KR20220103189A - pKal 매개 장애의 평가, 검정 및 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈장 칼리크레인, XII 인자 또는 둘 다에 결합하는 혈장 프로테아제 C1 저해제(C1-INH)를 검출하는 검정 방법, 및 pKal 매개 또는 브래디키닌 매개 장애의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 대상체를 확인하기 위한 이의 용도를 제공한다. 제공된 방법은 혈장 칼리크레인 매개 혈관 부종(KMA), 또는 평가 및 치료에서 유용한 pKal에 의해 매개되는 다른 질환을 갖는 환자의 분석을 허용한다.

Description

pKal 매개 장애의 평가, 검정 및 치료{EVALUATION, ASSAYS AND TREATMENT OF PKAL-MEDIATED DISORDERS}
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 미국 가출원 제61/754,600호(2013년 1월 20일 출원)의 출원일의 이익을 주장한다. 상기 가출원의 전체 내용은 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다.
혈장 칼리크레인(plasma kallikrein: pKal)은 순환에서 주요 브래디키닌 생성 효소이다. pKal의 활성화는 유전성 혈관 부종(hereditary angioedema: HAE)과 연관된 질환 병리에 관련된 접촉 시스템을 통해 발생한다. 브래디키닌은 통증, 염증, 부종 및 혈관신생의 주요 매개자이다.
혈장 프로테아제 C1 저해제(또한 C1-저해제 또는 C1-INH로 공지됨)는 세르핀 슈퍼패밀리에 속하는 프로테아제 저해제이다. 이의 주요 기능은 자발적 활성화를 방지하는 보체 시스템의 저해이다. 유전성 혈관 부종 1형 및 2형은 브래디키닌을 과생성시키는 C1-INH의 유전적 결핍에 의해 야기된다.
C1-INH를 조사하기 위한 현재 이용 가능한 기능적 진단학적 검정은 활성화된 C1s 및 이에 따른 보체 시스템의 저해를 이용한다. 본 개시내용은 PKal, FXII 또는 둘 다, 이에 따라 pKal 매개 신호전달 경로의 저해를 이용하는 새로운 진단학적 검정의 개발에 기초한다. 놀랍게도, 본 명세서에 기재된 진단학적 검정은 대조군 환자로부터 HAE 1형 및 2형을 갖는 환자의 100%를 성공적으로 구분한다.
따라서, 본 개시내용의 일 양상은 (a) 혈장 프로테아제 C1 저해제(C1-INH)를 함유하는 샘플을 포획 시약과 접촉시키는 단계, 및 (b) 포획 시약에 결합하는 샘플 내의 C1-INH의 수치를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 포획 시약은 ⅰ) XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편, ⅱ) 혈장 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편, 또는 ⅲ) ⅰ)과 ⅱ)의 조합을 포함한다. 예를 들어, 포획 시약은 XII 인자의 활성 형태, 혈장 칼리크레인의 활성 형태 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 명세서에 기재된 검정에서 사용하기 위한 임의의 포획 시약은 기질에 부동화될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 포획 물질에 결합하는 C1-INH의 수치를 C1-INH에 결합하는 검출제, 예를 들어 C1-INH에 결합하는 항체를 사용하여 측정한다. 몇몇 실시형태에서, 포획 물질에 결합하는 C1-INH의 수치를 효소 결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)에 의해 측정한다.
C1-INH를 함유하는 샘플(예를 들어, 혈액 샘플 또는 혈장 샘플)은 대상체로부터 얻어질 수 있다. 몇몇 예에서, 대상체는 부종, 종창의 재발성 공격; 완전히 또는 주로 말초인 종창; 두드러기; 감염의 증거의 부재 하의 충혈, 통증 및 종창; 또는 비히스타민 매개 부종일 수 있는 pKal 매개 장애의 증상을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 항히스타민 치료제, 코르티코스테로이드 치료제 또는 둘 다에 내성을 나타낸다. 또 다른 예에서, 대상체는 샘플이 수집되는 때에 pKal 매개 장애의 증상을 갖지 않거나, pKal 매개 장애의 증상의 병력을 갖지 않거나, pKal 매개 장애의 병력을 갖지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 샘플에서 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 수치가 기준값과 비교하여 감소하는 경우, 대상체를 pKal 매개 장애의 위험이 있거나 이를 갖는 것으로서 확인하는 단계를 추가로 포함한다. pKal 매개 장애는 히스타민 독립적 특발성 혈관 부종, 류마티스성 관절염, 크론병, 루푸스, 알츠하이머병, 패혈성 쇼크, 화상 손상, 뇌 허혈/관류 손상, 뇌 부종, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 황반 부종, 혈관염, 동맥 또는 정맥 혈전증, 심실 보조 장치 또는 스텐트와 연관된 혈전증, 혈전증을 동반한 헤파린 유도 혈소판 감소증, 혈전색전증 질환, 및 불안정 협심증을 동반한 관상 동맥 질환, 부종, 눈 질환, 통풍, 장 질환, 구강 점막염, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 척추관 협착증-퇴행성 척추 질환, 수술후 장폐색, 대동맥 동맥류, 골관절염, 유전성 혈관 부종(HAE), 폐 색전증, 뇌졸중, 머리 외상 또는 종양 주변 뇌 부종, 패혈증, 급성 중대뇌동맥(middle cerebral artery: MCA) 허혈성 사건(뇌졸중), 재협착증, 정신 홍반 루푸스 신염, 자가면역 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경학적 질환, 단백질 미스폴딩과 연관된 질환, 혈관신생, 고혈압성 신경병증 및 당뇨병성 신경병증과 연관된 질환, 알레르기 및 호흡기 질환, 또는 조직 손상일 수 있다. 몇몇 예에서, pKal 매개 장애는 HAE이다.
대상체가 pKal 매개 장애(예를 들어, HAE)의 위험이 있거나 이를 갖는 것으로서 확인되는 경우, 본 명세서에 기재된 방법은 유효량의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 치료제는 칼리크레인 결합제; 브래디키닌 B2 수용체 길항제 및 C1-INH 대체 물질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 경우에, 치료제는 DX-88, DX-2930 또는 EPIKAL-2이다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 칼리크레인 결합제, 브래디키닌 B2 수용체 길항제 또는 C1-INH 대체 물질인 유효량의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 pKal 매개 장애(예를 들어, HAE)를 갖는 대상체(예를 들어, 인간 환자)를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법에 의해 치료하고자 하는 대상체는 기준값과 비교하여 포획 시약에 결합할 수 있는 감소한 수치의 C1-INH를 갖는다. 포획 시약은 ⅰ) XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편; ⅱ) 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편 또는 ⅲ) ⅰ)과 ⅱ)의 조합을 포함한다. 대상체의 C1-INH 수치를 본 명세서에 기재된 임의의 검정 방법에 의해 결정할 수 있다.
몇몇 예에서, 치료제는 DX-88, DX-2930 또는 EPIKAL-2이다.
pKal 매개 장애(예를 들어, HAE) 및 기준값과 비교하여 포획 시약에 결합할 수 있는 감소한 수치의 C1-INH를 갖는 대상체(예를 들어, 인간 환자)를 치료하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물이 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다. 약제학적 조성물은 칼리크레인 결합제, 브래디키닌 B2 수용체 길항제 또는 C1-INH 대체 물질일 수 있는 장애를 치료하기 위한 치료제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 개시내용은 또한 pKal 매개 장애, 예컨대 HAE를 치료하는 데 사용하기 위한 약제를 제조하는 데 있어서의 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 다른 양상에서, 본 개시내용은 포획 시약에 결합할 수 있는 혈장 프로테아제 C1 저해제(C1-INH)를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 키트는,
a) ⅰ) XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편;
ⅱ) 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편; 또는
ⅲ) ⅰ)과 ⅱ)의 조합을 포함하는 포획 시약; 및
b) C1-INH에 결합하는 검출 시약 및
임의로, c) C1-INH를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, FXIIa, PKal의 활성 형태 또는 이들의 조합일 수 있는 포획 시약은 기질에 부동화될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 검출 시약은 항-C1-INH 항체이다.
추가로, 본 개시내용은 (a) 치료 전에 및 후에 또는 치료의 과정 동안에 대상체로부터 수집된 샘플에서 혈장 칼리크레인, XII 인자 또는 둘 다를 저해할 수 있는 혈장 프로테아제 C1 저해제(C1-INH)의 수치를 측정하는 단계 및 (b) C1-INH의 수치에 기초하여 치료의 유효성을 평가하는 단계(여기서, 치료 후에 또는 치료의 과정에 걸쳐 C1-INH 수치의 감소는 치료가 대상체에 효과적이라는 것을 나타냄)를 포함하는, 대상체(예를 들어, 인간 HAE 환자)에서 pKal 매개 장애의 치료를 평가하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 치료는 칼리크레인 결합제, 브래디키닌 B2 수용체 길항제 또는 C1-INH 대체 물질을 포함한다. 예를 들어, 치료는 DX-88, DX-2930 또는 EPIKAL-2를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 대상체로부터 수집된 샘플은 혈액 샘플 또는 혈장 샘플이다.
몇몇 실시형태에서, C1-INH의 수치를 본 명세서에 기재된 바와 같은 검정 방법에서 측정할 수 있다. 예를 들어, C1-INH의 수치를 (a) 대상체로부터 수집된 샘플을 (예를 들어, 기질에 부동화된) 포획 시약과 접촉시키는 단계 및 (b) ⅰ) XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편, ⅱ) 혈장 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편 또는 ⅲ) ⅰ)과 ⅱ)의 조합을 포함할 수 있는 포획 시약에 결합하는 샘플에서 C1-INH의 수치를 측정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 측정할 수 있다. 몇몇 예에서, 포획 시약은 XII 인자의 활성 형태, 혈장 칼리크레인의 활성 형태 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 검정에서, C1-INH의 수치를 C1-INH에 결합하는 검출제, 예를 들어 C1-INH에 결합하는 항체를 사용하여 측정할 수 있다. 몇몇 예에서, C1-INH의 수치를 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 측정한다.
하기 실시형태는 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 개시내용은 대상체, 예를 들어 pKal 매개 또는 브래디키닌 매개 장애의 위험이 있거나 이를 앓고 있는(예를 들어, 갖는) 대상체를 평가하는(예를 들어, 확인하는) 방법을 제공한다. 제공된 방법은 혈장 칼리크레인 매개 혈관 부종(kallikrein-mediated angioedema: KMA), 또는 평가 및 치료에서 유용한 pKal에 의해 매개되는 다른 질환을 갖는 환자의 분석을 허용한다.
본 개시내용의 실시형태는 예를 들어 혈장 칼리크레인에 의해 생성된 브래디키닌에 의해 야기된 부종을 앓고 있는 환자의 확인 및 치료에서의 바이오마커 및 이의 용도를 제공한다. 본 명세서에 개시된 방법, 조성물 및 장치는 다수의 방식에서 유용하다. 예를 들어, 상승한 접촉 시스템 활성화와 연관된 장애를 확인하기 위해 pKal 마커의 수치를 이용할 수 있다. 초기 스크리닝은 예를 들어 질환의 전임상 모델에서 혈장 칼리크레인 저해제(예를 들어, DX-88, EPI-KAL2 또는 DX-2930)에 의한 실험실내 또는 생체내 시험에 의해 추적관찰될 수 있다. 본 명세서에 개시된 마커는 또한 약동학적 바이오마커로서 또는 그렇지 않으면 칼리크레인 저해제에 대한 대상체의 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 마커는 혈장 칼리크레인에 의해 매개된 질환의 치료가 가능하게 하고, pKal 매개 또는 브래디키닌 매개 장애, 예를 들어 HAE, 비히스타민 독립적 특발성 혈관 부종, 류마티스성 관절염, 크론병, 루푸스, 알츠하이머병, 패혈성 쇼크, 화상 손상, 뇌 허혈/관류 손상, 뇌 부종, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 황반 부종, 혈관염, 심실 보조 장치와 연관된 혈전증, 혈전증을 동반한 헤파린 유도 혈소판 감소증, 혈전색전증 질환, 및 불안정 협심증을 동반한 관상 동맥 질환의 예방학적 치료 동안 투약을 조절하도록 하는 동반 진단에서 사용될 수 있다
일 양상에서, 본 발명은 대상체, 예를 들어 pKal 매개 장애, 브래디키닌 매개 장애, 예를 들어 항히스타민 내성 부종 또는 HAE의 위험이 있는 대상체를 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 대상체 조직, 예를 들어 혈액, 혈장 또는 눈물을 포함하는 샘플을 획득하는 단계; b) C1-INH와 상기 하나 이상의 포획 시약 사이의 복합체의 형성에 충분한 조건 하에 상기 샘플을 예를 들어 실험실내 하나 이상의 포획 시약과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 포획 시약은 ⅰ) XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티; 또는 ⅱ) 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티 중 하나 도는 둘 다를 포함함); 및 c) 상기 포획 시약에 대한 CI-INH의 결합의 수치를 평가하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 평가는 상기 포획 시약에 대한 CI-INH의 결합의 결정된 수치를 기준치와 비교하는 단계(여기서, 미리 결정된 기준을 만족시키는 수치는 예를 들어 기준치이거나 이보다 낮은 경우, pKal 저해제에 의한 치료에 감수성인 장애를 나타냄)를 포함한다. 기준치는 예를 들어 pKal 매개 장애를 갖지 않는 사람, 예를 들어 HAE 또는 본 명세서에 기재된 다른 장애를 갖지 않는 사람, 또는 이러한 장애의 증상의 병력을 갖지 않는 사람에서의 수치일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, pKal 매개 장애는 HAE, 비히스타민 독립적 특발성 혈관 부종, 류마티스성 관절염, 크론병, 루푸스, 알츠하이머병, 패혈성 쇼크, 화상 손상, 뇌 허혈/관류 손상, 뇌 부종, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 황반 부종, 혈관염, 동맥 또는 정맥 혈전증, 심실 보조 장치 또는 스텐트와 연관된 혈전증, 혈전증을 동반한 헤파린 유도 혈소판 감소증, 혈전색전증 질환, 및 불안정 협심증을 동반한 관상 동맥 질환, 부종, 눈 질환, 통풍, 장 질환, 구강 점막염, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 척추관 협착증-퇴행성 척추 질환, 수술후 장폐색, 대동맥 동맥류, 골관절염, 유전성 혈관 부종, 폐 색전증, 뇌졸중, 머리 외상 또는 종양 주변 뇌 부종, 패혈증, 급성 중대뇌동맥(MCA) 허혈성 사건(뇌졸중), 재협착증(예를 들어, 혈관성형술 후), 정신 홍반 루푸스 신염, 자가면역 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경학적 질환, 단백질 미스폴딩과 연관된 질환, 혈관신생, 고혈압성 신경병증 및 당뇨병성 신경병증과 연관된 질환, 알레르기 및 호흡기 질환(예를 들어, 아나필락시스, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 급성 호흡기 불안 증후군, 낭성 섬유증, 지속성, 비염) 및 조직 손상(예를 들어, 화상 또는 화학 손상)으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 대상체는 pKal 매개 장애에 대한 감수성에 대해 평가된다. 소정의 실시형태에서, 상기 대상체는 pKal 매개 장애, 예를 들어 부종의 증상, 예를 들어 이와 일치하는 증상을 갖는다. 소정의 실시형태에서, 상기 대상체는 원치않는 pKal 활성화를 특징으로 하는 장애의 증상을 갖고, 상기 대상체는 항히스타민 치료제 또는 코르티코스테로이드 치료제가 투여되고, 증상은 이에 내성을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 상기 대상체는 하기 증상 또는 특성 중 하나 이상 또는 모두를 갖거나, 항히스타민 또는 코르티코스테로이드 치료제에 반응하지 않거나; 비히스타민 매개 부종을 갖는다: 종창의 재발성 공격; 종창(여기서, 상기 종창은 완전히 또는 주로 말초이고, 예를 들어, 대상체는 상당한 복부 또는 기도 종창을 갖지 않음); 두드러기; 충혈, 통증 및 감염의 증거의 부재 하의 종창.
몇몇 실시형태에서, 상기 대상체는 지속성 또는 재발성 부종을 갖고, 항히스타민 및 스테로이드 치료제 중 하나 또는 둘 다에 비반응성이다.
몇몇 실시형태에서, 대상체는 HAE, IAE, IBD 또는 IBS와 같은 pKal 매개 장애의 병력을 갖지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 HAE, IAE, IBD 또는 IBS와 같은 pKal 매개 장애의 병력을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 HAE의 병력을 갖지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 HAE의 병력을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 IAE의 병력을 갖지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 IAE의 병력을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 IBD 또는 IBS의 병력을 갖지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 IBD 또는 IBS의 병력을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 식품 알레르기와 같은 히스타민 매개 장애의 병력을 갖지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 식품 알레르기와 같은 히스타민 매개 장애의 병력을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 HAE, IAE, IBD 또는 IBS와 같은 pKal 매개 장애의 병력을 갖지 않지 않고, 식품 알레르기와 같은 히스티딘 매개 장애의 병력을 갖지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 HAE, IAE, IBD 또는 IBS와 같은 pKal 매개 장애의 병력을 갖지 않지 않고, 식품 알레르기와 같은 히스타민 매개 장애의 병력을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 HAE, IAE, IBD 또는 IBS와 같은 pKal 매개 장애의 병력을 갖고, 식품 알레르기와 같은 히스티딘 매개 장애의 병력을 갖지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 HAE, IAE, IBD 또는 IBS와 같은 pKal 매개 장애의 병력을 갖고, 식품 알레르기와 같은 히스타민 매개 장애의 병력을 갖는다.
소정의 실시형태에서, 상기 대상체는 혈관 부종의 병력을 갖는다. 소정의 실시형태에서, 상기 대상체는 혈관 부종의 병력을 갖지 않는다. 특정한 실시형태에서, 상기 대상체는 부종과 같은 pKal 또는 브래디키닌 매개 장애에 특징적인 증상을 겪지 않는다. 소정의 실시형태에서, 상기 조직이 대상체의 신체로부터 제거될 때, 상기 대상체는 혈관 부종 공격을 겪는다.
몇몇 실시형태에서, 상기 하나 이상의 포획 시약은 기질에 배치된다. 소정의 실시형태에서, 기질은 불용성 기질이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 하나 이상의 포획 시약은 XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 하나 이상의 포획 시약은 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 하나 이상의 포획 시약은 XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편 및 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 활성화된 C1, 예를 들어 C1s에 대한 C1-INH의 결합을 평가하는 단계를 포함하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 상기 하나 이상의 포획 시약은 상기 기질에 배치된 제2 특이적 결합 모이어티와 복합체를 형성하는 제1 특이적 결합 모이어티를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 결합 모이어티는 바이오틴 및 아비딘으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어 상기 평가에서, 검출 시약과 상기 복합체의 결합을 평가하는 단계를 포함하고, 예를 들어 복합체화된 C1INH에 결합하는 검출 시약, 예를 들어 항-C1NH 항체, 예를 들어 검출 시약은, C1IHN과 포획 시약 사이의 복합체의 형성 전에 또는 후에, C1INH에 결합할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 상기 방법은 C1-INH와 검출 시약 사이에 복합체를 형성하기에 충분한 조건 하에 검출 시약을 공급하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 C1-INH는 포획 시약과 복합체 형성한다. 특정한 실시형태에서, 상기 방법은 검출 시약, C1-INH 및 포획 시약을 포함하는 복합체를 형성하는 단계를 포함하고, 상기 검출 시약은 상기 C1-INH과 복합체 형성하고, 상기 CI-INH는 포획 시약과 복합체 형성한다.
몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 ⅰ) XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티 또는 ⅱ) 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 포획 시약은 XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 포획 시약은 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 포획 시약은 XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티 및 XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티 둘 다를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 상기 복합체를 기질에 결합시키는 모이어티를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 모이어티는 제1 및 제2 결합 파트너를 포함하고, 하나는 상기 포획 시약에 결합하고, 다른 하나는 상기 기질에 결합한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 치료제는 칼리크레인 결합제; 브래디키닌 B2 수용체 길항제; 또는 C1-INH 대체 물질로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 DX-88을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 DX-2930을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 EPIKAL-2를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 상기 대상체가 HAE를 갖는지를 결정하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 HAE 유형에 대해 대상체를 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 (ⅰ) 본 명세서에 개시된 방법에 의해 대상체에 대한 C1-INH 기능에 대한 값을 획득하는 단계(예를 들어, 포획 시약에 결합하는 샘플에서 C1-INH의 수치를 측정하는 단계); 및 (ⅱ) 전체 C1-INH 단백질 수치에 대한 값을 획득하는 단계(예를 들어, 전체 C1-INH 수치를 측정하는 단계)를 포함하고, 여기서, (ⅰ)에 의해 제공된 C1-INH 기능에 대한 값이 예비선택되는 기준을 만족시키고(예를 들어 이것이 기준값보다 낮음), (ⅱ)에 의해 제공된 C1-INH 단백질 수치에 대한 값이 예비선택되는 기준을 만족시키는(예를 들어 이것이 기준값보다 큼) 경우, 대상체를 2형 HAE를 갖는 것으로 분류한다. 몇몇 실시형태에서, (ⅰ) 및 (ⅱ) 중 적어도 하나가 직접적으로 획득된다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 이루어진 상기 대상체의 평가를 획득하는 단계; 및 이에 반응하여, 상기 환자에 대해 치료제를 선택하거나 치료제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 치료제는 칼리크레인 결합제; 브래디키닌 B2 수용체 길항제; 또는 C1-INH 대체 물질로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 DX-88을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 DX-2930을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 EPIKAL-2를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 평가된 대상체를 제공하는 단계; 및 이에 반응하여, 상기 환자에 대해 치료제를 선택하거나 치료제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 치료제는 칼리크레인 결합제; 브래디키닌 B2 수용체 길항제; 또는 C1-INH 대체 물질로부터 선택된다. 특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 DX-88을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 DX-2930을 포함하다. 특정한 실시형태에서, 상기 치료제는 EPIKAL-2를 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은, 임의로, C1-IHN와 복합체 형성하고 임의로 검출 시약과 복합체 형성하는, 본 명세서에 기재된 포획 시약을 포함하는 반응 혼합물을 제공한다. 실시형태에서, 반응 혼합물은 대상체 혈장을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 샘플의 복합체 형성되지 않은 부재는 예를 들어 세척에 의해 제거된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 포획 물질, 예를 들어 ⅰ) XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티 또는 ⅱ) 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 기질을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 기질은 개별적으로 다룰 수 있는 구역에 배치된 모이어티 ⅰ 및 ⅱ를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 포획 시약 중 적어도 하나 및 실시형태에서 둘 다가 배치된 기질을 포함하는 장치를 제공한다. 실시형태에서, 예를 들어 상이한 웰에서 제1 포획 시약은 상기 기질의 제1 구역에 배치되고, 제2 포획 시약은 제2 구역에 배치된다.
다른 양상에서, 본 발명은 임의로 기질에 배치된 본 명세서에 기재된 포획 시약 중 하나 또는 둘 다; 검출 시약, 예를 들어 항-C1-INH 항체 또는 항-C1-INH 항체; 및 표준품, 예를 들어 C1-INH 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 상세내용은 도면 및 하기 설명에 기재되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면 및 청구범위로부터 명확할 것이다.
본원 및 이하에 기재된 것에 걸쳐 인용된 참조 문헌, 등록 특허, 공개 또는 비공개 특허 출원을 포함하는 모든 인용된 문헌의 내용은 본 명세서에 언급된 목적 또는 대상을 위해 본 명세서에 명확히 참조문헌으로 그 전문이 포함된다.
도 1은 ELISA에 의한 칼리크레인-C1-INH 복합체 형성의 예시적인 검출을 도시한 것이다. 왼쪽부터 오른쪽으로, 정상 대조군, 1형 HAE, 2형 HAE 및 3형 HAE 환자 혈장 샘플.
도 2는 ELISA에 의한 활성화된 XII 인자-C1-INH 복합체 형성의 예시적인 검출을 도시한 것이다. 왼쪽부터 오른쪽으로, 정상 대조군, 1형 HAE, 2형 HAE 및 3형 HAE 환자 혈장 샘플.
도 3은 ELISA 검정을 통해 FXIIa의 저해에 기초하여 C1-INH 수치를 측정하기 위한 예시적인 방법의 도식적 예시이다.
도 4는 대조군 샘플 및 HAE 샘플에서 예시적인 기능적 ELISA로부터의 데이터를 나타내는 그래프를 포함한다. 도 4a는 C1s의 저해에 기초하여 C1-INH를 측정하기 위한 상업적으로 구입 가능한 기능적 ELISA로부터의 데이터를 도시한 것이다. 도 4b는 칼리크레인의 저해에 기초하여 C1-INH를 측정하기 위한 예시적인 기능적 ELISA 검정으로부터의 데이터를 도시한 것이다. 도 4c는 FXII의 저해에 기초하여 C1-INH를 측정하기 위한 예시적인 기능적 ELISA 검정으로부터의 데이터를 도시한 것이다.
혈장 칼리크레인(pKal)은 접촉 시스템의 세린 프로테아제 성분이고, 순환에서 주요 브래디키닌 생성 효소이다. 접촉 시스템은 외래 또는 음으로 하전된 표면에 노출 시 XIIa 인자(XII 인자 또는 FXII의 활성 형태)에 의해 또는 프롤릴카복시펩티다제에 의해 내피 세포 표면 상에 활성화된다(Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). 혈장 칼리크레인의 활성화는 XII 인자의 이의 피드백 활성화를 통해 내재 응고를 증폭시키고, 전염증성 노나펩타이드 브래디키닌의 생성을 통해 염증을 증대시킨다. 순환에서 주요 키니노게나제로서, 혈장 칼리크레인은 맥관구조에서의 브래디키닌의 생성을 주로 담당한다. C1-저해제 단백질(C1-INH)의 유전자 결핍증은 유전성 혈관 부종(HAE)을 발생시킨다. HAE를 갖는 환자는 미공지 촉발 인자가 대개 참여하는 통증 있는 부종의 급성 공격을 겪는다(Zuraw B.L. et al., N Engl J Med 359, 1027-1036, 2008). 동물 모델에서의 약동학적 물질의 사용 또는 유전자 연구를 통해, 혈장 칼리크레인-키닌 시스템(plasma kallikrein-kinin system: 혈장 KKS)은 다양한 질환에 연류된다.
유전성 혈관 부종(HAE), 1형 및 2형은 손발, 얼굴, 위장관 또는 상기도에서 종창을 특징으로 하는 상염색체 우성 장애이다(1). 공격은 2일 내지 5일 지속하고, 적절히 치료되지 않으면, 후두의 종창은 특히 치명적일 수 있다. 이것은 다양한 표출을 갖는 희귀 장애(1:20,000 내지 1:50,000명의 사람에게 영향을 미침)이므로, 진단이 놓쳐질 수 있다. HAE는 통상적으로 단백질 수치 감소(1형 HAE, 사례의 85%) 또는 기능 감소(2형 HAE, 15%)를 발생시키는 C1-INH 유전자의 이형접합성 돌연변이에 의해 야기된다(2). 1형 HAE에서, C1-INH 단백질 수치는 낮고, 기능적 수치는 비례하여 낮지만, 2형 HAE에서, 단백질 수치는 정상이거나 심지어 상승하지만, 기능적 수치는 낮다. 따라서, 기능적 검정이 HAE의 진단을 확신하는 데 필수적일 뿐만 아니라, 2형 질환은 이것 없이 진단될 수 없다.
C1 INH는 보체, 응고 및 키닌 형성 캐스케이드의 활성화된 단백질을 저해하는 세린 프로테아제 효소이다. C1-INH 기능적 수치를 평가하기 위해 현재 이용 가능한 검정은 발색 검정 또는 복합 ELISA 방법을 이용하여 C1-INH에 의해 보체 캐스케이드의 C1s의 저해를 측정한다. 발색 검정은 일반적으로 바람직한 것으로 고려되지만(3), 방법 둘 다 제한을 가진다. 발색 검정은 가끔의 거짓 양성을 더욱 가질 것이지만, 복합 ELISA는 불과 62%의 음의 예측 값을 갖는다.
당해 분야에 공지된 복합 ELISA 및 발색 방법 둘 다의 제한은 검정이 보체 캐스케이드의 효소에서 C1-INH의 활성을 측정한다는 것이고, 이것은 HAE와 같은 pKal 매개 질환의 원인이 아니다. 실제로, 기능이상 C1-INH는 키닌 형성 캐스케이드에서 정상 활성을 갖는 것으로 보고되어서, 혈관 부종이 발생하지 않지만, 이것은 C1s를 저해하지 못해서, C1은 비정상으로 활성이고, C4가 고갈된다(7). 따라서, 현재 이용 가능한 기술은 키닌 형성 캐스케이드를 저해하는 데(예를 들어, PKal 및/또는 FXIIa를 저해하는 데) 기능적인 C1-INH의 수치를 측정하도록 허용되지 않을 것이다.
본 개시내용은, HAE I형 및 II형의 진단을 위해, 활성화된 XII 인자 또는 혈장 칼리크레인의 저해에 기초하여, ELISA 방법론을 이용하는 기능적 C1-INH를 측정하는 신규한 검정의 개발에 기초한다. 이 검정은 특히 PKal 신호전달 경로와 연관된 질환/장애와 생리학적 연관성을 갖고, 따라서 당해 분야에 공지된 방법에 비해 주요 진전일 것이다.
PKal 및/또는 FXII(예를 들어, 단백질의 활성 형태)의 저해에 기초하여 C1-INH의 수치를 측정하기 위한 새로운 검정 방법 및 검정 방법을 수행하기 위한 키트가 본 명세서에 기재되어 있다. HAE와 같은 PKal에 의해 매개되는 질환/장애를 갖거나 이의 위험이 있는 환자를 진단하거나 질환/장애의 치료를 평가하는 데 있어서 이러한 검정 방법의 적용이 본 명세서에 또한 기재되어 있다.
정의
편의를 위해, 본 발명의 추가의 설명 전에, 명세서, 실시예 및 청구범위에 사용된 소정의 용어가 본 명세서에 정의되어 있다. 다른 용어는 본 명세서에 나타난 것처럼 정의된다.
단수 형태 "일", "하나" 및 "이것"은 문맥이 명확히 다르게 나타내지 않는 한 복수 언급을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "획득한다" 또는 "획득하는"은 예를 들어 물리적 집합체 또는 값을 "직접적으로 획득" 또는 "간접적으로 획득"함으로써 물리적 집합체 또는 값, 예를 들어 숫자 값의 보유를 얻는 것을 의미한다. "직접적으로 획득하는"은 물리적 집합체 또는 값을 얻기 위해 프로세스를 수행하는 것(예를 들어, 그 용어가 본 명세서에 정의된 바대로 샘플에서 검정 또는 시험을 수행하거나 "샘플을 분석하는" 것)을 의미한다. "간접적으로 획득하는"은 또 다른 당사자 또는 공급원(예를 들어, 물리적 집합체 또는 값을 직접적으로 획득한 제3 당사자 실험실)으로부터 물리적 집합체 또는 값을 수취하는 것을 의미한다. 물리적 집합체를 직접적으로 획득하는 것은 프로세스를 수행하는 것, 예를 들어 물리적 물질, 예를 들어 출발 물질의 물리적 변화를 포함하는 샘플을 분석하는 것을 포함한다. 예시적인 변화는 2개 이상의 출발 물질로부터 물리적 집합체를 만드는 것, 물질을 전단 또는 단편화시키는 것, 물질을 분리하거나 정제하는 것, 2개 이상의 별개의 집합체를 혼합물로 합하는 것, 공유 또는 비공유 결합을 파괴하거나 형성하는 것을 포함하는 화학 반응을 수행하는 것을 포함한다. 값을 직접적으로 획득하는 것은 샘플 또는 또 다른 물질의 물리적 변화를 포함하는 프로세스를 수행하는 것, 예를 들어 물질, 예를 들어 샘플, 분석물질 또는 시약의 물리적 변화를 포함하는 분석 프로세스(때때로 본 명세서에서 "물리적 분석"이라 칭함)를 수행하는 것, 분석 방법, 예를 들어 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법을 수행하는 것을 포함한다: 또 다른 물질로부터 물질, 예를 들어 분석물질 또는 이의 단편 또는 다른 유도체의 분리 또는 정제; 분석물질 또는 이의 단편 또는 다른 유도체의 또 다른 물질, 예를 들어 완충제, 용매 또는 반응물과의 조합; 또는 예를 들어 분석물질의 제1 구성요소와 제2 구성요소 사이의 공유 또는 비공유 결합의 파괴 또는 형성에 의한 분석물질 또는 이의 단편 또는 다른 유도체의 구조의 변경; 또는 예를 들어 시약의 제1 구성요소와 제2 구성요소 사이의 공유 또는 비공유 결합의 파괴 또는 형성에 의한 시약 또는 이의 단편 또는 다른 유도체의 구조의 변경.
본 명세서에 사용된 바대로, 샘플을 "분석하는" 것은 샘플 또는 또 다른 물질, 예를 들어 출발 물질의 물리적 변화를 포함하는 프로세스를 수행하는 것을 포함한다. 예시적인 변화는 2개 이상의 출발 물질로부터 물리적 집합체를 만드는 것, 물질을 전단 또는 단편화시키는 것, 물질을 분리하거나 정제하는 것, 2개 이상의 별개의 집합체를 혼합물로 합하는 것, 공유 또는 비공유 결합을 파괴하거나 형성하는 것을 포함하는 화학 반응을 수행하는 것을 포함한다. 샘플을 분석하는 것은 물질, 예를 들어 샘플, 분석물질 또는 시약의 물리적 변화를 포함하는 분석 프로세스(때때로 본 명세서에서 "물리적 분석"이라 칭함)를 수행하는 것, 분석 방법, 예를 들어 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법을 수행하는 것을 포함할 수 있다: 또 다른 물질로부터 물질, 예를 들어 분석물질 또는 이의 단편 또는 다른 유도체의 분리 또는 정제; 분석물질 또는 이의 단편 또는 다른 유도체의 또 다른 물질, 예를 들어 완충제, 용매 또는 반응물과의 조합; 또는 예를 들어 분석물질의 제1 구성요소와 제2 구성요소 사이의 공유 또는 비공유 결합의 파괴 또는 형성에 의한 분석물질 또는 이의 단편 또는 다른 유도체의 구조의 변경; 또는 예를 들어 시약의 제1 구성요소와 제2 구성요소 사이의 공유 또는 비공유 결합의 파괴 또는 형성에 의한 시약 또는 이의 단편 또는 다른 유도체의 구조의 변경.
용어 "효현제"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 단백질의 바이오활성을 모방하거나 상향조절(예를 들어, 강화 또는 보강)하는 물질을 의미하도록 의도된다. 효현제는 야생형 단백질의 적어도 하나의 바이오활성을 갖는 야생형 단백질 또는 이의 유도체일 수 있다. 효현제는 또한 단백질의 적어도 하나의 바이오활성을 증가시키는 화합물일 수 있다. 효현제는 또한 폴리펩타이드와 또 다른 분자, 예를 들어 표적 펩타이드 또는 핵산의 상호작용을 증가시키는 화합물일 수 있다.
용어 "길항제"는 본 명세서에 사용된 바대로 단백질의 적어도 하나의 바이오활성을 하향조절(예를 들어, 억제 또는 저해)하는 물질을 의미하도록 의도된다. 길항제는 단백질과 또 다른 분자, 예를 들어 표적 펩타이드 또는 효소 기질 사이의 상호작용을 저해하거나 감소시키는 화합물일 수 있다. 길항제는 또한 존재하는 발현된 단백질의 양을 감소시키거나 저해하는 화합물일 수 있다. 통상적으로, 단백질 또는 유전자의 저해는, 본 명세서에 기재되거나 당해 분야에서 인정된 하나 이상의 방법에 의해 측정된, 적어도 10% 이상, 예를 들어 20%, 30%, 40% 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 단백질 또는 유전자의 발현 또는 관련 활성의 감소, 또는 1배 초과, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배 이상의 발현 또는 관련 활성의 감소를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "결합 친화도"는 겉보기 결합 상수 또는 Ka를 의미한다. Ka는 분해 상수(Kd)의 역수이다. 결합 단백질은, 예를 들어 특정한 표적 분자에 대해 적어도 105, 106, 107, 108, 109, 1010 및 1011M-1의 결합 친화도를 가질 수 있다. 제2 표적에 비해 제1 표적에 대한 결합 단백질의 더 높은 친화도 결합은 제2 표적의 결합에 대한 Ka(또는 숫자 값 Kd)보다 제1 표적의 결합에 대한 더 높은 Ka(또는 더 적은 숫자 값 Kd)로 표시될 수 있다. 이러한 경우에, 결합 단백질은 제2 표적(예를 들어, 제2 입체구성의 동일한 단백질 또는 이의 모방체; 또는 제2 단백질)에 비해 제1 표적(예를 들어, 제1 입체구성의 단백질 또는 이의 모방체)에 대해 특이성을 갖는다. (예를 들어, 특이성 또는 다른 비교에 대한) 결합 친화도의 차이는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000 또는 105배일 수 있다.
