JP2022529265A - 機能的なＣ１エステラーゼインヒビター（ｆＣ１－ＩＮＨ）の定量化のための方法 - Google Patents

Abstract

本明細書において、乾燥した血液スポットからｆＣ１－ＩＮＨを定量化するための方法が、提供される。このような方法は、支持体上にて血液サンプルをスポットおよび乾燥するステップと、乾燥した血液サンプルからタンパク質を抽出するステップと、抽出したタンパク質におけるｆＣ１－ＩＮＨのレベルを測定するステップとを含み得る。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条の下、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１９年４月１６日に出願の米国特許仮出願番号第６２／８３４，４６１号、および２０１９年１１月７日に出願の米国特許仮出願番号第６２／９３２，０１１号の利益を主張するものである。

遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）は、血漿タンパク質Ｃ１エステラーゼインヒビター（簡潔にＣ１インヒビター、Ｃ１－ＩＮＨ）の遺伝的な欠損または機能障害により引き起こされる希少な常染色体優性の遺伝性疾患である。ＨＡＥは、通常顔、皮膚、腸、および／または気道に関与する、血管性浮腫の再発エピソードを特徴とする。この症状は他の疾患で見出される場合があり、ＨＡＥの診断を複雑にする。ＨＡＥは、主に、２つのタイプに分けることができる。Ｉ型は、低レベルのＣ１－ＩＮＨタンパク質を特徴とし、ＨＡＥ発症の約８５％を占め、対してＩＩ型は、低機能的なＣ１－ＩＮＨ（ｆＣ１－ＩＮＨ）であるが、正常または高いＣ１－ＩＮＨタンパク質レベルを特徴とし、約１５％を占める。未処置のＩ型およびＩＩ型の患者においてＵｎｉｔｓ／ｍｌで測定される場合、典型的なｆＣ１－ＩＮＨは、正常なレベルの５～３０％である。

ｆＣ１－ＩＮＨを測定するための現在利用可能なアッセイは、血漿ベースのアッセイである。頻繁に使用されるアッセイは、発色性アッセイであり、合成のＣ１エステラーゼに特異的な基質を使用して試験サンプルにおけるＣ１－ＩＮＨによるＣ１エステラーゼの活性の阻害を間接的に測定する。別の一般に使用されるアッセイは、補体タンパク質成分Ｃ１ｓへのＣ１－ＩＮＨの機能的な結合を測定するＥＬＩＳＡアッセイである。しかしながら、集約された試験機関へのサンプルの発送および保存は、多くの場合、血漿ベースのアッセイにとって都合が悪い。

生体サンプルにおけるｆＣ１－ＩＮＨを測定するための中央の研究室で実行できる単純かつ使用しやすい方法を開発することに、強い関心がもたれている。

本開示は、たとえば液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を介したＣ１エステラーゼ酵素反応に由来する基質産物（Ｃ１ｓ基質産物）の測定による、分析のための機能的な血漿中Ｃ１エステラーゼインヒビター（ｆＣ１－ＩＮＨ）を含む乾燥した血液スポットの使用を含む、単純であり、感度があり、かつ選択的なアッセイの開発に少なくとも部分的に基づく。

よって、本開示の一態様は、乾燥した血液サンプル中のｆＣ１－ＩＮＨのレベルを決定するための方法であって、（ｉ）対象由来の血液サンプルを支持体上にスポットするステップと、（ｉｉ）前記支持体上の血液サンプルを乾燥させて乾燥した血液スポットを形成するステップと、（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの乾燥した血液スポットからタンパク質を抽出するステップと、（ｉｖ）存在する場合に、（ｉｉｉ）で抽出したタンパク質におけるｆＣ１－ＩＮＨのレベルを測定するステップとを含む、方法を提供する。このような測定は、検量線に照らしてまたはこれと比較して行われ得る。一部の例では、検量線は、Ｃ１－ＩＮＨフリーのバッファーまたは他の適切な成分を用いた正常な対象由来の全血の段階希釈により、調製され得る。

一部の例では、血液スポットを乾燥させるステップ（ｉｉ）は、室温で３時間行われ得る。一部の例では、支持体はろ紙である。あるいはまたはさらに、乾燥した血液スポットからタンパク質を抽出するステップ（ｉｉｉ）は、乾燥した血液スポットを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳバッファーと少なくとも３時間インキュベートすることにより行われ得る。

本明細書中開示される方法のいずれかでは、ｆＣ１－ＩＮＨのレベルを測定するステップ（ｉｖ）は、（ａ）前記抽出したタンパク質を、補体成分１ｓ（Ｃ１ｓ）およびＣ１ｓ基質とインキュベートして、反応混合物を産生させるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたＣ１ｓ基質産物のレベルを測定するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で測定したＣ１ｓ基質産物のレベルに基づき乾燥した血液スポットにおけるｆＣ１－ＩＮＨのレベルを決定するステップとを含み得る。一部の例では、Ｃ１基質産物は、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）または液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）のいずれかにより測定され得る。

一部の実施形態では、抽出したタンパク質を補体成分１ｓ（Ｃ１ｓ）およびＣ１ｓ基質とインキュベートするステップ（ａ）は、抽出したタンパク質をＣ１ｓとインキュベートして反応混合物を産生させ、次に反応混合物をＣ１ｓ基質とインキュベートしてＣ１ｓ基質産物を産生させることにより、行われ得る。一部の例では、Ｃ１ｓ基質産物のレベルは、液体クロマトグラフィー－質量分析法により測定され得る。例示的なＣ１ｓ基質としては、限定するものではないが、Ｃ１ｓ産物であるＮ^α－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ｃｂｚ－Ｌｙｓ）を生じさせるＮ^α－カルボベンジルオキシ－Ｌｙｓ－チオベンジルエステルが挙げられる。

本明細書中記載の方法のいずれかは、対象、たとえばヒト対象から血液サンプル（たとえば全血サンプル）を入手するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、ヒト対象は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）、たとえばＩ型ＨＡＥまたはＩＩ型ＨＡＥといったＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害を有するかまたは有する疑いのあるヒト患者であり得る。

本明細書中記載の方法は、対象がＨＡＥを有するかどうかを決定するステップをさらに含み得る。対照と比較して低いｆＣ１－ＩＮＨのレベル（Ｃ１ｓ基質産物の高いレベルと相関する）は、対象が血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）および／またはＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害、たとえば本明細書中開示されるＨＡＥを有することを表す。本明細書中記載の方法のいずれかは、（ａ）機能的なＣ１－ＩＮＨのレベルに基づき対象に適した処置を同定するステップ；（ｂ）本明細書中開示される方法により決定されるｆＣ１－ＩＮＨのレベルに基づき疾患の処置の候補として対象を同定するステップ；またはその両方をさらに含み得る。

本明細書中記載の方法のいずれかは、本明細書中開示される方法のいずれかによりＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害のリスクがあるかまたはこれを有すると同定された対象に治療薬を投与するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、治療薬は、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、またはＣ１エステラーゼインヒビターであり得る。例として、限定するものではないが、エカランチド、ラナデルマブ、イカチバント、またはヒト血漿由来のＣ１エステラーゼインヒビターが挙げられる。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の説明に記載する。本発明の他の特性または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明、また添付の特許請求の範囲から明らかである。

図１は、Ｃ１ｓ産物（ｃｂｚ－Ｌｙｓ）を分析するための例示的な乾燥した血液スポット（ＤＢＳ）ベースのｆＣ１－ＩＮＨの液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）アッセイを示す概略図である。 図２は、衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）下でのｃｂｚ－Ｌｙｓ親イオンのフラグメンテーションパターンを示す例示的なイオンクロマトグラムである。ｍ／ｚ ９１で最も強いピークが、検出のためのプロダクトイオンとして選択された。 図３は、対照としての純粋な（ｎｅａｔ）バッファー溶液（パネル（１））；最適な体積比の赤血球およびＢＳＡ溶液の混合物から構成される代替のマトリックス由来のＤＢＳ抽出物の酵素反応（パネル（２））；ならびに健常な個体由来の基準となる全血サンプル由来のＤＢＳ抽出物の酵素反応（パネル（３））に由来するｃｂｚ－Ｌｙｓおよび内部標準を示す例示的なイオンクロマトグラムを含む。 図４は、ＤＢＳにおけるｆＣ１－ＩＮＨの測定を示す検量線である。 図５は、Ｃ１ｓ産物（Ｎ^α－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン；ｃｂｚ－Ｌｙｓ）を測定するための例示的な乾燥した血液スポット（ＤＢＳ）ベースのｆＣ１－ＩＮＨ液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）アッセイを示す概略図である。 図６Ａ～６Ｄは、代表的なサンプルの例示的なイオンクロマトグラムを示す。図６Ａは、対照としての純粋なバッファー溶液におけるｃｂｚ－Ｌｙｓおよび内部標準を示す。図６Ｂは、ブランクの代替のマトリックスにおけるｃｂｚ－Ｌｙｓおよび内部標準を示す。図６Ｃは、集められた基準となる血液におけるｃｂｚ－Ｌｙｓおよび内部標準を示す。図６Ｄは、５００ｍＵ／ｍＬのＣ１－ＩＮＨをスパイクした集められた健常な血液におけるｃｂｚ－Ｌｙｓおよび内部標準を示す。ｍＵ／ｍＬは、ミリリットルあたりの機能的なＣ１－ＩＮＨのレベルのミリ単位である。 図７は、ＤＢＳにおけるｆＣ１－ＩＮＨの測定を示す代表的な検量線である。 図８は、健常な対象（ｎ＝１０３）およびＨＡＥ患者（ｎ＝２４）に由来するサンプルにおけるｆＣ１－ＩＮＨのレベルを示すプロットである。ｍＵ／ｍＬは、ミリリットルあたりの機能的なＣ１－ＩＮＨのレベルのミリ単位である。 図９は、分析のため異なる位置から採取されたパンチ（Ｎ＝３または＝６）でのＤＢＳサンプル（スポットＡ～Ｄ）を示す写真である。

Ｃ１インヒビタータンパク質（Ｃ１－ＩＮＨ）の遺伝的欠損は、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）をもたらす。ＨＡＥを有する患者は、多くの場合、未知の引き金が関与する疼痛のある浮腫の急性発作に苦しんでいる。

Ｃ１エステラーゼ（Ｃ１ｓ）インヒビター（Ｃ１－ＩＮＨ）は、ヒト血漿の正常な成分であり、アンチトロンビンＩＩＩ、α１プロテアーゼインヒビター、α２－プラスミンインヒビター、およびヘパリンコファクターＩＩを含むセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）のグループに属する。このグループの他の阻害剤と同じく、Ｃ１－ＩＮＨは、補体系、内因性の凝固（接触）系、線維素溶解系、および凝固カスケードを含む人体の主要なカスケード系のうちのいくつかに関する重要な阻害性の潜在力を有する。Ｃ１－ＩＮＨは、通常炎症プロセスの間に活性化され、反応部位への共有結合によりその基質を不活性化する。Ｃ１－ＩＮＨは、補体成分１（Ｃ１ｒ）の下位成分の、Ｃ１ｓ、凝固第ＸＩＩａ因子、およびカリクレインに対する唯一の既知の阻害剤である。さらにこれは、内因性の凝固カスケードにおける凝固第ＸＩａ因子の主要な阻害剤である。

ＨＡＥは、主に二つのタイプに分けることができる。Ｉ型は、低レベルのＣ１－ＩＮＨタンパク質を特徴とし、ＨＡＥ発症の約８５％を占め、対してＩＩ型は、低機能のＣ１－ＩＮＨ（ｆＣ１－ＩＮＨ）であるが、正常または高いＣ１－ＩＮＨのタンパク質レベルを特徴とし、約１５％を占める。未処置のＩ型およびＩＩ型の患者においてＵｎｉｔｓ／ｍｌで測定される場合、典型的なｆＣ１－ＩＮＨは、正常なレベルの５～３０％である。患者由来のサンプルにおけるｆＣ１－ＩＮＨの正確かつ信頼できる測定は、ＨＡＥ診断の基準として作用する。

現在、２つの種類の血漿試験が、ｆＣ１－ＩＮＨのレベルを決定するために使用されている。第１のアッセイは、発色性アッセイであり、合成のＣ１ｓに特異的な基質を使用して試験サンプルにおけるＣ１－ＩＮＨによる標的のプロテアーゼＣ１ｓの活性の阻害を間接的に測定する。第２の試験は、補体タンパク質の成分Ｃ１ｓへのＣ１－ＩＮＨの機能的な結合に基づくＥＬＩＳＡアッセイである。

現在、補体成分４（Ｃ４）のレベルと併せたｆＣ１－ＩＮＨの活性およびタンパク質の発現の血清または血漿中のレベルが、ｆＣ１－ＩＮＨの活性が最も重要な試験ではあるが、ＨＡＥＩ型／ＩＩ型の診断で推奨されている（たとえばＭａｕｒｅｒ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｌｌｅｒｇｙ （２０１８）７３：１５７５－９６参照）。ｆＣ１－ＩＮＨの活性を測定するための従来の方法は、発色性の方法または複合体を形成するイムノアッセイを含む。発色性の方法は、血漿サンプル中のＣ１－ＩＮＨタンパク質の阻害活性を測定するため合成Ｃ１ｓ基質を組み込み、ここで色の形成の欠損によりＣ１－ＩＮＨ誘導性の阻害が確認される。しかしながら、複合体を形成するイムノアッセイの方法は、Ｃ１－ＩＮＨの阻害活性を直接測定することなく、Ｃ１－ＩＮＨ－Ｃ１ｓ複合体の形成を検出する（たとえばＬｉ ＨＨ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｐｒａｃｔ （２０１５）３：２００－５参照）。

