CN104232739A - 枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法，首先进行干扰试验，确定使用何种灵敏度的鲎试剂对枸橼酸原料进行细菌内毒素检查；然后将待测的枸橼酸原料稀释配制成待测溶液，加入上述干扰试验中确定的鲎试剂，进行细菌内毒素检测。本发明的枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法，解决了新开发注射液产品中枸橼酸原料的细菌内毒素检查问题；从源头上对无菌产品质量进行控制，对保证输液产品的安全性有重要意义。该方法有生物化学的理论基础，更科学；利用酶的分子生化反应，专属性高，重现性强，准确度和灵敏度高；操作简单快速，无需特殊仪器设备，实用性强。

Description

枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，涉及一种枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法。 

背景技术

输液产品是医院日常的必备基础药品。目前国内输液市场正处于价格战，产品的升级换代是关键，产品升级换代必然要对其使用的原料进行严格的控制，以保证产品质量。细菌内毒素是控制项目之一。 

细菌内毒素是热原的主要代表物质。热原注入人体后产生热原反应。热原反应给临床治疗带来极大的危害，一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即会出现高热症状，反应严重者会造成死亡，故必须严格控制。 

传统的热原检查通常是在动物体内进行实验，实验过程复杂繁琐，且存在个异性，不宜普遍推广。现在，医药工业普遍接受控制细菌内毒素等于控制热原。细菌内毒素检查法通常采用凝胶法，其原理是：细菌内毒素会激活凝固酶，形成凝胶反应。这种检测方法更科学，更准确。 

枸橼酸作为一种新的药品原料，采用传统的检测方法不能准确地检查出样品中的细菌内毒素含量。 

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供一种枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法。 

本发明为解决这一问题所采取的技术方案是: 

本发明的枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法，包括如下步骤：首先选取L＜0.25EU/mg作为枸橼酸原料的细菌内毒素限值，进行干扰试验，确定使用何种灵敏度的鲎试剂对枸橼酸原料进行细菌内毒素检查；然后将待测的枸橼酸原料稀释配制成待测溶液，最大有效稀释倍数MVD=20，加入上述干扰试验中确定的鲎试剂，在37±1℃的温度下反应60±2分钟，而后缓缓倒转180°观察管内凝胶情况，管内凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；管内凝胶不能保持完整从管壁滑脱者为阴性；

当鲎试剂，供试品的配方，生产工艺改变或试验环境发生变化时，须重新进行干扰试验。

干扰试验的具体步骤如下： 

步骤一、供试品溶液的制备

取枸橼酸原料50mg加入到试管中，加入10ml细菌内毒素检查用水，震荡，使原料充分溶解，即为样品溶液；用细菌内毒素检查用水将样品溶液稀释10倍，生成S₁₀溶液；再用Na₂HPO₄溶液将S₁₀溶液稀释2倍，生成S₂₀溶液；稀释后的S₂₀溶液作为供试品溶液，即溶液A；

步骤二、三组对照溶液的制备

将供试品溶液与细菌内毒素标准品制成分别含细菌内毒素浓度2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的内毒素溶液，作为溶液B；每一浓度平行各做4支；

用细菌内毒素检查用水与细菌内毒素标准品制成分别含细菌内毒素浓度2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的内毒素溶液，作为溶液C；每一浓度平行各做4支；

取细菌内毒素检查用水，作为溶液D；

步骤三、细菌内毒素检测

向盛装有上述四组溶液的各个试管中加入一定灵敏度的鲎试剂，轻轻混匀后，垂直放入37±1℃试管恒温仪中，保温60±2分钟；将试管从恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转180°，观察并记录各个试管的细菌内毒素检测结果；

步骤四、统计分析

当溶液A和溶液D所有试管均为阴性；溶液B和溶液C中的最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度的0.25λ管均为阴性时，试验结果有效;按统计学方法分别计算溶液C的反应终点浓度的几何平均值Es和溶液B的反应终点浓度的几何平均值Et；当0.5λ≤Es≤2.0λ、且0.5Es ≤Et≤2.0Es时，则试验有效，认为供试品在该浓度下不存在干扰作用，确定该灵敏度的鲎试剂；如Et不在此规定范围内，则应重新更换灵敏度更高的鲎试剂重复进行以上试验内容。

本发明具有的优点和积极效果是： 

本发明的枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法，解决了新开发注射液产品中枸橼酸原料的细菌内毒素检查问题；从源头上对无菌产品质量进行控制，对保证输液产品的安全性有重要意义。该方法有生物化学的理论基础，更科学；利用酶的分子生化反应，专属性高，重现性强，准确度和灵敏度高；操作简单快速，无需特殊仪器设备，实用性强。