결합 친화도는 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라스몬 공명 또는 (예를 들어, 형광 검정을 이용한) 분광법을 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 결합 친화도를 평가하기 위한 예시적인 조건은 트리스-완충제(50mM 트리스, 150mM NaCl, 5mM CaCl2(pH 7.5)) 중에 있다. 이 기술은 결합 단백질(또는 표적) 농도의 함수로서 결합 및 유리 결합 단백질의 농도를 측정하도록 이용될 수 있다. 결합 결합 단백질의 농도([결합])는 유리 결합 단백질의 농도([유리]) 및 표적에서의 결합 단백질에 대한 결합 부위의 농도와 관련되고, 여기서 (N)은 하기 식에 의해 표적 분자마다 결합 부위의 수이다:
[결합] = Nㆍ[유리]/((1/Ka) + [유리]).
Ka를 정확히 결정하는 것이 항상 필요한 것이 아니더라도, 이것이 때때로 예를 들어 ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 이용하여 측정된 친화도의 정량적 측정을 얻기에 충분하므로 Ka에 비례하고, 따라서 친화도의 정성적 측정을 얻도록, 또는 실험실내 또는 생체내 검정과 같은 기능적 검정에서, 예를 들어 활성에 의해 친화도의 추론을 얻도록, 더 높은 친화도가 예를 들어 2배 더 높은지를 결정하는 것과 같은 비교에 사용될 수 있다.
용어 "결합 단백질"은 표적 분자와 상호작용할 수 있는 단백질을 의미한다. 이 용어는 "리간드"와 상호 교환되어 사용된다. "혈장 칼리크레인 결합 단백질"은 혈장 칼리크레인과 상호작용(예를 들어, 결합)할 수 있는 단백질을 의미하고, 특히 혈장 칼리크레인과 우선적으로 또는 특이적으로 상호작용하고/하거나 이를 저해하는 단백질을 포함한다. 단백질은 동일한 조건 하에 단백질의 부재 하에 혈장 칼리크레인의 활성과 비교하여 혈장 칼리크레인의 활성을 감소시키는 경우 혈장 칼리크레인을 저해한다. 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 항체이다.
용어 "포획 시약"은 리간드에 특이적으로 결합하는 모이어티를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "복합체" 또는 "복합체 형성"은 서로에 대해 특이적 친화도를 갖는 구성원 사이의 복합체를 의미한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에 정의되어 있다. 이 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
생물중합체에 대한 모티프 서열은 아미노산이 변할 수 있는 위치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상황에서 기호 "X"는 일반적으로 달리 기재되지 않은 한 임의의 아미노산(예를 들어, 임의의 20개의 천연 아미노산)을 의미하고, 예를 들어 임의의 비시스테인 아미노산을 의미한다. 다른 허용되는 아미노산은 또한 예를 들어 괄호 및 슬래시를 사용하여 표시될 수 있다. 예를 들어, "(A/W/F/N/Q)"는 알라닌, 트립토판, 페닐알라닌, 아스파라긴 및 글루타민이 이 특정한 위치에서 허용된다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "검출 시약"은 검출하고자 하는 모이어티에 결합하는 모이어티를 의미한다. 통상적으로, 이것은 신호, 예를 들어 형광을 생성하거나, 측정 가능한 화합물을 생성한다.
"에피토프"는 결합 단백질(예를 들어, 항체, 예컨대 Fab 또는 전장 항체)에 의해 결합된 표적 화합물 상의 부위를 의미한다. 표적 화합물이 단백질인 경우, 이 부위는 전부 아미노산 성분으로 이루어지거나, 전부 단백질의 아미노산의 화학 변형(예를 들어, 글라이코실 모이어티)으로 이루어지거나, 이들의 조합으로 이루어질 수 있다. 중첩하는 에피토프는 적어도 하나의 공통의 아미노산 잔기, 글라이코실기, 포스페이트기, 설페이트기 또는 다른 분자 특징을 포함한다.
제1 결합 단백질이 제2 결합 단백질이 결합하는 표적 화합물 상의 동일한 부위에 결합하거나, 제2 결합 단백질이 결합하는 부위와 중첩(예를 들어, 아미노산 서열 또는 다른 분자 특징(예를 들어, 글라이코실기, 포스페이트기 또는 설페이트기)의 면에서, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 중첩)하는 부위에 결합하는 경우, 제1 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 제2 결합 단백질(예를 들어, 항체)과 "동일한 에피토프에 결합한다".
에피토프에 대한 제1 결합 단백질의 결합이 에피토프에 결합하는 제2 결합 단백질의 양을 (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상) 감소시키는 경우, 제1 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 제2 결합 단백질(예를 들어, 항체)과 "결합에 대해 경쟁한다". 경쟁은 직접적(예를 들어, 제1 결합 단백질은 제2 결합 단백질이 결합한 에피토프와 동일하거나 이와 중첩하는 에피토프에 결합함) 또는 간접적(예를 들어, 에피토프에 대한 제1 결합 단백질의 결합은 에피토프에 결합하는 제2 결합 단백질의 능력을 감소시키는 표적 화합물의 입체 변화를 발생시킴)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, "기능적" 생물학적 분자는 이것이 특징으로 하는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다.
2개의 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성"(이 용어는 본 명세서에서 상호 교환되어 사용됨)의 계산을 하기와 같이 수행한다. 최적 비교 목적을 위해 서열을 정렬한다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에서 갭이 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비상동성 서열을 버릴 수 있음). 최적 정렬은 12의 갭 패널티(gap penalty), 4의 갭 연장 패널티(gap extend penalty) 및 5의 프레임 시프트 갭 패널티(frameshift gap penalty)를 갖는 블러섬(Blossum) 62 스코어링 매트릭스를 갖는 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 이용하여 최고의 점수로서 결정된다. 이후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치를 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 점유하는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다(본 명세서에 사용된 바대로 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동일함). 2개의 서열 사이의 동일성의 백분율은 서열이 공유한 동일한 위치의 수의 함수이다.
바람직한 실시형태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 기준 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 60% 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98% 또는 100%이다. 예를 들어, 기준 서열은 면역글로불린 가변 도메인 서열의 길이일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "낮은 엄격도, 중간 엄격도, 높은 엄격도 또는 매우 높은 엄격도 조건 하에 하이브리드화한다"는 하이브리드화 및 세척에 대한 조건을 기술한다. 하이브리드화 반응을 수행하기 위한 가이드라인은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 확인될 수 있다. 수성 및 비수성 방법은 이 참조문헌에 기재되어 있고, 이 중 어느 하나가 이용될 수 있다. 본 명세서에서 언급한 특정한 하이브리드화 조건은 하기와 같다: (1) 약 45℃에서의 6X 염화나트륨/나트륨 시트레이트(SSC) 중에서, 이어서 적어도 50℃(세척의 온도는 낮은 엄격도 조건 하에 55℃로 증가할 수 있음)에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 중의 2회 세척의 낮은 엄격도 하이브리드화 조건; (2) 약 45℃에서의 6X SSC, 이어서 60℃에서의 0.2X SSC, 0.1% SDS 중의 1회 이상의 세척의 중간 엄격도 하이브리드화 조건; (3) 약 45℃에서의 6X SSC, 이어서 65℃에서의 0.2X SSC, 0.1% SDS 중의 1회 이상의 세척의 높은 엄격도 하이브리드화 조건; 및 (4) 65℃에서의 0.5M 인산나트륨, 7% SDS, 이어서 65℃에서의 0.2X SSC, 1% SDS 중의 1회 이상의 세척의 매우 높은 엄격도 하이브리드화 조건. 매우 높은 엄격도 조건(4)이 바람직한 조건이고, 달리 기재되지 않은 한 사용되어야 하는 것이다. 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 핵산 또는 이의 보체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 낮은, 중간, 높은 또는 매우 높은 엄격도로 하이브리드화하는 핵산을 포함한다. 핵산은 기준 핵산의 길이와 동일한 길이 또는 이의 30%, 20% 또는 10% 내일 수 있다. 핵산은 본 명세서에 기재된 면역글로불린 가변 도메인 서열을 코딩하는 구역에 상응할 수 있다.
"단리된 조성물"은 단리된 조성물이 얻어질 수 있는 천연 샘플의 적어도 하나의 성분의 적어도 90%로부터 제거된 조성물을 의미한다. 관심 있는 종 또는 종의 집단이 중량-중량 기준으로 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 순수한 경우, 인공으로 또는 천연으로 생성된 조성물은 "적어도" 소정의 정도의 순도의 "조성"일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "실험실내"는 다세포 유기체 내보다는 인공 환경, 예를 들어 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등에서 발생하는 사건을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "생체내"는 다세포 유기체, 예컨대 인간 또는 비인간 동물 내에 발생하는 사건을 의미한다.
"단리된 조성물"은 단리된 조성물이 얻어질 수 있는 천연 샘플의 적어도 하나의 성분의 적어도 90%로부터 제거된 조성물을 의미한다. 관심 있는 종 또는 종의 집단이 중량-중량 기준으로 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 순수한 경우, 인공으로 또는 천연으로 생성된 조성물은 "적어도" 소정의 정도의 순도의 "조성"일 수 있다.
"단리된" 단백질은 단리된 단백질이 얻어질 수 있는 천연 샘플의 적어도 하나의 성분의 적어도 90%로부터 제거된 단백질을 의미한다. 관심 있는 종 또는 종의 집단이 중량-중량 기준으로 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 80%, 90%, 92%, 95%, 98% 또는 99% 순수한 경우, 단백질은 "적어도" 소정의 정도의 순도의 "조성"일 수 있다.
용어 "칼리크레인"(예를 들어, 혈장 칼리크레인)은 세린 프로테아제 패밀리의 하위그룹인 펩티다제(단백질 중에 펩타이드 결합을 개열시키는 효소)를 의미한다. 혈장 칼리크레인은 키니노겐을 개열시켜 강력한 전염증성 펩타이드인 키닌을 생성시킨다.
용어 "칼리크레인 저해제"는 칼리크레인을 저해하는 임의의 물질 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, DX-88(또한 본 명세서에서 "PEP-1"이라 칭함)은 혈장 칼리크레인(NP_000883)의 강력한(Ki < 1nM) 및 특이적 저해제이다. (또한, 예를 들어 WO 제95/21601호 또는 WO 제2003/103475호를 참조).
본 명세서에 사용된 바대로 용어 "DX-2922"는 용어 "X101-A01"과 상호 교환되어 사용된다. 이 항체의 다른 변이체는 이하에 기재되어 있다.
Figure pat00001
본 명세서에 사용된 바대로 용어 "DX-2930"은 용어 "X124-G01"과 상호 교환되어 사용된다. 이 항체의 다른 변이체는 이하에 기재되어 있다.
Figure pat00002
용어 "조절자"는, 조절을 발생시킬 수 있는 생물학적 물질, 예컨대 박테리아, 식물, 진균, 또는 동물 세포 또는 조직으로부터 만들어진, 폴리펩타이드, 핵산, 마크로분자, 복합체, 분자, 소분자, 화합물, 종 등(천연 발생 또는 비천연 발생) 또는 추출물을 의미한다. 조절자는 검정에서의 포함에 의해 기능적 특성, 생물학적 활성 또는 프로세스의 저해제 또는 활성자, 또는 이들의 조합(직접적으로 또는 간접적으로)(예를 들어, 효현제, 부분 길항제, 부분 효현제, 역효현제, 길항제, 항미생물제, 미생물 감염 또는 증식의 저해제 등)으로서 가능한 활성에 대해 평가될 수 있다. 이러한 검정에서, 일시에 많은 조절자는 스크리닝될 수 있다. 조절자의 활성은 공지되거나, 비공지되거나, 부분 공지될 수 있다.
"비필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 폐지하지 않거나 더 바람직하게는 이를 실질적으로 변경하지 않으면서 결합제, 예를 들어 항체의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이지만, "필수" 아미노산 잔기의 변경은 실질적인 활성을 손실시킨다.
본 방법에 의해 치료하고자 하는 "환자", "대상체" 또는 "숙주"(이들 용어는 상호 교환되어 사용됨)는 인간 또는 비인간 동물을 의미할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 칼리크레인 매개 장애, 예를 들어 브래디키닌 매개 장애, 예를 들어 유전성 혈관 부종(HAE), 비히스타민 의존적 특발성 혈관 부종, 류마티스성 관절염, 크론병, 루푸스, 알츠하이머병, 패혈성 쇼크, 화상 손상, 뇌 허혈/관류 손상, 대뇌 부종, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 황반 부종, 혈관염, 동맥 또는 정맥 혈전증, 심실 보조 장치 또는 스텐트와 연관된 혈전증, 혈전증을 동반한 헤파린 유도 혈소판 감소증, 혈전색전증 질환, 및 불안정 협심증을 동반한 관상 동맥 질환, 부종, 눈 질환, 통풍, 장 질환, 구강 점막염, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 척추관 협착증-퇴행성 척추 질환, 수술후 장폐색, 대동맥 동맥류, 골관절염, 유전성 혈관 부종, 폐 색전증, 뇌졸중, 머리 외상 또는 종양 주변 뇌 부종, 패혈증, 급성 중대뇌 동맥(MCA) 허혈성 사건(뇌졸중), 재협착증(예를 들어, 혈관성형술 후), 전신성 홍반성 낭창 신염, 자가면역 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경학적 질환, 단백질 미스폴딩과 연관된 질환, 혈관신생, 고혈압성 신경병증 및 당뇨병성 신경병증과 연관된 질환, 알레르기 및 호흡기 질환(예를 들어, 과민증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 급성 호흡기 불안 증후군, 낭성 섬유증, 지속성, 비염) 및 조직 손상(예를 들어, 화상 또는 화학 손상)이 의심되거나, 이의 위험이 있거나, 이를 앓고 있다.
용어 "프리칼리크레인" 및 "혈장 프리칼리크레인"은 본 명세서에서 상호 교환되어 사용되고, 프리칼리크레인으로도 공지된 활성 혈장 칼리크레인의 지모겐 형태를 의미한다.
대상체에서의 질환을 "예방하는" 또는 "예방한다"의 용어는 대상체를 약제학적 치료로 처리하는 것, 예를 들어 질환의 적어도 하나의 증상이 예방되게 하는 약물의 투여, 즉 이것이 원치않는 병증의 발생에 대해 숙주를 보호하도록 원치않는 병증(예를 들어, 숙주 동물의 질환 또는 다른 원치않는 상태)의 임상 표출 전에 투여되는 것을 의미한다. 질환을 "예방한다"는 또한 "예방" 또는 "예방학적 치료"로 칭해질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "실질적으로 동일한"(또는 "실질적으로 상동성")은 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열이 유사한 활성, 예를 들어 결합 활성, 결합 선호도 또는 생물학적 활성을 갖도록(또는 이를 갖는 단백질을 코딩하도록), 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 동일한 또는 동등한(예를 들어, 유사한 측쇄, 예를 들어 보존된 아미노산 치환을 가짐) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 충분한 수를 포함하는 제1 아미노산 또는 핵산 서열을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. 항체의 경우에, 제2 항체는 동일한 특이성 및 동일한 항원에 비해 적어도 50%, 적어도 25% 또는 적어도 10%의 친화도를 갖는다.
본 명세서에 개시된 서열에 대한 서열 유사성 또는 상동성(예를 들어, 적어도 약 85%의 서열 동일성)은 또한 본원의 일부이다. 몇몇 실시형태에서, 서열 동일성은 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다.
또한, 핵산 분절이 가닥의 보체에 선택적 하이브리드화 조건(예를 들어, 매우 엄격한 하이브리드화 조건) 하에 하이브리드화할 때 실질적인 동일성이 존재한다. 핵산은 전체 세포 중에, 세포 용해물 중에 또는 부분 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.
생물중합체에 대한 모티프 서열은 아미노산이 변할 수 있는 위치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상황에서 기호 "X"는 일반적으로 달리 기재되지 않은 한 임의의 아미노산(예를 들어, 임의의 20개의 천연 아미노산)을 의미하고, 예를 들어 임의의 비시스테인 아미노산을 의미한다. 다른 허용되는 아미노산은 또한 예를 들어 괄호 및 슬래시를 사용하여 표시될 수 있다. 예를 들어, "(A/W/F/N/Q)"는 알라닌, 트립토판, 페닐알라닌, 아스파라긴 및 글루타민이 이 특정한 위치에서 허용된다는 것을 의미한다.
임의의 분야 공지된 방법에 의해 통계 유의성을 결정할 수 있다. 예시적인 통계 시험은 스튜던트 T-시험, 만 휘트니(Mann Whitney) U 비모수 시험 및 윌콕손(Wilcoxon) 비모수 통계 시험을 포함한다. 몇몇 통계학적으로 유의적인 관계는 0.05 또는 0.02 미만의 P 값을 갖는다. 2개의 상태 사이의 구별 가능한 정성적 또는 정량적 차이를 나타내는 예를 들어 용어 "유도한다", "저해한다", "강화한다", "상승시킨다", "증가시킨다", "감소시킨다" 등은 2개의 상태 사이의 차이, 예를 들어 통계학적으로 유의적인 차이를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, "샘플"은 대상체로부터의 조직, 예를 들어 혈액, 혈장 또는 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. 샘플은 대상체로부터 취한 초기 비처리 샘플, 및 후속하여 처리된, 예를 들어 부분 정제된 또는 보존된 형태 둘 다를 포함한다. 예시적인 샘플은 혈액, 혈장, 눈물 또는 점액을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 샘플은 혈액 또는 혈장이다.
"치료학적으로 효과적인 투약량"은 바람직하게는 비처리 대상체에 비해 통계학적으로 유의적인 정도 또는 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 60% 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 80%로, 측정 가능한 매개변수, 예를 들어 혈장 칼리크레인 활성을 조절한다. 측정 가능한 매개변수, 예를 들어 질환 관련 매개변수를 조절하는 화합물의 능력은 인간 장애 및 병증에서 효능을 예견하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다.　대안적으로, 조성물의 이 특성은 실험실내 매개변수를 조절하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가될 수 있다.
대상체에서 질환(또는 병증)을 "치료하는" 또는 질환을 갖는 대상체를 "치료하는"은 질환의 적어도 하나의 증상이 치유되거나 경감되거나 감소하도록 대상체를 약제학적 치료로 처리하는 것, 예를 들어 약물의 투여를 의미한다.
대상체에서의 질환을 "예방하는"의 용어는 대상체를 약제학적 치료로 처리하는 것, 예를 들어 질환의 적어도 하나의 증상이 예방되게 하는 약물의 투여, 즉 이것이 원치않는 병증의 발생에 대해 숙주를 보호하도록 원치않는 병증(예를 들어, 숙주 동물의 질환 또는 다른 원치않는 상태)의 임상 표출 전에 투여되는 것을 의미한다. 질환을 "예방하는"은 또한 "예방" 또는 "예방학적 치료"로 칭해질 수 있다.
"예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 성취하는 데 필요한 효과적인 양, 투약량 및 기간을 의미한다. 통상적으로, 예방학적 용량이 질환 전에 또는 이의 초기 병기에 대상체에서 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 낮을 것이다.
알파벳 또는 숫자 도입부를 포함하는 도입부는 단지 이해 및 해석의 편의를 위한 것이고, 반대에 대한 명확한 표시의 부재 시, 제약인 순서 또는 선호도의 계급을 부여하지 않는다.