Ｃ１－ＩＮＨおよびＣ４の抗原レベルは、通常、比濁法のアッセイにより測定される。これらアッセイは、医師のクリニックでの血液サンプルの即時処理および適切な保存を必要とし、全ての地理的領域において標準化されておらず、費用対効果が高くなく、または容易に利用可能ではない。今日まで、診断の比率は、中国、メキシコ、日本、韓国での５～１０％から、米国および西ヨーロッパでの７５～８０％の範囲にある（データ未公開）。中央の研究室でｆＣ１－ＩＮＨを測定するための単純かつ標準化された方法を開発することに大きく関心が集まっている。

乾燥した血液スポット（ＤＢＳ）ベースのアッセイは、新生児のスクリーニングまたはリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）などの多くの遺伝性疾患の患者の診断で広く利用されている（１９～２３）。複数のレポートからの結果により、酵素活性がＤＢＳサンプルで保持され得ることが示された（２、２４）。従来の血漿または血清のアッセイと比較して、ＤＢＳは、固有の利点を提供する。第１に、たとえば指の穿刺を使用する、ＤＢＳのサンプリングは、侵襲性が低く、大量の血液およびいずれの実験機器をも必要としない。第２に、ＤＢＳサンプルは、酵素活性または遺伝子の情報を有意に失うことなく、大気温度で長期間、輸送および保存できる。これら利点は、ＤＢＳサンプルが医師のオフィスで調製でき、集約された研究室で試験できることを保証している。

本開示は、乾燥した血液スポット（ＤＢＳ）において機能的なＣ１インヒビター（ｆＣ１－ＩＮＨ）のレベルを測定するためのアッセイを記載する。このＤＢＳベースの試験は、血漿ベースの発色性アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイを超えるいくつかの利点、たとえば少量の血液、ろ紙で乾燥させた後の長期間の分析物の安定性、簡便なサンプルの輸送および保存を提供し、かつ／または、患者のサンプルを集約された研究室で試験することを可能にする。

Ｉ．機能的な血漿中エラスターゼＣ１インヒビター（ｆＣ１－ＩＮＨ）のレベルを検出するための方法
本開示は、患者の全血サンプルから調製した乾燥した血液スポット（ＤＢＳ）を使用した強力な液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりｆＣ１－ＩＮＨのレベルを決定する方法に関する。このような方法は、ＨＡＥなどのＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害の診断に利用され得る。本方法は、ＤＢＳサンプルの調製、ＤＢＳサンプルからのタンパク質の抽出、タンパク質抽出物の補体成分１ｓ（Ｃ１ｓ）とのインキュベーション、および、Ｃ１ｓ基質と反応させることによるＣ１ｓ基質産物の産生を含み得、これは、たとえば液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により測定され得る。

（ｉ）サンプルの調製
Ｃ１－ＩＮＨ（たとえばｆＣ１－ＩＮＨ、非機能的なＣ１－ＩＮＨ、またはその両方）を含んでもよくまたは含まなくてもよい全てのサンプルが、本明細書中記載の方法により分析され得る。本明細書中使用される場合、「サンプル」は、目的の分析物（本発明の場合はｆＣ１－ＩＮＨ）を含み得る組成物を表す。サンプルは、対象由来の組織、血液、血漿、または血清を含み得る。用語「サンプル」は、対象から採取された最初の未処理のサンプル、およびその後処理されたサンプル、たとえば免疫沈降を介して部分的に精製または保存された形態の両方を包有し得る。例示的なサンプルとして、血液、血漿、血清、涙、または粘液が挙げられる。他の例では、サンプルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ由来の組成物であり得る。

一部の実施形態では、サンプルは、体液サンプル、たとえば血清または血漿サンプルである。一部の実施形態では、サンプルは、分析を必要とする対象から得た生体サンプルである。「患者」、「対象」、または「宿主」（これら用語は互換可能に使用される）は、ヒトまたは非ヒトの動物を表し得る。一部の例では、対象は、接触系に関連する疾患を有し得るか、有する疑いがあり得るか、または当該疾患のリスクがあり得るヒト患者である。たとえば、ヒト患者は、ＨＡＥの病歴を有し得るか、またはＨＡＥのリスクがあり得る。このようなヒト患者は、以前に処置されていてもよく、または接触系の成分（たとえばＣ１ｓ、血漿カリクレイン）を標的とする薬物での処置の過程にあり得る。

生体サンプルは、体液サンプル、たとえば血液サンプルであり得る。一部の例では、血液サンプルは、全血サンプルである。全血は、赤血球、白血球、血小板、および血漿を含む。一部の実施形態では、血液サンプルは、血管（たとえば毛細血管、静脈、および動脈）から回収され得る。本明細書中記載の方法で使用するための全血サンプルは、当該分野で知られているいずれかの方法を使用して回収および処理され得る。一部の実施形態では、サンプルは、指の穿刺（指腹での採血）により得られる。一部の実施形態では、サンプルは、真空採血管を使用して回収され得る。

本開示のサンプルは、本明細書中記載される少なくとも１つのｆＣ１－ＩＮＨ測定アッセイの実行に十分ないずれかの体積であり得る。一部の実施形態では、対象から得たサンプルは、２５μＬ～１０ｍＬである。一部の実施形態では、本明細書中記載の方法で使用するためのサンプルまたはそのアリコートは、１００μＬ～２ｍＬである。一部の実施形態では、サンプルは、５０μＬ～１００μＬである。一部の実施形態では、サンプルは、５０μＬ～１ｍＬである。一部の実施形態では、サンプルは、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、６００μＬ、７００μＬ、８００μＬ、９００μＬ、１ｍＬ、１．１ｍＬ、１．２ｍＬ、１．３ｍＬ、１．４ｍＬ、１．５ｍＬ、１．６ｍＬ、１．７ｍＬ、１．８ｍＬ、１．９ｍＬ、２．０ｍＬ、２．５ｍＬ、３．０ｍＬ、３．５ｍＬ、４．５ｍＬ、５．０ｍＬ、５．５ｍＬ、６．０ｍＬ、６．５ｍＬ、７．０ｍＬ、７．５ｍＬ、８．０ｍＬ、８．５ｍＬ、９．０ｍＬ、９．５ｍＬ、または１０．０ｍＬである。一部の実施形態では、サンプルは、６０μＬである。

本明細書中開示されるサンプルのいずれか、たとえば全血サンプルは、回収されてもよく、サンプルのアリコートは取り出され、支持体にスポットされ得る。一部の実施形態では、サンプルまたはサンプルのアリコートを含む支持体は、支持体上にサンプルの乾燥したスポットの形成を可能にするために適切な期間（たとえば少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、またはそれ以上の長い時間）、適切な条件下（たとえば室温）に維持される。

支持体は、膜、フィルム、ろ紙、または乾燥した血液スポットのカードであり得る。一部の実施形態では、支持体は、１つ以上のサンプル回収領域と、任意選択で巻き付けられたカバーとを含み得る。支持体は、サンプルの輸送を容易にするための密閉可能な容器、たとえばＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグに適合し得る。一部の実施形態では、支持体は、折り畳み式であり得る。本明細書中記載の支持体のいずれかは、サンプルのさらなる情報（たとえば対象の人口統計情報）を記録するための１つ以上の領域をさらに含み得る。

サンプル（またはそのアリコート）は、適切な条件下で適切な期間の範囲内にて支持体上で乾燥させることが可能であり得る。一部の実施形態では、サンプルは、約１～６時間、たとえば１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、または６時間、乾燥させられる。一部の実施形態では、サンプルは、約１～２時間、１～３時間、１～４時間、１～５時間、２～３時間、２～４時間、２～５時間、２～６時間、３～４時間、３～５時間、３～６時間、４～５時間、４～６時間、または５～６時間、乾燥させられる。

一部の実施形態では、サンプルは、適切な温度、たとえば１０～４０℃、またはそれ以上の温度で乾燥させられる。一部の実施形態では、サンプルは、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、またはそれ以上の温度で乾燥させられる。乾燥プロセスは、比較的高い温度下で短期間、またはあるいは比較的低い温度下で長期間、行われ得ることは当業者に知られている。一部の例では、サンプルは、室温（約２５℃）で少なくとも３時間乾燥させられる。

（ｉｉ）タンパク質抽出
本明細書中記載されるように調製した乾燥したスポットサンプル、たとえば乾燥した血液サンプルは、サンプルに含まれる生体物質、たとえばタンパク質を抽出するように処理され得る。一部の実施形態では、乾燥したスポットサンプル、たとえばＤＢＳサンプルは、タンパク質抽出のために処理され得る。タンパク質抽出は、本明細書中使用される場合、乾燥したサンプルに含まれるタンパク質またはタンパク質の特定の一部を（たとえば標的タンパク質が可溶性である）適切なバッファーに抽出することを表す。一部の例では、支持体のサンプル回収領域に存在する乾燥したスポットサンプル、たとえばＤＢＳサンプルは、従来の方法（たとえばパンチャーを使用すること）により支持体の残りから単離され得る。単離された生体物質のサンプル、たとえばタンパク質サンプルは、さらなるタンパク質抽出のため適切な容器に移され得る。適切な容器の非限定的な例は、チューブ、ディッシュ、バイアル、複数のウェルのプレートであり得る。一部の例では、適切な容器は、９６ウェルプレートであり得る。１つ以上の乾燥したスポットサンプル、たとえばＤＢＳサンプルは、同時に処理され得る。

いずれかの適切なバッファーが、本明細書中記載の方法で使用され得る。好ましくは、バッファーは、抽出される生体物質と適合可能である（たとえばタンパク質を溶解でき、好ましくはタンパク質の機能を保持できる）。適切なバッファーの非限定的な例として、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）、またはハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）が挙げられる。一部の例では、バッファーは、ＰＢＳであり得る。一部の実施形態では、バッファーは、抽出される生体物質の安定性を促進し、かつ／または生体物質の分解を妨げるための１つ以上の成分を含み得る。

一部の実施形態では、抽出ステップで使用するためのバッファーは、適切な濃度（たとえば０．５％）でタンパク質抽出を容易にする１つ以上の作用物質（たとえばウシ血清アルブミン）を含み得る。一部の実施形態では、乾燥したスポットサンプル（たとえばＤＢＳサンプル）を含む支持体またはその一部は、サンプル中の目的の生体物質（たとえばｆＣ１－ＩＮＨ）の完全な抽出を可能にする適切な条件下でバッファーにおいてインキュベートされ得る。一部の実施形態では、乾燥したスポットサンプルを含有する支持体は、ｆＣ１－ＩＮＨのレベルが測定され得るように目的の生体物質（たとえばｆＣ１－ＩＮＨを含むタンパク質）の十分な抽出を可能にするため、適切な温度、たとえば２５～３７℃（たとえば３７℃）、適切な期間、たとえば２～５時間（たとえば３時間）、バッファーにおいてインキュベートされ得る。

一部の実施形態では、バッファー／サンプル混合物は、溶液への生体物質の抽出を容易にするため、適切な速度、たとえば８００～２０００ｒｐｍ（たとえば１２５０ｒｐｍ）で遠心分離され得る。温度、抽出期間、バッファーの使用、遠心分離を用いるかまたは用いないか、遠心分離の速度などを含む特定の抽出条件の選択は、たとえば抽出される生体物質および乾燥したスポットサンプルの形成に使用される支持体の種類に応じて変化し得る。このような情報は、当業者の知識の範囲内にあるとされているであろう。

（ｉｉｉ）ｆＣ１－ＩＮＨの測定
上記に開示されるように調製されたｆＣ１－ＩＮＨを含む溶液は、溶液中のｆＣ１－ＩＮＨのレベルを決定するために分析され得る。一部の例では、ｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、たとえば従来の手法または本明細書中開示される方法により、ｆＣ１－ＩＮＨの活性を決定することにより測定される。

ｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、当該分野で知られているかまたは本明細書中記載される適切な手法を使用して測定され得る。一部の実施形態では、ｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、Ｃ１ｓが切断できる発色性基質を使用した発色性アッセイにより測定される。一部の実施形態では、免疫アッセイが、本明細書中記載されるように目的のＣ１ｓ産物のレベルを評価するために使用される。免疫アッセイの例として、限定するものではないが、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（たとえばサンドイッチＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、エレクトロケミルミネッセンスベースの検出アッセイ、および関連する技術が挙げられる。アッセイ、たとえばウェスタンブロットアッセイは、定量的なイメージングシステム、たとえば市販されているＬＩＣＯＲイメージング技術（たとえばＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＯｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ赤外線イメージングシステムを参照）の使用をさらに含み得る。一部の実施形態では、エレクトロケミルミネッセンス検出アッセイまたはエレクトロケミルミネッセンスおよびパターンアレイ技術の組み合わせに依存するアッセイ（たとえばＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）製のＥＣＬまたはＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ技術アッセイ）が使用される。

