CN111141909A - 一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢等比例混合，在不超过最大有效稀释倍数的情况下对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液进行稀释，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。采用本发明的检测方法可以消除硫代甘油对细菌内毒素的干扰作用，稀释的倍数小，检测结果准确可靠、操作简便，检测成本低，相对于光度法检测，操作方便、简单。

Description

一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法。
背景技术
细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏细胞灭活，不造成机体损害，内毒素大量进入血液就会引起发热反应——“热原反应”，甚至导致死亡。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类(如一次性注射器，植入性生物材料)必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。制剂中的细菌内毒素，最大来源为生产用原辅料，因此，生产制剂的原辅料的内毒素水平同样需要监控。
硫代甘油是一种无色或微白色，粘稠，具吸湿性的液体，是药物制剂中经常用到的辅料，作为抗氧剂和防腐剂，结构式如下。因此用于制剂生产的硫代甘油，也需要进行细菌内毒素检测。
Figure BDA0002333440060000011
目前，细菌内毒素检测主要有两种方法，分别为：凝胶法和光度法。凝胶法操作简单，普及程度高，试验条件要求低(37±1℃，60±2分钟)。而光度法，操作相对复杂，普及程度低，试验需要酶标仪等专业的设备。凝胶法因上述优势，被各国药典选择作为仲裁试验的方法(当内毒素检测结果出现争议时，以凝胶法结果为准)。
硫代甘油因为结构式中巯基(-SH)的存在，能破坏鲎试剂中的凝固酶原、凝固蛋白原，引发细菌内毒素反应的抑制作用，即便样品中含有细菌内毒素，也会因为样品对细菌内毒素检测的抑制作用，而使检测结果呈现“假阴性”。目前市面上采用的消除上述抑制作用的方法主要为：对硫代甘油进行较大倍数的稀释(如稀释1200倍)后，采用光度法进行细菌内毒素检测。然而，光度法检测时，操作复杂，试验需要酶标仪等专业的设备，普及程度低。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法。
本发明的技术方案如下：
一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法，它包括以下步骤：将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢等比例混合，在不超过最大有效稀释倍数的情况下对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液进行稀释，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。
本发明以细菌内毒素检查用水溶解或稀释硫代甘油制备体积浓度为1％硫代甘油。
进一步地，过氧化氢溶液也采用细菌内毒素检查用水进行配置，例如，在制备供试品溶液时，将体积浓度为35％过氧化氢以细菌内毒素检查用水稀释至体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢。
在制备供试品溶液时，对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液采用细菌内毒素检查用水进行稀释，在不超过最大有效稀释倍数的情况下，按照《2015药典细菌内毒素检查法》，进行细菌内毒素及检查。
在一种优选方案中，在不超过最大有效稀释倍数的情况下，先以各稀释倍数的供试品溶液进行干扰实验，找出无干扰情况下的最小稀释倍数，再以该最小稀释倍数稀释制成的供试品溶液进行细菌内毒素检查。
在本发明中，根据待测硫代甘油油细菌内毒素限值和鲎试剂的灵敏度确定最大有效稀释倍数，例如：硫代甘油细菌内毒素限值为6EU/mL；鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL；可以确定其最大有效稀释倍数为400倍。
在本申请中，制备供试品溶液时，过氧化氢(双氧水)的用量很重要，加入过氧化氢时硫代甘油的浓度也需要严格控制，加入过氧化氢时硫代甘油的体积浓度约1％，硫代甘油的浓度过高或者过低都不易排除干扰作用，影响检测细菌内毒素的准确性。过氧化氢的用量过高或者过低也影响本申请检测硫代甘油中细菌内毒素的含量的准确性，在不破坏细菌内毒素的前提下，消除硫代甘油对细菌内毒素检测的干扰作用。当过氧化氢的用量较低时，不能够消除样品中硫代甘油的干扰作用，而使检测结果呈现“假阴性”；当过氧化氢的用量较高时，破坏了样品中的细菌内毒素，也会使检测结果呈现“假阴性”。
在一种优选方案中，在制备供试品溶液时，将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.225％过氧化氢等比例混合，以细菌内毒素检查用水在不超过最大有效稀释倍数的情况下进行稀释。
在一种更优选方案中，在制备供试品溶液时，将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.35％～1.05％过氧化氢等比例混合，以细菌内毒素检查用水在不超过最大有效稀释倍数的情况下进行稀释。