PKal 및/또는 FXII의 저해에 기초하여 C1-INH를 측정하기 위한 검정 방법 및 키트
활성 칼리크레인 및/또는 활성 FXII에 결합하고 이를 저해하는 C1-INH의 능력에 기초하여 기능적 C1-INH의 수치를 측정하기 위한 방법 및 키트가 본 명세서에 제공된다. 이러한 방법은 C1-INH를 함유하는 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같은 포획 시약과 접촉시키는 단계 및 포획 시약에 결합하는 것에서 C1-INH의 수치를 측정하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 전체 C1-INH의 수치(예를 들어, C1-INH가 본 명세서에 기재된 바와 같은 포획 시약에 결합하는지와 무관하게, 샘플에서의 C1-INH 단백질의 수치)를 또한 측정한다.
혈장 프로테아제 C1 저해제(C1-INH)는 일반적으로 보체 활성화(예를 들어, C1 복합체에서의 C1r 및 C1s 프로테아제의 저해), 혈액 응고, 섬유소용해 및 키닌의 생성을 포함하는 다양한 생리학적 경로를 조절하는 데 중요한 역할을 한다. C1-INH는 XIIa 인자, XIIf 인자 및 칼리크레인에 결합하고 이들을 저해한다. C1-INH는 단백질의 세르핀 슈퍼패밀리의 구성원이고, 2 도메인 구조를 갖는다. C1-INH의 C 말단 세르핀 도메인은 단백질의 저해 활성을 제공한다. 인간 C1-INH의 예시적인 아미노산 서열은 이하에 기재되어 있다(수탁 번호 NP_000053.2).
Figure pat00003
"활성" 또는 "기능적" C1-INH는 성숙 형태를 포함하는 천연 발생 C1-INH와 유사하지만, 반드시 동일하지는 않는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유한 C1-INH 폴리펩타이드 또는 C1-INH 폴리펩타이드 단편을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 활성 또는 기능적 C1-INH는 XIIa 인자, XIIf 인자 또는 칼리크레인 중 하나 이상에 결합하고 FXIIa 및/또는 PKal의 활성을 저해하여, 키닌 형성 과정을 조절하는 C1-INH 폴리펩타이드 또는 C1-INH 폴리펩타이드 단편이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 검정 방법에서 조사되는 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예를 들어 체액 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 혈장 샘플이다. 예를 들어, 적합한 C1-INH 단백질은 생물학적 조직 샘플(예를 들어, 혈액, 혈장, 눈물, 점액), 조직 추출물 또는 제제, 또는 다세포 유기체로부터 직접적으로 획득된(예를 들어, 생체외 절차) 고체 조직에서 제공될 수 있다. 따라서, 무엇보다도, 본 발명에 따른 검정은 진단 또는 바이오마커 측정을 위해 인간 및 다른 다세포 유기체에서 내인성 C1-INH를 모니터링하고/하거나 규명하도록 이용될 수 있다.
A. 검정 포맷
본 명세서에 기재된 검정 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 포획 시약에 결합하는 CI-INH의 수치의 평가(예를 들어, 측정)를 허용한다. 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 수치(예를 들어, 양)는 본 명세서에 기재된 검정 및/또는 당해 분야에 공지된 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 수치를 평가하기 위해 이용될 수 있는 검정은 면역검정, 예컨대 웨스턴 블롯, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)(예를 들어, 샌드위치 ELISA), 방사면역검정, 전기화학발광 기반 검출 검정 및 관련 기법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 예시적인 검정을 실행하기 위해 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 상업적으로 구입 가능하다(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Current edition, Wiley Online Library] 참조).
몇몇 실시형태에서, 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 수치를 ELISA를 이용하여 결정한다. ELISA는 당해 분야에 공지되어 있고(예를 들어, 문헌[Crowther, John R (2009). "The ELISA Guidebook." 2nd ed. Humana Press and Lequin R (2005). "Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)". Clin. Chem. 51 (12): 2415-8]을 참조), 예시적인 ELISA가 본 명세서에 기재되어 있다. ELISA를 실행하기 위한 키트가 또한 당해 분야에 공지되어 있고, 상업적으로 구입 가능하다(예를 들어, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 및 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)사제의 ELISA 키트 참조).
몇몇 실시형태에서, 단일 검정 포맷을 포함하는 저속 플랫폼에서 제공된 검정을 수행한다. 예를 들어, 진단 또는 바이오마커 측정을 위해 생물학적 샘플(예를 들어, 생물학적 조직, 조직 추출물)에서 C1-INH 활성 수치를 측정하기 위해 저속 플랫폼을 사용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제공된 검정은 고속 플랫폼에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 고속 검정을 위해 다중웰 플레이트, 예를 들어 24개, 48개, 96개, 384개 이상의 웰 플레이트를 사용할 수 있다. 각각의 웰에서 동시에 개별적인 검정을 수행할 수 있다. 따라서, 검정 쓰루풋을 증가시키기 위해 동시에 복수의 웰을 측정하게 하는 플레이트를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 몇몇 실시형태에서, 이 플랫폼에 동시에 다중웰(예를 들어, 4개, 16개, 24개, 48개, 96개, 384개 이상의 웰)을 영상화할 수 있는 플레이트 리더기를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 구입 가능한 플레이트 리더기(예를 들어, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer, 메사추세츠주 왈탐)사로부터 구입 가능한 플레이트::비전 시스템)를 사용할 수 있다. 이 플레이트 리더기는 동역학 기반 형광 분석을 할 수 있다. 플레이트::비전 시스템은 고 수집 효율 광학부품을 갖고, 동시의 96웰의 분석에 설계된 특수 광학부품을 갖는다. 추가의 적합한 평행한 플레이트 리더기는 SAFIRE(데칸(Tecan), 캘리포니아주 산호세), FLIPRTETRA(등록상표)(모레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 유니온 시티), FDSS7000(하마마츠(Hamamatsu), 뉴저지주 브릿지워터) 및 CellLux(퍼킨 엘머, 메사추세츠주 왈탐)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 고속 스크리닝 검정은 자동화된다(예를 들어, 로봇 검정에 적합함).
B. 포획 시약
본 명세서에 기재된 검정 방법에서 사용하기 위한 포획 시약은 키닌 형성 캐스케이드를 저해하는, 예를 들어 PKal, FXII 또는 둘 다를 저해하는 데 기능적인 C1-INH와 복합체를 형성할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티; 또는 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편을 포함하는 모이어티 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제공된 포획 시약은 천연 소스로부터 단리되거나/되고 정제된다. 몇몇 실시형태에서, 제공된 포획 시약은 재조합으로 또는 합성적으로 생성된다. 몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 기질, 예를 들어 불용성 기질에 배치된다(예를 들어, 이에 결합한다). 포획 시약은 공유 또는 비공유로 기질에 결합할 수 있다. 포획 시약은 기질에 직접적으로 결합할 수 있거나, 예를 들어 링커를 통해 간접적으로 결합할 수 있다. 링커의 예는 탄소 함유 사슬, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 핵산, 모노사카라이드 단위, 바이오틴-아비딘 및 펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 기질은 하나 이상의 웰을 포함하는 용기, 예를 들어 미량적정 플레이트이다. 전장 포획 시약의 단편을 생성하고, 단편이 C1-INH에 결합하는지를 결정함으로써 칼리크레인 또는 XII 인자의 활성 형태의 C1-INH-결합 단편을 만들 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 기질, 예를 들어 불용성 기질에 배치된(예를 들어, 이에 결합된) 제2 특이적 결합 모이어티, 예를 들어 바이오틴 또는 아비딘과 복합체를 형성하는 제1 특이적 결합 모이어티, 예를 들어 바이오틴 또는 아비딘을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 혈장 칼리크레인 또는 이의 기능적 단편, FXII 또는 이의 기능적 단편 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
(ⅰ) 혈장 칼리크레인
혈장 칼리크레인은 접촉 시스템의 세린 프로테아제 성분이다(Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). 접촉 시스템은 외래 또는 음으로 하전된 표면에 노출 시 XIIa 인자에 의해 또는 프롤릴카복시펩티다제에 의해 내피 세포 표면 상에 활성화된다(Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). 혈장 칼리크레인의 활성화는 XII 인자의 이의 피드백 활성화를 통해 내재 응고를 증폭시키고, 전염증성 노나펩타이드 브래디키닌의 생성을 통해 염증을 증대시킨다. 순환에서 주요 키니노게나제로서, 혈장 칼리크레인은 맥관구조에서의 브래디키닌의 생성을 주로 담당한다.
예시적인 혈장 칼리크레인 서열은 인간, 마우스 또는 랫트 혈장 칼리크레인 아미노산 서열, 이들의 서열 또는 이들의 단편, 예를 들어 하기 제공된 서열 중 하나와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인은 자연으로부터 단리된다. 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인은 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성된다.
인간 혈장 칼리크레인의 예시적인 서열은 이하에 기재되어 있다(수탁 번호 NP_000883.2). 인간 혈장 칼리크레인(86kDa)은 인간 혈장으로부터 정제되고 XIIa 인자에 의해 활성화된다. XIIa 인자는 (하기 서열에서 "/"로 표시된 개열 부위인, Arg371-Ile372 사이의) 단일 부위에서 폴리펩타이드 서열을 개열시킴으로써 프리칼리크레인을 활성화한다(이로써 활성 혈장 칼리크레인을 생성하고, 이것은 이후 2개의 이황화 연결된 폴리펩타이드; 대략 52kDa의 중쇄 및 대략 34kDa의 촉매 도메인으로 이루어짐)[Colman and Schmaier, (1997) "Contact System: A Vascular Biology Modulator With Anticoagulant, Profibrinolytic, Antiadhesive, and Proinflammatory Attributes" Blood, 90, 3819-3843].
Figure pat00004
인간, 마우스 및 랫트 프리칼리크레인 아미노산 서열 및 이들을 코딩하는 mRNA 서열은 하기 예시되어 있다. 프리칼리크레인의 서열은, 활성 혈장 칼리크레인(pKal)이 2개의 사슬을 생성하는 단일 위치("/"로 표시됨)에서 개열된 단일 폴리펩타이드 사슬을 갖는다는 점을 제외하고, 혈장 칼리크레인과 동일하다. 하기 제공된 서열은 신호 서열을 포함하는 완전 서열이다. 발현 세포로부터 분비 시, 신호 서열이 제거되는 것으로 예상된다.
인간 혈장 칼리크레인(수탁 번호 NP_000883.2)
Figure pat00005
마우스 혈장 칼리크레인(수탁 번호 NP_032481.1)
Figure pat00006
랫트 혈장 칼리크레인(수탁 번호 NP_036857.2)
Figure pat00007
"활성" 또는 "기능적" 혈장 칼리크레인은 성숙 형태를 포함하는 천연 발생 혈장 칼리크레인과 유사하지만, 반드시 동일하지는 않는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유한 혈장 칼리크레인 폴리펩타이드 또는 혈장 칼리크레인 폴리펩타이드 단편을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 활성 또는 기능적 혈장 칼리크레인은 C1-INH에 결합하는 혈장 칼리크레인 폴리펩타이드 또는 혈장 칼리크레인 폴리펩타이드 단편이다.
(ⅱ) XII 인자
XII 인자는 혈액 응고의 개시, 섬유소용해 및 브래디키닌 및 안지오텐신의 생성에 참여하는 혈청 당단백질이다. 프리칼리크레인은 XII 인자에 의해 개열되어 칼리크레인을 형성하고, 이것은 이후 XII 인자를 활성화하여 XIIa 인자 및 XII 인자 단편(XIIf 인자)를 형성시킨다("Histidine-rich glycoprotein binds factor XIIa with high affinity and inhibits contact-initiated coagulation" Macquarrie, et al. Blood 117:4134-4141 2011). C1 저해제(C1-INH)는 XIIa 인자 및 XIIf 인자 둘 다의 중요한 혈장 저해제인 것으로 밝혀졌다("Effect of negatively charged activating compounds on inactivation of factor XIIa by C1 inhibitor" Pixley, et al. Arch Biochem Biophys 256(2):490-8 1987).
인간 XII 인자의 전구체 단백질 서열 및 mRNA 서열(수탁 번호 NM_000505.3 및 NP_000496.2), 및 활성화된 형태 XIIa 인자는 이하에 기재되어 있다.
Figure pat00008
"활성" 또는 "기능적" XII 인자는 성숙 형태를 포함하는 천연 발생 XII 인자와 유사하지만, 반드시 동일하지는 않는 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 보유한 XII 인자 폴리펩타이드 또는 XII 인자 폴리펩타이드 단편을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 활성 또는 기능적 XII 인자는 C1-INH에 결합하는 XII 인자 폴리펩타이드 또는 XII 인자 폴리펩타이드 단편이다. 몇몇 실시형태에서, 활성 또는 기능적 XII 인자는 C1-INH에 결합하는 XIIa 인자 폴리펩타이드 또는 XIIa 인자 폴리펩타이드 단편이다. 몇몇 실시형태에서, 활성 또는 기능적 XII 인자는 C1-INH에 결합하는 XIIf 인자 폴리펩타이드 또는 XIIf 인자 폴리펩타이드 단편이다.
C. 검출제
제공된 방법은 포획 시약, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 포획 시약과 C1-INH 사이의 복합체 형성의 검출을 허용한다. 복합체의 검출은 임의의 이용 가능한 방법, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, C1-INH에 대한 항체를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 2차 항체, 예를 들어 항-C1-INH 항체를 사용한다. 하나 이상의 항체를 검출 모이어티에 커플링할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 검출 모이어티는 형광단이거나 이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "형광단"(또한 "형광성 라벨" 또는 "형광성 염료"라 칭함)은 한정된 여기 파장에서 광 에너지를 흡수하고 상이한 파장에서 광 에너지를 방출하는 모이어티를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 검출 모이어티는 효소이거나 이를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 효소는 무색 기질로부터 유색 생성물을 생성하는 것(예를 들어, β-갈락토시다제)이다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "측정하는" 또는 "측정", 또는 대안적으로 "검출하는" 또는 "검출"은, 이러한 물질의 정성적 또는 정량적 농도 수치의 편차를 포함하는, 샘플 내의 물질의 존재, 부재, 분량 또는 양(유효량일 수 있음)을 평가하는 것 또는 그렇지 않으면 대상체의 값 또는 분류를 평가하는 것을 의미한다.
몇몇 실시형태에서, 예를 들어 ELISA를 이용하여, 예를 들어 포획 물질이 기질에 결합하는 조건 하에 포획 물질을 기질, 예를 들어 반응 용기에 첨가함으로써 시험을 실행한다. 샘플, 예를 들어 대상체로부터의 조직 샘플, 예를 들어 혈액, 혈장 또는 눈물을 기질, 예를 들어 반응 용기를 함유하는 포획 물질에 첨가할 수 있다. 존재하는 임의의 포획 물질-결합 분자는 부동화된 포획 물질 분자에 결합할 수 있다. 항체 또는 항체-검출제 접합체를 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 접합체의 항체 부분은 이전에 결합된 임의의 항원 분자(예를 들어, C1-INH)에 결합하여, 항체-항원-항체 "샌드위치"를 생성한다. 임의의 비결합 접합체를 세척한 후, 검출을 보조하기 위해 기질 용액을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 세트 간격 후에, (예를 들어, 1N NaOH를 첨가함으로써) 반응을 중지시킬 수 있고, 분광기에서 형성된 유색 생성물의 농도를 측정할 수 있다. 색상의 강도는 결합 항원의 농도에 비례한다.
(ⅰ) 항체
제공된 방법에서 항체를 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 포획 물질은 항체이거나 이를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 검출제는 항체이거나 이를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, pKal 매개 또는 브래디키닌 매개 장애의 치료를 위한 치료학적 조성물은 항체이거나 이를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 표적 항원 또는 에피토프, 예를 들어 C1-INH에 특이적으로 결합한다. 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 당해 분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법은 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 항체는 대안적인 표적과 반응하거나 회합하는 것보다 특정한 표적 항원과 더 빈번히, 더 신속히, 더 긴 기간 동안 및/또는 더 높은 친화도로 반응하거나 회합하는 경우 "특이적 결합"을 나타낸다고 말해진다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 높은 친화도, 친화성으로, 더 용이하게 및/또는 더 긴 기간 동안 결합하는 경우 표적 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합한다". 예를 들어, 항원(예를 들어, C1-INH)에 특이적으로(또는 우선적으로) 결합하는 항체 또는 이 내부의 항원 에피토프는 다른 항원 또는 동일한 항원에서의 다른 에피토프에 결합하는 것보다 더 높은 친화도, 친화성으로, 더 용이하게 및/또는 더 긴 기간 동안 이 표적 항원에 결합하는 항체이다. 이 정의를 이해함으로써, 예를 들어 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 제2 표적 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 또한 이해된다. 그러므로, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (비록 포함할 수는 있지만) 반드시 필요한 것은 아니다. 반드시 그런 것은 아니지만, 일반적으로, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다. 몇몇 예에서, 표적 항원 또는 이의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 다른 항원 또는 동일한 항원에서의 다른 에피토프에 결합하지 않을 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 표적 항원 또는 항원 에피토프(예를 들어, C1-INH)에 대해 적합한 결합 친화도를 갖는다. 본 명세서에 사용된 바대로, "결합 친화도"는 겉보기 결합 상수 또는 KA를 의미한다. KA는 분해 상수(KD)의 역수이다. 본 명세서에 기재된 항체는 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10M 이하의 결합 친화도(KD)를 가질 수 있다. 결합 친화도 증가는 KD 감소에 상응한다. 제2 항원에 비해 제1 항원에 대한 항체의 더 높은 친화도 결합은 제2 항원의 결합에 대한 KA(또는 숫자 값 KD)보다 제1 항원의 결합에 대한 더 높은 KA(또는 더 작은 숫자 값 KD)로 표시될 수 있다. 이런 경우에, 항체는 제2 항원에 비해 제1 항원에 대해 특이성을 갖는다. (예를 들어, 특이성 또는 다른 비교에 대한) 결합 친화도의 차이는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10,000 또는 105배일 수 있다.
결합 친화도(또는 결합 특이성)은 본 명세서에 기재된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 "항체"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 항체는 중쇄(H) 가변 구역(본 명세서에서 VH로 축약), 및 경쇄(L) 가변 구역(본 명세서에서 VL이라 축약)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체는 2개의 중쇄(H) 가변 구역 및 2개의 경쇄(L) 사슬 가변 구역을 포함한다. 용어 "항체"는 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 사슬 항체, Fab 및 sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv 및 도메인 항체(dAb) 단편(de Wildt et al., Eur J Immunol. 1996; 26(3):629-39) 및 완전한 항체를 포함한다. 항체는 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM(및 이의 아형)의 구조적 특징을 가질 수 있다. 항체는 임의의 공급원 유래일 수 있지만, 영장류(인간 및 비인간 영장류) 및 영장류화가 바람직하다.
