KR20210153097A

KR20210153097A - 기능성 c1 에스테라제 저해제(fc1-inh)의 정량 방법

Info

Publication number: KR20210153097A
Application number: KR1020217037072A
Authority: KR
Inventors: 프리야 세투 초칼링감; 용취엔 라이; 지앙 우; 구오동 장; 쥐웨이 저우
Original assignee: 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2021-12-16
Also published as: US11754570B2; MX2021012581A; CA3137014A1; CN114402200A; US20200348311A1; IL287294A; JP2022529265A; CO2021014146A2; AU2020258869A1; TW202104900A; EP3956667B1; WO2020214638A1; EP3956667A1

Abstract

건조 혈반 유래의 fC1-INH를 정량하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 이러한 방법은 지지 부재 상에 혈액 샘플을 점적 및 건조시키는 단계, 건조된 혈액 샘플에서 단백질을 추출하는 단계, 및 추출된 단백질 중 fC1-INH의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

기능성 C1 에스테라제 저해제(FC1-INH)의 정량 방법

관련 출원

본 출원은 2019년 4월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/834,461호 및 2019년 11월 7일자로 출원된 미국 가출원 제62/932,011호의 35 U.S.C.§ 119(e) 하의 이익을 주장하며; 이들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

유전성 혈관부종(HAE)은 혈장 단백질 C1 에스테라제 저해제(간단히 C1 저해제, C1-INH)의 유전적 결핍 또는 기능장애로 인해 발생하는 드문 상염색체 우성 유전자 질환이다. HAE는 일반적으로 얼굴, 피부, 장 및/또는 기도를 수반하는 혈관부종의 재발성 에피소드를 특징으로 한다. 이 증상은 HAE 복합증으로 진단하게 하는 다른 질병에서 발견될 수 있다. HAE는 주로 두 가지 유형으로 나뉠 수 있다. I형은 낮은 수준의 C1-INH 단백질을 특징으로 하고 HAE 발병의 약 85%를 차지하는 반면, II형은 기능성 C1-INH(functional plasma C1-esterase inhibitor: fC1-INH)은 낮지만, 정상 또는 상승된 C1-INH 단백질 수준을 특징으로 하고 약 15%를 차지한다. 치료되지 않은 I형 및 II형 환자에서 단위/㎖로 측정되는 경우, 전형적인 fC1-INH는 정상 수준의 5 내지 30%이다.

fC1-INH를 측정하기 위한 현재 이용가능한 검정은 혈장 기반의 검정이다. 자주 사용되는 검정은 합성 C1-에스테라제 특이적 기질을 사용하여 테스트 샘플 중 C1-INH에 의한 C1-에스테라제 활성 저해를 간접적으로 측정하는 발색 검정이다. 또 다른 일반적으로 사용되는 검정은 보체 단백질 성분 C1s에 대한 C1-INH의 기능적 결합을 측정하는 ELISA 검정이다. 그러나, 중앙 테스트 실험실로 샘플을 수송하고 보관하는 것은 종종 혈장 기반 검정에 불편하다.

생물학적 샘플 중 fC1-INH를 측정하기 위해 중앙 실험실에서 진행될 수 있는 간단하고 사용자 친화적인 방법을 개발하는 것이 큰 관심을 끈다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로, 기능성 혈장 C1-에스테라제 저해제(fC1-INH)를 함유하는 건조 혈반(dried blood spot)을, 예를 들어, C1-에스테라제 효소 반응으로부터 유래된 기질 생성물(C1s 기질 생성물)을 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC-MS)을 통해 측정함으로써 분석하는데 사용하는 것을 수반하는, 간단하고, 민감하며 선택적인 검정의 개발을 기반으로 한다.

따라서, 본 개시내용의 일 양상은 건조 혈액 샘플 중 fC1-INH의 수준을 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (i) 지지 부재 상에 대상체의 혈액 샘플을 점적(spotting)하는 단계; (ii) 지지 부재 상의 혈액 샘플을 건조시켜 건조 혈반을 형성시키는 단계; (iii) (ii)의 건조 혈반으로부터 단백질을 추출하는 단계; 및 (iv) 존재하는 경우, (iii)에서 추출된 단백질 중 fC1-INH의 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 이러한 측정은 보정 곡선에 대비하여 수행하거나 보정 곡선과 비교될 수 있다. 일부 예에서 보정 곡선은 C1-INH가 없는 완충액 또는 기타 적절한 성분으로 정상적인 대상체의 전혈을 연속 희석하여 제조할 수 있다.

일부 예에서, 혈반을 건조시키는 단계 (ii)는 실온에서 3시간 동안 수행될 수 있다. 일부 예에서, 지지 부재는 여과지이다. 대안적으로 또는 추가로, 건조 혈반으로부터 단백질을 추출하는 단계 (iii)은 건조 혈반을 소 혈청 알부민(BSA)/PBS 완충액과 적어도 3시간 동안 인큐베이션하여 수행할 수 있다.

본 명세서에 개시된 임의의 방법에서, fC1-INH의 수준을 측정하는 단계 (iv)는 (a) 추출된 단백질을 보체 성분 1s(C1s) 및 C1s 기질과 함께 인큐베이션하여 반응 혼합물을 생성하는 단계; (b) 단계 (a)에서 생성된 C1s 기질 생성물의 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 측정된 C1s 기질 생성물의 수준에 기초하여 건조 혈반 내 fC1-INH의 수준을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서, C1 기질 생성물은 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC-MS) 또는 액체 크로마토그래피-텐덤 질량 분광분석(LC-MS/MS)에 의해 측정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 추출된 단백질을 보체 성분 1s(C1s) 및 C1s 기질과 함께 인큐베이션하는 단계 (a)는 추출된 단백질을 C1s와 인큐베이션하여 반응 혼합물을 생성한 다음, 반응 혼합물을 C1s 기질과 인큐베이션하여 C1s 기질 생성물을 생산하여 수행할 수 있다. 일부 경우에, C1s 기질 생성물의 수준은 액체 크로마토그래피-질량 분광분석에 의해 측정될 수 있다. 예시적인 C1s 기질은 C1s 생성물 N^α-벤질옥시카보닐-L-라이신(cbz-Lys)을 생성하는 N^α-카보벤질옥시-Lys-티오벤질 에스터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에 기술된 임의의 방법은 대상체, 예를 들어 인간 대상체로부터 혈액 샘플(예를 들어, 전혈 샘플)을 수득하는 것을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 대상체는 유전성 혈관부종(HAE), 예를 들어 I형 HAE 또는 II형 HAE와 같은 C1-INH 결핍 매개 장애를 갖거나, 갖는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다.

본 명세서에 기술된 방법은 대상체가 HAE를 갖는지 여부를 결정하는 것을 더 포함할 수 있다. 대조군과 비교하여 감소된 수준의 fC1-INH(C1s 기질 생성물의 향상된 수준과 상관됨)는 대상체가 본 명세서에 개시된 바와 같은 HAE와 같은 혈장 칼리크레인(pKal) 및/또는 C1-INH 결핍 매개 장애를 갖고 있음을 나타낸다. 본 명세서에 기술된 임의의 방법은 (a) 기능성 C1-INH의 수준에 기초하여 대상체에 적합한 치료를 식별하는 단계; (b) 본 명세서에 개시된 방법에 의해 결정되는 fC1-INH의 수준에 기초하여 질병을 치료하기 위한 후보로서 대상체를 식별하는 단계; 또는 둘 모두를 더 포함할 수 있다.

본 명세서에 기술된 임의의 방법은 본 명세서에 개시된 임의의 방법에 의해 C1-INH 결핍-매개 장애의 위험이 있거나 이를 갖는 것으로서 식별되는 대상체에게 치료제를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 혈장 칼리크레인(pKal) 저해제, 브래디키닌 B2 수용체 길항제, 또는 C1 에스테라제 저해제일 수 있다. 예로는 에칼란타이드(ecallantide), 라나델루맙(lanadelumab), 이카티반트(icatibant), 또는 인간 혈장 유래 C1 에스테라제 저해제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 하나 이상의 실시형태의 세부사항은 이하 상세한 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특징 또는 장점은 다음 도면 및 여러 실시형태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.

도 1 은 C1s 생성물(cbz-Lys)을 분석하기 위한 예시적인 건조 혈반(DBS) 기반의 fC1-INH 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS) 검정을 나타내는 개략도이다.
도 2 는 충돌 유도 해리(CID) 하에서 cbz-Lys 모(parent) 이온의 단편화 패턴을 나타내는 예시적인 이온 크로마토그램이다. m/z 91에서 가장 강렬한 피크가 검출하기 위한 생성물 이온으로서 선택되었다.
도 3 은 대조군으로서 순수 완충 용액에서 유래된 cbz-Lys 및 내부 표준물질(패널(1)); 최적의 부피비의 적혈구와 BSA 용액의 혼합물로 구성된 대체 공시료(surrogate matrix)로부터 DBS 추출물의 효소 반응(패널(2)); 및 건강한 개체의 진본 전혈 샘플로부터의 DBS 추출물의 효소 반응(패널(3))을 보여주는 예시적인 이온 크로마토그램을 포함한다.
도 4 는 DBS 중 fC1-INH의 측정을 보여주는 보정 곡선이다.
도 5 는 C1s 생성물(N ^α -벤질옥시카보닐-L-라이신; cbz-Lys)을 측정하기 위한 예시적인 건조 혈반(DBS) 기반의 fC1-INH 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS) 검정을 나타내는 개략도이다.
도 6A 내지 도 6D 는 대표적인 샘플의 예시적인 이온 크로마토그램을 나타낸다. 도 6A는 대조군으로서 순수한 완충 용액 중의 cbz-Lys 및 내부 표준물질을 나타낸다. 도 6B는 블랭크(blank) 대체 공시료 중의 cbz-Lys 및 내부 표준물질을 나타낸다. 도 6C는 통합된 진본 혈액(pooled authentic blood) 중의 cbz-Lys 및 내부 표준물질을 나타낸다. 도 6D는 500 mU/㎖ C1-INH가 스파이크된, 통합된 건강한 혈액 중의 cbz-Lys 및 내부 표준물질을 나타낸다. mU/㎖는 밀리리터당 기능성 C1-INH 수준의 밀리단위(milliUnit)이다.
도 7 은 DBS 중 fC1-INH의 측정을 보여주는 대표적인 보정 곡선이다.
도 8 은 건강한 대상체(n=103) 및 HAE 환자(n=24)로부터의 샘플 중 fC1-INH 수준을 보여주는 플롯이다. mU/㎖는 밀리리터당 기능성 C1-INH 수준의 밀리단위이다.
도 9 는 분석을 위해 상이한 위치에서 취한 펀치(N=3 또는 =6)를 갖는 DBS 샘플(반점 A-D)을 보여주는 사진이다.

C1 저해제 단백질(C1-INH)의 유전자 결핍은 유전성 혈관부종(HAE)을 초래한다. HAE가 있는 환자는 종종 미지의 계기에 의해 촉발되는 통증성 부종의 급성 발작으로 고통받는다.

C1 에스테라제(C1s) 저해제(C1-INH)는 인간 혈장의 정상적인 구성성분이며 항트롬빈 III, 알파1-프로테아제 저해제, 알파2-안티플라스민 및 헤파린 보조인자 II를 포함하는 세린 프로테아제 저해제(세르핀) 그룹에 속한다. 이 그룹의 다른 저해제와 마찬가지로, C1-INH는 보체 시스템, 내인성 응고(접촉) 시스템, 섬유소용해 시스템 및 응고 캐스케이드를 비롯한, 인체의 여러 주요 캐스케이드 시스템에 대해 중요한 저해 잠재성을 갖고 있다. 염증 과정 동안 일반적으로 활성화되는 C1-INH는 반응성 부위에 공유 결합하여 그의 기질을 비활성화시킨다. C1-INH는 보체 성분 1의 하위성분(C1r), C1s, 응고 인자 XIIa 및 칼리크레인에 대한 유일하게 알려진 저해제이다. 또한, 내인성 응고 캐스케이드에서 응고 인자 XIa의 주요 저해제이다.

