CN1368886A - 用于测定全血中的凝固因子活性的方法 - Google Patents

用于测定全血中的凝固因子活性的方法 Download PDF

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Abstract

通过测定和比较加有和不加有前凝血质或抗凝血质的抑制剂情况下的凝固时间,本发明涉及快速评估患者血液样品的总凝固特性。当样品为全血时,所得到的凝固时间代表血液中的血浆和细胞组分的总凝固活性,该总凝固活性可以指示由异常凝固性而产生的已存在或即将发生的病理学。通过功能性地确定全血中的一种或多种前凝血质或抗凝血质的当前水平,本发明还提供了一种用于测定患者发生血栓形成过程危险性的方法。另外,本发明也提供了测定抗凝疗法有效性的方法以及实施本发明方法的试剂盒。

Description

用于测定全血中的凝固因子活性的方法
本发明得到了美国国立卫生研究院(NIH)的资助，合同号HL48872。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明一般性地涉及医学诊断学和疾病预防领域。更具体地，通过使用全血样品、在存在和不存在前凝血质或抗凝血质的至少一种抑制剂的情况下，测定血液凝块形成的速率，本发明涉及用于快速评估血液凝固活性的诊断方法和测试试剂盒。个体血液样品中的凝固活性以及不同样品间的活性差异，指示了某些病理状态的存在或潜在发展。
背景技术
血液过快形成凝块，这种倾向性在预见若干严重病理状态的发生、发展和恢复中很重要。这些疾病或者直接产生于凝块形成的过程，或者受该过程的调节。这些疾病的例子包括心脏病发作、中风、冠状动脉疾病、深静脉血栓形成和肺栓塞等。在这些疾病中，冠状动脉疾病在美国是头号杀手。
此外，某些临床状态，诸如血管疾病、外科手术、创伤、恶性肿瘤、血管修复装置、全身麻醉、怀孕、服用口服避孕药、系统性红斑狼疮以及感染，可能使个体易于发生反向的凝块形成现象。由血液凝块形成异常而导致的可疑急性状态的患者，在急症室就诊。一种采用全血样品来快速测定患者当前形成血凝块危险性的方法，将有助于确定或排除血栓形成过程和凝血病。这不仅有利于将急诊健康治疗提供给那些有需要的人，同时还能够早期识别那些有可能发生潜在的致命性血液凝固病理的患者。
血液也可能形成凝块过慢或者根本不形成凝块，这种情况会导致出血或其他血液凝固障碍。血友病就是遗传性的出血疾病例子。另外，影响肝脏的疾病，诸如酒精性肝硬变以及急性和慢性肝炎，都与多种凝块形成异常相关，这是因为肝脏是合成多种凝固因子的器官。
在遗传性的凝固障碍中，已知最多的是血友病A和B，它们分别与因子VIII和IX的活性下降相关。这种障碍的严重程度，取决于相应的凝块形成因子的减少程度。严重的病例在生命的早期就已经表现出来，并且患血友病的儿童常常表现出大关节诸如膝盖容易出血以及凝块形成的显著缺陷。较轻微的血友病也许直到生命的晚期才明显表现出来。
血友病的治疗一般包括输入血液制品的浓缩剂，其中含有大量的凝固因子VIII或IX。虽然许多血友病患者能够过一种相对正常的生活，但是在进行户外活动以及在外科手术或牙病治疗期间却必须格外小心。不幸的是，10％的血友病患者人群产生了因子VIII抗体并变得难以治疗。
血液过快形成凝块(即凝固性太高)也是一种病理状态。弥散性血管内凝血(DIC)就是获得性血液凝固障碍的一个例子，其特征在于血液病理性地快速形成凝块。
血液形成凝块是一个复杂的过程；它涉及多种起始因子，以及激活剂、酶和调节剂的多级联系统，最终导致纤维蛋白的形成，纤维蛋白又聚合为不溶性的凝块。内源性和外源性的血液凝固途径，在例如Davie等人，血液凝固级联系统：起始、维持和调节，生物化学(Biochemistry)，30(43)：10363-70(1991)中有描述，此处引用作为参考。
确定血液凝块形成倾向的经典方法，是通过手工或自动化地测定血浆或血液样品形成不溶性的纤维蛋白丝或者凝块所需的时间。例如，凝块形成的检测，可以采用肉眼观察纤维蛋白丝的形成，或者采用自动化的方法诸如检测粘度的变化一粘度可通过机械或电阻抗来测定，或者采用光学检测。
对所抽取的没有加入抗凝血质的新鲜血液，可以立即进行凝固时间的测定。或者，也可以用含有结合钙离子的抗凝血质诸如柠檬酸盐的血液，测定凝固时间。在这种情况下，凝固时间的测定，是通过加入钙盐以逆转抗凝血质的效应而起始的。后一种测定方法所得到的时间被称为再钙化时间。通常所使用的测定血液凝固时间的典型方法，包括依赖于凝血酶原时间(PT)的测定、活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的测定、凝血酶时间的测定以及纤维蛋白原水平的测定这样一些方法。也可以通过测定循环血液中可溶性纤维蛋白或纤维蛋白降解产物的水平，对血栓形成过程进行检测。
血液凝固时间的确定，最常用于疾病诸如血友病、冯威勒布兰特病、B型血友病以及某些肝脏疾病的诊断，在这些疾病中，异常延长的凝固时间一般具有诊断价值。虽然有许多疾病均涉及到异常快速的血液凝固，但是当前的测定方法，在鉴定所有这些快速形成凝块病理状态时，除了那些最异常的情况之外，并没有足够敏感到具有诊断价值。
PT和APTT实验在临床上在对病理性凝固性过高状态的检测中并没有用途。一般地，这些测定被用于检测具有延长的凝固时间的状态，也就是凝固性过低状态。这些实验通常采用血浆来进行，但血浆中不含有激活的血小板和单核细胞，因为这两种成分均可以显著地改变血液的凝固状态。而且，在这些实验中，向样品中加入了本身就是前凝血质的试剂，从而将血浆的凝固时间从大约6分钟分别减小到PT值为大约10-13秒钟、APTT值为大约25-39秒钟。实验室测定手册(Laboratory Test Handbook)，第4版，Lexi-Comp公司，1996，第227页(APTT)和262页(PT)。由于将全血中的细胞组分诸如单核细胞的影响排除在外，所以这些基于血浆来测定凝固时间的常用方法，并不能对由血液中的细胞组分调节的血栓形成过程提供最大的预见和诊断价值。