本发明检查硫代甘油中细菌内毒素时，待测硫代甘油细菌内毒素限值为6EU/mL；选择的鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL，以各稀释倍数的供试品溶液进行干扰实验时，找出无干扰情况下的最小稀释倍数为400倍，再以稀释至400倍时制成的供试品溶液进行细菌内毒素检查。本发明可以采用凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的含量，只需要对硫代甘油进行400倍稀释，并加入适量的过氧化氢，从而消除硫代甘油对细菌内毒素的干扰作用，相对于光度法检测，操作方便、简单。
在一种方案中，供试品溶液的制备方法如下：用1.8ml细菌内毒素检查用水溶解0.2ml硫代甘油后，再稀释至100倍得到体积浓度为1％硫代甘油；取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和8～40μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水等比稀释至400倍。
在一种优选方案中，供试品溶液的制备方法如下：用1.8ml细菌内毒素检查用水溶解0.2ml硫代甘油后，再稀释至100倍得到体积浓度为1％硫代甘油；取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和10～30μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水等比稀释至400倍。
在一种更优选方案中，供试品溶液的制备方法如下：用1.8ml细菌内毒素检查用水溶解0.2ml硫代甘油后，再稀释至100倍得到体积浓度为1％硫代甘油；取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和10μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水等比稀释至400倍。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明采用凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素，只需将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢等比例混合，在不超过最大有效稀释倍数的情况下对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液进行稀释，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。采用本发明的检测方法可以消除硫代甘油对细菌内毒素的干扰作用，稀释的倍数小，检测结果准确可靠、操作简便，检测成本低，相对于光度法检测，操作方便、简单。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
试验准备：
1、试剂
硫代甘油；
鲎试剂(λ＝0.015EU/mL，查尔斯河试验室)；
细菌内毒素标准品；
细菌内毒素检查用水；
过氧化氢(双氧水)。
2、仪器
涡旋混合仪；
干式试管恒温仪；
微量移液器。
3、确定细菌内毒素限值
硫代甘油细菌内毒素限值为L≤6EU/mL。
4、确定最大有效稀释倍数(MVD)
最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数(MVD)，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。按照以下公式计算：MVD＝cL/λ，其中：c为供试品溶液的浓度，L为供试品的细菌内毒素限值，λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/mL)。本申请中，λ为鲎试剂的灵敏度，0.015EU/mL；L是硫代甘油的细菌内毒素限值，6EU/mL；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/mL表示时，则c等于1.0mL/mL；
按公式MVD＝cL/λ＝1.0(mL/mL)×6(EU/mL)/0.015(EU/mL)＝400，得最大稀释倍数为400倍(S400)。
5、鲎试剂的灵敏度复核试验
本试验中所使用的鲎试剂，已进行了灵敏度(λ)复核，灵敏度为λ＝0.015EU/mL。
6、干扰实验预实验
以硫代甘油作为原液(S1原液)，以细菌内毒素检查用水(BET水)稀释至100倍，得到体积浓度为1％硫代甘油；取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和10μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，按照拟定的内毒素限值，加入细菌内毒素检查用水并稀释至不超过MVD(400倍)规定的系列稀释度：1:250、1:300、1:350、1:400，再分别用每一个稀释度进行预干扰实验。
预干扰实验表明，无干扰情况下的最小稀释倍数为400倍，可以排除干扰；正式干扰时实验选用1:400的稀释倍数。
实施例1
硫代甘油与过氧化氢的反应，为大量放热的中和反应，为最大程度地减少过氧化氢本身及中和放热对细菌内毒素的破坏作用，本申请采取将过氧化氢溶液加入到硫代甘油稀释液中的方式进行干扰试验。
一、溶液配制
1、供试品溶液稀释
取硫代甘油0.2ml，用BET水按如下方式，逐步稀释至“≈S200”溶液，后向“≈S200”溶液中加入10μL的35％过氧化氢溶液得到S200，混合均匀后再用BET水稀释至S400，得到供试品溶液。
