TW202104900A - 定量功能性ｃ１酯酶抑制子（ｆｃ１—ｉｎｈ）之方法 - Google Patents

Abstract

本文提供定量來自乾燥血液樣點之fC1-INH之方法。如此方法可包含將血液樣本點樣於支撐構件上且乾燥、自該乾燥血液樣本萃取蛋白質及量測所萃取蛋白質中的fC1-INH之量。

Description

定量功能性C1酯酶抑制子（FC1-INH）之方法

相關申請案

本申請案根據35 U.S.C. § 119(e)主張於2019年4月16日申請之美國臨時申請案第62/834,461號及於2019年11月7日申請之美國臨時申請案第62/932,011號的權益；該等申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。

遺傳性血管水腫（hereditary angioedema，HAE）為由遺傳性血漿蛋白質C1酯酶抑制子（簡言之C1抑制子，C1-INH）之缺乏或功能異常所引起之罕見的常染色體顯性遺傳疾病。HAE之特徵在於血管性水腫之反覆性發作，其通常涉及面部、表皮、腸道及/或呼吸道。症狀可見於其他疾病中，這使得對HAE之診斷複雜化。HAE主要可劃分成兩種類型。I型之特徵在於低量之C1-INH蛋白質且佔HAE發生率之約85%，而II型之特徵在於低功能性C1-INH（fC1-INH）量但正常或升高之C1-INH蛋白質量且佔約15%。當以單位/毫升量測時，在未經治療之I型及II型患者中的典型fC1-INH為正常量之5-30%。

當前可供用於量測fC1-INH之檢定為基於血漿的檢定。常用檢定為發色檢定，其使用合成C1-酯酶特異性受質間接量測測試樣本中由C1-INH導致的C1-酯酶活性抑制。另一常用檢定為量測C1-INH與補體蛋白質組分C1s之功能性結合的ELISA檢定。然而，樣本運送至集中測試實驗室及在其中之儲存通常不便於基於血漿的檢定。

開發可在集中實驗室中操作用於量測生物樣本中之fC1-INH的簡單且用戶友好性方法受到了極大關注。

本文之揭示內容至少部分基於對簡單、靈敏且具選擇性之檢定的開發，該檢定涉及將含有功能性血漿C1-酯酶抑制子（fC1-INH）之乾燥血液樣點用於分析，該分析藉由例如經由液相層析-質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）量測來源於C1-酯酶酶反應的受質產物（C1s受質產物）來進行。

因此，本文之揭示內容之一個方面提供一種用於測定乾燥血液樣本中之fC1-INH之量之方法，該方法包含：（i）將來自個體之血液樣本點樣於支撐構件上；（ii）將該支撐構件上的該血液樣本乾燥以形成乾燥血液樣點；（iii）自來自（ii）之該乾燥血液樣點萃取蛋白質；及（iv）量測（iii）中所萃取之蛋白質中的fC1-INH之量（若存在）。如此量測可對照校準曲線或與校準曲線比較執行。在一些實例中，校準曲線可藉由用不含C1-INH的緩衝液或其他適合之組分對來自正常個體之全血進行連續稀釋來製備。

在一些實例中，將該血液樣點乾燥之步驟（ii）可在室溫下執行3小時。在一些實例中，該支撐構件為濾紙。替代地或另外，自該乾燥血液樣點萃取蛋白質之步驟（iii）可藉由用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）/PBS緩衝液培育該乾燥血液樣點至少3小時來執行。

在本文所揭示之任何方法中，量測fC1-INH之量的步驟（iv）可包含（a）將所萃取蛋白質與補體組分1s（complement component 1s，C1s）及C1s受質一起培育以產生反應混合物；（b）量測步驟（a）中所產生之C1s受質產物之量；及（c）基於步驟（b）中所量測的C1s受質產物之量來測定該乾燥血液樣點中的fC1-INH之量。在一些實例中，C1受質產物可藉由液相層析-質譜法（LC-MS）或液相層析-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）量測。

在一些實施方式中，將所萃取蛋白質與補體組分1s（C1s）及C1s受質一起培育之步驟（a）可藉由將所萃取蛋白質與該C1s一起培育以產生反應混合物且隨後將該反應混合物與該C1s受質一起培育以產生C1s受質產物來執行。在一些情況下，C1s受質產物之量可藉由液相層析-質譜法量測。例示性C1s受質包括（但不限於）N^α -苯甲氧羰基-Lys-苯甲硫醇酯，其產生C1s產物N^α -苯甲氧羰基-L-離胺酸（cbz-Lys）。

本文所述之任何方法可進一步包含自個體（例如人類個體）獲得該血液樣本（例如全血樣本）。在一些實施方式中，該人類個體可為患有或疑似患有C1-INH缺乏介導之病症的人類患者，該病症諸如遺傳性血管水腫（HAE），例如I型HAE或II型HAE。

本文所述之方法可進一步包含確定該個體是否患有HAE。與對照相比減小之fC1-INH之量（與提高之C1s受質產物之量相關）指示該個體患有血漿胰舒血管素（plasma kallikrein，pKal）及/或C1-INH缺乏介導之病症，諸如如本文所揭示之HAE。本文所述之任何方法可進一步包含（a）基於功能性C1-INH之量識別用於個體之適合治療；（b）基於如由本文所揭示之方法所測定的fC1-INH之量將個體識別為治療疾病之候選者；或兩者。

本文所述之任何方法可進一步包含向藉由本文所揭示之任何方法識別為具有C1-INH缺乏介導之病症的風險或患有該病症的個體投予治療劑。在一些實施方式中，該治療劑可為血漿胰舒血管素（pKal）抑制子、緩激肽B2受體拮抗劑、或C1酯酶抑制子。實例包括（但不限於）艾卡拉肽（ecallantide）、拉那蘆單抗（lanadelumab）、艾替班特（icatibant）、或人類血漿源性C1酯酶抑制子。

本發明之一或多個實施方式之細節闡述於下文實施方式中。本發明之其他特徵或優點基於以下圖式及以下實施方式之許多實施方式以及基於隨附申請專利範圍會是顯而易見的。

C1-抑制子蛋白質（C1-inhibitor protein，C1-INH）中之基因缺乏引起遺傳性血管水腫（HAE）。患有HAE之患者受通常由未知觸發事件而發生的疼痛水腫之急性發作影響。

C1酯酶（C1s）抑制子（C1-INH）為人類血漿之正常成分且屬於絲胺酸蛋白酶抑制子（serine protease inhibitor，serpin）群組，該群組包括抗凝血酶III、α1蛋白酶抑制子、α2抗纖維蛋白溶酶及肝素輔因子II。如同此群組中其他抑制子一樣，C1-INH對人體之數個主要級聯系統具有重要的抑制潛力，該等主要級聯系統包括補體系統、內在凝血（接觸）系統、纖維蛋白溶解系統及凝血級聯。通常在發炎過程期間活化之C1-INH藉由與反應位點共價結合使其受質失活。C1-INH為用於補體組分1之子組分（C1r）、C1s、凝血因子XIIa及激肽釋放酶的唯一已知抑制子。另外，其為用於內在凝血級聯中之凝血因子Xia的主要抑制子。

HAE主要可劃分成兩種類型。I型之特徵在於低量之C1-INH蛋白質且佔HAE發生率之約85%，而II型之特徵在於低功能性C1-INH（fC1-INH）量但正常或升高之C1-INH蛋白質量且佔約15%。當以單位/毫升量測時，在未經治療之I型及II型患者中的典型fC1-INH為正常量之5-30%。對來自患者之樣本中之fC1-INH的準確及可靠量測充當HAE診斷之基礎。

當前，兩種類型之血漿測試用於測定fC1-INH之量。第一種檢定為發色檢定，其使用合成C1s特異性受質間接量測由測試樣本中之C1-INH對目標蛋白酶C1s之活性的抑制。第二種測試為基於C1-INH與補體蛋白質組分C1s之功能性結合的ELISA檢定。

當前，建議將fC1-INH活性之血清或血漿量及蛋白質表現以及補體組分4（C4）之量用於I/II型HAE之診斷，其中fC1-INH活性為最至關重要的測試（參見例如Maurer M, 等人Allergy (2018)73:1575-96）。用於量測fC1-INH活性之習知方法涉及發色方法或複合物形成性免疫檢定。發色方法併入有合成C1s受質以量測血漿樣本中C1-INH蛋白質之抑制活性，其中顏色形成之缺少確證C1-INH誘導之抑制。然而複合物形成性免疫檢定方法在不直接量測C1-INH抑制活性的情況下偵測C1-INH-C1s複合物形成（參見例如Li HH, 等人J Allergy Clin Immunol Pract (2015)3:200-5）。

通常藉由濁度檢定來量測C1-INH及C4抗原量。此等檢定將需要在醫師門診對血液樣本進行即刻處理及適當儲存，且並非在所有地理區域中均為標準化、低本高效或可容易獲得的。迄今為止，診斷比率的範圍為在中國、墨西哥、日本、韓國5-10%至在美國及西歐75-80%（未公開資料）。開發簡單且標準化的用於在集中實驗室中量測fC1-INH之方法極受關注。

基於乾燥血液樣點（DBS）之檢定已廣泛用於許多基因疾病之新生兒篩查或患者診斷，該等基因疾病諸如溶體貯積病（lysosomal storage disease，LSD）（19-23）。來自多個報告之結果證明酶活性可保留於DBS樣本中（2，24）。與習知血漿或血清檢定相比，DBS提供獨特的優點。首先，DBS取樣（例如使用手指刺破）較無創傷性且並不需要較大體積之血液及任何實驗室儀器。其次，DBS樣本可在環境溫度下運送及長期儲存而不顯著損失酶活性或遺傳資訊。此等優點保證DBS樣本可在醫師室中製備及在集中實驗室中測試。

本文之揭示內容描述用於量測乾燥血液樣點（DBS）中功能性C1抑制子（functional C1 inhibitor，fC1-INH）量之檢定。此基於DBS之測試提供相對於基於血漿之發色或ELISA檢定之若干優點，例如較小血液體積、延長的於濾紙上乾燥後分析物穩定性，容易的樣本運送及儲存及/或允許在集中實驗室中測試患者樣本。I. 用於偵測功能性血漿酯酶 C1 抑制子 （ fC1-INH ）之 量之方法

本文之揭示內容係關於藉由穩健液相層析-串聯質譜法（LC-MS/MS）使用由患者之全血樣本製備的乾燥血液樣點（DBS）測定fC1-INH量之方法。如此方法可用於診斷C1-INH缺乏介導之病症，諸如HAE。該等方法可涉及製備DBS樣本、自DBS樣本萃取蛋白質、將蛋白質萃取物與補體組分1s（C1s）一起培育及與C1s受質反應以產生C1s受質產物，該C1s受質產物可藉由例如液相層析-串聯質譜法（LC-MS/MS）來加以量測。(i) 樣本製備

