CN111781365A - 一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：用二甲基亚砜作为溶剂制备盐酸右美托咪定溶液，用二甲基亚砜和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。采用本发明的检测方法可以消除盐酸右美托咪定对细菌内毒素的干扰作用，稀释的倍数小，检测结果准确可靠、操作简便，检测成本低，相对于光度法检测，操作方便、简单。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法。
背景技术
细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏细胞灭活，不造成机体损害，内毒素大量进入血液就会引起发热反应——“热原反应”，甚至导致死亡。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类(如一次性注射器，植入性生物材料)必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。制剂中的细菌内毒素，最大来源为生产用原辅料，因此，生产制剂的原辅料的内毒素水平同样需要监控。
盐酸右美托咪定是一种麻醉药，其注射液用于多种外科手术及重病监护患者机械通气时短期镇静的麻醉辅助药和于手术后镇痛，因此用于制剂生产的盐酸右美托咪定原料，也需要进行细菌内毒素检测。
目前，细菌内毒素检测主要有两种方法，分别为：凝胶法和光度法。凝胶法操作简单，普及程度高，试验条件要求低(37±1℃，60±2分钟)。而光度法，操作相对复杂，普及程度低，试验需要酶标仪等专业的设备。凝胶法因上述优势，被各国药典选择作为仲裁试验的方法(当内毒素检测结果出现争议时，以凝胶法结果为准)。
盐酸右美托咪定水溶液pH较低，且分子中含有具有螯合作用的“咪唑基”，这两个因素都会对细菌内毒素产生干扰作用。当使用NaOH溶液调节样品溶液pH值或使用稀释剂I减缓螯合作用并调节pH值时，都会引起盐酸右美托咪定从水溶液中析出，并且该析出影响了细菌内毒素的回收，回收率不足50％。目前市面上采用的消除上述抑制作用的方法主要为：对盐酸右美托咪定进行较大倍数的稀释后，采用光度法进行细菌内毒素检测。然而，光度法检测时，操作复杂，试验需要酶标仪等专业的设备，普及程度低。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法。
本发明的技术方案如下：
一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：
以二甲基亚砜作为溶剂制备5mg/mL～25mg/mL盐酸右美托咪定溶液，用二甲基亚砜(DMSO)和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水(BET水)将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查；所述供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度不高于2.5％，所述供试品溶液中稀释剂I的体积浓度为20％～50％。
本发明对供试品溶液按照《2015药典细菌内毒素检查法》，进行细菌内毒素及检查。
本发明中提及的稀释剂I的英文名称为Dilution Solution I，生产的企业为湛江安度斯生物有限公司。稀释剂I是一种辅助剂，用于枸橼酸盐类抗凝剂及一些会导致鲎反应溶液中二价离子缺失的样品的菌内毒素检查。中国药典及美国药典的细菌内毒素检查法允许使用辅助剂来消除鲎试剂试验的干扰因素。
在本申请中，溶解盐酸右美托咪定时，二甲基亚砜(DMSO)用量很重要，当二甲基亚砜(DMSO)的用量较低时，样品不能充分溶解，在后续稀释时易析出，不利于检测样品中内毒素的含量；二甲基亚砜(DMSO)的用量过高会破坏样品中细菌内毒素，从而影响检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素含量的准确性，会使检测结果呈现“假阴性”。在本发明中，溶解盐酸右美托咪定时，盐酸右美托咪定溶液中盐酸右美托咪定的浓度为5mg/mL～25mg/mL。在一种优选方案中，盐酸右美托咪定溶液中盐酸右美托咪定的浓度为5mg/mL～15mg/mL。例如，盐酸右美托咪定的浓度为5mg/mL或者10mg/mL。
对于本发明而言，进行细菌内毒素检查的供试品溶液中二甲基亚砜(DMSO)的浓度也有严格限定，二甲基亚砜(DMSO)的浓度过高或者过低都不易排除干扰作用，影响检测细菌内毒素的准确性。本发明对供试品溶液中二甲基亚砜(DMSO)的浓度进行了干扰实验，对DMSO对细菌内毒素的无干扰进行了确认，得出DMSO对细菌内毒素检测的无破坏体积浓度为≤2.5％。针对本发明细菌内毒素的检查方法，在一种优选方案中，供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度为1.5％～2.25％。例如，可以但不局限于1.5％或2.25％。
