CN1945324A - 一种筛选结核杆菌耐药蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学筛选新型抗结核药靶、疫苗抗原和检测靶标领域，具体的说，本发明提供了一种筛选结核杆菌耐利福平药物的蛋白的方法：首先，培养耐药菌株；其次，分别分离耐药菌株和敏感菌株中的蛋白；再次，将耐药菌株和敏感菌株中的蛋白进行对比，确定耐药蛋白；最后，分离鉴定耐药蛋白。本发明提供的方法可以准确分离鉴定结核杆菌耐药蛋白，为深入了解结核杆菌的耐药机理、临床耐药株的快速检测及疫苗、药靶的开发提供新的途径。

Description

一种筛选结核杆菌耐药蛋白的方法

技术领域

本发明属于分子生物学筛选新型抗结核药靶、疫苗抗原和检测靶标领域，具体的说，本发明提供了一种通过蛋白质组技术，筛选结核杆分枝杆菌中的耐利福平蛋白的方法。本发明还提供了该方法在筛药和制备疫苗等方面的应用。

背景技术

结核病仍对人类构成巨大的威胁。目前全球接近32％的人口已感染了结核杆菌。每年约有270万人死于结核病，平均每天死亡超过7000人。世界卫生组织已于1993年宣布结核病为全球健康紧急状态。

我国结核病疫情较严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数居世界第二位。2000年我国第四次全国结核病流行病学抽样调查结果分析，我国结核病的疫情十分严峻，在全球仅次于印度而居世界第二位。目前全国有5.5亿人感染结核菌，451万活动性肺结核病人，其中传染性肺结核患者达200万。每年因结核病死亡者达13万，是各种传染病中死亡人数最多的一种。

WHO和国际防痨和肺病联合会(IUATLD)2000年3月公布了在全球72个国家和地区对耐药结核的监测结果，新病例中至少对1种抗结核药的平均耐药率是10.7％(1.7％～36.9％)。目前我国已有5.5亿人受结核菌感染，总耐药率为27.8％，初始耐药率为18.6％，获得性耐药率为46.5％-68.4％，耐多药率为10.7％，现有耐药结核病人55.5万。由于耐药结核的诊断及传统药敏试验的周期较长而不能及时治疗、隔离患者，常规抗结核药物不足以治疗，导致其病程延长、传染性增加，成为结核病的重要传染源和主要死亡原因之一；同时耐药结核治疗相关费用增加50倍以上，浪费大量卫生资源。

耐药结核病的发生、传播以及艾滋病流行是当前结核病结核病流行难以遏制主要原因之一，已成为亟待解决的世界性的严重公共卫生问题。可以预测，人类在21世纪将面临比20世纪50年代中叶更为严峻的疫情。

利福平(rifampicin，RFP，即3-(4-Methylpiperazinyliminomethyl)，3-{〔(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基〕甲基}-利福霉素)，于1972年被使用作抗结核药物，RFP是通过特异地与RNA聚合酶β亚基结合，抑制RNA聚合酶活性，干扰分枝杆菌RNA的转录及合成，阻碍蛋白质合成而发挥抗菌作用。由于其MICs为0.1～0.2μg/mL，可以杀灭生活状态的结核杆菌，因此与异烟肼一起构成了抗结核最主要的两种药物，大大缩短了结核病治病的周期。编码RNA聚合酶β亚基的rpoB基因突变是90％以上的耐RFP菌株的分子机制。研究发现少数耐RFP菌株并无ropB突变，同时在少数敏感株组检测到ropB基因突变，提示利福平耐药尚有其他机制。研究表明，利福平耐药菌株通常也耐其它抗结核药物。因此研究耐利福平菌株意义重大。

蛋白质组技术可高通量描述微生物的蛋白质组特征，应用比较蛋白质组学的方法，人们可以迅速地寻找病原菌的致病因子，明确致病机理，构建新型疫苗，促进抗致病菌的新型治疗药物和诊断试剂的迅速发展。目前，已经应用比较蛋白质组学技术对分枝杆菌复合菌群的蛋白质表达进行了研究，及结核分枝杆菌(M.tb)在多种环境条件下的基因表达进行了分析。但尚无见到关于M.tb临床耐药菌株的全细胞组成蛋白的比较分析。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种筛选结核杆菌耐利福平药物的蛋白的方法。

本发明的目的之二是提供耐药基因和蛋白库，为新型抗结核药物开发提供药靶；为开发临床检测耐药菌株的新技术提供基因库和蛋白质库；为构建新型结核防治疫苗提供候选基因及蛋白文库。

本发明提供了一种筛选结核杆菌耐药蛋白的方法，所述药物为3-{〔(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基〕甲基}-利福霉素(即利福平)，该方法依次包括以下步骤：

(1)对结核杆菌菌株分别在同的条件下加药或者不加药培养，以最低抑菌浓度(MIC)在16μg/ml的菌株为耐药菌株；

(2)分别分离耐药菌株和敏感菌株中的蛋白；

(3)将耐药菌株和敏感菌株中的蛋白进行对比，以在耐药菌株中增加或者缺失的蛋白，或者表达量增加至少2倍的蛋白，或者表达量减少至少50％的蛋白为耐药蛋白；

(4)分离鉴定耐药蛋白。

本发明中，(2)中可以仅保留耐药菌株和敏感菌株中的碱性蛋白。

本发明中，(1)中检测最低抑菌浓度和(2)中分离提取蛋白的所用菌株可以是处于对数生长期的结核杆菌。

本发明中，(2)和(4)中可采用电泳、离心，盐析、过滤或者层析等方法分离蛋白。本发明中，除特别指出之外，所用实验条件均采用常规操作方法和实验条件。

本发明中，(4)中可通过蛋白电泳图谱分析、蛋白测序、质谱分析或者氨基酸组成分析等方法鉴定蛋白。

本发明中，将(4)得到的耐药蛋白作为药靶，可用于筛选或者检测抗结核药物。筛选或者检测抗结核药物的主要思路是，可与耐药蛋白结合相互作用，或者可以影响耐药蛋白表达的物质即可作为候选的抗结核药物。用生物信息学方法模拟耐药蛋白和耐药蛋白的分子结构，筛选出可与耐药蛋白结合相互作用的物质，然后，进一步确定其作用位点和作用机理，同时，可采用实验菌株或者实验动物验证。