可藉由本文所述之方法分析可能或可能不含有C1-INH（例如fC1-INH、非功能性C1-INH或兩者）的任何樣本。如本文所用，「樣本」係指可能包含所關注分析物（在本發明之情況下為fC1-INH）之組成物。樣本可包含來自個體之組織、血液、血漿或血清。術語「樣本」可涵蓋取自個體之初始未經處理樣本以及隨後經處理（例如部分純化或保藏形式，例如經由免疫沈澱經處理）之樣本兩者。例示性樣本包括血液、血漿、血清、淚液或黏液。在其他實例中，樣本可為來自試管內檢定之組成物。

在一些實施方式中，樣本為體液樣本，諸如血清或血漿樣本。在一些實施方式中，樣本為自需要分析之個體獲得的生物樣本。「患者」、「個體」或「宿主」（此等術語可互換使用）可指人類或非人類動物。在一些情況下，個體為可能患有與接觸系統相關之疾病、疑似患有該疾病、或具有該疾病的風險之人類患者。舉例而言，人類患者可能先前患有HAE或可能具有HAE的風險。如此人類患者可先前用靶向接觸系統之組分的藥物（例如C1s、血漿胰舒血管素）進行過治療或可正處於用該藥物進行治療之過程中。

生物樣本可為體液樣本，例如血液樣本。在一些實例中，血液樣本為全血樣本。全血包含紅血球、白血球、血小板及血漿。在一些實施方式中，可自血管（例如毛細血管、靜脈及動脈）收集血液樣本。可使用所屬領域中已知之任何方法收集及處理用於本文所述之方法中的全血樣本。在一些實施方式中，藉由手指刺破（手指針刺）獲得樣本。在一些實施方式中，可使用真空血液收集管收集樣本。

本文之揭示內容之樣本可具有對於執行至少一次如本文所述之fC1-INH量測檢定足夠的任何體積。在一些實施方式中，自個體獲得之樣本在25 μL-10 mL之間。在一些實施方式中，用於本文所述之方法中之樣本或其等分試樣在100 μL-2 mL之間。在一些實施方式中，樣本在50 μL-100 μL之間。在一些實施方式中，樣本在50 μL-1 mL之間。在一些實施方式中，樣本為50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL、700 μL、800 μL、900 μL、1 mL、1.1 mL、1.2 mL、1.3 mL、1.4 mL、1.5 mL、1.6 mL、1.7 mL、1.8 mL、1.9 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.0 mL、5.5 mL、6.0 mL、6.5 mL、7.0 mL、7.5 mL、8.0 mL、8.5 mL、9.0 mL、9.5 mL或10.0 mL。在一些實施方式中，樣本為60 μL。

可收集本文所揭示之任何樣本（例如全血樣本）及可將樣本之等分試樣取出且點樣於支撐構件上。在一些實施方式中，將含有樣本或樣本之等分試樣的支撐構件在適合條件（例如室溫）下維持適合之時間段（例如至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時或更長）以允許於支撐構件上形成樣本之乾燥樣點。

支撐構件可為膜片、膜、濾紙或乾燥血液樣點卡。在一些實施方式中，支撐構件可包含一或多個樣本收集區及視情況選用之環繞覆蓋物。可將支撐構件放入可密封容器中（例如Ziploc®袋子）以有助於樣本運送。在一些實施方式中，支撐構件可為可摺疊的。本文所述之任何支撐構件可進一步包含一或多個用於記錄樣本之其他資訊（例如個體之人口統計資訊）的區域。

可使樣本（或其等分試樣）在適合時間段內在適合條件下於支撐構件上乾燥。在一些實施方式中，使樣本乾燥約1-6小時，例如1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或6小時。在一些實施方式中，使樣本乾燥約1-2小時、1-3小時、1-4小時、1-5小時、2-3小時、2-4小時、2-5小時、2-6小時、3-4小時、3-5小時、3-6小時、4-5小時、4-6小時或5-6小時。

在一些實施方式中，使樣本在適合溫度下乾燥，例如在10℃-40℃之間或更高的溫度下。在一些實施方式中，使樣本在10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或更高的溫度下乾燥。所屬領域中具通常知識者已知乾燥過程可在相對較高溫度下執行較短時間段或替代地在相對較低溫度下執行較長時間段。在一些實例中，可使樣本在室溫（約25℃）下乾燥至少3小時。(ii) 蛋白質萃取

如本文所述製備之乾燥樣點樣本（例如乾燥血液樣本）可經處理以萃取樣本中所含有的生物學材料，例如蛋白質。在一些實施方式中，乾燥樣點樣本（諸如DBS樣本）可經處理用於蛋白質萃取。如本文所用，蛋白質萃取係指將乾燥樣本中所含有的蛋白質或蛋白質之某一部分萃取至適合緩衝液（例如其中目標蛋白質為可溶性的）中。在一些情況下，可藉由習知方法（例如使用打孔器）將存在於支撐構件之樣本收集區域上的乾燥樣點樣本（諸如DBS樣本）與支撐構件之其餘部分分離。可將經分離生物材料樣本（諸如蛋白質樣本）轉移至適合的容器用於進一步蛋白質萃取。適合容器之非限制性實例可為管子、培養皿、小瓶、多孔盤。在一些實例中，適合容器可為96孔盤。可同時處理一或多個乾燥樣點樣本（諸如DBS樣本）。

任何適合之緩衝液可用於本文所述之方法。較佳地，緩衝液與待萃取之生物學材料相容（例如能夠溶解蛋白質且較佳地保持蛋白質功能）。適合緩衝液之非限制性實例包括磷酸鹽緩衝鹽水（phosphate-buffered saline，PBS）、杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水（Dulbecco's phosphate-buffered saline，DPBS）或漢克氏平衡鹽溶液（Hanks' Balanced Salt Solution，HBSS）。在一些實例中，緩衝液可為PBS。在一些實施方式中，緩衝液可含有一或多種提高穩定性及/或防止待萃取生物學材料降解的組分。

在一些實施方式中，用於萃取步驟中之緩衝液可包含一或多種在適合之濃度（例如0.5%）下將有助於蛋白質萃取（例如牛血清白蛋白）之試劑。在一些實施方式中，可在允許完全萃取樣本中之所關注生物學材料（例如fC1-INH）的適合條件下於緩衝液中培育含有乾燥樣點樣本（例如DBS樣本）之支撐構件或其一部分。在一些實施方式中，可在適合溫度（例如25-37℃（例如37℃））下於緩衝液中培育含乾燥樣點樣本之支撐構件持續適合之時間段（例如2-5小時（例如3小時））以允許對所關注生物學材料（例如蛋白質，包括fC1-INH）進行足夠萃取以使得可量測fC1-INH之量。

在一些實施方式中，可以適合速度，例如800-2000 rpm（例如1250 rpm）離心緩衝液/樣本混合物，以有助於將生物學材料萃取至溶液中。特定萃取條件（包括溫度、萃取時間段、緩衝液之使用、經或不經離心、離心速度等）之選擇可視例如待萃取的生物學材料之類型及用於形成乾燥樣點樣本之支撐構件而定。如此資訊已在所屬領域中具通常知識者之知識內。(iii) fC1-INH 之量測

可分析如上文所揭示製備之含有fC1-INH之溶液以測定溶液中的fC1-INH之量。在一些情況下，藉由測定fC1-INH之活性，例如藉由本文所揭示之習知途徑或方法來量測fC1-INH之量。

可使用如所屬領域中已知或如本文所述之適合方法來量測fC1-INH之量。在一些實施方式中，藉由使用可由C1s分解之發色受質的發色檢定來量測fC1-INH之量。在一些實施方式中，如本文所述將免疫檢定用於評估所關注的C1s產物之量。免疫檢定之實例包括（但不限於）西方墨點、酶聯免疫吸附檢定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）（例如夾層ELISA）、放射免疫檢定、基於電化學發光之偵測檢定及相關技術。例如西方墨點檢定之檢定可進一步涉及定量成像系統之使用，例如可商購的LICOR成像技術（參見例如來自LI-COR Biosciences之Odyssey^® CLx紅外成像系統）。在一些實施方式中，使用電化學發光偵測檢定或依賴於電化學發光與圖案化陣列技術之組合的檢定（例如來自Meso Scale Discovery（MSD）之ECL或MULTI-ARRAY技術檢定）。

如本文所用，術語「量測（measuring/measurement）」或替代地「偵測（detecting/detection）」意謂評估樣本內一種物質之存在、不存在、數量或量（可為有效量），包括如此物質之定性或定量濃度水平的推導，或以其他方式估量個體之值或分類。

在一些實施方式中，可將自本文所揭示之任何乾燥樣點樣本（例如DBS樣本）萃取的含fC1-INH之樣本與C1s蛋白酶及C1s受質一起培育。C1s蛋白酶可作用於C1s受質以使C1s受質轉化成C1s受質產物，隨後可分析該C1s受質產物以確定C1s受質產物之存在及/或量。替代地，在與C1s蛋白酶及含fC1-INH之樣本一起培育後，可分析C1s受質以確定剩餘的C1s受質之存在及/或量。在藉由fC1-INH抑制C1s蛋白酶後，C1s受質產物之產生將減少或消除。如本文所用，「C1s受質產物」係指由C1s對C1s受質之蛋白酶反應產生的分解產物。在一些實施方式中，C1s受質及/或C1s受質產物之量可用作C1s蛋白酶及/或fC1-INH之活性的間接量度。

在一些實施方式中，可首先在適合條件下將自本文所揭示之任何乾燥樣點樣本（例如DBS樣本）萃取的含fC1-INH之樣本與C1s蛋白酶一起培育適合之時間段。隨後可將C1s受質添加至混合物中，可在適合條件下進一步培育該混合物持續適合之時間段以允許產生C1s受質產物。在一些實施方式中，可在暗處執行培育。在一些實例中，該方法可包含使C1s蛋白酶反應中止之步驟，其可提高分析之準確度。在一些實施方式中，可藉由於中止用溶液中稀釋（例如1:5-1:20）C1s反應混合物來達成使C1s蛋白酶反應中止。如本文所用，「中止用溶液」係指用於使如本文所述之酶反應（例如C1s蛋白酶反應）停止之溶液。在一些實施方式中，中止用溶液可包含能夠使酶變性或失活之試劑。非限制性變性劑包括醇、清潔劑、強酸、強鹼、螯合劑等。在一些實施方式中，中止用溶液可含有清潔劑（例如SDS）及/或醇（例如甲醇）。