在本发明中，制备供试品溶液时，稀释剂I的浓度很重要，对供试品中稀释剂I的浓度要也要严格控制，稀释剂I的浓度过高或者过低都不易排除干扰作用，影响检测细菌内毒素的准确性。当稀释剂I的浓度过低时，不能充分消除盐酸右美托咪定对细菌内毒素检测的干扰作用，而使检测结果呈现“假阴性”；当稀释剂I的浓度较高时，破坏了样品中的细菌内毒素，也会使检测结果呈现“假阴性”。本发明中，稀释剂I在供试品溶液溶液中的体积浓度为20％～50％范围内，能有效检测样品中内毒素含量。在一种优选方案中，供试品溶液中稀释剂I的体积浓度为23.5％～47.75％。例如，可以但不局限于23.5％或47.75％。
在制备供试品溶液时，采用二甲基亚砜、稀释剂I以及细菌内毒素检查用水或者仅仅采用稀释剂I以及细菌内毒素检查用水进行稀释，在不低于最低有效活性浓度的情况下，先以各有效活性浓度制成的供试品溶液进行干扰实验，找出无干扰情况下的最低有效活性浓度，再以该最低有效活性浓度制成的供试品溶液，按照《2015药典细菌内毒素检查法》，进行细菌内毒素及检查。
在本发明中，检查盐酸右美托咪定中细菌内毒素时，根据待测盐酸右美托咪定细菌内毒素限值和鲎试剂的灵敏度确定最低有效活性浓度，其中：所述盐酸右美托咪定细菌内毒素限值为0.1EU/mg；所述鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL；所述最低有效活性浓度为0.15mg/mL。
本发明检查盐酸右美托咪定中细菌内毒素时，待测盐酸右美托咪定的内毒素限值为0.1EU/mg；选择的鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL，以各有效活性浓度制成的供试品溶液进行干扰实验时，找出无干扰情况下的有效活性浓度为0.3mg/mL和0.15mg/mL(最低有效活性浓度)，再以稀释至浓度为0.15mg/mL的供试品溶液进行细菌内毒素检查。本发明采用凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的含量，只需要用二甲基亚砜(DMSO)溶解盐酸右美托咪定制成5mg/mL～25mg/mL盐酸右美托咪定溶液，再以二甲基亚砜(DMSO)和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水(BET水)将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液，供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度不高于2.5％，稀释剂I的体积浓度为20％～50％，即可消除盐酸右美托咪定对细菌内毒素的干扰作用，相对于光度法检测，操作方便、简单。
本发明的发明人在确定本发明的检查方法之前，分别使用了以下三种方法制备供试品溶液，均无法成功检测盐酸右美托咪定中的细菌内毒素：①用细菌内毒素检查用水溶解并稀释盐酸右美托咪定至浓度为5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL，制成的供试品溶液进行细菌内毒素检测的预干扰试验，结果显示上述几种浓度的供试品溶液对细菌内毒素的干扰作用均未能完全去除；②在盐酸右美托咪定不析出的前提下，使用适量的NaOH溶液调节样品溶液pH值或使用适量的稀释剂I减缓螯合作用并调节pH值，后用细菌内毒素检查用水将供试品溶液逐步稀释至5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL进行细菌内毒素检测的预干扰试验，结果显示上述几种浓度的供试品溶液对细菌内毒素的干扰作用均未能完全去除；③使用稀释剂I溶解供试品，将盐酸右美托咪定从供试品溶液中析出，取上清液用细菌内毒素检查用水逐步稀释至0.6mg/mL、0.3mg/mL、0.15mg/mL后进行干扰预试验，此干扰预试验的结果初步显示上述几种浓度的供试品溶液对细菌内毒素检测无干扰，但该方法需考察样品析出对细菌内毒素的回收是否有影响。后续试验采用方法③中供试品的制备方式进行了细菌内毒素的加标回收试验，以确定样品析出对细菌内毒素的回收是否有影响，结果显示，该细菌内毒素加标回收试验的回收率不足50％，也就是此种供试品制备方式影响了细菌内毒素回收，不可采用此供试品溶液的制备方法进行盐酸右美托咪定的细菌内毒素检测。
在一种优选方案中，本发明的供试品溶液的制备方法如下：以二甲基亚砜作为溶剂配制10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，用稀释剂I将制备好的10mg/mL盐酸右美托咪定溶液稀释至0.6mg/mL，再以细菌内毒素检查用水将0.6mg/mL盐酸右美托咪定溶液等比逐级稀释至0.15mg/mL，制成供试品溶液。