而且，如果可以对全血而不是单独的血浆的凝固性进行测定，那么将会改善对抗凝疗法诸如肝素和华法林的监测。这些治疗性施用的抗凝血质，通过细胞以及可溶性(血浆)血液组分，调节血液的凝固性。
在全血中存在着若干重要的血液凝块形成过程的起始物和调节剂。一种被称为组织因子，也称为因子III的前凝血质蛋白质就是这样一种分子，它是一种跨膜糖蛋白，存在于已知为单核细胞的循环细胞的表面上。在血浆中，发现组织因子也存在于磷脂小体中。已经将循环的组织因子之水平的提高与多种血栓形成障碍和病理状态联系起来。例如，在癌症、感染、血栓形成障碍诸如心脏病发作和中风这样一些患者的循环细胞和血浆小体上已发现有组织因子。全血中的组织因子活性水平在鉴别诊断有可能患血栓形成危险的患者时是一个具有诊断用途的参数。
组织因子(TF)必须与血浆凝块形成因子即因子VII或其激活形式即因子VIIa，形成活性复合物。接着，该TF：VIIa复合物将因子IX和因子X这两个酶原激活为其酶的活性形式，分别为因子IXa和因子Xa。因子Xa与因子Va结合，生成凝血酶原酶复合物(有活性的前凝血质)，该复合物接着将凝血酶原切割为凝血酶。然后，凝血酶又切割纤维蛋白原，产生出纤维蛋白，纤维蛋白则形成凝块。
已有描述直接测定组织因子的方法。除免疫测定方法诸如在美国专利5403716中所描述的之外，通过将全血与内毒素接触，正如在美国专利4814247以及Spillert与Lazaro，1993，J.Nat.Med.Assoc.85：611-616中所描述，提供了在几个小时之内评价TF水平的方法。在使用内毒素的方法中，测定了血液样品的修改的再钙化时间。当内毒素或其他免疫调节剂造成一种模仿疾病或创伤的状态时，这种评价代表了所存在的组织因子表达水平，所以当患者经历这种状态时就可以测定其凝块形成倾向性。本发明通过提供一种简单的方法来确定全血中循环的组织因子活性的当前实际水平值，而提供了另一种重要的组织因子测定方法，从而可以测定患者当前的形成血凝块的危险性。
例如，我们可以通过使用Sonoclot Coagulation and PlateletFunction Analyzer(一种血液凝固和血小板功能分析仪器)(Sienco，Wheat Ridge，CO)-这种仪器将一次性使用的振动探针浸入全血中来测定纤维蛋白丝的黏性阻力，测定纤维蛋白的形成。或者，也可以使用HEMOCHROTM系统(Internat ional Technidyne公司)，这种系统使用于试管内精确排列的磁块以及位于仪器内的磁性检测器来检测凝块的形成。
当前，并没有任何测定组织因子(TF)或组织因子通路抑制剂(TFPI)的功能活性的标准临床测定法。然而，在进行科学研究时，还确实有测定某些前凝血质或抗凝血质活性的方法。例如，对存在于血浆中的因子XII活性的百分比，可以通过将该血浆加入到因子XII严重缺乏的血浆中，用此时所获得的校正程度来加以确定。这种测定法是APTT实验的修改版，它测定了患者的血浆对含有少于1％因子XII的血浆的APTT“校正”能力。将通过稀释患者的血浆获得的校正量，与采用已知浓度的因子XII所获得的校正量进行比较。正常的血浆被认为是可以给出100％的校正。
对存在于血浆中的凝血酶(因子II)活性的百分比，也可以通过将该血浆加入到因子II严重缺乏的血浆中，用此时所获得的校正程度来加以确定。这种测定法是凝血酶原时间实验的修改版，它测定了患者的血浆对含有少于1％因子II的血浆的PT“校正”能力。将通过稀释患者的血浆获得的校正量，与采用已知浓度的因子II所获得的校正量进行比较。正常的血浆被认为是可以给出100％的校正。然而，所讨论的当前这类血液凝固因子测定法，仅仅在临床条件下，检测凝固性过低的状态(即，血液病理性地形成凝块慢)时有用途。
对于激活血液凝固级联系统的几个标志物，诸如F1.2凝血酶原片段、D-二聚体、可溶性的纤维蛋白和凝血酶/抗凝血酶III复合物，有多种免疫测定法来对它们进行测定。一般地，这些凝固性免疫测定法除了在作研究时常用外，对它们的接受程度还有限，这是因为这些方法涉及到很慢和劳动强度相对高的ELISA法。
因此，希望提供一种快速和简单的体外方法以评价：血液的总凝固性—它与体内血液形成凝块的危险性以及前凝血质或抗凝血质的某一效应对凝固性所起的作用相关。这将为医疗健康专业人员在下面三种情况下提供诊断及临床方面有用的数据：(1)评价患者的状态；(2)选择恰当的治疗程序；(3)监控外科手术或非外科手术治疗的快慢和有效性。以前，并没有一种可以使用的快速评价血液的总凝固性的方法，来特异评估组织因子以及其他前凝血质和抗凝血质所起的作用。如果能够检测出前凝血质和抗凝血质的水平提高了，那么将可以更早地采取治疗措施，从而改善预后。当前，并没有任何全血凝固性测定法来准确地评价这种血液凝固性过高或过低的状态。本发明的方法，通过在存在和不存在前凝血质或抗凝血质活性的至少一种抑制剂的情况下比较患者的全血凝固时间，测定凝固性过高或过低的状态。
发明内容
通过测定和比较加有或不加有前凝血质或抗凝血质的抑制剂情况下的凝固时间，本发明提供了一种方法，以快速评估患者血液样品的总凝固特性。当样品为全血时，所得到的凝固时间代表血液中的血浆和细胞组分的总凝固活性，该总凝固活性可以指示由异常凝固性而产生的已存在或即将发生的病理学。
本发明的一个目的是，通过功能性地确定全血中的一种或多种前凝血质或抗凝血质的当前水平，提供一种方法，用于测定患者发生血栓形成现象的危险性。
本发明的又一个目的是，通过测定全血样品中的凝固活性，提供一种方法，用于测定抗凝疗法诸如使用华法林或低分子量肝素的有效性；其中全血样品中的凝固活性是这样测定的：首先在全血样品中加入抑制剂，接着采用标准方法测定血液样品的凝固时间。凝固时间的长短，或者抑制剂处理过的样品值与对照值在凝固时间上的差别，用于监控抗凝疗法。
本发明的另一个目的是，通过采用本文中所描述的方法监控血液凝块形成，提供一种监控患者从与反向的血液凝固性相关的状态恢复过来的方法。
本发明的再一个目的是提供诊断试剂盒，在存在和不存在前凝血质或抗凝血质的至少一种抑制剂的情况下，这种试剂盒被用于测定全血和血浆的凝固时间。