用於本文所揭示之方法中的C1s受質可為可藉由C1s蛋白酶分解以產生可偵測C1s受質產物之任何受質。C1s受質之非限制性實例包括在C1s蛋白酶分解後產生N^α -苯甲氧羰基-L-離胺酸（cbz-Lys）之N^α -苯甲氧羰基-Lys-苯甲硫醇酯；及產生C4a及C4b之C4。

在一些實施方式中，在使酶反應中止之後，可進一步稀釋樣本用於隨後的液相層析-串聯質譜法（LC-MS/MS）分析。在一些實施方式中，可在適合溶液（例如80% MeOH/水（v/v））中使樣本稀釋200倍。

可藉由習知方法分析由此產生之C1s受質產物以確定其存在及/或量。在一些實施方式中，C1s受質產物可藉由液相層析-質譜法（LC-MS）方法來分析，液相層析-質譜法為組合液相層析之物理分離能力與質譜法（mass spectrometry，MS）之質量分析能力的分析技術。可使用常規方法執行LC-MS/MS檢定。

在一些情況下，用於分析C1s受質產物之質譜儀可在選擇反應監測（selective reaction monitoring，SRM）模式下操作。SRM模式為用於串聯質譜法之具有高度靈敏性及選擇性之方法，其中在串聯質譜儀之第一級中選擇具有特定質量之離子且在第二質譜儀級中選擇前驅離子之碎片化反應的離子產物用於偵測。SRM模式可用於藉由質譜法之靶向定量。在電離後，首先例如使用電噴霧源使前驅物分離以獲得大部分預期物種（例如母離子）之大量離子群體。隨後使此群體碎片化以得到產物離子，該等產物離子之信號豐度指示樣本中所關注的產物之豐度。在一些實施方式中，cbz-Lys母離子可在m/z 281，而選擇用於偵測之cbz-Lys產物離子可在m/z 91。如在實施例中所述，可使用適合之儀器，諸如ABSciex 5500或6500 QTrap質譜儀，且可在方法最佳化之後評估各個樣本之間的差異。如本文所述，可製備個體全血樣本用於LC-MS/MS分析。

可經由習知方法測定C1s受質產物之量（例如濃度）（例如藉由AUC表示），且由此可確定fC1-INH濃度。校準或標準曲線（例如四參數邏輯校準曲線）可藉由繪製fC1-INH濃度相對於分析物（例如cbz-Lys）比內部標準物（例如Nε-苯甲氧羰基-L-離胺酸-2,6,6-d3之濃度）之峰面積比率而產生。可將校準曲線擬合成方程式，例如：

（方程式1） 其中y指峰面積比率；x指樣本濃度；及A、B、C及D為曲線擬合參數。

在一些實施方式中，可藉由分析使用本文所述之方法製備的校準標準物驗證LC-MS/MS方法之準確度及再現性。在一些實施方式中，樣本中的fC1-INH之量（例如濃度）可藉由方程式（例如方程式1）計算。此等結果指示藉由樣本（由本文所述之方法製備）中C1s受質產物之量表示及計算的fC1-INH之量為用於HAE診斷之可靠生物指標。

在一些情況下，校準曲線可用所關注分析物（C1s標誌產物）比內部標準物之峰面積比率構建。如本文所用，「內部標準物」係指以常量添加至測試樣本、品質控制（quality control，QC）樣本、空白及校準標準物以校正樣本製備期間分析物之損失且由此提高分析物分析之準確度的化學物質。在一些實施方式中，內部標準物為Nε-苯甲氧羰基-L-離胺酸-2,6,6-d3或另一穩定的經同位素標記之C1s受質產物。在一些實施方式中，校準曲線可用於定量分析。

另外，可製備一系列校準標準物，且作為檢定之校準劑及出於品質控制目的與樣本一起進行LC-MS/MS分析。如本文所用，校準標準物係指含有已知量之所關注分析物或材料（例如在本文之揭示內容中之fC1-INH）的全血或溶液。校準標準物可用於以與樣本相同之方式測試具有已知濃度的材料以確保測試系統準確量測整個可報導範圍中之樣本。校準標準物可藉由將不同已知量之所關注材料（例如fC1-INH）添加至初始不含所關注材料或所關注材料耗盡之溶液中來製備。在一些實例中，可將所關注材料（例如fC1-INH）添加至與測試樣本（例如全血樣本）相似之生物樣本中以模擬測試樣本（例如替代基質）。在一個實例中，校準標準物可藉由將fC1-INH（例如經純化fC1-INH）與fC1-INH耗盡之替代血液混合來製備。如本文所用，fC1-INH耗盡之替代血液可藉由以下製備：（i）藉由適合方法（例如抽空血液收集管）自適合群體（理想地與個體（subject）（例如健康個體（individual），男性及/或女性）相同之物種）獲得及/或匯集新鮮全血；（ii）藉由使用適合方法（例如在室溫下以800 rpm離心10 min）移除上清液血漿來耗盡血液樣本中的內源性所關注材料（例如fC1-INH）；（iii）將適合體積（例如相等體積）之所匯集剩餘紅血球與適合緩衝液（例如含約4.3% BSA之PBS）混合。如本文所述，所關注材料（例如fC1-INH）之校準標準物及品質控制組（QC）可藉由將各個已知濃度之含有所關注材料（例如fC1-INH）的溶液摻入至fC1-INH耗盡之替代血液中來製備。如本文所述，在LC-MS/MS分析之前可對校準標準物進行生成C1s受質產物之方法。

在一個特定實例中，本文所述之方法可包含：（1）自全血樣本製備DBS卡之程序；（2）自DBS卡萃取C1-INH蛋白質；（3）將所萃取蛋白質與補體組分C1s一起培育；（4）與C1s受質N^α -苯甲氧羰基-Lys-苯甲硫醇酯進行酶反應以產生酶產物N^α -苯甲氧羰基-L-離胺酸（cbz-Lys）；及（5）隨後藉由LC-MS檢定使用N ^ε -苯甲氧羰基-L -離胺酸-2,6,6-d₃ 作為用於定量之內部標準物來量測cbz-Lys。II. 乾燥樣點檢定方法之應用

本文所述之用於量測樣本中之fC1-INH的檢定方法可用於臨床或非臨床目的。（ i ）疾病診斷及預後

C1-INH缺乏介導之病症（諸如遺傳性血管水腫（HAE））之診斷可基於自候選個體獲得之樣本中的fC1-INH之量。

可將本文所述之檢定方法及套組用於疾病之估量，例如疾病之診斷或預後。估量可包括將個體識別為具有如本文所述之疾病的風險或患有如本文所述之疾病，例如C1-INH缺乏介導之病症，諸如HAE（例如I型HAE或II型HAE）。估量亦可包括監測疾病之治療，諸如估量用於C1-INH缺乏介導之病症（諸如HAE）的治療之有效性。此外，估量可包括識別可藉由pKal抑制子治療，諸如藉由C1s抑制子（例如來源於人類血漿之C1s抑制子）或血漿激肽釋放素抑制子治療的疾病。 A.   診斷

在一些實施方式中，將本文所述之檢定、方法及套組用於確定自候選個體（例如疑似患有C1-INH缺乏介導之病症（例如HAE）的人類患者）收集之生物樣本（例如全血樣本）中的fC1-INH之量。fC1-INH之量可基於藉由本文所述之方法（例如藉由4參數邏輯校準曲線）生成的C1s受質產物之量而確定。可將如此fC1-INH量與預定參考值或參考比率比較以確定個體是否患有C1-INH缺乏介導之病症（例如HAE）或具有該病症之風險。舉例而言，若候選個體之樣本中的fC1-INH處於或低於參考值，則該個體可識別為患有C1-INH缺乏介導之病症（諸如HAE）或具有該病症之風險。

如本文所述，參考樣本可為fC1-INH之對照量。在一些實施方式中，對照量表示自健康個體或健康個體之群體（該等健康個體較佳地與候選個體具有相同的物種及年齡）獲得之對照樣本（例如全血樣本）中的fC1-INH之量。如本文所用，健康個體為在量測fC1-INH之量時明顯無目標疾病（例如C1-INH缺乏介導之病症，諸如HAE）或無該疾病病史之個體。

替代地，參考值可為預定值。如此預定標誌fC1-INH可代表不患有目標疾病或不具有目標疾病之風險的個體群體中的如本文所述之fC1-INH值。

預定值可採取多種形式。舉例而言，其可為單個截斷值，諸如中位值或平均值。在一些實施方式中，預定量可基於比較組確立，諸如其中一個經界定組已知為患有目標疾病而另一經界定組已知為不患有目標疾病。替代地，預定量可為處於預定百分位內的對照群體中之範圍，例如fC1-INH範圍。

如本文所述對照值可藉由常規技術測定。在一些實例中，對照值可藉由對對照樣本執行如本文亦描述之習知方法（例如如本文所述相同的用於獲得fC1-INH之量之檢定）來獲得。在其他實例中，fC1-INH之量可自對照群體之成員獲得且結果可藉由例如計算程式分析以獲得表示對照群體中fC1-INH之量的對照量（預定量）。

藉由比較自候選個體獲得之樣本中本文所述之fC1-INH的濃度與如本文所述之參考比率，可確定關於候選個體是否患有C1-INH缺乏介導之疾病（例如HAE）或具有該疾病之風險。舉例而言，若候選個體之樣本中的fC1-INH之值偏離參考值或比率（例如與參考值相比減小），則該候選個體可識別為患有該疾病或具有該疾病之風險。當參考值表示患有目標疾病之個體群體中如本文所述之fC1-INH的值範圍時，候選者之樣本中的fC1-INH之值落於該範圍內指示候選個體患有目標疾病或具有該目標疾病之風險。

如本文所用，「低於參考值之減小的值」意謂fC1-INH之量低於參考值，諸如對照樣本中的fC1-INH之預定臨限。本文詳細描述對照量。減小的fC1-INH值包括例如比對照樣本之參考值低1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更多的值。

在一些實施方式中，候選個體為具有C1-INH缺乏介導之病症（例如，諸如HAE）之一或多種症狀的人類患者。舉例而言，個體可具有水腫、腫脹（其中該腫脹完全或主要為外周）；蕁麻疹；發紅、疼痛及在不存在感染證據下之腫脹；非組織胺介導之水腫、腫脹復發性發作或其組合。在其他實施方式中，在收集樣本時個體無C1-INH缺乏介導之病症之症狀、無C1-INH缺乏介導之病症之症狀的病史或無C1-INH缺乏介導之病症（諸如HAE）之病史。在又其他實施方式中，個體對抗組織胺療法、皮質類固醇療法或兩者具有抗性。 B.   識別適合之治療