进一步优选地，上述供试品溶液的制备方法包括以下更详细的步骤：以二甲基亚砜作为溶剂配制10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，取1mL10mg/mL盐酸右美托咪定溶液以稀释剂I等比稀释至5mg/mL，再取0.3mL 5mg/mL盐酸右美托咪定溶液以稀释剂I稀释至0.6mg/mL，然后取1mL 0.3mg/mL盐酸右美托咪定溶液以细菌内毒素检查用水等比逐级稀释至0.15mg/mL，制成供试品溶液。
在另一种优选方案中，本发明的供试品溶液的制备方法如下：以二甲基亚砜作为溶剂配制10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，用相同体积的稀释剂I和二甲基亚砜将制备好的10mg/mL盐酸右美托咪定溶液等比稀释至5mg/mL，再以稀释剂I将5mg/mL盐酸右美托咪定溶液稀释至0.3mg/mL，然后以细菌内毒素检查用水等比稀释至0.15mg/mL，制成供试品溶液。
进一步优选地，上述供试品溶液的制备方法包括以下更详细的步骤：以二甲基亚砜作为溶剂配制10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，取1mL10mg/mL盐酸右美托咪定溶液以0.5mL稀释剂I和0.5mL二甲基亚砜等比稀释至5mg/mL后，取0.3mL 5mg/mL盐酸右美托咪定溶液以稀释剂I稀释至0.6mg/mL，再取1mL 0.6mg/mL盐酸右美托咪定溶液以稀释剂I等比稀释至0.3mg/mL，然后取0.5mL 0.3mg/mL盐酸右美托咪定溶液以细菌内毒素检查用水等比稀释至0.15mg/mL，制成供试品溶液。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明采用凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的含量，只需要用二甲基亚砜(DMSO)溶解盐酸右美托咪定制成5mg/mL～25mg/mL盐酸右美托咪定溶液，再以二甲基亚砜(DMSO)和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水(BET水)将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液，供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度不高于2.5％，稀释剂I的体积浓度为20％～50％，即可消除盐酸右美托咪定对细菌内毒素的干扰作用；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。采用本发明的检测方法可以消除盐酸右美托咪定对细菌内毒素的干扰作用，稀释的倍数小，检测结果准确可靠、操作简便，检测成本低，相对于光度法检测，操作方便、简单。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
试验准备：
1、试剂
盐酸右美托咪定；
鲎试剂(λ＝0.015EU/mL，查尔斯河试验室)；
细菌内毒素标准品；
细菌内毒素检查用水；
二甲基亚砜(DMSO)
稀释剂I(4mL/支，湛江安度斯)。
2、仪器
涡旋混合仪；
干式试管恒温仪；
微量移液器。
3、确定细菌内毒素限值
盐酸右美托咪定细菌内毒素限值为L≤0.1EU/mg。
4、确定最低有效活性浓度
最低有效活性浓度是指：当最大有效稀释倍数为1时，相对应的供试品溶液浓度即为最低有效活性浓度，在不低于此活性浓度下进行内毒素限值的检测。按照以下公式计算：CP＝λ/L，其中：CP为细菌内毒素限值为L时，供试品的最低有效活性浓度，L为供试品的细菌内毒素限值，λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/mL)。本申请中，λ为鲎试剂的灵敏度，0.015EU/mL；L是盐酸右美托咪定的细菌内毒素限值，0.1EU/mg；按公式：
CP＝λ/L＝0.015EU/mL÷0.1EU/mg＝0.15mg/mL，得最低有效活性浓度为0.15mg/mL。
5、鲎试剂的灵敏度复核试验
本试验中所使用的鲎试剂，已进行了灵敏度(λ)复核，灵敏度为λ＝0.015EU/mL。
6、干扰试验预试验
称取约10mg盐酸右美托咪定原料药，加适量DMSO，旋涡混合得10mg/mL盐酸右美托咪定DMSO溶液，后用稀释剂I和BET水逐步稀释，稀释步骤如下：
选取0.3mg/mL及0.15mg/mL两个浓度梯度进行预干扰试验。
预干扰实验表明，0.3mg/mL和0.15mg/mL的盐酸右美托咪定溶液对细菌内毒素检测均无干扰作用；正式干扰时实验选用0.15mg/mL的盐酸右美托咪定溶液。
