CN105181837A

CN105181837A - 一种结核分枝杆菌检测方法

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Publication number: CN105181837A
Application number: CN201510553431.5A
Authority: CN
Inventors: 程永娟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明提供了一种结核分枝杆菌检测方法，该方法针对特定蛋白质分子标志物执行检测，该标志物本身特异性强、稳定性好、灵敏度高，不会因培养过程中其他菌种占据种群优势而影响检测结果。此外由于该标志物位于菌体本身而非其代谢产物，因此无论菌体处于何种生长阶段都不影响检测结果，具有较强的稳定性和指向性。相对于现有技术的培养法和涂片法而言，本发明准确性更高，且可通过标志物蛋白含量近似性的推算结核分枝杆菌含量，从而在一定程度上实现定量检测；相对于噬菌体扩增法而言，本发明方法步骤较为简便，操作时间短，且灵敏性相对较高，具备技术优势。

Description

一种结核分枝杆菌检测方法

技术领域

本发明涉及致病微生物检测技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌检测方法。

背景技术

结核分枝杆菌俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身多种器官，严重威胁人类健康。

现有技术中针对结核分枝杆菌的检测方法主要包括涂片法、培养法、噬菌体扩增法等，其中涂片法操作快捷且成本低廉，但是其敏感性低，且无法区分结核与非结核分枝杆菌，因此检测结果易发生偏差。噬菌体扩增法虽然在敏感性和特异性等方面具有优势，但是其检测周期较长、步骤较繁琐且需要较苛刻的实验条件，因此该方法推广应用存在一定的局限性。

而培养法通常是利用含有指示剂的培养基执行微生物扩增，再依据指示剂的变化信息判别是否含有结核分支杆菌。由于此方法依赖于微生物代谢的表观信息进行判别，因此其灵敏度较低且易发生错误。例如，如果在培养过程中发生染菌现象，由于培养基被其他菌种建立了种群优势，那么即便待测样品中含有结核分支杆菌，由于其无法在此环境下形成菌落、难以产生足够改变指示剂外观的代谢产物，从而可能造成漏检。此外，此种检测方法仅能够实现定性检测而无法实现定量，因此如果能开发一种快捷、灵敏的结核分枝杆菌定量检测方法，将有助于提升临床诊断的准确性，为治疗方案的选择提供依据。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术问题，提供一种结核分枝杆菌检测方法，以解决现有技术中针对结核分支杆菌的检测方法灵敏度较低的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是技术中针对结核分支杆菌的检测方法难以实现定量检测。

本发明解决的再一技术问题是提供一种结核分枝杆菌检测的新方法。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种结核分枝杆菌检测方法，包括以下步骤：

1)取待测样品利用罗氏培养基进行培养，收集全部培养物分别通过乙醇、氯仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀、取上清液待用；

2)检测步骤1)所述上清液中是否含有氨基酸序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌标志性蛋白质片段。

优选的，步骤2)所述检测是氨基酸序列测定。在此基础上进一步优选的，步骤2)包括以下步骤：对步骤1)得到的上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质谱分析酶解产物中是否含有序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌标志性蛋白质片段。在此基础上进一步优选的，步骤2)所述胰酶酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于35～39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。在此基础上可以分别执行以下优选：所述二硫键还原剂是苏糖醇；所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺。

在利用以上方法对待测样品执行检测后，若检测结果显示待测样品总蛋白中含有序列为NSGYIECCR的蛋白片段则判定该样品中含结核分支杆菌，反之则不含有结核分枝杆菌，依据该鉴别原则形成鉴别结论。在以上技术方案中，步骤1的目的在于提取待测物总蛋白，因此本发明步骤1)的操作内容并不限于以上内容，也可以是任一能够获取待测物总蛋白的其他方法。

本发明是一种针对特定蛋白质分子标志物的检测技术，该标志物本身特异性强、稳定性好、灵敏度高，不会因培养过程中其他菌种占据种群优势而影响检测结果。此外由于该标志物位于菌体本身而非其代谢产物，因此无论菌体处于何种生长阶段都不影响检测结果，具有较强的稳定性和指向性。相对于现有技术的培养法和涂片法而言，本发明准确性更高，且可通过标志物蛋白含量近似性的推算结核分枝杆菌含量，从而在一定程度上实现定量检测；相对于噬菌体扩增法而言，本发明方法步骤较为简便，操作时间短，且灵敏性也相对较高，具备技术优势。本发明方法以巧妙的技术构思实现了突出的技术效果，同时成本较低、易于实现，具备突出的推广前景。