通过参考发明详述，更好的理解本发明的各个方面。
附图说明
图1是一个示意图，它表明了单核细胞TF在全血中纤维蛋白凝块形成起始期间的中心作用。TF：VIIa复合物将因子X激活为因子Xa以及因子IX激活为因子IXa。凝血酶(因子II)激活血小板，而血小板又为凝血酶原复合物(Xa：Va)形成血栓形成表面。纤维蛋白原被切割以产生纤维蛋白凝块。该示意图选自Kjalke等人，活性位点被灭活的因子VIIa、Xa和IXa在基于细胞的组织因子起始的凝固模型中抑制多个单步骤，Thromb.Haemost.，80：578-84(1998)。
图2表示在存在和不存在抗-TF抗体的情况下，在37℃温育10分钟后，通过比较凝固时间，检测全血中外源性加入的TF。
图3表示抗-TF抗体对再钙化全血的凝固时间的效应。将全血与LPS(10μg/mL)在37℃温育2小时，由于诱导了TF表达而导致凝固时间缩短。抗-TF抗体的加入，封阻了LPS-介导的再钙化全血凝固时间上的缩短。相比之下，加入非抑制性对照抗体，对LPS凝固时间没有任何效应。
图4表示重组TF对再钙化全血的凝固时间的效应。全血中加入脂质化的重组TF，以剂量依赖方式，在范围为0-80pg/mL内(平均值±95％平均值的可信区间，对于每个点n＝11个同样样品)，缩短了再钙化全血的凝固时间。
图5a表示从血液分离的细胞与多种血浆混合的凝固时间。
图5b表示将抑制性的抗—因子XI抗体(100μg/mL)加入到血液中，37℃温育10分钟的效应(平均值±标准差，n＝3)。加入抗—因子XIa抗体延长了凝固时间。相比之下，加入相应量的对照抗体，并影响凝固时间。
图5c表示在有或没有LPS刺激的情况下，将玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)(32μg/mL)加入到血液中，37℃温育2小时的效应(平均值±标准差，n＝3)。
图6a表示未分级的肝素(0-0.1U/ml)对LPS-刺激的血液的凝固时间的效应。
图6b表示低分子量的肝素(LMWH；0-0.25U/ml)对LPS-刺激的血液的凝固时间的效应。
图6c表示水蛭素(0-0.1U/ml)对LPS-刺激的血液的凝固时间的效应。
图7将不稳定心绞痛患者(n＝8)与健康正常人(n＝37)的再钙化全血凝固时间进行了比较。圆圈表示处于凝固时间的第5％和第95％之外的个体。
具体实施方式
血液凝固性异常会引起一系列疾病。特别是，提高血液凝固性或提高促血栓形成潜力的因子，在大多数情况下是非常不希望的，并且它们可能导致严重的病理状态，例如，心脏病发作、中风、冠状动脉疾病、深静脉血栓形成和肺栓塞。而且，某些临床状态，诸如血管疾病、外科手术、创伤、恶性肿瘤、血管修复装置、全身麻醉、怀孕、服用口服避孕药、系统性红斑狼疮以及感染，可能使个体易于发生反向的凝块形成现象。这些状态改变了血液的凝固状态，使得促血栓形成通路，在与保护性的抗凝通路相比时，占主导地位并被加强。
血液的总凝固性是由多种因子控制的，这些因子来自血液的可溶性部分(血浆)以及由细胞部分所提供的血液可溶性部分。测定凝块形成或血液凝固性的传统方法，例如，凝血酶原时间(PT)和活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的测定等，一般采用血浆来测定血液的凝固性。但是，这些基于血浆的方法，却忽略了细胞组分对血液凝固性所起的作用。一个例子是组织因子对血液凝固性的作用。正如上面所描述，组织因子是血液凝固的起始物和调节剂，并且可能存在于血液之中。组织因子水平的上升与病理状态相关。除组织因子外，存在于血液的细胞组分之中或之上的其他成分也可能调节血液的凝固性，并且使血液在体内易于凝集。
在一个实施方案中，本发明的一个方法涉及到在有或没有前凝血质或抗凝血质的抑制剂情况下，测定全血凝块形成的。在有或没有抑制剂的情况下，在凝固时间上的差异程度，与存在于样品中的前凝血质或抗凝血质的量成比例，即当差异较大时就表示所测定因子的量较多。除了在凝固时间上的差异外，凝固时间的绝对值也是重要的，因为导致患者凝固性过高的原因，也可能除了前凝血质水平的提高的另一种异常。
当用组织因子的抑制剂实施本发明的测定法时，与上面提到的由Spillert和Lazaro所描述的修改的再钙化时间测试—其中温育于全血样品中的内毒素诱导了组织因子的合成，而组织因子又依次影响了血液样品的凝固特性—相比，本发明的方法并不测定组织因子的合成对血液凝固性的效应。相反，它测定现存于全血样品中的组织因子对血液凝固性的影响。见例如，Santucci等人，全血中组织因子活性的测定，Thromb.Haemost.，83(3)：445-54(2000)，此处引用作为参考。
实施本发明的方法时可以采用新鲜的全血；向全血中加入抑制剂，然后，采用标准方法测定该血液样品以及不加抑制剂样品的凝固性。或者，也可以将血液样品收集于含诸如柠檬酸盐、草酸盐、EDTA等的抗凝血质的容器中。这里的抗凝血质不包括封阻内源性凝块形成通路的抗凝血质，也就是说，这里的抗凝血质将封阻外源性或者共同的通路。随后，可以将抑制剂加入，然后采用标准方法确定血液的凝固性。任何已知的测定血液凝固性的方法均可以用于本发明的方法中。
当血液被收集到含有抗凝血质的容器中时，在测定血液的凝固性或凝固时间时，必须将血液样品中的抗凝血质的效应予以逆转。这可通过加入钙盐诸如，例如，氯化钙来实现。通过加入钙盐再激活凝块形成过程，测定经抗凝处理的血液样品的凝固时间就称为再钙化时间。
前凝血质或抗凝血质的任何抑制剂，只要对某一特定的前凝血质或抗凝血质是特异的，就适用于本发明的方法。合适的抑制剂包括抗体或者前凝血质或抗凝血质的底物类似物，等等。在一个优选的实施方案中，类似物是肽。对本领域的技术人员而言，他们知道合适的抑制剂，并且这些抑制剂通常可商业获得。