具体实施方式

以下参照具体实施例对本发明的枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法进行详细的说明。 

本发明的枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法，包括如下步骤：首先进行干扰试验，确定使用何种灵敏度的鲎试剂对枸橼酸原料进行细菌内毒素检查；然后将待测的枸橼酸原料稀释配制成待测溶液，最大有效稀释倍数MVD=20，加入上述干扰试验中确定的鲎试剂，在37±1℃的温度下反应60±2分钟，而后缓缓倒转180°观察管内凝胶情况，管内凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；管内凝胶不能保持完整从管壁滑脱者为阴性； 

当鲎试剂，供试品的配方，生产工艺改变或试验环境发生变化时，须重新进行干扰试验。

干扰试验的具体步骤如下： 

步骤一、供试品溶液的制备

取枸橼酸原料50mg加入到试管中，加入10ml细菌内毒素检查用水，震荡，使原料充分溶解，即为样品溶液；用细菌内毒素检查用水将样品溶液稀释10倍，生成S₁₀溶液；再用Na₂HPO₄溶液将S₁₀溶液稀释2倍，生成S₂₀溶液；稀释后的S₂₀溶液作为供试品溶液，即溶液A；

步骤二、三组对照溶液的制备

将供试品溶液与细菌内毒素标准品制成分别含细菌内毒素浓度2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的内毒素溶液，作为溶液B；每一浓度平行各做4支；

用细菌内毒素检查用水与细菌内毒素标准品制成分别含细菌内毒素浓度2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的内毒素溶液，作为溶液C；每一浓度平行各做4支；

取细菌内毒素检查用水，作为溶液D；

步骤三、细菌内毒素检测

向盛装有上述四组溶液的各个试管中加入一定灵敏度的鲎试剂，轻轻混匀后，垂直放入37±1℃试管恒温仪中，保温60±2分钟；将试管从恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转180°，观察并记录各个试管的细菌内毒素检测结果；

步骤四、统计分析

当溶液A和溶液D所有试管均为阴性；溶液B和溶液C中的最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度的0.25λ管均为阴性时，试验结果有效;按统计学方法分别计算溶液C的反应终点浓度的几何平均值Es和溶液B的反应终点浓度的几何平均值Et；当0.5λ≤Es≤2.0λ、且0.5Es ≤Et≤2.0Es时，则试验有效，认为供试品在该浓度下不存在干扰作用，确定该灵敏度的鲎试剂；如Et不在此规定范围内，则应重新更换灵敏度更高的鲎试剂重复进行以上试验内容。

实施例1 

目前，原料的细菌内毒素检查主要是参考《中国药典》的标准进行，当《中国药典》中未收载该原料的细菌内毒素检测标准时，可参考其它国家等法定药典标准或相关文献，《中国药典》中并未收载枸橼酸原料。《英国药典》中枸橼酸原料的细菌内毒素限值：L＜0.5EU/mg。建立枸橼酸原料的内控标准，将细菌内毒素限值分别设定为L＜0.25EU/mg和L＜0.125EU/mg，对比试验结果。

由于枸橼酸偏酸性，需使用无热原碳酸钠减弱其酸性使其供试品溶液pH值在6.0-8.0之间，以满足细菌内毒素检查法要求。考虑到无热原碳酸钠可能会影响试验结果，选取NA2HPO4与无热原碳酸钠同时进行试验，对比试验结果。Na₂HPO₄溶液主要是调节供试液的酸碱度。 

依据以上两点，进行细菌内毒素初筛试验，对比无热原碳酸钠和NA2HPO4的试验效果。 

分别使用Na₂HPO₄溶液、无热原碳酸钠减弱供试液的酸性，细菌内毒素限值分别设定为L＜0.25EU/mg和L＜0.125EU/mg进行初筛试验。初筛试验结果如表1所示。 

表1  初筛试验结果 

  

从表1中可以看出，使用Na₂HPO₄溶液比使用无热原碳酸钠的试验结果更理想。当使用λ=0.06EU/ml灵敏度的鲎试剂时，最大有效稀释倍数MVD为10，细菌内毒素限值L＜0.125EU/mg初筛试验结果不太理想，所以选取L＜0.25EU/mg作为枸橼酸原料的细菌内毒素限值，进行干扰试验。

干扰试验的具体过程如下： 

1. 溶液系列的制备

1.1样品溶液的制备：

取枸橼酸原料50mg加入到试管中，加入10ml细菌内毒素检查用水，震荡，使原料充分溶解，即为样品溶液（S）。

1.2 溶液A的制备 

用细菌内毒素检查用水将样品溶液（S）稀释10倍，再用Na₂HPO₄溶液将S₁₀ 1:1稀释。稀释后的S₂₀作为供试品溶液，即溶液A。

1.3 溶液C的制备 

用细菌内毒素检查用水与细菌内毒素标准品制成分别含细菌内毒素浓度2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的内毒素溶液，每一浓度平行各做4支。即溶液C。

  