本发明中，可将(4)得到耐药蛋白的编码基因进行突变，并用于构建疫苗。鉴定耐药蛋白后，可进一步确定其导致耐药的关键氨基酸残基，然后突变这些氨基酸，并用突变后的相应蛋白或者其编码核苷酸构建疫苗。

本发明中，可以根据(4)得到的耐药蛋白检测结核杆菌耐药菌株。

本发明首次系统地对临床利福平耐药菌株的细胞内蛋白进行比较蛋白质组学分析，同时，以人型实验标准毒株H37Rv及临床全敏株作对照，检测5株临床利福平单耐药菌株，9株临床全敏株和标准株H37Rv共15株M.tb菌株，每个样本进行至少3次重复实验。找到了13个M.tb耐药相关蛋白，其中筛选到trpC(Rv1611)，wag31(ag84，Rv2145c，R6)，bfrB(Rv3841，R4)，cysK1(cysK，Rv2334，R8)，Rv2629(R9)，ilvN(ilvH，Rv3002c，10#)，devR(dosR，Rv3133c，R11)等上调表达蛋白；Ssb(Rv0054，R1)，Rv0068(R2)，Rv0927c(R3)，OpcA(Rv1446c，R5)，Rv2159(7#)，PPE51(Rv3136，R12)和NuoB(Rv3146，13#)等7个下调表达。经查新无相关报道。

结核病是各种传染病中死亡人数最多的一种。耐药结核的诊断繁琐及传统药敏试验的周期较长使患者不能及时进行隔离、得到治疗，成为结核病的重要传染源和主要死亡原因之一；同时耐药结核使治疗相关费用增加了50倍以上，浪费大量卫生资源，同时也加重了患者及其家庭的负担。本发明提供的方法可以准确分离鉴定结核杆菌耐药蛋白，为深入了解M.tb的耐药机理、临床耐药株的快速检测及疫苗、药靶的开发提供新的途径。

附图说明

图1为M.tb H37Rv株菌体蛋白2-DE图谱(pH4～7)。其中，2-DE即双向电泳；R1等图中编号为差异表达蛋白位点(后同)。

图2为M.tb临床全敏感菌株菌体蛋白2-DE图谱(pH4～7)。

图3为M.tb临床利福平单耐药菌株菌体蛋白2-DE图谱(pH4～7)。

图4为利福平单耐药菌株菌体蛋白R4切割图谱的比较(pH4～7)。其中，(a)M.tbH37Rv，(b)临床全敏感菌株，(c)利福平单耐药菌株，(d)蛋白表达定量比较。

图5为为利福平单耐药菌株菌体蛋白R6切割图谱的比较(pH4～7)。其中，(a)M.tbH37Rv，(b)临床全敏感菌株，(c)利福平单耐药菌株，(d)蛋白表达定量比较。

图6为M.tb H37Rv菌体碱性蛋白2-DE图谱(pH7～10)。

图7为M.tb临床利福平耐药菌株菌体碱性蛋白2-DE图谱(pH7～10)。

图8为利福平单耐药菌株菌体碱性蛋白R2切割图谱的比较(pH7～10)。其中，(a)M.tb H37Rv，(c)利福平单耐药菌株，(d)蛋白表达定量比较。

图9为利福平单耐药菌株菌体碱性蛋白7#切割图谱的比较(pH7～10)。其中，(a)M.tb H37Rv，(c)利福平单耐药菌株，(d)蛋白表达定量比较。

图10为R4点的肽指纹图谱。其中，横座标为荷质比(m/z)，纵座标为蛋白量(％intensity)。质谱参数：4700 reflector spec#1 MC[BP＝1500.8，7048]。

图11为R4点的1228.6MSMS(MSMS是串联质谱，1228.6为PMF质谱鉴定的一个多肽片断所具有的分子量；这个肽段再经氨基酸降解进行更进一步的氨基酸质谱分析，以确定其氨基酸组成和排列)。其中，横座标为荷质比(m/z)，纵座标为蛋白量(％intensity)。质谱参数：4700MS/MS Precursor 1228.67 spec #4[BP＝432.4，110]。

图12为R4点的1550.8MSMS。其中，横座标为荷质比(m/z)，纵座标为蛋白量(％intensity)。质谱参数：4700MS/MS Precursor spec #1 MC[BP＝1752，185]。

具体实施方式

实施例1结核分支杆菌的培养和药敏实验

结核分枝杆菌标准株Mycobacterium t uberculosis H37Rv(ATCC93009)，临床利福平(即针对3-{〔(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基〕甲基}-利福霉素，rifampicin，RFP，Sigma公司R 3501)单耐药菌株(5株)，临床全敏株(9株)均由上海市肺科医院结核研究室提供。将菌株接种到添加了10％ADC(DIFCO，0.5％牛血清白蛋白，0.2％葡萄糖，140mmol/LNaCl)和0.5％甘油的Middlebrook 7H9Broth(DIFCO，Bection-Dickinson)中，37℃恒温培养箱中静置培养15～20天，当菌体浓度达到至细菌密度为1×10⁸～2×10⁸或光密度(OD₆₀₀)为0.8～1之间收取菌体。

80℃水浴加热2h以杀死细菌。经5000rpm，4℃离心后弃上清(上清先经121℃30min高压灭菌后弃掉)，用pH7.4的PBS缓冲液洗涤细菌2次，菌体沉淀放-80℃低温冰箱贮存备用。

采用BACTEC MGIT-960法检测药物敏感性，9株临床全敏菌株对利福平的MIC值均低于0.5ug/mL，5株利福平单耐药菌株对利福平的MIC值分别为32ug/mL(3株)和64ug/mL(2株)。

实施例2菌体蛋白的提取

6000g4℃离心15分钟沉淀对数生长期的菌体20mL。用pH7.4的PBS缓冲液洗涤沉淀细菌2次。用0.5mL菌体超声缓冲液溶解。冰浴超声破碎裂解细菌15分钟，振幅70％，200W超声1分钟，停20秒。缓慢加入样品裂解液置于室温中30分钟，间隔振荡。10000r/min，20℃离心15分钟，收集上清液，-80℃冻存。Bradford法测蛋白质浓度。