在一个优选的的实施方案中，抑制性抗体或者对组织因子表现出足够亲和力的多抗体联合(combinations of antibodies)，可被用作TF：因子VIIa复合物的抑制剂。在一个实施方案中，将两种抗体，指定为VD10和VIC12，联合使用。对试剂中抗体或多抗体联合的浓度要予以提供，这样就可以将其容易地加入到血液样品中以提供恰当的终浓度，从而实施本发明的方法。在另一个实施方案中，抑制剂为因子VIIai，它是因子VIIa的无催化活性变体。
也可以在有某些另加的化合物存在下，采用本发明的方法来确定凝固时间；另加的化合物在鉴定和监测某些与血栓形成有关的疾病状态时，提供了诊断和治疗用途方面的有用信息。化合物诸如同型半胱氨酸、组织因子、Russell’s蝰蛇毒和其他促凝血蛇毒，均予以考虑。计划中用于本发明的凝块形成过程的其他调节剂包括前凝血质类诸如凝血酶、血小板激活因子、纤维蛋白原、高岭土、硅藻土、腺嘌呤二磷酸、花生四烯酸、胶原和瑞斯托菌素。具有抗凝活性、可用作本发明的凝块形成过程之调节剂的因子包括蛋白质C、蛋白质S、抗凝血酶III、血栓调节素、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、链激酶、组织因子通路抑制剂和冯威布兰特因子。所加入的可调节血液凝固活性的治疗性药物，也可以在本发明中用作调节剂。另外，癌细胞提取物和羊膜液也可以作为调节剂使用。
本发明并不局限于任何特定的测定凝块形成方法。在本发明中，可以使用任何数量的已知的测定血液凝块形成方法，其中包括手工、半自动和全自动的方法及其相应装置或仪器。适于该目的的仪器包括，例如，测定由起始凝块形成而引起的机械阻抗的所有仪器。起始凝块形成或者影响凝固时间的试剂，可以多种形式出现，其中包括但不限于溶液、冷干或风干的形式、或者干板模式(dry card formats)。
例如，Sienco公司的SONOCLOTTM血液凝固分析仪，通过测定粘弹性以确定待测样品的机械阻抗。这种分析对纤维蛋白形成非常敏感，因而提高了结果的敏感性和可重复性。
另一种装置，血栓弹力描述仪(TEG)，也可用于测定粘弹性。这类仪器的一个例子是计算机化的血栓弹力描述仪(CTEG)，来自Haemoscope公司。SONOCLOTTM和CTEG都能够通过分别测定血液的黏性或弹性的变化，记录血液凝固过程中的变化。最后，可以得到一张整个过程的完整图谱。
其他仪器诸如HEMOCHRONTM，虽然测定凝固时间，但是并不提供凝块形成参数随时间的变化曲线图。该HEMOCHRONTM系统(InternationalTechnidyne公司)使用了于试管内精确排列的磁块以及位于仪器内的磁性检测器来检测凝块的形成。
在本发明的一个实施方案中，其中的测定法是基于急情况实施的，例如，在急症室中对怀疑具有急性血栓形成现象诸如心脏病发作或中风的患者进行测定，因而不需要使用任何抗凝血质，并且可以用新鲜血液直接进行测定。所需要的试剂，诸如抗体，可以预先加载到凝固分析仪中，然后确定凝固时间，同时还可以对不加抗体的对照样品进行测定。或者，也可以首先将血液收集到含结合钙离子的抗凝血质诸如柠檬酸盐、草酸盐、EDTA等的容器中，接着在传统实验室条件下测定凝固时间。为了起始含一种或多种这些抗凝血质样品的凝块形成，必须加入钙盐。形成纤维蛋白聚合物所需要的时间，在这种情况下，被称为再钙化时间。在本发明的另一个实施方案中，当血液的收集是在有内源性接触激活凝固途径的一特定抑制剂，比如玉米胰蛋白酶抑制剂，存在下进行时，可能会改善血液凝固中的前凝血质或抗凝血质的检测敏感性和特异性。
作为对抗凝处理的血液进行测定的例子，我们将1毫升柠檬酸化的血液与抑制性的抗一组织因子单克隆抗体(终浓度为10毫克/毫升)混和。将另一个同样是1毫升分装的柠檬酸化的血液与对照抗体或对照蛋白质混和。在对样品进行混合处理后，置于37℃温育箱中。在经过一定的温育时间后，分别从每个样品取出300微升，与40微升0.1M氯化钙混合，然后采用自动化仪器测定再钙化时间(形成纤维蛋白所需要的时间)。对照与含有抑制剂(抗体)样品在再钙化时间上的差异，被诊断性地用于表明患者是否由于组织因子水平的升高而具有异常的血液凝固性以及患者是否需要医疗干预。
在本发明的另一个实施例中，提供了用于测定血液凝固性的测试试剂盒，其中提供了恰当浓度的抑制剂，目的就在于根据本发明的方法来确定凝块形成或再钙化的时间。
组织因子(TF)，也称为因子III，负责起始外源性血液凝固途径。组织因子主要存在于循环血液的单核细胞中。某些疾病状态可能会使人的单核细胞易于被组织因子所激活，所以就具有异常快速的全血凝固时间倾向性。这样的患者就很可能处于血栓形成或其他过程的危险之中。
目前，还没有任何方法来准确地评价这种血液凝固性过高的状态。通过在存在和不存在抗-TF抗体的情况下对未受刺激的凝固时间进行比较、从而检测出循环的TF水平，本发明可被用来评价血液的过高凝固性。在本发明的另一种形式中，通过在存在或不存在抗-TF抗体的情况下对患者的经LPS-刺激的全血凝固时间进行比较，已考虑过对血液凝固性过高的生理承受潜力进行测定。
实施例1
在本实施例中描述的组织因子全血测定法，包括一个在Hemochron仪器上进行的实验操作。这个操作使用了抗-TF抗体抑制实验，以评价全血中内源的循环的组织因子水平。评价血液循环中的TF所需要的材料和试剂
Hemochron P213样品试管
0.01M氯化钙储存液
含有非抑制性抗体的对照小试剂瓶
含有干燥的抗—组织因子抗体的小试剂瓶
测试质量对照试剂
Hemoliance RecombiPlasTin储存液(脂质化的重组组织因子)
TF稀释液(20mM HEPES 150mM氯化钠，pH7.4，含有0.10mg/mL
牛血清白蛋白)
含有抗凝血质柠檬酸盐液体和玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)的血液
收集管Hemochron P213试管的准备
在进行未受刺激的凝固时间测试之前，预先加载50μL 0.10M氯化钙溶液于Hemochron P213试管中。将试管盖上塞子于室温保存。用于未受刺激的全血凝固时间的质控样品之制备
阴性对照＝TF稀释液
强阳性TF对照：
将脂质化的重组TF储藏液按1∶100进行稀释，也就是，将10μl脂质化的重组TF储藏液加入到0.99ml稀释TF用溶液中。弱阳性TF对照：