实施例1
一、溶液配制
1、供试品溶液稀释
称取约10mg盐酸右美托咪定，加约1mL DMSO，完全溶解混匀得10mg/mL盐酸右美托咪定DMSO溶液。后使用稀释剂I和BET水，按照下列稀释方式，逐步稀释至0.3mg/mL(2c)和0.15mg/mL(c)的供试品溶液。0.15mg/mL(c)的供试品溶液中，DMSO的体积浓度为1.5％，稀释剂I的体积浓度为23.5％。
2、细菌内毒素标准品制备
用BET水溶解1支细菌内毒素标准品，用旋涡混合器连续混合20-30分钟，用BET水稀释，在进行下一步稀释前，至少混合30秒钟。依次稀释成0.03EU/mL(2λ)、
0.015EU/mL(λ)、0.0075EU/mL(0.5λ)、0.00375EU/mL(0.25λ)。
3、细菌内毒素供试品溶液的制备
为确证供试品溶液对鲎试剂是否存在干扰作用，分别用供试品溶液将细菌内毒素标准品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的系列内毒素溶液，每一步稀释前，至少混合30秒。
二、鲎试剂干扰试验
1、试验过程
取已用BET水溶解的鲎试剂(0.015EU/mL)30支，0.1mL/支。再分别加入表1制备的2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的细菌内毒素标准品溶液(C组)和细菌内毒素供试品溶液(B组)。同时制备阴性对照(D组)及供试品溶液(A组)。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。
表1 干扰试验各溶液的配制
2、结果判断
将安瓿从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶并且凝胶坚实不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记为(-)。依照公式计算Es和Et，若Es和Et均在0.5λ～2λ(含)范围内，则判定供试品溶液对应的盐酸右美托咪定对细菌内毒素反应无干扰作用，否则判有干扰作用。
3、结果
进行了三次干扰试验，结果如下：
表2 1.5％DMSO+23.5％稀释剂I溶液组(第1次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.K4853L
表3 1.5％DMSO+23.5％稀释剂I溶液组(第2次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
表4 1.5％DMSO+23.5％稀释剂I溶液组(第3次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
上述试验证实，采用DMSO溶解盐酸右美托咪定制备10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，后续采用稀释剂I和BET水逐步稀释至0.15mg/mL的供试品溶液，其中DMSO的体积浓度为1.5％，稀释剂I的体积浓度为23.5％，能够消除样品的干扰作用，效果较佳。
实施例2
一、溶液配制
1、供试品溶液稀释
称取约10mg盐酸右美托咪定，加约1mL DMSO，完全溶解混匀得10mg/mL盐酸右美托咪定DMSO溶液。后使用稀释剂I和BET水，按照下列稀释方式，逐步稀释至0.3mg/mL(2c)和0.15mg/mL(c)的供试品溶液。0.15mg/mL(c)的供试品溶液中，DMSO的体积浓度为2.25％，稀释剂I的体积浓度为47.75％。
2、细菌内毒素标准品制备
参照实施例1。
3、细菌内毒素供试品溶液的制备
参照实施例1。
二、鲎试剂干扰试验
1、试验过程
取已用BET水溶解的鲎试剂(0.015EU/mL)30支，0.1mL/支。再分别加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的细菌内毒素标准品溶液(C组)和细菌内毒素供试品溶液(B组)。同时制备阴性对照(D组)及供试品溶液(A组)。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。
2、结果判断
将安瓿从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶并且凝胶坚实不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记为(-)。依照公式计算Es和Et，若Es和Et均在0.5λ～2λ(含)范围内，则判定供试品溶液对应的盐酸右美托咪定对细菌内毒素反应无干扰作用，否则判有干扰作用。
3、结果
进行了三次干扰试验，结果如下：