本明細書中使用される場合、用語「～を測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」または「測定（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）」、またはあるいは「～を検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」または「検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」は、サンプルの中の物質の定性的または定量的な濃度のレベル、または対象の値もしくはカテゴリー化を評価する他のレベルの導出を含む、サンプルの中の当該物質の存在、非存在、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、または量（ａｍｏｕｎｔ）（有効量であり得る）を評価することを意味する。

一部の実施形態では、本明細書中開示される乾燥したスポットサンプル（たとえばＤＢＳサンプル）のいずれかから抽出したｆＣ１－ＩＮＨを含有するサンプルは、Ｃ１ｓプロテアーゼおよびＣ１ｓ基質とインキュベートされ得る。Ｃ１ｓプロテアーゼは、Ｃ１ｓ基質に作用して、Ｃ１ｓ基質をＣ１ｓ基質産物に変換し、次にＣ１ｓ基質産物の存在および／またはレベルを決定するために分析され得る。あるいは、Ｃ１ｓ基質は、Ｃ１ｓプロテアーゼおよびｆＣ１－ＩＮＨを含有するサンプルとインキュベートした後に残存するＣ１ｓ基質の存在および／またはレベルを決定するために分析され得る。Ｃ１ｓプロテアーゼがｆＣ１－ＩＮＨにより阻害されると、Ｃ１ｓ基質産物の産生が減少または排除される。「Ｃ１ｓ基質産物」は、本明細書中使用される場合、Ｃ１ｓ基質でのＣ１ｓのプロテアーゼ反応からもたらされる切断された産物を表す。一部の実施形態では、Ｃ１ｓ基質および／またはＣ１ｓ基質産物の量は、Ｃ１ｓプロテアーゼおよび／またはｆＣ１－ＩＮＨの活性の間接的な尺度として使用され得る。

一部の実施形態では、本明細書中開示される乾燥したスポットサンプル（たとえばＤＢＳサンプル）のいずれかから抽出したｆＣ１－ＩＮＨを含有するサンプルはまず、適切な期間、適切な条件下で、Ｃ１ｓプロテアーゼとインキュベートされ得る。次に、Ｃ１ｓ基質が混合物に添加されてもよく、Ｃ１ｓ基質産物の産生を可能にするための適切な期間、適切な条件下でさらにインキュベートされ得る。一部の実施形態では、このインキュベーションは、暗室で行われ得る。一部の例では、この方法は、Ｃ１ｓプロテアーゼ反応をクエンチするステップを含み得、これにより分析の正確性を増大させ得る。一部の実施形態では、Ｃ１ｓプロテアーゼ反応をクエンチすることは、クエンチ溶液でＣ１ｓ反応混合物を希釈（たとえば１：５～１：２０）することにより達成され得る。「クエンチ溶液」は、本明細書中使用される場合、本明細書中記載されるように酵素反応（たとえばＣ１ｓプロテアーゼ反応）を停止させるための溶液を表す。一部の実施形態では、クエンチ溶液は、酵素を変性または不活性化できる作用物質を含み得る。非限定的な変性剤として、アルコール、界面活性剤、強酸、強塩基、キレート剤などが挙げられる。一部の実施形態では、クエンチ溶液は、界面活性剤（たとえばＳＤＳ）および／またはアルコール（たとえばメタノール）を含み得る。

本明細書中開示される方法で使用するためのＣ１ｓ基質は、検出可能なＣ１ｓ基質産物を産生させるようにＣ１ｓプロテアーゼにより切断され得るいずれかの基質であり得る。Ｃ１ｓ基質の非限定的な例として、Ｃ１ｓプロテアーゼ切断後にＮα－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ｃｂｚ－Ｌｙｓ）を産生するＮα－カルボベンジルオキシ－Ｌｙｓ－チオベンジルエステル、ならびにＣ４ａおよびＣ４ｂを産生するＣ４が挙げられる。

一部の実施形態では、酵素反応をクエンチした後、サンプルは、その後の液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析のためにさらに希釈され得る。一部の実施形態では、サンプルは、適切な溶液（たとえば８０（ｖ／ｖ）％のＭｅＯＨ水溶液）で２００倍に希釈され得る。

このように産生されたＣ１ｓ基質産物は、その存在および／またはレベルを決定するために従来の方法により分析され得る。一部の実施形態では、Ｃ１ｓ基質産物は、質量分析法（ＭＳ）の質量分析の特性と液体クロマトグラフィーの物理的な分離特性を組み合わせる分析技術である、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）手法により分析され得る。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイは、規定の方法を使用して行われ得る。

一部の例では、Ｃ１ｓ基質産物の分析に使用するための質量分析計は、選択反応モニタリング（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ＳＲＭ）モードの下で作動し得る。ＳＲＭモードは、特定の質量のイオンがタンデム質量分析計の最初のステージで選択され、前駆体イオンのフラグメント化反応のイオン生成物が検出のための第２の質量分析計のステージで選択されるタンデム質量分析法に関して高感受性かつ高選択性の方法である。ＳＲＭモードは、質量分析法による目的とされた定量化のために使用され得る。イオン化の後、たとえばエレクトロスプレーの供給源を使用して、まず前駆体が、主に意図した種（たとえば親イオン）の実質的なイオン集団を得るために単離される。次に、この集団は、シグナルの存在量がサンプル中の目的の生成物の存在量を表すプロダクトイオンをもたらすようにフラグメント化される。一部の実施形態では、ｃｂｚ－Ｌｙｓの親イオンは、ｍ／ｚ ２８１であり得、検出のため選択されるｃｂｚ－Ｌｙｓのプロダクトイオンは、ｍ／ｚ ９１であり得る。実施例に記載されるように、ＡＢＳｃｉｅｘ ５５００または６５００ ＱＴｒａｐ質量分析計などの適切な器具が使用されてもよく、様々なサンプル間の差異が、方法の最適化の後に評価され得る。個体の全血サンプルは、本明細書中記載されるように、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析用に調製され得る。

（たとえばＡＵＣにより提示される）Ｃ１ｓ基質産物のレベル（たとえば濃度）、よってｆＣ１－ＩＮＨの濃度は、従来の方法を介して決定され得る。検量線または標準曲線（たとえば４つのパラメータのロジスティックな検量線）は、内部標準（たとえばＮε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン－２，６，６－ｄ３の濃度）に対する分析物（たとえばｃｂｚ－Ｌｙｓ）のピーク面積比に対してｆＣ１－ＩＮＨの濃度をプロットすることにより作成され得る。この検量線は、式、たとえば

（式中、ｙはピーク面積比を表し、ｘはサンプル濃度を表し、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、曲線適合パラメータである）
にあてはめられ得る。

一部の実施形態では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法は、本明細書中記載の方法を使用して調製される較正基準を分析することにより正確性および再現性に関して検証され得る。一部の実施形態では、サンプル中のｆＣ１－ＩＮＨのレベル（たとえば濃度）は、式（たとえば式１）により計算され得る。これら結果は、本明細書中記載の方法により調製されるサンプル中のＣ１ｓ基質産物のレベルにより提示および計算されたｆＣ１－ＩＮＨのレベルが、ＨＡＥの診断にとって信頼できるバイオマーカーであることを表している。

一部の例では、検量線は、内部標準に対する目的の分析物（Ｃ１ｓシグネチャー産物）のピーク面積比で構築され得る。本明細書中使用される場合、「内部標準」は、サンプル調製の間の分析物の喪失を補正するため、よって分析物の分析の正確性を高めるために、試験サンプル、クオリティコントロール（ＱＣ）のサンプル、ブランク、および較正基準に一定量で添加される化学物質を表す。一部の実施形態では、内部標準は、Ｎε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン－２，６，６－ｄ３または別の安定したアイソトープで標識したＣ１ｓ基質産物である。一部の実施形態では、検量線は、定量的な分析に使用され得る。

さらに、較正基準のシリーズが調製され得、アッセイの標準物質としてまたは品質管理のために、サンプルを用いたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供され得る。較正基準は、本明細書中使用される場合、既知の量の目的の分析物または物質（たとえば本開示のｆＣ１－ＩＮＨ）を含む全血または溶液を表す。較正基準は、試験系が記録可能な範囲にわたりサンプルを正確に測定していることを確保するためにサンプルと同じ方法で既知の濃度の物質を試験するために使用され得る。較正基準は、目的の物質を当初含まないかまたはこれが枯渇した溶液に様々な既知の量の目的の物質（たとえばｆＣ１－ＩＮＨ）を添加することにより調製され得る。一部の例では、目的の物質（たとえばｆＣ１－ＩＮＨ）は、試験サンプルを模倣するように試験サンプル（たとえば全血サンプル）に類似する生体サンプル（たとえば代替のマトリックス）に添加され得る。一例では、較正基準は、ｆＣ１－ＩＮＨが枯渇した代替の血液とｆＣ１－ＩＮＨ（たとえば精製したｆＣ１－ＩＮＨ）を混合することにより調製され得る。ｆＣ１－ＩＮＨが枯渇した代替の血液は、本明細書中使用される場合、（ｉ）適切な集団、理想的には対象と同じ種（たとえば健常な個体、雄性および／または雌性）から、適切な方法（たとえば真空採血管）により、新鮮な全血を入手および／または集め；（ｉｉ）適切な方法（たとえば室温、８００ｒｐｍ、１０分間での遠心分離）を使用して上清の血漿を除去することにより血液サンプル中の内因性の目的の物質（たとえばｆＣ１－ＩＮＨ）を枯渇させ；（ｉｉｉ）適切な容量（たとえば等体積）の集められた残りの赤血球を適切なバッファー（たとえばＰＢＳにおいて約４．３％のＢＳＡ）と混合することにより、調製され得る。目的の物質（たとえばｆＣ１－ＩＮＨ）のための較正基準およびクオリティコントロール（ＱＣ）は、本明細書中記載されるように、様々な既知の濃度の目的の物質（たとえばｆＣ１－ＩＮＨ）を含む溶液をｆＣ１－ＩＮＨが枯渇した代替の血液にスパイクすることにより調製され得る。較正基準は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前に、本明細書中記載されるＣ１ｓ基質産物を産生させる方法に供され得る。

１つの特定の例では、本明細書中記載の方法は、（１）全血サンプルからのＤＢＳカードの調製のための手法；（２）ＤＢＳカードからのＣ１－ＩＮＨタンパク質の抽出；（３）補体成分Ｃ１ｓと抽出したタンパク質のインキュベーション；（４）酵素産物、Ｎ^α－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ｃｂｚ－Ｌｙｓ）を産生させるための、Ｃ１ｓ基質、Ｎ^α－カルボベンジルオキシ－Ｌｙｓ－チオベンジルエステルとの酵素反応；および（５）定量化のための内部標準としてＮ^ε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン－２，６，６－ｄ_３を使用するＬＣ－ＭＳアッセイによるｃｂｚ－Ｌｙｓのその後の測定を含み得る。

ＩＩ．乾燥したスポットのアッセイ方法の適用
本明細書中記載されるサンプル中のｆＣ１－ＩＮＨを測定するためのアッセイ方法は、臨床目的または非臨床目的のために使用され得る。

（ｉ）疾患の診断および予後診断
遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）などのＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害の診断は、候補対象から得られたサンプル中のｆＣ１－ＩＮＨのレベルに基づき得る。

本明細書中記載されるアッセイ方法およびキットは、疾患の評価、たとえば疾患の診断または予後診断に適用され得る。評価は、本明細書中記載される疾患、たとえばＨＡＥ（たとえばＩ型ＨＡＥまたはＩＩ型ＨＡＥ）などのＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害のリスクがあるかまたはこれを有すると対象を同定することを含み得る。また評価は、疾患の処置をモニタリングすること、たとえばＨＡＥなどのＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害の処置の有効性を評価することを含み得る。さらに評価は、ｐＫａｌ阻害剤、たとえばＣ１ｓインヒビター（たとえばヒト血漿由来のＣ１ｓインヒビター）または血漿カリクレイン阻害剤により処置され得る疾患を同定することを含み得る。

Ａ．診断
一部の実施形態では、本明細書中記載されるアッセイ、方法、およびキットは、候補対象（たとえばＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害（たとえばＨＡＥ）を有する疑いのあるヒト患者）から回収した生体サンプル（たとえば全血サンプル）中のｆＣ１－ＩＮＨのレベルを決定するために使用される。ｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、本明細書中記載される方法により（たとえば４つのパラメータのロジスティックな検量線により）もたらされるＣ１ｓ基質産物のレベルに基づき決定され得る。このようなｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、対象がたとえばＨＡＥといったＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害を有するかまたはこのリスクがあるかどうかを決定するために、所定の参照値または参照比率と比較され得る。たとえば、候補対象のサンプル中のｆＣ１－ＩＮＨが参照値以下である場合、対象は、ＨＡＥなどのＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害を有するかまたはこのリスクがあると同定され得る。

参照サンプルは、本明細書中記載されるｆＣ１－ＩＮＨの対照レベルであり得る。一部の実施形態では、対照レベルは、好ましくは候補対象と同じ種および年齢である、健常な対象または健常な対象の集団から得た対照サンプル（たとえば全血サンプル）中のｆＣ１－ＩＮＨの量を表す。本明細書中使用される場合、健常な対象は、ｆＣ１－ＩＮＨのレベルが測定される時点で標的の疾患（たとえばＨＡＥなどのＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害）を明らかに有していないかまたはこの疾患の病歴がない対象である。