HAE는 주로 두 가지 유형으로 나뉠 수 있다. I형은 낮은 수준의 C1-INH 단백질을 특징으로 하고 HAE 발병의 약 85%를 차지하는 반면, II형은 낮은 기능성 C1-INH(fC1-INH)이되, 정상 또는 상승된 C1-INH 단백질 수준을 특징으로 하고 약 15%를 차지한다. 미치료된 I형 및 II형 환자에서 단위/㎖로 측정되는 경우, 전형적인 fC1-INH는 정상 수준의 5-30%이다. 환자의 샘플에서 fC1-INH의 정확하고 신뢰할 수 있는 측정은 HAE 진단의 기초로서 작용한다.

현재, fC1-INH 수준을 결정하기 위해 두 가지 유형의 혈장 테스트가 사용된다. 첫 번째 검정은 합성 C1s 특이적 기질을 사용하여 테스트 샘플 중 C1-INH에 의한 표적 프로테아제 C1s의 활성 억제를 간접적으로 측정하는 발색 검정이다. 두 번째 테스트는 단백질 성분 C1s를 보완하기 위한 C1-INH의 기능적 결합을 기반으로 하는 ELISA 검정이다.

현재, 보체 성분 4(C4)의 수준과 함께 fC1-INH 활성 및 단백질 발현의 혈청 또는 혈장 수준은 가장 중요한 테스트인 fC1-INH 활성과 함께 HAE I형/II형의 진단에 권장된다(예를 들어, Maurer M, et al. Allergy(2018)73:1575-96 참조). fC1-INH 활성을 측정하는 기존의 방법은 발색법 또는 복합체 형성 면역검정을 수반한다. 발색 방법은 합성 C1s-기질을 혼입시켜 혈장 샘플 중 C1-INH 단백질의 저해 활성을 측정하며, 여기서 색 형성의 부족은 C1-INH 유도 저해를 확인시켜준다. 그러나, 복합체 형성 면역검정 방법은 C1-INH 저해 활성을 직접 측정함이 없이 C1-INH-C1s 복합체 형성을 검출한다(예를 들어, 문헌[Li HH, et al. J Allergy Clin Immunol Pract (2015)3:200-5] 참조).

C1-INH 및 C4 항원 수준은 일반적으로 탁도 검정에 의해 측정된다. 이러한 검정은 진료실에서 혈액 샘플의 즉시 처리 및 적절한 보관을 필요로 할 것이고, 모든 지역에서 표준화되거나 비용 효과적이거나 쉽게 접근가능한 것도 아니다. 현재까지 진단율은 중국, 멕시코, 일본, 한국에서 5 내지 10%에서부터 미국 및 서유럽에서 75 내지 80% 범위이다(미공개 데이터). 이에 중앙 실험실에서 fC1-INH를 측정하기 위한 간단하고 표준화된 방법을 개발하는 것이 큰 관심사이다.

건조 혈반(DBS) 기반의 검정은 리소좀 축적 질환(LSD)과 같은 수많은 유전자 질환의 신생아 선별 또는 환자 진단에 널리 활용되고 있다(19-23). 다수의 보고서의 결과는 효소 활성이 DBS 샘플에서 유지될 수 있음을 입증하였다(2, 24). 기존의 혈장 또는 혈청 검정과 비교하여 DBS는 고유한 장점을 제공한다. 첫째, 예를 들어, 손가락 찌르기를 사용한 DBS 샘플링은 덜 침습적이며 다량의 혈액과 임의의 실험실 장비를 필요로 하지 않는다. 둘째, DBS 샘플은 유전자 정보 또는 효소 활성의 유의적인 상실 없이 상온에서 수송 및 장기간 보관될 수 있다. 이러한 장점은 DBS 샘플이 진료실에서 제조되고 중앙 실험실에서 테스트될 수 있음을 보장한다.

본 개시내용은 건조 혈반(DBS) 중 기능성 C1 저해제(fC1-INH) 수준을 측정하기 위한 검정을 기술한다. 이 DBS 기반 테스트는 혈장 기반의 발색 검정 또는 ELISA 검정에 비해, 예를 들어, 적은 혈액량, 여과지에 일단 건조되면 연장된 분석물 안정성, 용이한 샘플 수송 및 보관과 같은 여러 장점을 제공하며, 및/또는 환자 샘플이 중앙 실험실에서 테스트될 수 있게 한다.

I. 기능성 혈장 에스테라제 C1 저해제(fC1-INH)의 수준을 검출하는 방법

본 개시내용은 환자의 전혈 샘플(들)로부터 제조된 건조 혈반(DBS)을 사용하여 강력한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS)에 의해 fC1-INH 수준을 결정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 HAE와 같은 C1-INH-결핍 매개 장애의 진단에 활용될 수 있다. 이 방법은 DBS 샘플 제조, DBS 샘플로부터 단백질 추출, 단백질 추출물과 보체 성분 1s(C1s)의 인큐베이션, 및 C1s 기질 생성물을 생성하기 위한 C1s 기질과의 반응을 수반할 수 있고, 이 생성물은, 예를 들어, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS)에 의해 측정될 수 있다.

(i) 샘플 제조

C1-INH(예를 들어, fC1-INH, 비기능성 C1-INH 또는 둘 다)를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 임의의 샘플은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 분석될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "샘플"은 관심 분석물(본 발명의 경우에 fC1-INH)을 포함할 수 있는 조성물을 지칭한다. 샘플은 대상체의 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청을 포함할 수 있다. "샘플"이라는 용어는 대상체로부터 채취한 초기 미처리 샘플뿐만 아니라, 후속적으로 처리된, 예를 들어 면역침전을 통해, 예를 들어 부분 정제된 또는 보존된 형태를 모두 포괄할 수 있다. 예시적인 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 눈물 또는 점액을 포함한다. 다른 예에서, 샘플은 시험관내 검정 유래의 조성물일 수 있다.

일부 실시형태에서, 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플과 같은 체액 샘플이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 분석이 필요한 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플이다. "환자", "대상체" 또는 "숙주"(이 용어는 상호교환적으로 사용됨)는 인간 또는 인간이 아닌 동물을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 접촉 시스템과 관련된 질병을 가질 수 있거나, 갖는 것으로 의심되거나, 또는 위험이 있는 인간 환자이다. 예를 들어, 인간 환자는 이전에 HAE가 발병한 적이 있거나 또는 HAE에 대한 위험이 있을 수 있다. 이러한 인간 환자는 이전에 치료를 받았을 수 있거나 접촉 시스템의 성분(예를 들어, C1s, 혈장 칼리크레인)을 표적으로 하는 약물로 치료 중일 수 있다.

생물학적 샘플은 체액 샘플, 예를 들어 혈액 샘플일 수 있다. 일부 예에서, 혈액 샘플은 전혈 샘플이다. 전혈은 적혈구, 백혈구, 혈소판 및 혈장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 혈액 샘플은 혈관(예를 들어, 모세혈관, 정맥 및 동맥)에서 수집될 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법에 사용하기 위한 전혈 샘플은 본 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수집 및 처리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 손가락 찌르기(핑거스틱)에 의해 수득된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 진공 채혈관을 사용하여 수집할 수 있다.

본 개시내용의 샘플은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 fC1-INH 측정 검정의 수행에 충분한 임의의 부피일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체로부터 얻은 샘플은 25㎕ 내지 10㎖이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 샘플 또는 이의 분취량은 100㎕ 내지 2㎖이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 50㎕ 내지 100㎕이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 50㎕ 내지 1㎖이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 50㎕, 100㎕, 200㎕, 300㎕, 400㎕, 500㎕, 600㎕, 700㎕, 800㎕, 900㎕, 1㎖, 1.1㎖, 1.2㎖, 1.3㎖, 1.4㎖, 1.5㎖, 1.6㎖, 1.7㎖, 1.8㎖, 1.9㎖, 2.0㎖, 2.5㎖, 3.0㎖, 3.5㎖, 4.5㎖, 5.0㎖, 5.5㎖, 6.0㎖, 6.5㎖, 7.0㎖, 7.5㎖, 8.0㎖, 8.5㎖, 9.0㎖, 9.5㎖ 또는 10.0㎖이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 60㎕이다.

본 명세서에 개시된 임의의 샘플, 예를 들어 전혈 샘플은 수집될 수 있고, 샘플의 분취량을 꺼내어 지지 부재에 점적할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 또는 샘플의 분취량을 함유하는 지지 부재는 적절한 기간(예를 들어, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 또는 그 이상) 동안 적절한 조건(예를 들어, 실온) 하에 유지되어 지지 부재 상에 샘플의 건조 반점을 형성한다.

지지 부재는 막, 필름, 여과지 또는 건조 혈반 카드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 지지 부재는 하나 이상의 샘플 수집 영역, 및 선택적으로 랩어라운드 커버(wrap-around cover)를 포함할 수 있다. 지지 부재는 샘플 수송을 용이하게 하기 위해 Ziploc® 백(bag)과 같은 밀봉가능한 용기에 들어갈 수 있다. 일부 실시형태에서, 지지 부재는 접힐 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 지지 부재는 샘플의 추가 정보(예를 들어, 대상체의 인구통계학적 정보)를 기록하기 위한 하나 이상의 영역을 더 포함할 수 있다.

샘플(또는 이의 분취량)은 적절한 조건 하에서 적절한 시간 내에 지지 부재 상에 건조되도록 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 약 1 내지 6시간, 예를 들어, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 또는 6시간 동안 건조되도록 한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 약 1 내지 2시간, 1 내지 3시간, 1 내지 4시간, 1 내지 5시간, 2 내지 3시간, 2 내지 4시간, 2 내지 5시간, 2 내지 6시간, 3 내지 4시간, 3 내지 5시간, 3 내지 6시간, 4 내지 5시간, 4 내지 6시간, 또는 5 내지 6시간 동안 건조되도록 한다.

일부 실시형태에서, 샘플은 적절한 온도, 예를 들어 10℃ 내지 40℃ 또는 그 이상의 온도에서 건조되도록 한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃ 이상의 온도에서 건조되도록 한다. 본 기술분야의 기술자에게 알려진 바에 따르면, 건조 공정은 상대적으로 더 높은 온도에서 더 짧은 기간 동안 수행될 수도 있고, 또는 대안적으로 상대적으로 더 낮은 온도에서 더 오랜 기간 동안 수행될 수 있다. 일부 예에서, 샘플은 실온(약 25℃)에서 적어도 3시간 동안 건조되도록 할 수 있다.

(ii) 단백질 추출

본 명세서에 기술된 바와 같이 제조된 건조 반점 샘플, 예를 들어, 건조 혈액 샘플은 이 샘플에 함유된 생물학적 물질, 예를 들어 단백질을 추출하도록 처리될 수 있다. 일부 실시형태에서, DBS 샘플과 같은 건조 반점 샘플은 단백질 추출을 위해 처리될 수 있다. 본 명세서에 사용된, 단백질 추출은 건조된 샘플에 함유된 단백질 또는 단백질의 특정 일부를 적합한 완충액(예를 들어, 표적 단백질이 용해성인 것) 내로 추출하는 것을 지칭한다. 일부 경우에, 지지 부재의 샘플 수집 영역에 존재하는 DBS 샘플과 같은 건조 반점 샘플은 기존의 방법(예를 들어, 펀처(puncher) 사용)에 의해 지지 부재의 나머지 부분으로부터 단리될 수 있다. 단리된 생물학적 물질 샘플, 예컨대 단백질 샘플은 추가 단백질 추출에 적합한 용기로 옮길 수 있다. 적합한 용기의 비제한적 예는 튜브, 접시, 바이알, 다중 웰 플레이트일 수 있다. 일부 예에서, 적합한 용기는 96웰 플레이트일 수 있다. DBS 샘플과 같은 하나 이상의 건조 반점 샘플은 동시에 처리될 수 있다.