VH 및 VL 구역은 "프레임워크 구역"("framework region: FR")이라 칭하는 더 보존된 구역 사이의 "상보성 결정 구역"("complementarity determining region: CDR")이라 칭하는 초가변 구역으로 추가로 세분될 수 있다. 프레임워크 구역 및 CDR의 정도는 정확히 정의되어 있다(문헌[Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 간행물 91-3242호, 및 Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917] 참조, 또한 www.hgmp.mrc.ac.uk 참조). 카밧 정의가 본 명세서에서 사용된다. 각각의 VH 및 VL은 통상적으로, 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다.
항체의 VH 또는 VL 사슬은 중쇄 또는 경쇄 불변 구역의 전부 또는 일부를 추가로 포함하여 각각 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 사슬을 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 2개의 중쇄 면역글로불린 사슬 및 2개의 경쇄 면역글로불린 사슬의 사합체이고, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬은 예를 들어 이황화 결합에 의해 상호 연결된다. IgG에서, 중쇄 불변 구역은 CH1, CH2 및 CH3인 3개의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 경쇄 불변 구역은 CL 도메인을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 구역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 구역은 통상적으로 전통적인 보체 시스템의 제1 성분(Clq) 및 면역계(예를 들어, 이팩터 세포)의 다양한 세포를 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개한다. 면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다의 유형일 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 글라이코실화된다. 항체는 항체 의존적 세포독성 및/또는 보체 매개 세포독성에 대해 기능적일 수 있다.
항체의 하나 이상의 구역은 인간 또는 효과적으로 인간일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 구역은 인간 또는 효과적으로 인간일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 CDR은 인간, 예를 들어 HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3일 수 있다. 각각의 경쇄 CDR은 인간일 수 있다. HC CDR3은 인간일 수 있다. 하나 이상의 프레임워크 구역은 인간, 예를 들어 HC 또는 LC의 FR1, FR2, FR3 및 FR4일 수 있다. 예를 들어, Fc 구역은 인간일 수 있다. 일 실시형태에서, 모든 프레임워크 구역은 인간이고, 예를 들어 인간 체세포 세포, 예를 들어 면역글로불린을 생성하는 조혈 세포 또는 비조혈 세포에 의해 생성된 항체의 프레임워크의 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, 인간 서열은 예를 들어 생식선 핵산에 의해 코딩된 생식선 서열이다. 일 실시형태에서, 선택된 Fab의 프레임워크(FR) 잔기는 가장 유사한 영장류 생식선 유전자, 특히 인간 생식선 유전자에서 상응하는 잔기의 아미노산 유형으로 전환될 수 있다. 하나 이상의 불변 구역은 인간 또는 효과적으로 인간일 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 가변 도메인, 불변 구역, 불변 도메인(CH1, CH2, CH3, CL1), 또는 전체 항체의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% 또는 100%는 인간 또는 효과적으로 인간일 수 있다.
항체의 전부 또는 일부는 면역글로불린 유전자 또는 이의 분절에 의해 코딩될 수 있다. 예시적인 인간 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파(IgA1 및 IgA2), 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 불변 구역 유전자, 및 많은 면역글로불린 가변 구역 유전자를 포함한다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25KDa 또는 약 214개의 아미노산)는 NH2 말단(약 110개의 아미노산)에서 가변 구역 유전자에 의해 코딩되고, COOH- 말단에서 카파 또는 람다 불변 구역 유전자에 의해 코딩된다. 전장 면역글로불린 "중쇄"(약 50KDa 또는 약 446개의 아미노산)는 유사하게 가변 구역 유전자(약 116개의 아미노산) 및 다른 상기 언급된 불변 구역 유전자 중 하나, 예를 들어 (약 330개의 아미노산을 코딩하는) 감마에 의해 코딩된다. HC CDR3이 약 3개의 아미노산 잔기로부터 35개 초과의 아미노산 잔기로 변하므로, 인간 HC의 길이가 상당히 변한다.
전장 항체의 용어 "항원 결합 단편"은 관심 있는 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 전장 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 전장 항체의 용어 "항원 결합 단편" 내에 포함된 결합 단편의 예는 (ⅰ) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ⅱ) 힌지 구역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (ⅲ) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (ⅳ) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (ⅴ) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (ⅵ) 작용성을 보유하는 단리된 상보성 결정 구역(CDR)을 포함한다. 더욱이, VL 및 VH인 Fv 단편의 2개의 도메인이 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들이, 단일 사슬 Fv(scFv)로서 공지된 1가 분자를 형성하도록 VL 및 VH 구역이 쌍을 지은, 단일 단백질 사슬을 만들게 하는, 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 이들은 연결될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,260,203호, 제4,946,778호 및 제4,881,175호; 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]을 참조한다.
항체 단편은 당해 분야의 당업자에게 공지된 종래의 기술을 포함하는 임의의 적절한 기술을 이용하여 얻어질 수 있다. 용어 "단일특이적 항체"는 특정한 표적, 예를 들어 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는 항체를 의미한다. 이 용어는 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"(이는 항체가 어떻게 생성되는지와 무관하게 본 명세서에 사용된 바대로 단일 분자 조성물의 항체 또는 이의 단편 제제를 의미함)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "인간화" 면역글로불린 가변 구역은, 면역글로불린 가변 구역이 정상 인간에서 면역원성 반응을 발생시키지 않도록, 충분한 수의 인간 프레임워크 아미노산 위치를 포함하도록 변형된 면역글로불린 가변 구역을 의미한다. "인간화" 면역글로불린의 상세내용은 예를 들어 미국 제6,407,213호 및 미국 제5,693,762호를 포함한다.
저해 상수(Ki)는 저해제 효력의 측정치를 제공하고; 이것은 효소 활성을 반으로 감소시키는 데 필요한 저해제의 농도이고, 효소 또는 기질 농도에 의존하지 않는다. 겉보기 Ki(Ki,app)는 반응의 정도(예를 들어, 효소 활성)에 대한 상이한 농도의 저해제(예를 들어, 저해 결합 단백질)의 저해 효과를 측정함으로써; 모리슨 식(Morrison equation)(식 1)에 대한 저해제 농도의 함수가 겉보기 Ki 값의 예측치를 생성하면서, 유사-1차 속도 상수의 변화를 맞춤으로써, 상이한 기질 농도에서 얻어진다. Ki는 기질 농도에 대한 Ki,app의 도면의 선형 회귀 분석으로부터 추출된 y 절편으로부터 얻어진다.
Figure pat00009
식 중, ν = 측정된 속도; ν0 = 저해제의 부재 하의 속도; Ki,app = 겉보기 저해 상수; I = 전체 저해제 농도; 및 E = 전체 효소 농도.
D. 키트
본 개시내용은 또한 PKal 및/또는 FXII를 저해하는 데 기능적인 C1-INH를 평가하는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 포획 시약 및 (b) 또한 본 명세서에 기재된 C1-INH에 결합하는 검출 시약, 예를 들어 항-C1-INH 항체 및 임의로, (c) C1-INH를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 (ⅰ) XII 인자의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편; (ⅱ) 칼리크레인의 활성 형태 또는 이의 C1-INH-결합 단편; 또는 (ⅲ) (ⅰ)과 (ⅱ)의 조합을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 포획 시약은 기질, 예컨대 마이크로플레이트에 부동화된다.
몇몇 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 포함된 설명서는 인간 환자로부터 수집된 생물학적 샘플일 수 있는 샘플에서 기능적 C1-INH의 수치를 측정하기 위해 키트에 포함된 성분을 어떻게 사용하는지의 설명을 포함할 수 있다.
키트의 사용에 관한 설명서는 일반적으로 본 명세서에 기재된 검정 방법을 수행하기 위한 각각의 성분의 양 및 적합한 조건에 대한 정보를 포함한다. 키트 내의 성분은 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중 용량 패키지) 또는 하위단위 용량으로 있을 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 설명서는 통상적으로 라벨 또는 패키지 인서트 위의 서면 설명서(예를 들어, 키트에 함유된 종이 시트)이지만, 기계로 판독 가능한 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 보유된 설명서)가 또한 허용된다.
라벨 또는 패키지 인서트는 PKal 및/또는 FXII의 저해에 기초하여 기능적 C1-INH의 수치를 평가하기 위해 키트가 사용된다는 것을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위해 설명서가 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합한 패키징에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 용기(jar), 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉 마일러(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특수 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 분무기) 또는 인퓨젼 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키징이 또한 고려된다. 키트는 무균 접근 포트(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘이 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음)를 가질 수 있다. 용기는 또한 무균 접근 포트(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘이 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음)를 가질 수 있다.
키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 보통, 키트는 용기 및 용기 위의 또는 이와 연관된 라벨 또는 패키징 인서트(들)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
질환 진단 및 예후에서의 검정 방법의 적용
본 명세서에 기재된 검정 방법 및 키트는 질환의 평가, 예를 들어 질환의 진단 또는 예후에 적용될 수 있다. 평가는 본 명세서에 기재된 바와 같은 질환, 예를 들어 pKal 매개 장애, 예컨대 HAE(예를 들어, 1형 및/또는 2형 HAE)의 위험이 있거나 이를 갖는 것으로서 대상체를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 평가는 또한 질환의 치료를 모니터링하는 단계, 예컨대 PKal 매개 장애, 예컨대 HAE(예를 들어, 1형 및/또는 2형 HAE)에 대해 치료의 유효성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
A. 진단
몇몇 실시형태에서, 후보 대상체(예를 들어, PKal 매개 장애, 예컨대 HAE를 갖는 것으로 의심되는 인간 환자)로부터 수집된 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액 샘플 또는 혈장 샘플)에서 C1-INH의 수치를 결정하기 위해 검정 방법 및 키트를 수행한다. 이후, C1-INH 수치를 기준값과 비교하여 대상체가 PKal 매개 장애를 갖거나 이의 위험이 있는지를 결정한다. 기준값은 본 명세서에 기재된 바와 같은 포획 시약(예를 들어, pKal 또는 FXII)에 결합할 수 있는 대조군 C1-INH의 수준일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 대조군 수준은 포획 시약, 예컨대 바람직하게는 후보 대상체와 동일한 종인 건강한 대상체 또는 건강한 대상체의 집단으로부터 얻은 샘플(예를 들어, 혈액 또는 혈장 샘플)에 결합할 수 있는 대조군 샘플에서의 C1-INH의 수준이다. 본 명세서에 사용된 바대로, 건강한 대상체는 C1-INH의 수치가 측정되는 때에 표적 질환(예를 들어, PKal 매개 장애, 예컨대 HAE)이 겉보기에 없거나 질환의 병력을 갖지 않는 대상체이다.
대조군 수준은 또한 미리 결정된 수준일 수 있다. 이러한 미리 결정된 수준은 표적 질환을 갖지 않거나 이의 위험을 갖지 않는 대상체의 집단에서 (포획 시약에 결합할 수 있는) 기능적 C1-INH의 수치를 나타낼 수 있다. 이것은 또한 pKal 저해제에 의한 치료에 이익을 받지 않을 것 같은 대상체의 집단에서의 기능적 C1-INH의 수치를 나타낼 수 있다.
미리 결정된 수준은 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 이것은 단일 컷오프 값, 예컨대 중앙 또는 평균일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이러한 미리 결정된 수준은 비교 그룹에 기초하여 확립될 수 있고, 예컨대 여기서 하나의 규정된 그룹은 표적 질환을 갖는 것으로 공지되어 있고, 또 다른 규정된 그룹은 표적 질환을 갖지 않는 것으로 공지되어 있다. 대안적으로, 미리 결정된 수준은 범위, 예를 들어 미리 결정된 백분위 내의 대조군 집단에서의 기능적 C1-INH의 수치를 나타내는 범위일 수 있다.
본 명세서에 기재된 바대로 대조군 수준은 일상적인 기술에 의해 결정될 수 있다. 몇몇 예에서, 대조군 수준은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 대조군 샘플에서 종래의 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 시험 샘플에서 포획 시약에 결합할 수 있는 C1-INH의 수치를 얻기 위한 동일한 검정)을 수행함으로써 얻어질 수 있다. 다른 예에서, C1-INH의 수치는 대조군 집단의 구성원으로부터 얻어질 수 있고, 결과는 대조군 집단에서 개열된 키니노겐 및/또는 온전한 키니노겐의 수치를 나타내는 대조군 수준(미리 결정된 수준)을 얻기 위해, 예를 들어 컴퓨터 프로그램에 의해 분석될 수 있다.
후보 대상체로부터 얻은 샘플에서의 포획 시약에 결합할 수 있는 C1-INH의 수치를 본 명세서에 기재된 바와 같은 기준값과 비교함으로써, 후보 대상체가 PKal 매개 질환(예를 들어, HAE)을 갖거나 이의 위험이 있는지에 대해 결정할 수 있다. 예를 들어, 후보 대상체의 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 수치가 기준값으로부터 벗어나는 경우(예를 들어, 기준값과 비교하여 감소하는 경우), 후보 대상체는 HAE와 같은 질환을 갖거나 이의 위험이 있는 것으로서 확인될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, "상승한 수치 또는 기준값보다 높은 수치"는 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 수치가 기준값, 예컨대 대조군 샘플에서의 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 미리 결정된 쓰레스홀드 또는 수치보다 높다는 것을 의미한다. 대조군 수준은 본 명세서에 자세히 기재되어 있다. 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 상승한 수치는 기준값보다 예를 들어 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 높은 C1-INH 수치를 포함한다. 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 상승한 수치는 또한 0의 상태(예를 들어, 샘플에서 포획 시약에 결합하는 C1-INH가 검출 가능하지 않거나 없음)로부터 0이 아닌 상태(예를 들어, 샘플에서 약간의 또는 검출 가능한 포획 시약에 결합하는 C1-INH)의 현상을 증가시키는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "감소한 수치 또는 기준값보다 낮은 수치"는 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 수치가 기준값, 예컨대 대조군 샘플에서의 포획 시약에 결합하는 C1-INH의 미리 결정된 쓰레스홀드 또는 수치보다 낮다는 것을 의미한다. 대조군 수준은 본 명세서에 자세히 기재되어 있다. 감소한 C1-INH의 수치는 기준값보다 예를 들어 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 낮은 C1-INH 수치를 포함한다. 포획 시약에 결합하는 감소한 C1-INH의 수치는 또한 0이 아닌 상태(예를 들어, 샘플에서의 약간의 또는 검출 가능한 C1-INH)로부터 0의 상태(예를 들어, 샘플에서 포획 시약에 결합하는 C1-INH가 검출 가능하지 않거나 없음)의 현상을 감소시키는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 후보 대상체는 pKal 매개 장애, 예를 들어 본 명세서에 개시된 것, 예컨대 HAE의 증상을 갖는 인간 환자이다. 예를 들어, 대상체는 부종, 종창(여기서, 상기 종창은 완전히 또는 주로 말초임); 두드러기; 충혈, 통증 및 감염의 증거의 부재 하의 종창; 비히스타민 매개 부종, 종창의 재발성 공격 또는 이들의 조합을 갖는다. 다른 실시형태에서, 대상체는 샘플이 수집된 때에 pKal 매개 장애의 증상을 갖지 않거나, pKal 매개 장애의 증상의 병력을 갖지 않거나, pKal 매개 장애, 예컨대 HAE의 병력을 갖지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 항히스타민 치료제, 코르티코스테로이드 치료제 또는 둘 다에 내성을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 활성을 포함하는 질환 또는 병증은 유전성 혈관 부종(HAE)이다. 유전성 혈관 부종(HAE)은 또한 "퀸케(Quincke) 부종", C1 에스터라제 저해제 결핍증, C1 저해제 결핍증 및 유전성 혈관신경성 부종(HANE)으로 공지되어 있다. HAE는 예를 들어 사지, 얼굴, 생식기, 위장관 및 기도에 영향을 미칠 수 있는 심각한 종창(혈관 부종)의 재발성 삽화를 특징으로 한다. HAE의 증상은 예를 들어 팔, 다리, 입술, 눈, 혀 및/또는 목의 종창; 목 종창 및 갑작스런 목쉼을 포함할 수 기도 폐색; 명확한 원인이 없는 복부 경련의 반복 삽화; 및/또는 장의 종창(중증일 수 있고, 복부 경련, 구토, 탈수, 설사, 통증 및/또는 쇼크를 발생시킬 수 있음)을 포함한다. 이 HAE를 갖는 개인의 약 ⅓이 공격 동안 윤곽성 홍반이라 불리는 가렵지 않은 발진을 전개시킨다.
기도의 종창은 삶을 위협할 수 있고, 몇몇 환자에서 사망을 야기한다. 사망률은 15-33%로 추정된다. HAE는 매년 약 15,000 내지 30,000개의 응급실 방문을 발생시킨다.
외상 또는 스트레스, 예를 들어 치아 시술, 질병(예를 들어, 바이러스 질병, 예컨대 감기 및 독감), 월경 및 수술은 혈관 부종의 공격을 촉발할 수 있다. HAE의 급성 공격을 예방하기 위해, 환자는 이전에 야기된 공격을 갖는 특수 자극을 피하도록 시도할 수 있다. 그러나, 많은 경우에, 공지된 촉발물질 없이 공격이 발생한다. 통상적으로, HAE 증상은 처음에 어린이에서 나타나고, 사춘기 동안 악화된다. 대체로, 치료되지 않은 개인은 1주 내지 2주마다 공격을 갖고, 대부분의 삽화는 약 3일 내지 4일 동안 지속한다(ghr.nlm.nih.gov/condition/hereditary-angioedema). 공격의 빈도 및 기간은 유전성 혈관 부종을 갖는 사람 중에서, 심지어 동일한 가족의 사람 중에서 매우 변한다.
I형, II형 및 III형으로 공지된 3개의 유형의 HAE가 존재한다. HAE가 50,000명 중 1명의 사람에게 영향을 미치고, I형이 사례의 약 85%를 차지하며, II형이 사례의 약 15%를 차지하고, III형이 매우 희귀한 것으로 추정된다. III형이 가장 새로 기재된 형태이고, 원래 여성에게만 발생하는 것으로 생각되었지만, 이환된 남성을 갖는 가족이 확인되었다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 검정 방법은 1형 HAE 또는 2형 HAE의 진단에 적용될 수 있다. 하기 실시예를 참조한다.
HAE는 상염색체 우성 패턴으로 유전되어서, 이환된 사람은 1명의 이환된 부모로부터 돌연변이를 유전 받을 수 있다. 돌연변이의 새로운 유전자가 또한 발생할 수 있고, 따라서 HAE는 이의 가족에서 장애의 병력을 갖지 않은 사람에서 또한 발생할 수 있다. 사례의 20-25%는 새로운 자발적 돌연변이로부터 생기는 것으로 추정된다.