あるいは、参照値は、所定の値であり得る。このような所定のシグネチャーのｆＣ１－ＩＮＨは、標的の疾患を有さないかまたは標的の疾患のリスクがない対象の集団における本明細書中記載のｆＣ１－ＩＮＨの値を表し得る。

所定の値は、様々な形態をとり得る。たとえば、これは、単一のカットオフ値、たとえば中央値または平均値であり得る。一部の実施形態では、所定のレベルは、たとえば１つの定義されたグループが標的疾患を有することが知られており、別の定義されたグループが標的疾患を有さないことが知られているグループなどの、比較のグループに基づき確立され得る。あるいは、所定のレベルは、ある範囲にあり得、たとえば所定のパーセンタイルの範囲内での対照集団のｆＣ１－ＩＮＨの範囲であり得る。

本明細書中記載の対照値は、規定の技術により決定され得る。一部の例では、対照値は、同様に本明細書中開示される対照サンプルで従来の方法（たとえば本明細書中記載されるｆＣ１－ＩＮＨのレベルを得るための同じアッセイ）を行うことにより入手され得る。他の例では、ｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、対照集団のメンバーから入手され得、この結果は、たとえばコンピュータプログラムにより、対照集団におけるｆＣ１－ＩＮＨのレベルを表す対照レベル（所定のレベル）を入手するために、分析され得る。

候補対象から得たサンプル中の本明細書中記載されるｆＣ１－ＩＮＨの濃度を本明細書中記載される参照比率と比較することにより、候補対象がＣ１－ＩＮＨ欠乏介在疾患（たとえばＨＡＥ）を有するかまたは当該疾患のリスクがあるかどうかに関して決定され得る。たとえば、候補対象のサンプル中のｆＣ１－ＩＮＨの値が参照値または参照比率から逸脱（たとえば参照値と比較して減少）する場合、候補対象は、当該疾患を有するかまたは当該疾患のリスクがあると同定され得る。参照値が標的疾患を有する対象の集団において本明細書中記載されるｆＣ１－ＩＮＨの値の範囲を表す場合、この範囲にある候補のサンプルにおけるｆＣ１－ＩＮＨの値は、候補対象が標的疾患を有するかまたは当該疾患のリスクがあることを表す。

本明細書中使用される場合、「参照値未満の値の減少」は、ｆＣ１－ＩＮＨのレベルが、参照値、たとえば対照サンプルにおけるｆＣ１－ＩＮＨの所定の閾値よりも低いことを意味する。対照レベルは、本明細書中詳述されている。ｆＣ１－ＩＮＨの値の減少は、たとえば対照サンプルの参照値より１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上低い値を含む。

一部の実施形態では、候補対象は、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏介在障害、たとえばＨＡＥなどの１つ以上の症状を有するヒト患者である。たとえば、対象は、浮腫、腫脹（上記腫脹は、完全にまたは主に末梢性である）；蕁麻疹；感染症のエビデンスの不存在下での発赤、疼痛、および腫脹；非ヒスタミン介在性浮腫、腫脹の再発性発作、またはそれらの組み合わせを有し得る。他の実施形態では、対象は、サンプルが回収される時点でＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害の症状を有さないか、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏介在障害の症状の病歴を有さないか、またはＨＡＥなどのＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害の病歴を有さない。さらなる他の実施形態では、対象は、抗ヒスタミン療法、副腎皮質ステロイド療法、またはその両方に耐性がある。

Ｂ．適した処置の同定
一部の実施形態では、本明細書中記載されるアッセイ方法およびキットはまた、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏介在障害（たとえばＩ型ＨＡＥまたはＩＩ型ＨＡＥ）を有するかまたは有するリスクがある対象に適した処置を同定するために使用され得る。たとえば、対象のｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、本明細書中記載の方法のいずれかを使用して測定され、ｆＣ１－ＩＮＨの所定の値と比較され得る。対象のｆＣ１－ＩＮＨの値が所定の値以下である場合、対象は、ｆＣ１－ＩＮＨの所定の値に基づく処置（たとえば本明細書中記載される組み換えＣ１－ＩＮＨ治療薬または他の治療薬）により処置され得る。一部の例では、対象は、ｆＣ１－ＩＮＨのレベルに基づく疾患の処置の候補であり得る。

一部の実施形態では、本明細書中記載の方法は、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏介在障害（たとえばＨＡＥ）を有するかまたは有するリスクのある対象に治療薬を投与することをさらに含む。治療薬の非限定的な例として、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤（たとえばエカランチド、ラナデルマブ）、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト（たとえばイカチバント）、およびＣ１ｓインヒビター（たとえばヒト血漿由来のＣ１ｓインヒビター）が挙げられる。

（ｉｉ）非臨床的な適用
さらに、本明細書中記載のアッセイ方法は、たとえば研究目的および／または前臨床の薬物開発の目的のための、非臨床的な適用を有し得る。Ｃ１－ＩＮＨ欠乏に関連する多くの疾患が同定されているが、他の疾患が同様の機構により仲介されるかまたは同様の構成要素を含む可能性がある。一部の実施形態では、本明細書中記載の方法は、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏に関連する疾患を同定するために使用され得る。一部の実施形態では、本明細書中記載の方法は、疾患の機構（たとえば疾患の発症に関与する新規の生体経路またはプロセスの発見）または疾患の進行を試験するために使用され得る。

一部の実施形態では、本明細書中記載のアッセイ方法により決定されるｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏に関連する疾患のための新規の治療法の開発に使用され得る。たとえば、本明細書中記載されるｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、新規の治療（たとえば遺伝子療法）を行った対象から得たサンプル、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから得たサンプルで測定され得る。一部の実施形態では、ｆＣ１－ＩＮＨレベルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでの新規の治療法の活性または臨床試験の状況での新規の治療法の有効性を表し得る。

ＩＩＩ．乾燥したスポットのアッセイ方法を行うためのキット
また本開示は、本明細書中記載されるｆＣ１－ＩＮＨのレベルの測定に使用するためのキットを提供する。このようなキットは、サンプルを回収および調製し、サンプルからタンパク質から抽出するための物質、サンプル中のｆＣ１－ＩＮＨを測定するための構成要素、および／またはサンプル中のｆＣ１－ＩＮＨレベルをアッセイするための説明書を含み得る。

一部の実施形態では、本キットは、膜、ろ紙、または乾燥した血液スポットのカードなどの支持体を含む。本方法に適切な支持体の選択は、評価されるサンプルの数およびサンプルからタンパク質を抽出する方法などの様々な要因に依存する。

一部の実施形態では、支持体は、ＥＬＩＳＡプレートなどのマルチウェルプレートである。一部の実施形態では、本明細書中記載のイムノアッセイは、高スループットのプラットフォームで行われ得る。一部の実施形態では、マルチウェルプレート、たとえば２４、４８、９６、３８４、またはそれ以上の数のウェルのプレートが、高スループットイムノアッセイで使用され得る。個別のイムノアッセイは、各ウェルにおいて並行して行われ得る。よって、全般的に、アッセイのスループットを増大させるために、マルチウェルプレートを並行して測定するようにプレートリーダーを使用することが望ましい。一部の実施形態では、並行して複数のウェル（たとえば４、１６、２４、４８、９６、３８４、またはそれ以上のウェル）をイメージングできるプレートリーダーがこのプラットフォームで使用され得る。

また本キットは、本明細書中に記載される１つ以上のバッファーを含み得るが、クエンチバッファー、変性バッファー、およびタンパク質抽出バッファーに限定されない。バッファーの例として、限定するものではないが、ＰＢＳ、ＤＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、および塩化カリウムが挙げられる。

一部の実施形態では、本キットは、本明細書中記載の方法のいずれかに係る使用のための説明書を含み得る。含まれる説明書は、ヒト患者などの対象から回収される生体サンプル中のｆＣ１－ＩＮＨのレベルを測定するためのキットに含まれる成分を使用する方法の説明を含み得る。

本キットの使用に関連する説明書は、全般的に、本明細書中記載の方法を行うための各成分の量および適切な条件に関する情報を含む。本キットの成分は、単位用量、バルクパッケージ（たとえば複数の用量のパッケージ）、または下位単位用量であり得る。本開示のキットに供給される説明書は、通常、ラベルまたは添付文書（たとえば本キットに含まれる紙のシート）上に書かれた説明書であるが、機械可読な説明書（たとえば磁気保存ディスクまたは光保存ディスクに担持された説明書）もまた許容される。

ラベルまたは添付文書は、本キットが１つ以上のサンプルにおけるｆＣ１－ＩＮＨのレベルを評価するために使用されることを表す。説明書は、本明細書中記載の方法のいずれかを行うために提供され得る。一部の実施形態では、本キットは、分析の前に乾燥したサンプルを輸送するための密閉可能な容器（たとえばＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグ）を含み得る。

本開示のキットは、適切なパッケージングにある。適切なパッケージングとして、限定するものではないが、バイアル、ビン、ジャー、可撓性のパッケージング（たとえば密閉されたマイラーバッグまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。

キットは、任意選択で、たとえば検量線を作成するための、対照および／または標準サンプルもしくは参照サンプルなどの解釈上の情報などのさらなる構成要素を提供し得る。通常、本キットは、容器および容器上にあるかまたは容器に関連したラベルまたは添付文書を含む。一部の実施形態では、本開示は、上述のキットの中身を含む製造物品を提供する。

さらに詳しく説明はされないが、当業者は上記説明に基づき本発明を最も完全な度合いまで利用できることが考えられる。よって、以下の特定の実施形態は、単なる例であり、いかなる方法であっても本開示の残りを限定しない。本明細書中引用される全ての刊行物は、本明細書中言及される目的または主題のため参照により組み込まれている。

実施例１：ＤＢＳベースのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｆＣ１－ＩＮＨアッセイ
この実施例は、血液サンプル中の機能的なＣ１インヒビター（ｆＣ１－ＩＮＨ）を測定するための乾燥した血液スポット（ＤＢＳ）ベースのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を説明する。図１は、このアッセイの例示的なスキームを示す。

この方法は、ヒト全血サンプルにおけるｆＣ１－ＩＮＨレベルを決定することを目的とする。この方法は、較正基準、クオリティコントロール（ＱＣ）、およびＤＢＳサンプルの調製、ＤＢＳサンプルからのタンパク質の抽出、タンパク質抽出物の補体成分１ｓ（Ｃ１ｓ）とのインキュベーション、Ｎα－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ｃｂｚ－Ｌｙｓ）を産生させるためのＣ１ｓ基質のＮα－カルボベンジルオキシ－Ｌｙｓ－チオベンジルエステルとの反応、ならびに液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用したｃｂｚ－Ｌｙｓのその後の測定を含む。ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ６５００質量分析計を、陽イオンモードにおいてｃｂｚ－Ｌｙｓおよび内部標準（Ｎε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン－２，６，６－ｄ３）の検出に最適な条件下にて選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）モードで作動させた。

実験手法
（ｉ）較正基準およびクオリティコントロール（ＱＣ）の調製
標準物質およびクオリティコントロール（ＱＣ）を、Ｃ１－ＩＮＨタンパク質を枯渇させた代替血液から調製した。簡潔に述べると、健常な個体（雄性および雌性）由来の新鮮な全血を集め、１２００×ｇにて室温で１０分間遠心分離した。上清の血漿を廃棄し、得られた赤血球をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で１回洗浄した。Ｃ１－ＩＮＨを含まない代替血液は、等体積の集めた赤血球およびＰＢＳにおいて４．３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を混合することにより調製した。較正基準およびＱＣを調製するために、異なる濃度のＣ１－ＩＮＨ溶液を代替血液にスパイクした。

（ｉｉ）ＤＢＳサンプルの調製
全血の検体を回収した後、最大６０μＬのアリコートをＤＢＳカード（９０３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｖｅｒ Ｃａｒｄ， Ｗｈａｔｍａｎ）のろ紙のスポット上に沈着させた。ＤＢＳカードは、ろ紙を染み通った血液の喪失を防ぐために後ろ側がどの表面との接触しないように湾曲していた。このカードを、少なくとも３時間（ｈ）乾燥させ、室温で保存した。

標準物質、ＱＣ、および試験サンプルの調製のため、ＤＢＳ Ｐｕｎｃｈｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して３．０ｍｍの孔をあけ、ＤＢＳサンプルを、５００μＬの９６ウェルプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｂｉｎｄ）のバイアルに移した。ＤＢＳサンプルを、１２５０ｒｐｍで作動するインキュベータにて、ＰＢＳバッファー中０．５％のＢＳＡ１００μＬと３７℃で３時間インキュベーションすることにより抽出した。抽出したサンプルのアリコート（２０μＬ）を、別の９６ウェルプレートに移し、ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡで新たに調製した０．５μｇ／ｍＬのＣ１ｓ溶液５０μＬと混合させた。８００ｒｐｍ、３７℃で１．５時間インキュベートした後、基質溶液（Ｎα－カルボベンジルオキシ－Ｌｙｓ－チオベンジルエステル）および内部標準（Ｎε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン－２，６，６－ｄ３）の混合物１０５μＬを添加し、暗室にて室温で４０分間インキュベートすることにより酵素反応を進行させた。この反応を、ＭｅＯＨ／水（８０／２０、Ｖ／Ｖ）において０．１％のＳＤＳ４５０μＬに反応溶液５０μＬを移すことによりクエンチした。上記サンプルを、ＭｅＯＨ／水（８０／２０、Ｖ／Ｖ）で２００倍にさらに希釈した後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。