1.4 溶液B的制备

将供试液与细菌内毒素标准品制成分别含细菌内毒素浓度2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的内毒素溶液，每一浓度平行各做4支。即溶液B。

1.5 另取细菌内毒素检查用水，作为溶液D，即阴性对照。 

2.  试验条件和过程 

向盛装有上述四组溶液的各个试管中加入灵敏度0.06EU/ml的鲎试剂，将试管中溶液轻轻混匀后，垂直放入37±1℃试管恒温仪中，保温60±2分钟。

3. 试验结果判定 

将试管从恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录（+）；凝胶不能保持完整从管壁滑脱者为阴性，记录（－）。保温和拿取试管过程应避免受到震动造成假阴性结果。

当溶液A和D所有平行管均为阴性；C溶液中的最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度的0.25λ管均为阴性时，试验结果有效。按下式计算，细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Es)和用供试液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(Et)。 

E_s = l g ^- 1 ( ∑X _s / 4 )               

E_t = l g ^- 1 ( ∑X _t / 4 )

式中X s、X t分别为细菌内毒素检查用水制成和供试液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的对数值(lg)。

4.     期待结果 

当0.5λ≤Es≤2.0λ、且0.5Es ≤Et≤2.0Es时，则试验有效；认为供试品在该浓度下不存在干扰作用。

如Et不在此规定范围内，则应重新确定MVD并更换灵敏度更高的鲎试剂重复进行以上试验内容。 

干扰试验的试验结果如表2所示。 

表2 干扰试验结果 

 

试验结果表明，该方法可行。

后续的检测步骤，只需将枸橼酸原料配制成0.5%的样品溶液，最大有效稀释倍数MVD=20（即用细菌内毒素检查用水将样品溶液稀释10倍，再用Na₂HPO₄溶液将S₁₀ 1:1稀释，稀释后的S₂₀作为供试品溶液），使用灵敏度0.06EU/ml的鲎试剂进行细菌内毒素检查。 

当鲎试剂，供试品的配方，生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。 

本发明通过干扰试验，确立了枸橼酸原料的细菌内毒素日常检查方法，符合《中国药典》附录ⅪE细菌内毒素检查法的要求。该方法科学、准确、灵敏度高、操作简单、快速。 

Claims (2)

1.一种枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：首先选取L＜0.25EU/mg作为枸橼酸原料的细菌内毒素限值进行干扰试验，确定使用何种灵敏度的鲎试剂对枸橼酸原料进行细菌内毒素检查；然后将待测的枸橼酸原料稀释配制成待测溶液，最大有效稀释倍数MVD=20，加入上述干扰试验中确定的鲎试剂，在37±1℃的温度下反应60±2分钟，而后缓缓倒转180°观察管内凝胶情况，管内凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；管内凝胶不能保持完整从管壁滑脱者为阴性；

当鲎试剂，供试品的配方，生产工艺改变或试验环境发生变化时，须重新进行干扰试验。

2.根据权利要求1所述的枸橼酸原料中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，干扰试验的具体步骤如下：

步骤一、供试品溶液的制备

取枸橼酸原料50mg加入到试管中，加入10ml细菌内毒素检查用水，震荡，使原料充分溶解，即为样品溶液；用细菌内毒素检查用水将样品溶液稀释10倍，生成S₁₀溶液；再用Na₂HPO₄溶液将S₁₀溶液稀释2倍，生成S₂₀溶液；稀释后的S₂₀溶液作为供试品溶液，即溶液A；

步骤二、三组对照溶液的制备

将供试品溶液与细菌内毒素标准品制成分别含细菌内毒素浓度2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的内毒素溶液，作为溶液B；每一浓度平行各做4支；

用细菌内毒素检查用水与细菌内毒素标准品制成分别含细菌内毒素浓度2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ的内毒素溶液，作为溶液C；每一浓度平行各做4支；

取细菌内毒素检查用水，作为溶液D；

步骤三、细菌内毒素检测

向盛装有上述四组溶液的各个试管中加入一定灵敏度的鲎试剂，轻轻混匀后，垂直放入37±1℃试管恒温仪中，保温60±2分钟；将试管从恒温仪中轻轻取出，缓缓倒转180°，观察并记录各个试管的细菌内毒素检测结果；

步骤四、统计分析

当溶液A和溶液D所有试管均为阴性；溶液B和溶液C中的最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度的0.25λ管均为阴性时，试验结果有效;按统计学方法分别计算溶液C的反应终点浓度的几何平均值Es和溶液B的反应终点浓度的几何平均值Et；当0.5λ≤Es≤2.0λ、且0.5Es ≤Et≤2.0Es时，则试验有效，认为供试品在该浓度下不存在干扰作用，确定该灵敏度的鲎试剂；如Et不在此规定范围内，则应重新更换灵敏度更高的鲎试剂重复进行以上试验内容。