表5 2.25％DMSO+47.75％稀释剂I溶液组(第1次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.K4853L
表6 2.25％DMSO+47.75％稀释剂I溶液组(第2次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
表7 2.25％DMSO+47.75％稀释剂I溶液组(第3次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
上述试验证实，采用DMSO溶解盐酸右美托咪定制备10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，后续采用稀释剂I和BET水逐步稀释至0.15mg/mL的供试品溶液，其中DMSO的体积浓度为2.25％，稀释剂I的体积浓度为47.75％，能够消除样品的干扰作用，效果较佳。
对比例1
一、溶液配制
1、供试品溶液稀释
称取约10mg盐酸右美托咪定，加约2mL DMSO，完全溶解混匀得5mg/mL盐酸右美托咪定DMSO溶液。后使用稀释剂I和BET水，按照下列稀释方式，逐步稀释至0.3mg/mL(2c)和0.15mg/mL(c)的供试品溶液。0.15mg/mL(c)的供试品溶液中，DMSO的体积浓度为3％，稀释剂I的体积浓度为11％。
2、细菌内毒素标准品制备
参照实施例1。
3、细菌内毒素供试品溶液的制备
参照实施例1。
二、鲎试剂干扰试验
1、试验过程
取已用BET水溶解的鲎试剂(0.015EU/mL)30支，0.1mL/支。再分别加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的细菌内毒素标准品溶液(C组)和细菌内毒素供试品溶液(B组)。同时制备阴性对照(D组)及供试品溶液(A组)。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。
2、结果判断
将安瓿从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶并且凝胶坚实不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记为(-)。依照公式计算Es和Et，若Es和Et均在0.5λ～2λ(含)范围内，则判定供试品溶液对应的盐酸右美托咪定对细菌内毒素反应无干扰作用，否则判有干扰作用。
3、结果
进行了三次干扰试验，结果如下：
表8 3％DMSO+11％稀释剂I溶液组(第1次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
表9 3％DMSO+11％稀释剂I溶液组(第2次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
表10 3％DMSO+11％稀释剂I溶液组(第3次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.K4853L
上述试验证实，采用DMSO溶解盐酸右美托咪定制备5mg/mL盐酸右美托咪定溶液，后续采用稀释剂I和BET水逐步稀释至0.15mg/mL的供试品溶液，其中DMSO的体积浓度为3％，稀释剂I的体积浓度为11％，不能消除样品的干扰作用，使检测出现假阴性结果。
实施例3二甲基亚砜(DMSO)干扰试验
通过实施例1试验证实，使用DMSO溶解的盐酸右美托咪定制备10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，在后续稀释过程中加入适量稀释剂I不会致使样品析出，能消除盐酸右美托咪定对细菌内毒素检测的干扰作用。
为了验证上述DMSO添加方式和添加量本身，是否会破坏细菌内毒素，DMSO也进行了1次干扰预试验，3次干扰试验。
一、DMSO干扰预试验
1、供试液制备：取DMSO，用BET水逐步稀释成DMSO浓度分别为20％，10％，5％，2.5％，1.25％的稀释液，将此系列溶液记为NPC。
2、细菌内毒素标准品溶液制备：用BET水溶解1支细菌内毒素标准品，用旋涡混合器连续混合20-30分钟，用BET水稀释，在进行下一步稀释前，至少混合30秒钟。依次稀释成2λ、0.25λ。
3、每个试验浓度的DMSO溶液供试品阳性对照溶液(PPC-2λ)、供试品阴性对照溶液(PPC-0.25λ)的配制
取1支细菌内毒素标准品，用1ml 20％DMSO溶液溶解，用旋涡混合器连续混合20-30分钟。后用20％DMSO溶液逐步稀释至含内毒素2λ的供试品阳性对照溶液(PPC-2λ)和含内毒素0.25λ的供试品阴性对照溶液(PPC-0.25λ)。
剩余4个浓度的DMSO溶液供试品阳性对照溶液(PPC-2λ)、供试品阴性对照溶液(PPC-0.25λ)的配制方法同上，只是溶解液和稀释液用对应浓度的DMSO溶液。