（ｉｉｉ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
反応しなかった基質、基質産物（分析物、ｃｂｚ－Ｌｙｓ）、および内部標準の分離を、３０℃に設定した逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４、３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）を使用してＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ上で達成させた。移動相Ａは、０．１％のギ酸水溶液であり、移動相Ｂはアセトニトリルであった。流速は０．３ｍｌ／分であり、移動相の勾配は、以下の時点（時間、Ｂ（％））：０分、４％；０．５分、４％；３．５分、１２％；３．６分、７０％；４．６分、７０％；４．７分、４％；５．５分、４％の間の勾配ステップから構成された。オートサンプラーの温度は４℃に設定し、３μＬのサンプルを、部分ループＬＣ注入モードで注入した。分析物および内部標準のシグナルは、ｃｂｚ－Ｌｙｓおよび内部標準（Ｎε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン－２，６，６－ｄ３）の検出に最適な設定の下、エレクトロスプレーイオン化により形成される陽イオンを使用した選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）モードで作動させたＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ６５００質量分析計で得た。

最適化されたＭＳパラメータの設定は、以下の通りであった：カーテンガス（Ｃｕｒｔａｉｎ Ｇａｓ）、２０；衝突ガス（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｇａｓ）、中程度；イオンスプレー電圧（ＩｏｎＳｐｒａｙ Ｖｏｌｔａｇｅ）、４０００；温度、５５０；イオン源ガス（Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｇａｓ）１、５０；イオンガス源（Ｉｏｎ Ｇａｓ Ｓｏｕｒｃｅ）２、５０；デクラスタリング電位（Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、１２０；Ｅｎｔｒａｎｃｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ、１０．０；衝突エネルギー（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ）、２６．０；ＣＸＰ（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｅｘｉｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、１２．０。分析物および内部標準を、それぞれｍ／ｚ ２８１．２からｍ／ｚ ９１．０まで、およびｍ／ｚ ２８４．２からｍ／ｚ ９１．０まで、ＳＲＭイオンでモニタリングした。

（ｉｖ）データ分析
分析物および内部標準のピーク面積を、Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアにより決定した。４つのパラメータのロジスティックな検量線を、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７．０を使用し、内部標準に対する分析物のピーク面積比および標準物質にスパイクしたｆＣ１－ＩＮＨの濃度で構築した。サンプル中のｆＣ１－ＩＮＨのレベルを、以下の式に基づき計算した：

（式中、ｙはピーク面積比を表し、ｘはサンプル濃度を表し、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、曲線適合パラメータである）。さらに、正確性および相対標準偏差（ＲＳＤ）を、エクセルを使用して計算した。

結果
図２は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）の下でのｃｂｚ－Ｌｙｓ前駆体イオンのフラグメンテーションパターンを示す。ｍ／ｚ ９１での最も強いピークが、検出のためのプロダクトイオンとして選択された。

図３は、（１）対照としての純粋なバッファー溶液；（２）最適な体積比の赤血球およびＢＳＡ溶液の混合物から構成される代替のマトリックス由来のＤＢＳ抽出物の酵素反応産物；（３）健常な個体由来の基準となる全血サンプル由来のＤＢＳ抽出物の酵素反応産物に由来するｃｂｚ－Ｌｙｓおよび内部標準（ＩＳ）のイオンクロマトグラムを表す。異なる供給源のサンプルからのｃｂｚ－ＬｙｓおよびＩＳの保持時間は、再現性がある。さらに、純粋な溶液および代替血液マトリックスからのｃｂｚ－Ｌｙｓのピーク強度は非常に類似しており、代替血液マトリックスにおける残渣のｆＣ１－ＩＮＨが最小限であることを暗示している。他方で、ｆＣ１－ＩＮＨが正常である健常な血液サンプル由来のｃｂｚ－Ｌｙｓのピーク強度は有意に低く、ｆＣ１－ＩＮＨの存在によるＣ１ｓの酵素の活性の阻害が示唆される。この図は、ＤＢＳ抽出物の酵素反応後のｃｂｚ－Ｌｙｓを検出する実現可能性を示している。

ＤＢＳにおけるｆＣ１－ＩＮＨの測定のための検量線を、図４に示す。

ＤＢＳベースのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｆＣ１－ＩＮＨアッセイの実験間（ｉｎｔｅｒ－ｒｕｎ）での再現性を評価するために、６名の個別の対象から集めた血液サンプルを回収し、３つの異なる日に、ＤＢＳベースのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｆＣ１－ＩＮＨアッセイを使用して分析した。このアッセイの結果を表１に示す。アッセイの精度（％ＣＶ～１０．３）は、極めて良好である。

表１．ＤＢＳベースのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｆＣ１－ＩＮＨアッセイの実験間での再現性

ＤＢＳベースのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｆＣ１－ＩＮＨアッセイの日内（ｉｎｔｒａ－ｄａｙ）の再現性を評価するために、Ｃ１－ＩＮＨを、クオリティコントロールとしての異なる濃度（定量下限（ＬＬＯＱ）、Ｌｏｗ、Ｍｉｄ、およびＨｉｇｈ）で赤血球マトリックスにスパイクした。次に、サンプルを、ＤＢＳベースのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｆＣ１－ＩＮＨアッセイを使用して分析した。この結果を表２に示す。アッセイから得られたｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、サンプルにスパイクしたｆＣ１－ＩＮＨのレベルに対応しており、ＤＢＳを使用してｆＣ１－ＩＮＨを測定する際のこのアッセイの精度を表す。

表２．ＤＢＳベースのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｆＣ１－ＩＮＨアッセイの日内の再現性

実施例２：ＤＢＳベースのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｆＣ１－ＩＮＨアッセイの使用
本明細書において、ＨＡＥ患者の診断のためのＤＢＳにおけるｆＣ１－ＩＮＨの活性を測定できる新規アッセイの開発および検証を記載する。このアッセイは、規制のガイドラインおよび業界の最良の手法にしたがい検証した。ＨＡＥ患者由来のＤＢＳサンプルは、有意に低いｆＣ１－ＩＮＨの活性を示し、健常な対象とＨＡＥ患者の差別化を可能にした。

実験手法
（ｉ）材料
Ｎ^α－カルボベンジルオキシ－Ｌｙｓ－チオベンジルエステルハイドロクロライド（Ｚ－Ｌｙｓ－ＳＢｚｌ・ＨＣｌ、Ｃ１ｓ基質）およびＮ^ε－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン－２，６，６－ｄ_３（Ｎ^ε－ＣＢＺ－Ｌ－リジン－ｄ_３、内部標準）は、それぞれＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）およびＣＤＮ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ， Ｃａｎａｄａ）から購入した。組み換え型ヒト補体成分Ｃ１ｓ（Ｃ１ｓ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， ＵＳＡ）から購入した。組み換え型Ｃ１－ＩＮＨ（ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標））は、組織内で入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎｂｉｏ（Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ， ＵＳＡ）から入手した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液（１０％）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）の製品であった。５００μＬの９６ウェルプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄ）は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。３ｍｍのパンチャーおよびＷｈａｔｍａｎ ＃９０３タンパク質保存カードは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）から購入した。乾燥剤（１ｇ）およびバイオハザードバッグは、ＶＷＲ（Ｒａｄｎｏｒ， ＰＡ， ＵＳ）から得た。試験に使用される他の全ての化学物質は、最も高いグレードであり、さらに精製することなく使用した。

（ｉｉ）溶液の調製
Ｃ１ｓ希釈標準溶液（０．５μｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳバッファーにおいて調製した０．５％のＢＳＡ溶液でＣ１ｓストック溶液（３６７μｇ／ｍＬ）を７３４倍に希釈することにより新たに調製した。基質ストック溶液は、ＤＭＳＯにＺ－Ｌｙｓ－ＳＢｚｌ・ＨＣｌを最終濃度１０ｍＭとなるまで溶解することにより調製した。内部標準（ＩＳ）ストック溶液（２．５ｍＭ）を、５ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３を含むメタノール／水（５０／５０）溶液にＮ^ε－ＣＢＺ－Ｌ－リジン－ｄ_３を溶解することにより調製した。基質、Ｃ１ｓ、およびＩＳのストック溶液は、使用前に－８０℃で保存した。０．８３ｍＭのＺ－Ｌｙｓ－ＳＢｚｌ・ＨＣｌおよび３３．３μＭのＮ^ε－ＣＢＺ－Ｌ－リジン－ｄ_３を含む基質－ＩＳカクテルを、ＰＢＳバッファーにおいて新たに調製した。ＳＤＳ溶液（０．１％）をメタノール／水（８０／２０、Ｖ／Ｖ）溶液で１０％のＳＤＳを１００倍に希釈することにより調製した。

（ｉｉｉ）ＤＢＳサンプルの調製
２４名の以前に診断されたＨＡＥ患者由来の全血は、患者が記入したインフォームドコンセントと共に提供された。この血液を、バキュテイナＥＤＴＡチューブに引き込み、４℃で保存した。回収から２４時間以内に、チューブを数回反転させて血液細胞を再懸濁させ、６０μＬのアリコートをろ紙の局所にスポットした。１０３名の健常な対象由来の正常なヒト全血を、ＢＩＯＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ， ＵＳＡ）から購入した。血液スポットを室温で少なくとも３時間乾燥させ、密閉したバイオハザードバッグに、各バッグに１つの乾燥剤を用いて－２０℃で保存した。

（ｉｖ）代替のマトリックスとしてのＣ１－ＩＮＨフリーの血液の調製
検量線およびクオリティコントロール（ＱＣ）の調製のためのｆＣ１－ＩＮＨを枯渇させた代替のマトリックスを得るために、ヒト全血サンプル（３名の男性および３名の女性、それぞれ１０ｍＬ）の６つの異なるロットを、実施例１に記載のように調製した。簡潔に述べると、全血を、室温で、１０分間、１２００×ｇで遠心分離した。上清の血漿を除去し、赤血球を５ｍＬのＰＢＳ溶液で洗浄して、残りの血漿およびｆＣ１－ＩＮＨを除去した。赤血球を、１２００×ｇ、室温で１０分間遠心分離することにより再度単離した。結果得られるｆＣ１－ＩＮＨフリーの赤血球を集めた。代替血液マトリックスを、等体積の集めた赤血球およびＰＢＳバッファーで調製した４．３％のＢＳＡを混合することにより調製した。

（ｖ）ＤＢＳにおける較正基準およびＱＣサンプルの調製
較正基準（標準物質）を、異なる濃度のｆＣ１－ＩＮＨ（ＣＩＮＲＹＺＥ（登録商標））を代替のマトリックスにスパイクすることにより調製した。名目上のｆＣ１－ＩＮＨの濃度は、それぞれ１００、２００、３００、５００、１０００、および１５００ｍＵ／ｍＬであった。クオリティコントロール（ＱＣ）のサンプルは、代替のマトリックスまたは集めたヒト全血のいずれかで調製した。定量下限（ＬＬＯＱ）のＱＣ（１００ｍＵ／ｍＬ）およびＬｏｗ ＱＣ（１５０ｍＵ／ｍＬ）を代替のマトリックスで調製した。他の全てのＱＣを、内因性Ｃ１－ＩＮＨのレベル（ＥＬ）：Ｌｏｗ－Ｍｉｄ ＱＣ（ＥＬ）、Ｍｉｄ ＱＣ（ＥＬ＋２００ｍＵ／ｍＬ）、Ｍｉｄ－Ｈｉｇｈ ＱＣ（ＥＬ＋５００ｍＵ／ｍＬ）、およびＨｉｇｈ ＱＣ（ＥＬ＋８００ｍＵ／ｍＬ）を考慮することにより集めた全血で調製した。ＤＢＳにおける標準物質およびＱＣの調製は、同じ上述の手法に倣った。

（ｖｉ）サンプルの抽出および酵素反応
サンプルを抽出し、酵素反応を実施例１に記載のように行った。簡潔に述べると、ＤＢＳディスクを、３ｍｍのパンチャーで切断し、５００μＬの９６ウェルプレートに移した。ディスク中のタンパク質を、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒインキュベータにて、ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ１００μＬにおいて３７℃の温度、１２５０ｒｐｍで３時間ボルテックスしながらインキュベートすることにより、抽出した。プレートを、４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、次に２０μＬの抽出物を、Ｃ１ｓ希釈標準溶液５０μＬを含む別の９６ウェルプレートに移した。この後に、８００ｒｐｍ、３７℃で１．５時間インキュベートを行った。その後、１０５μＬの基質－内部標準（基質－ＩＳ）カクテルを上記の溶液に添加した後、暗室にて、８００ｒｐｍ、室温で４０分間インキュベートした。この反応を、５０μＬの溶液をＭｅＯＨ／水（８０／２０、ｖ／ｖ）中０．１％のＳＤＳ４５０μＬに移すことにより終結させた。結果得られたサンプルを、ＭｅＯＨ／水（８０／２０、ｖ／ｖ）で２００倍にさらに希釈した後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。