在一些實施方式中，本文所述之檢定方法及套組亦可用於識別用於患有C1-INH缺乏介導之病症（例如I型HAE或II型HAE）或具有患有該病症之風險的個體之適合治療。舉例而言，個體之fC1-INH之量可使用如本文所述之任何方法來量測且將其與fC1-INH之預定值比較。若個體之fC1-INH值處於或低於預定值，則該個體可藉由基於fC1-INH之預定值的治療（例如如本文所述之重組C1-INH治療劑或其他治療劑）來治療。在一些實例中，個體可為進行基於fC1-INH之量之疾病的治療之候選者。

在一些實施方式中，本文所述之方法進一步包含向患有C1-INH缺乏介導之病症（例如HAE）或具有患有該病症之風險的個體投予治療劑。治療劑之非限制性實例包括血漿激肽釋放素（pKal）抑制子（例如艾卡拉肽、拉那蘆單抗）、緩激肽B2受體拮抗劑（例如艾替班特）及C1s抑制子（例如人類血漿源性C1s抑制子）。（ ii ）非臨床應用

此外，本文所述之檢定方法可具有非臨床應用，例如用於研究目的及/或臨床前藥物開發目的。儘管已識別許多與C1-INH缺乏相關之疾病，但有可能其他疾病由類似機制介導或涉及類似組分。在一些實施方式中，本文所述之方法可用以將疾病識別為與C1-INH缺乏相關。在一些實施方式中，本文所述之方法可用以研究疾病之機制（例如探索涉及疾病發展之新型生物學路徑或過程）或進展。

在一些實施方式中，藉由如本文所述之檢定方法確定的fC1-INH之量可用於開發用於與C1-INH缺乏相關之疾病的新型治療劑。舉例而言，如本文所述之fC1-INH之量可在自已投予新型療法（例如基因療法）之個體獲得的樣本中或在自試管內檢定獲得之樣本中量測。在一些實施方式中，fC1-INH量可指示新型治療劑在試管內檢定中之活性或新型治療劑在臨床試驗設置中之功效。III. 用於執行乾燥樣點檢定方法之套組

本文之揭示內容亦提供用於量測如本文所述之fC1-INH之量的套組。如此套組可包含用於收集及製備樣本、自樣本萃取蛋白質之材料；用於量測樣本中之fC1-INH的組分及/或用於檢定樣本中之fC1-INH量的說明書。

在一些實施方式中，套組包含支撐構件，諸如膜片、濾紙或乾燥血液樣點卡。用於該方法之適當支撐構件之選擇將視各種因素而定，諸如待評估的樣本之數量及自樣本萃取蛋白質之方法。

在一些實施方式中，支撐構件為多孔盤，諸如ELISA盤。在一些實施方式中，本文所述之免疫檢定可於高通量平台上進行。在一些實施方式中，多孔盤，例如24孔盤、48孔盤、96孔盤、384孔盤或更多孔之盤可用於高通量免疫檢定。個別免疫檢定可在各孔中並行進行。因此，一般期望使用讀盤器來並行量測多個孔以增加檢定通量。在一些實施方式中，能夠使多孔（例如4、16、24、48、96、384或更多孔）並行成像之讀盤器可用於此平台。

套組亦可包含一或多種如本文所述之緩衝液，但不限於中止用緩衝液、變性用緩衝液及蛋白質萃取緩衝液。緩衝液之實例包括（但不限於）PBS、DPBS、HBSS、HEPES、Tris、Tris-HCl、磷酸鈉、磷酸鉀及氯化鉀。

在一些實施方式中，套組可包含根據本文所述之任何方法的使用說明書。所包括的說明書可包含如何使用套組中所含有的組分用於量測自個體（諸如人類患者）收集之生物樣本中的fC1-INH之量之描述。

與套組之使用相關之說明書通常包括關於各組分之量及用於執行本文所述之方法之適合條件的資訊。套組中之組分可呈單位劑量、整體包裝（例如多劑量包裝）或次單位劑量。本文之揭示內容之套組中提供的說明書典型地為標籤或包裝插頁（例如套組中所包括之紙張）上之書面說明書，但機器可讀說明書（例如磁性或光學儲存磁碟上攜帶之說明書）亦可接受。

標籤或包裝插頁指示套組用於估量一或多個樣本中的fC1-INH之量。可提供說明書用於實踐本文所述之任何方法。在一些實施方式中，套組可包括用於在分析之前運送乾燥樣本之可密封容器（例如Ziploc®袋子）。

本文之揭示內容之套組在適合包裝中。適合包裝包括（但不限於）小瓶、瓶子、罐、軟包裝（例如密封Mylar或塑膠袋）及其類似物。

套組可視情況提供其他組分，諸如說明資訊，諸如對照及/或標準或參考樣本，例如以生成校準曲線。通常，套組包含容器及在容器上或與容器相聯之標籤或包裝插頁。在一些實施方式中，本文之揭示內容提供包含上文所述之套組之內含物的製品。

無需進一步詳細描述，咸信所屬技術領域中具有通常知識者可基於上文描述最大程度地利用本發明。因此，以下特定實施方式應理解為僅為說明性的且無論如何不以任何方式限制本文之揭示內容之其餘部分。本文引用之所有出版物以引用的方式併入用於本文提及之目的或主題。實施例 實施例 1 ： 基於 DBS 之 LC-MS/MS fC1-INH 檢定

此實施例描述基於乾燥血液樣點（DBS）之LC-MS/MS分析，其用於量測血液樣本中之功能性C1-抑制子（fC1-INH）。圖1說明此檢定之例示性流程。

該方法旨在確定人類全血樣本中之fC1-INH量。該方法涉及製備校準標準物、品質控制組（QC）及DBS樣本；自DBS樣本萃取蛋白質；將蛋白質萃取物與補體組分1s（C1s）一起培育、與C1s受質N^α -苯甲氧羰基-Lys-苯甲硫醇酯反應以產生N^α -苯甲氧羰基-L-離胺酸（cbz-Lys）；及隨後使用液相層析-串聯質譜法（LC-MS/MS）量測cbz-Lys。以選擇反應監測（SRM）模式在用於以正離子模式偵測cbz-Lys及內部標準物（Nε-苯甲氧羰基-L-離胺酸-2,6,6-d3）的最佳化條件下操作AB Sciex QTrap 6500質譜儀。 實驗程序：（ i ） 製備校準標準物及品質控制組 （ QC ）

由耗盡C1-INH蛋白質之替代血液製備校準劑及品質控制組（QC）。簡言之，匯集來自健康個體（男性及女性）之新鮮全血並將其在1200 ×g及室溫下離心10 min。丟棄上清液血漿且用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）溶液洗滌所得紅血球一次。不含C1-INH之替代血液藉由將等體積的匯集紅血球與含4.3%牛血清白蛋白（BSA）之PBS混合來製備。為製備校準標準物及QC，將不同濃度之C1-INH溶液摻入替代血液中。（ ii ） 製備 DBS 樣本

在收集全血樣本之後，將最多60 µL等分試樣沈積於DBS卡（903蛋白質保存卡，Whatman）之濾紙樣點上。將DBS卡彎曲以使得背面不與任何表面接觸以防止浸透濾紙之血液損失。使卡乾燥至少3小時且在室溫下儲存。

為了製備校準劑、QC及測試樣本，使用DBS打孔器（GE Health Care Life Science Whatman）打孔3.0 mm孔洞且將DBS樣本轉移至具有500 µL 96孔盤（Eppendorf Protein Lobind）之小瓶。藉由在以1250 rpm操作培育箱中在37℃下用100 µL含0.5% BSA之PBS緩衝液培育3小時來萃取DBS樣本。將所萃取樣本之等分試樣（20 µL）轉移至另一96孔盤且使其與50 µL之於含0.5% BSA之PBS中新鮮製備的0.5 µg/mL C1s溶液混合。在以800 rpm及37℃培育1.5小時之後，添加105 µL受質溶液（N^α -苯甲氧羰基-Lys-苯甲硫醇酯）與內部標準物（Nε-苯甲氧羰基-L-離胺酸-2,6,6-d3）之混合物且藉由在暗處在室溫下培育40 min使酶反應進行。藉由將50 µL之反應溶液轉移至450 µL之含0.1% SDS的MeOH/水（80/20，V/V）使反應中止。在LC-MS/MS分析之前將上文樣本用MeOH/水（80/20，V/V）進一步稀釋200倍。（ iii ） LC-MS/MS 分析

未反應受質、受質產物（分析物，cbz-Lys）及內部標準物之分離於設置為30℃之Waters Acquity UPLC上使用逆相管柱（Waters Xbridge Protein BEH C4，3.5 µm，2.1×50 mm）來達成。流動相A為含0.1%甲酸之水及流動相B為乙腈。流動速率為0.3 ml/min且流動相梯度由以下時間點之間的梯度步長（時間，B%）組成：0 min，4%；0.5 min，4%；3.5 min，12%；3.6 min，70%；4.6 min，70%；4.7 min，4%；5.5 min，4%。自動取樣器溫度設置為4℃，且以局部環路LC注入模式注入3 µL之樣本。於以選擇反應監測（SRM）模式操作之AB Sciex QTrap 6500質譜儀上使用由電噴霧電離所形成的正離子在用於偵測cbz-Lys及內部標準物（Nε-苯甲氧羰基-L-離胺酸-2,6,6-d3）的最佳化設置下採集分析物及內部標準物信號。

最佳化MS參數設置如下：氣簾，20；碰撞氣體，中等；離子噴霧電壓，4000；溫度，550；離子源氣體1，50；離子氣體源2，50；去簇電壓（declustering potential），120；入口電壓，10.0；碰撞能量，26.0；碰撞室出口電壓，12.0。分析物及內部標準物分別用m/z 281.2變為m/z 91.0及m/z 284.2變為m/z 91.0之SRM離子監測。（ iv ）數據分析

分析物及內部標準物之峰面積藉由Analyst軟體確定。用分析物比內部標準物之峰面積比率及標準物中摻入的fC1-INH之濃度，使用SoftMax Pro 7.0構建4參數邏輯校準曲線。樣本中之fC1-INH量係基於以下方程式計算。

（方程式1） 其中y為峰面積比率；x為樣本濃度；A、B、C及D為曲線擬合參數。另外，使用Excel計算準確度及相對標準差（relative standard deviation，RSD）。結果

圖2展示在碰撞誘導之解離（CID）情況下cbz-Lys前驅物離子之碎片化圖譜。選擇m/z 91處之最強峰為用於偵測之產物離子。

圖3顯示cbz-Lys及內部標準物（IS）之離子層析圖，cbz-Lys及內部標準物（IS）來源於（1）作為對照之純淨緩衝溶液；（2）來自由具有最佳化體積比的紅血球與BSA溶液之混合物組成的替代基質的DBS萃取物之酶反應產物；（3）來自來自於健康個體之原始真全血樣本的DBS萃取物之酶反應產物。cbz-Lys及IS展示來自不同樣本來源之可再現保留度。另外，來自純淨溶液及替代血液基質之cbz-Lys峰強度極相似，意味著替代血液基質中之剩餘fC1-INH最少。另一方面，來源於fC1-INH正常之健康血液樣本的cbz-Lys強度顯著降低，表明fC1-INH之存在抑制C1s酶活性。該圖證實在DBS萃取物之酶反應後偵測cbz-Lys之可行性。