임의의 적합한 완충액은 본 명세서에 기술된 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는 완충액은 추출될 생물학적 물질과 양립 가능하다(예를 들어, 단백질을 용해할 수 있고 바람직하게는 단백질 기능을 유지할 수 있음). 적합한 완충액의 비제한적 예로는 인산염 완충 식염수(PBS), 둘베코(Dulbecco)의 인산염 완충 식염수(DPBS), 또는 행크스(Hanks) 균형 염 용액(HBSS)을 포함한다. 일부 예에서, 완충액은 PBS일 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충액은 안정성을 촉진하고/하거나 추출될 생물학적 물질의 분해를 방지하기 위해 하나 이상의 성분을 함유할 수 있다.

일부 실시형태에서, 추출 단계에 사용하기 위한 완충액은 적합한 농도(예를 들어, 0.5%)에서 단백질 추출(예를 들어, 소 혈청 알부민)을 촉진하는 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 건조 반점 샘플(예를 들어, DBS 샘플)을 함유하는 지지 부재 또는 이의 일부는 샘플 중 관심 있는 생물학적 물질(예를 들어, fC1-INH)을 완전하게 추출하도록 하는 적절한 조건 하에 완충액에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 건조 반점 샘플-함유 지지 부재는 관심 있는 생물학적 물질(예를 들어, fC1-INH를 포함하는 단백질)이 충분히 추출되어 fC1-INH의 수준이 측정될 수 있도록 하기 위해, 적절한 온도, 예를 들어 25 내지 37℃(예를 들어, 37℃) 하에 적절한 기간, 예를 들어 2 내지 5시간(예를 들어, 3시간) 동안 완충액에서 인큐베이션될 수 있다.

일부 실시형태에서, 완충액/샘플 혼합물은 용액 내로 생물학적 물질의 추출을 용이하게 하기 위해 적절한 속도, 예를 들어, 800 내지 2000 rpm(예를 들어, 1250 rpm)에서 원심분리될 수 있다. 온도, 추출 시간 기간, 완충액의 사용법, 원심분리 유무, 원심분리 속도 등을 비롯한 특정 추출 조건의 선택은, 예를 들어, 추출될 생물학적 물질의 유형 및 건조 반점 샘플의 형성에 사용된 지지 부재에 따라 달라질 수 있다. 이러한 정보는 본 기술분야의 기술자의 지식 내에 있는 것일 것이다.

(iii) fC1-INH의 측정

상기 개시된 바와 같이 제조된 fC1-INH를 함유하는 용액은 이 용액 중 fC1-INH의 수준을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 일부 예에서, fC1-INH의 수준은 fC1-INH의 활성을 결정함으로써, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 통상적인 접근법 또는 방법에 의해 측정된다.

fC1-INH의 수준은 본 기술분야에 공지되어 있거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 적절한 접근법을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, fC1-INH의 수준은 C1s에 의해 절단될 수 있는 발색 기질을 사용하는 발색 검정에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 면역 검정은 본 명세서에 기재된 바와 같이 관심 있는 C1s 생성물의 수준을 평가하는 데에 사용된다. 면역 검정의 예로는 웨스턴 블롯, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)(예를 들어, 샌드위치 ELISA), 방사선면역검정, 전기화학발광 기반 검출 검정 및 관련 기술을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 검정, 예를 들어 웨스턴 블롯 검정은 정량적 영상화 시스템, 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 LICOR 영상화 기술의 사용을 추가로 수반할 수 있다(예를 들어, LI-COR Biosciences의 Odyssey^® CLx 적외선 영상화 시스템 참조). 일부 실시형태에서, 전기화학발광 검출 검정 또는 전기화학발광과 패턴화된 어레이 기술의 조합에 의존하는 검정이 사용된다(예를 들어, Meso Scale Discovery(MSD)의 ECL 또는 MULTI-ARRAY 기술 검정).

본 명세서에 사용된 용어 "측정하는" 또는 "측정", 또는 대안적으로 "검출하는" 또는 "검출"은 샘플 내의 물질의 존재, 부재, 정량 또는 양(유효량일 수 있음)을 평가하는 것, 예를 들어, 이러한 물질의 정성적 또는 정량적 농도 수준의 유도, 또는 다른 방식으로 대상체의 값 또는 범주화를 평가하는 것을 의미한다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 건조 반점 샘플(예를 들어, DBS 샘플)로부터 추출된 fC1-INH-함유 샘플은 C1s 프로테아제 및 C1s 기질과 함께 인큐베이션될 수 있다. C1s 프로테아제는 C1s 기질에 작용하여 C1s 기질을 C1s 기질 생성물로 전환시킬 수 있으며, 그 다음 이 생성물은 분석되어 C1s 기질 생성물의 존재 및/또는 수준을 결정할 수 있다. 대안적으로, C1s 기질은 C1s 프로테아제 및 fC1-INH-함유 샘플과의 인큐베이션 후에 남아있는 C1s 기질의 존재 및/또는 수준을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 일단 C1s 프로테아제가 fC1-INH에 의해 저해되면, C1s 기질 생성물의 생산은 감소되거나 제거될 것이다. 본 명세서에 사용된 "C1s 기질 생성물"은 C1s 기질 상의 C1s의 프로테아제 반응으로부터 생성된 절단된 생성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, C1s 기질 및/또는 C1s 기질 생성물의 양은 C1s 프로테아제 및/또는 fC1-INH의 활성의 간접적인 척도로서 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 건조 반점 샘플(예를 들어, DBS 샘플)로부터 추출된 fC1-INH-함유 샘플은 적합한 기간 동안 적합한 조건 하에 C1s 프로테아제와 먼저 인큐베이션될 수 있다. 그 다음, 이 혼합물에 C1s 기질이 첨가될 수 있고, 이는 C1s 기질 생성물이 생성되도록 적절한 기간 동안 적합한 조건 하에 추가로 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션는 암실에서 수행될 수 있다. 일부 예에서, 방법은 C1s 프로테아제 반응을 켄칭(quenching)시키는 단계를 포함할 수 있고, 이는 분석의 정확도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, C1s 프로테아제 반응의 켄칭은 켄칭 용액에 C1s 반응 혼합물을 희석(예를 들어, 1:5 내지 1:20)함으로써 달성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "켄칭 용액"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 효소 반응(예를 들어, C1s 프로테아제 반응)을 정지시키기 위한 용액을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 켄칭 용액은 효소를 변성 또는 불활성화시킬 수 있는 작용제를 포함할 수 있다. 비제한적인 변성제는 알코올, 세제, 강산, 강염기, 킬레이트화제 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 켄칭 용액은 세제(예를 들어, SDS) 및/또는 알코올(예를 들어, 메탄올)을 함유할 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법에 사용하기 위한 C1s 기질은 C1s 프로테아제에 의해 절단되어 검출가능한 C1s 기질 생성물을 생성할 수 있는 임의의 기질일 수 있다. C1s 기질의 비제한적 예로는 C1s 프로테아제 절단 시 Nα-벤질옥시카보닐-L-라이신(cbz-Lys)을 생성하는 Nα-카보벤질옥시-Lys-티오벤질 에스터; 및 C4a 및 C4b를 생성하는 C4를 포함한다.

일부 실시형태에서, 효소 반응이 켄칭된 후, 샘플은 후속 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS) 분석을 위해 추가로 희석될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 적합한 용액(예를 들어, 80% MeOH 수용액(v/v))에 200배 희석될 수 있다.

이렇게 생성된 C1s 기질 생성물은 그 존재 및/또는 수준을 결정하기 위해 기존의 방법에 의해 분석될 수 있다. 일부 실시형태에서, C1s 기질 생성물은 액체 크로마토그래피의 물리적 분리 능력과 질량 분광분석(MS)의 질량 분석 능력을 조합한 분석 기술인 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC-MS) 접근법에 의해 분석될 수 있다. LC-MS/MS 검정은 일상적인 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

일부 경우에, C1s 기질 생성물을 분석하는 데 사용하기 위한 질량 분광분석기는 선택적 반응 모니터링(selective reaction monitoring: SRM) 모드 하에 작동될 수 있다. SRM 모드는 탠덤 질량 분광분석기의 첫 번째 단계에서 특정 질량의 이온이 선택되고 검출을 위한 두 번째 질량 분광분석기 단계에서 전구체 이온의 단편화 반응의 이온 생성물이 선택되는, 탠덤 질량 분광분석의 매우 민감하고 선택적인 방법이다. SRM 모드는 질량 분광분석에 의한 표적 정량에 사용될 수 있다. 이온화, 예를 들어, 전기분무 공급원을 사용한 이온화 후, 전구체를 먼저 단리하여 대부분 의도된 종의 실질적인 이온 집단(예를 들어, 모 이온)을 얻는다. 그 다음, 이 집단을 단편화하여, 신호 풍부도(abundance)가 샘플 중 관심 생성물의 풍부도를 나타내는 생성물 이온을 산출한다. 일부 실시형태에서, cbz-Lys 모 이온은 m/z 281에 있을 수 있고 검출을 위해 선택된 cbz-Lys 생성물 이온은 m/z 91에 있을 수 있다. 실시예에 기술된 바와 같이, ABSciex 5500 또는 6500 QTrap 질량 분광분석기와 같은 적합한 기기가 사용될 수 있으며, 방법 최적화 후에 다양한 샘플 간의 차이가 평가될 수 있다. 개채 전혈 샘플은 본 명세서에 기술된 바와 같은 LC-MS/MS 분석을 위해 제조될 수 있다.

C1s 기질 생성물의 수준(예를 들어, 농도)(예를 들어, AUC로 표시), 및 이에 따른 fC1-INH 농도는 통상적인 방법을 통해 결정될 수 있다. 보정 곡선 또는 표준 곡선(예를 들어, 4-매개변수 로지스틱 보정 곡선)은 내부 표준물질(예를 들어, Nε-벤질옥시카보닐-L-라이신-2,6,6-d3의 농도)에 대한 분석물(예를 들어, cbz-Lys)의 피크 면적 비율에 대비하여 fC1-INH의 농도를 플로팅하여 생성할 수 있다. 보정 곡선, 예를 들어, 다음과 같은 방정식에 피팅될 수 있다:

여기서, y는 피크 면적 비율을 지칭하고; x는 샘플 농도를 지칭하며; A, B, C 및 D는 곡선 피팅 매개변수이다.

일부 실시형태에서, LC-MS/MS 방법은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 제조된 보정 표준물질을 분석함으로써 정확도 및 재현성에 대해 검증할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 중 fC1-INH의 수준(예를 들어, 농도)은 방정식(예를 들어, 방정식 1)에 의해 계산될 수 있다. 이러한 결과는 본 명세서에 기술된 방법에 의해 제조된 샘플에서 C1s 기질 생성물의 수준으로 표시되고 계산되는 fC1-INH의 수준이 HAE 진단을 위한 신뢰할 수 있는 바이오마커임을 나타낸다.

일부 경우에, 보정 곡선은 내부 표준물질에 대한 관심 분석물(C1s 시그니처 생성물)의 피크 면적 비율로 작제할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "내부 표준물질"은 샘플 제조 동안 분석물의 손실에 대해 교정하여 분석물 분석의 정확도를 향상시키기 위해 테스트 샘플, 품질 대조군(QC) 샘플, 블랭크 및 보정 표준물질에 일정한 양으로 첨가되는 화학적 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 내부 표준물질은 Nε-벤질옥시카보닐-L-라이신-2,6,6-d3 또는 다른 안정한 동위원소-표지된 C1s 기질 생성물이다. 일부 실시형태에서 보정 곡선은 정량적 분석에 사용될 수 있다.

