。在某些实施方式中，所述受试者具有表征为不期望的pKal激活的病症的症状，和所述受试者已经被施用抗组胺疗法或皮质类固醇疗法，并且症状对其耐受的。在一些实施方式中，所述受试者具有以下症状或特性中的一个或多个或所有：肿胀的复发性发作；肿胀，其中，所述肿胀完全或主要是外周的，例如受试者没有明显的腹部或呼吸道肿胀；荨麻疹；在没有感染的迹象的情况下发红、疼痛和肿胀；不能响应抗组胺或皮质类固醇疗法；或具有非组胺-介导的水肿。
在一些实施方式中，所述受试者具有持续的或复发的水肿，并且对抗-组胺和类固醇疗法中之一或两者没有应答。
在一些实施方式中，受试者没有pKal介导的病症例如HAE、IAE、IBD或IBS的历史。在一些实施方式中，受试者具有pKal-介导的病症例如HAE、IAE、IBD或IBS的历史。在一些实施方式中，受试者没有HAE的历史。在一些实施方式中，受试者具有HAE的历史。在一些实施方式中，受试者没有IAE的历史。在一些实施方式中，受试者具有IAE的历史。在一些实施方式中，受试者没有IBD或IBS的历史。在一些实施方式中，受试者具有IBD或IBS的历史。在一些实施方式中，受试者没有组胺介导的病症例如食物过敏的历史。在一些实施方式中，受试者具有组胺介导的病症例如食物过敏的历史。在一些实施方式中，受试者没有pKal介导的病症例如HAE、IAE、IBD或IBS的历史和没有组氨酸-介导的病症例如食物过敏的历史。在一些实施方式中，受试者没有pKal介导的病症例如HAE、IAE、IBD或IBS的历史和具有组胺-介导的病症例如食物过敏的历史。在一些实施方式中，受试者具有pKal-介导的病症例如HAE、IAE、IBD或IBS的历史和没有组氨酸-介导的病症食物过敏的历史。在一些实施方式中，受试者具有pKal-介导的病症例如HAE、IAE、IBD或IBS的历史和具有组胺-介导的病症例如食物过敏的历史。
在某些实施方式中，所述受试者具有血管性水肿的历史。在某些实施方式中，所述受试者没有血管性水肿的历史。在具体实施方式中，所述受试者没有遭受特征为pKal或缓激肽介导的病症例如水肿的症状。在某些实施方式中，当所述组织从受试者的身体去除时，所述受试者正经历血管性水肿发作。
在一些实施方式中，所述一种或多种捕获试剂布置在基质上。在某些实施方式中，基质是不溶的基质。在一些实施方式中，所述一种或多种捕获试剂包括活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段。在具体实施方式中，所述一种或多种捕获试剂包括活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段。在具体实施方式中，所述一种或多种捕获试剂包括活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段和活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段。
在一些实施方式中，所述方法不包括评估C1-INH与激活的C1例如C1s的结合。
在一些实施方式中，所述一种或多种捕获试剂包括第一特异性结合部分，其与布置在所述基质上的第二特异性结合部分形成复合物。在某些实施方式中，所述第一和第二结合部分选自生物素和抗生物素蛋白。
在一些实施方式中，所述方法包括例如在所述评估中，评估检测试剂与所述复合物的结合，例如结合复合的C1INH的检测试剂，例如抗-C1NH抗体，例如检测试剂可在C1IHN和捕获试剂之间形成复合物之前或之后结合C1INH。在某些实施方式中，方法包括在足以在C1-INH和检测试剂之间形成复合物的条件下提供检测试剂。在一些实施方式中，所述C1-INH与捕获试剂复合。在具体实施方式中，所述方法包括形成包括检测试剂、C1-INH和捕获试剂的复合物，其中，所述检测试剂与所述C1-INH复合，所述CI-INH与捕获试剂复合。
在一些实施方式中，捕获试剂包括这样的部分，所述部分包括活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段。在一些实施方式中，捕获试剂包括这样的部分，所述部分包括活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段。在一些实施方式中，捕获试剂包括以下之一或两者：i)包括活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段的部分，或ii)包括活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段的部分。在具体实施方式中，捕获试剂包括这样的部分，所述部分包括活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段。在具体实施方式中，捕获试剂包括这样的部分，所述部分包括活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段。在具体实施方式中，捕获试剂包括包含活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段的部分和包含活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段的部分二者。
在一些实施方式中，捕获试剂进一步包括结合所述复合物与基质的部分。在某些实施方式中，所述部分包括第一和第二结合伴侣(binding partner)，其中，一个结合所述捕获试剂和另一个结合所述基质。
在一些实施方式中，方法进一步包括向所述受试者施用本文公开的治疗剂。在某些实施方式中，所述治疗剂选自：激肽释放酶结合剂；缓激肽B2受体拮抗剂；或C1-INH取代剂。在具体实施方式中，所述治疗剂包括DX-88。在具体实施方式中，所述治疗剂包括DX-2930。在具体实施方式中，所述治疗剂包括EPIKAL-2。在一些实施方式中，方法进一步包括施用第二疗法。
在一些实施方式中，方法包括确定所述受试者是否具有HAE。
在另外的方面中，本发明提供评估受试者HAE类型的方法，包括：(i)通过本文公开的方法(例如测量与捕获试剂结合的样品中C1-INH的水平)，获得受试者的C1-INH功能的值；和(ii)获得总C1-INH蛋白质水平的值(例如测量总C1-INH水平)；其中，如果通过(i)提供的C1-INH功能的值满足预选的标准，例如其低于参考值，和通过(ii)提供的C1-INH蛋白质水平的值满足预选的标准，例如其高于参考值，则将受试者归类为具有II型HAE。在一些实施方式中，(i)和(ii)中的至少一个是直接获得的。
在另外的方面中，本发明提供治疗受试者的方法，包括获得通过本文公开的方法对所述受试者进行的评估；和响应所述评估，选择疗法用于所述患者或向所述患者施用疗法。在一些实施方式中，方法进一步包括施用本文公开的治疗剂给所述受试者。在某些实施方式中，所述治疗剂选自：激肽释放酶结合剂；缓激肽B2受体拮抗剂；或C1-INH取代剂。在具体实施方式中，所述治疗剂包括DX-88。在具体实施方式中，所述治疗剂包括DX-2930。在具体实施方式中，所述治疗剂包括EPIKAL-2。
在另外的方面中，本发明提供治疗受试者的方法，包括：提供已经通过本文公开的方法评估的受试者；和响应所述评估，选择疗法用于所述患者或向所述患者施用疗法。在一些实施方式中，方法进一步包括施用本文公开的治疗剂给所述受试者。在某些实施方式中，所述治疗剂选自：激肽释放酶结合剂；缓激肽B2受体拮抗剂；或C1-INH取代剂。在具体实施方式中，所述治疗剂包括DX-88。在具体实施方式中，所述治疗剂包括DX-2930。在具体实施方式中，所述治疗剂包括EPIKAL-2。
在进一步的方面中，本发明提供反应混合物，其包括本文所述的捕获试剂，其任选地与C1-IHN复合，和任选地与检测试剂复合。在实施方式中，反应混合物包括受试者血浆。在一些实施方式中，样品的未复合的成分已经被去除，例如通过洗涤。
在进一步的方面中，本发明提供基质，其包括本文所述的一种或多种捕获剂，例如以下之一或两者：i)包括活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段的部分；或ii)包活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段的部分。在一些实施方式中，所述基质包括部分i和ii，其独立地布置在可访问的区域中。
在再另外的方面中，本发明提供设备，其包括基质，所述基质上布置至少一种本文公开的捕获试剂，并且在一些实施方式中，所述基质上布置本文公开的捕获试剂中的两种。在实施方式中，第一捕获试剂布置在所述基质的第一区域和第二捕获试剂布置在所述基质的第二区域，例如在不同的壁中。
在另外的方面中，本发明提供试剂盒，其包括以下的一种或多种：本文所述的捕获试剂之一或两者，其任选地布置在基质上；检测试剂，例如抗C1-INH抗体或抗-抗-C1-INH抗体；和标准品，例如C1-INH。
本发明一种或多种实施方式的细节在附图和下面的描述中阐释。本发明的其他特征、目的和优势通过说明书和附图以及通过权利要求书将变得明显。
所有引用的参考文献的内容——包括遍及本申请引用的文献参考，出版的专利，公开的或非公开的专利申请以及下面列举的那些的内容在这里通过参考以它们的全部明确并入本文，用于本文的目的或本文引用的主题。
附图说明
图1描述通过ELISA对激肽释放酶-C1-INH复合物形成的示例性检测。从左到右–正常对照、I型HAE、II型HAE和III型HAE患者血浆样品。
图2描述通过ELISA对激活的因子XII-C1-INH复合物形成的示例性检测。从左到右-正常对照、I型HAE、II型HAE和III型HAE患者血浆样品。
图3是基于FXIIa的抑制通过ELISA分析测量C1-INH水平的示例性方法的示意图示。
图4包括显示对照样品和HAE样品中示例性功能ELISA的数据的图表。图4A描述用于基于C1s的抑制测量C1-INH的商业上可得的功能ELISA的数据。图4B描述用于基于激肽释放酶的抑制测量C1-INH的示例性功能ELISA分析的数据。图4C描述用于基于FXII的抑制测量C1-INH的示例性功能ELISA分析的数据。
发明详述
血浆激肽释放酶(pKal)是接触系统的丝氨酸蛋白酶组分并且是循环中主要的产生缓激肽的酶。接触系统在暴露于外源或带负电荷的表面时通过任一因子XIIa(活性形式的因子XII或FXII)被激活，或通过脯氨酰羧肽酶在内皮细胞表面上被激活(Sainz I.M.等,Thromb Haemost 98,77-83,2007)。血浆激肽释放酶的激活经其对因子XII的反馈激活增强了内在凝聚并且经产生促炎性九肽缓激肽而加重炎症。作为循环中的主要激肽原酶，血浆激肽释放酶主要负责产生脉管系统中的缓激肽。C1-抑制剂蛋白(C1-INH)中的遗传缺陷导致遗传性血管性水肿(HAE)。患HAE的患者遭受通常由未知的触发剂促发的疼痛水肿的急性发作(Zuraw B.L.等，N Engl J Med 359，1027-1036，2008)。通过动物模型中药理学试剂的使用或遗传研究，血浆激肽释放酶-激肽系统(血浆KKS)已经牵涉到各种疾病。
遗传性血管性水肿(HAE)I型和II型是常染色体显性病症，特征在于肢端(extremities)、面部、胃肠道或上呼吸道肿胀(1)。发作持续2-5天，并且，如果不适当治疗，喉部肿胀尤其可致命。由于这是罕见的病症(影响1:20,000至1:50,000的人)，具有可变的表现，所以诊断会被错过。HAE通常通过C1-INH基因中的杂合突变引起，这导致降低的蛋白质水平(I型HAE，病例的85％)或降低的功能(II型HAE，15％)(2)。在I型HAE中，C1-INH蛋白质水平低，并且功能水平成比例地低，然而，在II型HAE中，蛋白质水平正常，或甚至上升，但功能水平低。因此，功能测定是必要的，不仅为了确认HAE的诊断，而且II型疾病的诊断不能没有它。
C1INH是丝氨酸蛋白酶，其抑制补体的激活的蛋白质、凝结和形成激肽的级联。当前可用的用于评估C1-INH功能水平的测定利用生色分析或复合ELISA方法测量C1-INH对补体级联的C1s的抑制。生色分析通常被认为是优选的(3)，但是两种方法都具有局限性。生色分析更可能具有偶然的假阳性，而复合ELISA仅具有62％的阴性预测值。
本领域已知的复合ELISA和生色方法的局限是该测定测量C1-INH对补体级联的酶的活性，其不是PKal-介导的疾病诸如HAE的原因。实际上，已经报道功能失调的C1-INH对激肽形成级联具有正常的活性，因此不发生血管性水肿，但是它不能抑制C1s，使得C1异常地有活性和C4被消耗(7)。因此，当前可用的技术不允许测量在功能上抑制激肽形成级联(例如抑制PKal和/或FXIIa)的C1-INH的水平。
本公开是基于采用ELISA方法基于激活的因子XII或血浆激肽释放酶的抑制测量功能性C1-INH的新测定的发展，用于诊断HAE的I和II型。这些测定尤其与pKal信号传导途径相关的疾病/病症有生理相关性，因此相对于现有技术中已知的方法是重要的进步。
本文所述的是基于PKal和/或FXII(例如活性形式的蛋白质)的抑制测量C1-INH的水平的新测定方法，和用于完成所述测定方法的试剂盒。而且，本文所述的是这样的测定方法在诊断具有通过PKal介导的疾病/病症诸如HAE的患者或处于通过PKal介导的疾病/病症诸如HAE风险中的患者的应用，或在评估疾病/病症的治疗中的应用。
定义
为了方便，在进一步描述本发明之前，在这里定义说明书、实施例和所附的权利要求中采用的某些术语。其他术语在说明书中出现时被定义。
单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数参考物，除非上下文另外明确指出。
如本文所使用，术语“获取(acquire)”或“获取(acquiring)”指通过“直接获取”或“间接获取”物理实体或值获得对物理实体或值例如数值的拥有。“直接获取”意思是执行程序(例如，对样品进行测定或测试或“分析样品”，如该术语在本文定义的那样)，以获得物理实体或值。“间接获取”指接收来自另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第三方实验室)的物理实体或值。直接获取物理实体包括执行程序例如分析样品，其包括物理物质例如原料的物理变化。示例性变化包括由两种或更多种原料制造物理实体、剪切或破碎物质、分离或纯化物质、将两个或更多个分开的实体组合成混合物、进行化学反应——包括断裂或形成共价或非共价键。直接获取值包括执行包括样品或另一物质中的物理变化的程序，例如执行包括物质例如样品、分析物或试剂中的物理变化的分析程序(有时本文称为“物理分析”)；执行分析方法，例如包括下述一个或多个步骤的方法：从另一物质分离或纯化物质例如分析物或其片段或其他衍生物，将分析物或其片段或其他衍生物与另一物质例如缓冲液、溶剂或反应物组合，或改变分析物或其片段或其他衍生物的结构，例如通过在分析物的第一和第二原子之间断裂或形成共价或非共价键、或通过改变试剂或其片段或其他衍生物的结构，例如通过在试剂的第一和第二原子之间断裂或形成共价或非共价键。
如本文所使用，“分析”样品包括执行程序，其涉及样品或另一物质例如原料的物理变化。示例性变化包括由两种或更多种原料制造物理实体、剪切或破碎物质、分离或纯化物质、将两个或更多个分开的实体组合成混合物、进行化学反应——包括断裂或形成共价或非共价键。分析样品可包括执行包括物质例如样品、分析物或试剂的物理变化的分析程序(有时本文称为“物理分析”)；执行分析方法，例如其包括下述一个或多个步骤的方法：从另一物质分离或纯化物质例如分析物或其片段或其他衍生物，将分析物或其片段或其他衍生物与另一物质例如缓冲液、溶剂或反应物组合，或改变分析物或其片段或其他衍生物的结构，例如通过在分析物的第一和第二原子之间断裂或形成共价或非共价键，或通过改变试剂或其片段或其他衍生物的结构，例如通过在试剂的第一和第二原子之间断裂或形成共价或非共价键。
如本文所使用，术语“激动剂”意思是指模拟或上调(例如，加强或补充)蛋白质生物活性的试剂。激动剂可以是野生型蛋白质或其具有野生型蛋白质的至少一种生物活性的衍生物。激动剂可也以是增加蛋白质的至少一种生物活性的化合物。激动剂也可以是增加多肽与另外的分子例如靶肽或核酸的相互作用的化合物。
如本文所使用，术语“拮抗剂”意思是指下调(例如，阻抑或抑制)蛋白质的至少一种生物活性的试剂。拮抗剂可以是抑制或降低蛋白质和另外的分子例如靶肽或酶基质之间的相互作用的化合物。拮抗剂可也以是降低或抑制存在的表达蛋白质的量的化合物。典型地，抑制蛋白或基因指降低蛋白质或基因的表达或相关活性至少10％或更多例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多，或降低表达或相关的活性大于1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多，如通过本文所述的或本领域知道的一种或多种方法测量的。