附图说明

图1是本发明实施例1中结核分枝杆菌菌体标准品的液相色谱-生物质谱检测结果图。

图2是本发明实施例1中待测药品的液相色谱-生物质谱检测结果图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1(检测特异性实验)

一、实验方法

一种结核分枝杆菌检测方法包括以下步骤：

1)取待测样品利用罗氏培养基进行培养，收集全部培养物分别通过乙醇、氯仿-甲醇溶液浸泡；收集固形物干燥，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀，得到待测物上清液待用。

2)另一方面取结核分枝杆菌纯品，加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀，得到标准品上清液待用。

3)将上述待测物上清液和标准品上清液分别利用碳酸氢铵溶液溶解，加入苏糖醇于室温下孵育，而后加入碘乙酰胺避光孵育，最后加入胰蛋白酶于37℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，分别得到待测物酶解产物和标准品酶解产物。

4)将步骤3)得到的待测物酶解产物和标准品酶解产物分别注入色谱-生物质谱联用系统检测，利用生物质谱分析方法获得结核分枝杆菌标志性蛋白质片段NSGYIECCR的检测信号。实验结果如图1、2所示。

二、实验结果

如图1所示，在结核分支杆菌纯品的液相色谱-生物质谱检测结果图中能够清晰看到序列为NSGYIECCR的蛋白片段吸收峰。而对待测样品检测发现在同样位置也出现了明显的峰值，因此可以判断本实施例的待测样品中含有结核分支杆菌。本发明检测方法对结核分枝杆菌具有很好的特异性。

实施例2(检测灵敏度实验)

一、实验方法

取结核分支杆菌菌体纯品，利用无菌水分别制备得到菌体浓度为10cfu/mL、10²cfu/mL、10³cfu/mL、10⁴cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁶cfu/mL、10⁷cfu/mL、10⁸cfu/mL的菌液，而后取同样体积的上述菌液作为待测样品分别执行以下检测。

1)取待测样品加入蛋白提取溶液提取；弃沉淀，得到待测物上清液待用。

2)将上述上清液利用碳酸氢铵溶液溶解，加入苏糖醇于室温下孵育，而后加入碘乙酰胺避光孵育，最后加入胰蛋白酶于37℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，得到酶解产物。

3)将步骤2)得到的酶解产物注入色谱-生物质谱联用系统检测，利用生物质谱分析方法获得结核分枝杆菌标志性蛋白质片段NSGYIECCR的检测信号。实验结果如表1所示。

二、实验结果

表1不同菌体浓度待测产物的检测结果

如表1所示，利用本发明方法，浓度超过10²cfu/mL的待测样品都检测出了结核分枝杆菌，表面本发明方法具有较强的灵敏性，能够对较低菌体含量的待测样品实现准确检测，从而为疾病早发现、早治疗奠定了基础。

实施例3

一种结核分枝杆菌检测方法，包括以下步骤：

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)所述检测是氨基酸序列测定。

步骤2)包括以下步骤：对步骤1)得到的上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质谱分析酶解产物中是否含有序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌标志性蛋白质片段。

步骤2)所述胰酶酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于35℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

以上所述二硫键还原剂是苏糖醇。

以上所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺。

实施例4

一种结核分枝杆菌检测方法，包括以下步骤：

在以上技术方案的基础上，满足以下条件：

步骤2)所述胰酶酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

实施例5

一种结核分枝杆菌检测方法，包括以下步骤：

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种结核分枝杆菌检测方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤2)所述检测是氨基酸序列测定。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于步骤2)包括以下步骤：对步骤1)得到的上清液进行胰酶酶解；而后通过生物质谱分析酶解产物中是否含有序列为NSGYIECCR的结核分枝杆菌标志性蛋白质片段。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于步骤2)所述胰酶酶解包括以下步骤：将步骤1)得到的总蛋白溶解后加入二硫键还原剂孵育，而后加入巯基封闭试剂，最后加入胰蛋白酶于35～39℃下孵育，将酶解后的蛋白脱盐、干燥，即得到酶解产物。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述二硫键还原剂是苏糖醇。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述巯基封闭试剂是碘乙酰胺。