또한, 일련의 보정 표준물질은 제조되어 검정의 보정인자로서 및 품질 관리 목적을 위해 LC-MS/MS 분석으로 샘플과 함께 처리될 수 있다. 본 명세서에 사용된 보정 표준물질은 알려진 양의 관심 분석물 또는 물질(예를 들어, 본 개시내용의 fC1-INH)을 함유하는 전혈 또는 용액을 지칭한다. 보정 표준물질은 테스트 시스템이 보고가능한 범위 전체에 걸쳐 샘플을 정확하게 측정하는지 확인하기 위해 샘플과 동일한 방식으로 알려진 농도의 물질을 테스트하는데 사용될 수 있다. 보정 표준물질은 초기에 함유하지 않거나 관심 물질이 고갈된 용액에 관심 물질(예를 들어, fC1-INH)의 다양한 알려진 양을 첨가하여 제조할 수 있다. 일부 예에서, 관심 물질(예를 들어, fC1-INH)은 테스트 샘플(예를 들어, 대체 공시료)을 모방하기 위해 테스트 샘플(예를 들어, 전혈 샘플)과 유사한 생물학적 샘플에 첨가될 수 있다. 일 예에서, 보정 표준물질은 fC1-INH(예를 들어, 정제된 fC1-INH)를 fC1-INH가 고갈된 대체 혈액과 혼합하여 제조할 수 있다. 본 명세서에 사용된 fC1-INH 고갈된 대체 혈액은 (i) 적합한 집단, 이상적으로는 대상체와 동일한 종(예를 들어, 건강한 개체, 남성 및/또는 여성)으로부터 신선한 전혈을 적절한 방법(예를 들어, 채혈관 진공화)에 의해 수득 및/또는 통합(pooling)하는 단계; (ii) 적절한 방법(예를 들어, 실온에서 10분 동안 800rpm에서 원심분리)을 사용하여 상청액 혈장을 제거하여 혈액 샘플 중 관심 있는 내인성 물질(예를 들어, fC1-INH)을 고갈시키는 단계; (iii) 통합된 나머지 적혈구의 적절한 부피(예를 들어, 동일 부피)를 적절한 완충액(예를 들어, PBS 중 약 4.3% BSA)과 혼합하는 단계에 의해 제조할 수 있다. 이 관심 물질(예를 들어, fC1-INH)에 대한 보정 표준물질 및 품질 대조군(QC)은 관심 물질(예를 들어, fC1-INH)을 함유하는 다양한 알려진 농도의 용액을 본 명세서에 기재된 바와 같은 fC1-INH 고갈된 대체 혈액에 스파이킹하여 제조할 수 있다. 보정 표준물질은 LC-MS/MS 분석 전에 본 명세서에 기재된 바와 같이 C1s 기질 생성물을 생성하는 방법으로 처리될 수 있다.

하나의 특정 예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 다음을 포함할 수 있다: (1) 전혈 샘플로부터 DBS 카드를 제조하기 위한 절차; (2) DBS 카드에서 C1-INH 단백질 추출; (3) 추출된 단백질과 보체 성분 C1s의 인큐베이션; (4) C1s 기질, N ^α -카보벤질옥시-Lys-티오벤질 에스터와의 효소 반응을 통한 효소 생성물인 N ^α -벤질옥시카보닐-L-라이신(cbz-Lys)의 생성; 및 (5) 정량을 위한 내부 표준물질로서 N ^ε -벤질옥시카보닐-L-라이신-2,6,6-d₃을 사용한 LC-MS 검정에 의한 cbz-Lys의 후속 측정.

Ⅱ. 건조 반점 검정 방법의 적용

본 명세서에 기술된 샘플에서 fC1-INH를 측정하기 위한 검정 방법은 임상 또는 비임상 목적으로 사용될 수 있다.

(i) 질병 진단 및 예후

유전성 혈관부종(HAE)과 같은 C1-INH 결핍 매개 장애의 진단은 후보 대상체로부터 얻은 샘플의 fC1-INH 수준에 기초할 수 있다.

본 명세서에 기재된 검정 방법 및 키트는 질병의 평가, 예를 들어, 질병의 진단 또는 예후에 적용될 수 있다. 평가는 본 명세서에 기재된 바와 같은 질병, 예를 들어 C1-INH 결핍 매개 장애, 예컨대, HAE(예를 들어, I형 HAE 또는 II형 HAE)에 대한 위험이 있거나 그 질병를 갖는 것으로서 대상체를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 평가는 HAE와 같은 C1-INH 결핍 매개 장애에 대한 치료 효과를 평가하는 것과 같이 질병의 치료를 모니터링하는 것을 포함할 수 있다. 더 나아가평가는 pKal 저해제, 예를 들어 C1s 저해제(예를 들어, 인간 혈장에서 유래된 C1s 저해제) 또는 혈장 칼리크레인 저해제에 의해 치료될 수 있는 질병을 식별하는 것을 포함할 수 있다.

A. 진단

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 검정, 방법 및 키트는 후보 대상체(예를 들어, C1-INH 결핍 매개 장애(예를 들어, HAE)를 갖는 것으로 의심되는 인간 환자)로부터 수집된 생물학적 샘플(예를 들어, 전혈 샘플) 중 fC1-INH의 수준을 결정하는데 사용된다. fC1-INH의 수준은 본 명세서에 기술된 방법(예를 들어, 4-매개변수 로지스틱 보정 곡선에 의해)에 의해 생성된 C1s 기질 생성물의 수준에 기초하여 결정될 수 있다. 이러한 fC1-INH 수준은 대상체가 C1-INH 결핍-매개 장애, 예를 들어, HAE를 갖거나 이에 대한 위험이 있는지 여부를 결정하기 위해 미리 결정된 참조 값(reference value) 또는 참조 비율과 비교될 수 있다. 예를 들어, 후보 대상체의 샘플에서 fC1-INH가 참조 값 이하인 경우, 대상체는 HAE와 같은 C1-INH 결핍 매개 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 식별될 수 있다.

참조 샘플은 본 명세서에 기재된 바와 같은 fC1-INH의 대조군 수준일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 수준은 건강한 대상체 또는 바람직하게는 후보 대상체와 동일한 종 및 연령인 건강한 대상체 집단으로부터 수득된 대조군 샘플(예를 들어, 전혈 샘플) 중 fC1-INH의 양을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 건강한 대상체는 fC1-INH 수준이 측정되는 시기에 표적 질환(예를 들어, HAE와 같은 C1-INH 결핍 매개 장애)이 명백히 없거나 또는 그 질병의 병력이 없는 대상체이다.

대안적으로, 참조 값은 미리 결정된 값일 수 있다. 이러한 미리 결정된 시그니처 fC1-INH는 표적 질환이 없거나 이에 대한 위험이 없는 대상체 집단 중 본 명세서에 기재된 바와 같은 fC1-INH의 값을 나타낼 수 있다.

미리 결정된 값은 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 이는 단일 컷오프 값, 예컨대, 중앙값 또는 평균일 수 있다. 일부 실시형태에서, 미리 결정된 수준은 하나의 정해진 그룹이 표적 질환을 갖는 것으로 공지되어 있고 다른 정해진 그룹이 표적 질환을 갖지 않는 것으로 공지된 경우와 같이 비교 그룹에 기초하여 확립될 수 있다. 대안적으로, 미리 결정된 수준은 범위, 예를 들어 미리 결정된 백분위수 내인 대조군 집단의 fC1-INH 범위일 수 있다.

본 명세서에 기술된 대조군 값은 일상적인 기술에 의해 결정될 수 있다. 일부 예에서, 대조군 값은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 대조군 샘플에 대해 통상적인 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 fC1-INH의 수준을 수득하기 위한 동일한 검정)을 수행함으로써 수득할 수 있다. 다른 예에서, fC1-INH의 수준은 대조군 집단의 구성원으로부터 수득될 수 있고, 결과는 대조군 집단의 fC1-INH 수준을 나타내는 대조군 수준(미리 결정된 수준)을 수득하기 위해, 예를 들어, 계산 프로그램에 의해 분석될 수 있다.

후보 대상체로부터 얻은 샘플 중의 본 명세서에 기술된 fC1-INH의 농도를 본 명세서에 기술된 참조 비율과 비교함으로써, 후보 대상체가 C1-INH 결핍 매개 질병(예를 들어, HAE)을 갖거나 그 질병의 위험이 있는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 후보 대상체의 샘플에서 fC1-INH의 값이 기준 값 또는 비율에서 벗어나는 경우(예를 들어, 참조 값과 비교하여 감소), 후보 대상체는 그 질병을 갖거나 위험이 있는 것으로서 식별될 수 있다. 참조 값이 표적 질병을 가진 대상체의 집단에서 본 명세서에 기술된 fC1-INH의 값 범위를 나타낼 때, 이 범위에 속하는 후보 샘플의 fC1-INH 값은 후보 대상체가 표적 질병을 갖거나, 그 질병의 위험이 있는 것을 나타낸다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "참조값 미만의 감소된 값"은 fC1-INH의 수준이 대조군 샘플에서 fC1-INH의 미리 결정된 역치와 같이 참조 값보다 낮다는 것을 의미한다. 대조군 수준은 본 명세서에 상세히 설명된다. fC1-INH의 감소된 값은, 예를 들어, 대조군 샘플의 참조 값보다 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 낮은 값을 포함한다.

일부 실시형태에서, 후보 대상체는 C1-INH 결핍-매개 장애, 예를 들어 HAE의 하나 이상의 증상을 갖는 인간 환자이다. 예를 들어, 대상체는 부종(edema), 전적으로 또는 주로 말초인 부기(swelling); 두드러기; 감염의 증거가 없는 발적, 통증 및 부기; 비-히스타민 매개 부종, 부기의 재발성 발작, 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 샘플 수집 시점에 C1-INH 결핍 매개 장애의 증상이 없고, C1-INH 결핍 매개 장애의 증상의 병력이 없거나, 또는 HAE와 같은 C1-INH 결핍 매개 질환의 병력이 없다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 항히스타민 요법, 코르티코스테로이드 요법, 또는 둘 모두에 내성이 있다.

B. 적절한 치료 식별

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 검정 방법 및 키트는 또한 C1-INH 결핍-매개 장애(예를 들어, I형 HAE 또는 II형 HAE)를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에 적합한 치료를 식별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 fC1-INH 수준은 본 명세서에 기술된 임의의 방법을 사용하여 측정할 수 있고 fC1-INH의 미리 결정된 값과 비교될 수 있다. 대상체의 fC1-INH 값이 미리 결정된 값 이하인 경우, 대상체는 fC1-INH의 미리 결정된 값에 기초한 치료(예를 들어, 재조합 C1-INH 치료제 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 치료제)에 의해 치료될 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 fC1-INH의 수준에 기초한 질병의 치료를 위한 후보일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 C1-INH 결핍-매개 장애(예를 들어, HAE)를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에게 치료제를 투여하는 것을 더 포함한다. 치료제의 비제한적 예로는 혈장 칼리크레인(pKal) 저해제(예를 들어, 에칼란타이드, 라나델루맙), 브래디키닌 B2 수용체 길항제(예를 들어, 이카티반트), 및 C1s 저해제(예를 들어, 인간 혈장 유래 C1s 저해제)를 포함한다.

(ii) 비임상 적용예

또한, 본 명세서에 기술된 검정 방법은 예를 들어 연구 목적 및/또는 전임상 약물 개발 목적과 같은 비임상 적용예를 가질 수 있다. C1-INH 결핍과 관련된 많은 질병이 식별되었지만, 다른 질병이 유사한 메커니즘에 의해 매개되거나 유사한 성분을 수반하는 것도 가능하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 C1-INH 결핍과 관련이 있는 것으로서 질병을 식별하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 질병의 메커니즘(예를 들어, 질병 발달에 관여하는 신규 생물학적 경로 또는 과정의 발견) 또는 진행을 연구하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 검정 방법에 의해 결정된 fC1-INH의 수준은 C1-INH 결핍과 관련된 질병에 대한 신규 치료제의 개발에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 fC1-INH의 수준은 새로운 요법(예를 들어, 유전자 요법)이 투여된 대상체로부터 얻은 샘플에서, 또는 시험관내 검정으로부터 얻은 샘플에서 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, fC1-INH 수준은 시험관내 검정에서 신규 치료제의 활성 또는 임상 시험 환경에서 신규 치료제의 효능을 나타낼 수 있다.

III. 건조 반점 검정 방법을 수행하기 위한 키트

본 개시내용은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이 fC1-INH의 수준을 측정하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 샘플을 수집 및 제조하기 위한 재료, 샘플에서 단백질을 추출하기 위한 재료, 샘플에서 fC1-INH를 측정하기 위한 구성요소 및/또는 샘플에서 fC1-INH 수준을 검정하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 키트는 막, 여과지, 또는 건조 혈반 카드와 같은 지지 부재를 포함한다. 방법에 적절한 지지 부재의 선택은 평가할 샘플의 수 및 샘플에서 단백질을 추출하는 방법과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.