如本文所使用，“结合亲和力”指表观缔合常数(apparent associationconstant)或Ka。Ka是解离常数(Kd)的倒数。结合蛋白对于具体的靶分子可例如具有至少105、106、107、108、109、1010和1011M-1的结合亲和力。结合蛋白相对于第二靶标对第一靶标更高的亲和力结合可由比结合第二靶标的Ka(或数值Kd)更高的结合第一靶标的Ka(或更小数值Kd)指示。在这样的情况下，结合蛋白相对于第二靶标(例如，处于第二构象的相同蛋白质或其模拟物；或第二蛋白质)具有对于第一靶标(例如，处于第一构象的蛋白质或其模拟物)的特异性。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000或105倍。
可通过各种方法包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子共振或光谱学(例如，使用荧光试验)测定结合亲和力。用于评估结合亲和力的示例性条件是在TRIS-缓冲液(50mM TRIS、150mM NaCl、5mM CaCl2，pH7.5)中。这些技术可用于测量结合的和游离的结合蛋白的浓度，其作为结合蛋白(或靶标)浓度的函数。结合的结合蛋白([结合])的浓度与游离的结合蛋白([游离])的浓度和靶标上的结合蛋白的结合位点的浓度相关，其中(N)是每个靶分子的结合位点的数量，如下述方程式：
[结合]＝N·[游离]/((1/Ka)+[游离])。
尽管没有必要总是精确测定Ka，但是因为有时足以获得对例如使用比如ELISA或FACS分析的方法测定的亲和力的定量测量，其与Ka成比例，并且因此可用于比较，比如确定更高的亲和力是否是例如高2倍，以获得对亲和力的定性测量或获得对亲和力的推导——例如通过功能测定例如体外或体内测定的活性。
术语“结合蛋白”指可与靶分子相互作用的蛋白质。该术语与“配体”互换使用。“血浆激肽释放酶结合蛋白”指可与血浆激肽释放酶相互作用(例如，结合)的蛋白质，并且包括，尤其包括，优选或特异性与血浆激肽释放酶相互作用和/或抑制血浆激肽释放酶的蛋白质。如果蛋白质使得血浆激肽释放酶的活性与在没有该蛋白质并且在相同条件下的血浆激肽释放酶的活性相比下降，则该蛋白质抑制血浆激肽释放酶。在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白是抗体。
术语“捕获剂”指特异性结合其配体的部分。
如本文所使用，术语“复合物”或“复合物形成”指彼此之间具有特异性亲和力的成员之间的复合物。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的取代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
生物聚合物的基序序列可包括可以是变化的氨基酸的位置。例如，在该背景下，除非另外指出，符号“X”一般指任何氨基酸(例如，二十种天然氨基酸的任意氨基酸)，例如指任何非半胱氨酸的氨基酸。也可例如，使用括弧和斜线指示其他允许的氨基酸。例如，“(A/W/F/N/Q)”意思是丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺在该具体位置是被允许的。
如本文所使用，“检测剂”指结合待检测部分的部分。通常其产生信号例如荧光或产生可测量的化合物。
“表位”指靶化合物上被结合蛋白(例如，抗体比如Fab或全长抗体)结合的位点。在靶化合物是蛋白质的情况下，位点可完全由氨基酸组分组成、完全由蛋白质的氨基酸的化学修饰(例如，糖基部分)组成或由其组合组成。重叠表位包括至少一种常见的氨基酸残基、糖基基团、磷酸根基团、硫酸根基团或其他分子特征。
如果第一结合蛋白结合靶化合物上第二结合蛋白结合的相同位点或结合与第二结合蛋白结合的位点重叠(例如，50％、60％、70％、80％、90％、或100％重叠，例如就氨基酸序列或其他分子特征(例如，糖基基团、磷酸根基团或硫酸根基团)而言)的位点，则第一结合蛋白(例如，抗体)与第二结合蛋白(例如，抗体)一样“结合相同的表位”。
如果第一结合蛋白与其表位的结合降低(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多)结合其表位的第二结合蛋白的量，那么第一结合蛋白(例如，抗体)与第二结合蛋白(例如，抗体)“竞争结合”。竞争可以是直接的(例如，第一结合蛋白结合与第二结合蛋白结合的表位相同的或重叠的表位)或间接的(例如，第一结合蛋白与其表位的结合造成靶化合物的空间改变，其降低了第二结合蛋白结合其表位的能力)。
如本文所使用，“功能性”生物分子是其展示被表征的性质和/或活性的形式的生物分子。
如下进行两条序列之间的“同源性”或“序列同一性”(该术语在本文可交换使用)的计算。为了最佳比较目的比对序列(例如，空隙可引入第一和第二氨基酸之一或二者或核酸序列中，以进行最佳比对，并且为了比较目的可忽略非同源序列)。使用GCG软件包中的GAP程序将最佳比对确定为最佳分数，其中采用Blossum 62评分矩阵，空隙罚分为12、空隙延伸罚分为4，和移码空隙罚分为5。然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置的相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是一致的(如本文所使用，氨基酸或核酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”等同)。两条序列之间的同一性百分数是由序列共享的一致位置数目的函数。
在优选的实施方式中，为了比较目的而比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少30％，优选地至少40％，更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，和甚至更优选地至少70％、80％、90％、92％、95％、97％、98％或100％。例如，参考序列可以是免疫球蛋白可变结构域序列的长度。
如本文所使用，术语“在低严格性、中严格性、高严格性或非常高严格性条件下杂交”描述杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可见于Current Protocolss inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。水性和非水性方法描述在该参考文献中，并且都可被使用。本文提及的具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件，在约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后至少在50℃在0.2X SSC、0.1％SDS洗涤两次(对于低严格性条件，洗涤的温度可增加至55℃)；(2)中严格性杂交条件，在约45℃在6X SSC中，随后在60℃在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；(3)高严格性杂交条件，在约45℃在6X SSC中，随后在65℃在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；和(4)非常高的严格性杂交条件是在65℃0.5M磷酸钠、7％SDS，随后在65℃在0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或多次。非常高的严格性条件(4)是优选的条件并且是应当被使用的条件，除非另外指出。本公开包括以低、中、高或非常高的严格性与本文所述的核酸或与其补体例如编码本文所述的结合蛋白的核酸杂交的核酸。核酸长度可以与参考核酸长度相同或在参考核酸长度的30％、20％或10％之内。核酸可对应编码本文所述的免疫球蛋白可变区序列的区域。
“分离的组合物”指从天然样品的至少一种组分的至少90％中去除的组合物，从所述天然样品中可获得分离的组合物。如果感兴趣的种类或种类群体以重量-重量计是至少5％、10％、25％、50％、75％、80％、90％、92％、95％、98％或99％纯的，则人工或天然产生的组合物可以是“具有至少一定程度的纯度的组合物”。
如本文所使用，术语“体外”指在人工环境中例如在试管或反应容器中、细胞培养中等发生的事件，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
如本文所使用，术语“体内”指在多细胞生物体比如人或非人动物中发生的事件。
“分离的组合物”指从可获得分离组合物的天然样品的至少一种组分的至少90％中去除的组合物。如果感兴趣的种类或种类群体以重量-重量计是至少5％、10％、25％、50％、75％、80％、90％、92％、95％、98％或99％纯的，则人工或天然产生的组合物可以是“具有至少一定程度的纯度的组合物”。
“分离的”蛋白质指从可获得分离蛋白质的天然样品的至少一种组分的至少90％中去除的蛋白质。如果感兴趣的种类或种类群体以重量-重量计是至少5％、10％、25％、50％、75％、80％、90％、92％、95％、98％或99％纯的，则蛋白质可以具有“至少”一定程度的纯度。
术语“激肽释放酶”(例如，血浆激肽释放酶)指肽酶(切割蛋白质中肽键的酶)，其是丝氨酸蛋白酶家族的亚类。血浆激肽释放酶切割激肽原产生激肽，其是一种有效的促炎性肽。
术语“激肽释放酶抑制剂”指抑制激肽释放酶的任何试剂或分子。例如，DX-88(本文也称为“PEP-1”)是血浆激肽释放酶的有效的(Ki<1nM)和特异性抑制剂(NP_000883)。(也见例如WO 95/21601或WO 2003/103475)。
如本文所使用术语“DX-2922”与术语“X101-A01”可交换使用。下面描述该抗体的其他变体。
如本文所使用的，术语“DX-2930”与术语“X124-G01”可互换使用。下面描述该抗体的其他变体。
术语“调谐剂”指可能够导致调整的多肽、核酸、大分子、复合物、分子、小分子、化合物、种类等(天然存在的或非天然存在的)，或由生物材料比如细菌、植物、真菌或动物细胞或组织制备的提取物。可通过包括在测定中评估调谐剂作为具有功能性质、生物活性或过程或它们组合的抑制剂或活化剂(例如，激动剂、部分拮抗剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂、抗微生物剂、微生物感染或增殖的抑制剂等)(直接或间接)的潜在活性。在这样的测定中，可一次筛选许多调谐剂。调谐剂的活性可以是已知的、未知的或部分已知的。
“非必需”氨基酸残基是这样的残基，其可以与结合剂例如抗体的野生型序列不同，而不消除或更优选基本上不改变生物活性，但是改变“必需”氨基酸残基使得活性大大丧失。
待通过本发明方法治疗的“患者”、“受试者”或“宿主”(这些术语可交换使用)可指人或非人动物。在一些实施方式中，受试者被怀疑具有激肽释放酶介导的病症或有激肽释放酶介导的病症的风险或遭受激肽释放酶介导的病症，例如缓激肽介导的病症，例如遗传性血管性水肿(HAE)、非组胺-依赖性特发性血管性水肿、类风湿性关节炎、克罗恩病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、败血症性休克、烧伤、脑缺血性/再灌注损伤、脑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、黄斑性水肿、血管炎、动脉或静脉血栓形成、与心室辅助设备或支架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素-诱导的血小板减少症、血栓栓塞病，和伴随不稳定的心绞痛的冠心病、水肿、眼病、痛风、肠疾病、口腔粘膜炎、神经病痛、炎性疼痛、椎管狭窄退行性脊柱病、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨关节炎、遗传性血管性水肿、肺栓塞、中风、头部创伤或瘤周脑水肿、脓毒、急性大脑中动脉(MCA)缺血性事件(中风)、再狭窄(例如，血管成形术之后)、系统性红斑狼疮肾炎、自身免疫疾病、炎性疾病、心血管疾病、神经疾病、与蛋白质错折叠相关的疾病、与血管生成相关的疾病、高血压肾病和糖尿病性肾病、变应性疾病和呼吸疾病(例如过敏症、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、急性呼吸窘迫综合症、囊性纤维化、持续性鼻炎)和组织损伤(例如烧伤或化学损伤)。
术语“前激肽释放酶”和“前血浆激肽释放酶(preplasma kallikrein)”在本文中可互换使用并且指酶原形式的活性血浆激肽释放酶，其也称为前激肽释放酶。
术语“预防(preventing)”或“待预防”受试者中的疾病指使受试者进行药学治疗例如施用药物，使得疾病的至少一种症状被预防，即，在有害的病况(例如，宿主动物的疾病或其他有害状态)的临床表现之前施用，从而其保护宿主抵抗有害病况的发展。“预防”疾病也可称为“预防(prophylaxis)”或“预防性治疗”。
如本文所使用，本文使用术语“基本上一致的”(或“基本上同源的”)来指这样的第一氨基酸或核酸序列，其包含足够数量的与第二氨基酸或核酸序列一致或等同的(例如，具有类似的侧链例如保守的氨基酸取代)氨基酸残基或核苷酸，使得第一和第二氨基酸或核酸序列具有类似的活性(或编码具有类似活性的蛋白质)，例如结合活性，结合偏好或生物活性。在抗体的情况下，相对于相同抗原，第二抗体具有相同的特异性并且具有至少50％、至少25％或至少10％的亲和力。
与本文公开的序列类似或同源的(例如，至少约85％序列同一性)序列也是本申请的一部分。在一些实施方式中，序列同一性可以是约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
另外，当核酸区段在选择性杂交条件(例如，高度严格杂交条件)下与链的补体杂交时，存在本质上的同一性。核酸可存在于整个细胞中、细胞溶解产物中或部分纯化或基本上纯的形式中。
生物聚合物的基序序列可包括这样的位置，其可以是变化的氨基酸。例如，在该背景下，除非另外指出，符号“X”一般指任何氨基酸(例如，二十种天然氨基酸中的任意氨基酸)，例如指任何非半胱氨酸氨基酸。也可例如，使用括弧和斜线指示其他允许的氨基酸。例如，“(A/W/F/N/Q)”意思是丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺在该具体位置是被允许的。
可通过任何现有技术已知的方法测定统计显著性。示例性统计检验包括：学生T检验、Mann Whitney U非参数检验和Wilcoxon非参数统计检验。一些统计学上显著的关系的P值小于0.05或0.02。指示两个状态之间可区分的定性或定量的区别的术语例如“诱导”、“抑制”、“加强”、“升高”、“增加”、“降低”等可指两个状态之间的差异，例如统计学上显著的差异。
如本文所使用，“样品”指包括来自受试者的组织例如血液、血浆或蛋白质的组合物。样品包括从受试者获得的初始未处理的样品以及随后处理的例如部分纯化或保藏形式。示例性样品包括血液、血浆、眼泪或粘液。在一些实施方式中，样品是血液或血浆。
相对于未治疗的受试者，“治疗有效的剂量”以统计学上显著的程度或至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，和仍更优选至少约80％优选地调节可测量的参数例如血浆激肽释放酶活性。可在预测人病症和病况效力的动物模型系统中评估化合物调节可测量参数例如疾病相关的参数的能力。可选地，可通过检查化合物体外调节参数的能力评估组合物的该性质。
“治疗”受试者中的疾病(或病况)或“治疗”具有疾病的受试者指使受试者进行药学治疗例如施用药物，使得治愈、缓解或减轻疾病的至少一种症状。
术语“预防”受试者中的疾病指使受试者进行药学治疗例如施用药物，使得疾病的至少一种症状被预防，即，在有害的病况(例如，宿主动物的疾病或其他有害的状态)的临床表现之前施用，从而其保护宿主抵抗发展有害病况。“预防”疾病也可称为“预防”或“预防性治疗”。
“预防性有效量”指以剂量和在必要的时间周期内实现期望的预防性结果的有效的量。典型地，因为预防性剂量在疾病早期阶段之前或在疾病早期阶段用于受试者，所以预防性有效量将小于治疗有效量。
标题，包括字母或数字标题仅仅为了易于理解和阅读，并且在没有相反指示的表达下，不强调优选的时间顺序或等级。