（ｖｉｉ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
反応サンプルを、実施例１に記載されるようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。簡潔に述べると、基質（Ｚ－Ｌｙｓ－ＳＢｚｌ・ＨＣｌ）、分析物（Ｎ^α－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン、ｃｂｚ－Ｌｙｓ）、およびＩＳ（Ｎ^ε－ＣＢＺ－Ｌ－リジン－ｄ_３）の分離を、逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４、３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）を使用してカラムの温度を３０℃に維持しながらＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで達成した。移動相Ａは、０．１％のギ酸水溶液であり、移動相Ｂは、アセトニトリルであった。流速は、０．３ｍＬ／分であり、移動相の勾配は、以下の通りであった（時間、Ｂ（％））：０分、４％；０．５分、４％；３．５分、１２％；３．６分、７０％；４．６分、７０％；４．７分、４％；５．５分、４％。オートサンプラーは４℃に設定し、３．０μＬのサンプルを、部分ループＬＣ注入モードを使用して注入した。分析物およびＩＳを、陽イオンを使用して選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）モードで作動させたＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ６５００質量分析計で定量化した。最適なＭＳパラメータは、以下の通りであった：カーテンガス（Ｃｕｒｔａｉｎ Ｇａｓ）、２０；衝突ガス（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｇａｓ）、中程度；イオンスプレー電圧（ＩｏｎＳｐｒａｙ Ｖｏｌｔａｇｅ）、４０００；温度、５５０；イオン源ガス（Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｇａｓ）１、５０；イオンガス源（Ｉｏｎ Ｇａｓ Ｓｏｕｒｃｅ）２、５０；デクラスタリング電位（Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、１２０；Ｅｎｔｒａｎｃｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ、１０．０；衝突エネルギー（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ）、２６．０；ＣＸＰ（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｅｘｉｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、１２．０。分析物およびＩＳを、それぞれｍ／ｚ ２８１．２～ｍ／ｚ ９１．０およびｍ／ｚ ２８４．２～ｍ／ｚ ９１．０のＳＲＭイオン対を使用してモニタリングした。

（ｖｉｉｉ）目的にかなったアッセイの検証
目的にかなったアッセイの検証は、バイオマーカーおよびＤＢＳベースの診断アッセイのための業界の最良の手法に従うものであった（１～６）。この方法を、様々な条件下での検量線、正確性、精度、マトリックス効果、ヘマトクリット、抽出、サンプリングの位置、および安定性に関して検証した。

正確性（相対誤差またはＲＥ（％））および精度（ＲＳＤ（％））を、各濃度レベルで３日間毎日、代替のマトリックスおよび基準となるマトリックスの両方においてＱＣサンプルの６つのレプリケートを分析することにより評価した。日内および日間（Ｉｎｔｒａ－およびｉｎｔｅｒ－ｄａｙ）は、正確性および精度が連続して計算されたことを意味する。分析物のキャリーオーバーは、定量上限（ＵＬＯＱ）の標準物質の実験を行った後ブランク溶液を注入することにより試験した。

アッセイの特性に及ぼすヘマトクリットレベルの影響を、４名の健常な対象由来の全血を使用して評価した。簡潔に述べると、血漿を、１２００×ｇ、１０分間の遠心分離により赤血球から分離した。次に、異なる容量の血漿および赤血球を混合して、それぞれ２５％、４５％、６０％、および７５％のヘマトクリットレベルを達成した。４５％のヘマトクリットに由来するＤＢＳサンプルを、他のヘマトクリットレベルでのＣ１－ＩＮＨの活性の正規化のための参照として使用した。

ＤＢＳスポット上のパンチの位置およびＤＢＳスポットのバリエーションの作用を、スポット上の３～６つのパンチの位置および合計４つの異なるＤＢＳスポットからＬｏｗおよびＭｉｄ－Ｈｉｇｈ ＱＣサンプルを使用することにより評価した（図９、表３）。Ｌｏｗ ＱＣは、代替のマトリックスで調製し、Ｍｉｄ－Ｈｉｇｈ ＱＣは、集めた全血で調製した。

表３．ＤＢＳ均一性試験の概要

抽出効率を、１００、６００、および１０００ｍＵ／ｍＬの代替のマトリックスで調製したＱＣを使用してスパイク後（ｐｏｓｔ－ｓｐｉｋｅｄ）のサンプルとスパイク前（ｐｒｅ－ｓｐｉｋｅｄ）サンプルの結果を比較することにより評価した。スパイク前のサンプルは、ＤＢＳカードを調製する前にＣ１－ＩＮＨを代替のマトリックスにスパイクすることにより調製した。他方で、スパイク後のサンプルは、ブランクの代替のマトリックスに由来するＤＢＳ抽出物に同じ濃度のＣ１－ＩＮＨ（３．３μＬ、３．０ｍｍのパンチにおける湿潤した血液量に対応）をスパイクすることにより調製した。

Ｃ１－ＩＮＨの活性の全血の安定性を、６名の健常な対象（３名の男性および３名の女性）から集めた等体積の全血を使用して試験した。サンプルを、最大７日間４℃で保存した後、Ｗｈａｔｍａｎ ＃９０３タンパク質保存カードに添加した。同様に、集めた全血から調製したＤＢＳサンプルを、発送条件および保存条件下での安定性を評価するために、それぞれ４５℃で３日間および室温で１３４日間保存した。

（ｉｘ）データ分析
データの分析を、実施例１に記載されるように行った。簡潔に述べると、内部標準に対する分析物のピーク面積比を、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ Ａｎａｌｙｓｔ（１．６．３）により決定した。４つのパラメータのロジスティックな検量線を、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７．０を使用して、ピーク面積比およびスパイクしたＣ１－ＩＮＨの濃度で構築した。サンプル濃度を、以下の式に基づき計算した：

（式中、ｙはピーク面積比を表し、ｘはサンプル濃度を表し、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、曲線適合パラメータである）。さらに、平均値、正確性（ＲＥ（％））、標準偏差、および相対標準偏差（ＲＳＤ（％））を、エクセルを使用して計算した。

結果
包括的な戦略
乾燥した血液スポットに由来するサンプルにおける酵素反応産物のｃｂｚ－Ｌｙｓを測定するためのＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイを、図５に示すように開発した。このアッセイは、以下のステップ：（１）ＤＢＳカードからのＣ１－ＩＮＨの抽出；（２）過剰なＣ１ｓとＣ１－ＩＮＨの結合；（３）未結合のＣ１ｓのその基質との反応；および（４）酵素反応産物ｃｂｚ－ＬｙｓのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析からなる。Ｃ１ｓおよびその基質の相対濃度、Ｃ１ｓとｆＣ１－ＩＮＨとの間の結合時間および温度、Ｃ１ｓとその基質との間の酵素反応の時間および温度、ならびにＬＣ－ＭＳ／ＭＳの条件などのアッセイ条件は、検証前の実験の間に最適化した。

較正マトリックスおよび検量線
Ｃ１－ＩＮＨを枯渇させた血液マトリックスを集めたヒト全血から調製して、Ｃ１－ＩＮＨの活性が正常な対照より低いＨＡＥ患者のＣ１－ＩＮＨの活性を測定した。Ｃ１－ＩＮＨは、循環タンパク質であり、赤血球を沈降させるための遠心分離の後に血漿の上清に留まる。その後、基準となる全血における血漿タンパク質の濃度を模倣するために、赤血球にＢＳＡ溶液を補充した。同じ容量の赤血球と混合した４．３％のＢＳＡ（４３ｍｇ／ｍＬ）は、ろ紙での同じスポットの大きさにより示されるように、基準となる全血と同じ粘度をもたらした。図６Ａおよび６Ｂに示されるように、Ｃ１－ＩＮＨの完全な枯渇が、代替のマトリックスおよびブランク対照由来の同じ分析物のシグナルにより確認され、代替のマトリックスにおけるｆＣ１－ＩＮＨの活性の不存在が暗示された。対照的に、集めた健常な血液（図６Ｃ）および５００ｍＵ／ｍＬのＣ１－ＩＮＨをスパイクした集めた健常な血液（図６Ｄ）でＣ１－ＩＮＨ依存性のシグナルが減弱する。

図７は、４つのパラメータのロジスティックな曲線適合を使用して、代替のマトリックスにスパイクした６つの異なるＣ１－ＩＮＨ濃度（ｍＵ／ｍＬ）に対し分析物のシグナルをプロットすることによる典型的な検量線を示す。この曲線は、１００～１５００ｍＵ／ｍＬの作用可能な範囲を示す。アッセイの検証結果は、６つのポイントの検量線が、予め設定した基準に一致することを示した：（１）各濃度レベルの標準物質の少なくとも半分で相対誤差（ＲＥ（％））が、２５％以下であるＬＬＯＱおよびＵＬＯＱの標準物質を除き、２０％以下である；（２）標準物質の総数の７５％以上が、検量線に含まれていなければならない；（３）２回超の連続する検証の実行が失敗しない。分析実行にパスした１４回のうちの１３回は、全ての標準物質において平均の実験間の正確性が－１．４％～５．９％の範囲にあった（表４）。

表４．較正結果の概要

アッセイの精度および正確性
アッセイの精度および正確性を、代替のマトリックスおよび基準となる全血の両方で調製したＱＣサンプルを使用して評価した。ＬＬＯＱ ＱＣおよびＬｏｗ ＱＣは、ｆＣ１－ＩＮＨを代替のマトリックスに、それぞれ１００ｍＵ／ｍＬおよび１５０ｍＵ／ｍＬの最終濃度となるまでスパイクすることにより調製した。集めた全血は、Ｌｏｗ－Ｍｉｄ ＱＣとして使用し、Ｍｉｄ、Ｍｉｄ－Ｈｉｇｈ、およびＨｉｇｈ ＱＣサンプルは、ｆＣ１－ＩＮＨを集めた全血にスパイクすることにより調製した。それらの名目上の濃度は、内因性Ｃ１－ＩＮＨの平均濃度（５１８ｍＵ／ｍＬ、ｎ＝１８）およびスパイクしたｆＣ１－ＩＮＨの濃度の合計であった。表５に示されるように、それぞれ、日内の精度および正確性は、４．４％～１１．６％および－１１．１％～－２．１％の範囲にあり、日間の精度および正確性は、８．１％～１３．１％および－１０．３％～０．９％であった。

表５：日内および日間の精度および正確性の概要

ヘマトクリットレベルの作用
全血のヘマトクリットレベルがろ紙における血液希釈、よってＤＢＳのスポットの大きさに影響し、アッセイのバイアスをもたらすことが良好に論述されている（１－３、６、７）。ヘマトクリットレベルが増加すると、ＤＢＳサンプルのスポット領域は減少する。性別および年齢に応じて、全血におけるヘマトクリットレベルは、２８％～６７％の範囲にある（７）。アッセイの特性に及ぼすヘマトクリットの作用を、４つのヘマトクリットレベル、２５％、４５％、６０％、および７５％で調査し、ここで４５％のヘマトクリットレベルを対照として使用した。ｆＣ１－ＩＮＨの活性は、乾燥した血液スポットにおけるヘマトクリットレベルとの線形の相関を示した（表６）。３０％～６０％のヘマトクリットレベルはｆＣ１－ＩＮＨの活性の測定に最小限の作用を有する（ＲＥ＜２０％）。

表６．ＤＢＳで測定したｆＣ１－ＩＮＨの活性に及ぼすヘマトクリットレベルの作用

Ｃ１－ＩＮＨの活性のパンチの位置
ＤＢＳベースアッセイにおける別の関心は、分析物の測定に及ぼすパンチの位置の作用である（１、６、８）。Ｃ１－ＩＮＨの活性に及ぼすＤＢＳカード上のパンチの位置の作用を試験するために、中央および周辺のパンチからの合計１８個の反復したサンプルを、同じ対象の４つのスポットから回収し、Ｌｏｗ ＱＣおよびＭｉｄ－Ｈｉｇｈ ＱＣサンプルについて分析した。精度および正確性は、１５％の範囲内にあり、パンチの位置がＣ１－ＩＮＨの活性の測定に影響しないことが暗示された（表４）。

抽出効率
Ｃ１－ＩＮＨの抽出効率を、代替のマトリックスで調製したＱＣを使用して評価した。平均抽出効率は、１００、６００、および１０００ｍＵ／ｍＬのＱＣ濃度で、それぞれ４８．８％、６５．９％、および５８．２％であった（表７）。検量線は、サンプルの試験の間の各試験の実行に使用し、抽出効率の変動は、アッセイの正確性に影響しないと思われる。