일부 실시형태에서, 지지 부재는 ELISA 플레이트와 같은 다중-웰 플레이트이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역검정은 고처리량 플랫폼에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중-웰 플레이트, 예를 들어, 24웰, 48웰, 96웰, 384웰 또는 그 이상의 웰 플레이트가 고처리량 면역검정에 사용될 수 있다. 각 웰에서 개별 면역검정은 병렬로 수행될 수 있다. 따라서, 일반적으로 검정 처리량을 증가시키기 위해, 다중 웰을 병렬로 측정하는 플레이트 판독기를 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 다중 웰(예를 들어, 4, 16, 24, 48, 96, 384 또는 그 이상의 웰)을 병렬로 영상화할 수 있는 플레이트 판독기가 이 플랫폼에 사용될 수 있다.

키트는 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있지만, 켄칭 완충액, 변성 완충액, 및 단백질 추출 완충액에 제한되지는 않는다. 완충액의 예는 PBS, DPBS, HBSS, HEPES, Tris, Tris-HCl, 인산나트륨, 인산칼륨 및 염화칼륨을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기술된 임의의 방법에 따른 사용 설명서를 포함할 수 있다. 포함된 설명서는 인간 환자와 같은 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플에서 fC1-INH의 수준을 측정하기 위해 키트에 함유된 구성요소를 사용하는 방법에 대한 설명을 포함할 수 있다.

키트의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로 각 구성요소의 양과 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기에 적합한 조건에 대한 정보를 포함함다. 키트의 구성 요소는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중 용량 패키지) 또는 하위단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 공급된 설명서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입지(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)에 적힌 설명서이지만, 기계 판독가능 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 실린 설명서)도 허용된다.

라벨 또는 패키지 삽입지는 키트가 하나 이상의 샘플에서 fC1-INH 수준을 평가하는 데 사용된다는 것을 나타낸다. 본 명세서에 기술된 방법 중 임의의 방법을 실행하는 것에 대해 설명서가 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 분석 전에 건조된 샘플의 수송을 위한 밀봉가능한 용기(예를 들어, Ziploc® 백)를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 키트는 적합한 포장 내에 있다. 적합한 포장으로는 바이알, 병(bottle), 병(jar), 가요성 포장(예를 들어, 밀봉 Mylar 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

키트는, 예를 들어, 보정 곡선을 생성하기 위해 대조군 및/또는 표준 또는 참조 샘플과 같은 해석 정보와 같은 추가 구성요소를 선택적으로 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기 및 용기 위 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입지(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.

추가 설명 없이, 본 기술분야의 기술자는 상기 상세한 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 생각한다. 따라서, 다음의 특정 실시형태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떤 식으로든 개시 내용의 나머지 부분을 제한하지 않는다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물은 본 명세서에 언급된 목적 또는 주제를 위해 참조에 의해 원용된다.

실시예

실시예 1: DBS 기반 LC-MS/MS fC1-INH 검정

이 실시예는 혈액 샘플에서 기능성 C1-저해제(fC1-INH)를 측정하기 위한 건조 혈반(DBS) 기반의 LC-MS/MS 분석을 기술한다. 도 1은 이 검정의 예시적인 계획을 보여준다.

이 방법은 인간 전혈 샘플에서 fC1-INH 수준을 결정하는 것을 목표로 한다. 이 방법은 보정 표준물질, 품질 대조군(QC) 및 DBS 샘플의 제조, DBS 샘플에서 단백질 추출, 단백질 추출물과 보체 성분 1s(C1s)의 인큐베이션, C1s 기질인 Nα-카보벤질옥시-Lys-티오벤질 에스터와의 반응에 의한 Nα-벤질옥시카보닐-L-라이신(cbz-Lys)의 생성, 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS)을 사용한 cbz-Lys의 후속 측정을 수반한다. AB Sciex QTrap 6500 질량 분광분석기는 cbz-Lys 및 내부 표준물질(Nε-벤질옥시카보닐-L-라이신-2,6,6-d3)을 양이온모드로 검출하기 위한 최적화된 조건 하에 SRM(Selected Reaction Monitoring) 모드로 작동시켰다.

실험 절차:

(i) 보정 표준물질 및 품질 대조군(QC)의 제조

보정인자 및 품질 대조군(QC)은 C1-INH 단백질이 고갈된 대체 혈액으로 제조했다. 간단히 설명하면, 건강한 개체(남성 및 여성)의 신선한 전혈을 통합해서 1200×g 및 실온에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액 혈장은 버리고 생성된 적혈구를 인산염 완충 식염수(PBS) 용액으로 1회 세척하였다. C1-INH가 없는 대체 혈액은 PBS에서 동일한 부피의 통합된 적혈구와 4.3% 소 혈청 알부민(BSA)을 혼합하여 제조했다. 보정 표준물질 및 QC를 제조하기 위해 서로 다른 농도의 C1-INH 용액을 대체 혈액에 스파이크했다.

(ii) DBS 샘플의 제조

전혈 표본을 수집한 후, DBS 카드(903 Protein Saver Card, Whatman)의 여과지 반점 상에 최대 60㎕의 분취량을 침착시켰다. DBS 카드는 여과지를 통해 스며든 혈액의 손실을 방지하기 위해 뒷면이 어떤 표면과도 접촉하지 않도록 구부렸다. 카드를 최소 3시간(h) 동안 건조시키고 실온에서 보관했다.

교정인자, QC 및 테스트 샘플을 제조하기 위해 DBS Puncher(GE Health Care Life Science Whatman)를 사용하여 3.0㎜ 구멍을 뚫고 DBS 샘플을 500㎕ 96웰 플레이트(Eppendorf Protein Lobind)의 바이알로 옮겼다. DBS 샘플은 1250rpm에서 작동하는 인큐베이션기에서 PBS 완충액 중 0.5% BSA 100㎕와 함께 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하여 추출했다. 추출된 샘플의 분취량(20 ㎕)을 다른 96-웰 플레이트로 옮기고 PBS 중 0.5% BSA에 새로 제조한 50㎕의 0.5 ㎍/㎖ C1s 용액과 혼합되도록 했다. 800 rpm 및 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 후 기질 용액(Nα-카보벤질옥시-Lys-티오벤질 에스터)과 내부 표준물질(Nε-벤질옥시카보닐-L-라이신-2,6,6-d3)의 105㎕ 혼합물을 첨가하고 효소 반응을 실온의 암실에서 40분 동안 인큐베이션함으로써 진행되도록 하였다. 반응 용액 50 ㎕를 MeOH/물(80/20, V/V) 중 0.1% SDS 450 ㎕로 옮겨 반응을 켄칭시켰다. 상기 샘플을 LC-MS/MS 분석 전에 MeOH/물(80/20, V/V)로 200배 더 희석하였다.

(iii) LC-MS/MS 분석

30℃로 설정된 역상 컬럼(Waters Xbridge Protein BEH C4, 3.5㎛, 2.1×50㎜)을 사용한 Waters Acquity UPLC에서 미반응 기질, 기질 생성물(분석물, cbz-Lys) 및 내부 표준물질의 분리를 달성했다. 이동상 A는 0.1% 포름산 수용액이었고, 이동상 B는 아세토나이트릴이었다. 유속은 0.3 ㎖/분이었고 이동상 구배는 다음 시점 간의 구배 단계(시간, %B)로 구성되었다: 0분, 4%; 0.5분, 4%; 3.5분, 12%; 3.6분, 70%; 4.6분, 70%; 4.7분, 4%; 5.5분, 4%. 자동 샘플러 온도는 4℃로 설정했으며 부분 루프 LC 주입 모드로 3㎕의 샘플을 주입했다. cbz-Lys 및 내부 표준물질(Nε-벤질옥시카보닐-L-라이신-2,6,6-d3)의 검출을 위한 최적화된 설정 하에, 전기분무 이온화에 의해 형성된 양이온을 사용하는 선택적 반응 모니터링(SRM) 모드로 작동하는 AB Sciex QTrap 6500 질량 분광분석기에서 분석물 및 내부 표준물질 신호를 획득했다.

최적화된 MS 매개변수 설정은 다음과 같다: 커튼 가스, 20; 충돌 가스, 중간; 이온분무 전압, 4000; 온도, 550; 이온 공급원 가스 1, 50; 이온 가스 공급원 2, 50; 탈클러스터화 전위, 120; 입구 전위, 10.0; 충돌 에너지, 26.0; 충돌 셀 출구 전위, 12.0. 분석물 및 내부 표준물질은 각각 m/z 281.2 내지 m/z 91.0 및 m/z 284.2 내지 m/z 91.0의 SRM 이온으로 모니터링했다.

(iv) 데이터 분석

분석물 및 내부 표준물질의 피크 면적은 Analyst 소프트웨어에 의해 결정했다. SoftMax Pro 7.0을 사용하여 내부 표준물질에 대한 분석물의 피크 면적 비율과 표준물질 중 스파이크된 fC1-INH의 농도를 가지고 4-매개변수 로지스틱 보정 곡선을 작도했다. 샘플의 fC1-INH 수준은 다음 식에 따라 계산했다.

여기서, y는 피크 면적 비율이고; x는 샘플 농도이며; A, B, C 및 D는 곡선 피팅 매개변수이다. 또한 정확도 및 상대 표준 편차(RSD)는 Excel을 사용하여 계산했다.

결과

도 2는 충돌 유도 해리(CID) 하에 cbz-Lys 전구체 이온의 단편화 패턴을 보여준다. m/z 91에서 가장 강렬한 피크가 검출하기 위한 생성물 이온으로서 선택되었다.

도 3은 (1) 대조군으로서 순수 완충 용액; (2) 최적화된 부피 비율의 적혈구와 BSA 용액의 혼합물로 구성된 대체 공시료로부터의 DBS 추출물의 효소 반응 생성물; (3) 건강한 개체의 진본 전혈 샘플로부터의 DBS 추출물의 효소 반응 생성물로부터 유래되는 cbz-Lys 및 내부 표준물질(IS)의 이온 크로마토그램을 나타낸다. cbz-Lys 및 IS는 상이한 공급원의 샘플에서 재현가능한 체류를 보여준다. 또한, cbz-Lys 피크 강도는 순수 용액과 대체 혈액 공시료에서 매우 유사하며, 이는 대체 혈액 공시료 중 잔류 fC1-INH가 최소의 양임을 암시한다. 다른 한편, fC1-INH가 정상인 건강한 혈액 샘플에서 유래되는 cbz-Lys 강도는 현저히 낮았으며, 이는 fC1-INH 존재에 의해 C1s 효소 활성이 저해됨을 시사한다. 이 도면은 DBS 추출물의 효소 반응 후 cbz-Lys의 검출 가능성을 입증한다.

DBS 중 fC1-INH를 측정하기 위한 보정 곡선은 도 4에 도시된다.

DBS-기반의 LC-MS/MS fC1-INH 검정의 진행간(inter-run) 재현성을 평가하기 위해, 6명의 개별 대상체로부터 통합된 혈액 샘플을 수집하고 다른 3일에 DBS-기반의 LC-MS/MS fC1-INH 검정을 사용하여 분석했다. 검정의 결과는 표 1에 제시된다. 검정의 정확도(CV% 약 10.3)는 우수하다.

DBS 기반의 LC-MS/MS fC1-INH 검정의 일중(intra-day) 재현성을 평가하기 위해, C1-INH를 품질 대조군(정량 하한(LLOQ), 낮음, 중간 및 높음)으로서 상이한 농도로 적혈구 공시료에 스파이크했다. 샘플은 그 다음 DBS 기반의 LC-MS/MS fC1-INH 검정을 사용하여 분석했다. 결과는 표 2에 제시된다. 이 검정으로부터 수득된 fC1-INH의 수준은 샘플에 스파이크된 fC1-INH의 수준에 상응하고, 이는 DBS를 사용하여 fC1-INH를 측정하는데 있어서 이 검정의 정확도를 나타낸다.

