CN103983627A - 作为抗结核病药的吡啶并嘧啶化合物 - Google Patents

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Abstract

一种作为抗结核病药的吡啶并嘧啶化合物。本发明涉及小分子化合物及其在治疗细菌感染、特别是肺结核中的应用。

Description

作为抗结核病药的吡啶并嘧啶化合物
本申请是申请日为2009年6月17日、申请号为200980128440.2、发明名称为“作为抗结核病药的吡啶并嘧啶化合物”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及小分子化合物及其在治疗细菌感染、特别是肺结核中的应用。
发明背景
肺结核(TB)作为疾病每年持续导致数以百万计的死亡。化疗的不充分应用已经导致抗药性病例的数量逐步增加。这种情况可能恶化对所有目前已知药物的极端耐药性株的出现(Van Rie和Enarson，2006)。国际上推荐的TB控制策略、也称作直接观察到的短程化疗(DOTS)依赖于5种抗菌药的组合服用超过6个月的延长期限(http://www.who.int/tb/dots/en/)。由于使用了数学模型、考虑到了治疗期限和TB动力学，所以预测减少治疗期限的有益性是显著的并且能够极大地促进总体TB负担下降(Salomon等人，2006)。
目前化疗由通过中和一般信息途径和关键过程(例如RNA聚合和蛋白质合成抑制)或通过干扰分枝杆菌特异性细胞包膜合成直接靶向结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)杆状菌的化合物组成。最广泛使用的专用抗结核药异烟肼、乙硫异烟胺和吡嗪酰胺是第一种需要活化的前体药物。当活性成分形成时，它们显示对尚未完全得到表征的广泛分枝杆菌靶标的抑制活性。就其他慢性感染性疾病(如人免疫缺陷病毒)而言，迄今为止经证实多-疗法手段(包括靶向结核分枝杆菌广泛关键特征的药物)是最成功的策略。因此，可能的情况是具有对结核分枝杆菌不同作用机制的目前药物抑制剂的组合会解决控制疾病的问题。
用于研发新抗-TB药的最具有挑战性的手段依赖于筛选靶向杆状菌存活必需的关键特征的活性化合物。尽管仍然缺乏对在人体中结核杆菌持久性后面的生物学机制即潜在菌的位置和状态的理解，但是认为结核分枝杆菌居留于低氧条件下的初期肉芽肿中(Lenaerts等人，2007)并且隐藏于各种类型的细胞内(Houben等人，2006；Neyrolles等人，2006)。杆状菌主要位于吞噬细胞例如巨噬细胞和树突细胞内部，并且显然已经确立与胞外条件中的生长相比，结核杆菌采取了宿主巨噬细胞吞噬体内的不同表型(Rohde等人，2007；Schnappinger等人，2003)。在感染时，诱导炎症应答，由此开始募集释放白细胞介素和细胞因子的T淋巴细胞，由此活化感染的巨噬细胞以便能够破坏病原体。在适合的触发后，宿主巨噬细胞由此能够消除侵入的杆状菌。这一结果进一步得到如下事实的支持：吸入结核分枝杆菌的人有95％以上不发病，从而启示在大部分病例中人体宿主应答足以阻止结核分枝杆菌诱导的发病机制。这产生如下推定：小分子化合物可以模拟免疫细胞应答信号并且诱导宿主细胞清除分枝杆菌。
因此，本发明的一个目的在于研发适合于高流通量筛选的基于表型细胞的测定法，所述高流通量筛选能够搜索到可以预防结核分枝杆菌在宿主巨噬细胞内部繁殖的化合物。
迄今为止，这种类型的结核杆菌在宿主细胞内的生长研究依赖于宿主细胞裂解后的菌落形成单位(CFUs)测定、然后是系列稀释和细菌在琼脂板上生长所需的3-周温育期限。已经证实表达荧光素酶的分枝杆菌有效减少实验期限，不过，仍然需要细胞裂解和荧光素底物添加步骤(Arain等人，1996)。此外，这些类型的实验不易于进行大规模筛选。
本发明的另一个目的在于鉴定对细菌感染有效的化合物，特别是可以预防结核分枝杆菌在宿主巨噬细胞内繁殖的化合物。
本发明的描述
本发明在一个方面中涉及具有通式VIII的化合物：
其中
m是0、1、2或3；
X3选自CH2、O、S和NH；
X4选自卤化物、烷基、OR23、SR24和NR25R26；
R20选自酰基、烷氧基、烷基、烷基氨基、烷基羧酸、芳基羧酸、烷基羧酸烷基酯、亚烷基、烷基醚、烷基羟基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧酸，氰基、环烷基、羧酸、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、卤代烷基醚，杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基和氢，它们中的任意一个任选被取代；
R21和R22各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷基醚、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基醚、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代；
R23选自酰基、烷基、烷基氨基、亚烷基、炔基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、环烷基、酯、醚、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、氢、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代；
R24选自烷基、烷基芳基、亚烷基、炔基、芳基、环烷基、酯、卤素、卤代烷基、杂芳基、杂环烷基和氢，它们中的任意一个任选被取代；且