表７．ＤＢＳサンプルにおけるＣ１－ＩＮＨの抽出効率

全血およびＤＢＳにおけるｆＣ１－ＩＮＨの安定性
ｆＣ１－ＩＮＨの安定性を、全血で評価した。以前の報告から、ｆＣ１－ＩＮＨが、患者および健常な対象の両方において室温で最大３日間安定であることが示されていた（９）。集めた健常な血液でのｆＣ１－ＩＮＨの活性は、４℃で７日間保存した後の変化は最小限であった（表８）。ＤＢＳにおけるｆＣ１－ＩＮＨの安定性を試験するために、ＱＣ対照を、室温および４５℃で、乾燥剤のパックを含む気密性のバッグに置いた。Ｃ１－ＩＮＨの活性は、各カード由来の異なるパンチで測定し、４５℃で３日間保存した後、室温で保存した場合は１３４日後に、最小限の喪失（＜１５％）を示した（表８）。これら結果は、ｆＣ１－ＩＮＨが活性を喪失することなくＤＢＳにおいて大気温度で発送および保存できることを示した。

表８．異なる温度で保存した全血およびＤＢＳでのｆＣ１－ＩＮＨの活性の安定性

再注入の安定性を評価するために、処理したサンプルを、４℃で２日間オートサンプラーに置いた後に再注入した。この結果は、精度および正確性があらかじめ定義された合否基準に一致したことを示した（表９）。さらに、分析物のキャリーオーバーは検出できなかった（データ不図示）。

表９．再注入の安定性の試験の概要

健常な対象およびＨＡＥ対象に由来するＤＢＳサンプルの分析
検証したアッセイを使用して、ｆＣ１－ＩＮＨの活性を、１０３名の健常な対象および２４名のＨＡＥ患者（９名の男性および１５名の女性）から回収したＤＢＳサンプルで測定し、この結果を図８に提示する。健常な対象のグループでは、ｆＣ１－ＩＮＨの活性は、３１１～１０９０ｍＵ／ｍＬの範囲にあり、平均活性および標準偏差（ＳＤ）は、それぞれ５７３および１３５ｍＵ／ｍＬであった。にもかかわらず、全ての試験したＨＡＥ対象は、Ｃ１－ＩＮＨが１５８ｍＵ／ｍＬであった１名の対象を除き、ＬＬＯＱ（１００ｍＵ／ｍＬ）未満のＣ１－ＩＮＨの活性を有していた。３０３ｍＵ／ｍＬカットオフ値（平均値－２×ＳＤ）が確立され、これにより、健常な対象とＨＡＥ対象とを完全に差別化することができた。

論考
Ｃ１－ＩＮＨは、補体系、接触系、凝固系、および線維素溶解系を含む幅広い範囲の阻害性生体活性を調節するように機能する（１０～１２）。カリクレイン－キニンカスケードにおける３つの酵素（第ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩｆ因子、および血漿カリクレイン）の鍵となる阻害剤として、正常なｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、ＨＡＥ発作を誘導する炎症促進性介在物質である、ブラジキニンの過剰産生を妨げる。ｆＣ１－ＩＮＨの活性の欠乏は、接触系の再発する活性化をもたらし、活性タンパク分解性酵素である、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）を過度にもたらし、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）を切断してブラジキニンを放出する（１３～１５）。現在、４５０超の変異が、Ｃ１－ＩＮＨ ＳＥＲＰＩＮＧ１遺伝子で同定されており、多くが、ＨＡＥ患者のｆＣ１－ＩＮＨの欠乏に関連している（１６）。

異なるタイプのＨＡＥが存在するが、全てが、不十分なＣ１－ＩＮＨの機能を特徴とする。通常、ＨＡＥ患者のｆＣ１－ＩＮＨのレベルは、正常な値の５～３０％であり、減弱したＣ１－ＩＮＨの活性は、ＨＡＥの診断にとって最も重要な研究パラメータとして使用される（９）。ｆＣ１－ＩＮＨの活性に関する従来のアッセイは、ｃｂｚ－Ｌｙｓおよびチオメチルベンゼンを産生させる、Ｃ１ｓとその人工的な基質の、Ｚ－Ｌｙｓ－ＳＢｚｌ・ＨＣｌとの間の反応によりｆＣ１－ＩＮＨの活性を間接的に測定する。チオメチルベンゼンは、５，５’－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）での誘導体化の後、発色性アッセイにより測定される（９）。内因性またはスパイクインのＣ１－ＩＮＨの存在は、酵素反応を阻害し、よって、反応産物の形成は、Ｃ１－ＩＮＨの活性と逆比例する。従来のアッセイは、血漿サンプルまたは血清サンプルで健常な対象およびＨＡＥ対象を区別するために有効ではあるが、ＤＢＳにおけるその使用は、全血における赤血球によるアッセイの干渉により限定されていた。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイは、従来の発色性アッセイを超える固有の利点を有する。第１に、発色性アッセイは、２つのステップの反応に基づくが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイは、Ｃ１ｓ反応の直接的な産物を測定し、よって、アッセイの変動を低くすることができる。第２に、アッセイにおける内部標準（ＩＳ）の使用もまた、サンプルの調製および分析の間の分析の変動を補正することを支援する。第３に、Ｃ１－ＩＮＨを含まない代替のマトリックスで調製した検量線およびＱＣは、アッセイの正確性および再現性をさらに高めるために、各実験の実行に含まれていた。健常な対象の広い範囲のＣ１－ＩＮＨの活性、ＨＡＥ患者における限定されたＣ１－ＩＮＨの活性の変化（正常な活性の５～３０％）、および狭い範囲の酵素の動的反応を考慮すると、アッセイの変動を最小限にすることは、Ｃ１－ＩＮＨの活性の正確な測定に対する重要な要因であり得る。

酵素活性のアッセイでは、分析物の検量線は、通常、基準となるマトリックスよりも純粋なバッファー溶液で調製され、アッセイの性能は、ＱＣサンプルによりモニタリングされる。この手法は単純であるが、酵素反応は非常に迅速であり、反応条件のわずかな変化が分析の結果に影響し、よって患者の正確な診断に影響するため、Ｃ１－ＩＮＨの活性の測定に容易に適用することはできない。「代替のマトリックス」の概念は、内因性の分析物を含む基準となるマトリックスとしてバイオマーカーアッセイでの標準物質およびＱＣの調製で広く利用されており、これらの試験で採用した（１５）。代替のマトリックスは、分析物が枯渇しているが、消化効率、イオン化の作用、および抽出収率に関して基準となるマトリックスに近い。検量線およびＱＣの調製のための全血由来の代替のマトリックスの使用は、Ｃ１－ＩＮＨの活性が低い患者サンプルの酵素反応を正確に評価するために重要である。この手法では、１００～１５００ｍＵ／ｍＬのアッセイの範囲が達成された。さらに、極めて優れた正確性および精度が、代替のマトリックスおよび基準となる全血の両方で調製されたＱＣサンプルから達成され、アッセイ条件下での２つのマトリックスの類似が示された。

本明細書中記載されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイは、１５％未満の平均の日内および日間の変動、および無視できるサンプル間のキャリーオーバーを示した。さらに、Ｃ１－ＩＮＨの活性の測定は、ＤＢＳの中のパンチの位置とは無関係であったが、ＤＢＳにおけるいくつかの他の分析物の場合ではこれは当てはまらなかった（１）。しかしながら、アッセイの正確性は、ヘマトクリットレベルの影響を受ける場合があり、３０％未満または６０％超のヘマトクリットレベルを有するサンプルから試験の結果を解釈する際には注意すべきである。

サンプルの輸送および保存の間ＤＢＳにおいて安定した分析物のレベルを有することが重要である。全血におけるＣ１－ＩＮＨは、４℃で７日間安定していた。ＤＢＳでは、４５℃で保存した場合最大３日間、室温で保存した場合は１３４日間安定していた。これは、発展途上国であっても、サンプルの回収、中央の研究室への発送、および研究室での試験および再試験の全期間にとって十分である。

１０３名の健常な対象で測定したＣ１－ＩＮＨの活性は、５７３ｍＵ／ｍＬの平均活性および１３５ｍＵ／ｍＬの標準偏差で正規分布を示した。２４名のＨＡＥ患者のうち、２３名が、１００ｍＵ／ｍＬ未満のＣ１－ＩＮＨの活性を有し、最も高いＣ１－ＩＮＨの活性、１５８ｍＵ／ｍＬを有するＨＡＥサンプルは、平均正常活性の２７．６％に対応した。このデータは、健常な個体由来のサンプルと対応するＨＡＥ患者由来のサンプルとの間の明確な区別を支援する。

結論として、本明細書において、ＤＢＳサンプルにおけるｆＣ１－ＩＮＨの活性のための強力なアッセイを記載する。このアッセイは、ＨＡＥ患者の診断のための優れた再現性および正確性を提供する。単純なサンプルの回収ならびに発送および保存の安定性の延長は、特に設備が完全に整った臨床検査室へのアクセスが限定されているかまたはアクセスがない場所において、診断試験の利用可能性を拡大する。本アッセイは、ＨＡＥ診断のアルゴリズムを世界中で根本的に変える大きな可能性を示している。