将强阳性TF对照溶液按1∶7进行稀释，也就是，将100μL强阳性TF对照溶液加入到0.60ml稀释TF用溶液中。抽血
弃去所抽血液开始的几毫升，然后抽血至5ml柠檬酸盐/CTI血液收集管中。所抽血液应在4小时内进行分析。循环的TF之未受刺激的血块凝固时间测试(10分钟温育)
从每8支柠檬酸盐/CTI血液收集测试管中取出一支，用于未受刺激的凝固时间测试。
将10μl阴性或者阳性TF对照试剂加入到下列4支测试小管中：
对照小管+阴性TF对照
抗-TF抗体小管+阴性TF对照
对照小管+阳性TF对照
抗-TF小管+阳性TF对照
取0.5mL柠檬酸盐/CTI抗凝处理的血液，转移到每支测试小管中。缓慢翻转试管几次予以混匀。
置于37℃水浴中温育10分钟。
在温育10分钟结束之后，从每支测试小管中取0.40ml血液转移到含有50μl氯化钙的Hemochron P213样品试管中。
在Hemochron 8000上，选择测试(test)＝“ACT”和试管(tube)＝“P214/5”。按“开始(start)”键，启动凝块形成计时器。缓慢地转动Hemochron试管，将血液和氯化钙溶液混匀。将试管置于Hemochron样品井中。转动样品井中的试管，直到绿灯亮了为止。
典型的未受刺激的凝固时间：
对照小管+阴性TF对照：＞850秒
TF抗体小管+阴性TF对照：＞850秒
对照小管+强阳性TF对照：250-350秒
对照小管+弱阳性TF对照：650-750秒
TF抗体小管+弱或强阳性对照：＞850秒
为了阐明本发明在检测循环的TF、从而评价血液的凝固性过高中的用途，图2表示在存在和不存在抗-TF抗体的情况下，在37℃温育10分钟后，通过比较凝固时间，检测全血中外源性加入的TF。
实施例2
本实施例描述在Hemochron仪器上进行的脂多糖—刺激实验操作过程，它评价了全血中内毒素(脂多糖)刺激后反应性TF的产生。评价LPS刺激后在全血中反应性产生的TF所需的材料和试剂
Hemochron P213样品试管
0.10M氯化钙储存液
含有干燥的LPS的小试剂瓶
含有干燥的LPS和干燥的抗-组织因子抗体的小试剂瓶
含有抗凝血质柠檬酸盐液体和玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)的血液
收集管Hemochron P213试管的准备
在进行受刺激的组织因子凝固时间测试之前，预先加载50μl0.10M氯化钙溶液于Hemochron P213试管中。将试管盖上塞子于室温保存。抽血
弃去所抽血液开始的几毫升，然后抽血至试剂盒所提供的5ml柠檬酸盐/CTI血液收集管中。所抽血液应在4小时内进行分析。LPS-刺激的凝固时间测试(2小时温育)
取0.5ml柠檬酸盐/CTI抗凝处理的样本血液，转移到下列每支测试小管中：
含有干燥的LPS和对照试剂的小管
含有干燥的LPS和干燥的抗-TF抗体这二者的小管
缓慢翻转几次测试小管，将样品混匀。置于37℃水浴中2小时在温育2小时结束之后，缓慢翻转测试小管予以混匀。从每支测试小管中取0.40ml血液转移到含有50μl氯化钙的Hemochron P213样品试管中。
在Hemochron 8000上，选择测试(test)＝“ACT”和试管(tube)＝“P214/5”。按“开始(start)”键，启动凝块形成计时器。缓慢地转动含有再钙化血液的Hemochron试管。将试管置于Hemochron上。扭转样品井中的试管，直到绿灯亮了为止。
在2小时的LPS刺激后，典型的凝固时间为：
LPS小管：200-350秒
带有抗-TF抗体的LPS小管：＞850秒
实施例3
在本实施例中描述的组织因子全血测定法，包括一个在SonoclotTM仪器上进行的实验操作。这个操作使用了抗-TF抗体抑制实验，以评价LPS-刺激的全血中组织因子水平。样本要求
使用19mm刻度针，按照静脉切开放血术步骤，详细操作见，例如，用于凝固性测试和凝固性测定法操作的血液样本的收集、运输和加工(美国国家临床实验室标准委员会文件，#H21-A-2，第11卷，第23)((Collection.Transport and Processing of Blood Specimensfor Coagulation Testing and Performance of Coagulation Assays)National Committee for Clinical Laboratory Standards document#H21-A-2，Volume XI，No.23)。首先收集一个弃管(顶部为蓝色的Vacutainer)，接着在弃管内放入含有50μg/ml的玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)和0.5ml 3.2％的柠檬酸钠的塑料Vacutainer试管，用作实际的测试样本。Vacutainer试管应含有至少4.5ml血液。如果不够4.5ml，不要继续进行测试。在样本的收集过程中如果不能获得充分的血流，那么就弃去样本并尝试在患者的另外一只胳膊上再进行一次静脉穿刺术。抽血后，缓慢翻转Vacutainer几次。注意：将收集后的样本放在室温。试剂的制备和保存
1.带盖小管(2.0-ml聚丙烯)和冷干试剂由Sienco提供。在小管的盖上有彩色标码：干净无色盖(代表对照单克隆抗体)，白色插入物(代表TF单克隆抗体混合剂)，黄色插入物(不含任何试剂)，蓝色插入物(含有20微升0.5mg/ml的冷干的Difco内毒素)。每个患者的样品将需要4支试管，每种颜色1支。保存于2-8℃。
2.氯化钙0.1M(Analytical Control Systems，Inc.，Fishers，Ind.)。保存于2-8℃。
1.于Tris缓冲的盐液(pH7.4)1mg/ml BSA中的抗-骨钙素单克隆抗体。保存于2-8℃。
2.于Tris缓冲的盐液(pH7.4)1mg/ml BSA中的组织因子单克隆抗体。保存于2-8℃。所需要的设备
1.SonoclotTM分析仪