基于PKal和/或FXII的抑制测量C1-INH的测定方法和试剂盒
本文提供的是方法和试剂盒，其用于基于C1-INH结合和抑制活性激肽释放酶和/或活性FXII的能力测量功能性C1-INH的水平。这样的方法可如下完成：通过使含C1-INH的样品与本文所述的捕获试剂接触，和测量所述样品中结合捕获试剂的C1-INH的水平。在一些实施方式中，样品中总C1-INH的水平(例如C1-INH蛋白质的水平，与C1-INH是否结合本文所述的捕获试剂无关)也被测量。
血浆蛋白酶C1抑制剂(C1-INH)通常在调节各种生理途径，包括补体激活(例如C1复合物中C1r和C1s蛋白酶的抑制)、血液凝结、纤维蛋白溶解和激肽产生中发挥重要的作用。C1-INH结合和抑制因子XIIa、因子XIIf和激肽释放酶。C1-INH是蛋白质的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族的成员，具有2种结构域结构。C1-INH的C-末端丝氨酸蛋白酶抑制蛋白结构域提供蛋白质的抑制活性。示例性人C1-INH的氨基酸序列显示在下面(登录号NP_000053.2)
>gi|73858568|ref|NP_000053.2|血浆蛋白酶C1抑制剂前体[智人(Homosapiens)]MASRLTLLTLLLLLLAGDRASSNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA(SEQ ID NO:1)
“活性”或“功能性”C1-INH是指C1-INH多肽或C1-INH多肽片段，其保留类似的生物学和/或免疫学活性，但不一定与天然产生的C1-INH，包括成熟形式，一致。在一些实施方式中，活性或功能性C1-INH是C1-INH多肽或C1-INH多肽片段，其结合因子XIIa、因子XIIf或激肽释放酶中的一种或多种，并抑制FXIIa和/或PKal的活性，从而调节激肽形成过程。
在一些实施方式中，在本文所述的测定方法中检验的样品是生物学样品，例如获自本文所述的受试者的生物学样品，例如体液样品诸如血液样品或血浆样品。例如，合适的C1-INH蛋白质可提供在生物学组织样品(例如血液、血浆、眼泪、黏液)、组织提取物或制剂或直接从多细胞有机体获取的固体组织(例如离体程序)中。因此，除了别的以外，根据本发明的测定可用于监测和/或表征人和其他多细胞有机体中的内源C1-INH，用于诊断或生物标记物测量。
A.测定形式
本文所述的测定方法允许评价(例如测量)结合本文所述的捕获试剂的CI-INH的水平。结合捕获试剂的CI-INH的水平(例如量)可利用本文所述的测定和/或本领域已知的测定被测量。可用于评估结合捕获试剂的C1-INH的水平的测定包括但不限于免疫测定诸如蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)(例如夹心ELISA)、放射免疫测定、基于电化学发光的检测测定和相关技术。执行这些示例性测定的方法是本领域中已知的，并且是商业上可获得的(见，例如Current Protocols in Molecular Biology，现行版，Wiley OnlineLibrary)。
在一些实施方式中，结合捕获试剂的C1-INH的水平利用ELISA测定。ELISA是本领域中已知的(见，例如Crowther,John R(2009)。“The ELISA Guidebook.”第二版,HumanaPress and Lequin R(2005)。"Enzyme immunoassay(EIA)/enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA)".Clin.Chem.51(12):2415–8))，并且，示例性ELISA在本文中描述。执行ELISA的试剂盒也是本领域中已知的，并且是商业上可获得的(见，例如ELISA试剂盒，其来自Life Technologies and BD Biosciences)。
在一些实施方式中，提供的测定在低通量平台上进行，包括单一测定形式。例如，低通量平台可用于测量生物学样品(例如生物学组织、组织提取物)中的C1-INH活性水平，用于诊断或生物标记物测量。
在一些实施方式中，提供的测定可在高通量平台上进行。在一些实施方式中，多孔板，例如24-、48-、96-、384-或更多孔的板可用于高通量测定。单独的测定可在每个孔中平行进行。因此，通常期望使用板读取仪来平行测量多个孔，以提高测定通量。在一些实施方式中，能够将多个孔(例如4个、16个、24个、48个、96个、384个或更多个孔)平行成像的板读取仪可用于该平台。例如，可使用商售板读取仪(例如可获自Perkin Elmer，Waltham，MA的板::视觉系统(plate::vision system))。该板阅读器能够进行基于动力学的荧光分析。板::视觉系统具有高的收集效率光学(optics)并且具有针对平行分析96孔的专用光学设计。另外适当的平行板阅读器包括但不限于SAFIRE(Tecan，San Jose，CA)、(Molecular Devices，Union City，CA)、FDSS7000(Hamamatsu，Bridgewater，NJ)和CellLux(Perkin Elmer，Waltham，MA)。在一些实施方式中，本发明的高通量筛选测定是自动化的(例如，适于自动测试)。
B.捕获试剂
用于本文所述的测定方法的捕获试剂能够与在功能上抑制激肽形成级联，例如抑制PKal、FXII或两者的C1-INH形成复合物。在一些实施方式中，捕获试剂可包括下列中的一种或两者：包含活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段的部分；或包含活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段的部分。在一些实施方式中，提供的捕获试剂从天然源被分离和/或纯化。在一些实施方式中，提供的捕获试剂被重组或合成产生。在一些实施方式中，捕获试剂被布置在(例如结合于)基质上，例如不溶的基质。捕获试剂可共价或非共价结合基质。捕获试剂可直接结合基质或可间接结合基质，例如通过连接体。连接体的实例包括但不限于含碳的链、聚乙二醇(PEG)、核酸、单糖单元、生物素-抗生物素蛋白和肽。在一些实施方式中，基质，包括一个或多个孔的容器，例如微量滴定板。活性形式的因子XII或激肽释放酶的C1-INH-结合片段可通过产生全长捕获试剂的片段和确定片段是否结合C1-INH来制备。
在一些实施方式中，捕获试剂包括第一特异性结合部分，例如生物素或抗生物素蛋白，其与布置在(例如结合于)基质上的第二特异性结合部分，例如生物素或抗生物素蛋白，形成复合物，所述基质例如不溶的基质。
在一些实施方式中，捕获试剂可包括血浆激肽释放酶或其功能片段、FXII或其功能片段或其组合。
(i)血浆激肽释放酶
血浆激肽释放酶是接触系统的丝氨酸蛋白酶成分(Sainz I.M.等，ThrombHaemost 98，77-83，2007)。接触系统在暴露于外源或带负电荷的表面时通过任一因子XIIa被激活，或通过脯氨酰羧肽酶在内皮细胞表面上被激活(Sainz I.M.等,Thromb Haemost98,77-83,2007)。血浆激肽释放酶的激活经其对因子XII的反馈激活增强了内在凝聚并且经产生促炎性九肽缓激肽而加重炎症。作为循环中的主要激肽原酶，血浆激肽释放酶主要负责产生脉管系统中的缓激肽。
示例性血浆激肽释放酶序列可包括人、小鼠或大鼠血浆激肽释放酶氨基酸序列、与这些序列之一具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列或其片段，例如下面提供的序列的片段。在一些实施方式中，血浆激肽释放酶从自然中分离。在一些实施方式中，血浆激肽释放酶通过重组或合成手段产生。
示例性人血浆激肽释放酶的序列显示在下面(登陆号NP_000883.2)。人血浆激肽释放酶(86kDa)从人血浆中纯化，并用因子XIIa激活。因子XIIa通过在单一位点切割多肽序列(在Arg371-Ile372之间，切割位点由下面序列中的“/”标记)激活前激肽释放酶，以产生活性血浆激肽释放酶，其则由两个二硫键连接的多肽组成；大约52kDa的重链和大约34kDa的催化结构域[Colman和Schmaier,(1997)“Contact System:A Vascular BiologyModulator With Anticoagulant,Profibrinolytic,Antiadhesive,and ProinflammatoryAttributes”Blood,90,3819-3843]。
GCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPASSINDMEKRFGCFLKDSVTGTLPKVHRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKRCTSNIRCQFFSYATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMNIFQHLAFSDVDVARVLTPDAFVCRTICTYHPNCLFFTFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENTISGYSLLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQETCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLRLSMDGSPTRIAYGTQGSSGYSLRLCNTGDNSVCTTKTSTR/IVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRHLCGGSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDVWRIYSGILNLSDITKDTPFSQIKEIIIHQNYKVSEGNHDIALIKLQAPLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIYTNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQDYKITQRMVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSWGEGCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDGKAQMQSPA(SEQ ID NO:2)
人、小鼠和大鼠前激肽释放酶氨基酸序列和编码其的mRNA序列在下面示出。前激肽释放酶的序列与血浆激肽释放酶相同，除了活性血浆激肽释放酶(pKal)具有单一多肽链，其在单一位置(由“/”指示)被切割，以产生两条链。下面提供的序列是全序列，其包括信号序列。在从表达细胞分泌时，期望信号序列被去除。
人血浆激肽释放酶(登陆号：NP_000883.2)
>gi|78191798|ref|NP_000883.2|血浆激肽释放酶B1前体[智人]
MILFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPASSINDMEKRFGCFLKDSVTGTLPKVHRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKRCTSNIRCQFFSYATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMNIFQHLAFSDVDVARVLTPDAFVCRTICTYHPNCLFFTFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENTISGYSLLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQETCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLRLSMDGSPTRIAYGTQGSSGYSLRLCNTGDNSVCTTKTSTR/IVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRHLCGGSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDVWRIYSGILNLSDITKDTPFSQIKEIIIHQNYKVSEGNHDIALIKLQAPLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIYTNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQDYKITQRMVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSWGEGCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDGKAQMQSPA(SEQ ID NO:3)
小鼠血浆激肽释放酶(登陆号：NP_032481.1)
>gi|6680584|ref|NP_032481.1|激肽释放酶B，血浆1[小家鼠(Mus musculus)]MILFNRVGYFVSLFATVSCGCMTQLYKNTFFRGGDLAAIYTPDAQYCQKMCTFHPRCLLFSFLAVTPPKETNKRFGCFMKESITGTLPRIHRTGAISGHSLKQCGHQISACHRDIYKGLDMRGSNFNISKTDNIEECQKLCTNNFHCQFFTYATSAFYRPEYRKKCLLKHSASGTPTSIKSADNLVSGFSLKSCALSEIGCPMDIFQHSAFADLNVSQVITPDAFVCRTICTFHPNCLFFTFYTNEWETESQRNVCFLKTSKSGRPSPPIPQENAISGYSLLTCRKTRPEPCHSKIYSGVDFEGEELNVTFVQGADVCQETCTKTIRCQFFIYSLLPQDCKEEGCKCSLRLSTDGSPTRITYGMQGSSGYSLRLCKLVDSPDCTTKINAR/IVGGTNASLGEWPWQVSLQVKLVSQTHLCGGSIIGRQWVLTAAHCFDGIPYPDVWRIYGGILSLSEITKETPSSRIKELIIHQEYKVSEGNYDIALIKLQTPLNYTEFQKPICLPSKADTNTIYTNCWVTGWGYTKEQGETQNILQKATIPLVPNEECQKKYRDYVINKQMICAGYKEGGTDACKGDSGGPLVCKHSGRWQLVGITSWGEGCGRKDQPGVYTKVSEYMDWILEKTQSSDVRALETSSA(SEQ ID NO:4)
大鼠血浆激肽释放酶(登录号：NP_036857.2)
>gi|162138905|ref|NP_036857.2|激肽释放酶B,血浆1[褐家鼠(Rattusnorvegicus)]
MILFKQVGYFVSLFATVSCGCLSQLYANTFFRGGDLAAIYTPDAQHCQKMCTFHPRCLLFSFLAVSPTKETDKRFGCFMKESITGTLPRIHRTGAISGHSLKQCGHQLSACHQDIYEGLDMRGSNFNISKTDSIEECQKLCTNNIHCQFFTYATKAFHRPEYRKSCLLKRSSSGTPTSIKPVDNLVSGFSLKSCALSEIGCPMDIFQHFAFADLNVSHVVTPDAFVCRTVCTFHPNCLFFTFYTNEWETESQRNVCFLKTSKSGRPSPPIIQENAVSGYSLFTCRKARPEPCHFKIYSGVAFEGEELNATFVQGADACQETCTKTIRCQFFTYSLLPQDCKAEGCKCSLRLSTDGSPTRITYEAQGSSGYSLRLCKVVESSDCTTKINAR/IVGGTNSSLGEWPWQVSLQVKLVSQNHMCGGSIIGRQWILTAAHCFDGIPYPDVWRIYGGILNLSEITNKTPFSSIKELIIHQKYKMSEGSYDIALIKLQTPLNYTEFQKPICLPSKADTNTIYTNCWVTGWGYTKERGETQNILQKATIPLVPNEECQKKYRDYVITKQMICAGYKEGGIDACKGDSGGPLVCKHSGRWQLVGITSWGEGCARKEQPGVYTKVAEYIDWILEKIQSSKERALETSPA(SEQ ID NO:5)