세르핀G1 유전자의 돌연변이는 유전성 혈관 부종 I형 및 II형을 발생시킨다. 세르핀G1 유전자는 염증을 조절하는 데 중요한 C1 저해제 단백질을 만드는 명령을 제공한다. C1 저해제는 염증을 촉진하는 소정의 단백질의 활성을 차단한다. 유전성 혈관 부종 I형을 발생시키는 돌연변이는 혈액 중 C1 저해제의 수치를 감소시킨다. 반대로, II형을 발생시키는 돌연변이는 비정상적으로 작용하는 C1 저해제를 생성시킨다. 적절한 수치의 기능적 C1 저해제 없이는, 과도한 양의 브래디키닌이 생성된다. 브래디키닌은 혈관벽을 통해 신체 조직으로 유체의 누출을 증가시킴으로써 염증을 촉진한다. 신체 조직에서의 과도한 유체 축적은 유전성 혈관 부종 I형 및 II형을 갖는 개인에서 보이는 종창의 삽화를 발생시킨다.
F12 유전자의 돌연변이는 유전성 혈관 부종 III형의 몇몇 경우와 연관된다. F12 유전자는 응고 XII 인자를 만드는 명령을 제공한다. 혈액 응고(응혈)에서의 중요한 역할 이외에, XII 인자는 또한 염증의 중요한 자극제이고, 브래디키닌의 생성에 관여한다. F12 유전자의 소정의 돌연변이는 활성이 증가한 XII 인자를 생성시킨다. 그 결과, 더 많은 브래디키닌이 생성되고, 혈관벽은 더 누출이 되어, 종창의 삽화를 발생시킨다. 유전성 혈관 부종 III형의 다른 원인은 공지되어 있지 않다. 하나 이상의 아직 확인되지 않은 유전자의 돌연변이는 이 경우에 장애에 원인이 될 수 있다.
HAE는 알레르기 또는 다른 의학 병증으로부터 생긴 혈관 부종의 다른 형태와 유사하게 존재할 수 있지만, 이것은 원인 및 치료에서 상당히 다르다. 유전성 혈관 부종이 알레르기로 오진될 때, 이것은 항히스타민, 스테로이드 및/또는 에피네프린(통상적으로 HAE에서 비효과적이지만, 에피네프린은 삶을 위협하는 반응에 사용될 수 있음)으로 가장 흔히 치료된다. 오진은 또한 복부 종창을 갖는 환자에 대해 불필요한 시험적 수술을 발생시키고, 몇몇 HAE 환자에서 복부 통증은 정신신체증(psychosomatic)으로 부정확하게 진단된다.
HAE의 증상은, 예를 들어 질의서, 예를 들어 환자, 임상의 또는 가족 구성원이 완료한 질의서를 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 질의서는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 육안 아날로그 스케일을 포함한다. 예를 들어, 문헌[McMillan, C.V. et al. Patient. 2012;5(2):113-26]을 참조한다.
혈장 칼리크레인 활성과 관련된 다른 예시적인 질환 또는 병증은 비히스타민 독립적 특발성 혈관 부종, 류마티스성 관절염, 크론병, 루푸스, 알츠하이머병, 패혈성 쇼크, 화상 손상, 뇌 허혈/관류 손상, 뇌 부종, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 황반 부종, 혈관염, 동맥 또는 정맥 혈전증, 심실 보조 장치 또는 스텐트와 연관된 혈전증, 혈전증을 동반한 헤파린 유도 혈소판 감소증, 혈전색전증 질환, 및 불안정 협심증을 동반한 관상 동맥 질환, 부종, 눈 질환, 통풍, 장 질환, 구강 점막염, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 척추관 협착증-퇴행성 척추 질환, 수술후 장폐색, 대동맥 동맥류, 골관절염, 유전성 혈관 부종, 폐 색전증, 뇌졸중, 머리 외상 또는 종양 주변 뇌 부종, 패혈증, 급성 중대뇌동맥(MCA) 허혈성 사건(뇌졸중), 재협착증(예를 들어, 혈관성형술 후), 정신 홍반 루푸스 신염, 자가면역 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경학적 질환, 단백질 미스폴딩과 연관된 질환, 혈관신생, 고혈압성 신경병증 및 당뇨병성 신경병증과 연관된 질환, 알레르기 및 호흡기 질환(예를 들어, 아나필락시스, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 급성 호흡기 불안 증후군, 낭성 섬유증, 지속성, 비염) 및 조직 손상(예를 들어, 화상 또는 화학 손상)을 포함한다.
PKal 매개 장애를 갖거나 이의 위험이 있는 것으로서 확인된 대상체는 치료, 예컨대 본 명세서에 기재된 것으로 처리될 수 있다.
B. 치료 유효성의 평가
본 명세서에 기재된 검정 방법은 또한 PKal 매개 장애(예를 들어, HAE)에 대한 치료의 유효성을 평가하도록 적용될 수 있다. 예를 들어, 복수의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액 또는 혈장 샘플)은 치료 전에 및 후에 또는 치료의 과정 동안에 치료가 수행된 대상체로부터 수집될 수 있다. (PKal 및/또는 FXII를 저해할 수 있는) 기능적 C1-INH의 수치는 본 명세서에 기재된 임의의 검정 방법에 의해 측정될 수 있다. 기능적 C1-INH의 수치가 치료 후에 또는 치료의 과정에 걸쳐 증가하거나(이전에 수집된 샘플과 비교하여 이후에 수집된 샘플에서의 기능적 C1-INH의 수치), 동일하게 있거나 증가하는 경우, 이는 치료가 효과적이라는 것을 나타낸다. 몇몇 예에서, 치료는 치료제, 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같은 칼리크레인 결합제, 본 명세서에 기재된 바와 같은 브래디키닌 B2 수용체 길항제, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 C1-INH 대체 물질을 포함한다. 치료제의 예는 DX-2930 또는 DX88을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
대상체가 치료에 반응성이 아닌 것으로서 확인되는 경우, 치료제의 더 높은 용량 및/또는 투약의 빈도는 확인된 대상체에게 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 치료에 반응하는 것으로서 확인되거나 추가의 치료를 필요로 하지 않는 대상체에서 치료제의 투약량 또는 투약의 빈도가 유지되거나 저하되거나 중지된다. 대안적으로, 상이한 치료는 제1 치료에 반응성이 아닌 것으로 밝혀진 대상체에 적용될 수 있다.
치료
pKal 매개 장애, 예컨대 HAE를 갖거나 이의 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법이 본 명세서에 또한 기재되어 있다. 대상체는, 본 명세서에 기재된 임의의 검정 방법에 의해 결정될 수 있는, (예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은) 기준값과 비교하여 (PKal 또는 FXII를 저해할 수 있는) 기능적 C1-INH의 감소한 수치를 가질 수 있다.
pKal 매개 또는 브래디키닌 매개 장애의 위험이 있거나 이를 앓는(예를 들어, 갖는) 대상체는 임의의 적절한 치료제에 의해 치료될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제공된 방법은 검정의 결과에 기초하여 대상체에 대해 치료를 선택하는 단계를 포함한다. 제공된 검정은 샘플에 존재하는 기능적 C1-INH와 브래디키닌 경로의 활성화된 성분, 예를 들어 무엇보다도 혈장 칼리크레인, XIIa 인자 및 XIIa 인자 사이의 상호작용의 검출을 허용한다. 이러한 상호작용의 낮은 수준은 샘플에서의 기능적 C1-INH의 낮은 수치를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 칼리크레인 결합제, 예를 들어 C1-INH 대체 치료제에 의한 치료는 샘플이 대조군 샘플 또는 기준품과 비교하여 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만의 기능적 CI-INH 결합 활성을 갖는 대상체로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 검정의 결과에 기초하여 대상체에게 투여하기 위한, 치료제, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 칼리크레인 결합제, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 브래디키닌 B2 수용체 길항제, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 C1-INH 대체 물질을 선택하는 단계 또는 투여하는 단계 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질 또는 폴리펩타이드는 대상체에게 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 칼리크레인 결합제는 칼리크레인 저해제, 예를 들어 펩타이드, 소분자 저해제, 칼리크레인 항체 또는 이들의 단편이다. 몇몇 실시형태에서, 브래디키닌 B2 수용체의 길항제는 대상체에게 투여된다. 몇몇 실시형태에서, C1-INH 대체 치료제는 대상체에게 투여된다.
치료제, 예를 들어 칼리크레인 저해제, 예를 들어 브래디키닌 B2 수용체 길항제, 예를 들어 C1-INH 대체 물질은 혈장 칼리크레인 및/또는 브래디키닌 활성을 포함하는 질환 또는 병증의 치료를 위해 병용 치료의 일부로서 또 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 칼리크레인 저해제, 브래디키닌 B2 수용체 길항제 또는 C1-INH 대체 물질 중 하나 이상, 예를 들어 칼리크레인 저해제, 브래디키닌 B2 수용체 길항제 또는 C1-INH 대체 물질 중 하나 이상 및 또 다른 치료제와의 병용 치료는 복수의 상이한 구성으로 제공될 수 있다. 제1 물질은 다른 치료제의 투여 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 몇몇 상황에서, 제1 물질 및 또 다른 치료제(예를 들어, 치료 물질)는 동시에 또는 가까운 시간적 근접성으로(예를 들어, 주사 사이의 짧은 시간 간격, 예컨대 동일한 치료 세션 동안) 투여된다. 제1 물질 및 다른 치료제는 또한 더 긴 시간적 간격으로 투여될 수 있다.
혈장 칼리크레인 결합제
혈장 칼리크레인 결합제(예를 들어, 결합 단백질, 예를 들어 폴리펩타이드, 예를 들어 저해 폴리펩타이드, 예를 들어 항체, 예를 들어 저해 항체, 또는 다른 결합제, 예를 들어 소분자)는 다양한 질환 및 병증, 예를 들어 혈장 칼리크레인 활성을 포함하는 질환 및 병증에 유용한 치료제이다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 활성을 포함하는 질환 또는 병증은 유전성 혈관 부종(HAE)이다. 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질 또는 폴리펩타이드는 pKal 매개 또는 브래디키닌 매개 장애의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 대상체에게 투여된다.
조직 및/또는 혈장 칼리크레인 중 어느 하나인, 칼리크레인의 다수의 유용한 단백질 저해제는 쿠니츠 도메인(Kunitz domain)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바대로, "쿠니츠 도메인"은 적어도 51개의 아미노산을 갖고 적어도 2개 및 바람직하게는 3개의 이황화를 포함하는 폴리펩타이드 도메인이다. 이 도메인은 폴딩되어 제1 시스테인과 제6 시스테인, 제2 시스테인과 제4 시스테인 및 제3 시스테인과 제5 시스테인은 이황화 결합을 형성하거나(예를 들어, 58개의 아미노산을 갖는 쿠니츠 도메인에서, 시스테인은 하기 제공된 BPTI 상동성 서열의 수에 따라 5번, 14번, 30번, 38번, 51번 및 55번 아미노산에 상응하는 위치에 존재할 수 있고, 이황화는 5번과 55번, 14번과 38번 및 30번과 51번 위치의 시스테인 사이에 형성될 수 있음), 2개의 이황화가 존재하는 경우, 이들은 이의 시스테인의 상응하는 하위세트 사이에 형성될 수 있다. 각자의 시스테인 사이의 간격은 하기 제공된 BPTI 서열의 넘버링에 따라 5번 내지 55번, 14번 내지 38번 및 30번 내지 51번에 상응하는 위치 사이의 상기 간격의 7개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개의 아미노산 내에 있을 수 있다. BPTI 서열은 임의의 제너릭 쿠니츠 도메인에서 특정 위치를 언급하도록 기준으로서 사용될 수 있다. 정렬된 시스테인의 수가 최대화되는 베스트 피트 정렬(best fit alignment)을 확인함으로써 관심 있는 쿠니츠 도메인과 BPTI의 비교를 수행할 수 있다.
BPTI의 쿠니츠 도메인의 (높은 해상도의) 3D 구조가 공지되어 있다. X선 구조 중 하나는 "6PTI"로서 브룩하벤(Brookhaven) 단백질 데이터 은행에 수탁되어 있다. 몇몇 BPTI 동족체의 3D 구조(Eigenbrot et al., (1990) Protein Engineering, 3(7):591-598; Hynes et al., (1990) Biochemistry, 29:10018-10022)가 공지되어 있다. 적어도 81개의 쿠니츠 도메인 서열이 공지되어 있다. 공지된 인간 동족체는 조직 인자 경로 저해제(tissue factor pathway inhibitor: TFPI)로서 또한 공지된 LACI의 3개의 쿠니츠 도메인(Wun et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(13):6001-6004; Girard et al., (1989) Nature, 338:518-20; Novotny et al, (1989) J. Biol. Chem., 264(31):18832-18837), α-트립신 간 저해제의 2개의 쿠니츠 도메인, APP-I(Kido et al., (1988) J. Biol. Chem., 263(34):18104-18107), 콜라겐으로부터의 쿠니츠 도메인, TFPI-2의 3개의 쿠니츠 도메인(Sprecher et al., (1994) PNAS USA, 91:3353-3357), 간세포 성장 인자 활성자 저해제 1형의 쿠니츠 도메인, 간세포 성장 인자 활성자 저해제 2형의 쿠니츠 도메인, 미국 특허 공보 제2004-0152633호에 기재된 쿠니츠 도메인을 포함한다. LACI는 3개의 쿠니츠 도메인을 함유하는 분자량이 39kDa인 인간 혈청 포스포글라이코단백질(표 1의 아미노산 서열)이다.
Figure pat00010
상기 쿠니츠 도메인은 LACI-K1(50번 내지 107번 잔기), LACI-K2(121번 내지 178번 잔기) 및 LACI-K3(213번 내지 270번 잔기)으로 칭해진다. LACI의 cDNA 서열은 문헌[Wun et al. (J. Biol. Chem., 1988, 263(13):6001-6004)]에 보고되어 있다. 문헌[Girard et al. (Nature, 1989, 338:518-20)]은 3개의 쿠니츠 도메인의 각각의 P1 잔기가 변경된 돌연변이 연구를 보고하였다. VIIa 인자(F.VIIa)가 조직 인자와 복합체화될 때 LACI-K1은 F.VIIa를 저해하고, LACI-K2는 Xa 인자를 저해한다.
예시적인 쿠니츠 도메인을 함유하는 단백질은 하기를 포함하고, SWISS-PROT 수탁 번호는 괄호 내에 있다:
Figure pat00011
서열 데이터베이스로부터 쿠니츠 도메인을 확인하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 쿠니츠 도메인, 공통 서열 또는 모티프(예를 들어, 프로사이트(ProSite) 모티프)의 공지된 아미노산 서열이 예를 들어 BLAST를 사용한 젠뱅크(GenBank) 서열 데이터베이스(국립 바이오기술 정보 기관(National Center for Biotechnology Information), 국립 보건원(National Institutes of Health), 메사추세츠주 베데스다); 예를 들어 Pfam 조사에 대한 디폴트 매개변수를 사용한 HMM(히든 마코브(Hidden Markov) 모델)의 Pfam 데이터베이스; SMART 데이터베이스; 또는 ProDom 데이터베이스에 대해 조사될 수 있다. 예를 들어, Pfam 방출 9의 Pfam 수탁 번호 PF00014는 수많은 쿠니츠 도메인 및 쿠니츠 도메인을 확인하기 위한 HMM을 제공한다. Pfam 데이터베이스의 설명은 문헌[Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405-420]에서 확인될 수 있고, HMM의 자세한 설명은 예를 들어 문헌[Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; 및 Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314]에서 확인될 수 있다. HMM의 SMART 데이터베이스(Simple Modular Architecture Research Tool, EMBL, 독일 하이델베르크)는 문헌[Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857 및 Schultz et al. (2000) Nucl. Acids Res 28:231]에 기재되어 있다. SMART 데이터베이스는 HMMer2 조사 프로그램의 히든 마코브 모델에 의한 프로파일링에 의해 확인된 도메인을 함유한다(R. Durbin et al. (1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press). 데이터베이스는 또한 설명되고 모니터링된다. ProDom 단백질 도메인 데이터베이스는 상동성 도메인의 자동 편집으로 이루어진다(Corpet et al. (1999), Nucl. Acids Res. 27:263-267). 현재의 ProDom 버전은 SWISS-PROT 38 및 TREMBL 단백질 데이터베이스의 귀납적 PSI-BLAST 조사를 이용하여 축조되었다(Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Gouzy et al. (1999) Computers and Chemistry 23:333-340.). 데이터베이스는 각각의 도메인에 대한 공통 서열을 자동으로 생성한다. 프로사이트는 모티프로서 쿠니츠 도메인을 목록화하고 쿠니츠 도메인을 함유하는 단백질을 확인한다. 예를 들어, 문헌[Falquet et al. Nucleic Acids Res. 30:235-238(2002)]을 참조한다.
쿠니츠 도메인은 2개의 루프 구역("결합 루프")에서 아미노산을 주로 사용하여 표적 프로테아제와 상호작용한다. 제1 루프 구역은 BPTI의 13번 내지 20번 아미노산에 상응하는 잔기 사이에 있다. 제2 루프 구역은 BPTI의 31번 내지 39번 아미노산에 상응하는 잔기 사이에 있다. 쿠니츠 도메인의 예시적인 라이브러리는 제1 및/또는 제2 루프 구역에서 하나 이상의 아미노산 위치가 변한다. 칼리크레인과 상호작용하는 쿠니츠 도메인을 스크리닝할 때 또는 개선된 친화도 변이체를 선택할 때, 특히 변하기 유용한 위치는 BPTI의 서열과 관련하여 13번, 15번, 16번, 17번, 18번, 19번, 31번, 32번, 34번 및 39번 위치를 포함한다. 이들 위치 중 적어도 몇몇은 표적 프로테아제와 가깝게 접촉하는 것으로 예상된다. 다른 위치, 예를 들어 3차원 구조에서 상기 언급된 위치에 인접한 위치를 변화시키는 것이 또한 유용하다.
쿠니츠 도메인의 "프레임워크 구역"은 쿠니츠 도메인의 일부인 잔기로서 규정되지만, 구체적으로 제1 및 제2 결합 루프 구역에서의 잔기, 즉 BPTI의 13번 내지 20번 아미노산 및 BPTI의 31번 내지 39번 아미노산에 상응하는 잔기를 배제한다. 반대로, 결합 루프에 있지 않은 잔기는 더 넓은 범위의 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 및/또는 비보존적 치환)을 용인할 수 있다.