R25和R26各自独立地选自酰基、烷基、氨基烷基、亚烷基、烷硫基、炔基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、环烷基、酯、醚、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、卤代烷基醚、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基和氢，它们中的任意一个任选被取代。
一般而言，本文所用的术语“任选取代的”意指基团(例如烷基、亚烷基、炔基、芳基、环烷基、杂环烷基或杂芳基)可以未被取代或被一个或多个取代基取代。涉及基团的“取代的”表示基团内连接成员原子的氢原子被替代。
本发明在另一个方面中涉及具有通式VIIIa的化合物：
其中
X5选自CH2、C＝O和C＝S；
Z1和Z2各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷基醚、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基醚，芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素，卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基和氢或两个基团彼此连接成5或6元环、杂环和杂芳基环，它们中的任意一个任选被取代；
R27和R28各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷基醚、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基醚、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代；
R29和R30各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷基醚、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基醚、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基或两个基团彼此连接成5或6元环、杂环、芳基和杂芳基环，它们中的任意一个任选被取代。
本文所用的术语“烷基”意指例如取代或未取代的具有直链或支链的C1-C10烷基的基团。
本文所用的术语“环烷基”意指表示例如取代或未取代的C3-C8环结构的环状化合物的基团。
本文所用的术语“杂芳基”意指例如取代或未取代的5－9元芳族化合物的基团，在其环结构自身中具有一个以上N、O和S的杂原子。
本文所用的术语“任选取代的”意指表示基团内与成员原子连接的氢原子可能被基团替代，所述基团例如C1-C10烷基、卤素(包括氟)、OH、NO2，OR31、CN、NR31R32、COR31、SOR32、SO2R31、SO2NR31、CR31＝CR31R32、CR31＝NR32、芳基、芳基氧基、C4-C10杂芳基或–NR31-COR32，-O-COR31。
R31和R32各自独立地选自氢、烷基、烷基氧基、烷基氨基、烷基羰基、烷基羰基氨基、烷基羰基氧基、烷基氨基羰基、烷基氧基羰基、环烷基、环烷基氧基、环烷基氨基、环烷基羰基、环烷基羰基氨基、环烷基羰基氧基、环烷基氨基羰基、环烷基氧基羰基、杂芳基、杂芳基氧基、杂芳基氨基、杂芳基羰基、杂芳基羰基氨基、杂芳基羰基氧基、杂芳基氨基羰基、杂芳基氧基羰基、杂芳基烷基、杂芳基烷基氧基、杂芳基烷基氨基、杂芳基烷基羰基、杂芳基烷基羰基氨基、杂芳基烷基羰基氧基、杂芳基烷基氨基羰基、杂芳基烷基氧基羰基、苯基、苯基氧基、苯基氨基、苯基羰基、苯基羰基氨基、基羰基氧基、苯基氨基羰基和苯基氧基羰基，它们中的任意一个任选被取代。
本发明在另一个方面中涉及具有如实施例7所示的式125-301之一的式的化合物，优选如表4所示的132-135、137、139-140、147、151-152、160、163、173、180、184-185、193、195、199-201、204、206-222、224、226、229、231-243、245-278、280-286和290-301。特别优选的化合物是具有如表4所示的式133、232和264之一的化合物。
本发明在一个方面中涉及具有通式II的化合物：
其中
R5和R6各自独立地选自酰基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、环烷基、酯、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、磺酸、磺酸盐、磺酸酯和磺酰基，它们中的任意一个任选被取代，且
R7、R8和R9各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代。
本发明在另一个方面中涉及具有通式II的化合物，其中R5和R6连接，具有式IIa：
其中
n是0、1、2或3；
Y和Z各自独立地选自CH2、CHOR10、CHNR10R11、CR10R11和NR10；且
R10和R11各自独立地选自酰基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、环烷基、酯、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、氢、磺酸、磺酸盐、磺酸酯和磺酰基，它们中的任意一个任选被取代。