“活性”或“功能性”血浆激肽释放酶是指血浆激肽释放酶多肽或血浆激肽释放酶多肽片段，其保留类似的生物学和/或免疫学的活性，但不一定与天然产生的血浆激肽释放酶，包括成熟形式，一致。在一些实施方式中，活性或功能性血浆激肽释放酶是血浆激肽释放酶多肽或血浆激肽释放酶多肽片段，其结合C1-INH。
(ii)因子XII
因子XII是血清糖蛋白，其参与引发血液凝结、纤维蛋白溶解和缓激肽以及血管紧张素的产生。前激肽释放酶被因子XII切割，形成激肽释放酶，其然后激活因子XII，导致形成因子XIIa和因子XII片段(因子XIIf)(“Histidine-rich glycoprotein binds factorXIIa with high affinity and inhibits contact-initiated coagulation”Macquarrie等,Blood 117:4134-4141 2011)。已经显示C1抑制剂(C1-INH)是因子XIIa和因子XIIf二者的重要的血浆抑制剂(“Effect of negatively charged activating compounds oninactivation of factor XIIa by C1inhibitor”Pixley等,Arch Biochem Biophys 256(2):490-8 1987)。
人因子XIId前体蛋白质序列和mRNA序列显示在下面(登录号NM_000505.3和NP_000496.2)，以及激活形式的因子XIIa。
>gi|145275213|ref|NP_000496.2|凝结因子XII前体[智人]MRALLLLGFLLVSLESTLSIPPWEAPKEHKYKAEEHTVVLTVTGEPCHFPFQYHRQLYHKCTHKGRPGPQPWCATTPNFDQDQRWGYCLEPKKVKDHCSKHSPCQKGGTCVNMPSGPHCLCPQHLTGNHCQKEKCFEPQLLRFFHKNEIWYRTEQAAVARCQCKGPDAHCQRLASQACRTNPCLHGGRCLEVEGHRLCHCPVGYTGAFCDVDTKASCYDGRGLSYRGLARTTLSGAPCQPWASEATYRNVTAEQARNWGLGGHAFCRNPDNDIRPWCFVLNRDRLSWEYCDLAQCQTPTQAAPPTPVSPRLHVPLMPAQPAPPKPQPTTRTPPQSQTPGALPAKREQPPSLTR/2NGPLSCGQR/2LRKSLSSMTR/1VVGGLVALRGAHPYIAALYWGHSFCAGSLIAPCWVLTAAHCLQDRPAPEDLTVVLGQERRNHSCEPCQTLAVRSYRLHEAFSPVSYQHDLALLRLQEDADGSCALLSPYVQPVCLPSGAARPSETTLCQVAGWGHQFEGAEEYASFLQEAQVPFLSLERCSAPDVHGSSILPGMLCAGFLEGGTDACQGDSGGPLVCEDQAAERRLTLQGIISWGSGCGDRNKPGVYTDVAYYLAWIREHTVS(SEQID NO:6)
在该位置(353)的“/1切割导致全长FXIIa
在这些另外的位置(334和343)的“/2切割导致活性形式的FXII，其被称为β-FXIIa或FXIIf(FXIIa的片段)
“活性”或“功能性”因子XII是指因子XII多肽或因子XII多肽片段，其保留类似的生物学和/或免疫学的活性，但不一定与天然产生的因子XII，包括成熟形式，一致。在一些实施方式中，活性或功能性因子XII是因子XII多肽或因子XII多肽片段，其结合C1-INH。在一些实施方式中，活性或功能性因子XII是因子XIIa多肽或因子XIIa多肽片段，其结合C1-INH。在一些实施方式中，活性或功能性因子XII是因子XIIf多肽或因子XIIf多肽片段，其结合C1-INH。
C.检测剂
提供的方法允许检测捕获试剂例如本文公开的捕获试剂和C1-INH之间的复合物形成。复合物的检测可通过任何可用的方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，完成。例如，在一些实施方式中，使用C1-INH的抗体。在一些实施方式中，使用二次抗体，例如抗-抗-C1-INH抗体。一种或多种抗体可连接至检测部分。在一些实施方式中，检测部分是或包括荧光团。如本文使用的，术语“荧光团”(也称为“荧光标记”或“荧光染料”)是指在限定的激发波长吸收光能量和在不同的波长发射光能量的部分。在一些实施方式中，检测部分是或包括酶。在一些实施方式中，酶是从无色基质产生有色产物的酶(例如β-半乳糖苷酶)。
如本文中使用的，术语“测量(measuring)"或"测量(measurement)"或可选地，"检测(detecting)"或"检测(detection)"意味着评估样品中物质的存在、不存在、质量或量(其可以是有效量)，包括这样的物质的定量或定性浓度水平的推导，或以另外方式评价受试者的值或类别。
在一些实施方式中，通过将捕获剂添加至基质例如反应容器，例如在捕获剂结合基质的条件下，进行测试，例如利用ELISA。样品例如来自受试者的组织样品，例如血液、血浆或眼泪，可被加入到含有捕获剂的基质例如反应容器中。存在的任何结合捕获剂的分子均可结合固定的捕获剂分子。抗体或抗体-检测剂缀合物可被加入至反应混合物。缀合物的抗体部分结合之前结合的任何抗原分子(例如C1-INH)，产生抗体-抗原-抗体"夹心"。在洗去任何未结合的缀合物之后，可加入底物溶液以帮助检测。例如，在设定的间隔之后，反应可被停止(例如通过加入1N NaOH)，并且形成的有色产物的浓度可在分光光度计中被测量。颜色的密度与结合抗原的浓度成比例。
(i)抗体
抗体可用于提供的方法。在一些实施方式中，捕获剂是或包括抗体。在一些实施方式中，检测剂是或包括抗体。在一些实施方式中，用于治疗pKal-介导的或缓激肽-介导的病症的治疗组合是或包括抗体。
在一些实施方式中，抗体特异性结合靶抗原或表位，例如C1-INH。“特异性结合”抗原或表位的抗体是本领域熟知的术语，并且，测定这样的特异性结合的方法也是本领域熟知的。如果抗体与具体的靶抗原比与可选的靶标更频繁、更快速、更持久和/或以更大的亲和力反应或缔合，则认为所述抗体展示“特异性结合”。如果抗体相比于结合其他物质，以更大的亲和力、抗体亲抗原性、更容易和/或以更长的持续时间结合，则认为抗体“特异性结合”靶抗原或表位。例如，特异性(或优先)结合抗原(例如，C1-INH)或其中的抗原表位的抗体是这样的抗体：相比于其结合其他抗原或相同抗原中的其他表位，其以更大的亲和力、抗体亲抗原性、更容易和/或以更长的持续时间结合该靶抗原。通过阅读该定义也理解，例如特异性结合第一靶抗原的抗体可以或可以不特异性或优先结合第二靶抗原。这样，“特异性结合”或“优先结合”不一定要求(尽管其可包括)排他性结合。一般而言，但是不是必要的，提及结合意思是优先结合。在一些例子中，“特异性结合”靶抗原或其表位的抗体可能不结合其他抗原或相同抗原中的其他表位。
在一些实施方式中，本文所述的抗体对于靶抗原或抗原表位(例如，C1-INH)具有适当的结合亲和力。如本文所使用，“结合亲和力”指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所述的抗体可具有至少10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10M或更低的结合亲和力(KD)。增加的结合亲和力对应降低的KD。抗体相对于第二抗原对第一抗原更高的亲和力结合可由比对于结合第二抗原的KA(或数值KD)更高的结合第一抗原的KA(或更小数值KD)指示。在这样的情况下，抗体相对于第二抗原，具有对于第一抗原的特异性。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其他比较)可以是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000或105倍。
结合亲和力(或结合特异性)可通过本文所述的各种方法测定。
如本文所使用，术语“抗体”指包括至少一种免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质。例如，抗体可包括重(H)链可变区(本文简称为VH)，和轻(L)链可变区(本文简称为VL)。在另一例子中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”包括抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段(de Wildt等，Eur J Immunol.1996；26(3):629-39.))以及完整的抗体。抗体可具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亚型)的结构特征。抗体可来自任何来源，但是灵长类(人和非人灵长类)和灵长类源化(primatized)是优选的。
VH和VL区域可进一步划分成高变性的区域，称为“互补决定区”(“CDR”)，其散布有更加保守的区域，称为“框架区”(“FR”)。已经精确定义了框架区和CDR的范围(见，Kabat,E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生和人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242，和Chothia,C.等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917，也见www.hgmp.mrc.ac.uk)。本文使用Kabat定义。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，其从氨基端至羧基端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体的VH或VL链可进一步包括所有或部分重链或轻链恒定区，从而分别形成免疫球蛋白重链和轻链。在一种实施方式中，抗体是具有两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链和轻链通过例如二硫键相互连接。在IgG中，重链恒定区包括三个免疫球蛋白结构域，CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包括CL结构域。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ类型的。在一种实施方式中，抗体被糖基化。抗体对于抗体-依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性可以是功能性的。
抗体的一个或多个区域可以是人的或实际上是人的。例如，一个或多个可变区可以是人的或实际上是人的。例如，一个或多个CDR可以是人的，例如HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。每个轻链CDR均可以是人的。HC CDR3可以是人的。一个或多个框架区可以是人的，例如HC或LC的FR1、FR2、FR3和FR4。例如，Fc区域可以是人的。在一种实施方式中，所有的框架区是人的，例如具有人的体细胞例如产生免疫球蛋白的造血细胞或非造血细胞产生的抗体的框架的序列。在一种实施方式中，人序列是生殖系序列，例如由生殖系核酸编码的生殖系序列。在一种实施方式中，选择的Fab的框架(FR)残基可转化成最类似的灵长类生殖系基因，尤其是人生殖系基因中的相应残基的氨基酸类型。恒定区中的一个或多个可以是人的或实际上是人的。例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或100％的免疫球蛋白可变区、恒定区、恒定结构域(CH1、CH2、CH3、CL1)或整个抗体可以是人的或实际上是人的。
所有或部分抗体可由免疫球蛋白基因或其区段编码。示例性人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及许多免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25KDa或约214个氨基酸)由在NH2-末端(约110个氨基酸)的可变区基因和在COOH--末端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50KDa或约446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其他上述恒定区基因之一例如γ(编码约330个氨基酸)编码。人HC的长度变化很大，因为HC CDR3从约3个氨基酸残基变化至超过35个氨基酸残基。
术语全长抗体的“抗原结合片段”指保持特异性结合感兴趣靶标的能力的全长抗体的一个或多个片段。术语全长抗体的“抗原结合片段”包括的结合片段的例子包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)保持功能的分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可使用重组方法通过合成的连接体连接，所述连接体使它们能够形成为单个蛋白质链，其中VL和VH区域配对以形成称为单链Fv(scFv)的单价分子。见例如，美国专利5,260,203、4,946,778和4,881,175；Bird等(1988)Science 242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883。
可使用任何适当的技术获得抗体片段，所述技术包括本领域技术人员已知的常规技术。术语“单特异性抗体”指对于具体的靶标例如表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，其如本文所使用的指单一分子组合物的抗体或其片段的制剂，而不考虑抗体如何产生。
如本文所使用，“人源化的”免疫球蛋白可变区指这样的免疫球蛋白可变区：其被修饰以包括足够数量的人框架氨基酸位置，使得免疫球蛋白可变区不在正常人中引起免疫原性应答。“人源化的”免疫球蛋白的描述包括例如U.S.6,407,213和U.S.5,693,762。
抑制常数(Ki)提供对抑制剂效力的测量；其是使酶活性减半所需要的抑制剂的浓度并且不取决于酶或底物浓度。通过下列获得在不同的底物浓度的表观Ki(Ki,app)：测量不同浓度的抑制剂(例如，抑制结合蛋白)对反应程度的抑制作用(例如，酶活性)；将作为抑制剂浓度的函数的准一级速率常数的变化拟合至Morrison方程式(方程式1)，产生对表观Ki值的评估。从Ki,app对底物浓度的图的线性回归分析提取的y-截距获得Ki。
其中v＝测量速率；v0＝没有抑制剂的情况下的速率；Ki,app＝表观抑制常数；I＝总抑制剂浓度；和E＝总酶浓度。
D.试剂盒
本公开还提供用于评价在功能上抑制PKal和/或FXII的C1-INH的试剂盒。这样的试剂盒可包括：(a)本文所述的捕获试剂和(b)结合C1-INH的检测试剂，其也是在本文中被描述，例如抗-C1-INH抗体，和任选的(c)C1-INH。在一些实施方式中，捕获试剂包括(i)活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段；(ii)活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段；或(iii)(i)和(ii)的组合。在一些实施方式中，捕获试剂被固定在基质上诸如微板。
在一些实施方式中，试剂盒可包括根据本文所述的任何方法进行使用的说明书。包括的说明书可包括对如何使用试剂盒中包含的组分测量样品中功能性C1-INH水平的描述，所述样品可以是收集自人患者的生物样品。
与试剂盒使用相关的说明书一般包括关于每种组分的量和用于进行本文所述的试验方法适当的条件的信息。试剂盒中的组分可为单位剂量、散装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插入物(例如，试剂盒中包括的纸片)上的书面说明书，但是也可接受机器可读的说明书(例如，在磁盘或光盘上携带的说明书)。
标签或包装插入物指示试剂盒用于基于PKal和/或FXII的抑制评价功能性C1-INH的水平。可提供说明书用于实践本文所述的任何方法。