量測DBS中之fC1-INH的校準曲線展示於圖4中。

為了估量基於DBS之LC-MS/MS fC1-INH檢定的操作間再現性，收集來自六名單獨個體之匯集血液樣本且在不同的三天使用基於DBS之LC-MS/MS fC1-INH檢定進行分析。檢定之結果展示於表1中。檢定之精確度（CV%約10.3）極好。表 1. 基於 DBS 之 LC-MS/MS fC1-INH 檢定的操作間再現性 匯集之全血（Whole Blood，WB）由六個批次之個體製備

操作日期/編號	量測之濃度（mU/mL）	平均濃度（mU/mL）	同日內SD	同日內CV（%）
2018年11月15日（操作編號1）	559 542 495 557 460 429	507	54.5	10.8
2018年11月16日（操作編號3）	567 502 501 459 455 459	491	43.2	8.8
2018年11月19日（操作編號5）	573 563 604 536 479 583	556	44.0	7.9
異日間平均（mU/mL）	518
異日間SD	53.1
異日間CV（%）	10.3

為估量基於DBS之LC-MS/MS fC1-INH檢定的同日內再現性，將C1-INH以不同濃度摻入紅血球基質中作為品質控制組（定量之下限（lower limit of quantitation，LLOQ）、低、中及高）。隨後使用基於DBS之LC-MS/MS fC1-INH檢定分析樣本。結果顯示在表2中。自檢定獲得之fC1-INH之量對應於摻入樣本中之fC1-INH之量，指示此檢定在使用DBS量測fC1-INH中的精確度。表 2. 基於 DBS 之 LC-MS/MS fC1-INH 檢定的同日內再現性

QC樣本	同日內（n=6）
樣本名稱	樣本基質	標稱濃度（mU/mL）	量測之濃度±S.D. （mU/mL）	R.S.D. （%）	RE（%）
QC LLOQ	紅血球+BSA基質	100	97.9 ± 10.4	10.6	-2.2
QC低	150	136 ±10.4	7.7	-9.3
QC中	750	745 ± 22.0	3.0	-0.7
QC高	1130	1064± 69.4	6.5	-5.8

實施例 2 ： 基於 DBS 之 LC-MS/MS fC1-INH 檢定的用途

本文描述用於HAE患者之診斷的能夠量測DBS中之fC1-INH活性的新型檢定之開發及驗證。遵循管理準則及行業最佳慣例驗證該檢定。來自HAE患者之DBS樣本展示顯著較低的fC1-INH活性，允許區分HAE患者與健康個體。 實驗程序 （ i ） 材料

N^α -苯甲氧羰基-Lys-苯甲硫醇酯鹽酸鹽（Z-Lys-SBzl·HCl，C1s受質）及N^ε -苯甲氧羰基-L-離胺酸-2,6,6-d₃ （N^ε -CBZ-L-離胺酸-d₃ ，內部標準物）分別購自BACHEM（美國，加利福尼亞州，托蘭斯）及CDN Isotopes（加拿大，魁北克）。重組人類補體組分C1s（C1s）係購自R&D System（美國，明尼蘇達州，明尼阿波利斯）。重組C1-INH（CINRYZE®）為內部獲得。牛血清白蛋白（BSA）獲自Americanbio（美國，馬薩諸塞州，納蒂克）。十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液（10%）為Sigma （美國，密蘇里州，聖路易斯）之產品。500 µL 96孔盤（Eppendorf Protein LoBind）係購自Eppendorf（德國，漢堡）。3 mm打孔器及Whatman #903蛋白質保存卡係購自GE Health Care Life Science（英國，白金漢郡，小查爾方頓）。乾燥劑（1 g）及生物危害品袋係獲自VWR（美國，賓夕法尼亞州，拉德納）。用於研究之所有其他化學物質均為最高等級且未經進一步純化即使用。（ ii ）製備溶液

藉由用於PBS緩衝液中製備之0.5% BSA溶液將C1s儲備溶液（367 µg/mL）稀釋734倍來新鮮製備C1s工作溶液（0.5 µg/mL）。藉由將Z-Lys-SBzl·HCl溶解於DMSO中至最終濃度為10 mM來製備受質儲備溶液。藉由將N^ε -CBZ-L-離胺酸-d₃ 溶解於含5 mM Na₂ CO₃ 之甲醇/水（50/50）溶液中來製備內部標準物（IS）儲備溶液（2.5 mM）。受質、C1s及IS儲存溶液在使用之前在-80℃下儲存。含有0.83 mM之Z-Lys-SBzl·HCl及33.3 µM之N^ε -CBZ-L-離胺酸-d₃ 的受質-IS混合液於PBS緩衝液中新鮮製備。SDS溶液（0.1%）藉由將10% SDS用甲醇/水（80/20，V/V）溶液稀釋100倍來製備。（ iii ） 製備 DBS 樣本

提供來自24名先前經診斷之HAE患者的全血與患者之書面知情同意書。將血液吸入真空管EDTA管且在4℃下儲存。在收集之24小時內，將管子倒置若干次以使血細胞再懸浮，且將60 μL等分試樣點樣至濾紙樣點上。來自103名健康個體之正常人類全血購自BIOIVT（美國，紐約，韋斯特伯里）。在室溫下將血液樣點乾燥至少3小時且將其在-20℃下儲存於密封的生物危害品袋中，每個袋子中一份乾燥劑。（ iv ） 製備不含 C1-INH 之血液作為替代基質

為獲得用於製備校準曲線及品質控制（QC）的耗盡fC1-INH之替代基質，如實施例1中所述製備六個不同批次之人類全血樣本（三批男性及三批女性，每個10 mL）。簡言之，在室溫下以1200 x g離心全血10 min。移除上清液血漿，將紅血球用5 mL PBS溶液洗滌以移除剩餘血漿及fC1-INH。藉由在室溫下以1200 x g離心10 min再次分離紅血球。匯集所得不含fC1-INH之紅血球。替代血液基質藉由將相等體積之匯集的紅血球與於PBS緩衝液中製備的4.3% BSA混合來製備。（ v ） 在 DBS 中製備校準標準物及 QC 樣本

校準標準物（校準劑）藉由將不同濃度之fC1-INH（CINRYZE®）摻入至替代基質中來製備。標稱fC1-INH濃度分別為100、200、300、500、1000及1500 mU/mL。於替代基質或匯集的人類全血中製備品質控制（QC）樣本。在替代基質中製備定量之下限（LLOQ）QC（100 mU/mL）及低QC（150 mU/mL）。藉由考量內源性C1-INH量（EL）來在匯集的全血中製備所有其他QC：低-中QC（EL）、中QC （EL+200 mU/mL）、中-高QC（EL+500 mU/mL）及高QC（EL+800 mU/mL）。在DBS中製備校準劑及QC遵循上文所述相同程序。（ vi ）樣本萃取及酶反應

萃取樣本及如實施例1中所述執行酶反應。簡言之，使用3 mm打孔器切割DBS圓盤且將其轉移至500 µL 96孔盤。藉由於熱混合器培育箱中以1250 rpm渦旋在37℃之溫度下在100 µL含0.5% BSA之PBS中培育3小時來萃取圓盤中之蛋白質。以4000 rpm離心該盤3 min，且隨後將20 µL萃取物轉移至另一含有50 µL C1s工作溶液之96孔盤。此後以800 rpm在37℃下培育1.5小時。隨後，將105 µL受質-內部標準物（受質-IS）混合液添加至上文溶液中，隨後以800 rpm在室溫下在暗處培育40 min。藉由轉移50 µL溶液至450 µL含0.1% SDS之MeOH/水（80/20，v/v）來使反應終止。在LC-MS/MS分析之前用MeOH/水（80/20，v/v）將所得樣本進一步稀釋200倍。（ vii ） LC-MS/MS 分析

如實施例1中所述藉由LC-MS/MS分析反應樣本。簡言之，於Waters Acquity UPLC系統上使用管柱溫度維持在30℃之逆相管柱（Waters Xbridge Protein BEH C4，3.5 µm，2.1×50 mm）達成受質（Z-Lys-SBzl·HCl）、分析物（N^α -苯甲氧羰基-L-離胺酸，cbz-Lys）及IS（N^ε -CBZ-L-離胺酸-d₃ ）之分離。流動相A為含0.1%甲酸之水及流動相B為乙腈。流動速率為0.3 mL/min且流動相梯度如下（時間，B%）：0 min, 4%；0.5 min，4%；3.5 min，12%；3.6 min，70%；4.6 min，70%；4.7 min，4%；5.5 min，4%。自動取樣器設置為4℃，且使用局部環路LC注入模式注入3.0 µL之樣本。於以選擇反應監測（SRM）模式操作之AB Sciex QTrap 6500質譜儀上使用正離子來定量分析物及IS。最佳化MS參數如下：氣簾，20；碰撞氣體，中等；離子噴霧電壓，4000；溫度，550；離子源氣體1，50；離子氣體源2，50；去簇電壓，120；入口電壓，10.0；碰撞能量，26.0；碰撞室出口電壓，12.0。分析物及IS分別使用m/z 281.2變為m/z 91.0及m/z 284.2變為m/z 91.0之SRM離子對監測。（ viii ）符合目的檢定驗證

符合目的檢定驗證遵循生物標誌物及基於DBS之診斷性檢定的行業最佳慣例（1-6）。在各種條件下驗證方法之校準曲線、準確度、精確度、基質作用、血容比、萃取、取樣位置及穩定性。

藉由每天分析以每種濃度水平處於替代基質及原始真基質中的QC樣本之六個複本持續三天來估量準確度（相對誤差或RE%）及精確度（RSD%）。依序計算同日內及異日間平均準確度及精確度。藉由在運行定量之上限（ULOQ）校準劑之後注入空白溶液來檢驗分析物殘留。

使用來自四名健康個體之全血來估量血容比水平對檢定效能之影響。簡言之，藉由以1200 × g離心10 min使血漿與紅血球分離。隨後，混合不同體積之血漿與紅血球以分別達成25%、45%、60%及75%之血容比水平。將來源於45%血容比之DBS樣本用作對其他血容比水平下之C1-INH活性進行歸一化的參考。

藉由使用來自一個樣點上之3-6個打孔位置及來自總共四個不同DBS樣點的低及中-高QC樣本來評估打孔位置對DBS樣點及DBS樣點之偏差的影響（圖9，表3）。在替代基質中製備低QC而在匯集的全血中製備中-高QC。表 3.DBS 均質性測試之概述