Figure BDA0002333440060000051
2、细菌内毒素标准品制备
用BET水溶解1支细菌内毒素标准品，用旋涡混合器连续混合20-30分钟，用BET水稀释，在进行下一步稀释前，至少混合30秒钟。依次稀释成0.03EU/mL(2λ)、0.015EU/mL(λ)、0.0075EU/mL(0.5λ)、0.00375EU/mL(0.25λ)。
3、细菌内毒素供试品溶液的制备
为确证供试品溶液对鲎试剂是否存在干扰作用，分别用供试品溶液将细菌内毒素标准品配制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的系列内毒素溶液，每一步稀释前，至少混合30秒。
二、鲎试剂干扰试验
1、试验过程
取已用BET水溶解的鲎试剂(0.015EU/mL)30支，0.1mL/支。再分别加入表1制备的2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的细菌内毒素标准品溶液(C组)和细菌内毒素供试品溶液(B组)。同时制备阴性对照(D组)及供试品溶液(A组)。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。
表1干扰试验各溶液的配制
Figure BDA0002333440060000061
2、结果判断
将安瓿从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶并且凝胶坚实不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记为(-)。依照公式计算Es和Et，若Es和Et均在0.5λ～2λ(含)范围内，则判定供试品溶液对应的硫代甘油对细菌内毒素反应无干扰作用，否则判有干扰作用。
3、结果
进行了三次干扰试验，结果如下：
表2 10μL的35％过氧化氢溶液组(第1次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
Figure BDA0002333440060000062
Figure BDA0002333440060000071
表3 10μL的35％过氧化氢溶液组(第2次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J4262L
Figure BDA0002333440060000072
表4 10μL的35％过氧化氢溶液组(第3次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
Figure BDA0002333440060000073
Figure BDA0002333440060000081
上述试验证实，体积浓度为1％硫代甘油中加入体积浓度为0.35％过氧化氢，再稀释至400倍得到的供试品溶液，能够消除样品的干扰作用，效果较佳。
实施例2
一、溶液配制
1、供试品溶液稀释
取硫代甘油0.2ml，用BET水按如下方式，逐步稀释至“≈S200”溶液，后向“≈S200”溶液中加入30μL的35％过氧化氢溶液得到S200，混合均匀后再用BET水稀释至S400。
Figure BDA0002333440060000082
2、细菌内毒素标准品制备
参照实施例1。
3、细菌内毒素供试品溶液的制备
参照实施例1。
二、鲎试剂干扰试验
1、试验过程
取已用BET水溶解的鲎试剂(0.015EU/mL)30支，0.1mL/支。再分别加入按照表1制备的2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的细菌内毒素标准品溶液(C组)和细菌内毒素供试品溶液(B组)。同时制备阴性对照(D组)及供试品溶液(A组)。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。
2、结果判断
将安瓿从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶并且凝胶坚实不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记为(-)。依照公式计算Es和Et，若Es和Et均在0.5λ～2λ(含)范围内，则判定供试品溶液对应的硫代甘油对细菌内毒素反应无干扰作用，否则判有干扰作用。
3、结果
进行了三次干扰试验，结果如下：
表5 30μL的35％过氧化氢溶液组(第1次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
Figure BDA0002333440060000091
表6 30μL的35％过氧化氢溶液组(第2次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J4262L
Figure BDA0002333440060000101
表7 30μL的35％过氧化氢溶液组(第3次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
Figure BDA0002333440060000102
Figure BDA0002333440060000111
上述试验证实，体积浓度为1％硫代甘油中加入体积浓度为1.05％过氧化氢，再稀释至400倍得到的供试品溶液，能够消除样品的干扰作用，效果较佳。
对比例1
一、溶液配制
1、供试品溶液稀释
取硫代甘油0.2ml，用BET水按如下方式，逐步稀释至“≈S200”溶液，后向“≈S200”溶液中加入5μL的35％过氧化氢溶液得到S200，混合均匀后再用BET水稀释至S400。