本发明的试剂盒在适当的包装中。适当的包装包括但不限于管形瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如，密封聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。也考虑与具体的设备一起使用的包装，比如吸入器、鼻施用设备(例如，雾化器)或注入设备比如微型泵。试剂盒可具有无菌进入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或管形瓶，其具有皮下注射针可刺破的阻塞物)。容器也可具有无菌进入口(例如容器可以是静脉注射溶液包或管形瓶，其具有皮下注射针可刺破的塞子)。
试剂盒可任选地提供另外的组分比如缓冲液和解释信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与其结合的标签或包装插入物(一个或多个)。在一些实施方式中，本公开提供了制造包括上述试剂盒内容物的制品。
测定方法在疾病诊断和预后中的应用
本文所述的测定方法和试剂盒可用于评估疾病，例如进行疾病的诊断或预后。评估可包括鉴定受试者具有本文所描述的疾病的风险或具有本文所描述的疾病，例如pKal介导的病症，比如HAE(例如I型和/或II型HAE)。评估也可包括监测疾病的治疗，比如评估治疗pKal介导的病症比如HAE(例如I型和/或II型HAE)的效力。
A.诊断
在一些实施方式中，执行测定方法和试剂盒，测定从候选受试者(例如被怀疑患有PKal-介导的病症诸如HAE的人患者)中收集的生物学样品(例如血液样品或血浆样品)的C1-INH的水平。然后，将C1-INH水平与参考值比较，以确定受试者是否具有pKal-介导的病症或处于pKal-介导的病症的风险。参考值可以是能够结合本文所述的捕获试剂(例如pKal或FXII)的C1-INH的对照水平。在一些实施方式中，对照水平是能够结合捕获试剂的对照样品，诸如获自健康受试者或健康受试者群体的样品(例如血液或血浆样品)中C1-INH的水平，所述健康受试者或健康受试者群体优选与候选受试者属于相同的物种。如本文中使用的，健康受试者是在测量C1-INH的水平时明显没有目标疾病(例如PKal-介导的病症诸如HAE)的受试者，或没有所述疾病的历史的受试者。
对照水平也可以是预定的水平。这样的预定的水平可表示不具有目标疾病或不处于目标疾病风险中的受试者群体中功能性C1-INH(能够结合捕获试剂)的水平。其还可表示不太可能受益于用pKal抑制剂进行治疗的受试者群体中功能性C1-INH的水平。
预定的水平可采用各种形式。例如，其可以是单个临界值(cut off value)，比如中值或平均值。在一些实施方式中，可基于比较组确定这样的预定水平，比如其中一个定义的组已知具有目标疾病和另一定义的组已知没有该目标疾病。可选地，预定的水平可以是一个范围例如表示在预定的百分数以内对照群体中功能性C1-INH的水平的范围。
可通过常规技术测定如本文所描述的对照水平。在一些例子中，可通过对如本文所述的对照样品进行常规方法(例如，为获得如本文所描述的测试样品中能够结合捕获剂的C1-INH的水平的相同测定)获得对照水平。在其他实例中，C1-INH的水平可获得自对照群体的成员，并且可通过例如计算程序分析结果，以获得代表对照群体中C1-INH的水平的对照水平(预定的水平)。
通过比较获得自候选受试者的样品中能够结合捕获剂的C1-INH的水平与本文所描述的参考值，可确定候选受试者是否具有pKal介导的疾病(例如，HAE)或处在上述疾病的风险中。例如，如果候选受试者的结合捕获剂的C1-INH的水平偏离参考值(例如，与参考值相比降低)，那么候选受试者可能被鉴定为具有疾病或处在所述疾病的风险中。
如本文中使用的，“升高的水平或高于参考值的水平”表示结合捕获试剂的C1-INH的水平高于参考值，诸如预定的阈值或对照样品中结合捕获试剂的C1-INH的水平。对照水平在本文详细描述。结合捕获试剂的C1-INH的升高的水平包括这样的C1-INH水平，其例如高于参考值1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。结合捕获试剂的C1-INH的升高的水平还包括增加从零状态(例如样品中没有或不可检测的结合捕获剂的C1-INH)到非零状态(例如样品中一些或可检测的结合捕获剂的C1-INH)的现象(phenomenon)。
如本文中使用的，“降低的水平或低于参考值的水平”表示结合捕获试剂的C1-INH的水平低于参考值，诸如预定的阈值或对照样品中结合捕获试剂的C1-INH。对照水平在本文详细描述。结合捕获试剂的C1-INH的降低的水平包括这样的C1-INH水平，其例如比参考值低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。结合捕获试剂的C1-INH的降低的水平还包括降低从非零状态(例如样品中一些或可检测的结合捕获剂的C1-INH)到零状态(例如样品中没有或不可检测的结合捕获剂的C1-INH)的症候。
在一些实施方式中，候选受试者是具有pKal介导的病症例如本文所公开的那些病症比如HAE的症状的人患者。例如，受试者患有水肿、肿胀，其中所述肿胀完全或主要是外周的；荨麻疹；发红、疼痛和没有感染迹象的肿胀；非组胺介导的水肿，肿胀的复发性发作或其组合。在其他实施方式中，受试者在收集样品时没有pKal介导的病症的症状、没有pKal介导的病症症状的历史或没有pKal介导的病症比如HAE的病史。在仍其他实施方式中，受试者耐受抗组胺疗法、皮质类固醇疗法或二者。
在一些实施方式中，涉及血浆激肽释放酶活性的疾病或病况是遗传性血管性水肿(HAE)。遗传性血管性水肿(HAE)也称为“Quincke水肿”、C1酯酶抑制剂缺陷、C1抑制剂缺陷和遗传性血管神经性水肿(HANE)。HAE的特征在于严重肿胀(血管性水肿)的复发发作，其可影响例如四肢、面部、生殖器、胃肠道和气道。HAE的症状包括例如臂、腿、嘴唇、眼睛、舌和/或喉咙的肿胀；可涉及喉咙肿胀和突然嘶哑的气道阻塞；没有明显原因的腹部痉挛的重复发作；和/或肠的肿胀，其可以是严重的并且可导致腹部痉挛、呕吐、脱水、腹泻、疼痛和/或休克。患该HAE的约三分之一的个体在发作期间被发展称为边缘性红斑的非痒皮疹。
气道的肿胀可威胁生命并且造成一些患者的死亡。死亡率估计为15-33％。HAE每年导致约15,000-30,000例急诊室访问。
创伤或压力例如牙科操作、疾病(例如，病毒疾病比如感冒和流感)、月经和外科手术可触发血管性水肿的发作。为了预防HAE的急性发作，患者可尝试避免先前造成发作的具体的刺激。但是，在许多情况下，在没有已知触发物的情况下出现发作。典型地，HAE症状首先出现在幼年期并且在青春期恶化。平均，未治疗的个体每1至2周发作，并且大部分发作持续约3至4天(ghr.nlm.nih.gov/condition/hereditary-angioedema)。发作的频率和持续时间在具有遗传性血管性水肿的人之间，甚至在同一家族的人之间变化非常大。
有三种类型的HAE，称为I、II和III型。估计HAE每50,000人中影响1个人，I型占病例的约85％，II型占病例的约15％，而III型非常少见。III型是最新描述的形式，并且最初认为仅发生在女性中，但是已经鉴定出具有受影响的男性的家族。在一些实施方式中，本文所述的测定方法可用于诊断I型HAE或II型HAE。见下面的实例。
HAE以常染色体显性模式遗传，使得受影响的人可从一个受影响的亲本遗传突变。也可发生基因的新突变，并且因此HAE也可出现在其家族没有该病症历史的人中。估计20-25％的病例源自新的自发突变。
SERPING1基因的突变造成I型和II型遗传性血管性水肿。SERPING1基因提供制备对于控制炎症重要的C1抑制剂蛋白质的指令。C1抑制剂阻止促进炎症的某些蛋白质的活性。造成I型遗传性血管性水肿的突变导致血液中C1抑制剂水平下降。相反，造成II型的突变导致产生功能异常的C1抑制剂。在没有适当水平的功能性C1抑制剂的情况下，产生过量的缓激肽。缓激肽通过增加流体穿过血管壁向身体组织的渗漏而促进炎症。身体组织中过量积聚的流体造成患有I型和II型遗传性血管性水肿的个体中可见的肿胀的发作。
F12基因的突变与III型遗传性血管性水肿的一些病例相关。F12基因提供制备凝结因子XII的指令。除了在血液凝固(凝结)中发挥关键的作用之外，因子XII也是炎症的重要的刺激剂并且参与产生缓激肽。F12基因中的某些突变导致产生具有增加活性的因子XII。结果，产生更多的缓激肽并且血管壁变得更渗漏，这导致肿胀的发作。III型遗传性血管性水肿的其他病例的原因仍是未知的。一个或多个仍未鉴定的基因中的突变可能是造成这些病例中的病症的原因。
HAE可与源自变态反应或其他医学病况的其他形式的血管性水肿类似地呈现，但是其病因和治疗明显不同。当遗传性血管性水肿被误诊为变态反应时，其最常见用抗组胺药、类固醇类和/或肾上腺素治疗，其通常对HAE无效，尽管肾上腺素可用于威胁生命的反应。对具有腹部肿胀的患者，误诊也导致不必要的试探性外科手术，并且在一些HAE患者中，腹部疼痛错误地诊断为身心失调的。
可例如，使用问卷例如由患者、临床医生或家族成员完成的问卷评估HAE的症状。这样的问卷是本领域已知的并且包括例如视觉模拟评分(visual analog scale)。见例如McMillan,C.V.等Patent.2012；5(2):113-26。
与血浆激肽释放酶活性有关的其他示例性疾病或病况包括非组胺-依赖性特发性血管性水肿、类风湿性关节炎、克罗恩病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、败血症性休克、烧伤、脑缺血性/再灌注损伤、脑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、黄斑性水肿、血管炎、动脉或静脉血栓形成、与心室辅助设备或支架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素-诱导的血小板减少症、血栓栓塞病和伴随不稳定的心绞痛的冠心病、水肿、眼病、痛风、肠疾病、口腔粘膜炎、神经病痛、炎性疼痛、椎管狭窄退行性脊柱病、术后肠梗阻、主动脉瘤、骨关节炎、遗传性血管性水肿、肺栓塞、中风、头部创伤或瘤周脑水肿、脓毒症、急性大脑中动脉(MCA)缺血性事件(中风)、再狭窄(例如血管成形术之后)、系统性红斑狼疮肾炎、自身免疫疾病、炎性疾病、心血管疾病、神经疾病、与蛋白质错折叠相关的疾病、与血管生成相关的疾病、高血压肾病和糖尿病性肾病、变应性疾病和呼吸疾病(例如过敏症、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、急性呼吸窘迫综合症、囊性纤维化、持续性鼻炎)和组织损伤(例如烧伤或化学损伤)。
被鉴定为具有PKal-介导的病症或处于PKal-介导的病症风险的受试者可以进行治疗，诸如本文所述的那些治疗。
B.评价治疗效力
本文所述的测定方法还可用于评价PKal-介导的病症(例如HAE)的治疗的效力。例如，在治疗前和治疗后或在治疗过程中，多个生物学样品(例如血液或血浆样品)可收集自进行治疗的受试者。功能性C1-INH的水平(能够抑制PKal和/或FXII)可通过本文所述的任意测定方法测量。如果功能性C1-INH的水平在治疗后或在治疗过程中增加(在稍后收集的样品中的功能性C1-INH的水平与较早收集的样品中的功能性C1-INH的水平进行比较)保持相同或增加，则指示治疗是有效的。在一些实例中，治疗涉及治疗剂诸如本文所述的激肽释放酶结合剂、本文所述的缓激肽B2受体拮抗剂或本文所述的C1-INH取代剂。治疗剂的实例包括但不限于DX-2930或DX88。
如果受试者被鉴定为不响应治疗，则更高剂量和/或更高的治疗剂给药频率被施用至经鉴定的受试者。在一些实施方式中，在被鉴定为响应治疗或不需要进一步治疗的受试者中保持、降低或终止治疗剂的剂量或给药频率。可选地，不同的治疗可施用至被发现为不响应第一治疗的受试者。
治疗
本文所述的还有治疗具有PKal-介导的病症诸如HAE或处于PKal-介导的病症诸如HAE风险中的受试者的方法。与参考值相比(例如如本文所述的)，受试者具有降低水平的功能性C1-INH(能够抑制PKal或FXII)，其可通过本文所述的任何测定方法测定。
处于pKal-介导的或缓激肽-介导的病症的风险中或遭受(例如具有)pKal-介导的或缓激肽-介导的病症的受试者可用任何适当的治疗剂治疗。在一些实施方式中，提供的方法包括基于测定的输出为受试者选择治疗。提供的测定允许检测样品中存在的功能性C1-INH和缓激肽途径的激活的成分，例如血浆激肽释放酶、因子XIIa和因子XIIa等，之间的相互作用。低水平的这类相互作用指示样品中低功能性C1-INH的水平。在一些实施方式中，为受试者选择治疗，例如用激肽释放酶结合剂，例如用C1-INH替代治疗剂，与对照样品或参考相比，所述受试者的样品具有小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的功能性CI-INH结合活性。
在一些实施方式中，方法包括以下两个步骤之一或二者：基于测定的输出，选择或施用治疗剂，例如如本文所描述的激肽释放酶结合剂，例如如本文所描述的缓激肽B2受体拮抗剂，例如如本文所描述的C1-INH取代剂，用于施用至受试者。
在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白或多肽被施用至受试者。在一些实施方式中，激肽释放酶结合剂是激肽释放酶抑制剂例如肽、小分子抑制剂、激肽释放酶抗体或其片段。在一些实施方式中，缓激肽B2受体的拮抗剂被施用至受试者。在一些实施方式中，C1-INH替换治疗剂被施用至受试者。
治疗剂例如激肽释放酶抑制剂例如缓激肽B2受体拮抗剂例如C1-INH取代剂，可与另一疗法一起施用，作为治疗涉及血浆激肽释放酶和/或缓激肽活性的疾病或病况的联合疗法的部分。例如，用激肽释放酶抑制剂、缓激肽B2受体拮抗剂或C1-INH取代剂中的一个或多个，例如用激肽释放酶抑制剂、缓激肽B2受体拮抗剂或C1-INH取代剂中的一个或多个和另一疗法的联合疗法，可以多种不同的配置被提供。第一试剂可在施用其他疗法之前或之后施用。在一些情况下，同时或时间上接近地(例如，注射之间的短时间间隔，比如相同的治疗期间)施用第一试剂和另一疗法(例如，治疗剂)。也可以更大的时间间隔施用第一试剂和其他疗法。
血浆激肽释放酶结合剂
血浆激肽释放酶结合剂(例如，结合蛋白，例如多肽，例如抑制性多肽，例如抗体，例如抑制性抗体或其他结合剂，例如小分子)是对各种疾病和病况有用的治疗剂，所述疾病和病况例如涉及血浆激肽释放酶活性的疾病和病况。例如，在一些实施方式中，涉及血浆激肽释放酶活性的疾病或病况是遗传性血管性水肿(HAE)。在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白或多肽被施用至处在pKal介导的或缓激肽介导的病症风险或遭受pKal介导的或缓激肽介导的病症的受试者。
激肽释放酶——组织和/或血浆激肽释放酶——的许多有用的蛋白质抑制剂包括Kunitz结构域。如本文所使用，“Kunitz结构域”是具有至少51个氨基酸的多肽结构域并且包含至少两个，和优选地三个，二硫键。折叠结构域，以便第一和第六半胱氨酸、第二和第四以及第三和第五半胱氨酸形成二硫键(例如，在具有58个氨基酸的Kunitz结构域中，半胱氨酸可存在于对应氨基酸5、14、30、38、51和55的位置，其根据下面提供的BPTI同源序列的编号，并且可在位置5和55，14和38，和30和51的半胱氨酸之间形成二硫键)，或者，如果存在两个二硫键，它们可在其半胱氨酸的相应的亚组之间形成。各半胱氨酸之间的间隔可在对应：5至55、14至38和30至51位置之间的下述间隔的7、5、4、3、2、1或0个氨基酸以内，其根据下面提供的BPTI序列的编号。BPTI序列可用作参考来指任何一般性Kunitz结构域中的具体位置。感兴趣的Kunitz结构域与BPTI的比较可通过鉴定最佳适合比对进行，其中比对的半胱氨酸的数量最大化。