실시예 2: DBS 기반의 LC-MS/MS fC1-INH 검정의 용도

본 명세서에는 HAE 환자의 진단을 위해 DBS 중 fC1-INH 활성을 측정할 수 있는 신규 검정의 개발 및 검증이 기술된다. 이 검정은 규제 안내 및 산업의 최상의 관례에 따라 검증되었다. HAE 환자로부터의 DBS 샘플은 현저히 낮은 fC1-INH 활성을 나타내었고, 이는 건강한 대상체로부터 HAE 환자를 구별할 수 있도록 한다.

실험 절차

(i) 재료

N^α-카보벤질옥시-Lys-티오벤질 에스터 염산염(Z-Lys-SBzl·HCl, C1s 기질) 및 N^ε-벤질옥시카보닐-L-라이신-2,6,6-d₃(N^ε-CBZ-L-라이신-d₃, 내부 표준물질)은 각각 BACHEM(미국 캘리포니아주 토런스 소재) 및 CDN Isotopes(캐나다 퀘벡 소재)에서 구입했다. 재조합 인간 보체 성분 C1s(C1s)는 R&D System(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)에서 구입했다. 재조합 C1-INH(CINRYZE®)는 사내에서 얻었다. 소 혈청 알부민(BSA)은 Americanbio(미국 매사츄세츠주 나티크 소재)에서 얻었다. 소듐 도데실 설페이트(SDS) 용액(10%)은 Sigma(미국 미주리주 세인트루이스 소재)의 제품이었다. 500㎕ 96웰 플레이트(Eppendorf Protein LoBind)는 Eppendorf(독일 함부르크 소재)에서 구입했다. 3㎜ 펀처 및 Whatman #903 단백질 세이버 카드는 GE Health Care Life Science(영국 버킹햄셔 리틀 찰폰트 소재)에서 구입했다. 제습제(1g) 및 바이오해저드 백은 VWR(미국 펜실베니아주 래드너 소재)에서 구입했다. 연구에 사용된 다른 모든 화학 물질은 최고 등급이었고 추가 정제 없이 사용했다.

(ii) 용액의 제조

C1s 작업 용액(0.5 ㎍/㎖)은 PBS 완충액에 제조된 0.5% BSA 용액으로 C1s 스톡 용액(367 ㎍/㎖)을 734배 희석하여 새로 제조했다. Z-Lys-SBzl·HCl을 최종 농도가 10mM이 되도록 DMSO에 용해하여 기질 스톡 용액을 제조하였다. 내부 표준(IS) 스톡 용액(2.5mM)은 메탄올/물(50/50) 용액 중 5mM Na₂CO₃에 N^ε-CBZ-L-라이신-d₃을 용해시켜 제조했다. 기질, C1s 및 IS 스톡 용액은 사용 전에 -80℃에 보관했다. 0.83mM의 Z-Lys-SBzl·HCl 및 33.3μM의 N^ε-CBZ-L-라이신-d₃을 함유하는 기질-IS 칵테일을 PBS 완충액에서 새로 제조했다. SDS 용액(0.1%)은 10% SDS를 메탄올/물(80/20, V/V) 용액으로 100배 희석하여 제조했다.

(iii) DBS 샘플의 제조

이전에 진단된 HAE 환자 24명의 전혈은 환자의 서면 동의서에 의해 제공되었다. 혈액을 Vacutainer EDTA 튜브에 채취하여 4℃에 보관했다. 수집 24시간 이내에 튜브를 여러 번 뒤집어 혈액 세포를 재현탁하고 60㎕ 분취량을 여과지 반점에 점적했다. 103명의 건강한 대상체의 정상 인간 전혈은 BIOIVT(미국 뉴욕 웨스트베리 소재)에서 구입했다. 혈반을 실온에서 최소 3시간 동안 건조시키고 밀봉된 바이오해저드 백에서 각 백 중 하나의 제습제와 함께 -20℃에 보관했다.

(iv) 대체 공시료로서 C1-INH가 없는 혈액의 제조

보정 곡선의 제조를 위해 fC1-INH가 고갈된 대체 공시료 및 품질 대조군(QC)을 얻기 위해, 6가지 다른 로트의 인간 전혈 샘플(3명의 남성 및 3명의 여성, 각각 10㎖)을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조했다. 간단히 말해서, 전혈을 1200×g에서 10분 동안 실온에서 원심분리했다. 상청액 혈장을 재거하고, 적혈구를 PBS 용액 5㎖로 세척하여 잔류 혈장 및 fC1-INH를 제거하였다. 적혈구는 실온에서 1200×g에서 10분 동안 원심분리하여 다시 단리하였다. 생성된 fC1-INH가 없는 적혈구를 통합했다. 대체 혈액 공시료는 PBS 완충액에 제조된 4.3% BSA와 통합된 적혈구를 동일 부피로 혼합하여 제조했다.

(v) DBS 중 보정 표준물질 및 QC 샘플의 제조

보정 표준물질(보정인자)은 서로 다른 농도의 fC1-INH(CINRYZE®)를 대체 공시료에 스파이크하여 제조했다. 공칭 fC1-INH 농도는 각각 100, 200, 300, 500, 1000 및 1500 mU/㎖였다. 품질 대조군(QC) 샘플은 대체 공시료 또는 통합된 인간 전혈으로 제조했다. 정량 하한(LLOQ) QC(100 mU/㎖) 및 낮음 QC(150 mU/㎖)는 대체 공시료로 제조했다. 다른 모든 QC는 내인성 C1-INH 수준(EL)을 고려하여 통합된 전혈으로 제조했다: 낮음-중간 QC(EL), 중간 QC(EL + 200 mU/㎖), 중간-높음 QC(EL + 500 mU/㎖), 및 높음 QC(EL + 800 mU/㎖). DBS 중 보정인자(calibrator) 및 QC의 제조는 전술한 바와 동일한 절차를 따랐다.

(vi) 샘플 추출 및 효소 반응

샘플을 추출하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 효소 반응을 수행하였다. 간단히 설명하면, DBS 디스크를 3㎜ 펀처를 사용하여 절단하고 500㎕ 96-웰 플레이트로 옮겼다. 디스크의 단백질은 PBS 중 0.5% BSA 100㎕에 넣어 Thermomixer 인큐베이션기에서 인큐베이션하고 37℃의 온도에서 3시간 동안 1250rpm으로 볼텍싱하여 추출했다. 플레이트를 4000rpm에서 3분 동안 원심분리한 다음, 추출물 20㎕를 그 다음 C1s 작업 용액 50㎕를 함유하는 또 다른 96웰 플레이트로 옮겼다. 그 다음 800rpm 및 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 상기 용액에 기질-내부 표준물질(substrate-IS) 칵테일 105 ㎕를 첨가한 다음, 암실의 실온에서 40분 동안 800 rpm으로 인큐베이션하였다. MeOH/물(80/20, v/v) 중 0.1% SDS 450㎕에 용액 50㎕를 전달하여 반응을 종결시켰다. 생성된 샘플은 LC-MS/MS 분석 전에 MeOH/물(80/20, v/v)로 200배 더 희석하였다.

(vii) LC-MS/MS 분석

반응 샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같이 LC-MS/MS로 분석하였다. 간단히 말하면, 기질(Z-Lys-SBzl·HCl), 분석물(N^α-벤질옥시카보닐-L-라이신, cbz-Lys) 및 IS(N^ε-CBZ-L-라이신-d₃)의 분리는 Waters Acquity UPLC 시스템에서 컬럼 온도가 30℃로 유지되는 역상 컬럼(Waters Xbridge Protein BEH C4, 3.5μm, 2.1×50㎜)을 사용하여 달성했다. 이동상 A는 0.1% 포름산 수용액이었고 이동상 B는 아세토나이트릴이었다. 유속은 0.3 ㎖/분이었고 이동상 구배는 다음과 같았다(시간, B%): 0분, 4%; 0.5분, 4%; 3.5분, 12%; 3.6분, 70%; 4.6분, 70%; 4.7분, 4%; 5.5분, 4%. 오토샘플러는 4℃로 설정되었으며 부분 루프 LC 주입 모드를 사용하여 3.0㎕의 샘플을 주입했다. 양이온을 사용하여 선택적 반응 모니터링(SRM) 모드로 작동되는 AB Sciex QTrap 6500 질량 분광분석기에서 분석물 및 IS를 정량했다. 최적의 MS 매개변수는 다음과 같다: 커튼 가스, 20; 충돌 가스, medium; 이온분무 전압, 4000; 온도, 550; 이온 공급원 가스 1, 50; 이온 가스 공급원 2, 50; 탈클러스터화 전위, 120; 입구 전위, 10.0; 충돌 에너지, 26.0; 충돌 셀 출구 전위, 12.0. 분석물 및 IS는 각각 m/z 281.2 내지 m/z 91.0 및 m/z 284.2 내지 m/z 91.0의 SRM 이온 쌍을 사용하여 모니터링했다.

(viii) 목적에 맞는 검정 검증

목적에 맞는 검정 검증은 바이오마커 및 DBS 기반 진단 검정에 대한 산업계의 모범 사례를 따랐다(1 내지 6). 이 방법은 다양한 조건 하에 보정 곡선, 정확도, 정밀도, 공시료 효과, 헤마토크릿, 추출, 샘플링 위치 및 안정성에 대해 검증했다.

정확도(상대 오류 또는 RE%) 및 정밀도(RSD%)는 3일 동안 매일 각 농도 수준에서 대체 공시료 및 진본 공시료 둘 모두 중 QC 샘플의 6회 반복물을 분석하여 평가했다. 일중 및 일간(inter-day) 평균 정확도와 정밀도가 순차적으로 계산되었다. 정량 상한선(ULOQ) 보정인자를 진행시킨 후 블랭크 용액을 주입하여 분석물 이월을 검사했다.

검정 성능에 대한 헤마토크릿 수준의 영향은 4명의 건강한 대상체의 전혈을 사용하여 평가했다. 간단히 말해서, 혈장은 1200×g에서 10분 동안 원심분리하여 적혈구로부터 분리했다. 그 다음, 서로 다른 부피의 혈장과 적혈구를 혼합하여 각각 25%, 45%, 60% 및 75%의 헤마토크릿 수준을 달성했다. 45% 헤마토크릿에서 유래된 DBS 샘플은 다른 헤마토크릿 수준에서의 C1-INH 활성을 정규화하기 위한 참조로서 사용했다.

DBS 반점에 대한 펀치 위치의 효과 및 DBS 반점의 변동 효과는 한 반점에 대해 3 내지 6개의 펀치 위치 및 총 4개의 상이한 DBS 반점으로부터 얻은 낮음 및 중간-높음 QC 샘플을 사용하여 평가했다(도 9, 표 3). 낮음 QC는 대체 공시료에서 제조했고 중간-높음 QC는 통합된 전혈에서 제조했다.

추출 효율은 100, 600 및 1000 mU/㎖로 대체 공시료에 제조된 QC를 사용하여 스파이크전(pre-spiked) 샘플과 스파이크후(post-spiked) 샘플의 결과를 비교하여 평가했다. DBS 카드를 제조하기 전에 대체 공시료 내로 C1-INH를 스파이킹하여 스파이크전 샘플을 제조했다. 다른 한편, 스파이크후 샘플은 블랭크 대체 공시료에서 유래된 DBS 추출물에 동일한 농도의 C1-INH(3.3㎕, 3.0㎜ 펀치 중 습윤 혈액 부피에 해당)를 스파이킹하여 제조했다.

C1-INH 활성의 전혈 안정성은 6명의 건강한 대상체(3명의 남성 및 3명의 여성)로부터 동일한 부피의 통합된 전혈을 사용하여 테스트했다. 샘플은 Whatman #903 단백질 세이버 카드에 첨가하기 전에 최대 7일 동안 4℃에서 보관했다. 유사하게, 통합된 전혈으로부터 제조된 DBS 샘플은 각각 운송 및 보관 조건에서의 안정성을 평가하기 위해 45℃에서 3일 동안, 및 실온에서 134일 동안 보관했다.