本发明在另一个方面中涉及具有如表2所示的通式/骨架II之一的化合物和如实施例6所示的式1-123之一的化合物，优选如表4所示的1-24、26-34、54、56、58-61、63-64、67、90-101、103-105、107-109、112、114-116和118-121。特别优选的化合物是具有如表4所示的式4和24之一的化合物。
优选如上述所定义的化合物对宿主细胞内部(优选对巨噬细胞内部)细菌生长(优选结核分枝杆菌生长)具有抑制活性，优选抑制活性高于65％，抑制浓度为5-20μM，优选低于5μM。
本发明在一个方面中涉及如上述所定义的用于治疗细菌感染的化合物。
本发明在一个方面中涉及如上述所定义的用于治疗肺结核的化合物。
本发明在一个方面中涉及包含如上述所定义的化合物的药物组合物。
本发明在一个方面中涉及治疗肺结核的方法，其包括对有此需要的人施用适量的如上述所定义的化合物。
本发明在另一个方面中涉及具有如表3所示的通式/骨架I、III-VII和IX-XX之一的化合物。
本发明在一个方面中涉及具有通式I的化合物：
其中
X1和X2各自独立地选自CH和NH；
R1和R2各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代；且
R3和R4各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、氰基、环烷基、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基和氢，它们中的任意一个任选被取代。
本发明在一个方面中涉及具有通式III的化合物：
其中
R10和R11各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代。
本发明在另一个方面中涉及具有通式IV的化合物：
其中
A是任选取代的杂芳基、萘基和苯基，且
R12选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代。
本发明在一个方面中涉及具有通式V的化合物：
其中
R13、R14和R15各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代。
本发明在另一个方面中涉及具有通式VI的化合物：
其中
R16选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、炔基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、环烷基、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基和氢，它们中的任意一个任选被取代，且
R17选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代。
本发明在一个方面中涉及具有通式VII的化合物：
其中
R18和R19各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基和氢，它们中的任意一个任选被取代。
本发明在另一个方面中涉及具有如表2所示的通式I、III-VII和IX-XX之一的化合物。
本发明在一个方面中涉及表1中举出的化合物。
本发明在一个方面中涉及如上述所定义的用于治疗细菌感染的化合物。
本发明在一个方面中涉及如上述所定义的用于治疗肺结核的化合物。
本发明在一个方面中涉及包含如上述所定义的化合物的药物组合物。
本发明在一个方面中涉及治疗肺结核的方法，包括对有此需要的人施用适量的如上述所定义的化合物。
本发明在另一个方面中涉及筛选方法，包括下列步骤：
(a)用荧光标记的结核分枝杆菌分批感染宿主细胞；
(b)除去游离的未结合分枝杆菌；
(c)将测试化合物添加到多孔板上；
(d)将感染了荧光标记的结核分枝杆菌的所述宿主细胞接种入包含所述化合物的所述多孔板；
(e)温育包含感染了荧光标记的结核分枝杆菌和所述化合物的宿主细胞的所述多孔板；
(f)荧光标记所述宿主细胞；
(g)使用自动化共焦显微镜检查分析所述多孔板。
本发明的筛选方法代表了基于表型细胞的测定法，其能够寻找干扰宿主巨噬细胞内结核分枝杆菌繁殖的药物。该测定法利用了感染了荧光标记的分枝杆菌的荧光标记的活巨噬细胞和使用自动化共焦显微镜检查测定胞内分枝杆菌生长。设置该测定法用于高流通量筛选(HTS)大规模化学品库。
图和表
现在涉及图和表，其中
图1显示通过自动化共焦显微镜检查监测结核杆菌在巨噬细胞内的细胞内生长：(a)感染了结核分枝杆菌H37Rv-GFP的Raw264.7细胞在感染后不同时间点的有代表性的图片。(b)图像分析：1：典型2-色图像；2：环形物体对应于检测细胞；3：环形物体对应于细菌聚集物；4：充满的紫色细胞对应于感染细胞(c,d,e)。基于图像的感染细胞百分比定量和以0.5感染复数感染H37Rv-GFP后2小时－7天的细胞平均数(灰色正方形)、1(黑色圆圈)和2(深灰色三角形)。未感染的细胞(黑色菱形)用作阴性对照；
图2显示体外生长荧光测定和基于表型细胞的测定中对照药物的药理学验证和MIC(最小抑制浓度)比较：(a)在1μg/mL INH或DMSO对照品的存在下感染细胞的有代表性的图片(b,c,d)。INH、利福平和乙硫异烟胺的剂量应答；黑色正方形和线对应于基于细胞的测定中的生长抑制；灰色圆圈和线对应于体外生长抑制；所示的是有代表性的数据组；
图3显示基于表型细胞的测定的测定自动验证：(a)相对于384-板孔-指数的结核分枝杆菌感染细胞百分比。黑色正方形、深灰色正方形、灰色正方形和空心正方形分别对应于INH1μg/mL、利福平5μg/mL、PBS和DMSO对照品。(b,c)相对于INH和利福平浓度的结核分枝杆菌感染细胞百分比。在两个独立的天对4个不同板进行实验；