4、试验过程：取鲎试剂36支，先分别加入0.1mlBET水溶解。再分别加入0.1ml供试品、0.1ml供试品阳性(2λ)、0.1ml供试品阴性(0.25λ)各浓度溶液，同时做2组阴性对照(NC和PC-0.25λ)和1组阳性对照(PC-2λ)，每个浓度平行做2管。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。
5、结果判断
将安瓿从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶并且凝胶坚实不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记为(-)；
当2组阴性对照(NC和PC-0.25λ)全呈阴性，阳性对照(PC-2λ)全呈阳性，试验有效；
当供试品呈阴性时，则此浓度的干扰预实验有效；若某浓度的供试品呈阳性，说明供试品中可能含有内毒素或有促凝作用，则此浓度干扰预实验无效。
依照供试品阳性对照试验(结果呈阳性的浓度)，供试品阴性对照试验(结果呈阴性的浓度)，得出干扰预实验中不产生干扰性的最大样品浓度，并结合鲎试剂灵敏度，选择合适的干扰试验浓度。
根据此实验得到DMSO对细菌内毒素反应的最大无干扰浓度。
6、结果
表11 DMSO干扰预试验结果
试验结果表明：DMSO浓度≤2.5％时，对细菌内毒素反应未产生干扰作用。
二、DMSO干扰试验
1、供试液制备：取DMSO，用BET水逐步稀释成DMSO浓度为2.5％的稀释液。
2、细菌内毒素标准品溶液制备：用BET水溶解1支细菌内毒素标准品，用旋涡混合器连续混合20-30分钟，用BET水稀释，在进行下一步稀释前，至少混合30秒钟。依次稀释成2λ、λ、0.5λ、0.25λ。
3、细菌内毒素供试品溶液制备：用DMSO溶解1支细菌内毒素标准品，用旋涡混合器连续混合20-30分钟。后用2.5％DMSO溶液逐步稀释至含内毒素2λ、λ、0.5λ、0.25λ的，DMSO浓度近似为2.5％的细菌内毒素供试品溶液。
4、试验过程：取鲎试剂38支，先分别加入0.1mlBET水溶解。再分别加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的细菌内毒素标准品溶液和细菌内毒素供试品溶液0.1ml，每一浓度平行做4份。同时用0.1mlBET水平行做2份，用0.1ml浓度为2.5％的DMSO供试品溶液(C)平行做4份作为阴性对照。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。
5、结果判断：将安瓿从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶并且凝胶坚实不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记为(-)。依照公式计算Es和Et，若Es和Et均在0.5λ～2λ(含)范围内，则判定浓度为2.5％的DMSO溶液对细菌内毒素反应无干扰作用，否则判有干扰作用。
6、结果
表12 DMSO第一次干扰试验结果
表13 DMSO第二次干扰试验结果
表14 DMSO第三次干扰试验结果
DMSO干扰试验结论：上述试验证实，上述DMSO添加方式和添加量本身，不会破坏细菌内毒素。
实施例4盐酸右美托咪定细菌内毒素检查试验
一、溶液配制
1、供试品溶液稀释
称取约10mg盐酸右美托咪定，加约1mL DMSO，完全溶解混匀得10mg/mL供试品原液。
取上述浓度为10mg/mL的供试品溶液，用稀释剂I和BET水，按照如下方式逐步稀释至0.3mg/mL(2c)和0.15mg/mL(c)。
2、细菌内毒素标准品溶液制备
用BET水溶解1支细菌内毒素标准品，用旋涡混合器连续混合20-30分钟，用BET水稀释至0.03EU/mL(2λ)，每一步稀释前至少混合30秒钟。
3、细菌内毒素供试品溶液的制备
用供试品溶液将细菌内毒素标准品配制成2λ浓度的内毒素溶液，每一步稀释前至少混合30秒钟。
4、加样
取已用BET水溶解的鲎试剂8支，0.1mL/支，分别加入0.1mL的供试品溶液(A)、0.1mL的供试品阳性对照溶液(B组)、0.1mL的BET水(D组)、0.1mL的0.03EU/mL(2λ)内毒素标准品溶液(C组)，分别作为供试品管、供试品阳性对照管、阴性对照管、阳性对照管，每组平行做2份。如表15所示。
表15 内毒素检查试验各溶液的配制
5、结果判断
加样完成后，轻轻混匀，置于试管恒温仪中37±1℃，孵育60±2min。孵育完成后，从试管恒温仪中轻轻取出安瓿，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑落者为阳性，记录为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑落者为阴性，记录为(－)。保温和拿取试管过程应避免受到震动，造成假阴性结果。