	QC樣本
替代基質中之低QC	原始真基質中之中-高QC
標稱濃度（mU/mL）	150	1020
基質	用BSA再提供之紅血球	匯集的全血
總複本，N	18	18
量測之濃度± S.D.（mU/mL）	143 ± 13.1	915 ± 75.0
R.S.D（%）	9.2	8.2
RE（%）	-4.6	-10.3

使用以100、600及1000 mU/mL在替代基質中製備之QC，藉由比較預摻入型樣本與後摻入型樣本之結果來估量萃取效率。藉由在製備DBS卡之前將C1-INH摻入替代基質中來製備預摻入型樣本。另一方面，藉由將相同濃度之C1-INH（3.3 µL，對應於3.0 mm孔中之濕血液體積）摻入來源於空白替代基質之DBS萃取物中來製備後摻入型樣本。

使用等體積之來自六名健康個體（3名男性及3名女性）之匯集的全血來測試C1-INH活性之全血穩定性。在添加至Whatman #903蛋白質保存卡之前將樣本在4℃下儲存長達7天。相似地，將由匯集的全血製備之DBS樣本分別在45℃下儲存3天及在室溫下儲存134天以估量在運送及儲存條件下之穩定性。（ ix ）數據分析

如實施例1中所述執行數據分析。簡言之，分析物比內部標準物之峰面積比率藉由AB Sciex Analyst（1.6.3）來確定。用峰面積比率及摻入之C1-INH的濃度，使用SoftMax Pro 7.0構建4參數邏輯校準曲線。基於以下方程式計算樣本濃度：

（方程式1） 其中y為峰面積比率；x為樣本濃度；A、B、C及D為曲線擬合參數。另外，使用Excel計算平均值、準確度（RE%）、標準差及相對標準差（RSD%）。 結果 整體策略

如圖5中所示開發LC-MS/MS檢定以量測來源於乾燥血液樣點之樣本中的酶反應產物cbz-Lys。檢定由以下步驟組成：（1）自DBS卡萃取C1-INH；（2）使C1-INH與過量C1s結合；（3）使未結合之C1s與其受質反應；及（4）對酶反應產物cbz-Lys進行LC-MS/MS分析。在驗證前操作期間最佳化檢定條件，諸如C1s與其受質之相對濃度、C1s與fC1-INH之間的結合時間及溫度、C1s與其受質之間的酶反應時間及溫度以及LC-MS/MS條件。校準基質及校準曲線

由匯集的人類全血製備C1-INH耗盡之血液基質以便量測C1-INH活性低於正常對照之HAE患者中之C1-INH活性。C1-INH為循環蛋白質且在離心以使紅血球離心沈降之後與血漿上清液保持在一起。隨後用BSA溶液補給紅血球以模擬原始真全血中之血漿蛋白質濃度。與相同體積之紅血球混合的4.3%之BSA（43 mg/mL）引起與原始真全血相似的黏度，如由濾紙中之相同樣點大小所展現。如圖6A及6B中所展示，C1-INH之完全耗盡藉由來自替代基質及空白對照之相同分析物信號來確認，其意味著替代基質中不存在fC1-INH活性。相比之下，在匯集的健康血液（圖6C）及摻有500 mU/mL之C1-INH的匯集的健康血液（圖6D）中存在C1-INH依賴性信號衰減。

圖7藉由繪製分析物信號對比摻入替代基質中之六個不同C1-INH濃度（mU/mL）的圖，使用四參數邏輯曲線擬合顯示典型校準曲線。曲線展示介於100至1500 mU/mL之可工作範圍。檢定驗證結果證明六點校準曲線符合預設準則：（1）在每個濃度水平下，對於至少一半的校準劑而言相對誤差（RE%）應≤20%，除對於LLOQ及ULOQ校準劑，相對誤差≤25%以外；（2）校準劑之總數量之≥75%必須包括於校準曲線中；（3）驗證操作失敗應不超過連續兩次。在通過分析操作的14個中之13個，所有校準劑之平均操作間準確度範圍為-1.4%至5.9%（表4）。表 4. 校準結果之概述

檢定精確度及準確度

使用於替代基質及原始真全血中製備之QC樣本評估檢定精確度及準確度。藉由將fC1-INH摻入替代基質中分別至100 mU/mL及150 mU/mL之最終濃度來製備LLOQ QC及低QC。將匯集的全血用作低-中QC，然而中、中-高及高QC樣本藉由將fC1-INH摻入匯集的全血中來製備。其標稱濃度為平均內源性C1-INH濃度（518 mU/mL，n=18）與摻入的fC1-INH之濃度的總和。如表5中所示，同日內精確度及準確度範圍為4.4%至11.6%及-11.1%至-2.1%，且異日間精確度及準確度分別為8.1%至13.1%及-10.3%至0.9%。表 5. 同日內及異日間精確度及準確度之概述

QC樣本	同日內（n=6）	異日間（n=18）
QC名稱	樣本基質	標稱濃度 （mU/mL）	量測之濃度± S.D. （mU/mL）	R.S.D. （%）	RE （%）	量測之濃度± S.D. （mU/mL）	R.S.D. （%）	RE （%）
LLOQ QC	替代基質	100	97.9 ± 10.4	10.6	-2.2	99.1 ± 9.40	9.5	0.9
低QC	150	134 ± 5.3	4.0	-10.8	143 ±13.1	9.2	-4.6
低-中QC （EL）	匯集的全血	518	507 ±54.5	10.8	-2.1	518 ± 53.1	10.3	N/A
中QC （EL+200 mU/mL）	718	639 ± 73.9	11.6	-11.1	651 ± 52.7	8.1	-9.4
中-高QC （EL+500 mU/mL）	1020	991 ±44.1	4.4	-2.8	915 ± 75.0	8.2	-10.3
高QC（EL+800 mU/mL）	1320	1187 ±118	10.0	-10.1	1250 ± 163	13.1	-5.5

血容比水平之影響

充分記載了全血之血容比水平影響血液在濾紙中之稀釋且由此影響DBS樣點大小，導致檢定偏差（1-3,6,7）。隨著血容比水平提高，DBS樣本之樣點面積減小。視性別及年齡而定，全血中之血容比水平在28%至67%範圍內（7）。在四個血容比水平25%、45%、60%及75%下探究血容比對檢定效能之影響，其中45%血容比水平用作對照。fC1-INH活性展示在乾燥血液樣點中與血容比水平之線性相關性（表6）。30%-60%之間的血容比水平應對fC1-INH活性量測具有最小影響（RE＜20%）。表 6. 血容比水平對 DBS 中量測之 fC1-INH 活性的影響

樣本標識	血容比水平（%）	量測之濃度± S.D.（mU/mL，n=4）	理論濃度（mU/mL）	R.S.D. （%）	RE%
HMN13491	25	572 ± 76.1	851	13.3	-32.8
45	624 ±32.3	624	5.2	0
60	463 ±81.8	454	17.7	2.00
75	406 ±16.6	284	4.1	43.0
HMN13492	25	793 ± 74.4	1055	9.4	-24.8
45	774 ±95.3	774	12.3	0
60	643 ± 42.5	563	6.6	14.2
75	502 ± 21.1	352	4.2	42.6
HMN13493	25	835 ± 139	1189	16.7	-29.8
45	872 ± 123	872	14.1	0
60	582 ± 50.9	634	8.7	-8.20
75	478 ± 27.0	396	5.6	20.7
HMN13494	25	766 ±83.6	949	10.9	-19.3
45	696 ±66.1	696	9.5	0
60	587 ± 48.0	506	8.2	16.0
75	497 ± 34.2	316	6.9	57.3

C1-INH 活性之打孔位置

基於DBS之檢定中的另一關注點為打孔位置對分析物量測之影響（1, 6, 8）。為檢驗DBS卡上之打孔位置對C1-INH活性之影響，自同一個體之四個樣點收集來自中心及外周之孔的總共18份複製樣本且分析低QC及中-高QC樣本。精確度及準確度均在15%內，意味著打孔位置並不影響C1-INH活性量測（表4）。萃取效率

使用於替代基質中製備之QC估量C1-INH之萃取效率。在100、600及1000 mU/mL之QC濃度下平均萃取效率分別為48.8%、65.9%及58.2%（表7）。將校準曲線用於樣本測試期間之每次操作，萃取效率之偏差將不影響檢定準確度。表 7.DBS 樣本中 C1-INH 之萃取效率

濃度（mU/mL）	萃取效率± S.D. （%，n=4）	R.S.D. （%）
100	48.8 ± 4.92	10.1
600	65.9 ± 3.93	6.0
1000	58.2 ± 3.45	5.9

全血及DBS中之fC1-INH穩定性

在全血中估量fC1-INH之穩定性。先前報告證明fC1-INH在室溫下在患者及健康個體中均穩定長達三天（9）。在4℃下儲存七天之後，匯集的健康血液中之fC1-INH活性具有最小變化（表8）。為了測試DBS中之fC1-INH穩定性，在室溫及45℃下將QC對照放入具有乾燥劑包裝之密閉袋子中。在來自各卡之不同孔中量測C1-INH活性且在45℃下儲存3天之後及在室溫下儲存134天時展示最小損失（＜15%）（表8）。此等結果證明fC1-INH可在環境溫度下在DBS中運送及儲存而不損失活性。表 8. 在不同溫度下儲存之全血及 DBS 中的 fC1-INH 活性之穩定性

基質	儲存溫度（℃）	儲存天數	量測之濃度± S.D. （mU/mL）	R.S.D. （%）	RE （%）
全血	4℃	0 5 7	489±54.2（n=4） 497±64.0（n=4） 473±33.8（n=4）	11.1 12.9 7.2	N/A 1.6 -3.3
DBS	室溫	0 134	512±56.2 （n=18） 441±53.9（n=6）	11 12.2	N/A -13.8
室溫 45℃	0 3	407±13.6（n=6） 383±36.8（n=6）	3.3 9.6	N/A -5.8

在於4℃下放入自動取樣器中兩天之後再注入經處理樣本以評估再注入穩定性。結果展示精確度及準確度符合預定接受準則（表9）。另外，分析物殘留不可偵測（數據未展示）。表 9. 再注入穩定性測試之概述

QC取樣器	同日內（n=6）
樣本名稱	樣本基質	標稱濃度（mU/mL）	量測之濃度± S.D. （mU/mL）	R.S.D. （%）	RE （%）
低QC	紅細胞基質	150	145 ± 13.9	9.6	-3.1
低-中QC（匯集的全血，EL）	匯集的全血	518	488 ± 44.3	9.1	-5.7
中QC（EL+200 mU mL）	718	645 ± 52.8	8.2	-10.2
中-高QC（EL+500 mU/mL）	1020	867 ± 48.5	5.6	-15.0
高QC （EL+800 mU-mL）	1320	1200 ± 74.4	6.2	-8.8