图4显示26500种化合物基于表型细胞的测定和体外生长测定的初步筛选结果：(a)基于相对于每种化合物和分布的感染比的抑制百分比。(b)基于相对于每种化合物和分布的RFU的抑制百分比。(c)基于每种化合物的表型细胞的测定和体外生长测定的抑制百分比比较；
图5显示来自体外生长荧光测定和基于表型细胞的测定的系列稀释结果：抑制体外细菌生长(a,b,c)体外和胞内生长(d,e,f)和仅胞内生长(g,h,i)的化合物的典型曲线。(a,d,g)相对于化合物浓度的感染比。(b,e,h)相对于化合物浓度的细胞数量。(c,f,i)相对于化合物浓度的相对荧光强度。化合物浓度以M给出；
图6显示(a)测定自动化流程图。(b)384-板格描述；(c)384-板剂量-响应曲线描述，A－P和a－b分别对应于20mg/mL起始浓度的INH和利福平在孔A或a中的2-倍系列稀释；RIF：利福平5μg/mL，Cpd：化合物，INH1001μg/mL，INH500.05μg/mL；
图7显示以MOI2.5：1感染7天后化合物4和24(5μM)对结核分枝杆菌H37Rv-GFP在(a)Raw267.4(104细胞)、(b)小鼠骨髓衍生的巨噬细胞和(c)用50ng/mL rhM-CSF(1.5*104)分化的人初级巨噬细胞中的抗肺结核效果(对照品INH为5μM)；
图8示例从感染结核分枝杆菌H37Rv后不同时间点的巨噬细胞中回收的菌落形成单位(CFUs)。以MOI1：1感染Raw264.7细胞(a)或鼠BMDM(b)并且用所示量的吡啶并嘧啶酮化合物232(20μM)与DMSO、INH(10μM)和RIF(10μM)作为对照品处理；
表1举出340种命中化合物，其抑制活性在胞内(QIM)试验或体外(QUM)试验中得以证实，其中缩写“QIM”表示胞内分枝杆菌定量，缩写“QUM”表示体外生长的分枝杆菌定量，缩写“CellNb”表示细胞数量；
表2举出了121种化合物，其在2μM显示高于65％的抑制活性，在20μM没有任何明显的细胞毒性且由此选择它们用于进一步通过10种3-倍系列稀释证实；
表3概述了表2中举出的121种命中化合物的独立/一般分子骨架/式；
表4举出具有其相应抑制活性的二硝基苯甲酰胺和吡啶并嘧啶酮衍生物(分别为一般骨架II和VIII，参见表3)，其中粗印刷体形式的数字意指实施例6和7中举出的化合物；
表5显示二硝基苯甲酰胺化合物4和24的细胞毒性和抗菌谱(参见表4)；
表6显示吡啶并嘧啶酮化合物133的细胞毒性和抗菌谱(参见表4)；且
表7显示有代表性的二硝基苯甲酰胺和吡啶并嘧啶酮化合物的自发耐药性频率。
实施例
现在参照预以示例的如下实施例进一步描述本发明，但不限制本发明的范围。
材料和方法
遗传构建体和分枝杆菌菌株
表达绿色荧光蛋白(H37Rv-GFP)的结核分枝杆菌H37Rv重组菌株通过转化整合质粒得到(Abadie等人，2005；Cremer等人，2002)。在来源于Ms6分枝杆菌噬菌体的该质粒内，克隆gfp基因并且在强分枝杆菌启动子pBlaF控制下组成型表达。由补充了白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(ADC，Difco，Sparks MD，USA)、甘油和0.05％Tween80的400mL15日龄Middlebrook7H9培养物(Difco，Sparks MD，USA)制备用于结核分枝杆菌H37Rv-GFP的电效能细胞。通过以3000g离心20min收集杆菌，在室温用H2O洗涤两次，再离心后在室温重新悬浮于1-2mL10％甘油。将250μl杆菌与编码绿色荧光蛋白的质粒混合并且使用Biorad Gene Pulser(Biorad)电穿孔。电穿孔后，将杆菌重新混悬于培养基并且在37℃静置1天。在补充了油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(OADC，Difco，Sparks MD，USA)和50μg/mL潮霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA USA)的Middlebrook7H11培养基(Difco，Sparks MD，USA)上选择转化体。选择的潮霉素耐药性和绿色荧光蛋白菌落在3周后出现。使100mL H37Rv-GFP菌株培养物生长在补充了0.05％Tween80和50μg/mL潮霉素的Middlebrook7H9-ADC培养基上。收集细菌，洗涤两次，混悬于50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)。然后超声处理细菌，使其静置1小时，以使残留聚集物沉降。然后等分细菌悬浮液并且在-80℃冷冻。将单一解冻的等分部分在接种前用于定量CFUs(菌落形成单位)并且典型储备溶液浓度约为2－5x108CFU/mL。
宿主细胞
使50ng/mL PMA(Sigma)分化的小鼠巨噬细胞细胞系Raw264.7(ATCC#TIB-71)，J774A.1(ATCC#TIB-67)或人单核细胞(ATCC#TIB-202)生长在具有10％热灭活胎牛血清(Gibco)的RPMI1640(Gibco)中。
化学化合物
将来自筛选库的小合成分子以10mM的浓度(Master板)混悬于Corning96孔澄清V-形底聚丙烯板(Corning，#3956)的纯DMSO(Sigma，D5879-500mL)中。然后将该化合物重新定格于Greiner384孔V-形聚丙烯板(Greiner，#781280)并且用纯DMSO稀释至2mM终浓度。将该化合物保持冷冻至使用为止。为了筛选，将化合物板在室温温育至融化。使用EVObird液体操纵器(Evotec Technologies)将该化合物从DMSO储备溶液中直接加入到测定板中，两次转入250nl化合物，以达到最终稀释液为1：100。这种一步稀释降低了化合物沉淀在中间板中的风险并且允许低DMSO最终浓度(1％)。