BPTI的Kunitz结构域的3D结构(以高分辨率)是已知的。一种X射线结构作为"6PTI"存放在Brookhaven蛋白质数据库中(Brookhaven Protein Data Bank)。一些BPTI同源物的3D结构是已知的(Eigenbrot等，(1990)Protein Engineering，3(7):591-598；Hynes等，(1990)Biochemistry，29:10018-10022)。至少八十一个Kunitz结构域序列是已知的。已知的人同源物包括也称为组织因子途径抑制剂(TFPI)的LACI的三个Kunitz结构域(Wun等，(1988)J.Biol.Chem.263(13):6001-6004；Girard等，(1989)Nature，338:518-20；Novotny等，(1989)J.Biol.Chem.，264(31):18832-18837)、间-α-胰蛋白酶抑制剂APP-I的两个Kunitz结构域(Kido等，(1988)J.Biol.Chem.，263(34):18104-18107)、来自胶原蛋白的Kunitz结构域、TFPI-2的三个Kunitz结构域(Sprecher等，(1994)PNAS USA，91:3353-3357)、1型肝细胞生长因子活化剂抑制剂的Kunitz结构域、2型肝细胞生长因子活化剂抑制剂的Kunitz结构域、描述在美国专利出版号：2004-0152633中的Kunitz结构域。LACI是包含三个Kunitz结构域、分子量为39kDa(表1中的氨基酸序列)的人血清磷糖蛋白。
表1：示例性天然Kunitz结构域
上面的Kunitz结构域称为LACI-K1(残基50至107)、LACI-K2(残基121至178)和LACI-K3(213至270)。Wun等报道了LACI的cDNA序列(J.Biol.Chem.，1988，263(13):6001-6004)。Girard等(Nature，1989，338:518-20)报道了突变研究，其中三个Kunitz结构域的每个的P1残基均被改变。当F.VIIa复合至组织因子时，LACI-K1抑制因子VIIa(F.VIIa)，并且LACI-K2抑制因子Xa。
包含示例性Kunitz结构域的蛋白质包括下述蛋白质，其中SWISS-PROT登陆号在括弧中：
各种方法可用于鉴定来自序列数据库的Kunitz结构域。例如，可针对GenBank序列数据库(National Center for Biotechnology Information(国家生物技术信息中心)、National Institutes of Health(国立卫生研究院)、Bethesda MD)，例如使用BLAST；针对HMMs的Pfam数据库(Hidden Markov Models)(例如，使用Pfam搜索的默认参数；针对SMART数据库；或针对ProDom数据库，检索Kunitz结构域的已知氨基酸序列、共有序列或基序(例如，ProSite基序(ProSite Motif))。例如，Pfam版本9的Pfam登陆号PF00014提供了许多Kunitz结构域和HMM，用于鉴定Kunitz结构域。Pfam数据库的描述可见Sonhammer等(1997)Proteins28(3):405-420，并且HMM的详细说明可见于例如Gribskov等(1990)Meth.Enzymol.183:146-159；Gribskov等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4355-4358；Krogh等(1994)J.Mol.Biol.235:1501-1531；和Stultz等(1993)Protein Sci.2:305-314。HMMs的SMART数据库(Simple Modular Architecture Research Tool(简单模块架构研究工具)，EMBL，Heidelberg，DE)描述在Schultz等(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:5857和Schultz等(2000)Nucl.Acids Res 28:231中。SMART数据库包含通过用HMMer2搜素程序的隐马尔可夫模型进行性能分析(profiling)而鉴定的结构域(R.Durbin等(1998)Biological sequence analysis:probabilistic models of proteins and nucleicacids.Cambridge University Press(剑桥大学出版社))。也注释和监测数据库。ProDom蛋白质结构域数据库由同源的结构域的自动汇编组成(Corpet等(1999)，Nucl.AcidsRes.27:263-267)。使用SWISS-PROT 38和TREMBL蛋白质数据库的递归PSI-BLAST搜索(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Gouzy等(1999)Computers andChemistry 23:333-340.)构建当前版本的ProDom。数据库自动产生每个结构域的共有序列。Prosite列举了作为基序的Kunitz结构域并且鉴定包括Kunitz结构域的蛋白质。见例如Falquet等Nucleic Acids Res.30:235-238(2002)。
Kunitz结构域主要利用两个环区域(“结合环”)中的氨基酸与靶蛋白酶相互作用。第一环区域大概在对应BPTI的氨基酸13-20的残基之间。第二环区域大概在对应BPTI的氨基酸31-39的残基之间。Kunitz结构域的示例性文库改变第一和/或第二环区域的一个或多个氨基酸位置。当筛选与激肽释放酶相互作用的Kunitz结构域时或当选择改善的亲和力变体时，尤其有用的待改变的位置包括：就BPTI的序列而言，位置13、15、16、17、18、19、31、32、34和39。这些位置的至少一些预期密切接触靶蛋白酶。改变其他位置也是有用的，例如在三维结构中临近上述位置的位置。
Kunitz结构域的“框架区”被定义为是Kunitz结构域的部分的那些残基，但是尤其不包括第一和第二结合环区域中的残基，即，大概对应BPTI的氨基酸13-20和BPTI的31-39的残基。相反地，不在结合环中的残基可忍耐更宽范围的氨基酸取代(例如，保守和/或非保守取代)。
在一种实施方式中，这些Kunitz结构域是环状结构的变体形式，包括人脂蛋白相关的凝结抑制剂(LACI)蛋白质的Kunitz结构域1。LACI包含三个内部的、明确定义的肽环结构，其是典范Kunitz结构域(Girard，T.等，1989.Nature，338:518-520)。已经筛选、分离本文所述的LACI的Kunitz结构域1的变体，其以增强的亲和力和特异性结合激肽释放酶(见例如美国专利号5,795,865和6,057,287)。这些方法也可施用至其他Kunitz结构域框架，以获得与激肽释放酶例如血浆激肽释放酶相互作用的其他Kunitz结构域。激肽释放酶功能的有用调谐剂通常结合和/或抑制激肽释放酶，如使用激肽释放酶结合和抑制试验测定的。
在一些方面中，激肽释放酶结合剂(例如，结合蛋白，例如多肽，例如抑制性多肽，例如抗体，例如抑制性抗体或其他结合剂，例如小分子)结合血浆激肽释放酶的活性形式。在一些实施方式中，激肽释放酶结合剂结合和抑制血浆激肽释放酶，例如人血浆激肽释放酶和/或鼠激肽释放酶。
血浆激肽释放酶结合蛋白可以是全长(例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(例如，IgA1、IgA2)、IgD和IgE)或可仅仅包括抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2或scFv片段)。结合蛋白可包括两个重链免疫球蛋白和两个轻链免疫球蛋白，或可以是单链抗体。血浆激肽释放酶结合蛋白可以是重组蛋白质比如人源化的、CDR移植的、嵌合的、去免疫化的或体外产生的抗体，并且可任选地包括源自人生殖系免疫球蛋白序列的恒定区。在一种实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白是单克隆抗体。
在一些实施方式中，激肽释放酶结合蛋白结合和抑制血浆激肽释放酶例如人血浆激肽释放酶和/或鼠激肽释放酶。示例性血浆激肽释放酶结合蛋白公开在美国公开号20120201756中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，激肽释放酶结合蛋白是抗体(例如，人抗体)，其具有选自下述的抗体的轻链和/或重链：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X101-A01(本文也称为DX-2922)、X81-B01、X67-D03、X67-G04、X81-B01、X67-D03、X67-G04、X115-B07、X115-D05、X115-E09、X115-H06、X115-A03、X115-D01、X115-F02、X124-G01(本文也称为DX-2930)、X115-G04、M29-D09、M145-D11、M06-D09和M35-G04。在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白与同下述一样的表位竞争或结合同下述一样的表位：M162-A04、M160-G12、M142-H08、X63-G06、X101-A01(本文也称为DX-2922)、X81-B01、X67-D03、X67-G04、X81-B01、X67-D03、X67-G04、X115-B07、X115-D05、X115-E09、X115-H06、X115-A03、X115-D01、X115-F02、X124-G01(本文也称为DX-2930)、X115-G04、M29-D09、M145-D11、M06-D09和M35-G04。在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白是DX-2930。还见US20120201756，其通过引用并入本文。
下面提供了DX-2930的重链和轻链可变区序列。
DX-2930重链可变区：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRIGVPRRDEFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:9)
DX-2930轻链可变区：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEI(SEQ ID NO:10)
在一些方面中，激肽释放酶结合多肽(例如，抑制性多肽)结合活性形式的血浆激肽释放酶。示例性多肽血浆激肽释放酶试剂公开在美国专利号5,795,865、美国专利号5,994,125、美国专利号6,057,287、美国专利号6,333,402、美国专利号7,628,983和美国专利号8,283,321、美国专利号7,064,107、美国专利号7,276,480、美国专利号7,851,442、美国专利号8,124,586、美国专利号7,811,991和美国公开号20110086801中，其每一篇的全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，激肽释放酶结合多肽是DX-88(非天然产生的激肽释放酶抑制剂，也称为(艾卡拉肽(ecallantide))，SEQ ID NO：11)。在一些实施方式中，激肽释放酶抑制剂包括SEQ ID NO：11的氨基酸3-60的约58-氨基酸序列或具有SEQ ID NO：11的60-氨基酸序列的DX-88多肽，或由SEQ ID NO：11的氨基酸3-60的约58-氨基酸序列或具有SEQ ID NO：11的60-氨基酸序列的DX-88多肽组成。
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys ArgAla Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe IleTyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys LysMet Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO:11)
在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白是EPIKAL-2(SEQ ID NO：12)，其是非天然存在的激肽释放酶抑制剂，具有58残基氨基酸序列(SEQ ID NO：11的残基3-60)，并且在残基34具有Ile至Ser的氨基酸取代和在残基39具有Glu至Gly的氨基酸取代。EPIKAL-2的序列显示在下面：
EpiKal2：Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys ArgAla Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe SerTyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys LysMet Cys Thr Arg Asp(SEQ ID NO:12)
在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白与本文所述的结合蛋白可具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白在HC和/或LC框架区(例如，HC和/或LC FR 1、2、3和/或4)中可与本文所述的结合蛋白具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白在HC和/或LC CDR(例如，HC和/或LC CDR1、2和/或3)中与本文所述的结合蛋白可具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方式中，血浆激肽释放酶结合蛋白可在恒定区(例如，CH1、CH2、CH3、和/或CL1)可与本文所述的结合蛋白具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
缓激肽B2受体拮抗剂
在一些实施方式中，缓激肽B2受体拮抗剂被施用至受试者。示例性缓激肽B2受体拮抗剂包括Incatibant其是包含10个氨基酸的拟肽药物，其阻止天然缓激肽与缓激肽B2受体的结合。
C1-INH取代剂
在一些实施方式中，C1-INH取代剂被施用至受试者。示例性C1-INH取代剂是公众可获得的并且包括例如其是纯化的人巴氏消毒的纳米过滤的C1-INH缩合物。
C1抑制剂疗法以及针对HAE的其他疗法描述在Kaplan,A.P.，J Allergy ClinImmunol，2010，126(5):918-925中。
提供对HAE发作的急性治疗，以尽快阻止水肿的发展。静脉内施用的来自供体血液的C1抑制剂浓缩物是一种急性治疗；然而，该治疗在许多国家不可用。在C1抑制剂浓缩物不可用的紧急情况下，新鲜的冷冻血浆(FFP)可用作可选项，其也含有C1抑制剂。
源于人血液的纯化的C1抑制剂自1979年已经用于欧洲。若干C1抑制剂治疗现在可用于美国，和两种C1抑制剂产品可用于加拿大。经巴氏消毒的Berinert P(CSL Behring)在2009年被F.D.A批准用于急性发作。经纳米过滤的Cinryze(ViroPharma)在2008被F.D.A批准用于预防。Rhucin(Pharming)是正在开发的C1抑制剂，其不带来由于人血液携带的病原体造成的感染病传播的风险。
急性HAE发作的治疗也可包括用于疼痛缓解的药物和/或IV流体。
其他治疗方式可激励C1抑制剂的合成或降低C1抑制剂消耗。雄激素药物，诸如达那唑(danazol)可通过激励C1抑制剂的产生而降低发作的频率和严重性。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)可触发腹部发作。治疗幽门螺杆菌的抗生素将降低腹部发作。
更新的治疗攻击接触级联。Ecallantide(DX-88，Dyax)抑制血浆激肽释放酶，并且已经在美国得到批准。Icatibant(Shire)抑制缓激肽B2受体，并且已经在欧洲和美国得到批准。
HAE的诊断可依赖，例如家族史和/或血液测试。描述了与I、II和III型HAE有关的实验室发现，例如在Kaplan,A.P.，J Allergy Clin Immunol，2010，126(5):918-925中。在I型HAE中，与C4的水平一样，C1抑制剂的水平被降低，然而C1q水平正常。在II型HAE中，C1抑制剂的水平正常或增加；然而，C1抑制剂功能不正常。C4水平降低和C1q水平正常。在III型中，C1抑制剂、C4和C1q的水平都可以是正常的。
C1抑制剂疗法以及针对HAE的其他疗法描述在Kaplan,A.P.，J Allergy ClinImmunol，2010，126(5):918-925中。
下面提供HAE的示例性疗法。提供HAE发作的急性治疗，以尽快阻止水肿的发展。静脉内施用的来自供体血液的C1抑制剂浓缩物是一种急性治疗；然而，该治疗在许多国家不可用。在C1抑制剂浓缩物不可用的紧急情况下，新鲜的冷冻血浆(FFP)可用作可选项，因为其也含有C1抑制剂。