6、接受标准
盐酸右美托咪定样品中细菌内毒素含量≤0.1EU/mg。
7、结果
检查试验的结果如表16所示。
表16 内毒素检查试验的检测结果
8、结论
盐酸右美托咪定样品中细菌内毒素含量≤0.1EU/mg，符合规定。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种凝胶法检测盐酸右美托咪定中细菌内毒素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：以二甲基亚砜作为溶剂制备5mg/mL～25mg/mL盐酸右美托咪定溶液，用二甲基亚砜和/或稀释剂I以及细菌内毒素检查用水将制备好的盐酸右美托咪定溶液稀释至不低于最低有效活性浓度，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查；所述供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度不高于2.5％，所述供试品溶液中稀释剂I的体积浓度为20％～50％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐酸右美托咪定溶液中盐酸右美托咪定的浓度为5mg/mL～15mg/mL；优选为10mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液中二甲基亚砜的体积浓度为1.5％～2.25％；优选为1.5％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液中稀释剂I的体积浓度为23.5％～47.75％；优选为23.5％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先以各有效活性浓度制成的供试品溶液进行干扰实验，找出无干扰情况下的最低有效活性浓度，再以该最低有效活性浓度制成的供试品溶液进行细菌内毒素检查。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其特征在于，先以盐酸右美托咪定细菌内毒素限值和鲎试剂的灵敏度确定最低有效活性浓度，其中：所述盐酸右美托咪定细菌内毒素限值为0.1EU/mg；所述鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL；所述最低有效活性浓度为0.15mg/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：以二甲基亚砜作为溶剂配制10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，用稀释剂I将制备好的10mg/mL盐酸右美托咪定溶液稀释至0.6mg/mL，再以细菌内毒素检查用水将0.6mg/mL盐酸右美托咪定溶液等比逐级稀释至0.15mg/mL，制成供试品溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：以二甲基亚砜作为溶剂配制10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，取1mL10mg/mL盐酸右美托咪定溶液以稀释剂I等比稀释至5mg/mL，再取0.3mL 5mg/mL盐酸右美托咪定溶液以稀释剂I稀释至0.6mg/mL，然后取1mL 0.3mg/mL盐酸右美托咪定溶液以细菌内毒素检查用水等比逐级稀释至0.15mg/mL，制成供试品溶液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以二甲基亚砜作为溶剂配制10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，用相同体积的稀释剂I和二甲基亚砜将制备好的10mg/mL盐酸右美托咪定溶液等比稀释至5mg/mL，再以稀释剂I将5mg/mL盐酸右美托咪定溶液稀释至0.3mg/mL，然后以细菌内毒素检查用水等比稀释至0.15mg/mL，制成供试品溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，以二甲基亚砜作为溶剂配制10mg/mL盐酸右美托咪定溶液，取1mL10mg/mL盐酸右美托咪定溶液以0.5mL稀释剂I和0.5mL二甲基亚砜等比稀释至5mg/mL后，取0.3mL 5mg/mL盐酸右美托咪定溶液以稀释剂I稀释至0.6mg/mL，再取1mL 0.6mg/mL盐酸右美托咪定溶液以稀释剂I等比稀释至0.3mg/mL，然后取0.5mL0.3mg/mL盐酸右美托咪定溶液以细菌内毒素检查用水等比稀释至0.15mg/mL，制成供试品溶液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201016 |