手动将阳性对照抗生素(异烟肼(Sigma，I3377-50G)和利福平(Euromedex，1059-8，5g))和阴性对照(DMSO)加入到各板的1-2和23-24栏中(板描述参见图6b)。
总计测试26500种化合物。这些化合物来源于来自Timtec的商品库(25000种来自ActiProbe不同库，1000种来自激酶抑制剂ActiTargK库，500来自蛋白酶抑制剂ActitargP库)。基于高度差异性和药物类特性选择筛选的化合物(使用Lipinski五规则(Lipinski等人，2001))。首先以一种浓度筛选它们(初步筛选，浓度＝20μM)。然后通过在3种浓度(20、2和0.2μM)测试证实选自初步筛选的“阳性”化合物，以鉴定最具有活性的成分和/或采用10种3-倍稀释液(20μM－0.5nM)。
巨噬细胞侵入测定设置
首先以20,000细胞/孔的密度将细胞接种在50μl384-孔板(Evotectechnologies#781058)中16小时，然后以10：1－1：1(细菌：宿主细胞)的感染复数(MOI)感染细菌悬浮液。2小时后，用磷酸缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤三次，加入在新鲜培养基中稀释的化合物。将细胞在37℃、5％CO2温育达7天。
巨噬细胞分批感染测定扩大
在37℃与振摇(100rpm)下使细胞(1.5x108细胞)感染在300mL中MOI1：1的H37Rv-GFP悬浮液2小时。通过以1100rpm离心(Beckman SX4250，165g)5min.进行2次洗涤后，通过1小时阿米卡星(20μM，Sigma，A2324-5G)处理杀灭来自感染细胞悬浮液的剩余胞外杆菌。最终离心步骤后，用Wellmate(Matrix)将细胞分配入预先用10μl细胞培养基稀释的相应化合物预先铺板的384-孔Evotec板(#781058)。然后在化合物的存在下在37℃、5％CO2将感染细胞温育5天。5天后，用SYTO60(Invitrogen，S11342)给巨噬细胞染色，然后进行板封闭和图像获取。在筛选过程中，每隔2小时对一组三个板进行活细胞染色一次，以限制因与细胞化学染料一起延长温育导致的细胞死亡。
图像获取和数据分析
用使用20X-water物镜(NA0.70)、488-nm和635-nm激光和488/635初级分色镜的自动化荧光共焦显微镜OperaTM(EvotecTechnologies)记录共焦图像。然后使用专用内部图像分析软件(IM)加工每一图像。测定的参数是总细胞数和感染细胞数。简言之，算法首先使用如其他文献所述(Fenistein等人，原稿印刷中)的加工步骤顺序截取红色通道上的细胞。一般基于如下顺序：1)限定原始图像的直方图范围(3类K-mean)；2)高斯过滤具有设置等于细胞平均半径的标准偏差的原始图像；3)搜索提供作为接种的细胞中心的过滤图像的局部极大值，以用于4)确定每一细胞自身表面的区域生长；和最终5)除去作为潜在人为现象或噪声的极小细胞。该步骤提供了红色通道中的总细胞数。然后将感染细胞定义为具有至少指定数量(通常为3)像素的那些，其在绿色通道中的强度高于指定强度阈值。感染细胞与总细胞数之比是所关注的测量值(称作感染比)。对每一孔而言，记录4个图像，而就每一参数而言，使用4个图像的平均值。
然后使用ActivityBase(IDBS)加工获自胞内测定图像分析或常规抗菌测定的数据(参见下文)，以计算统计学数据(％抑制，每一化合物的Z得分，对照板的Z’、CV等)并且将数据储存在Oracle数据库中。使用各种软件包(包括Spotfire(Tibco)和Pipelinepilot(Accelrys))进行有关筛选和命中鉴定的质量控制的其他分析。
体外需氧菌生长测定
用补充了0.05％Tween80的Middlebrook7H9-ADC培养基以1.5x106CFU/mL稀释结核分枝杆菌H37Rv-GFP的冷冻等分部分。首先用EVOBird(Evotec)在补充了0.05％Tween80的10μl Middlebrook7H9-ADC培养基中调配的0.5μl化合物预先在Greinerμclear-黑色384-孔板(Greiner，#781091)上铺板。然后将40μl稀释的H37Rv-GFP细菌悬浮液加入到稀释化合物上部，导致最终体积为包含1％DMSO的50μl。将板在37℃、5％CO2温育10天，然后使用Victor3读出器(Perkin-Elmer Life Sciences)记录GFP-荧光。
巨噬细胞感染测定和图像分析
在37℃与振摇下(100rpm)使Raw264.7(ATCC#TIB-71)(1.5*108细胞)感染MOI为1:1的H37Rv-GFP(Abadie等人，2005，Cremer等人，2002)悬浮液2小时。通过离心进行2次洗涤后，通过1小时阿米卡星(20μM，Sigma，A2324)处理杀灭来自感染细胞悬浮液的剩余胞外杆菌。最终离心步骤后，将细胞分配入预先用化合物和对照品预先铺板的384-孔Evotec板(#781058)。然后在37℃、5％CO2将感染细胞温育5天。如上所述产生鼠骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)(Brodin等人，2006)。简言之，从6周龄雌性小鼠(C57BL/6，Orientbio)的股骨和胫骨中提取细胞并且在包含10％热灭活胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基(来自Invitrogen的Carlsbad，CA)和10％L-929细胞条件培养基中培养。