일 실시형태에서, 이 쿠니츠 도메인은 인간 리포단백질 관련 응고 저해제(lipoprotein-associated coagulation inhibitor: LACI) 단백질의 쿠니츠 도메인 1을 포함하는 루프로 된 구조의 변이체 형태이다. LACI는 패러다임 쿠니츠 도메인인, 3개의 내부의, 잘 한정된, 펩타이드 루프 구조를 함유한다(Girard, T. et al., 1989. Nature, 338:518-520). 본 명세서에 기재된 LACI의 쿠니츠 도메인 1의 변이체가 스크리닝되고 단리되고, 증가한 친화도 및 특이성으로 칼리크레인에 결합한다(예를 들어, 미국 특허 제5,795,865호 및 제6,057,287호 참조). 이 방법은 또한 칼리크레인, 예를 들어 혈장 칼리크레인과 상호작용하는 다른 쿠니츠 도메인을 얻기 위해 다른 쿠니츠 도메인 프레임워크에 적용될 수 있다. 칼리크레인 기능의 유용한 조절자는 통상적으로, 칼리크레인 결합 및 저해 검정을 이용하여 결정된 것처럼, 칼리크레인에 결합하고/하거나 이를 저해한다.
몇몇 양상에서, 칼리크레인 결합제(예를 들어, 결합 단백질, 예를 들어 폴리펩타이드, 예를 들어 저해 폴리펩타이드, 예를 들어 항체, 예를 들어 저해 항체, 또는 다른 결합제, 예를 들어 소분자)는 혈장 칼리크레인의 활성 형태에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 칼리크레인 결합제는 혈장 칼리크레인, 예를 들어 인간 혈장 칼리크레인 및/또는 쥣과 칼리크레인에 결합하고 이를 저해한다.
혈장 칼리크레인 결합 단백질은 전장(예를 들어, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA(예를 들어, IgA1, IgA2), IgD 및 IgE)일 수 있거나, 오직 항원 결합 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 2개의 중쇄 면역글로불린 및 2개의 경쇄 면역글로불린을 포함할 수 있거나, 단일 사슬 항체일 수 있다. 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 재조합 단백질, 예컨대 인간화된, CDR 그래프팅된, 키메라화된, 탈면역화된 또는 실험실내 생성된 항체일 수 있고, 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래한 불변 구역을 임의로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 단일클론 항체이다.
몇몇 실시형태에서, 칼리크레인 결합 단백질은 혈장 칼리크레인, 예를 들어 인간 혈장 칼리크레인 및/또는 쥣과 칼리크레인에 결합하고 이를 저해한다. 예시적인 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 미국 공보 제20120201756호(이의 전체 내용은 본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 칼리크레인 결합 단백질은 M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01(본 명세서에서 또한 DX-2922라 칭함), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01(본 명세서에서 또한 DX-2930이라 칭함), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 및 M35-G04로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 갖는 항체(예를 들어, 인간 항체)이다. 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01(본 명세서에서 또한 DX-2922라 칭함), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X124-G01(본 명세서에서 또한 DX-2930이라 칭함), X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 및 M35-G04와 동일한 에피토프와 경쟁하고 이에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 DX-2930이다. 또한 US 제20120201756호를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참조문헌으로 포함된다.
DX-2930의 중쇄 및 경쇄 가변 구역 서열은 하기 제공된다.
DX-2930 중쇄 가변 구역:
Figure pat00012
DX-2930 경쇄 가변 구역:
Figure pat00013
몇몇 양상에서, 칼리크레인 결합 폴리펩타이드(예를 들어, 저해 폴리펩타이드)는 혈장 칼리크레인의 활성 형태에 결합한다. 예시적인 폴리펩타이드 혈장 칼리크레인 물질은 미국 특허 제5,795,865호, 미국 특허 제5,994,125호, 미국 특허 제6,057,287호, 미국 특허 제6,333,402호, 미국 특허 제7,628,983호 및 미국 특허 제8,283,321호, 미국 특허 제7,064,107호, 미국 특허 제7,276,480호, 미국 특허 제7,851,442호, 미국 특허 제8,124,586호, 미국 특허 제7,811,991호 및 미국 공보 제20110086801호(이들의 각각의 전체 내용은 본 명세서에서 참조문헌으로 포함됨)에 개시되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 칼리크레인 결합 폴리펩타이드는 DX-88(비천연 발생 칼리크레인 저해제, KALBITOR(등록상표)(에칼란타이드)로도 공지됨, 서열 번호 11)이다. 몇몇 실시형태에서, 칼리크레인 저해제는 서열 번호 11의 3번 내지 60번 아미노산의 약 58개의 아미노산 서열 또는 서열 번호 11의 60개의 아미노산 서열을 갖는 DX-88 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다.
Figure pat00014
몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 EPIKAL-2(서열 번호 12)이고, 이것은 58개의 잔기 아미노산 서열(서열 번호 11의 3-60번 잔기)을 갖고, 34번 잔기에서 Ser로의 Ile의 아미노산 치환 및 39번 잔기에서 Gly로의 Glu의 아미노산 치환을 갖는 비천연 발생 칼리크레인 저해제이다. EPIKAL-2의 서열은 이하에 기재되어 있다:
Figure pat00015
몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 본 명세서에 기재된 결합 단백질과 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 HC 및/또는 LC 프레임워크 구역(예를 들어, HC 및/또는 LC FR 1, 2, 3 및/또는 4)에서 본 명세서에 기재된 결합 단백질과 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 HC 및/또는 LC CDR(예를 들어, HC 및/또는 LC CDR1, 2 및/또는 3)에서 본 명세서에 기재된 결합 단백질과 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 혈장 칼리크레인 결합 단백질은 불변 구역(예를 들어, CH1, CH2, CH3 및/또는 CL1)에서 본 명세서에 기재된 결합 단백질과 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
브래디키닌 B2 수용체 길항제
몇몇 실시형태에서, 브래디키닌 B2 수용체 길항제는 대상체에게 투여된다. 예시적인 브래디키닌 B2 수용체 길항제는 브래디키닌 B2 수용체에 대한 네이티브 브래디키닌의 결합을 차단하는 10개의 아미노산을 함유하는 펩티도미메틱 약물인 인카티반트(Firazyr(등록상표))를 포함한다.
C1-INH 대체 물질
몇몇 실시형태에서, 대체 C1-INH 물질은 대상체에게 투여된다. 예시적인 C1-INH 대체 물질은 공중에게 이용 가능하고, 예를 들어 베리너트(등록상표)을 포함하고, 이것은 정제된 인간 살균 나노여과 C1-INH 농축물이다.
C1 저해제 치료제, 및 HAE에 대한 다른 치료제는 문헌[Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925]에 기재되어 있다.
HAE 공격의 급성 치료는 가능한 빨리 부종의 진행을 중지시키도록 제공된다. 정맥내 투여되는 공여자 혈액으로부터의 C1 저해제 농축물은 하나의 급성 치료이지만; 이 치료는 많은 나라에서 이용 가능하지 않다. C1 저해제 농축물이 이용 가능하지 않은 응급 상황에서, 새로 냉동된 혈장(fresh frozen plasma: FFP)이 또한 C1 저해제를 함유하므로, 이를 대안으로서 사용할 수 있다.
유럽에서 1979년 이후로 인간 혈액으로부터 유래한 정제된 C1 저해제가 사용되었다. 몇몇 C1 저해제 치료제가 미국에서 현재 이용 가능하고, 2종의 C1 저해제 제품이 캐나다에서 현재 이용 가능하다. 급성 공격을 위해 2009년에 식품의약청(F.D.A.)이 살균된 베리네트(Berinert) P(CSL Behring)를 허가하였다. 예방을 위해 2008년에 식품의약청이 나노여과된 신리지(Cinryze)(ViroPharma)를 허가하였다. 루신(Rhucin)(Pharming)은 인간 혈액 매개 병원균으로 인해 감염성 질환 전달의 위험을 보유하지 않는 개발 하에 재조합 C1 저해제이다.
급성 HAE 공격의 치료는 또한 통증 경감을 위한 약제 및/또는 IV 유체를 포함할 수 있다.
다른 치료 양상은 C1 저해제의 합성을 자극하거나 C1 저해제 소비를 감소시킬 수 있다. 안드로겐 약제, 예컨대 다나졸은 C1 저해제의 생성을 자극함으로써 공격의 빈도 및 중증도를 감소시킬 수 있다.
헬리코박터 파일로리(helicobacter pylori)는 복부 공격을 촉발할 수 있다. 에이치. 파일로리를 치료하는 항생제는 복부 공격을 감소시킬 수 있다.
더 새로운 치료는 접촉 캐스케이드를 공격한다. 에칼란타이드(KALBITOR(등록상표), DX-88, Dyax)는 혈장 칼리크레인을 저해하고, 미국에서 승인되었다. 이카티반트(Icatibant)(FIRAZYR(등록상표), Shire)는 브래디키닌 B2 수용체를 저해하고, 유럽 및 미국에서 승인되었다.
HAE의 진단은 예를 들어 가족 병력 및/또는 혈액 시험에 의존할 수 있다. HAE I형, II형 및 III형과 연관된 실험실 발견은 예를 들어 문헌[Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925]에 기재되어 있다. 1형 HAE에서, C4의 수치과 같이 C1 저해제의 수치가 감소하지만, C1q 수치는 정상이다. 2형 HAE에서, C1 저해제의 수치는 정상이거나 증가하지만; C1 저해제 기능은 비정상이다. C4 수치는 감소하고, C1q 수치는 정상이다. 3형에서, C1 저해제, C4 및 C1q의 수치는 모두 정상일 수 있다.
C1 저해제 치료제, 및 HAE에 대한 다른 치료제는 문헌[Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925]에 기재되어 있다.
HAE에 대한 예시적인 치료는 하기 제공된다. HAE 공격의 급성 치료는 가능한 빨리 부종의 진행을 중지시키도록 제공된다. 정맥내 투여되는 공여자 혈액으로부터의 C1 저해제 농축물은 하나의 급성 치료이지만; 이 치료는 많은 나라에서 이용 가능하지 않다. C1 저해제 농축물이 이용 가능하지 않은 응급 상황에서, 새로 냉동된 혈장(FFP)이 또한 C1 저해제를 함유하므로, 이를 대안으로서 사용할 수 있다.
유럽에서 1979년 이후로 인간 혈액으로부터 유래한 정제된 C1 저해제가 사용되었다. 몇몇 C1 저해제 치료제가 미국에서 현재 이용 가능하고, 2종의 C1 저해제 제품이 캐나다에서 현재 이용 가능하다. 급성 공격을 위해 2009년에 식품의약청이 살균된 베리네트 P(CSL Behring)를 허가하였다. 예방을 위해 2008년에 식품의약청이 나노여과된 신리지(ViroPharma)를 허가하였다. 루신(Pharming)은 인간 혈액 매개 병원균으로 인해 감염성 질환 전달의 위험을 보유하지 않는 개발 하에 재조합 C1 저해제이다.
급성 HAE 공격의 치료는 또한 통증 경감을 위한 약제 및/또는 IV 유체를 포함할 수 있다.
다른 치료 양상은 C1 저해제의 합성을 자극하거나 C1 저해제 소비를 감소시킬 수 있다. 안드로겐 약제, 예컨대 다나졸은 C1 저해제의 생성을 자극함으로써 공격의 빈도 및 중증도를 감소시킬 수 있다.
헬리코박터 파일로리는 복부 공격을 촉발할 수 있다. 에이치. 파일로리를 치료하는 항생제는 복부 공격을 감소시킬 수 있다.
더 새로운 치료는 접촉 캐스케이드를 공격한다. 에칼란타이드(KALBITOR(등록상표), DX-88, Dyax)는 혈장 칼리크레인을 저해하고, 미국에서 승인되었다. 이카티반트(FIRAZYR(등록상표), Shire)는 브래디키닌 B2 수용체를 저해하고, 유럽 및 미국에서 승인되었다.
HAE의 진단은 예를 들어 가족 병력 및/또는 혈액 시험에 의존할 수 있다. HAE I형, II형 및 III형과 연관된 실험실 발견은 예를 들어 문헌[Kaplan, A.P., J Allergy Clin Immunol, 2010, 126(5):918-925]에 기재되어 있다. 1형 HAE에서, C4의 수치과 같이 C1 저해제의 수치가 감소하지만, C1q 수치는 정상이다. 2형 HAE에서, C1 저해제의 수치는 정상이거나 증가하지만; C1 저해제 기능은 비정상이다. C4 수치는 감소하고, C1q 수치는 정상이다. 3형에서, C1 저해제, C4 및 C1q의 수치는 모두 정상일 수 있다.
하기 실시예는 추가로 예시를 제공하고, 제한이 아니다.
실시예
실시예 1. 혈장에서의 기능적 Cl-INH의 정량화를 위한 활성화된 XII 인자 및/또는 혈장 칼리크레인을 사용한 복합 ELISA
C1-INH인 C1 저해제의 기능적 비정상은 2형 유전성 혈관 부종(HAE)에 존재하여, 저해제가 비효과적이게 한다고 입증되었다. 1형 HAE는 낮은 전체 C1-INH 단백질 수치를 갖는다. 3형 HAE는 C1-INH의 정상 수치와 연관된다.("Enzymatic pathways in the pathogenesis of hereditary angioedema: The role of C1 inhibitor therapy." Kaplan, A., The Journal of Allergy and Clinical Immunology 126(5):918-25 2010). C1-INH는 XIIa 인자, XII 인자 단편(XIIf), 칼리크레인 및 플라스민을 저해한다. C1-INH 기능의 부재 하에, 심각한 혈관 부종을 발생시키는 브래디키닌 형성 캐스케이드의 활성화가 현저하다. 1형 HAE는 일반적으로 전체 C1-INH의 수치의 감소를 특징으로 한다. 2형 HAE는 일반적으로 C1-INH의 수치의 정상 내지 증가를 특징으로 하지만, C1-INH의 기능은 비정상이다. 3형 HAE를 야기하는 기전은 훌륭히 규명되지 않았고, 3형 HAE는 암컷 환자에서 주로 기재되었다.
유전성 혈관 부종(HAE)은 검정, 예를 들어 보체의 활성화된 제1 성분의 저해를 위한 발색 또는 ELISA 검정(예를 들어, C1 저해제에 대한 기능적 검정)을 이용하여 진단될 수 있다. 몇몇 경우에, C1INH의 C1s 포획에 기초한 검정을 이용한다. 기존의 발색 HAE 진단학적 검정이 일반적으로 바람직하게 고려되지만, 방법 둘 다 제한을 가진다. 발색 검정은 가끔의 거짓 양성을 더욱 가질 것이지만, 복합 ELISA는 불과 62%의 음의 예측 값을 갖는다. 더욱이, 기존의 진단학적 방법에 대한 이론적 제한은 보체의 활성화된 제1 성분에 대한 C1-INH의 저해 활성이 HAE 질환 병인과 관련이 적다는 것이다.
본 발명자들은, 혈관 부종을 발생시키는 C1 저해제의 발병 역할에 직접적으로 관련되는, 브래디키닌 형성의 경로에서의 저해제로서의 C1 저해제의 기능을 검출하는 방법론을 개발하였다. 제공된 검정은 브래디키닌을 과생성시켜, 결국 혈관 부종을 발생시키는, 활성화된 XII 인자 및 혈장 칼리크레인을 저해하는 C1-INH의 능력 또는 불능의 분석을 허용한다. 본 실시예는 활성화된 XII 인자, 혈장 칼리크레인 또는 둘 다의 저해를 조사하기 위해 복합 ELISA에 의한 기능적 C1-INH에 대한 검정을 기술한다. 이 검정은 1형 및 2형 HAE의 진단에 훌륭한 감수성을 갖는다.
본 발명자들의 접근법은 활성 효소를 바이오티닐화하고, 이를 아비딘 코팅된 플레이트에 결합시키고, 혈장(미공지물질로서의 대조군, 추정되는 HAE 혈장에 대해 정상)과 항온처리하고, 효소-C1-INH 복합체를 측정하는 것이다. 본 발명자들은 결합 C1-INH의 검출을 위해 C1-INH에 대한 알칼리 포스파타제 표지된 항체를 사용하였다. C1-INH의 정량화를 위해, 혈장 대신에 완충제 중의 공지된 분량의 C1-INH를 공제함으로써 표준 곡선을 만들었다. 중요하게는, 다른 유형의 혈관 부종(예를 들어, 3형 HAE)이 C1s를 저해하지만 활성화된 XII 인자 또는 칼리크레인을 저해하지 않는 돌연변이체 C1-INH를 갖는 경우, 제공된 검정은 비정상의 검출을 허용하지만, 현재 이용 가능한 검정 중 하나를 이용하여 진단을 놓칠 수 있다. C1-INH가 비정상이더라도, 약 5%의 환자가 정상 C4 수치를 갖는다. 2형에서, C1-INH 단백질 수치가 정상이므로, 제공된 기능적 검정이 진단에 중요하다. 제공된 방법(들)은 이 상황에서 특히 유용할 것이다. 도 1 및 도 2는 HAE 1형 및 2형과 2개의 정상 대조군을 대비하여, 진단이 이루어질 수 있는 용이성을 나타낸다. 기능적 C1-INH는 브래디키닌 형성 효소에 기초한 3형 HAE를 갖는 환자에서 결코 측정되지 않고, 본 발명자들은 이것이 정상(약 40%)이라는 것을 입증하였다.
이뮬론(Immulon) 2HB 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅 완충제(100㎕) 중의 5㎍/㎖ 아비딘으로 코팅하였다. PBS-트윈(200㎕/각각)을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 후속적으로, PBS 중의 200㎕의 1% BSA를 첨가하여 미사용 자리를 차단하였다. 37℃에서 1시간 동안 플레이트를 항온처리하였다. PBS-트윈(200㎕/각각)을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 25㎕의 표준품 또는 샘플, 25㎕의 바이오티닐화된 XII1 인자 및/또는 바이오티닐화된 칼리크레인(1㎍/㎖) 및 50㎕의 결합 완충제를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBS-트윈(200㎕/각각)을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. C1-INH에 대한 다중클론 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBS-트윈(200㎕/각각)을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 알칼리 포스파타제 접합된 2차 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBS-트윈(200㎕/각각)을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 색상 전개를 위한 기질을 첨가하고, 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 450㎚에서의 OD를 판독하고, 표준 곡선을 이용하여 계산을 실행하였다.
도 1 및 도 2에 도시된 바대로, 복합 ELISA 검정은 정상 대조군과 비교하여 낮은 기능적 C1-INH를 갖는 1형 및 2형 HAE 환자를 정확히 확인하였다. 검정의 전개의 하나의 고려사항은 브래디키닌 형성에 필수적인 효소에 기초하여 기능적 C1-INH를 정량화하는 검정을 이용하는 것이 유리하다는 것이다. 검정은 XII 인자의 활성화된 형태(XIIa 인자 또는 XIIf 인자) 중 하나 또는 혈장 칼리크레인을 이용할 수 있다. C1-INH를 제외하고, XIIa 인자는 혈장에서 다른 상당한 저해제를 갖지 않는다. C1-INH에 의한 저해 이외에, 혈장 칼리크레인은 또한 알파 2 마크로글로불린에 의해 저해된다. 그럼에도 불구하고, C1-INH에 의해 저해된 칼리크레인의 분획(약 60%)만이 검출되므로, C1-INH와 XIIa 인자 또는 칼리크레인 중 어느 하나와의 기능적 상호작용을 검출하는 복합 ELISA 검정은 훌륭히 작용한다.