参照文献
１．Ｈｏｌｕｂ Ｍ， Ｔｕｓｃｈｌ Ｋ， Ｒａｔｓｃｈｍａｎｎ Ｒ， Ｓｔｒｎａｄｏｖａ ＫＡ， Ｍｕｈｌ Ａ， Ｈｅｉｎｚｅ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｎｃｈ ｉｎ ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔｓ ｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｃｙｌｃａｒｎｉｔｉｎｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２００６；３７３：２７－３１．
２．Ｄｅ Ｊｅｓｕｓ ＶＲ， Ｚｈａｎｇ ＸＫ， Ｋｅｕｔｚｅｒ Ｊ， Ｂｏｄａｍｅｒ ＯＡ， Ｍｕｈｌ Ａ， Ｏｒｓｉｎｉ ＪＪ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００９；５５：１５８－６４．
３．ｄｅ Ｖｒｉｅｓ Ｒ， Ｂａｒｆｉｅｌｄ Ｍ， ｖａｎ ｄｅ Ｍｅｒｂｅｌ Ｎ， Ｓｃｈｍｉｄ Ｂ， Ｓｉｅｔｈｏｆｆ Ｃ， Ｏｒｔｉｚ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ ｏｎ ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｂｓ： Ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｂｆ ｄｂｓ－ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ２０１３；５：２１４７－６０．
４．Ｌｅｅ ＪＷ， Ｄｅｖａｎａｒａｙａｎ Ｖ， Ｂａｒｒｅｔｔ ＹＣ， Ｗｅｉｎｅｒ Ｒ， Ａｌｌｉｎｓｏｎ Ｊ， Ｆｏｕｎｔａｉｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｆｉｔ－ｆｏｒ－ｐｕｒｐｏｓｅ ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２００６；２３：３１２－２８．
５．ＭｃＤａｄｅ ＴＷ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｓａｙ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｗｉｔｈ ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔ ｓａｍｐｌｅｓ． Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｂｉｏｌ ２０１４；２６：１－９．
６．Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ Ｐ， Ｗｈｉｔｅ Ｓ， Ｇｌｏｂｉｇ Ｓ， Ｌｕｄｔｋｅ Ｓ， Ｂｒｕｎｅｔ Ｌ， Ｓｍｅｒａｇｌｉａ Ｊ． Ｅｂｆ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔｓ． Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ２０１１；３：１５６７－７５．
７．Ｄｅｎｎｉｆｆ Ｐ， Ｓｐｏｏｎｅｒ Ｎ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ ｏｎ ａｓｓａｙ ｂｉａｓ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ＤＢＳ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓ． Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ２０１０；２：１３８５－９５．
８．Ｃｏｂｂ Ｚ， ｄｅ Ｖｒｉｅｓ Ｒ， Ｓｐｏｏｎｅｒ Ｎ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｓ， Ｓｔａｅｌｅｎｓ Ｌ， Ｄｏｉｇ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ＤＢＳ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ： Ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＥＢＦ ＤＢＳ－ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ． Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ２０１３；５：２１６１－９．
９．Ｗａｇｅｎａａｒ－Ｂｏｓ ＩＧ， Ｄｒｏｕｅｔ Ｃ， Ａｙｇｏｒｅｎ－Ｐｕｒｓｕｎ Ｅ， Ｂｏｒｋ Ｋ， Ｂｕｃｈｅｒ Ｃ， Ｂｙｇｕｍ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃ１－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｉｎ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ： Ａｓｓａｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８；３３８：１４－２０．
１０．Ｂｏｒｋ Ｋ， Ｄａｖｉｓ－Ｌｏｒｔｏｎ Ｍ． Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｃ１－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ： Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ． Ｅｕｒ Ａｎｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１３；４５：７－１６．
１１．Ｃｓｕｋａ Ｄ， Ｖｅｓｚｅｌｉ Ｎ， Ｖａｒｇａ Ｌ， Ｐｒｏｈａｓｚｋａ Ｚ， Ｆａｒｋａｓ Ｈ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；８９：５９－６８．
１２．Ｒａｔｎｏｆｆ ＯＤ， Ｐｅｎｓｋｙ Ｊ， Ｏｇｓｔｏｎ Ｄ， Ｎａｆｆ ＧＢ． Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎ， ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ， ｐｌａｓｍａ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ， ａｎｄ ｔｈｅ Ｃ’１ｒ ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｂｙ ｓｅｒｕｍ Ｃ’１ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６９；１２９：３１５－３１．
１３．Ｎｚｅａｋｏ ＵＣ， Ｆｒｉｇａｓ Ｅ， Ｔｒｅｍａｉｎｅ ＷＪ． Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ： Ａ ｂｒｏａｄ ｒｅｖｉｅｗ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ． Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２００１；１６１：２４１７－２９．
１４．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ＪＡ， Ｍｏｅｌｌｍａｎ Ｊ． Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ． Ｉｎｔ Ｊ Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ ２０１２；５：３９．
１５．Ｚｈａｎｇ Ｇ， Ｓｅｘｔｏｎ ＤＪ， Ｆａｕｃｅｔｔｅ ＲＲ， Ｑｉｕ Ｙ， Ｗｕ Ｊ． ２ｄ－ｌｃ－ｍｓ／ｍｓ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｃｌｅａｖｅｄ ｈｉｇｈ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ａｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｃ１－ＩＮＨ－ＨＡＥ． Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ ２０１７；９：１４７７－９１．
１６．Ｊｏｈｎｓｒｕｄ Ｉ， Ｋｕｌｓｅｔｈ ＭＡ， Ｒｏｄｎｉｎｇｅｎ ＯＫ， Ｌａｎｄｒｏ Ｌ， Ｈｅｌｓｉｎｇ Ｐ， Ｗａａｇｅ Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｅ， Ｈｅｉｍｄａｌ Ｋ． Ａ ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｎｏｒｗｅｇｉａｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ ｗｉｔｈ Ｃ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｉｘ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＳＥＲＰＩＮＧ１． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１５；１０：ｅ０１３１６３７．
１７．Ｍａｕｒｅｒ Ｍ， Ｍａｇｅｒｌ Ｍ， Ａｎｓｏｔｅｇｕｉ Ｉ， Ａｙｇｏｒｅｎ－Ｐｕｒｓｕｎ Ｅ， Ｂｅｔｓｃｈｅｌ Ｓ， Ｂｏｒｋ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｗａｏ／ｅａａｃｉ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ－ｔｈｅ ２０１７ ｒｅｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ ｕｐｄａｔｅ． Ａｌｌｅｒｇｙ ２０１８；７３：１５７５－９６．
１８．Ｌｉ ＨＨ， Ｂｕｓｓｅ Ｐ， Ｌｕｍｒｙ ＷＲ， Ｆｒａｚｅｒ－Ａｂｅｌ Ａ， Ｌｅｖｙ Ｈ， Ｓｔｅｅｌｅ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ＥＬＩＳＡ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ． Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｐｒａｃｔ ２０１５；３：２００－５．
１９．Ｇａｎｚ Ｎ， Ｓｉｎｇｒａｓａ Ｍ， Ｎｉｃｏｌａｓ Ｌ， Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ Ｍ， Ｄｉｎｇｅｍａｎｓｅ Ｊ， Ｄｏｂｅｌｉｎ Ｗ， Ｇｌｉｎｓｋｉ Ｍ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ｈｕｍａｎ ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｏｓｅｎｔａｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｃａｒｄ ａｎｄ ｐｒｅｐ ｄｂｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２０１２；８８５－８８６：５０－６０．
２０．Ｈｏｌｕｂ Ｍ， Ｔｕｓｃｈｌ Ｋ， Ｒａｔｓｃｈｍａｎｎ Ｒ， Ｓｔｒｎａｄｏｖａ ＫＡ， Ｍｕｈｌ Ａ， Ｈｅｉｎｚｅ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｎｃｈ ｉｎ ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔｓ ｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｃｙｌｃａｒｎｉｔｉｎｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２００６；３７３：２７－３１．
２１．Ｍａｔｅｒｎ Ｄ， Ｏｇｌｅｓｂｅｅ Ｄ， Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌｉ Ｓ． Ｎｅｗｂｏｒｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｄｅｖ Ｄｉｓａｂｉｌ Ｒｅｓ Ｒｅｖ ２０１３；１７：２４７－５３．
２２．Ｍｏｋｈｔａｒｉｙｅ Ａ， Ｈａｇｈ－Ｎａｚａｒｉ Ｌ， Ｖａｒａｓｔｅｈ ＡＲ， Ｋｅｙｆｉ Ｆ． Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｒｅｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１９；７：１１９－２８．
２３．Ｚｈａｎｇ ＸＫ， Ｅｌｂｉｎ ＣＳ， Ｃｈｕａｎｇ ＷＬ， Ｃｏｏｐｅｒ ＳＫ， Ｍａｒａｓｈｉｏ ＣＡ， Ｂｅａｕｒｅｇａｒｄ Ｃ， Ｋｅｕｔｚｅｒ ＪＭ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｅｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔｓ ｆｏｒ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００８；５４：１７２５－８．
２４．Ｏｌｉｖｏｖａ Ｐ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｅｎ Ｋ， Ｃｕｌｌｅｎ Ｅ， Ｒｏｓｅ Ｍ， Ｚｈａｎｇ ＸＫ， Ｓｉｍｓ ＫＢ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ａｌｐｈａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｄｒｉｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｐｏｔｓ ｏｎ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２００９；４０３：１５９－６２．

他の実施形態
本明細書に開示される全ての特性は、任意の組み合わせで組み合わせられ得る。本明細書で開示される各特性は、同じであるか、均等であるか、または類似する目的を提供する別の特性と置き換わり得る。よって、他の意味が明記されない限り、開示される各特性は均等または類似する特性の包括的なシリーズの単なる例である。

上記説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に解明でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適用するために本発明の様々な変更および修正を作製することができる。よって、他の実施形態もまた特許請求の範囲内にある。

均等論
いくつかの本発明の実施形態が本明細書において記載および例示されているが、当業者は、本明細書中記載される機能を行い、かつ／または結果および／もしくは１つ以上の利点を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、このようなバリエーションおよび／または修正はそれぞれ、本明細書中記載される本発明の実施形態の範囲内にあるとされる。より全般的には、当業者は、本明細書中記載される全てのパラメータ、次元、物質、および構成が、単なる例であること、ならびに実際のパラメータ、次元、物質、および／または構成が、本発明の教示が使用される特定の適用に応じて変化することを容易に理解するであろう。当業者は、単なる規定の実験を使用して、本明細書中記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは解明できる。よって、上記の実施形態が単なる例であること、および添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載および請求されたもの以外の他の方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書中記載される各個別の特性、系、物品、物質、キット、および／または方法を対象とする。さらに、当該特性、系、物品、物質、キット、および／または方法が互いに異なる場合、２つ以上のこのような特性、系、物品、物質、キット、および／または方法の任意の組み合わせが、本開示の本発明の範囲内に含まれる。

本明細書中定義および使用される全ての定義は、辞書上の定義、参照により組み込まれている文書での定義、および／または定義された用語の通常の意味を超えて統括すると理解されるべきである。

本明細書中開示される全ての参照文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、一部の場合では文書の全体を包有し得る。

不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および特許請求の範囲においてここで使用される場合、明確に矛盾するような記載がない限り、「少なくとも１つ」を意味することを理解されたい。文言「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲においてここで使用される場合、等位接続した要素の「いずれかまたは両方」、すなわち一部の場合では連言的に存在し、他の場合では選言的に存在している要素を意味することを理解されたい。「および／または」と共に列挙された複数の要素は、同じ形式、すなわち等位接続した要素の「１つ以上」と解釈される。具体的に同定された要素に関連するかまたは関連しないかに関わらず、「および／または」の項により具体的に同定された要素以外の他の要素が、任意選択で存在し得る。よって、非限定的な例として、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンドの言語と併用して使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」に対する言及は、一実施形態ではＡのみ（任意選択でＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）；さらなる別の実施形態ではＡおよびＢの両方（任意選択で他の要素を含む）などを表し得る。

本明細書および特許請求の範囲においてここで使用される場合、「または」は、上記に定義される「および／または」と同じ意味を有することを理解されたい。たとえば、列挙の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的であり、すなわち、少なくとも１つの包含だけでなく、要素の数または列挙のうちの１超と任意選択でさらなる列挙されていない項目とを含むと解釈されるべきである。「～のうちの１つのみ」または「～のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合の「～からなる」などの明らかに反対の意味を示す用語のみが、要素の数または列挙のうちの正確に１つの要素の包含を表す。一般的に、用語「または」は、本明細書中使用される場合、「いずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうちの１つのみ」、または「～のうちの正確に１つ」などの排他性の用語が先行する場合、排他的な選択肢（すなわち「いずれかではあるが両方ではない」）を示すとのみ解釈すべきである。「～から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される場合の通常の意味を有する。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素の列挙に対する言及において、文言「少なくとも１つ」は、要素の列挙における要素のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるが、要素のリストの中で具体的に列挙されるあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むものではなく、要素のリスト中の要素のいずれかの組み合わせを排除するものではない。この定義はまた、文言「少なくとも１つの」が表す要素のリストの中で具体的に同定される要素以外の要素が、具体的に同定された要素に関連するかまたは関連しないかに関わらず、任意選択で存在し得ることを可能にする。よって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、任意選択で１超のＡを含む少なくとも１つのＡ（ここでＢは存在しない）（および任意選択でＢ以外の要素を含む）を表し；別の実施形態では、任意選択で１超のＢを含む少なくとも１つのＢ（ここでＡは存在しない）（および任意選択でＡ以外の要素を含む）を表し；さらなる別の実施形態では、任意選択で１超のＡを含む少なくとも１つのＡおよび任意選択で１超のＢを含む少なくとも１つのＢ（および任意選択で他の要素を含む）などを表すことができる。

また、明確に矛盾する記載がない限り、１超のステップまたは作用を含む本明細書中請求される全ての方法において、この方法のステップまたは作用の順序は、本方法のステップまたは作用が記載される順序に必ずしも限定されないことを理解されたい。

Claims (21)

1. サンプル中の機能的なＣ１エステラーゼインヒビター（ｆＣ１－ＩＮＨ）のレベルを決定するための方法であって、
   （ｉ）対象由来の血液サンプルを支持体上にスポットするステップと、
   （ｉｉ）前記支持体上の血液サンプルを乾燥させて乾燥した血液スポットを形成するステップと、
   （ｉｉｉ）（ｉｉ）からの乾燥した血液スポットからタンパク質を抽出するステップと、
   （ｉｖ）存在する場合に、（ｉｉｉ）で抽出したタンパク質におけるｆＣ１－ＩＮＨのレベルを測定するステップと、
   を含む方法。
2. ｆＣ１－ＩＮＨのレベルを測定するステップが、
   （ａ）前記抽出したタンパク質を、必要に応じて連続的に、補体成分１ｓ（Ｃ１ｓ）およびＣ１ｓ基質とインキュベートして、Ｃ１ｓ基質産物を産生させるステップと、
   （ｂ）ステップ（ａ）で産生されたＣ１ｓ基質産物のレベルを測定するステップと、
   （ｃ）ステップ（ｂ）で測定したＣ１ｓ基質産物のレベルに基づいて前記乾燥した血液スポットにおけるｆＣ１－ＩＮＨのレベルを決定するステップと、
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ａ）が、前記抽出したタンパク質をＣ１ｓおよびＣ１ｓ基質とインキュベートして反応混合物を産生させることにより行われる、請求項２に記載の方法。
4. ステップ（ｂ）の測定するステップが、液体クロマトグラフィー－質量分析法により行われる、請求項２または３に記載の方法。
5. Ｃ１ｓ基質が、Ｎ^α－カルボベンジルオキシ－Ｌｙｓ－チオベンジルエステルであり、Ｃ１ｓ産物が、Ｎ^α－ベンジルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ｃｂｚ－Ｌｙｓ）である、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
6. （ｉｉｉ）の抽出が、前記乾燥した血液スポットを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳバッファーと少なくとも３時間インキュベートすることにより行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記支持体がろ紙である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. ステップ（ｉｉ）の乾燥が、室温で少なくとも３時間行われる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記対象から血液サンプルを得るステップをさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記血液サンプルが、全血サンプルである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記対象が、ヒト対象である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記対象が、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を有するか、有する疑いがあるか、または有するリスクがある、請求項１１に記載の方法。
13. ＨＡＥが、Ｉ型ＨＡＥまたはＩＩ型ＨＡＥである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記対象が、Ｃ１－ＩＮＨ欠乏介在障害を有するかどうかを決定するステップをさらに含み、対照と比較して低いｆＣ１－ＩＮＨ産物のレベルが、前記対象がＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害を有することを表す、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. ｆＣ１－ＩＮＨのレベルに基づき、前記対象に適した処置を同定するステップをさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. ステップ（ｃ）で決定したｆＣ１－ＩＮＨのレベルに基づき前記疾患の処置の候補として前記対象を同定するステップをさらに含む、請求項２～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記対象がＣ１－ＩＮＨ欠乏介在障害のリスクがあるかまたは当該障害を有すると同定される場合、前記対象に治療薬を投与するステップをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記治療薬が、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）阻害剤、ブラジキニンＢ２受容体アンタゴニスト、またはＣ１エステラーゼインヒビターである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記治療薬が、エカランチド、ラナデルマブ、イカチバント、またはヒト血漿由来のＣ１エステラーゼインヒビターである、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 前記Ｃ１－ＩＮＨ欠乏介在障害が、ＨＡＥである、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. ＨＡＥが、Ｉ型ＨＡＥまたはＩＩ型ＨＡＥである、請求項２０に記載の方法。

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