(ix) 데이터 분석

데이터 분석은 실시예 1에 기술된 대로 수행했다. 간단히 말해서, 내부 표준물질에 대한 분석물의 피크 면적 비율은 AB Sciex Analyst(1.6.3)를 사용하여 결정했다. SoftMax Pro 7.0을 사용하여 피크 면적 비율과 스파이크된 C1-INH의 농도를 가지고 4개 매개변수 로지스틱 보정 곡선을 작도했다. 샘플 농도는 다음 방정식에 따라 계산했다:

여기서, y는 피크 면적 비율이고; x는 샘플 농도이며; A, B, C 및 D는 곡선 피팅 매개변수이다. 또한, 평균, 정확도(RE%), 표준편차 및 상대표준편차(RSD%)는 Excel을 사용하여 계산했다.

결과

전반적인 전략

LC-MS/MS 분석은 도 5에 도시된 바와 같이 개발하여 건조 혈반에서 유래한 샘플 중 효소 반응 생성물인 cbz-Lys을 측정했다. 검정은 다음 단계로 이루어진다: (1) DBS 카드에서 C1-INH의 추출; (2) 과량의 C1s와 C1-INH의 결합; (3) 미결합된 C1s와 이의 기질과의 반응; 및 (4) 효소 반응 생성물 cbz-Lys의 LC-MS/MS 분석. 검정 조건은 C1s 및 이의 기질의 상대적 농도, C1s와 fC1-INH 사이의 결합 시간 및 온도, C1s와 이의 기질 사이의 효소 반응 시간 및 온도뿐만 아니라, LC-MS/MS 조건과 같은 검증전 진행 동안 최적화되었다.

보정 공시료 및 보정 곡선

활성이 정상 대조군보다 낮은 HAE 환자에서 C1-INH 활성을 측정하기 위해 통합된 인간 전혈으로부터 C1-INH-고갈 혈액 공시료를 제조하였다. C1-INH는 순환계 단백질이며 적혈구를 스핀 다운하는 원심분리 후에 혈장 상청액에 남아 있을 것이다. 진본 전혈 중의 혈장 단백질 농도를 모방하기 위해 적혈구에는 BSA 용액을 후속해서 보충하였다. 동일한 부피의 적혈구와 혼합된 4.3%의 BSA(43 ㎎/㎖)는 여과지에서 동일한 반점 크기로 입증되는 바와 같이 진본 전혈과 유사한 점도를 나타냈다. 도 6A 및 6b에 나타낸 바와 같이, C1-INH의 완전한 고갈은 대체 공시료 및 블랭크 대조군과 동일한 분석물 신호에 의해 확인했으며, 이는 대체 공시료에 fC1-INH 활성의 부재를 암시한다. 이와 대조적으로, 통합된 건강한 혈액(도 6C) 및 500 mU/㎖의 C1-INH가 스파이크된 통합된 건강한 혈액에서는 C1-INH 의존적 신호 감쇠가 존재한다(도 6D).

도 7은 4개 매개변수 로지스틱 곡선 맞춤을 사용하여 대체 공시료에 스파이크된 6개의 상이한 C1-INH 농도(mU/㎖)에 대한 분석물 신호를 플로팅한 전형적인 보정 곡선을 표시한다. 곡선은 100 내지 1500 mU/㎖의 작용가능 범위를 보여준다. 검정 검증 결과는 6개 포인트 보정 곡선이 사전설정된 기준을 충족시킨다는 것을 보여주었다: (1) 상대 오차(RE%)는 25% 이하인 LLOQ 및 ULOQ 보정인자를 제외하고 각 농도 수준에서 보정인자의 최소 절반에 대해 20% 이하이어야 한다; (2) 보정 곡선에는 총 보정인자 수의 75% 이상이 포함되어야 한다; (3) 2회 초과의 연속 검증 진행이 실패하지 않아야 한다. 14개의 통과된 분석 진행 중 13개에서 모든 교정인자의 평균 진행 간 정확도는 -1.4% 내지 5.9% 범위였다(표 4).

검정 정밀도 및 정확도

검정 정밀도 및 정확도는 대체 공시료와 진본 전혈 둘 모두에서 제조된 QC 샘플을 사용하여 평가했다. LLOQ QC 및 낮음 QC는 대체 공시료에 fC1-INH를 각각 100 mU/㎖ 및 150 mU/㎖의 최종 농도로 스파이킹하여 제조했다. 통합된 전혈은 낮은-중간 QC로 사용했으며, 반면 중간, 중간-높음 및 높음 QC 샘플은 통합된 전혈에 fC1-INH를 스파이킹하여 제조했다. 이들의 공칭 농도는 평균 내인성 C1-INH 농도(518 mU/㎖, n=18)와 스파이크된 fC1-INH 농도의 합이었다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 일중 정밀도 및 정확도는 각각 4.4% 내지 11.6%, 및 -11.1% 내지 -2.1% 범위였고, 일간 정밀도 및 정확도는 각각 8.1% 내지 13.1%, 및 -10.3% 내지 0.9%였다.

헤마토크릿 수준의 효과

전혈의 헤마토크릿 수준이 여과지의 혈액 희석 및 이에 따른 DBS 반점 크기에 영향을 미쳐 검정 편향을 초래한다는 것은 잘 보고되어 있다(1-3, 6, 7). 헤마토크릿 수준이 증가함에 따라 DBS 샘플의 반점 면적은 감소한다. 성별과 연령에 따라 전혈의 헤마토크릿 수준은 28%에서 67% 범위이다(7). 검정 성능에 대한 헤마토크릿의 효과는 25%, 45%, 60% 및 75%의 4가지 헤마토크릿 수준에서 조사했고, 여기서 45% 헤마토크릿 수준은 대조군으로 사용했다. fC1-INH 활성은 건조 혈반 중 헤마토크릿 수준과 선형 상관관계를 나타냈다(표 6). 30% 내지 60% 사이의 헤마토크릿 수준은 fC1-INH 활성 측정에 미치는 영향이 최소일 것이다(RE < 20%).

C1-INH 활성의 펀치 위치

DBS 기반 검정의 또 다른 문제는 분석물 측정에 대한 펀치 위치의 효과이다(1, 6, 8). C1-INH 활성에 대한 DBS 카드의 펀치 위치 효과를 조사하기 위해 동일한 대상체의 4개 반점에서 중앙 및 주변 펀치 유래의 총 18개의 반복 샘플을 수집하고 낮음 QC 및 중간 높음 QC 샘플에 대해 분석했다. 정밀도 및 정확도는 모두 15% 이내였으며, 이는 펀치 위치가 C1-INH 활성 측정에 영향을 미치지 않았음을 암시한다(표 4).

추출 효율

C1-INH의 추출 효율은 대체 공시료에 제조된 QC를 사용하여 평가했다. 평균 추출 효율은 100, 600 및 1000 mU/㎖의 QC 농도에서 각각 48.8%, 65.9% 및 58.2%였다(표 7). 보정 곡선은 샘플 테스트 동안 각 진행마다 사용되었고, 추출 효율의 변동은 분석 정확도에 영향을 미치지 않을 것이다.

전혈 및 DBS 중 fC1-INH 안정성

fC1-INH의 안정성은 전혈에서 평가했다. 이전 보고서에 따르면 fC1-INH는 환자 및 건강한 대상체 모두에서 최대 3일 동안 실온에서 안정적인 것으로 입증되었다(9). 통합된 건강한 혈액에서 fC1-INH 활성은 4℃에서 7일 동안 보관 후 최소 변화를 보였다(표 8). DBS 중 fC1-INH 안정성을 테스트하기 위해 QC 대조군을 실온 및 45℃에서 제습제 팩이 들어 있는 기밀 백에 넣었다. C1-INH 활성은 각 카드의 여러 펀치로부터 측정되었으며 45℃에서 3일 보관 후 및 실온 보관 시 134일 후 최소 손실(15% 미만)을 나타냈다(표 8). 이러한 결과는 fC1-INH가 활성 손실 없이 DBS의 주변 온도에서 운송 및 보관될 수 있음을 입증했다.

재주사 안정성을 평가하기 위해, 처리된 샘플을 오토샘플러에서 4℃ 하에 2일 동안 둔 후, 재주사했다. 결과는 정밀도 및 정확도가 사전 정의된 허용 기준을 충족함을 보여주었다(표 9). 또한, 분석물의 이월은 검출할 수 없었다(데이터는 제시되지 않음).

건강한 대상체 및 HAE 대상체로부터의 DBS 샘플 분석

검증된 검정을 사용하여 fC1-INH 활성은 103명의 건강한 대상체와 24명의 HAE 환자(9명의 남성 및 15명의 여성)로부터 수집된 DBS 샘플에서 측정했고 결과는 도 8에 제시된다. 건강한 대상체 그룹의 경우 fC1-INH 활성 범위는 311 내지 1090 mU/㎖였고, 평균 활성 및 표준 편차(SD)는 각각 573 및 135 mU/㎖였다. 그럼에도 불구하고, C1-INH가 158 mU/㎖인 대상체 1명을 제외한, 테스트된 모든 HAE 대상체는 LLOQ(100 mU/㎖) 미만의 C1-INH 활성을 나타냈다. 303 mU/㎖의 컷오프 값(평균 - 2xSD)이 확립되었으며, 이는 HAE 대상체와 건강한 대상체를 완전히 구별할 수 있었다.

논의

C1-INH는 보체, 접촉, 응고 및 섬유소용해 시스템을 포함하는 광범위한 저해 생물학적 활성을 조절하는 기능을 한다(10-12). 칼리크레인-키닌 캐스케이드에서 3가지 효소(인자 XIIa, 인자 XIIf 및 혈장 칼리크레인)의 주요 저해제로서 정상적인 fC1-INH 수준은 HAE 공격을 유도하는 전염증성 매개인자인 브래디키닌의 과잉생산을 방지한다. 결핍성 fC1-INH 활성은 접촉 시스템을 반복적으로 활성화시켜 활성 단백분해 효소인 혈장 칼리크레인(pKal)을 과도하게 생성하고, 결국 고분자량 키니노겐(high-molecular-weight kininogen, HMWK)을 절단하여 브래디키닌을 방출한다(13-15). 현재, C1-INH SERPING1 유전자 전체에 걸쳐 450개 초과의 돌연변이가 식별되었으며 많은 돌연변이가 HAE 환자의 fC1-INH 결핍과 관련이 있다(16).

다양한 유형의 HAE가 있지만 모두 결핍성 C1-INH 기능을 특징으로 한다. 전형적으로, HAE 환자의 fC1-INH 수준은 정상 값의 5 내지 30% 사이이며 약화된 C1-INH 활성은 HAE 진단에 가장 중요한 실험실 매개변수로서 사용된다(9). fC1-INH 활성에 대한 기존의 검정은 C1s와 이의 인공 기질인 Z-Lys-SBzl·HCl 간의 반응을 통해 cbz-Lys와 티오메틸 벤젠을 생성함으로써, fC1-INH 활성을 간접적으로 측정한다. 티오메틸 벤젠은 5,5'-다이티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB)으로 유도체화한 후 발색 검정에 의해 측정된다(9). 내인성 또는 스파이크-인(spike-in) C1-INH의 존재는 효소 반응을 저해할 것이므로, 반응 생성물의 형성은 C1-INH 활성에 반비례한다. 기존의 검정은 건강한 대상체와 HAE 대상체를 혈장 또는 혈청 샘플에서 구별하는 데 강력하지만, DBS에서 그 검정의 사용은 전혈 중 적혈구에 의한 검정 방해로 인해 한계가 있었다. LC-MS/MS 검정은 기존의 발색 검정에 비해 고유한 장점을 가지고 있다. 첫째, 발색 검정은 두 단계의 반응을 기초로 하는 반면, LC-MS/MS 검정은 C1s 반응의 직접 생성물을 측정하여, 검정 변동이 더 적을 수 있다. 둘째, 검정 중 내부 표준물질(IS)의 사용은 샘플 제조 및 분석 동안 분석 변동을 교정하는 데 도움을 준다. 셋째, 보정 곡선 및 C1-INH가 없는 대체 공시료에 제조된 QC가 각 진행마다 포함되어 검정의 정확도 및 재현성을 더욱 향상시킬 수 있다. 건강한 대상체에서 광범위한 C1-INH 활성, HAE 환자에서 제한된 C1-INH 활성 이동(정상 활성의 5-30%) 및 효소 동역학 반응의 좁은 범위를 고려하면, 검정 변동의 최소화는 C1-INH 활성의 정확한 측정에 핵심 요소일 수 있다.