2.使用手册
3.由Sienco提供的小池。对于每一个患者的样品，将需要5个小池(4个装血液样品，剩下的那个用来温暖氯化钙)
4.由Sienco提供的磁力搅拌棒
5.由Sienco提供的探针
6.由Sienco提供的探针提取器
7.加热装置或者设置到37℃的水浴箱
8.计时器
9.Eppendorf移液管和移液管吸头(40微升，300微升和1000微升)
10. 13个100mm规格的Haematologic Technologies公司的Vacutainer，其中每个含有0.5ml 3.2％缓冲的柠檬酸盐和50μg/ml的玉米胰蛋白酶抑制剂
11. 19mm刻度针操作步骤
1.样品的制备：将1个无色透明小管、1个白色小管、1个黄色小管和1个蓝色小管置于试管架上。手工混合Vacutainer 6-10次，确保混合均匀。在通风橱中或者在防溅装置下打开Vacutainer。
2.吸取1.0ml血液移至每个无色透明和白色的小管中。在每个无色透明小管中加入5微升对照抗体。在每个白色小管中加入5微升TF单克隆抗体混合剂。把每个小管的盖合上，缓慢翻转6-10次，然后将小管置于水浴中。设定计时器为10分钟。
3.吸取1.0ml血液移至每个黄色和蓝色的小管中。不要向这些小管中加入任何试剂。把每个小管的盖合上，缓慢翻转6-10次，然后将小管置于水浴中。设定计时器为2小时。
4.样品的测试
a)吸取300微升氯化钙移至已置于SonoclotTM分析仪侧井中的小池中，如此将氯化钙温暖至37℃。
b)通过略微摆动，将探针置于SonoclotTM上合适的位置。也是通过略微摆动，将小池稳固地置于插座上。
c)将1根磁力搅拌棒插入到小池中。
d)加40μl0.1M氯化钙于小池中。合上盖头。
e)在校正温育时间后，从水浴中移出合适颜色的小管并缓慢翻转6-10次。把盖子移开，然后立即吸出300微升样品移至置于SonoclotTM分析仪中的小池中。要避免泡沫的形成。
f)缓慢地再抽吸样品仅仅一次(以避免激活血小板)，使其与已处于小池中的氯化钙混和均匀。一旦样品被转移到小池中并与氯化钙混和，立即将SonoclotTM分析仪上的金属肘节开关按至“开始(Start)”(下)位置，以激活磁力搅拌器。等待声音提示以及屏幕上的文字说明，以关闭盖头。合上门盖(port head)这将把探针引入到样品中并将开始进行测试。
g)当测试完成时将会听到一声声音提示音响。读取数据盘上的数值以及SonoclotTM分析仪的图表记录。SoneclotTM分析仪自动地计算出凝固时间。即使音响较早地响起，也应让测试运行至少20分钟，以获得更多原始数据。
h)立即记录下全血的凝固时间，同时还有鉴定信息，其中包括小管的类型(无色透明，白色，黄色，或蓝色)、患者的身份号码和进行测试的日期和时间。
i)清洗小池，用探针提取器处理探针
j)对于每个样品小管，一旦已将其温育了合适的时间，就重复上述步骤a-i。
3.安全预防措施：技术人员应采取广泛的预防措施，以消除通过血液中携带的病原体感染上疾病的可能性。这些预防措施应至少包括眼镜、手套和合适的罩衣。应采用恰当的移液管、吸头、小管和样品容器处理技术。操作步骤评注：
1.检查试剂的日期。试剂不应该已过其失效期。
2.确保温育时间和温度的准确性。这些步骤至关重要。
3.操作患者样品时要采取适当的预防措施。
4.所有移液管吸头使用塑料制品。在任何情况下，不能使玻璃制品与血液接触。
5.采用合适的消毒程序以除去流出血液。
6.将测试试剂盒材料保存于2-8℃。失效期过后不要使用。这种测试仅用于体外诊断性研究。质控
1.与SonoclotTM分析仪一起提供的粘度油对照，应按照说明手册中所述进行。
2.技术人员应进行定期的样品复读(至少每组或每25次读数一次，无论哪个更频繁)。为了这么做，从同一个温育小管中吸取两个300微升样品并置于两台仪器中，以同时记录全血的凝固时间读数。对从小管中要吸出的每一个样品都使用一支新移液管吸头。复份数值的误差应在平均值的10％以内。
3.为质控目的，每日应根据制造商的说明要求，其位于SonoclotTM说明书手册第4章中，对仪器作出评价。错误来源
在进行测定中可能发生的错误是那些可以归咎到技术人员错误、仪器或供给问题以及记录错误的错误。每一组错误的主要来源包括：
1.技术人员错误—低水平或创伤性静脉穿刺，样品抽不满，样品没有恰当地混合和翻转，样品或钙的体积不合适，温育时间错误，仪器使用错误，数据传输错误，或者样品混杂。
2.仪器错误—没有按照说明书进行，没有运行仪器制造商的质控操作步骤，没有运行凝固性质控操作步骤，温度错误，以及复读样品间持续缺乏一致性。
3.记录错误—无法保持准确和及时的记录，数据传输错误，没有记录小瓶的批号。受试人群
供血受试者是从位于LaJolla，California的Scripps研究所(TheScripps Research Institute)的一般临床研究中心(General ClinicalResearch Centre(GCRC))中的健康正常人群中抽取的。受试者没有长期服用任何药物，并且在供血前的20天内不能使用非类固醇性抗炎药物(NSAIDS)。人血液样品的使用，得到了人类受试者研究委员会(Human Subjects Research Committee)的批准，并受其管理。凝固时间的测定
全血凝固时间的测定，正如上面所描述，使用了SonoclotTMCoagulation and Platelet Function Analyzer(Sienco公司，WheatRidge，CO)，这种仪器将一次性使用的振动探针浸入300μl全血中，以测定纤维蛋白丝的黏性阻力(1，2)。通过使用Sienco公司修改的软件以用于预定启始(custom onset)计算法(CoagulationDiagnostics公司，Bethesda，MD)，计算再钙化样品的阻抗上升至高于基线6个单位的秒数，就可以得出凝固时间。正如上面所提到，用于测定的全血样品，是无创伤性地收集至含有0.5ml 3.2％柠檬酸钠(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)的5ml Vacutainer玻璃试管中的。从抽血到进行测试，这之间的时间少于4小时。在将血液等量分装至温育试管中之前，将装有血样的试管翻转几次以对全血进行再混合。在有或没有细菌脂多糖(LPS)(10μg/ml)(大肠杆菌055：B5 Weatphal，Difco；Detroit，MI)存在下，将处于塑料试管中的血液(1ml)于37℃温育10分钟或2和4小时。在37℃温育期间不能有任何搅动。温育之后，再混合血液，然后等量分装300μl至已温暖的小池中，小池中已预先加载了40微升0.1M CaCl2和磁力搅拌棒。在10秒的搅拌顺序之后，对凝固时间进行测定。抑制TF活性对凝固时间的效应