源于人血液的纯化的C1抑制剂自1979年已经用于欧洲。若干C1抑制剂治疗现在可用于美国，和两种C1抑制剂产品可用于加拿大。经巴氏消毒的Berinert P(CSL Behring)在2009年被F.D.A批准用于急性发作。经纳米过滤的Cinryze(ViroPharma)在2008年被F.D.A批准用于预防。Rhucin(Pharming)是正在开发的C1抑制剂，其不带来由于人血液携带的病原体造成的感染病传播的风险。
急性HAE发作的治疗也可包括用于疼痛缓解的药物和/或IV流体。
其他治疗方式可激励C1抑制剂的合成或降低C1抑制剂消耗。雄激素药物，诸如达那唑可通过激励C1抑制剂的产生而降低发作的频率和严重性。
幽门螺杆菌可触发腹部发作。治疗幽门螺杆菌的抗生素将降低腹部发作。
更新的治疗攻击接触级联。EcallantideDX-88，Dyax)抑制血浆激肽释放酶，并且已经在美国得到批准。Icatibant(Shire)抑制缓激肽B2受体，并且已经在欧洲和美国得到批准。
HAE的诊断可依赖，例如家族史和/或血液测试。描述了与I、II和III型HAE有关的实验室发现，例如在Kaplan,A.P.，J Allergy Clin Immunol，2010，126(5):918-925中。在I型HAE中，与C4的水平一样，C1抑制剂的水平被降低，然而C1q水平正常。在II型HAE中，C1抑制剂的水平正常或增加；然而，C1抑制剂功能不正常。C4水平降低和C1q水平正常。在III型中，C1抑制剂、C4和C1q的水平都可以是正常的。
以下实施例提供进一步示例，并且不是限制性的。
实施例
实施例1.利用激活的因子XII和/或血浆激肽释放酶用于量化血浆中的功能性Cl-INH的复合ELISA
已经证明C1抑制剂，C1-INH，的功能异常存在于II型遗传性血管性水肿(HAE)中，其导致抑制剂无效。I型HAE具有低的总C1-INH蛋白质水平。III型HAE与正常的C1-INH水平相关。(“Enzymatic pathways in the pathogenesis of hereditary angioedema:Therole of C1inhibitor therapy.”Kaplan,A.，The Journal of Allergy and ClinicalImmunology 126(5):918-25 2010)。C1-INH抑制因子XIIa、因子XII片段(XIIf)、激肽释放酶和纤溶酶。在没有C1-INH功能时，缓激肽形成级联的显著激活导致严重血管性水肿。I型HAE通常表征为降低的总C1-INH水平。II型HAE通常表征为正常到增加的C1-INH水平，然而C1-INH的功能是不正常的。导致III型HAE的机理较不能被充分表征，并且，III型HAE主要在雌性患者中被描述。
遗传性血管性水肿(HAE)可利用测定例如生色测定或ELISA测定诊断，以抑制补体的激活的第一组分(例如针对C1抑制剂的功能性测定)。在一些情况下，使用基于C1INH的C1s捕获的测定。现有生色HAE诊断测定通常被认为是优选的，但是两种方法都具有局限性。生色测定更可能具有偶然的假阳性，而复合ELISA仅具有62％的阴性预测值。而且，现有诊断方法的理论限制是对补体的激活的第一组分的C1-INH的抑制性活性与HAE疾病病因学关系不大。
我们已经开发了检测C1抑制剂作为缓激肽形成途径中的抑制剂的功能的方法，缓激肽形成途径与C1抑制剂在导致血管性水肿中的致病作用直接相关。提供的测定允许分析C1-INH能够或不能抑制激活的因子XII和血浆激肽释放酶，所述激活的因子XII和血浆激肽释放酶导致缓激肽过量产生，这进而又导致血管性水肿。本实施例描述通过复合ELISA对功能性C1-INH进行测定，以检验激活的因子XII、血浆激肽释放酶或两者的抑制。这些测定对I和II型HAE的诊断具有良好的敏感性。
我们的方法是使活性酶生物素化，使其结合抗生物素蛋白涂覆的板，用血浆(对照为正常的，推定的HAE血浆为未知的)进行孵育，和测量酶-C1-INH复合物。我们应用碱性磷酸酶标记的C1-INH的抗体用于检测结合的C1-INH。为了量化C1-INH，通过用缓冲液中已知量的C1-INH替代血浆来制备标准曲线。重要的是，如果其他类型的血管性水肿(例如III型HAE)具有抑制C1s而不是激活的因子XII或激肽释放酶的突变的C1-INH，则提供的测定允许检测异常，而应用任一当前可用的测定都会错过该诊断。约5％的患者具有正常的C4水平，即使C1-INH是不正常的。在II型中，提供的功能性测定对于诊断是重要的，因为C1-INH蛋白质水平是正常的。提供的方法(一种或多种)尤其可用于该情况。图1和2对比I和II型与HAE两个正常对照，表明通过其可容易进行诊断。基于缓激肽形成酶，功能性C1-INH从没有在III型HAE患者中被测量到，并且我们证明它是正常的(～40％)。
Immulon 2HB板用5μg/ml抗生物素蛋白在涂布缓冲液(100μl)中在4℃被涂覆过夜。板利用PBS-Tween被洗涤三次(200μl/每次)。随后，PBS中的200μl 1％BSA被加入以阻断未使用的位点。板在37℃被孵育1hr。板利用PBS-Tween被洗涤三次(200μl/每次)。加入到板中的是：25μl标准品或样品、25μl生物素化的因子XII1和/或生物素化的激肽释放酶(1μg/ml)和50μl结合缓冲液。板在37℃被混合和孵育1小时。板利用PBS-Tween被洗涤三次(200μl/每次)。加入C1-INH的多克隆抗体并在室温下孵育1小时。板利用PBS-Tween被洗涤三次(200μl/每次)。加入碱性磷酸酶缀合的二次抗体并在室温下孵育1小时。板利用PBS-Tween被洗涤三次(200μl/每次)。加入用于显色的基质并在室温下孵育10分钟。读取450nm处的OD，并利用标准曲线进行计算。
如示于图1和2，复合ELISA测定正确地鉴定了与正常对照相比的具有低功能性C1-INH的I型和II型HAE患者。开发测定的一个考虑因素是应用基于对于缓激肽形成必须的酶量化功能性C1-INH的测定是有益的。测定可应用激活形式的因子XII(因子XIIa或因子XIIf)或血浆激肽释放酶之一。除了C1-INH之外，因子XIIa在血浆中没有其他明显的抑制剂。除了通过C1-INH进行抑制之外，血浆激肽释放酶还通过α2巨球蛋白被抑制。然而，检测C1-INH和因子XIIa或激肽释放酶之间的功能相互作用的复合ELISA测定很好地起作用，因为仅通过C1-INH抑制的激肽释放酶(～60％)的部分被检测。
实施例2.基于激活的因子XII和/或血浆激肽释放酶的抑制对遗传性血管性水肿的诊断测定
方法
患者和样品收集：HAE的诊断通过临床表现、低C1-INH蛋白质和/或功能水平(利用商业测定)进行。来自具有HAE的42名患者和23名健康对照的柠檬酸化的血浆通过在4℃，2000rpm离心新鲜收集的血液10分钟而被分离。所有样品均立即被等分和存储在-80℃。在所有参与点(Odense，Denmark；Budapest，Hungary)类似地处理样品和在干冰上过夜运输。方案通过两个参与点的伦理委员会(Ethics Committee)和数据管理局(Data ProtectionAgency)批准。
纯化的人因子XIIa和激肽释放酶获自酶研究实验室(Enzyme ResearchLaboratories)(South Bend,IN)，生物素化试剂获自Thermo Scientific(Rockford，IL)，并且所有其他试剂获自Sigma chemical company(St.Louis，MO)。
蛋白质的生物素化：根据制造商的推荐生物素化蛋白质。简言之，1mg蛋白质(激肽释放酶或因子XII)被溶于0.5ml的磷酸缓冲盐水(PBS)中。大约27μl的新鲜制备的10mMSulfo-NHS-LC-生物素加入到蛋白质溶液，并在冰上孵育2小时。过多非反应的和水解的生物素利用旋转脱盐柱(spin-desalting column)去除。蛋白质的标记通过ELISA确定和蛋白质浓度通过Bradford测定确定(8)。
量化测定血浆中C1-INH的ELISA：Immulon 2HB板用5μg/ml C1-INH的多克隆抗体涂布。在用PBS中的1％BSA阻断之后，加入样品和标准品和在室温下孵育1h。结合的C1-INH用碱性磷酸酶缀合的C1-INH的单克隆抗体探测，然后利用5-溴-4-氯吲哚基磷酸盐/硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium)(BCIP/NBT)显色。
基于激肽释放酶和因子XII的抑制量化血浆中功能性C1-INH：Immulon 2HB板用5μg/ml抗生物素蛋白在涂布缓冲液(100μl)中在4℃涂布过夜。板利用PBS-Tween被洗涤三次(200μl/每次)。随后，加入200μl PBS中的1％BSA，以阻断未使用的位点。板在37℃被孵育1小时和利用PBS-Tween被洗涤三次(200μl/每次)。样品或标准品与生物素化蛋白质被加入到板中(25μl标准品或样品，25μl生物素化的因子XII或生物素化的激肽释放酶(1μg/ml)和50μl结合缓冲液)并被混合，并在37℃孵育1小时。孵育后，板利用PBS-Tween再次被洗涤三次(200μl/每次)和加入C1-INH的多克隆抗体并在室温下孵育1小时。板再次被洗涤和加入碱性磷酸酶缀合的二次抗体和在室温下孵育1小时，然后利用磷酸酶基质BCIP/NBT显色。读取450nm处的OD，并利用标准曲线进行计算。方法按步骤总结在图1中。
基于补体的抑制功能性ELISA：ELISA试剂盒购自Quidel Corporation，用于测量功能性C1-INH的量。该测定是基于血浆C1-INH抑制激活的C1s的能力(复合ELISA)。测定根据制造商的方案执行。
结果
通过抑制C1s诊断HAE：来自正常对照的23个样品和来自患有I型或II型HAE的患者的42个样品利用现有商业测定(复合ELISA)进行测试。根据测定说明，“正常”为68-100％的C1-INH，而“异常”低于67％。说明书指示，41％和67％之间的样品需要被重复，因为它们被认为是不可靠的，但是如果重复值在这两个数字之内，则报告为正常的。作为正常的百分数供应标准品，即，标准品是0％、23％、44％、66％和88％，并且未知的从曲线读取。正常对照样品在80％和100％之间变化，而HAE样品在0和81％之间变化。HAE样品的平均和标准偏差是38±17％。HAE患者中的两个的诊断利用该测定被错过。
通过激肽释放酶或因子XIIa的抑制诊断HAE：采用血浆激肽释放酶的抑制或因子XIIa的抑制的结果表示为复合物形成的mg/ml，分别显示于图4B和4C中，其中，将正常对照与获自具有I和II型HAE的患者的样品进行比较。以μg/ml表示的因子XIIa-C1-INH的平均和标准偏差是：正常，63.1+12.4；和I和II型HAE，6.1+5.4。比较I和II型HAE与正常对照的“P”值为<0.0001。测定激肽释放酶-C1-INH复合物获得的结果非常类似，在HAE和对照组之间没有重叠。
本文的结果显示，基于激肽释放酶或因子XIIa的抑制的测定正确鉴定了所有测试的I型和II型HAE患者，其显示与正常对照相比的较低水平的功能性C1-INH(图3和4)。因此，本文所述的测定方法与常规方法相比在基于功能上抑制PKal和/或FXII的C1-INH水平测定功能性C1-INH的水平和鉴别患有PKal-介导的疾病(例如HAE)的患者方面明显具有敏感性。
本文使用的方法是使活性酶生物素化，使其结合抗生物素蛋白涂覆的板，用血浆(对照为正常的，推定的HAE血浆为未知的)进行孵育和测量酶-C1-INH复合物。C1-INH的碱性磷酸酶标记的抗体用于检测结合的C1-INH。为量化C1-INH，通过用缓冲液中已知量的C1-INH替代血浆制备标准曲线。而且，如果其他类型的血管性水肿(对于实施例，III型HAE)具有抑制C1s而不是激活的因子XII或激肽释放酶的突变C1-INH，该异常可利用该方法检测，然而，以任一当前可用的测定会错过该诊断。本文所述的测定具有替代当前的商业方法的可能性，用于诊断I和II型HAE，因为两种测定对于检测功能失调的C1-INH相比于检测C1s的抑制更敏感，并且还可用于评价其中应用其他方法获得不可靠结果的患者。在无临床症状时，约5％的患者具有正常的C4水平，即使C1-INH是不正常的，并且在II型HAE患者中诊断依赖于功能性测定，因为蛋白质水平通常是正常的或甚至升高。本文所述的测定尤其可用于这种情况。总之，I和II型HAE的诊断可通过缓激肽形成级联的酶的抑制被确定，以便通过与导致血管性水肿异常直接相关的功能性评价进行诊断。
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其他实施方式
本说明书中公开的所有特征可以任何组合结合。本说明书中公开的每个特征可通过服务于相同、等同或类似的目的的可选特征替换。因此，除非另外明确指出，公开的每个特征仅仅是一系列普通的等同物或类似特征的例子。
通过上面的说明书，本领域技术人员可容易知道本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本发明作出各种改变和修饰，以使其适合各种用途和条件。因此，其他实施方式也在权利要求范围内。
序列表
<110> 戴埃克斯有限公司
K•约瑟夫
A•P•卡普兰
<120> PKAL-介导的病症的评估、测定和治疗
<130> D0617.70058WO00
<140> TBD
<141> 2014-01-17
<150> US 61/754,600
<151> 2013-01-20
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版本
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290 295 300
Glu Glu Leu Asn Ala Thr Phe Val Gln Gly Ala Asp Ala Cys Gln Glu
305 310 315 320
Thr Cys Thr Lys Thr Ile Arg Cys Gln Phe Phe Thr Tyr Ser Leu Leu
325 330 335
Pro Gln Asp Cys Lys Ala Glu Gly Cys Lys Cys Ser Leu Arg Leu Ser
340 345 350
Thr Asp Gly Ser Pro Thr Arg Ile Thr Tyr Glu Ala Gln Gly Ser Ser
355 360 365
Gly Tyr Ser Leu Arg Leu Cys Lys Val Val Glu Ser Ser Asp Cys Thr
370 375 380
Thr Lys Ile Asn Ala Arg Ile Val Gly Gly Thr Asn Ser Ser Leu Gly
385 390 395 400
Glu Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Val Lys Leu Val Ser Gln Asn
405 410 415
His Met Cys Gly Gly Ser Ile Ile Gly Arg Gln Trp Ile Leu Thr Ala
420 425 430
Ala His Cys Phe Asp Gly Ile Pro Tyr Pro Asp Val Trp Arg Ile Tyr
435 440 445
Gly Gly Ile Leu Asn Leu Ser Glu Ile Thr Asn Lys Thr Pro Phe Ser
450 455 460
Ser Ile Lys Glu Leu Ile Ile His Gln Lys Tyr Lys Met Ser Glu Gly
465 470 475 480
Ser Tyr Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Gln Thr Pro Leu Asn Tyr Thr
485 490 495
Glu Phe Gln Lys Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Ala Asp Thr Asn Thr
500 505 510
Ile Tyr Thr Asn Cys Trp Val Thr Gly Trp Gly Tyr Thr Lys Glu Arg
515 520 525
Gly Glu Thr Gln Asn Ile Leu Gln Lys Ala Thr Ile Pro Leu Val Pro