효소 활성 검정에서 분석물의 보정 곡선은 일반적으로 진본 공시료보다는 순수한 완충 용액에 제조되며, 검정 성능은 QC 샘플에 의해 모니터링된다. 이 접근법은 간단하지만, 효소 반응이 너무 빠르게 진행되어 반응 조건의 약간의 이동이 분석 결과 및 이에 따른 환자의 정확한 진단에 영향을 미칠 것이기 때문에 C1-INH 활성 측정에 쉽게 적용될 수 없다. 본 연구에서는 진본 공시료가 내인성 분석물을 함유하기 때문에, 바이오마커 검정에서 보정인자 및 QC의 제조에 널리 활용된 "대체 공시료"의 개념을 채택했다(15). 대체 공시료에는 분석물이 고갈되어 있어야 하지만, 분해 효율, 이온화 효과 및 추출 수율과 관련하여 진본 공시료와 유사해야 한다. 보정 곡선 및 QC의 제조를 위해 전혈에서 유래된 대체 공시료의 사용은 C1-INH 활성이 낮은 환자 샘플에서 효소 반응을 정확하게 평가하는 데 중요하다. 이 접근 법을 통해 100~1500 mU/㎖의 검정 범위가 달성되었다. 또한, 대체 공시료 및 진본 전혈 둘 모두에서 제조된 QC 샘플에서는 우수한 정확도와 정밀도가 달성되었으며, 이는 이 검정 조건 하에 두 공시료의 평행관계를 입증한다.

본 명세서에 기술된 LC-MS/MS 검정은 15% 미만의 평균 일중 및 일간 변동성 및 샘플 간의 무시할 수 있는 이월을 보여주었다. 또한, C1-INH 활성 측정은 DBS의 일부 다른 분석물에서는 그렇지 않은 경우도 있었지만(1), DBS 내의 펀치 위치와 무관했다. 그러나, 분석 정확도는 헤마토크릿 수준이 영향을 줄 수 있으므로, 헤마토크릿 수준이 30% 미만 또는 60% 초과인 샘플의 테스트 결과를 해석하는 데에는 주의해야 한다.

샘플 수송 및 보관 동안 DBS에서는 안정적인 분석물 수준을 보유하는 것이 중요하다. 전혈 중 C1-INH는 4℃에서 7일 동안 안정적이었다. DBS에서는 45℃에서 보관한 경우 최대 3일 동안, 그리고 실온에서 보관한 경우에는 134일 동안 안정적이었다. 이것은 개발 도상국에서도 샘플 수집, 중앙 실험실로의 이송, 실험실 테스트 및 재 테스트의 전체 기간에 충분하다.

103명의 건강한 대상체에서 측정된 C1-INH 활성은 평균 활성이 573 mU/㎖, 표준편차가 135 mU/㎖인 정규 분포를 보였다. 24명의 HAE 환자 중 23명은 < 100 mU/㎖ C1-INH 활성을 보였고, 가장 높은 C1-INH 활성인 158 mU/㎖을 갖는 HAE 샘플은 평균 정상 활성의 27.6%에 상응했다. 이 데이터는 건강한 개체로부터의 샘플과 HAE 환자의 상응하는 샘플 간의 명확한 차이를 지지한다.

결론적으로, 본 명세서에는 DBS 샘플 중 fC1-INH 활성에 대한 강력한 검정이 기술된다. 이 검정은 HAE 환자를 진단하는데 탁월한 재현성과 정확도를 제공한다. 간단한 샘플 수집과 장기간의 운송 및 보관 안정성은 특히 완비된 임상 실험실에 대한 접근이 제한적이거나 전혀 되지 않는 곳에서, 진단 테스트의 이용가능성을 확대시켜준다. 이 검정은 세계적으로 HAE 진단 알고리즘을 근본적으로 바꿀 수 있는 엄청난 가능성을 보여준다.

참고문헌

기타 실시형태

본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적 특징으로 교체될 수 있다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 개시된 각 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다.

이상의 설명으로부터, 본 기술분야의 기술자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 그 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 맞추어 다양한 변경 및 수정을 할 수 있다. 따라서, 다른 실시형태도 청구범위 내에 포함된다.

등가물

몇 가지 본 발명의 실시형태가 본 명세서에서 기술되고 예시되었지만, 본 기술분야의 기술자는 기능을 수행하고 및/또는 결과 및/또는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 장점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이며, 이러한 변형 및/또는 수정은 각각 본 명세서에 기술된 본 발명의 실시형태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 본 기술분야의 기술자는 본 명세서에 기술된 모든 매개변수, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것을 의미하고 실제 매개변수, 치수, 재료 및/또는 구성이 본 발명의 교시가 사용되는 특정 적용예 또는 적용예들에 따라 달라질 것이라는 것을 쉽게 이해할 것이다. 본 기술분야의 기술자는 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 특정 발명의 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시형태는 단지 예로서 제시되고 첨부된 청구범위 및 이에 대한 등가물의 범위 내에서 본 발명의 실시형태는 구체적으로 기술되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 실시형태는 본 명세서에 기재된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 기능, 시스템, 제품, 재료, 키트 및/또는 방법이 서로 모순되지 않는다면, 이러한 기능, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 2개 이상의 임의의 조합은 본 개시내용의 발명의 범위에 포함된다.

본 명세서에서 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전적 정의, 참고로 포함되는 문서의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 지배하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참고로 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포함할 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 단수 표현은 명백하게 반대로 표시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 "및/또는"이라는 문구는 그렇게 결합된 요소, 즉 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 별개로 존재하는 요소의 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 여러 요소는 동일한 방식, 즉, 이렇게 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 간주되어야 한다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소는, 이것이 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있는지 여부에 관계없이 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 일 실시형태에 따르면 A만을 지칭할 수 있고(선택적으로, B 외의 다른 요소를 포함함); 다른 실시형태에 따르면, B만을 지칭할 수 있으며(선택적으로 A 외의 다른 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에 따르면, A 및 B 둘 모두 등을 지칭할 수 있다(선택적으로 다른 요소를 포함함).

본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, "또는"은 위에서 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로서, 즉 다수의 또는 일련의 요소 및 선택적으로 또 다른 나열되지 않은 항목 중 적어도 하나의 내포뿐만 아니라 하나보다 많은 것을 포함하는 것으로서 해석되어야 한다. 단지 "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같이 명확하게 반대되는 용어, 또는 청구범위에 "~로 이루어지는"으로 사용되는 경우에는 다수의 요소 또는 요소 목록 중 정확히 하나의 요소를 포괄할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 사용된 용어 "또는"은 "어느 하나", "중 하나", "중 하나만" 또는 "중 정확히 하나"와 같은 배타성 용어가 앞에 오는 경우 배타적 대안(즉, "하나 또는 다른 하나이되, 둘 모두는 아님")을 나타내는 것으로만 해석되어야 할 것이다. 청구범위에서 사용될 때 "본질적으로 이루어지는"은 특허법 분야에서 사용되는 일상적인 의미를 가질 것이다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소 목록과 관련하여 "적어도 하나"라는 문구는 요소 목록에 있는 요소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 나열된 각각 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함해야 하는 것은 아니며 요소의 목록 중 요소의 임의의 조합을 배제하지도 않는다. 이 정의는 또한 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든, "적어도 하나"라는 문구가 언급하는 요소 목록 내에서 구체적으로 식별된 요소 이외의 요소가 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 일 실시형태에 따르면, B는 존재하지 않고(선택적으로 B 이외의 다른 요소는 포함함) 하나보다 많은 A를 선택적으로 포함하는, 적어도 하나의 A를 지칭할 수 있고; 다른 실시형태에 따르면, A는 존재하지 않고(선택적으로 A 이외의 다른 요소는 포함함) 하나보다 많은 B를 선택적으로 포함하는, 적어도 하나의 B를 지칭할 수 있으며; 또 다른 실시형태에 따르면, 하나보다 많은 A를 선택적으로 포함하는 적어도 하나의 A 및 하나보다 많은 B를 선택적으로 포함하는 적어도 하나의 B(및 선택적으로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.

또한, 명백히 반대로 표시되지 않는 한, 하나보다 많은 단계 또는 행동을 포함하는 본 명세서에 청구된 임의의 방법에서, 이 방법의 단계 또는 행동의 순서는 이 방법의 단계 또는 행동이 언급된 순서에만 반드시 제한되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

샘플 중 기능성 C1-에스테라제 저해제(functional plasma C1-esterase inhibitor: fC1-INH)의 수준을 결정하는 방법으로서,
(i) 지지 부재 상에 대상체의 혈액 샘플을 점적(spot)하는 단계;
(ii) 상기 지지 부재 상의 상기 혈액 샘플을 건조시켜 건조 혈반(dried blood spot)을 형성시키는 단계;
(iii) 상기 (ii)의 건조 혈반으로부터 단백질을 추출하는 단계; 및
(iv) 존재하는 경우, 상기 (iii)에서 추출된 단백질 중 fC1-INH의 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 fC1-INH의 수준을 측정하는 단계가,
(a) 상기 추출된 단백질을, 선택적으로 보체 성분 1s(C1s) 및 C1s 기질과 함께 순차적으로 인큐베이션하여 C1s 기질 생성물을 생성하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 생성된 C1s 기질 생성물의 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 측정된 C1s 기질 생성물의 수준에 기초하여 상기 건조 혈반 중 fC1-INH의 수준을 결정하는 단계
를 포함하는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제2항에 있어서, 단계 (a)는 상기 추출된 단백질을 상기 C1s 및 상기 C1s 기질과 함께 인큐베이션함으로써 수행되어 반응 혼합물을 생성하는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 단계 (b)의 상기 측정하는 단계는 액체 크로마토그래피-질량 분광분석에 의해 수행되는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1s 기질이 N^α-카보벤질옥시-Lys-티오벤질 에스터이고, 상기 C1s 생성물이 N^α-벤질옥시카보닐-L-라이신(cbz-Lys)인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (iii)의 추출하는 단계가 상기 건조 혈반을 소 혈청 알부민(BSA)/PBS 완충액과 함께 적어도 3시간 동안 인큐베이션함으로써 수행되는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 부재가 여과지인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (ii)의 건조가 실온에서 적어도 3시간 동안 수행되는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터 상기 혈액 샘플을 수득하는 것을 더 포함하는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액 샘플이 전혈 샘플인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 인간 대상체인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 대상체가 유전성 혈관부종(HAE)을 갖고 있거나, 갖는 것으로 의심되거나, 또는 가질 위험이 있는 것인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 HAE가 I형 HAE 또는 II형 HAE인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 C1-INH-결핍-매개 장애가 있는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하되, 대조군과 비교하여 감소된 수준의 fC1-INH 생성물은 대상체가 C1-INH-결핍 매개 장애가 있음을 나타내는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, fC1-INH의 수준에 기초하여 상기 대상체에 적합한 치료를 식별하는 단계를 더 포함하는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 결정된 상기 fC1-INH의 수준에 기초하여 질병 치료의 후보로서 대상체를 식별하는 단계를 더 포함하는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 C1-INH 결핍-매개 장애의 위험이 있거나 장애를 갖는 것으로 식별된 경우, 상기 대상체에게 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 치료제가 혈장 칼리크레인(pKal) 저해제, 브래디키닌 B2 수용체 길항제 또는 C1 에스테라제 저해제인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 치료제가 에칼란타이드(ecallantide), 라나델루맙(lanadelumab), 이카티반트(icatibant), 또는 인간 혈장 유래 C1 에스테라제 저해제인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C1-INH 결핍 매개 장애가 HAE인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 HAE가 I형 HAE 또는 II형 HAE인, fC1-INH의 수준을 결정하는 방법.