外周血单核细胞(PBMC)分离自来自健康志愿者的血沉棕黄层。用15ml Ficoll-Paque Plus(Amersham Biosciences，Sweden)处理用补充了1％FCS的PBS稀释的血沉棕黄层并且以2500×g离心20min。通过CD14+珠分离(Miltenyi Biotec，Germany)得到PBMC，用PBS(1％FCS)洗涤3-次，转入包含RPMI1640培养基、10％FCS和50ng/ml重组-人巨噬细胞集落刺激因子(R&D系统，Minneapolis)的75cm2培养烧瓶。在37℃使6日龄贴壁鼠BMDM和PBMC衍生的人巨噬细胞感染MOI1：1的H37Rv-GFP(Abadie等人，2005)悬浮液2小时，然后充分洗涤，最终与化合物或对照品一起温育。几天后，用SYTO60(Invitrogen，S11342)染色巨噬细胞并且用整合了OperaTM(20X-water物镜，NA0.70)并且置于BSL-3安全实验室中的EVOscreen-MarkIII全自动平台(PerkinElmer)进行图像获取。使结合了535/50nm检测过滤器的488-nm激光器检测分枝杆菌-GFP并且使用结合了690/40nm检测过滤器的635-nm激光器标记细胞。记录每一板孔的4个视野，然后如其他文献中所述(Fenistein等人,印刷中)使用专用内部图像分析软件(IM)加工每一图像。
分枝杆菌菌株和体外细菌生长测定
结核分枝杆菌H37Rv、H37Ra和BCG Pasteur用作参比菌株。用补充了0.05％Tween80的Middlebrook7H9-ADC培养基以1.5×106CFU/mL稀释全部菌株。首先用EVOBird(Evotec)在补充了0.05％Tween80的10μl Middlebrook7H9-ADC培养基中调配的0.5μl化合物预先在384-孔板(Greiner，#781091)上铺板。然后将40μl稀释的H37Rv-GFP细菌悬浮液加入到稀释化合物，导致最终体积为包含1％DMSO的50μl。将板在37℃、5％CO2温育10天。通过使用Victor3读出器(Perkin-Elmer Life Sciences)测定H37Rv-GFP的GFP-荧光或使用刃天青法测定分枝杆菌生长。0.05μg/mL和1μg/mL异烟肼(Sigma，I3377)、1μg/mL利福平(Euromedex)和DMSO用作对照品。
细胞毒性测定
为了找到化合物的毒性，在从100μM开始3-倍化合物稀释液的存在下培养来源于不同身体组织的7种细胞系。5天培养后，通过刃天青试验评价细胞存活率。简言之，在37℃下、5％CO2中将细胞与10μg/mL刃天青(Sigma-Aldrich St.Louis，MO)一起温育4h。如上所述测定Resofurin荧光(RFU)。如下计算对细胞的毒性百分比：细胞毒性(％)＝(RFUDMSO-RFU空白)-(RFU化合物-RFU空白)/(RFUDMSO-RFU空白)×100。将细胞毒性百分比对化合物浓度作图并且通过非线性回归分析将最小毒性浓度(MTC50)测定为最低化合物浓度，其中用相应细胞系观察到50％毒性。
自发耐药性频率
在包含递增浓度二硝基苯甲酰胺(0.2、0.8、1.6和3.2μg/ml)或吡啶并嘧啶酮(0.4、0.8、1.6和3.2μg/ml)化合物的7H10板上测定自发突变频率。将包含106、107和108CFU的细菌悬浮液铺展在包含化合物的琼脂板上。在37℃5-6周后，对菌落计数并且将突变频率评价为菌落与原始接种物之比。DMSO和INH分别用作阴性和阳性对照。
实施例1：基于表型巨噬细胞的测定设定和自动化图像定量
为了设定结核分枝杆菌感染的最佳条件，首先使Raw264.7巨噬细胞感染不同感染复数(MOI)的组成型表达绿色荧光蛋白(GFP)的分枝杆菌，然后进行动力学分析。截止到杆菌感染后7天，每日用红色化学荧光染料Syto60标记宿主活细胞，使用自动化共焦显微镜获取活样品的共焦图像。典型图像展示在图1a中。在前24小时过程中，几个分散的弱荧光细菌位于细胞内。截至到第2天，细胞平均数已经增加并且分枝杆菌开始铺展入相邻细胞，从而产生强荧光细菌区。绿色信号定位始终距离红色细胞信号5μm，并且在大部分情况中，实际上与细胞信号重叠。这证实胞内分枝杆菌生长性质。截至到第4天，细胞数量已经减少并且细菌已经形成大的高度荧光聚集物，它们几乎覆盖了来自前5天的全部图像。作为对照，未感染细胞在第2天生长至汇合并且保持活动至第7天。
为了自动定量胞内细菌载荷，研发了内部图像分析文件。这种文件能够自动定量细胞数量和感染细胞百分比，其中感染细胞是包含至少三种具有高于确定阈值强度的绿色像素的细胞(图1b)。感染后2小时，发现2－10％的Raw264.7细胞包含少量杆菌(图1c)。下文称作感染比的感染细胞百分比从感染后72小时持续增加，在感染后第7天达到70％。这种感染比的增加与细胞死亡率增加相关(图1d/e)。
实施例2：已知抗结核药的对比最小抑制浓度
为了验证测定设置，研究了目前抗肺结核药对结核分枝杆菌胞内生长的效果。对异烟肼(INH)、利福平和乙硫异烟胺进行2-倍系列稀释，然后对已经预先感染结核分枝杆菌H37Rv-GFP的巨噬细胞进行检测。5天温育后，染色巨噬细胞并且如上所述用自动化共焦显微镜获取图像。与DMSO阴性对照相比，在对应于INH温育的样品的图像上清楚地观察到较大数量的细胞和较少数量的细菌。这显示INH防止胞内结核分枝杆菌生长和杆菌介导的细胞毒性(图2a)。通过图像-提取的分析得到清楚的抑制剂量-响应曲线(图2b)。平行地，通过在相同条件下记录绿色荧光强度监测INH抑制结核分枝杆菌H37Rv-GFP体外生长。在两种实验中，INH的最小抑制浓度(MIC)是0.1μg/mL，这与文献中有关胞外结核分枝杆菌生长报道的MIC一致(Andries等人，2005)。使用标准抗-肺结核药乙硫异烟胺(图2c)和乙胺丁醇(数据未显示)得到类似结果，而就利福平而言，与体外测定相比，在基于相比的测定中存在MIC的log-倍数减小(图2d)。利福平在基于细胞的测定中的功效下降可能由于细胞透入受损导致并且进一步证实在本测定中监测的胞内抗菌活性。因此，为了高流通量筛选(HTS)对胞内和体外结核分枝杆菌生长测定进行调节。
实施例3：测定按比例扩大和验证
为了简化用于HTS目的的方案，使巨噬细胞分批感染结核分枝杆菌，然后分配在化合物上。分批感染使用巨噬细胞悬浮液在37℃、适度振摇下进行。通过用PBS洗涤3次和差速离心并且通过再与阿米卡星一起温育1小时的步骤除去游离的未结合分枝杆菌，已知阿米卡星是选择性杀灭胞外微生物的抗生素(图6a)。然后将结核分枝杆菌感染的巨噬细胞接种在预先分配有化合物、DMSO或抗生素对照的板上。首先测试逐日和逐板再现性。为了这一目的，将系列稀释的INH或利福平与有序的DMSO和阳性对照(1μg/mL(MIC100)和0.05μg/mL(MIC90)INH和1μg/mL利福平)一起分配入8个板的各孔，然后给各孔接种感染细胞。在2个连续天内重复相同实验。温育5天和巨噬细胞染色后，获取来自每一板的图像。对2天实验每一板内DMSO阴性对照测定的感染比平均值为50％－70％，而对INH和利福平样品，感染比平均值下降至低于20％(图3a)。尽管两次实验之间存在感染比平均值上的一些变化，但是INH-阳性与DMSO-阴性对照之间的差异就所述天数而言高于5-倍。使用配对t-Student检验对每一板计算的P值也证实在阳性与阴性对照之间存在显著性差异(p<0.000001，数据未显示)。此外，发明人进行了实验以确定是否可以通过进行双盲对照检测到在板上任意孔中调配的结核分枝杆菌胞内生长感染抑制剂(3种不同浓度的INH和利福平的增加)。实际上，鉴定了1％的增加(数据未显示)。这些结果共同证实本测定的敏感性足以能够鉴定HTS条件下的抑制剂。最终，通过监测对照化合物的剂量响应检查本测定。测定了抗生素阳性对照的几乎相同的MICs，与板或实验日期无关(图3b/c)。基于感染比的定量从图像计算的MICs为，对INH和利福平相应地为0.16+/-0.05μg/mL和2.4+/-1.3μg/mL，并且通过CFU铺板证实(数据未显示)。平行地，使用类似手段验证胞外生长测定(数据未显示)。
实施例4：使用基于表型细胞的测定法对小合成化合物大库的初步筛选
将根据Lipinski规则(Lipinski等人，2001)因其高度化学多样性和药物类特性选择的26500种小分子化合物库选作第一个使用经验证的基于表型细胞测定筛选的库。使用辛格尔顿的20μM化合物进行初步筛选。将流通量设定在约6000种化合物/工作日，包括25个板。使用Raw264.7细胞进行筛选，该细胞在感染结核分枝杆菌H37Rv-GFP前已经从冷冻储备溶液铺展了10天。为了接受筛选结果，从筛选天开始时和结束时处理的2个系列稀释的INH和利福平得到的MICs与在验证过程中得到的值相比应显示类似结果(参见上文)。然后根据质量控制操作接受每一筛选的板，条件是DMSO与INH(1μg/ml)之间的视窗高于3且对存在于每一板中的320种化合物计算的CV低于25。这种质量控制标准能够鉴定具有高于75％活性的命中化合物。然后测定1μg/mL INH(100％)与DMSO(0％)之间在相同384-孔板中的相对于相应感染比平均值的每种化合物的抑制百分比。抑制百分比分布以约-20％抑制为中心(图4a)。决定选择具有大于65％的抑制效果的化合物，其相当于稍低于总化合物的1.5％。
平行地，仅测试了相同化合物对结核分枝杆菌H37Rv-GFP细菌生长的抑制活性。来自本测定的基于典型荧光强度的结果显示高度再现性且将用于板验证的标准设定在大于0.35的Z’值(DMSO/INH)。用于基于荧光的测定的流通量约为20,000种化合物/天。然后将具有高于65％抑制效果的防止结核分枝杆菌体外生长的化合物选作命中化合物(1.4％)，因为它们属于与无活性的以0％为中心的群体相比明显的独立群体(图4b)。
然后搜集和比较采集自两次不同筛选的结果(图4c)。可以鉴定4种不同群体：化合物：i)仅对胞外细菌具有活性；ii)仅对胞内细菌具有活性；iii)对两种设置具有活性；或iv)无活性。657种化合物(2.5％)属于前三类之一且由此选择其用于进一步研究。
可以在图像分析过程中测定的重要参数是总细胞数，也称作细胞毒性。低细胞数可以是两次独立现象、化合物毒性和结核分枝杆菌生长介导的细胞毒性的结果。实际上，在感染结核分枝杆菌后5天时，与未感染细胞的500细胞/图像相比，细胞数量降至低于100细胞/图像(图1e)。相反，当化合物无毒性且防止分枝杆菌生长时，仅得到高细胞数。这就产生了化合物抗分枝杆菌活性的第二个相关测量值。然而，该标准不适用于从初步筛选中选择命中化合物，因为仅对一些化合物发现了低细胞数且发明人需要避免不能选择高度活性化合物，尽管所述高度活性化合物在20μM具有细胞毒性，但随后可以证实它们在极低浓度下具有活性。为接下来的筛选步骤再加入大于0.2的总细胞数的Z’(DMSO/INH)值验证标准。
实施例5：筛选结果、剂量响应分析和命中化合物分类的证实