來自健康及 HAE 個體之 DBS 樣本之分析

使用經驗證檢定，在自103名健康個體及24名HAE患者（9名男性及15名女性）收集之DBS樣本中量測fC1-INH活性且結果呈現於圖8中。對於健康個體組，fC1-INH活性範圍為311至1090 mU/mL，平均活性及標準差（SD）分別在573及135 mU/mL。儘管如此，除一個個體之C1-INH為158 mU/mL以外，所有測試的HAE個體之C1-INH活性低於LLOQ（100 mU/mL）。確立303 mU/mL之截斷值（平均值-2xSD），其能夠完全區分健康個體與HAE個體。討論

C1-INH用以調節廣泛範圍的抑制性生物活性，包括補體、接觸、凝血及纖維蛋白溶解系統（10-12）。作為激肽釋放酶-激肽級聯中之三種酶（因子XIIa、因子XIIf及血漿激肽釋放素）的關鍵抑制子，正常fC1-INH量防止緩激肽（誘導HAE發作之促發炎介體）的過度產生。缺乏fC1-INH活性導致接觸系統之復發性活化、生成過量血漿激肽釋放素（pKal）（一種活性蛋白水解酶），該血漿激肽釋放素隨後分解高分子量激肽原（high-molecular-weight kininogen，HMWK）以釋放緩激肽（13-15）。當前，在C1-INH SERPING1基因中已識別超過450個突變且許多與HAE患者中之fC1-INH缺乏相關（16）。

儘管存在不同類型之HAE，但其特徵均在於缺乏C1-INH功能。典型地，HAE患者中之fC1-INH量在正常值之5-30%之間，且減弱的C1-INH活性用作HAE診斷之最重要實驗室參數（9）。fC1-INH活性之習知檢定藉助於C1s與其人工受質Z-Lys-SBzl·HCl之間反應以產生cbz-Lys及硫基甲基苯來間接量測fC1-INH活性。在用5,5'-二硫基雙-(2-硝基苯甲酸)（DTNB）衍生化之後藉由發色檢定來量測硫基甲基苯（9）。內源性或摻入的C1-INH之存在將抑制酶反應，因此，反應產物之形成與C1-INH活性成反比。儘管習知檢定在血漿或血清樣本中有力區分健康個體與HAE個體，但由於全血中紅血球之檢定干擾，其在DBS中之使用受限制。LC-MS/MS檢定相比於習知發色檢定擁有獨特優點。首先，發色檢定係基於反應之兩個步驟，然而LC-MS/MS檢定量測C1s反應之直接產物，因此檢定偏差可降低。其次，在檢定中使用內部標準物（IS）亦有助於校正樣本製備及分析期間的分析偏差。第三，於不含C1-INH之替代基質中製備的校準曲線及QC包括於每次操作中以進一步提高檢定之準確度及再現性。考慮到健康個體中C1-INH活性之較寬範圍、HAE患者中之受限C1-INH活性偏移（正常活性之5-30%）及酶動力學反應之狹窄範圍，最小化檢定偏差可為準確量測C1-INH活性之關鍵因素。

在酶活性檢定中，分析物之校準曲線通常在純淨緩衝溶液而非原始真基質中製備，且檢定效能藉由QC樣本來監測。儘管此法較簡單，但其不能容易地應用於C1-INH活性量測，因為酶反應進行地太快速，使得反應條件之輕微偏移將影響分析結果且由此影響患者之準確診斷。在此等研究中採用已在生物標記物檢定中之校準劑及QC之製備中廣泛用作含有內源性分析物之原始真基質的「替代基質」之概念（15）。替代基質應耗盡分析物但在消化效率、電離作用及萃取產率方面接近原始真基質。將來源於全血之替代基質用於製備校準曲線及QC對準確評估C1-INH活性較低的患者樣本中之酶反應至關重要。用此法，達到100至1500 mU/mL之間的檢定範圍。此外，自替代基質及原始真全血中製備之QC樣本均達成極好的準確度及精確度，表明檢定條件下兩種基質之並行性。

本文所述之LC-MS/MS檢定展示小於15%之平均同日內及異日間變化及可忽略的樣本之間的殘留。另外，C1-INH活性量測與DBS內之打孔位置無關，對DBS中之一些其他分析物而言，情況可能並非如此（1）。然而，檢定準確度可能受血容比水平影響，且在小於30%或超過60%之血容比水平的情況下，解釋來自樣本之測試結果應多加注意。

在樣本運送及儲存期間在DBS中具有穩定的分析物量較重要。全血中之C1-INH在4℃下穩定7天。在DBS中，當在45℃下儲存時穩定長達3天且當在室溫下儲存時穩定長達134天。即使在發展中國家，此對於樣本收集、運送至集中實驗室及實驗室測試及再測試之全部持續時間而言足夠。

在103名健康個體中量測之C1-INH活性展示平均活性為573 mU/mL且標準差為135 mU/mL之常態分佈。在24名HAE患者中，23名展示＜100 mU/mL C1-INH活性，且具有最高C1-INH活性158 mU/mL之HAE樣本對應於平均正常活性之27.6%。數據支持來自健康個體之樣本與對應的來自患有HAE之患者之樣本之間的明確區別。

總之，本文描述用於DBS樣本中之fC1-INH活性的穩健檢定。該檢定提供診斷HAE患者之優良再現性及準確度。簡單樣本收集及長期運送及儲存穩定性擴展診斷性測試之可用性，尤其在進入配備充分之臨床實驗室受限制或不能進入配備充分之臨床實驗室的地方。該檢定展示在基本上於世界範圍內改變HAE診斷之算法的極大潛力。參考文獻 1. Holub M, Tuschl K, Ratschmann R, Strnadova KA, Muhl A, Heinze G, 等人 Influence of hematocrit and localisation of punch in dried blood spots on levels of amino acids and acylcarnitines measured by tandem mass spectrometry. Clin Chim Acta 2006;373:27-31. 2. De Jesus VR, Zhang XK, Keutzer J, Bodamer OA, Muhl A, Orsini JJ, 等人 Development and evaluation of quality control dried blood spot materials in newborn screening for lysosomal storage disorders. Clin Chem 2009;55:158-64. 3. de Vries R, Barfield M, van de Merbel N, Schmid B, Siethoff C, Ortiz J, 等人 The effect of hematocrit on bioanalysis of dbs: Results from the ebf dbs-microsampling consortium. Bioanalysis 2013;5:2147-60. 4. Lee JW, Devanarayan V, Barrett YC, Weiner R, Allinson J, Fountain S, 等人 Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement. Pharm Res 2006;23:312-28. 5. McDade TW. Development and validation of assay protocols for use with dried blood spot samples. Am J Hum Biol 2014;26:1-9. 6. Timmerman P, White S, Globig S, Ludtke S, Brunet L, Smeraglia J. Ebf recommendation on the validation of bioanalytical methods for dried blood spots. Bioanalysis 2011;3:1567-75. 7. Denniff P, Spooner N. The effect of hematocrit on assay bias when using DBS samples for the quantitative bioanalysis of drugs. Bioanalysis 2010;2:1385-95. 8. Cobb Z, de Vries R, Spooner N, Williams S, Staelens L, Doig M, 等人 In-depth study of homogeneity in DBS using two different techniques: Results from the EBF DBS-microsampling consortium. Bioanalysis 2013;5:2161-9. 9. Wagenaar-Bos IG, Drouet C, Aygoren-Pursun E, Bork K, Bucher C, Bygum A, 等人 Functional C1-inhibitor diagnostics in hereditary angioedema: Assay evaluation and recommendations. J Immunol Methods 2008;338:14-20. 10. Bork K, Davis-Lorton M. Overview of hereditary angioedema caused by C1-inhibitor deficiency: Assessment and clinical management. Eur Ann Allergy Clin Immunol 2013;45:7-16. 11. Csuka D, Veszeli N, Varga L, Prohaszka Z, Farkas H. The role of the complement system in hereditary angioedema. Mol Immunol 2017;89:59-68. 12. Ratnoff OD, Pensky J, Ogston D, Naff GB. The inhibition of plasmin, plasma kallikrein, plasma permeability factor, and the C'1r subcomponent of the first component of complement by serum C'1 esterase inhibitor. J Exp Med 1969;129:315-31. 13. Nzeako UC, Frigas E, Tremaine WJ. Hereditary angioedema: A broad review for clinicians. Arch Intern Med 2001;161:2417-29. 14. Bernstein JA, Moellman J. Emerging concepts in the diagnosis and treatment of patients with undifferentiated angioedema. Int J Emerg Med 2012;5:39. 15. Zhang G, Sexton DJ, Faucette RR, Qiu Y, Wu J. 2d-lc-ms/ms to measure cleaved high-molecular-weight kininogen in human plasma as a biomarker for C1-INH-HAE. Bioanalysis 2017;9:1477-91. 16. Johnsrud I, Kulseth MA, Rodningen OK, Landro L, Helsing P, Waage Nielsen E, Heimdal K. A nationwide study of norwegian patients with hereditary angioedema with C1 inhibitor deficiency identified six novel mutations in SERPING1. PLoS One 2015;10:e0131637. 17. Maurer M, Magerl M, Ansotegui I, Aygoren-Pursun E, Betschel S, Bork K, 等人 The international wao/eaaci guideline for the management of hereditary angioedema-the 2017 revision and update. Allergy 2018;73:1575-96. 18. Li HH, Busse P, Lumry WR, Frazer-Abel A, Levy H, Steele T, 等人 Comparison of chromogenic and ELISA functional C1 inhibitor tests in diagnosing hereditary angioedema. J Allergy Clin Immunol Pract 2015;3:200-5. 19. Ganz N, Singrasa M, Nicolas L, Gutierrez M, Dingemanse J, Dobelin W, Glinski M. Development and validation of a fully automated online human dried blood spot analysis of bosentan and its metabolites using the sample card and prep dbs system. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2012;885-886:50-60. 20. Holub M, Tuschl K, Ratschmann R, Strnadova KA, Muhl A, Heinze G, 等人 Influence of hematocrit and localisation of punch in dried blood spots on levels of amino acids and acylcarnitines measured by tandem mass spectrometry. Clin Chim Acta 2006;373:27-31. 21. Matern D, Oglesbee D, Tortorelli S. Newborn screening for lysosomal storage disorders and other neuronopathic conditions. Dev Disabil Res Rev 2013;17:247-53. 22. Mokhtariye A, Hagh-Nazari L, Varasteh AR, Keyfi F. Diagnostic methods for lysosomal storage disease. Rep Biochem Mol Biol 2019;7:119-28. 23. Zhang XK, Elbin CS, Chuang WL, Cooper SK, Marashio CA, Beauregard C, Keutzer JM. Multiplex enzyme assay screening of dried blood spots for lysosomal storage disorders by using tandem mass spectrometry. Clin Chem 2008;54:1725-8. 24. Olivova P, van der Veen K, Cullen E, Rose M, Zhang XK, Sims KB, 等人 Effect of sample collection on alpha-galactosidase an enzyme activity measurements in dried blood spots on filter paper. Clin Chim Acta 2009;403:159-62.其他實施方式