通过加入终浓度为10g/ml抑制性的鼠抗人组织因子(3)(9C3，5G9，6B4)的IgG1单克隆抗体的混合剂，，测定了抑制性的抗-TF抗体对凝固时间的影响。非抑制性的鼠IgG1抗体(10H10)被用来作为对照。
为了确定TF对全血的凝固时间所起的作用，我们检验了抑制性的抗-TF抗体混合剂对凝固时间的效应。抑制性的抗-人TF单克隆抗体显著地延长了LPS-刺激的血液的凝固时间，但对来自健康自愿者的未受刺激的血液就不是这样。非抑制性抗体对照对受刺激或未受刺激的血液没有任何效应(图3)。对19位健康个体的进一步研究证明，抑制性的抗-TF抗体对平均基线凝血时间(10分钟)没有任何效应(有抗体存在时478±78对无抗体存在时473±113，平均值±SD)。这些数据表明，该测定法测定了LPS-刺激的全血中依赖TF的纤维蛋白丝形成。加入到全血中的重组的脂质化TF，在0-80pg/ml的范围内以剂量依赖方式，缩短了再钙化的全血凝固时间(图4)。实施例4  接触激活途径对未受刺激血液的凝固时间的作用
为了估计接触激活途径对全血凝固所起的作用，我们使用了3个方案：i)我们将再构建于因子XII，XI，或VII缺陷的血浆中的血液形成凝块；ii)我们使用了玉米胰蛋白酶抑制剂，它抑制因子XIIa；和iii)我们使用了抑制性的抗—因子XIa抗体，以抑制因子XIa活性。为了确定缺陷血浆的效应，通过850×g离心10分钟将细胞与血浆分开，并对所分离的细胞进行冲洗和再悬浮于以下血浆：自体血浆，汇集的正常血浆，因子XI-缺陷血浆，因子XII-缺陷血浆和因子VII-缺陷血浆(Sigma)。在分析因子XIIa抑制实验中，我们使用了玉米胰蛋白酶抑制剂(32g/ml)(Haematologic Technology，EssexJunction，VT)。在分析因子XIa抑制实验中，在37℃温育之前，将山羊抗-人因子XIa抗体(10g/ml)(由K.Mann博士慷慨提供)或者未免疫山羊抗体对照加入到全血中。在所有情况下，在测定全血凝固时间之前，均将血液在37℃温育10分钟。
在测定凝固时间之前，将从全血中分离的细胞与多种血浆再构建。再构建于自体血浆中的细胞比未处理的血液表现出略微较快的凝固时间(图5A)，这也许反映出在分离细胞的过程中，单核细胞和血小板被部分激活。再构建于正常血浆或因子VII-缺陷血浆中的细胞，所表现出的凝固时间与用自体血浆再构建所观察到的那些结果相似，这与抗-TF抗体研究相一致，即未受刺激的血液没有表现出任何TF活性。自体血浆与正常或因子VII-缺陷血浆之间的微小差别，也许是由于新鲜血浆与冰冻/冷干血浆之间有不同之处所致。与用因子VII-缺陷血浆所得到的结果相反，当将细胞与因子XI-和因子-XII这二者均缺陷的血浆再构建时，凝固时间被显著地延长了，这就提示接触激活途径对未受刺激血液的凝固时间产生了作用。类似地，抑制性的抗-因子XIa抗体显著地延长了未受刺激全血的凝固时间(图5B)。
我们使用了玉米胰蛋白酶抑制剂，以封阻因子XIIa活性(4)。又一次地，我们同样观察到在存在玉米胰蛋白酶抑制剂时，未受刺激血液的凝固时间延长了(图5c)。在使用或不使用玉米胰蛋白酶抑制剂的情况下，在凝固时间上的平均差异为141±88秒(平均值±SD，n＝28)。重要的是，玉米胰蛋白酶抑制剂并不封阻LPS-刺激的血液的凝固时间(图5c)，并且我们已经表明它是依赖TF的(见图3)。总起来，这些研究表明：虽然接触激活途径对未受刺激血液的凝固时间产生了作用，但是它并不显著地影响LPS-刺激的血液之较短的凝固时间。实施例5  抑制抗凝血质对全血凝固时间的作用
我们对未分级肝素、低分子量肝素(LMWH)和水蛭素这些抗凝血质对LPS-刺激的血液的凝固时间进行了检验。其结果分别表示于图6A-6C。未分级肝素和LMWH既抑制凝血酶又抑制因子Xa。但是，相对于其抗—因子Xa活性，未分级肝素表现出更强的抗凝血酶活性(5)。相反，与其抗-因子Xa活性相比，LMWH之类所具有的抗凝血酶活性低(5)。水蛭素选择性地抑制凝血酶(6)。对LPS-刺激的血液施用临床相关剂量的这三种抗凝血质中的任何一种，均以剂量依赖方式显著地延长了凝固时间。这些数据表明，该凝固时间测定法可用于临床方面，以监测抗凝血质治疗。实施例6  不稳定心绞痛患者的血液凝固时间
为了研究不稳定心绞痛，我们对收入位于Baltimore的JohnHopkins医院急症室、入院诊断为不稳定心绞痛患者(n＝8)的血液进行了分析。排除了服用抗凝血质的患者。将一组来自同一地点的健康自愿者(n＝37)作为对照组。人血样品的使用，得到了人类受试者研究委员会(Human Subjects Research Committee)的批准，并受其管理。在文献(7，8，9，10)中已报道不稳定心绞痛患者的血液中的TF蛋白质的水平升高。我们检查了收入急症室、患有不稳定心绞痛患者的未受刺激血液的凝固时间。不稳定心绞痛患者的未受刺激血液的凝固时间显著地快于健康自愿者组的凝固时间(图7)。这些结果表明，不稳定心绞痛患者的循环TF活性水平已经提高了。
虽然前面的详述讲述了本发明的原理，为了阐明还提供了实施例，但是本领域的技术人员应该理解，通过阅读本发明公开内容，可以对其进行多种形式和细节上的改变而不脱离本发明的真正范畴。
本文所引用的所有专利和出版物，均为全文引用、作为参考。