Figure BDA0002333440060000112
2、细菌内毒素标准品制备
参照实施例1。
3、细菌内毒素供试品溶液的制备
参照实施例1。
二、鲎试剂干扰试验
1、试验过程
取已用BET水溶解的鲎试剂(0.015EU/mL)30支，0.1mL/支。再分别加入按照表1制备的2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的细菌内毒素标准品溶液(C组)和细菌内毒素供试品溶液(B组)。同时制备阴性对照(D组)及供试品溶液(A组)。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。
2、结果判断
将安瓿从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶并且凝胶坚实不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记为(-)。依照公式计算Es和Et，若Es和Et均在0.5λ～2λ(含)范围内，则判定供试品溶液对应的硫代甘油对细菌内毒素反应无干扰作用，否则判有干扰作用。
3、结果
进行了三次干扰试验，结果如下：
表8 5μL的35％过氧化氢溶液组(第1次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
Figure BDA0002333440060000121
表9 5μL的35％过氧化氢溶液组(第2次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J4262L
Figure BDA0002333440060000122
Figure BDA0002333440060000131
表10 5μL的35％过氧化氢溶液组(第3次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
Figure BDA0002333440060000132
上述试验证实，体积浓度为1％硫代甘油中加入体积浓度为0.175％过氧化氢，再稀释至400倍得到的供试品溶液，不能够消除样品的干扰作用，使检验结果呈现出假阴性。
对比例2
一、溶液配制
1、供试品溶液稀释
取硫代甘油0.2ml，用BET水按如下方式，逐步稀释至“≈S200”溶液，后向“≈S200”溶液中加入50μL的35％过氧化氢溶液得到S200，混合均匀后再用BET水稀释至S400。
Figure BDA0002333440060000141
2、细菌内毒素标准品制备
参照实施例1。
3、细菌内毒素供试品溶液的制备
参照实施例1。
二、鲎试剂干扰试验
1、试验过程
取已用BET水溶解的鲎试剂(0.015EU/mL)30支，0.1mL/支。再分别加入按照表1制备的2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的细菌内毒素标准品溶液(C组)和细菌内毒素供试品溶液(B组)。同时制备阴性对照(D组)及供试品溶液(A组)。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，在37±1℃无振动保温60±2分钟。
2、结果判断
将安瓿从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶并且凝胶坚实不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记为(-)。依照公式计算Es和Et，若Es和Et均在0.5λ～2λ(含)范围内，则判定供试品溶液对应的硫代甘油对细菌内毒素反应无干扰作用，否则判有干扰作用。
3、结果
进行了三次干扰试验，结果如下：
表11 50μL的35％过氧化氢溶液组(第1次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
Figure BDA0002333440060000142
Figure BDA0002333440060000151
表12 50μL的35％过氧化氢溶液组(第2次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J4262L
Figure BDA0002333440060000152
表13 50μL的35％过氧化氢溶液组(第3次)
鲎试剂批号Lysate reagent Batch No.J2703L
Figure BDA0002333440060000153
Figure BDA0002333440060000161
上述试验证实，体积浓度为1％硫代甘油中加入体积浓度为1.75％过氧化氢，再稀释至400倍得到的供试品溶液，破坏了样品中的细菌内毒素，使检验结果呈现出假阴性。
实施例3过氧化氢干扰试验
通过上述4个试验证实，取硫代甘油100倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水和10～30μL 35％过氧化氢稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水稀释至400倍时，均能消除硫代甘油对细菌内毒素检测的干扰作用，但10μL 35％过氧化氢添加量时检测效果最佳。
为了验证上述过氧化氢添加方式和添加量本身，是否会破坏细菌内毒素，特进行过氧化氢干扰试验：分别用“4λ”、“2λ”、“λ”、“0.5λ”的内毒素溶液代替“≈S200”的供试品溶液，后分别加入10μL 35％过氧化氢溶液，再用BET水等比稀释至“2λ”、“λ”、“0.5λ”、“0.25λ”，以此系列内毒素溶液进行干扰试验，分别独立进行3次，结果如下：