本說明書中揭示之所有特徵可以任何組合形式組合。本說明書中揭示之各特徵可經服務相同、等效或類似目的之替代性特徵替換。因此，除非另外明確說明，否則所揭示之各特徵僅為一系列通用等效或類似特徵之一個實例。

根據以上描述，所屬領域中具有通常知識者可易於確定本發明之基本特徵，且在不脫離本發明之精神及範疇的情況下可對本發明作出各種改變及修改以使其適應各種用途及條件。因此，其他實施方式亦屬於申請專利範圍內。等效物

儘管本文中已描述及說明若干發明性實施方式，但所屬領域中具有通常知識者將容易設想多種其他方法及/或結構來執行本文所描述之功能及/或獲得本文所描述之結果及/或一或多種優點，且如此變化及/或修改中之每一者視為屬於本文所描述之本發明實施方式之範疇內。更一般而言，所屬領域中具有通常知識者將容易地理解，本文所描述之所有參數、尺寸、材料及組態意欲為例示性且實際參數、尺寸、材料及/或組態將視使用發明性教示內容之一或多種特定應用而定。所屬領域中具有通常知識者將認識到或使用不多於常規實驗便能夠確定本文所描述之特定發明性實施方式的許多等效物。因此，應瞭解前述實施方式僅藉助於實例呈現及在所附申請專利範圍及其等效物之範疇內，發明性實施方式可以與特定描述及所主張不同之方式實踐。本文之揭示內容之發明性實施方式係關於本文所述之各個別特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法。另外，若如此特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法相互間無不一致，則兩種或超過兩種如此特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法之任何組合均包括於本文之揭示內容之發明性範疇內。

如本文中所定義及使用之所有定義應理解為相對於辭典定義、以引用之方式併入的文獻中的定義及/或所定義術語之普通含義，以本文為準。

本文所揭示之全部參考文獻、專利及專利申請案根據各自所引述之主題以引用之方式併入，該主題在一些情況下可涵蓋文件之全部內容。

除非指示截然相反，否則如本文在說明書及申請專利範圍中所用之不定冠詞「一（a/an）」應理解為意謂「至少一個」。

如本文在說明書及申請專利範圍中所用之片語「及/或」應理解為意謂如此結合之要素的「任一者或兩者」，亦即，在一些情況下結合地存在且在其他情況下未結合地存在的要素。使用「及/或」列出之多個要素應以相同方式解釋，亦即，如此結合之「一或多個」要素。可視情況存在除了藉由「及/或」條項所特定識別之要素以外的其他要素，無論與特定識別之彼等要素相關或不相關。因此，作為一非限制性實例，提及「A及/或B」在結合諸如「包含」等開放式措辭使用時，在一個實施方式中，可僅指A（視情況包括除B以外之要素）；在另一實施方式中，可僅指B（視情況包括除A以外之要素）；在又一實施方式中，可指A及B兩者（視情況包括其他要素）；等。

如本文在說明書及申請專利範圍中所用，「或」應理解為具有與上文所定義之「及/或」相同的含義。舉例而言，當分開清單中之項目時，「或」或「及/或」應解釋為包括性的，亦即，包括一些或一列要素及（視情況）其他未列出項目的至少一個以及多於一個。僅指示截然相反的術語，諸如「中之僅一者」或「中之恰好一者」或當用於申請專利範圍中時「由……組成」，將指包括一些或一列要素中之恰好一個要素。一般而言，當置於諸如「任一」、「中之一者」、「中之僅一者」或「中之恰好一者」的排他性術語之前時，如本文所用之術語「或」應僅解釋為指示排他性替代方案（亦即「一者或另一者但非二者皆」）。當用於申請專利範圍中時，「主要由……組成」應具有如其在專利法律領域中所使用之普通含義。

如本文在說明書及申請專利範圍中所用，關於一列一或多個要素之片語「至少一個」應理解為意謂由要素之清單中之任何一或多個要素中選出的至少一個要素，但未必包括要素之清單內具體列出的每一及每個要素中之至少一者，且未必排除要素之清單中之要素的任何組合。此定義亦允許可視情況存在除片語「至少一個」所指的要素之清單內具體識別的要素以外的要素，而無論與具體識別的彼等要素相關或不相關。因此，作為一非限制性實例，「A及B中之至少一者」（或等效地「A或B中之至少一者」或等效地「A及/或B中之至少一者」）在一個實施方式中可指至少一個（視情況包括多於一個）A而不存在B（且視情況包括除了B以外的要素）；在另一實施方式中，指至少一個（視情況包括多於一個）B而不存在A（且視情況包括除了A以外的要素）；在又一實施方式中，指至少一個（視情況包括多於一個）A及至少一個（視情況包括多於一個）B（且視情況包括其他要素）；等等。

亦應理解，除非指示截然相反，否則在本文所主張之包括多於一個步驟或操作之任何方法中，該方法之步驟或操作之次序無需侷限於敍述該方法之步驟或操作之順序。

無

[ 圖 1] 為說明用於分析C1s產物（cbz-Lys）之例示性基於乾燥血液樣點（DBS）之fC1-INH液相層析-串聯質譜法（LC-MS/MS）檢定的示意圖。 [ 圖 2] 為說明在碰撞誘導之解離（collision-induced dissociation，CID）情況下cbz-Lys母離子之碎片化圖譜的例示性離子層析圖。選擇m/z 91處之最強峰為用於偵測之產物離子。 [ 圖 3] 包括來源於以下者的展示cbz-Lys及內部標準物之例示性離子層析圖：作為對照之純淨緩衝溶液（子圖（1））；來自由具有最佳化體積比的紅血球與BSA溶液之混合物組成的替代基質的DBS萃取物之酶反應（子圖（2））；及自來自於健康個體之原始真全血樣本的DBS萃取物之酶反應（子圖（3））。 [ 圖 4] 為展示DBS中fC1-INH之量測的校準曲線。 [ 圖 5] 為說明用於量測C1s產物（N^α -苯甲氧羰基-L-離胺酸；cbz-Lys）之例示性基於乾燥血液樣點（DBS）之fC1-INH液相層析-串聯質譜法（LC-MS/MS）檢定的示意圖。 [ 圖 6A-6D] 展示代表性樣本之例示性離子層析圖。圖6A展示作為對照之純淨緩衝溶液中之cbz-Lys及內部標準物。圖6B展示空白替代基質中之cbz-Lys及內部標準物。圖6C展示匯集的原始真血液中之cbz-Lys及內部標準物。圖6D展示匯集的摻有500 mU/mL C1-INH之健康血液中之cbz-Lys及內部標準物。mU/mL為功能性C1-INH量之毫單位/毫升。 [ 圖 7] 為展示DBS中fC1-INH之量測的代表性校準曲線。 [ 圖 8] 為展示來自健康個體（n=103）及HAE患者（n=24）之樣本中的fC1-INH量之曲線圖。mU/mL為功能性C1-INH量之毫單位/毫升。 [ 圖 9] 為展示具有取自不同位置之孔（N=3或=6）之DBS樣本（樣點A-D）用於分析的相片。

Claims (21)

1. 一種用於測定樣本中功能性C1-酯酶抑制子（functional C1-esterase inhibitor，fC1-INH）之量之方法，該方法包含： （i）將來自個體之血液樣本點樣於支撐構件上； （ii）將該支撐構件上之該血液樣本乾燥以形成乾燥血液樣點； （iii）自來自（ii）之該乾燥血液樣點萃取蛋白質；及 （iv）量測（iii）中所萃取之蛋白質中的fC1-INH之量（若存在）。
2. 如請求項1之方法，其中量測fC1-INH之量包含 （a）將所萃取蛋白質與補體組分1s（C1s）及C1s受質一起培育（視情況係依序地）以產生C1s受質產物； （b）量測步驟（a）中所產生之C1s受質產物之量；及 （c）基於步驟（b）中所量測的該C1s受質產物之量來測定該乾燥血液樣點中的fC1-INH之量。
3. 如請求項2之方法，其中步驟（a）藉由將該等所萃取蛋白質與該C1s及該C1s受質一起培育以產生反應混合物來執行。
4. 如請求項2或請求項3之方法，其中步驟（b）之量測步驟藉由液相層析-質譜法執行。
5. 如請求項2至4中任一項之方法，其中該C1s受質為N^α -苯甲氧羰基-Lys-苯甲硫醇酯且該C1s產物為N^α -苯甲氧羰基-L-離胺酸（cbz-Lys）。
6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中（iii）之萃取藉由用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）/PBS緩衝液培育該乾燥血液樣點至少3小時來執行。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該支撐構件為濾紙。
8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中步驟（ii）之乾燥在室溫下執行至少3小時。
9. 如請求項1至8中任一項之方法，其進一步包含自該個體獲得該血液樣本。
10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該血液樣本為全血樣本。
11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中個體為人類個體。
12. 如請求項11之方法，其中該個體患有遺傳性血管水腫（hereditary angioedema，HAE）、疑似患有HAE、或具有患有HAE之風險。
13. 如請求項12之方法，其中該HAE為I型HAE或II型HAE。
14. 如請求項1至13中任一項之方法，其進一步包含確定該個體是否患有C1-INH缺乏介導之病症，其中與對照相比減小之fC1-INH產物之量指示該個體患有該C1-INH缺乏介導之病症。
15. 如請求項1至14中任一項之方法，其進一步包含基於fC1-INH之量識別用於該個體之適合治療。
16. 如請求項2至15中任一項之方法，其進一步包含基於步驟（c）中所測定的fC1-INH之量將該個體識別為進行該疾病之治療的候選者。
17. 如請求項1至16中任一項之方法，其進一步包含若該個體被識別為具有C1-INH缺乏介導之病症之風險或患有該病症則向該個體投予治療劑。
18. 如請求項17之方法，其中該治療劑為血漿胰舒血管素（plasma kallikrein，pKal）抑制子、緩激肽B2受體拮抗劑、或C1酯酶抑制子。
19. 如請求項17或18之方法，其中該治療劑為艾卡拉肽（ecallantide）、拉那蘆單抗（lanadelumab）、艾替班特（icatibant）或人類血漿源性C1酯酶抑制子。
20. 如請求項14至19中任一項之方法，其中該C1-INH缺乏介導之病症為HAE。
21. 如請求項20之方法，其中該HAE為I型HAE或II型HAE。

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