实施例3碱性蛋白的提取

6000g4℃离心15分钟沉淀对数生长期的菌体20mL。4000r/min，4℃离心15分钟沉淀细菌，用pH7.4的PBS缓冲液洗涤沉淀细菌2次。用1mLPBS重新悬浮沉淀细菌并转入1.5mL EP管。6000r/min，4℃离心15分钟沉淀细菌。用0.5mL菌体超声缓冲液溶解。冰浴超声破碎裂解细菌15分钟，振幅70％，200W超声1分钟，停20秒。经预冷甲醇于4℃下固定40分钟(中间换一次甲醇)，慢慢加入1/4体积的预冷的1.0N H₂SO₄，连续搅拌30分钟。悬液在4℃，12000×g离心20分钟，保留上清液。将沉淀打碎，重悬于冷的0.4N H₂SO₄中再一次抽提，离心，合并上清。加入4倍体积的冷无水乙醇到上清液中，-10℃存放24小时来沉淀碱性蛋白。2000×g离心30分钟收集沉淀物，尽可能倾出乙醇，将沉淀再悬于冷的无水乙醇中，10000×g离心15分钟收集沉淀，冻干后称重进行后续分析。

实施例4第一向——固相pH梯度等电聚焦凝胶电泳(用自制的电泳上样缓冲液，17cm的胶条，pH 4-7)

采用被动水化，低电压胶内泡胀法。从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液，置室温溶解。在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5μl，充分混匀。从中取出300μl，加入60μg样品(约100μl)，充分混匀。从冰箱取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH 4-7)，于室温放置10分钟。沿着聚焦盘中槽的边缘线性加入样品。当所有的蛋白质样品都已经加入后，用镊子去除预制IPG胶条上的保护层。将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。室温静30分钟后，在每根胶条上缓慢覆盖2-3mL矿物油，对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。胶条的极限电流50-70μA/根，聚焦温度17℃。

水化      50V         12-16小时(17℃)            主动水化

S1        250V        线性     30分钟            除盐

S2        1000V       快速     1小时             除盐

S3        10000V      线性     5小时             升压

S4        10000V      快速     60,000伏小时      聚焦

S5        500V        快速     任意时间          保持

聚焦结束后，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，或者将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

实施例5碱性蛋白一向等电聚焦(“Cup-Loading”上样，用自制的电泳上样缓冲液，17cm的胶条，pH 7-10)

采用20℃主动水化法。水化上样缓冲液，置室温溶解。在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte(pH7-10)5μL，充分混匀。将缓冲液330/340μL均匀地铺在水化盘加样孔中，胶条胶面朝下放入，30分钟后覆盖矿物油5mL，室温下水化12-20小时。杯上样胶条槽洗净，按标志放在IEF电极板上。水化好的胶条从水化盘中夹出来，沥干矿物油，或用MilliQ水打湿的滤纸吸走矿物油。将胶面朝上放入胶条槽，阴极尽量顶到槽的(-)端。将纸盐桥放在电极与胶面接触部位，放好移动电极。加5mL矿物油覆盖胶面，把样品杯放在阳极端移动电极外面。加样60μg(100-150μL)。

盖上盖子。设置等电聚焦程序。胶条的极限电流50-70μA/根，聚焦温度20℃。

S1    250V       快速        30分钟             除盐

S2    500V       快速        45分钟             除盐

S3    1000V      快速        1小时              除盐

S4    4000V      线性        3小时              升压

S5    4000V      慢速        60000伏小时        聚焦

S6    500V       快速        任意时间           保持

聚焦结束的胶条立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，或者将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

实施例6第二向SDS-PAGE电泳

配制12％的聚丙烯酰胺凝胶两块。用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。刚聚焦好的胶条用MilliQ水浸湿的滤纸，吸去多余水分和矿物油及多余样品，将胶条转移至溶涨盘中，加入5mL胶条平衡缓冲液I。在水平摇床上缓慢摇晃12分钟。彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I，再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃14分钟。将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。使胶条与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。封胶液彻底凝固后，进行二向电泳。起始时用低电流(5mA/gel/17cm)或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm)，溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。取出凝胶，并切角以作记号

实施例7蛋白质的银染

电泳完毕后将胶取出，放入固定液中30分钟。倒出固定液后加入浸泡液处理30分钟。MilliQ水漂洗三次，每次5分钟。加入银染液，20分钟后倒掉染液，加入显色液，摇床加速，肉眼观察至显色完全，加入终止液停止显色。整个染色过程在摇床上室温进行。

实施例8凝胶图像的分析

凝胶用Molecular Image Fx激光图像扫描仪扫描，选择临床耐药M.tb全菌蛋白凝胶图像与临床敏感M.tb及标准菌株H37Rv的全蛋白凝胶图像之间进行配比，寻找差异表达的蛋白点，配比分析采用PDQuest 6.0软件完成。

实施例9MALDI-TOF-MS肽指纹图谱分析

分别筛选耐药M.tb与敏感M.tb及标准菌株H37Rv的全菌蛋白质组中产生差异的蛋白质斑点，切下放入样品管中，挖取蛋白点切成碎块，50％乙氰脱色，加100％乙氰使胶块缩水变白后，去上清，加适量0.1mol/l NH₄HCO₃，5分钟后加等体积乙氰，15分钟后抽干。加适量10mmol/lDTT/0.1mol/l NH₄HCO₃，56℃水浴45分钟，去上清，加等体积55mmol/l碘乙酰胺/0.1mol/l NH₄HCO₃，室温避光30分钟。加适量0.1mol/lNH₄HCO₃，5分钟后加等体积乙氰，15分钟后抽干，加适量消化液(50mmol/l NH₄HCO₃，5mmol/lCaCl₂，12.5ng/ul Trypsin)，4℃30分钟后吸出残余液体，加适量无酶消化液，37℃过夜。加25mmol/l NH₄HCO₃，15分钟后加等体积乙氰，15分钟后加适量5％TFA，40℃1小时，收集上清，再加2.5％TFA/50％乙氰，30℃1小时，合并上清，抽干，加0.5％TFA溶解。MALDI-TOF-MS肤指纹图谱分析。

实施例10数据库搜索

肽指纹图谱匹配使用PepIdent(www.expasy.org/tools/peptident.pl)。参数设置为：物种来源-细菌；Mw-表观分子量±30％；pI-不设限制；酶-胰酶；允许忽略的酶切位点-1；修饰类型-碘乙酰化。氨基酸序列结构域匹配使用PrositeScan(www.expasy.org/tools/prosite scan.pl)。氨基酸序列同源性搜索使用Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)。

本发明的方法最终筛选到13个蛋白，具体见表1。其中有若干是已知蛋白并被证明与结核杆菌有密切联系。

对表1中全部13个蛋白的功能进行了归类，所依据的功能分类标准(http：//genolist.pasteur.fr/TubercuList/)。0：毒力，解毒，适应；1：类脂(化合)物代谢；2：信号通路；3：细胞壁和细胞加工；5：插入序列和抗菌素；6：PE/PPE；7：中间代谢和呼吸；8：未知；9：调节蛋白；10：保守假蛋白。

大部分利福平耐药相关蛋白的功能集中在第7类和第10类，这两类蛋白的功能分属于代谢和呼吸作用的中间产物和保守的假定蛋白，以前者居多。可见，当细菌产生利福平耐药性之后，主要是一些参与代谢和呼吸作用的蛋白发生变化，通过调节代谢从而影响对利福平的抗性。

R1，Ssb，Rv0054属于信号通路中的蛋白，在绝大多数DNA代谢过程中(包括复制、修复、重组)发挥重要的作用[Saikrishnan K.，Jeyakanthan J.，Venkatesh J.，Acharya N.，Sekar K.，Varshney U.，Vijayanl M..Structure of Mycobacterium tuberculosisSinglestranded DNA-binding Protein.Variability in Quaternary Structure and ItsImplications[J].J.Mol.Biol.，2003，331：385-393；Mothe Sreedhar Reddy，Guhan N.，Muniyappa K..Characterization of Single-stranded DNA-binding Proteins fromMycobacteria[J].The Journal of Biological Chemistr，2001，276(49)：45959-45968.]。SsB蛋白连接着一条具有高度亲和性的单链DNA，吸附和解吸常数一样，这种结合可以改变ssB羧基端结构域，而羧基端结构域是ssB与同源的RecA的结合位点[Ajay Kumar R.，Moreshwar B.Vaze，Nagasuma R.Chandra，Vijayan M.，Muniyappa K..FunctionalCharacterization of the Precursor and Spliced Forms of RecA Protein of Mycobacteriumtuberculosis[J].Biochemistry，1996，35：1793-1802，Priya Handa，Narottam Acharya，UmeshVarshney.Chimeras Between Single-stranded DNA-binding Proteins from Escherichia coliand Mycobacterium tuberculosis Reveal That Their C-terminal Domains Interact with UracilDNA Glycosylases[J].The Journal of Biological Chemistry，2001，276(20)：16992-16997]，在体内这两种蛋白具有高度的亲和性，常共同发挥调节作用。SsB在分支杆菌之间具有高度的蛋白保守性，其特征性构象包括二级结构中大量的发夹结构，以及椭圆形四聚体。这种功能性四聚体与E.coli中不同[Hans Joachim Mollenkopf，Leander Grode，JensMattow，Maik Stein，Peggy Mann，Bernhard Knapp，Jeffrey Ulmer，Stefan H.E.Kaufmannl.Application of Mycobacterial Proteomics to Vaccine Design：Improved Protection byMycobacterium bovis BCG Prime-Rv3407 DNA Boost Vaccination Against Tuberculosis[J].Infection And Immunity，2004，72(11)：6471-6479.]，与DNA结合的方式也不同。因此，如果把SsB蛋白作为分子靶标可以控制结核病原菌的生长。研究中发现，这个蛋白在耐药株和临床全敏株中同时下降，提示可能是临床菌株在感染过程中出现的普遍改变，导致临床菌株与实验室标准敏感菌株之间的差别。

R2，Rv0068是一种假定蛋白，可能是一种氧化还原酶，在呼吸通路中发挥作用。Hans等曾经对M.tuberculosis和M.bovis的菌体蛋白做过蛋白质组分析，发现Rv0068在M.tuberculosis中表达而在M.bovis中不表达[Betts J.C.，Dodson P.，Quan S.，LewisA.P.，Thomas P.J.，et al..Comparison of the Proteome of Mycobacterium tuberculosis StrainH37Rv with Clinical Isolate CDC 1551[J].Microbiology，2000，146：3205-3216]，提示这种蛋白可以用于结核分支杆菌的血清学检测或药靶。我们的实验发现，这种蛋白在单耐药菌株中也不表达，在多耐药样本中浓度下降。说明耐药株的呼吸作用有下降的可能，这也许与临床耐药菌株的生活力相关。

R3，Rv0927c也是假定蛋白，其功能可能与脱氢酶或还原酶相关。Betts等对不同生长时期的M.tb H37Rv和CDC1551所表达的蛋白进行了蛋白质组学分析，发现随着培养时间的延长，这个蛋白在CDC1551中特异性表达，而在H37Rv中不表达[7]。我们发现在临床利福平耐药菌株和临床全敏感菌株中这个蛋白不表达，而在作为对照的H37Rv中有比较大量的出现。这样的结果可能与本次实验培养时间有关，我们所检测的是对数生长期的细菌，Betts实验描述的是一直到稳定期末的蛋白表达，细胞内蛋白的合成具有时序性，生长时间和生长状态的不同，会导致蛋白表达出现差异。另外，两次实验所选的菌株类型不同，我们所选的菌株属于H37Rv北京家族型，这是在亚洲流行的致病菌，欧洲和美洲极少出现。虽然迄今没有关于不同传染家族M.tb的详尽的蛋白表达分析，但这些不同来源和流行方式的结核杆菌可能存在蛋白表达上的差别。

R4，BfrB，Rv3841是一种细菌铁蛋白。属于分支杆菌体内一种大分子膜蛋白的亚单位，这种膜蛋白具有很强的免疫原性[Brooks B.W.，Young N.M.，Watson D.C.，Robertson R.H.，Sugden E.A.，Nielsen K.H.，Becker Sawe.Mycobacterium-ParatuberculosisAntigen-D-Characterization and Evidence That It Is a Bacterio ferritin[J].Journal ofClinical Microbiology，1991，29(8)：1652-1658.]。氨基酸序列分析表明，细菌铁蛋白含有铁离子的铁氧化酶中心保守性很强，在Mycobacterium paratuberculosis、Mycobacteriumavium、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium scrofulaceum中，这一蛋白的基因序列同源性程度很高。推测是分支杆菌的一种必须蛋白[Pessosani MCV.，Smith D.R.，Rivoire B.，Mccormick J.，Hefta S.A.，Cole S.T.，Brennan P.J..Purification，Characterization，Gene Sequence，and Significance of a Bacterioferritin from Mycobacterium leprae[J].Journalof Experimental Medicine，1994，180(1)：319-327]。从功能上看，铁蛋白与细菌氮素代谢密切相关，包括N₂的氧化和NO的还原。而关于NO在决定M.tuberculosis对宿主的感染性方面的作用一直是人们讨论的热点，其重要性一直倍受关注。有报道指出，两种不同的毒株H37Rv和I2646在NO处理后，会导致蛋白表达的变化，其中就包括BfrB的上调表达，如果加上BfrB与结核感染和患病者血清的免疫反应检测，就可以说明这个蛋白在M.tb感染中所发挥的功能[Garbe T.R.，Hibler N.S.，Deretic V..Response to ReactiveNitrogen Intermediates in Mycobacterium tuberculosis：Induction of the 16-kilodaltona-crystallin Homolog by Exposure to Nitric Oxide Donors[J].Infect.

Immun，1999，67：460-65]。但目前为止，关于这个蛋白的报道不多，数据库中也没有关于它的研究工作进展。在利福平耐药菌株中BfrB表达量同样明显上升，全敏样本中有微弱上升。可能这是一个受细菌耐药程度影响的蛋白，同时也提醒我们注意M.tb利福平耐药性产生的机理和NO对M.tb感染性的作用机理之间的相关性。

R5，OpcA，Rv1446c基因编码的一种暴露于细胞表面的外膜蛋白，有10个跨膜侧链，5个暴露在表面的环。OpcA具有保守的跨膜区域，但膜外的环状结构及细胞周质中的转角却在微生物种间具有广泛的多样性。在许多病原菌中，OpcA蛋白能介导菌体对内皮细胞和上皮细胞的黏附、侵入以及胞内定位。主要与内皮细胞的整合蛋白发生作用[Moore Jeremy，Bailey Simon E.S.，Benmechernene Zineb，Tzitzilonis Christos，GriffithsNatalie J.E.，Virji Mumtaz，Derrick Jeremy P..Recognition of Saccharides by the OpcA，OpaD，and OpaB Outer Membrane Proteins from Neisseria meningitidis[J].Journal ofBiological Chemistry，2005，280(36)：31489-31497；Peixuan Zhu，Giovanna Morelli，MarkAchtman.The opcA and opcB Regions in Neisseria：Genes，Pseudogenes，Deletions，InsertionElements and DNA Islands[J].Molecular Microbiology，1999，33(3)：635-650]。转录水平不同，OpcA蛋白的表达也是高度可变的，这主要依赖于基因起始区域多聚胞嘧啶侧链的长度而定。虽然这个蛋白在M.tb中已经被表达，关于其在结核杆菌中的更多的信息至今未见报道。在耐药菌株和敏感菌株中，OpcA蛋白全部下调，但耐药株中下调幅度更大。

R6，Wag31，Rv2145c是一个在结核分支保守性很强的蛋白。2-DE检测发现它位于细胞外膜或细胞壁[Peter R.Jungblut.Proteome Analysis of Bacterial Pathogens[J].Microbes and Infection，2001，3：831-840]，也是一种分泌型的表面糖/脂多糖蛋白，具有免疫原性[Andrew E.Greenstein，Christoph Grundner，Nathaniel Echols，Laurie M.，GayT.，Noelle Lombana，Carl A.Miecskowski，Kristi E.Pullen，Pei-yi Sung Tom.Structure/Function Studies of Ser/Thr/Tyr Protein Phosphorylation in Mycobacteriumtuberculosis[J].J Mol Microbiol Biotechnol，2005，9：167-181]。在体内，Wag31的功能与Ser/Thr/Tyr蛋白激酶(Pkn)密切相关。当PknA和PknB共同作用，可以导致Wag31的73位Thr被强烈磷酸化，继而调节细胞分裂和细胞形态[Andrew E.Greenstein，ChristophGrundner，Nathaniel Echols，Laurie M.，Gay T.，Noelle Lombana，Carl A.Miecskowski，KristiE.Pullen，Pei-yi Sung Tom.Structure/Function Studies of Ser/Thr/Tyr ProteinPhosphorylation in Mycobacterium tuberculosis[J].J Mol Microbiol Biotechnol，2005，9：167-181]。Wag31有260个氨基酸组成，通过MS-MS分析发现，耐药菌中这个蛋白有8个AA残基出现了磷酸化修饰，分别位于Thr、Ser，及一个Tyr残基上。

对内外环境以及自身特定的生理状态进行代谢水平的应答，是生命的基本特征。蛋白的可逆磷酸化一直是灵敏的生理信号，通过这种信号通路，机体能够有效地对不同的影响因素做出相应的的反应，包括细胞分型、毒力、趋化性、病原性等等。与H37Rv相比，临床全敏株中Wag31的表达几乎不变，而利福平耐药菌株中则上调表达。其中多位点磷酸化提示我们，Wag31与细菌对利福平的耐药性密切相关。但是，它的这种变化究竟是属于利福平耐药性状出现的原因还是结果，尚有待深入研究。

7#，Rv2159是一种保守的假定蛋白[Lia Danelishvili，Martin Wu，Lowell S.Young，andLuiz E.Bermudezl.Genomic Approach to Identifying the Putative Target of andMechanisms of Resistance to Mefloquine in Mycobacteria[J].Antimicrobial Agents AndChemotherapy，2005，40(9)：3707-3714]。蛋白质组学分析表明它属于M.tb的膜蛋白[Colette Goffin，Jean-Marie Ghuysen.Biochemistry and Comparative Genomics of SxxKSuperfamily Acyltransferases Offer a Clue to the Mycobacterial Paradox：Presence ofPenicillin-Susceptible Target Proteins versus Lack of Efficiency of Penicillin as TherapeuticAgent[[J].Microbiology And Molecular Biology Reviews，2002，66(4)：702-738]。虽然功能未知，但这个蛋白的编码基因Rv2159c与E.coli的ddl基因(编码D-alanyl-D-alanine形成过程中的连接酶)具有较强的序列同源性，但在M.tuberculosis，M.leprae，和S.coelicolor中，这个基因位于染色体的其他位点[Colette Goffin，Jean-Marie Ghuysen.Biochemistryand Comparative Genomics of SxxK Superfamily Acyltransferases Offer a Clue to theMycobacterial Paradox：Presence of Penicillin-Susceptible Target Proteins versus Lack ofEfficiency of Penicillin as Therapeutic Agent[[J].Microbiology And Molecular BiologyReviews，2002，66(4)：702-738]。在结核分支杆菌的感染过程中，伴随着基因表达的调控。转录调节子在这个过程中进行着重要的调节。M.tb中多种δ因子调节着细菌在环境压力下的基因表达，其中一些是M.tb毒力或体内持续感染所必须的基因。Raman等发现在sigD基因缺失的突变株中，Rv2159基因表达量下降1.7倍，在野生型H37Rv菌中，sigD基因表达量稳定，不随着生活周期的改变而变化，但随着氧气的消耗，其含量迅速下降，相应细菌的感染能力也下降。Rv2159c与sigD基因在体内表达的同步特性说明二者在功能上的密切相关[Sahadevan Raman，Rohan Hazra，Christopher C.Dascher，and Robert N.Husson.Transcription Regulation by the Mycobacterium tuberculosis Alternative SigmaFactor SigD and Its Role in Virulence[J].Journal of Bacteriology，

2004，186(19)：6605-6616]。我们研究发现R7蛋白在耐药菌株中都呈下降趋势，说明耐药性的出现可能会导致结核杆菌对宿主的侵染能力的下降，同时在体内潜伏的能力也会受到影响。

R8，CysK，Rv2334这个蛋白已经获得了晶体，完成了结构分析。是一种半胱氨酸酶。L-Cys的生物合成包括两个反应，第二步是由O-乙酰-L-丝氨酸硫醇裂合酶催化，以磷酸吡哆醛为辅基，用巯基替代O-乙酰基。由两种同功酶催化，其中之一就是CysK。它能够直接以硫化物为底物，生成L-Cys[Tobias 

Thomas Maier，ChristophWinterhalter，August 

Identification of a Major Facilitator Protein from Escherichiacoli Involved in Efflux of Metabolites of the Cysteine Pathway[J].Molecular

Microbiology，2000，36(5)：1101-1112]。Cys合成代谢是微生物吸收硫的主要方式，cysK基因发生突变，微生物体内几乎所有硫酸盐同化作用所需要的基因结构都发生了变化，因此，CysK除了在半胱氨酸生物合成中的催化作用以外，还是硫代谢相关基因的整体负调节子[Albanesi Daniela，Mansilla Maria Cecilia，Schujman Gustavo E.，de Mendoza Diego.Bacillus subtilis Cysteine Synthetase Is a Global Regulator of the Expression of GenesInvolved in Sulfur Assimilation[J].Journal of Bacteriology，2005，187(22)：7631-7638]。

在对Moorella thermoacetica的研究中发现，移去常规的还原剂之后，胞浆中的CysK被诱发表达。提示CysK可能和这种细菌抵抗氧的压力保护机制有关，令其耐受一定程度的好氧环境[Das Amaresh，Silaghi-Dumitrescu Radu，Ljungdahl Lars G.，Kurtz Jr.DonaldM.Cytochromebd Oxidase，Oxidative Stress，and Dioxygen Tolerance of the StrictlyAnaerobic Bacterium Moorella thermoacetica[J].Journal of Bacteriology，2005，

187(6)：2020-2029]。不过，在对M.tb好氧/厌氧培养下的比较蛋白质组学分析中，并未发现这个蛋白出现表达异常[Joakim Starck，Gunilla Kllenius，Britt-Inger Marklund，Dan I.Andersson，Thomas kerlund.Comparative Proteome Analysis of Mycobacteriumtuberculosis Grown Under Aerobic and Anaerobic Conditions[J].Microbiology，2004，150：3821-3829]。在所有临床菌株中，CysK都呈上调表达，因此，这个蛋白可能与M.tb耐药性关系不大。但这一现象说明，在临床菌株中，M.tb的氨基酸，尤其是Cys、Met、Ser的代谢发生了变化，同时对高氧环境的适应力上升，这也是对其生活环境和传播方式的适应。

R9，Rv2629保守的假定蛋白，功能未知。关于这个蛋白的研究至今未见，仅在一篇文献中提到[Jack C.Tarleton，Bert Ely.Isolation and Characterization of ilvA，ilvBN，andilvD Mutants of Caulobacter crescentus[J].Journal of Bacteriology，1991，173(3)：1259-1267]。在低浓度NO诱导或厌氧条件下Rv2629上调表达，所以被认为是环境压力下出现的特异性蛋白，是与潜伏感染有关的标志蛋白(Marker)。实验发现，在H37Rv中，这个蛋白不表达。临床全敏感菌株有微弱表达，但在包括全耐药的所有耐药菌株里，这个蛋白大量出现。与厌氧状态下的表达情况相近。可能细菌通过降低生活能力，进入潜伏状态来抵抗外界的不良环境，或以这种进入潜伏状态的方式降低与药物的作用效率，从而降低或抵抗抗生素对其的杀灭作用。

10#，ilvN，Rv3002c，这是在碱性蛋白胶面上检测到的新增点，所有耐药株中都存在，提示这个蛋白与M.tb耐药性的密切关系。ilvN存在于支链氨基酸代谢途径(Branched amino acid family)。乙酰羟酸合成酶(acetohydroxyacid synthases，AHAS)催化异亮氨酸和缬氨酸合成。在结核杆菌中存在2种AHAS同工酶，分别为AHAS I和AHAS II，前者由大亚基ilvB(Rv3003c)、ilvB2(Rv3470c)和小亚基ilvN(Rv3002c)构成，后者为单一亚基组成的酶——ilvG(Rv1820)，这同大多数原核生物的结构有很大差异[Lillian Eoyang，Philip M.Silverman.Role of Small Subunit(IlvN Polypeptide)ofAcetohydroxyacid Synthase I from Escherichia coli K-12 in Sensitivity of the Enzyme toValine Inhibition[J].Journal of Bacteriology，1986，166(3)：901-904]。IlvN决定了AHAS I对缬氨酸反馈控制的敏感性[Sharmila Anishetty，Mrudula Pulimi，Gautam Pennathur.Potential drug targets in Mycobacterium tuberculosis through metabolic pathway analysis[J].Computational Biology and Chemistry，2005，8：1-12]。Anishetty采用计算机分析人类和结核杆菌的的代谢通路，从KEGG的代谢数据库中结核杆菌的的生化代谢酶类同非冗余的人类蛋白质进行比对，筛选同宿主——人类蛋白质的相似性较低的酶，以作为潜在的药靶进行后续研究。共计有185个潜在的药靶，其中86个存在于氨基酸代谢途径。在缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸代谢途径中，IlvN(Rv3002c)同ilvC(Rv3001c)、ilvDRv018c]、异丙基苹果酸合成酶leuA(Rv3710)和异丙基苹果酸脱氢酶小亚基leuD(Rv2987c)都可能为作为潜在的药靶筛选抗结核药物[Sharmila Anishetty，Mrudula Pulimi，GautamPennathur.Potential drug targets in Mycobacterium tuberculosis through metabolic pathwayanalysis[J].Computational Biology and Chemistry，2005，8：1-12]。通过蛋白质组学分析发现，IlvN在临床耐药株中的新增表达，这种模式使其可以成为有效的抗结核，尤其是抗耐药结核的药物设计靶标和可能的耐药检测标准。

R11，DevR，Rv3136，结核分支杆菌双组分调节家族中的转录调节因子，是M.tb中低氧状态信号中最早的介导子[Heui Dong Park，Kristi M.Guinn，Maria I.Harrell，ReilingLiao，Martin I.Voskuil，Martin Tompa，Gary K.Schoolnik，David R.Sherman.Rv3133c/dosRis a Transcription Factor That Mediates the Hypoxic Response of Mycobacteriumtuberculosis[J].Molecular Microbiology，2003，48(3)：833-843]。M.tb在宿主的潜伏状态与低氧条件有关。几乎所有低氧条件相关的基因表达都需要DevR的诱导，其编码基因Rv3133c位于这些基因的上游[David R.Sherman，Martin Voskuil，DirkSchnappinger，Reiling Liao，Maria I.Harrell，Gary K.Schoolnik.Regulation of theMycobacterium tuberculosis Hypoxic Response Gene Encoding a-crystallin[J].PNAS，2001，98(13)：7534-7539]。Rv3133/DosR与低氧相关基因上游的小的热休克蛋白α晶体状球蛋白(Acr)结合在一起，共同完成调节作用。而Acr在还原条件下的诱导表达也需要DevR，在低氧、加入CO₂的环境下，DevR可以诱导Acr类蛋白的下调表达，它可能是许多ACG家族成员启动子的普遍调节子。可见Rv3133是M.tb在低氧潜伏生长时必需的[Matthew A.Florczyk，Lee Ann McCue，Anjan Purkayastha，Egidio Currenti，Meyer J.Wolin，Kathleen A.Mcdonough.A Family of acr-Coregulated Mycobacterium tuberculosisGenes Shares a Common DNA Motif and Requires Rv3133c(dosR or devR)forExpression[J].Infection And Immunity，2003，71(9)：5332-5343]。

M.tb在体内的感染会导致肉芽肿的出现，在肉芽内，结核分支杆菌以一种静止的不复制的抗性状态存在，但具体的情况很少有报道。推测肉芽内的低氧状态作为结核分支杆菌潜伏性持续感染的信号引起了人们的普遍关注。在这个过程中，RV3133的作用至关重要。

临床耐药菌株中，DevR全部上调表达，敏感株中表达量不变。此时，大量的DevR诱导Acr类蛋白的下调表达，促进菌体进入非复制抗性状态。结核杆菌的潜伏感染一直是一个严重的公共健康问题。现有的抗结核药物都是针对活跃生长状态的细菌，休眠状态病原菌的存在使得传统的结核治疗更加困难。Rv3133蛋白的发现，为我们控制治疗潜伏感染的结核病，耐药性结核都提供了新的线索。

目前的实验发现在所有结核分支杆菌样本中及检验的临床分离株中devR都存在，在M.tb毒株中出现表达差异。临床上通过扩增Rv3133(devR)基因的250-500bp片段，可以提高PCR法检测病例的灵敏性和有效性[Soumitesh Chakravorty，Divya Pathak，MriduDudeja，Sagarika Haldar，M.Hanif，Jaya Sivaswami Tyagi.PCR Amplification of ShorterFragments From the DevR(Rv3133c)Gene Significantly Increases the Sensitivity ofTuberculosis Diagnosis[J].FEMS Microbiol Lett，2006，257：306-311]。我们的蛋白质组学检测结果很好地验证了前人的工作成果。

R12，PPE，值得注意的是，在我们的实验中还筛选到一个PPE家族成员Rv3136c。但它的具体功能未见报道，以前的研究也曾发现有些PE、PPE成员在体内表达[SinghK.K.，Zhang X.，Patibandia A.S.，Chien P.J.R.，Laal S.，Antigens of Mycobacterium tuberculosisExpressed During Preclinical Tnb-erculosis：Serological Immunodominance of P-roteins withRepetitive Amino Acid Sequence[J].Infection and Immunity，2001，69(6)：4185-4191；TriccasJ.A.，Berthet F.X.，Pelicic V.，et al.Use of Fluorescence Induction and SucroseCounterselection to Identify Mycobacterium tuberculosis Genes Expressed Within HostCells[J].Microbiology-UK，1999，145：2923-2930；李霆，高志勇，王恒樑，冯尔玲，陈宗德，李新月，黄留玉，黄翠芬。应用体内诱导抗原技术筛选结核分枝杆菌体内表达基因遗传学报[J].2005，2(2)：111-117.]。PPE蛋白家族被称为结核杆菌的“分子咒语”，因为这一家族蛋白数量巨大，分别包含100和67个成员，占结核杆菌基因组的8％，但功能却远不清楚。现有研究初步表明，部分PE、PPE蛋白可能是细胞表面抗原，与结核杆菌毒力、致病性相关。另外，PE/PPE家族蛋白的序列高度同源，对单个基因进行分子与理化分析十分困难[Sailu Yellaboina，Jayashree Seshadril，M.Senthil Kumar，Akash Ranjan.PredictRegulon：a Web Server for the Prediction of the Regulatory Protein Binding Sites andOperons in Prokaryote Genomes[J].Nucleic Acids Research，2004，32：318-320]。在我们的研究中，这个蛋白在临床菌株中普遍下降或缺失。可能临床株中Rv3136的表达下降，但更大的可能是这个蛋白被分泌到胞外，作为一种抗原加强临床株的致病能力。

13#，nuoB，Rv3146，这个蛋白属于NADH-脱氢酶的B链，或者叫做NADH-COQ氧化还原酶B链。蛋白的晶体结构已经研究出来，作为呼吸作用催化酶的亚单位，nuoB的功能比较明确，关于其报道不多。近年的文献仅有一篇提到nuoB可能是M.tb转录调节子LexA的结合位点，但只是根据B.subtilis的LexA基因序列设计的比对引物，这种数据库比对结果还需要进一步实验验证。在耐药株的碱性蛋白分析中发现，这个蛋白的表达波动很大，但并不同步。利福平单耐药菌株中nuoB消失，但全耐药菌株中的表达量上升。说明M.tb的耐药性与其呼吸作用的变化相关，但不同的耐药模式，对呼吸作用的影响是不同的，可能各种耐药菌株会有特异性的耐药机制。

综合13个利福平耐药相关蛋白的功能，发现其中3个蛋白(Rv2159、Rv2629和DevR)的功能直接与结核分支杆菌潜伏性持续感染相关，耐药菌株中的变化模式都导致对宿主的侵染能力下降、生活能力降低、进入潜伏状态等的出现，M.tb以这种方式降低与药物的作用效率，从而降低或抵抗抗生素对其的杀灭作用，提高耐药性。这提示，临床耐药菌株的侵染性、生活能力会有所下降，但可以通过进入休眠状态逃避药物作用，结合菌体内其他蛋白的综合作用，使其保持一定的生物活性和耐药性、传染性。

                                                    表1利福平单耐药菌株差异蛋白的鉴定结果

序号.	蛋白	NCBI中gi号	座位标签	PMF分值	串联质谱(MS/MS)	pI(理论值/实验值)	MW(理论值/实验值)	临床菌株的表达情况
									R1R2R3R4R5	SsbHypothetical proteinHypothetical proteinBfrBOpcA	gi|15607196gi|15607210gi|15608067gi|15610977gi|15608584	Rv0054Rv0068Rv0927Rv3841Rv1446	234(5/6)58(5/11)132(6/11)112(6/10)143(6/18)	母离子：1655.885MH+肽段：TVIEVEVDEIGPSLR      分值：43母离子：1793.918MH+肽段：TPSGAAVANFTVASTPR    分值：89母离子：1957.0236MH+肽段：AGDTTITIVGNLTADPELR  分值：55母离子：1499.6913MH+肽段：GGQYFGPDGFGEIR       分值：11母离子：1418.7122MH+肽段：TSSELDAVAEQIR        分值：71母离子：2056.1548MH+肽段：GASLRGAAIALAFAQAGADVLI分值：16母离子：1228.6531MH+肽段：EALALALDQER          分值：21母离子：1550.796MH+肽段：AGANLFELENFVAR       分值：49母离子：1212.731MH+肽段：AVGELKVELVR          分值：29母离子：1360.7218MH+肽段：VGADAGAGEFVVLR       分值：38母离子：1237.7262MH+肽段：TGKPDALVPLAR         分值：15	4.84/5.128.82/8.075.6/5.494.47/4.734.98/5.2	17320.99/17342.632398.79/3237926745.62/26729.120441.93/20429.232717.49/32697.4	下降消失消失增加下降

R67#R8R910#R11R1213#

Antigen 84Hypothetical proteinCysKHypothetical proteinilvNDevRPPEnuoB

AG84_MYCTUgi|15609296gi|15609471gi|15609766gi|15610139gi|15610269gi|15610272gi|15610282

Rv2145Rv2159Rv2334Rv2629Rv3002Rv3133cRv3136Rv3146

133(6/16)189(5/13)91(6/12)187(4/15)70(2/3)9073(6/7)55(4)

母离子：1565.7805MH+肽段：TYLESQLEELGQR       分值：10母离子：1995.879MH+肽段：GFNSRAAPVDSNADAGGFDQ分值：81母离子：1515.7914MH+肽段：IGTWIGAAAEGQVSR     分值：12母离子：2147.1455MH+肽段：LAAALRLTGLAPHQVTDDDVA分值：70母离子：1356.7885MH+肽段：LIVVVLPDFGER        分值：32母离子：2028.0085MH+肽段：YFVPQQFENPANPAIHR   分值：17母离子：1194.7205MH+肽段：IAPLDGVGALLR        分值：14母离子：1801.933MH+肽段：LVDAADPEVVFVSGEVR   分值：10母离子：1275.7054MH+肽段：SQVIEAVNLFR         分值：38母离子：1477.8485MH+肽段：VPAARPDVAVLDVR      分值：21母离子：1559.7886MH+肽段：MDFALLPPEVNSAR      分值：62

4.52/4.87.82/7.214.93/5.25.01/5.28.52/7.935.45/5.624.11/4.377.95/7.68

28277.1/28260.136376.38/36353.932752.62/32732.340839.76/4090018186.89/18175.823261.87/23279.337979.75/37956.220186.78/20433.5

增加下降增加新出现新出现增加下降消失

Claims (8)

1.一种筛选结核杆菌耐药蛋白的方法，其特征在于，该药物为3-{〔(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基〕甲基}-利福霉素，该方法包括以下步骤：

(1)对结核杆菌菌株分别在相同的条件下加药物或者不加药物培养，以最低抑菌浓度为16μg/ml的菌株为耐药菌株；

(2)分别分离耐药菌株和不加药菌株中的蛋白；

(3)将耐药菌株和不加药菌株中的蛋白进行对比，以在耐药菌株中增加或者缺失的蛋白，或者表达量增加至少2倍的蛋白，或者表达量减少至少50％的蛋白为耐药蛋白；

(4)分离鉴定耐药蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中仅保留耐药菌株和不加药菌株中的碱性蛋白。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中检测最低抑菌浓度和步骤(2)中分离提取蛋白的所用菌株均为处于对数生长期的结核杆菌。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)中采用电泳、离心，盐析、过滤或者层析方法分离蛋白。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中通过蛋白电泳图谱分析、蛋白测序、质谱分析或者氨基酸组成分析的方法鉴定蛋白。

6.如权利要求1所述方法的应用，其特征在于，将步骤(4)得到的耐药蛋白作为药靶，筛选或者检测抗结核药物。

7.如权利要求1所述方法的应用，其特征在于，将步骤(4)得到耐药蛋白的基因进行突变，并用于构建疫苗。

8.如权利要求1所述方法的应用，其特征在于，根据步骤(4)得到的耐药蛋白检测结核杆菌耐药菌株。

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