실시예 2. 활성화된 XII 인자 및/또는 혈장 칼리크레인의 저해에 기초한 유전성 혈관 부종에 대한 진단학적 검정
방법
환자 및 샘플 수집: HAE의 진단은 임상 제시, 낮은 C1-INH 단백질 및/또는 (상업용 검정을 이용한) 기능적 수치에 의해 확인되었다. 4℃에서 2000rpm에서 10분 동안 새로 수집된 혈액의 원심분리에 의해 HAE를 갖는 42명의 환자 및 23명의 건강한 대조군으로부터의 시트르산화 혈장을 분리하였다. 모든 샘플을 즉시 분취하고, -80℃에서 저장하였다. 샘플을 모든 참여 기관(덴마크 오덴세; 헝가리 부다페스트)에서 유사하게 취급하였고, 드라이아이스에 밤새 운송하였다. 참여 기관 둘 다에서 윤리 위원회 및 데이터 보호 기관(Ethics Committee and Data Protection)이 프로토콜을 승인하였다.
엔자임 리서치 레버러토리즈(Enzyme Research Laboratories)(인디애나주 사우스 벤드)로부터 정제된 인간 XIIa 인자 및 칼리크레인을 얻었고, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)(일리노이주 락포드)으로부터 바이오티닐화 시약을 얻었고, 시그마 케미컬 컴퍼니(Sigma chemical company)(미주리주 세인트 루이스)로부터 모든 다른 시약을 얻었다.
단백질의 바이오티닐화: 제조업자의 추천에 따라 단백질을 바이오티닐화하였다. 간단히 말하면, 1㎎의 단백질(칼리크레인 또는 XII 인자)을 0.5㎖의 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 용해하였다. 약 27㎕의 새로 제조된 10mM 설포-NHS-LC-바이오틴을 단백질 용액에 첨가하고, 얼음에서 2시간 동안 항온처리하였다. 스핀-탈염 칼럼을 이용하여 과량의 미반응 바이오틴 및 가수분해된 바이오틴을 제거하였다. ELISA에 의해 단백질의 표지를 확인하고, 브래드포드(Bradford) 검정에 의해 단백질 농도를 결정하였다(8).
혈장 중의 C1-INH의 정량적 결정을 위한 ELISA: 이뮬론 2HB 플레이트를 C1-INH에 대한 5㎍/㎖의 다중클론 항체로 코팅하였다. PBS 중의 1% BSA에 의해 차단한 후, 샘플 및 표준품을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 결합 C1-INH를 C1-INH에 대한 알칼리 포스파타제 접합된 단일클론 항체에 의해 프로빙한 후, 5-브로모-4-클로로인돌릴 포스페이트/나이트로블루 테트라졸륨(BCIP/NBT)을 사용하여 색상을 전개시켰다.
칼리크레인 및 XII 인자의 저해에 기초한 혈장 중의 기능적 C1-INH의 정량화: 4℃에서 밤새 이뮬론 2HB 플레이트를 코팅 완충제(100㎕) 중의 5㎍/㎖의 아비딘으로 코팅하였다. PBS-트윈(200㎕/각각)을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 후속적으로, PBS 중의 200㎕의 1% BSA를 첨가하여 미사용 자리를 차단하였다. 37℃에서 1시간 동안 플레이트를 항온처리하고, PBS-트윈(200㎕/각각)을 사용하여 플레이트를 3회 세척하였다. 샘플 또는 표준품을 바이오티닐화된 단백질(25㎕의 표준품 또는 샘플, 25㎕의 바이오티닐화된 XII1 인자 또는 바이오티닐화된 칼리크레인(1㎍/㎖) 및 50㎕의 결합 완충제)과 함께 플레이트에 첨가하고, 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, PBS-트윈(200㎕/각각)을 사용하여 플레이트를 3회 다시 세척하고, C1-INH에 대한 다중클론 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 알칼리 포스파타제 접합된 2차 항체를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후, 포스파타제 기질 BCIP/NBT를 사용하여 색상을 전개시켰다. 450㎚에서의 OD를 판독하고, 표준 곡선을 이용하여 계산을 실행하였다. 방법은 도 1에서 단계별로 요약되어 있다.
보체의 저해에 기초한 기능적 ELISA: 기능적 C1-INH의 양을 측정하기 위해 퀴델 코포레이션(Quidel Corporation)으로부터 ELISA 키트를 구입하였다. 이 검정은 활성화된 C1s를 저해하는 혈장 C1-INH의 능력에 기초한다(복합 ELISA). 제조업자의 프로토콜에 따라 검정을 실행하였다.
결과
C1s의 저해에 의한 HAE의 진단: 기존의 상업용 검정(복합 ELISA)을 이용하여 정상 대조군으로부터의 23개의 샘플 및 1형 또는 2형 HAE 중 어느 하나를 갖는 환자로부터의 42개의 샘플을 시험하였다. 검정 해석에 따라, "정상"은 68-100% C1-INH이고, "비정상"은 67% 미만이었다. 지시는 41% 내지 67%의 샘플이 반복되어야 하지만, 애매한 것으로 생각되므로, 반복 값이 이 2개의 숫자 사이에 있는 경우, 이것은 비정상으로 보고된다는 것을 나타낸다. 표준품은 정상의 백분율로 제공되고, 즉 표준품은 0%, 23%, 44%, 66% 및 88%이고, 미공지는 곡선으로부터 읽혀진다. 정상 대조군 샘플은 80% 내지 100%로 변하고, HAE 샘플은 0% 내지 81%로 변했다. HAE 샘플의 평균 및 표준 편차는 38±17%이었다. 이 검정을 이용하여 HAE 환자 중 2명의 진단은 놓칠 것이다.
칼리크레인 또는 XIIa 인자의 저해에 의한 HAE의 진단: 혈장 칼리크레인의 저해 또는 XIIa 인자의 저해를 이용한 결과는 각각 도 4b 및 도 4c에서 복합체 형성의 ㎎/㎖로 표시되고, 정상 대조군을 1형 및 2형 HAE를 갖는 환자로부터 얻은 샘플과 비교하였다. ㎍/㎖ 단위의 XIIa 인자-C1-INH의 평균 및 표준 편차는 정상, 63.1+12.4; 및 1형 및 2형 HAE, 6.1+5.4이었다. 1형 및 2형 HAE를 정상 대조군과 비교하는 "P" 값은 <0.0001이었다. 칼리크레인-C1-INH 복합체를 평가하여 얻은 결과는 HAE와 대조군 사이에 중첩 없이 놀랍게도 유사하였다.
본 명세서의 결과는 칼리크레인 또는 XIIa 인자의 저해에 기초한 검정이 시험된 1형 및 2형 HAE 환자의 모두를 정확히 확인한다는 것을 나타내고, 이것은 정상 대조군과 비교하여 더 낮은 수치의 기능적 C1-INH를 나타낸다(도 3 및 도 4). 따라서, 본 명세서에 기재된 검정 방법은 기능적 C1-INH의 수치를 결정하고, PKal 및/또는 FXII을 저해하는 데 있어서 기능적인 C1-INH의 수치에 기초하여, pKal 매개 질환(예를 들어, HAE)을 갖는 환자를 확인하는 데 있어서 종래의 방법과 비교하여 상당히 민감하다.
본 명세서에서 이용된 접근법은 활성 효소를 바이오티닐화하고, 이것을 아비딘 코팅된 플레이트에 결합시키고, 혈장(미공지물질로서의 대조군, 추정되는 HAE 혈장에 대해 정상)과 항온처리하고, 효소-C1-INH 복합체를 측정하는 것이다. 결합 C1-INH의 검출을 위해 C1-INH에 대한 알칼리 포스파타제 표지된 항체를 사용하였다. C1-INH의 정량화를 위해, 혈장 대신에 완충제 중의 공지된 분량의 C1-INH를 공제함으로써 표준 곡선을 만들었다. 추가로, 다른 유형의 혈관 부종(예를 들어, 3형 HAE)이 C1s를 저해하지만 활성화된 XII 인자 또는 칼리크레인을 저해하지 않는 돌연변이체 C1-INH를 갖는 경우, 이 방법을 이용하여 이 비정상을 검출할 수 있지만, 현재 이용 가능한 검정 중 하나를 이용하여 진단을 놓칠 수 있다. 본 명세서에서 기재된 검정이 1형 및 2형 HAE의 진단을 위한 현재의 상업용 방법을 대신하는 가능성을 갖는데, 검정 둘 다 C1s의 저해보다 기능이상 C1-INH의 검출에 민감한 것으로 보이고, 환자를 평가하기 위해 또한 이용될 수 있기 때문이다(여기서, 다른 방법론을 이용하여 애매한 결과가 얻어짐). 무증상일 때, C1-INH가 비정상이더라도, 약 5%의 환자가 정상 C4 수치를 갖고, 단백질 수치가 통상적으로 정상이거나 심지어 상승하므로, 2형 HAE 환자에서 진단은 기능적 검정에 독립적일 것이다. 본 명세서에 기재된 검정은 이러한 상황에서 특히 유용할 것이다. 결론적으로, 혈관 부종을 발생시키는 비정상에 직접적으로 관련된 기능적 평가에 의해 진단이 이루어지도록, 브래디키닌 형성 캐스케이드의 효소의 저해에 의해 HAE 1형 및 2형의 진단을 확신할 수 있다.
참조문헌
Figure pat00016
다른 실시형태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 대안적인 특징에 의해 대체되어 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 제공할 수 있다. 따라서, 달리 명확히 기재되지 않은 한, 개시된 각각의 특징은 오직 동등한 또는 유사한 특징의 총체적 시리즈의 예이다.
상기 설명으로부터, 당해 분야의 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 쉽게 확신할 수 있고, 이의 정신 및 범위를 벗어남이 없이, 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 다양한 용법 및 조건에 적용하도록 이것을 만들 수 있다. 따라서, 다른 실시형태가 또한 청구범위 내에 있다.
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Homo sapiens <400> 6 Met Arg Ala Leu Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Val Ser Leu Glu Ser 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Pro Pro Trp Glu Ala Pro Lys Glu His Lys Tyr Lys 20 25 30 Ala Glu Glu His Thr Val Val Leu Thr Val Thr Gly Glu Pro Cys His 35 40 45 Phe Pro Phe Gln Tyr His Arg Gln Leu Tyr His Lys Cys Thr His Lys 50 55 60 Gly Arg Pro Gly Pro Gln Pro Trp Cys Ala Thr Thr Pro Asn Phe Asp 65 70 75 80 Gln Asp Gln Arg Trp Gly Tyr Cys Leu Glu Pro Lys Lys Val Lys Asp 85 90 95 His Cys Ser Lys His Ser Pro Cys Gln Lys Gly Gly Thr Cys Val Asn 100 105 110 Met Pro Ser Gly Pro His Cys Leu Cys Pro Gln His Leu Thr Gly Asn 115 120 125 His Cys Gln Lys Glu Lys Cys Phe Glu Pro Gln Leu Leu Arg Phe Phe 130 135 140 His Lys Asn Glu Ile Trp Tyr Arg Thr Glu Gln Ala Ala Val Ala Arg 145 150 155 160 Cys Gln Cys Lys Gly Pro Asp Ala His Cys Gln Arg Leu Ala Ser Gln 165 170 175 Ala Cys Arg Thr Asn Pro Cys Leu His Gly Gly Arg Cys Leu Glu Val 180 185 190 Glu Gly His Arg Leu Cys His Cys Pro Val Gly Tyr Thr Gly Ala Phe 195 200 205 Cys Asp Val Asp Thr Lys Ala Ser Cys Tyr Asp Gly Arg Gly Leu Ser 210 215 220 Tyr Arg Gly Leu Ala Arg Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro Cys Gln Pro 225 230 235 240 Trp Ala Ser Glu Ala Thr Tyr Arg Asn Val Thr Ala Glu Gln Ala Arg 245 250 255 Asn Trp Gly Leu Gly Gly His Ala Phe Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp 260 265 270 Ile Arg Pro Trp Cys Phe Val Leu Asn Arg Asp Arg Leu Ser Trp Glu 275 280 285 Tyr Cys Asp Leu Ala Gln Cys Gln Thr Pro Thr Gln Ala Ala Pro Pro 290 295 300 Thr Pro Val Ser Pro Arg Leu His Val Pro Leu Met Pro Ala Gln Pro 305 310 315 320 Ala Pro Pro Lys Pro Gln Pro Thr Thr Arg Thr Pro Pro Gln Ser Gln 325 330 335 Thr Pro Gly Ala Leu Pro Ala Lys Arg Glu Gln Pro Pro Ser Leu Thr 340 345 350 Arg Asn Gly Pro Leu Ser Cys Gly Gln Arg Leu Arg Lys Ser Leu Ser 355 360 365 Ser Met Thr Arg Val Val Gly Gly Leu Val Ala Leu Arg Gly Ala His 370 375 380 Pro Tyr Ile Ala Ala Leu Tyr Trp Gly His Ser Phe Cys Ala Gly Ser 385 390 395 400 Leu Ile Ala Pro Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Gln Asp 405 410 415 Arg Pro Ala Pro Glu Asp Leu Thr Val Val Leu Gly Gln Glu Arg Arg 420 425 430 Asn His Ser Cys Glu Pro Cys Gln Thr Leu Ala Val Arg Ser Tyr Arg 435 440 445 Leu His Glu Ala Phe Ser Pro Val Ser Tyr Gln His Asp Leu Ala Leu 450 455 460 Leu Arg Leu Gln Glu Asp Ala Asp Gly Ser Cys Ala Leu Leu Ser Pro 465 470 475 480 Tyr Val Gln Pro Val Cys Leu Pro Ser Gly Ala Ala Arg Pro Ser Glu 485 490 495 Thr Thr Leu Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly His Gln Phe Glu Gly Ala 500 505 510 Glu Glu Tyr Ala Ser Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Pro Phe Leu Ser 515 520 525 Leu Glu Arg Cys Ser Ala Pro Asp Val His Gly Ser Ser Ile Leu Pro 530 535 540 Gly Met Leu Cys Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Thr Asp Ala Cys Gln 545 550 555 560 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Asp Gln Ala Ala Glu Arg 565 570 575 Arg Leu Thr Leu Gln Gly Ile Ile Ser Trp Gly Ser Gly Cys Gly Asp 580 585 590 Arg Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Asp Val Ala Tyr Tyr Leu Ala Trp 595 600 605 Ile Arg Glu His Thr Val Ser 610 615 <210> 7 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu 20 25 30 Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys 35 40 45 Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys 50 55 60 Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu 65 70 75 80 Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser 85 90 95 Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile 100 105 110 Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu 115 120 125 Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 130 135 140 Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 145 150 155 160 Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu 165 170 175 Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn 180 185 190 Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu 195 200 205 Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly 210 215 220 Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly 225 230 235 240 Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn 245 250 255 Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile 260 265 270 Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys 275 280 285 Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met 290 295 300 <210> 8 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 8 Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45 Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 <210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Tyr Arg Arg Ile Gly Val Pro Arg Arg Asp Glu Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 <210> 11 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 11 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 12 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 12 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55

Claims (17)

  1. 대상체에서 혈장 칼리크레인(pKal) 매개 장애를 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 방법은
    pKal 매개 장애를 갖는 것으로 의심되는 대상체의 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    포획 시약에 결합하는 상기 생물학적 샘플에서 기능적 C1-억제자(C1-INH)의 수준을 측정하는 단계;
    상기 포획 시약에 결합하는 상기 생물학적 샘플의 기능적 C1-INH 수준을 기능적 C1-INH 수준과 비교하는 단계; 및
    상기 생물학적 샘플에서 기능적 C1-INH의 수준이 참조 샘플의 수준에서 벗어나는 경우 상기 대상체를 pKal 매개 장애가 있거나 그 위험이 있는 것으로 식별하는 단계를 포함하며,
    여기서, 상기 포획 시약은
    i) 활성 형태의 인자 XII 또는 이의 C1-INH-결합 단편,
    ii) 활성 형태의 pKal, 또는 이의 C1-INH-결합 단편, 또는
    iii) i) 및 ii의 조합인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포획 시약에 결합하는 기능적 C1-INH의 수준을 C1-INH에 결합하는 검출제를 사용하여 측정하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 검출제가 C1-INH에 결합하는 항체인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 시약이 기질상에 고정되는 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 시약이 인자 XII의 활성 형태, 혈장 칼리크레인의 활성 형태, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 시약에 결합하는 기능적 C1-INH의 수준이 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 샘플 또는 혈장 샘플인, 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pKal 매개 장애는 비히스타민 의존성 특발성 혈관 부종, 류마티스성 관절염, 크론병, 루푸스, 알츠하이머병, 패혈성 쇼크, 화상 손상, 뇌 허혈/관류 손상, 뇌 부종, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신경병증, 황반 부종, 혈관염, 동맥 또는 정맥 혈전증, 심실 보조 장치 또는 스텐트와 연관된 혈전증, 혈전증을 동반한 헤파린 유도 혈소판 감소증, 혈전색전증 질환 및 불안정 협심증을 동반한 관상 동맥 심장질환, 부종, 눈 질환, 통풍, 장 질환, 구강 점막염, 신경병증성 통증, 염증성 통증, 척추관 협착증-퇴행성 척추 질환, 수술후 장폐색, 대동맥 동맥류, 골관절염, 유전성 혈관 부종(HAE), 폐 색전증, 뇌졸중, 머리 외상 또는 종양 주변 뇌 부종, 패혈증, 급성 중대뇌동맥(MCA) 허혈성 사건(뇌졸중), 재협착증, 전신 홍반 루푸스 신염, 자가면역 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경학적 질환, 단백질 미스폴딩과 연관된 질환, 혈관신생, 고혈압성 신경병증 및 당뇨병성 신경병증과 연관된 질환, 알레르기 및 호흡기 질환, 및 조직 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 pKal 매개 장애는 HAE인, 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 pKal 매개 장애의 증상을 갖는, 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 항히스타민 치료제, 코르티코스테로이드 치료제 또는 둘 다에 내성인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 증상은 부종인, 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 증상은,
    종창의 재발성 공격;
    완전히 말초인 종창;
    두드러기;
    감염 증거의 부재 하의 충혈, 통증 및 종창; 또는
    비히스타민 매개 부종인 방법.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 샘플이 수집되는 시점에 pKal 매개 장애의 증상을 갖지 않거나, pKal 매개 장애의 증상의 병력을 갖지 않거나, pKal 매개 장애의 병력을 갖지 않는, 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 치료제가 pKal 결합제, 브래디키닌 B2 수용체 길항제, 또는 C1-INH 대체제를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 pKal 결합제가 DX-88, DX-2930 또는 EPIKAL-2를 포함하는, 방법.
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