CN104698159A - 一种内毒素含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本案公开了一种内毒素含量的检测方法，包括以下步骤：S1配制至少五个含不同浓度的内毒素标准液；S2将鲎试剂稀释液分别与每个内毒素标准液按比例混合；S3分别对每个混合液采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并绘制时间-内毒素浓度的双对数图，得出标准曲线图；S4将鲎试剂稀释液与待测样品液按照特定比例混合，随后采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并与标准曲线图对比，从而得出待测样品液中的内毒素含量。本案相比传统的浊度法以及电化学生物传感器，能对整个过程进行更全面的检测，有利于对这种特殊的生理过程的研究，并且大大缩短了检测时间，检测的灵敏度和精准度也得到同步提高。
Description
技术领域
本发明涉及内毒素的检测技术领域，特别涉及一种以弹力法对内毒素含量进行分析的方法。
背景技术
病人在静脉输注药剂后可能发生的发热、冷感、寒颤、恶心、呕吐、头痛、腰及四肢关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强、昏迷、休克、死亡等一系列症状称为热原反应。细菌内毒素是一种最广泛的热原。防止输注用药品及器械的热原污染，是临床上十分重要的。半个多世纪以来，热原检查法对保证注射用药品安全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展，该方法已不完全适合许多品种的热原检查。为此，人们研究了一种替代热原检查法的方法，这就是我们今天正在研究和扩大应用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素一是革兰氏阴性菌的细胞外壁层上的特有结构，即脂多糖，具有广泛的生物活性，以致热居首。其量值以国际单位(IU)或内毒素单位(EU)表示，现规定1IU＝1EU。细菌内毒素检查是输注药品及器械质量控制中的一项重要指标。
内毒素检测方法多基于鲎试验(limulus amebocyte lysate test，LAL)测定。鲎试验是根据鲎血提取液能被皮克水平的内毒素凝胶化的原理，通过检测凝胶的形成来检测内毒素。我国药典规定的细菌内毒素测定方法为浊度法(turbidimetric technique)和显色法(Chromogenic Technique)，此外也包括一些电化学法，但这些方法都是终点法，无法对内毒素凝固的过程进行监测，如在达到凝固的最高点后，产生的纤溶现象无法观察到。另外，传统的浊度法以及电化学法检测时间较长，已无法满足目前高通量高效率的监测要求了。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种直接检测的凝固体系的弹力变化的内毒素检测法，此法检测速度快，准确率高。
本发明采用的技术方案如下：
一种内毒素含量的检测方法，包括以下步骤：
步骤1)配制至少五个含不同浓度的内毒素标准液；
步骤2)将已知含量的鲎试剂稀释液分别与每个所述的内毒素标准液按特定体积比例混合，得到混合液；
步骤3)分别对每个混合液采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并绘制时间-内毒素浓度的双对数图，得出标准曲线图；
步骤4)将步骤2)中所述鲎试剂稀释液与待测样品液按照步骤2)中所述的特定体积比例混合，随后采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并与标准曲线图对比，从而得出待测样品液中的内毒素含量。
优选的是，所述的内毒素含量的检测方法，所述鲎试剂稀释液与内毒素标准液混合的特定体积比例为1∶2.5～1∶3.5。
优选的是，所述的内毒素含量的检测方法，所述鲎试剂稀释液与内毒素标准液混合的特定体积比例为1∶2.9～1∶3.1。
优选的是，所述的内毒素含量的检测方法，所述鲎试剂稀释液中，鲎试剂的含量为0.05～0.15mg/mL。
优选的是，所述的内毒素含量的检测方法，所述鲎试剂稀释液中还包括有0.03～0.05mg/mL的分子筛。
优选的是，所述的内毒素含量的检测方法，所述鲎试剂稀释液中还包括0.001～0.002mg/mL的对甲基苯磺酸钠。
优选的是，所述的内毒素含量的检测方法，所述鲎试剂稀释液中还包括0.0005～0.001mg/mL的氯化锂。
本发明的有益效果是：与传统的内毒素检测方法不同，该方法不是通过光学、浊度或电化学法进行测量，而是直接检测的凝固体系的弹力变化，得到的检测结果涵盖凝固过程中所有的信息，相比传统的浊度法以及电化学生物传感器，能对整个过程进行更全面的检测，有利于对这种特殊的生理过程的研究，比如达到凝固的最高点后，产生的纤溶现象也能够被观察到；另外，相较于浊度法和电化学法，此法大大缩短了检测时间，检测的灵敏度和精准度也得到同步提高。
附图说明
图1为内毒素诱导弹力变化机理示意图。
图2为不同浓度内毒素诱导弹力变化曲线图，由图2可知，若振幅上升得越快，则表明内毒素浓度越高。
图3为内毒素检测的标准曲线图。(以实施例1为例)
图4为弹力检测法与电化学检测法、浊度检测法的检测时间对比图。(以实施例1为例)
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
鉴于内毒素定量检测的重大意义，以及现阶段检测技术的缺陷，本发明提供了一种检测液体中内毒素含量的新方法。对于鲎血变形细胞裂解液凝集反应机制研究，一直到20世纪70年代后期才由日本学者所阐明。鲎血变形细胞裂解液中有许多能被内毒素激活的凝固系统，主要有凝固酶原、C因子、B因子及凝固蛋白原等，内毒素激活C因子，活化的C因子又激活B因子，或由(1-3)-β-D-葡聚糖激活G因子(G因子系统)，接着激活的B因子或激活的G因子，再去激活凝固酶原，使其转化为活化的凝固酶，该酶切断凝固蛋白原中特定的精氨肽链，形成凝固蛋白，产生凝胶。(参见图1)
作为本案一实施例的内毒素含量的检测方法，包括以下步骤：
步骤1)配制至少五个含不同浓度的内毒素标准液；
步骤2)将已知含量的鲎试剂稀释液分别与每个内毒素标准液按特定体积比例混合，得到混合液；
步骤3)分别对每个混合液采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并绘制时间-内毒素浓度的双对数图，得出标准曲线图；
步骤4)将步骤2)中的鲎试剂稀释液与待测样品液按照步骤2)中的特定体积比例混合，随后采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并与标准曲线图对比，从而得出待测样品液中的内毒素含量。
其中，鲎试剂是成熟的市售商品，可购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司。血栓弹力图仪也是成熟的市售产品，可购自多家医疗器械公司，本案对血栓弹力图仪无需做特殊限定。步骤3)得出的标准曲线图应趋于线性。
作为本案另一实施例，其中，鲎试剂稀释液与内毒素标准液混合的特定体积比例优选为1∶2.5～1∶3.5。实验发现，该比例应被限定，若不将该比例限定在一个很小的范围内，得出的标准曲线图将偏离线性，且超出该比例范围越多，偏离越严重。
作为本案又一实施例，其中，鲎试剂稀释液与内毒素标准液混合的特定体积比例为1∶2.9～1∶3.1。实验发现，在该比例下，标准曲线图的线性拟合指数R2＞0.985，说明标准曲线图已完美接近于一条直线，由此测得的内毒素含量将更加精准。(R2由软件0rigin8拟合获得)
作为本案又一实施例，其中，鲎试剂稀释液中，鲎试剂的含量优选为0.05～0.15mg/mL。通过实验发现，鲎试剂的含量大小也会影响最终所得的标准曲线图的线性拟合指数，通过对比得出，将鲎试剂的含量限定在该范围内，可以获得最理想的标准曲线图。
作为本案又一实施例，其中，鲎试剂稀释液中还包括有0.03～0.05mg/mL的分子筛。实验发现，分子筛可以调节内毒素与鲎试剂的反应速率，并且能够在凝固达到最高点时，延长纤溶现象存在的时间，使其能够被更容易的观察到。但分子筛的添加量应被限制，若超出该范围，其将会影响标准曲线的线性拟合指数。不仅添加量应被限制，分子筛的规格也应被限定，实验发现，分子筛和分子筛均不能实现其延长纤溶现象存在的时间的功能，而仅有分子筛可以实现这一功能，并且分子筛也能在一定程度上给标准曲线的线性拟合指数带来积极影响。
作为本案又一实施例，其中，鲎试剂稀释液中还包括0.001～0.002mg/mL的对甲基苯磺酸钠。对甲基苯磺酸钠是助剂，可改善内毒素与鲎试剂的反应速度，并提高标准曲线的线性拟合指数。作为更优选的方案，还可在鲎试剂稀释液中再加入0.0005～0.001mg/mL的氯化锂，它与对甲基苯磺酸钠可发挥协效作用，进一步改善标准曲线的线性拟合指数，使内毒素的检测更加准确灵敏。
以下是具体实施例，其中，均使用这7种不同浓度的内毒素标准液：0.01、0.05、0.2、0.5、1.0、2.0、10.0、20.0(EU/mL)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种内毒素含量的检测方法，包括以下步骤：
步骤1)配制至少五个含不同浓度的内毒素标准液；
步骤2)将已知含量的鲎试剂稀释液分别与每个所述的内毒素标准液按特定体积比例混合，得到混合液；
步骤3)分别对每个混合液采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并绘制时间-内毒素浓度的双对数图，得出标准曲线图；
步骤4)将步骤2)中所述鲎试剂稀释液与待测样品液按照步骤2)中所述的特定体积比例混合，随后采用血栓弹力图仪检测弹力达到0.1振幅时所需的时间，并与标准曲线图对比，从而得出待测样品液中的内毒素含量。
2.根据权利要求1所述的内毒素含量的检测方法，其特征在于，所述鲎试剂稀释液与内毒素标准液混合的特定体积比例为1∶2.5～1∶3.5。
3.根据权利要求2所述的内毒素含量的检测方法，其特征在于，所述鲎试剂稀释液与内毒素标准液混合的特定体积比例为1∶2.9～1∶3.1。
4.根据权利要求1所述的内毒素含量的检测方法，其特征在于，所述鲎试剂稀释液中，鲎试剂的含量为0.05～0.15mg/mL。
5.根据权利要求1所述的内毒素含量的检测方法，其特征在于，所述鲎试剂稀释液中还包括有0.03～0.05mg/mL的分子筛。
6.根据权利要求1所述的内毒素含量的检测方法，其特征在于，所述鲎试剂稀释液中还包括0.001～0.002mg/mL的对甲基苯磺酸钠。
7.根据权利要求6所述的内毒素含量的检测方法，其特征在于，所述鲎试剂稀释液中还包括0.0005～0.001mg/mL的氯化锂。
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