表14过氧化氢干扰试验(第1次)
Figure BDA0002333440060000162
Figure BDA0002333440060000171
表15过氧化氢干扰试验(第2次)
Figure BDA0002333440060000172
表16过氧化氢干扰试验(第3次)
Figure BDA0002333440060000181
过氧化氢干扰试验结论：上述试验证实，上述过氧化氢添加方式和添加量本身，不会破坏细菌内毒素。
实施例4硫代甘油细菌内毒素检查试验
一、溶液配制
1、供试品溶液稀释
取硫代甘油0.2ml，用BET水逐步稀释至体积浓度为1％(S100)的硫代甘油。
取10μL体积浓度为35％的过氧化氢，加入到0.99mL BET水中，得到体积浓度为0.35％的过氧化氢。
将上述体积浓度为1％(S100)的硫代甘油与体积浓度为0.35％的过氧化氢等体积混合均匀后，得到S200，再用BET水稀释至S400，得到供试品溶液。
2、细菌内毒素标准品溶液制备
用BET水溶解1支细菌内毒素标准品，用旋涡混合器连续混合20-30分钟，用BET水稀释至0.03EU/mL(2λ)，每一步稀释前至少混合30秒钟。
3、细菌内毒素供试品溶液的制备
用供试品溶液将细菌内毒素标准品配制成2λ浓度的内毒素溶液，每一步稀释前至少混合30秒钟。
4、加样
取已用BET水溶解的鲎试剂8支，0.1mL/支，分别加入0.1mL的供试品溶液(A)、0.1mL的供试品阳性对照溶液(B组)、0.1mL的BET水(D组)、0.1mL的0.03EU/mL(2λ)内毒素标准品溶液(C组)，分别作为供试品管、供试品阳性对照管、阴性对照管、阳性对照管，每组平行做2份。如表17所示。
表17内毒素检查试验各溶液的配制
Figure BDA0002333440060000191
5、结果判断
加样完成后，轻轻混匀，置于试管恒温仪中37±1℃，孵育60±2min。孵育完成后，从试管恒温仪中轻轻取出安瓿，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑落者为阳性，记录为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑落者为阴性，记录为(－)。保温和拿取试管过程应避免受到震动，造成假阴性结果。
6、接受标准
硫代甘油样品中细菌内毒素含量≤6.0EU/mL。
7、结果
检查试验的结果如表18所示。
表18内毒素检查试验的检测结果
Figure BDA0002333440060000192
8、结论
硫代甘油样品中细菌内毒素含量＜6EU/mL，符合规定。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：将体积浓度为1％硫代甘油与体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢等比例混合，在不超过最大有效稀释倍数的情况下对硫代甘油和过氧化氢的混合溶液进行稀释，制成供试品溶液；再采用凝胶法进行细菌内毒素检查。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体积浓度为1％硫代甘油中的溶剂为细菌内毒素检查用水；所述体积浓度为0.28％～1.4％过氧化氢中的溶剂为细菌内毒素检查用水；制备所述供试品溶液时采用细菌内毒素检查用水进行稀释。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先以各稀释倍数的供试品溶液进行干扰实验，找出无干扰情况下的最小稀释倍数，再以该最小稀释倍数稀释制成的供试品溶液进行细菌内毒素检查。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，先以硫代甘油细菌内毒素限值和鲎试剂的灵敏度确定最大有效稀释倍数，其中：所述硫代甘油细菌内毒素限值为6EU/mL；所述鲎试剂的灵敏度为0.015EU/mL；所述最大有效稀释倍数为400倍。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述过氧化氢的体积浓度为0.28％～1.225％。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述过氧化氢的体积浓度为0.35％～1.05％。
7.根据权利要求3、4、5或6中任一项所述的方法，其特征在于，所述最小稀释倍数为400倍。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：用1.8ml细菌内毒素检查用水溶解0.2ml硫代甘油后，再稀释至100倍得到体积浓度为1％硫代甘油；取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和8～40μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水等比稀释至400倍。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和10～30μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水等比稀释至400倍。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：取体积浓度为1％硫代甘油1ml，以细菌内毒素检查用水和10μL体积浓度为35％过氧化氢等比稀释至200倍，再取200倍的稀释液1ml以细菌内毒素检查用水等比稀释至400倍。
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