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Claims (29)

1.一种用于确定全血中前凝血质的存在及其功能测定的方法，包括：
(a)收集全血样品；
(b)将全血样品至少等量分装两份；
(c)于等量分装物之一中加入至少一种前凝血质抑制剂；
(d)对等量分装物进行温育；
(e)测定每个等量分装物的凝固时间；和
(f)比较各等量分装物的凝固时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的前凝血质选自α-2-抗纤维蛋白溶酶、纤维蛋白原、高分子量激肽原、激肽释放酶、前激肽释放酶、组织因子、因子II、因子IIa、因子Va、因子VIIa、因子VIIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa和因子XIIIa。
3.根据权利要求1所述的方法，它进一步地包括将接触激活抑制剂加入到全血样品中或者在存在接触激活抑制剂的情况下收集样品或全血。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的接触激活抑制剂是玉米胰蛋白酶抑制剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的前凝血质抑制剂是抗体或前凝血质底物的类似物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的抑制剂是抗体。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述的类似物是肽。
8.根据权利要求6所述的方法，它进一步包括将对照抗体加入到不含前凝血质的抗体性抑制剂的等量分装物中，其中对照抗体的加入量与前凝血质的抗体性抑制剂基本相等。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的前凝血质不是组织因子。
10.一种用于确定全血中抗凝血质的存在及其功能测定的方法，包括：
(a)收集全血样品；
(b)将全血样品至少等量分装两份；
(c)于等量分装物之一中加入至少抗凝血质抑制剂；
(d)对等量分装物进行温育；
(e)测定每个等量分装物的凝固时间；和
(f)比较各等量分装物的凝固时间。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的抗凝血质选自α-1-抗胰蛋白酶、激活的蛋白质C、抗凝血酶III、C1酯酶抑制剂、肝素、蛋白质C、蛋白质S、血栓调节素和组织因子通路抑制剂。
12.根据权利要求10所述的方法，它进一步地包括将接触激活抑制剂加入到全血样品中或者在存在接触激活抑制剂的情况下收集样品或全血。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的接触激活抑制剂是玉米胰蛋白酶抑制剂。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述的抗凝血质抑制剂是抗体。
15.根据权利要求14所述的方法，它进一步包括将对照抗体加入到不含抗凝血质的抗体性抑制剂的等量分装物中，其中对照抗体的加入量与抗凝血质的抗体性抑制剂基本相等。
16.根据权利要求1所述的方法，其中将全血样品收集到含有柠檬酸盐的溶液中，并且在步骤(e)之前将血液再钙化。
17.根据权利要求10所述的方法，其中将全血样品收集到含有柠檬酸盐的溶液中，并且在步骤(e)之前将血液再钙化。
18.根据权利要求16所述的方法，其中将全血样品收集到含有柠檬酸盐的溶液中，并且在步骤(e)之前将血液再钙化。
19.一种用于确定全血中前凝血质的存在及其功能测定的试剂盒，它包括：
(a)含有前凝血质抑制剂的小瓶；
(b)含有非抑制性对照试剂的小瓶；和
(c)含有液体柠檬酸盐抗凝血质的小瓶。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中含有液体柠檬酸盐抗凝血质的小瓶进一步地包含玉米胰蛋白酶抑制剂。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述的前凝血质是组织因子。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述的抑制剂是至少一种抗体。
23.一种用于确定全血中抗凝血质的存在及其功能测定的试剂盒，它包括：
(a)含有抗凝血质抑制剂的小瓶；
(b)含有非抑制性对照试剂的小瓶；和
(c)含有液体柠檬酸盐抗凝血质的小瓶。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中含有液体柠檬酸盐抗凝血质的小瓶进一步地包含玉米胰蛋白酶抑制剂。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述的抑制剂是至少一种抗体。
26.一种用于确定全血中前凝血质的存在及其功能测定的方法，包括：
(a)收集全血样品；
(b)将全血样品至少等量分装四份；
(c)于两个等量分装物中加入免疫调节剂；
(d)将至少一种前凝血质抑制剂加入到一个没有免疫调节剂的等
   量分装物中以及一个有免疫调节剂的等量分装物中；
(e)对等量分装物进行温育；
(f)测定每个等量分装物的凝固时间；和
(g)比较各等量分装物的凝固时间。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述的全血样品进一步包含抗凝血质和玉米胰蛋白酶抑制剂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的免疫调节剂是内毒素。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述的抑制剂是抗体。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication