CN105445467B - 焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法，涉及鲎属溶成剂的生物物质领域。本发明检测方法包括以下步骤：a.反应溶液制备（Ⅰ）称取焦亚硫酸钠，加入细菌内毒素检查用水，得供试品焦亚硫酸钠浓度为100mg/ml；（Ⅱ）用细菌内毒素检查用水将供试品焦亚硫酸钠稀释到0.1mg/ml‑0.6mg/ml；b. 取动态显色法鲎试剂，开启后加入细菌内毒素检查用水复溶；c. 将0.1mg/ml‑0.6mg/ml的供试品焦亚硫酸钠与步骤b中复溶的鲎试剂等体积混合，放入反应试管中并插到动态试管检测仪中，计算内毒素的含量。本发明避免了动物热原检查法的不足，重现性强，灵敏度高，操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及鲎属溶成剂的生物物质，具体是一种焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法。
背景技术
焦亚硫酸钠是一种常用的抗氧剂，广泛用于药品、食品等行业的生产中。焦亚硫酸钠极易被氧化，具有强还原性的物质，其氧化电势比药物低，当其与易氧化的药物（如含酚性成分、萜烯、蒎烯、芳香胺、吡唑酮等的物质）同时存在时，可首先与其作用而使主药保持稳定状态。
输液产品是医院日常的必备基础药品。目前国内输液市场正处于价格战，产品的升级换代是关键，产品升级换代必然要对其使用的原料进行严格的控制，以保证产品质量。而热原或细菌内毒素是注射剂质量关键控制项目之一。
按照《中国药典》2015年版的规定，热原检查可采用家兔升温法。该方法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，按时观察记录家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。家兔法检测内毒素的灵敏度为 0.001pg/ml，试验结果接近人体真实情况，是公认的比较可靠的热原检查方法。但其操作繁琐费，影响因素众多，检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。
随着制药工业的发展和科学技术的进步，人们发现革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖 (Lipoplysaccharide)和微量蛋白(Protein)的复合物——细菌内毒素，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质，当机体内毒素浓度阈值>0.005ng/ml时，即可刺激体温调节中枢导致机体发热。
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的兰色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。目前国际上销售的鲎试剂有两种，一种称美洲鲎试剂（LAL），由美国生产；另一种称东方鲎试剂（TAL）。TAL与LAL有相同的功效。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为 0.0001pg/ml，比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，特别适用于注射用原辅料、注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，也是受到各国药典承认的一种通用方法。
目前已经有学者用鲎试剂法检测焦亚硫酸钠原料的细菌内毒素，其结果是验证了鲎试剂法的可行性，但他们采用的是最常见的凝胶法来检测的。凝胶法也是药典规定的方法，实验设备要求低，但是该方法是一个限度测定法，这种方法只能分析产品中内毒素的含量有没有超过标准, 而不能够得出确切的定量结果。
因此，需要一种新的检测焦亚硫酸钠细菌内毒素的方法，可避免以上动物热原检查法、凝胶法的不足，检测细菌内毒素既省时又省经济，能够满足注射剂及其原辅料检测的需要。
发明内容
本发明就是为了解决传统的凝胶法只能分析产品中内毒素的含量是否超标, 而不能够得出确切的定量结果的问题，所提出的一种焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法，包括以下步骤：
a.反应溶液制备
（Ⅰ）称取焦亚硫酸钠，加入细菌内毒素检查用水，得供试品焦亚硫酸钠浓度为100mg/ml；
（Ⅱ）用细菌内毒素检查用水将供试品焦亚硫酸钠稀释到0.1mg/ml-0.6mg/ml；
b.试剂复溶
取动态显色法鲎试剂，开启后依动态显色法鲎试剂使用说明加入细菌内毒素检查用水复溶；
c.加样及反应
将0.1mg/ml-0.6mg/ml的供试品焦亚硫酸钠与步骤b中复溶的鲎试剂等体积混合，放入反应试管中并插到动态试管检测仪中，计算内毒素的含量。
步骤a（Ⅱ）中供试品焦亚硫酸钠的稀释浓度为0.4mg/ml。
步骤c中内毒素的检测温度为37.0±0.5℃，最长检测时间为60±2min，检测波长为340nm-660nm。
所述检测波长为405nm。
本发明获得了如下的有益效果。
本发明公开了一种焦亚硫酸钠原料中细菌内毒素的检测方法，确定使用焦亚硫酸钠的无干扰稀释浓度；然后将待测的焦亚硫酸钠原料稀释成0.4mg/ml待测溶液，进行细菌内毒素检测。本发明的焦亚硫酸钠原料中细菌内毒素的检测方法，可避免动物热原检查法的不足，解决了新开发注射液产品中焦亚硫酸钠原料的细菌内毒素检查问题；从源头上对无菌产品质量进行定量控制，对保证输液产品的安全性有重要意义。该方法有生物化学的理论基础，更科学；利用酶的分子生化反应，专属性高，重现性强，准确度和灵敏度高；操作简单快速，无需特殊仪器设备，实用性强。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
1.实验材料
1.1供试品
1.2 试剂及仪器
2. 标准曲线选择及最低有效浓度的确定
2.1标准曲线的选择
按注射剂每支最大装量为20mL，使用焦亚硫酸钠最大浓度为0.2%, 临床安全系数为10倍计算，临床一次使用抗氧剂的量为400mg。内毒素限值L = K /M =5 EU/kg÷( 400mg÷60 kg) =0.75EU/mg。
本试验选取0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml进行干扰初筛试验，故依据内毒素限值，系列反应溶液中可能含有的最大内毒素量为0.75EU/mg×0.8mg/ml=0.6 EU/ml，而鲎试剂检测最高灵敏度为0.005 EU/ml，故本次试验选择标准曲线为4点曲线，各点浓度为5EU/ml，0.5 EU/ml，0.05 EU/ml，0.005EU/ml。
2.2最低有效浓度的确定
最低有效浓度MVC=λ/ L=0.005EU/ml÷ 0.75EU/mg=6.67×10-3mg/ml
3. 干扰初筛试验
称取1g焦亚硫酸钠加10 ml BET水溶解，得供试品焦亚硫酸钠的浓度为100mg/ml。本试验选取0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml进行试验。
3.1反应溶液制备
称取1.0g焦亚硫酸钠加10 ml BET水溶解，得供试品焦亚硫酸钠的浓度为100mg/ml。
供试品（溶液A）稀释过程：
内毒素标准品（溶液C）稀释过程：
供试品阳性对照（溶液B）稀释过程：
阴性对照（溶液D）：细菌内毒素检查用水。
3.2试剂复溶
取动态显色法鲎试剂2支，开启后加入1.25ml 细菌内毒素检查用水复溶，待溶液澄清后，用无热原吸头转移合并至1支。
3.3加样及反应
将0.1ml上述制备的溶液A、B、C、D分别与0.1ml 鲎试剂加入8×75mm反应试管中，轻轻混匀，插入动态试管检测仪中反应，使用软件计算回收率、内毒素含量等数值。
3.4试验结果
药典要求
（Ⅰ）阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间；
（Ⅱ）标准曲线的相关系数│r│≥0.980；
（Ⅲ）回收率R满足：50%≤R≤200%；
初步确定往样品中加入BET水溶解后稀释到0.4mg/ml使用动态显色法试剂可排除焦亚硫酸钠对细菌内毒素检查的干扰。
4.干扰试验及细菌内毒素定量测定
根据干扰初筛试验结果，初步确定往样品中加入BET水溶解后稀释到0.4mg/ml使用动态显色法试剂可排除焦亚硫酸钠对细菌内毒素检查的干扰。本试验取三批焦亚硫酸钠进行干扰试验。
4.1反应溶液制备
称取三批20111201-1、20111201-2、101220140402称取1.0g焦亚硫酸钠加10 mlBET水溶解，得供试品焦亚硫酸钠浓度为100mg/ml。
三批20111201-1、20111201-2、101220140402供试品（溶液A）按以下稀释过程稀释：
内毒素标准品（溶液C）稀释过程：
三批20111201-1、20111201-2、101220140402供试品阳性对照（溶液B）按以下稀释过程稀释：
阴性对照（溶液D）：细菌内毒素检查用水。
4.2试剂复溶
取动态显色法鲎试剂2支，开启后加入1.25ml 细菌内毒素检查用水复溶，待溶液澄清后，用无热原吸头转移合并至1支。
4.3加样及反应
将0.1ml上述制备的溶液A、B、C、D分别与0.1ml 鲎试剂加入8×75mm反应试管中，轻轻混匀，插入动态试管检测仪中反应。
4.4试验结果
药典要求
（Ⅰ）阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间；
（Ⅱ）标准曲线的相关系数│r│≥0.980；
（Ⅲ）回收率R满足：50%≤R≤200%。
将焦亚硫酸钠溶解后稀释到0.4mg/ml使用动态显色法试剂可排除焦亚硫酸钠对细菌内毒素检查的干扰。
Claims (3)
1.一种焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a .反应溶液制备
（Ⅰ）称取焦亚硫酸钠，加入细菌内毒素检查用水，得供试品焦亚硫酸钠浓度为100mg/ml；
（Ⅱ）用细菌内毒素检查用水将供试品焦亚硫酸钠稀释到0 .4mg/ml；
b .试剂复溶
取动态显色法鲎试剂，开启后依动态显色法鲎试剂使用说明加入细菌内毒素检查用水复溶；
c .加样及反应
将0 .4mg/ml的供试品焦亚硫酸钠与步骤b中复溶的鲎试剂等体积混合，放入反应试管中并插到动态试管检测仪中，计算内毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法，其特征在于：步骤c中内毒素的检测温度为37 .0±0 .5℃，最长检测时间为60±2min，检测波长为340nm-660nm。
3.根据权利要求1所述的一种焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法，其特征在于：所述检测波长为405nm。
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