530 535 540
Asn Glu Glu Cys Gln Lys Lys Tyr Arg Asp Tyr Val Ile Thr Lys Gln
545 550 555 560
Met Ile Cys Ala Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Ile Asp Ala Cys Lys Gly
565 570 575
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys His Ser Gly Arg Trp Gln Leu
580 585 590
Val Gly Ile Thr Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Glu Gln Pro
595 600 605
Gly Val Tyr Thr Lys Val Ala Glu Tyr Ile Asp Trp Ile Leu Glu Lys
610 615 620
Ile Gln Ser Ser Lys Glu Arg Ala Leu Glu Thr Ser Pro Ala
625 630 635
<210> 6
<211> 615
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Arg Ala Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Val Ser Leu Glu Ser
1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Pro Pro Trp Glu Ala Pro Lys Glu His Lys Tyr Lys
20 25 30
Ala Glu Glu His Thr Val Val Leu Thr Val Thr Gly Glu Pro Cys His
35 40 45
Phe Pro Phe Gln Tyr His Arg Gln Leu Tyr His Lys Cys Thr His Lys
50 55 60
Gly Arg Pro Gly Pro Gln Pro Trp Cys Ala Thr Thr Pro Asn Phe Asp
65 70 75 80
Gln Asp Gln Arg Trp Gly Tyr Cys Leu Glu Pro Lys Lys Val Lys Asp
85 90 95
His Cys Ser Lys His Ser Pro Cys Gln Lys Gly Gly Thr Cys Val Asn
100 105 110
Met Pro Ser Gly Pro His Cys Leu Cys Pro Gln His Leu Thr Gly Asn
115 120 125
His Cys Gln Lys Glu Lys Cys Phe Glu Pro Gln Leu Leu Arg Phe Phe
130 135 140
His Lys Asn Glu Ile Trp Tyr Arg Thr Glu Gln Ala Ala Val Ala Arg
145 150 155 160
Cys Gln Cys Lys Gly Pro Asp Ala His Cys Gln Arg Leu Ala Ser Gln
165 170 175
Ala Cys Arg Thr Asn Pro Cys Leu His Gly Gly Arg Cys Leu Glu Val
180 185 190
Glu Gly His Arg Leu Cys His Cys Pro Val Gly Tyr Thr Gly Ala Phe
195 200 205
Cys Asp Val Asp Thr Lys Ala Ser Cys Tyr Asp Gly Arg Gly Leu Ser
210 215 220
Tyr Arg Gly Leu Ala Arg Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Cys Gln Pro
225 230 235 240
Trp Ala Ser Glu Ala Thr Tyr Arg Asn Val Thr Ala Glu Gln Ala Arg
245 250 255
Asn Trp Gly Leu Gly Gly His Ala Phe Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp
260 265 270
Ile Arg Pro Trp Cys Phe Val Leu Asn Arg Asp Arg Leu Ser Trp Glu
275 280 285
Tyr Cys Asp Leu Ala Gln Cys Gln Thr Pro Thr Gln Ala Ala Pro Pro
290 295 300
Thr Pro Val Ser Pro Arg Leu His Val Pro Leu Met Pro Ala Gln Pro
305 310 315 320
Ala Pro Pro Lys Pro Gln Pro Thr Thr Arg Thr Pro Pro Gln Ser Gln
325 330 335
Thr Pro Gly Ala Leu Pro Ala Lys Arg Glu Gln Pro Pro Ser Leu Thr
340 345 350
Arg Asn Gly Pro Leu Ser Cys Gly Gln Arg Leu Arg Lys Ser Leu Ser
355 360 365
Ser Met Thr Arg Val Val Gly Gly Leu Val Ala Leu Arg Gly Ala His
370 375 380
Pro Tyr Ile Ala Ala Leu Tyr Trp Gly His Ser Phe Cys Ala Gly Ser
385 390 395 400
Leu Ile Ala Pro Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Gln Asp
405 410 415
Arg Pro Ala Pro Glu Asp Leu Thr Val Val Leu Gly Gln Glu Arg Arg
420 425 430
Asn His Ser Cys Glu Pro Cys Gln Thr Leu Ala Val Arg Ser Tyr Arg
435 440 445
Leu His Glu Ala Phe Ser Pro Val Ser Tyr Gln His Asp Leu Ala Leu
450 455 460
Leu Arg Leu Gln Glu Asp Ala Asp Gly Ser Cys Ala Leu Leu Ser Pro
465 470 475 480
Tyr Val Gln Pro Val Cys Leu Pro Ser Gly Ala Ala Arg Pro Ser Glu
485 490 495
Thr Thr Leu Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly His Gln Phe Glu Gly Ala
500 505 510
Glu Glu Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Pro Phe Leu Ser
515 520 525
Leu Glu Arg Cys Ser Ala Pro Asp Val His Gly Ser Ser Ile Leu Pro
530 535 540
Gly Met Leu Cys Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Thr Asp Ala Cys Gln
545 550 555 560
Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Asp Gln Ala Ala Glu Arg
565 570 575
Arg Leu Thr Leu Gln Gly Ile Ile Ser Trp Gly Ser Gly Cys Gly Asp
580 585 590
Arg Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Asp Val Ala Tyr Tyr Leu Ala Trp
595 600 605
Ile Arg Glu His Thr Val Ser
610 615
<210> 7
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 7
Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu
20 25 30
Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys
35 40 45
Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys
50 55 60
Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu
65 70 75 80
Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser
85 90 95
Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile
100 105 110
Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu
115 120 125
Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn
130 135 140
Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly
145 150 155 160
Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu
165 170 175
Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn
180 185 190
Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu
195 200 205
Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly
210 215 220
Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly
225 230 235 240
Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn
245 250 255
Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile
260 265 270
Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys
275 280 285
Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met
290 295 300
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 8
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala
1 5 10 15
Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr
20 25 30
Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala
35 40 45
Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala
50 55
<210> 9
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Tyr Arg Arg Ile Gly Val Pro Arg Arg Asp Glu Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105
<210> 11
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 11
Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys
1 5 10 15
Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys
20 25 30
Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu
35 40 45
Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp
50 55 60
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 12
Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala
1 5 10 15
Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu
20 25 30
Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu
35 40 45
Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp
50 55

Claims (14)

1.有效量治疗剂在制造用于治疗具有pKal-介导的病症的受试者的药物中的用途，其中所述治疗剂是激肽释放酶结合剂、缓激肽B2受体拮抗剂或C1-INH取代剂，
其中，所述受试者具有与参考值相比下降的能够结合捕获试剂的C1-INH的水平，并且
其中，所述捕获试剂包括：
i)活性形式的因子XII或其C1-INH-结合片段；
ii)活性形式的激肽释放酶或其C1-INH-结合片段；或
iii)i)和ii)的组合。
2.权利要求1所述的用途，其中，所述受试者是人HAE患者。
3.权利要求1或权利要求2所述的用途，其中，所述治疗剂是DX-88、DX-2930或EPIKAL-2。
4.权利要求1所述的用途，其中，所述受试者的C1-INH的水平通过下述方法测量，所述方法包括：
使包含C1-INH的样品与捕获试剂接触，和
测量与所述捕获试剂结合的样品中所述C1-INH的水平。
5.权利要求1或权利要求4所述的用途，其中，结合所述捕获试剂的C1-INH的水平利用结合C1-INH的检测剂测量。
6.权利要求5所述的用途，其中，所述检测剂是结合C1-INH的抗体。
7.权利要求1-6中任一项所述的用途，其中，所述捕获试剂被固定在基质上。
8.权利要求1-7中任一项所述的用途，其中，所述捕获试剂包括所述活性形式的因子XII、所述活性形式的血浆激肽释放酶或其组合。
9.权利要求1-8中任一项所述的用途，其中，结合所述捕获试剂的C1-INH的水平通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量。
10.权利要求1所述的用途，其中所述受试者具有pKal-介导的病症的症状。
11.权利要求10所述的用途，其中所述受试者耐受抗组胺疗法、皮质类固醇疗法或两者。
12.权利要求10所述的用途，其中所述症状是水肿。
13.权利要求10所述的用途，其中所述症状是：
肿胀的复发性发作；
肿胀，其中，所述肿胀完全或主要是外周的；
荨麻疹；
在没有感染的迹象的情况下发红、疼痛和肿胀；或
非组胺-介导的水肿。
14.权利要求1所述的用途，其中所述受试者在收集样品时没有pKal介导的病症的症状、没有pKal介导的病症症状的历史或没有pKal介导的病症的历史。
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