首先在3种不同浓度20μM、2μM和0.2μM下证实657种选择的命中化合物。对340个命中化合物而言，证实在20μM或2μM对胞内或体外测定具有活性(参见表1)。针对这一后面的名单，121种化合物显示在2μM具有高于65％的抑制活性，在20μM无任何明显的细胞毒性，且由此被选择用于进一步通过10个3-倍系列稀释证实(参见表2)。通过系列稀释证实全部121种化合物，其中MIC在250nM－20μM。图5所示的结果是观察的三种类型行为的代表：大部分化合物在将活性测定为感染比时显示明显的剂量响应曲线(图5b/e/h)。即使MIC在测定之间彼此不同，但是对杆菌水平具有活性的化合物在胞外测定中呈现类似活性(图5c/f)。几种化合物未对体外杆菌呈现明显活性(图5i)且可以代表通过细胞靶标或对仅在感染过程中涉及的杆菌靶标起作用的药物。此外，可以鉴定毒性化合物，这归因于化合物浓度增加时细胞数量显著下降(图5d)且通过对细胞数具有剂量响应保护效果验证无毒性化合物的活性(图5a)。因此，细胞数检测代表了与初步测定同样良好的独立的二次测定。来自全部121种化合物的系列稀释结果如表2所示。
121种经证实的命中化合物可以集成20个独立/一般骨架(表3)。每一骨架的化合物数量可以在1－69种分子之间改变。来自69种化合物骨架的分子共有与INH类似的常见结构，由此验证了筛选结果。一种骨架包含仅在胞内测定中具有活性的分子且其作用机制是进一步研究的焦点。
实施例6：苯甲酰胺化合物的衍生
苯甲酰胺化合物(骨架II；参见表3)根据如下概括的方法进行衍生(方案1-7)。可以在一般条件下、使用EDC或DCC偶合剂与酸而不是酰氯进行酰胺形成。使用上述测定法检验得到的衍生物的抑制活性并且将结果概括在表4中。
方案1
方案2
合成2-苯氧基乙基异二氢吲哚-1,3-二酮(A1)的一般方法
向2-(2-羟基乙基)异二氢吲哚-1,3-二酮(1.68mmol)在二氯甲烷(10mL)的溶液中加入ADDP(1.68mmol)，三苯膦(1.68mmol)和苯酚(3.18mmol)，在室温搅拌。搅拌过夜后，用二氯甲烷(30mL)稀释该反应混合物，用1M NaOH水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(4：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，从己烷和乙酸乙酯的混合物中重结晶，得到A1。
合成N-(2-苯氧基乙基)-苯甲酰胺(A2)的一般方法
向A1(1.14mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中加入一水合肼(1.42mmol)，在氮气气氛中回流得到的混合物。3h后，将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩。用二氯甲烷(10mL)沉淀残余物。通过Celite过滤得到的沉淀，真空浓缩滤液，得到胺中间体。在0℃向胺在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三乙胺(0.45mmol)和苯甲酰氯(0.45mmol)，在室温搅拌得到的混合物。3h后，用二氯甲烷(10mL)稀释该反应混合物，用1M HCl水溶液(30mL)、饱和Na2CO3水溶液(30mL)和盐水(30mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(3：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，从己烷和乙酸乙酯的混合物中重结晶，得到A2。
3,5-二硝基-N-(2-苯氧基乙基)苯甲酰胺(1)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.88(t，J＝4.4Hz，2H)，4.21(t，J＝5.2Hz，2H)，6.89(d，J＝8.4Hz，3H)，7.24(t，J＝8.0Hz，2H)，8.78(brs，1H)，9.02(d，J＝2.0Hz，1H)，9.07(d，J＝2.0Hz，2H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ40.1，66.0，114.5，120.8，127.6，129.6，137.8，148.8，158.9，163.0。
N-(2-(2-甲氧基苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(2)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.89(s，3H)，3.92(dd，J＝5.2，10.4Hz，2H)，4.23(t，J＝4.8Hz，2H)，6.91-7.02(m，4H)，7.63(brs，1H)，9.02(d，J＝1.6Hz，2H)，9.14(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.0，56.1，68.8，112.2，115.8，121.0，121.5，122.9，127.3，137.8，147.5，148.6，149.8，162.6。
N-(2-(3-甲氧基苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(3)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.74(s，3H)，3.85(dd，J＝5.6Hz，4.8Hz，2H)，4.21(t，J＝5.2Hz，2H)，6.50(m，3H)，7.14(t，J＝8.4Hz，1H)，8.75(brs，1H)，9.04(s，1H)，9.08(s，2H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ40.1，54.8，66.1，100.9，106.5，106.8，120.9，127.5，130.0，137.9，148.8，160.2，161.2，163.0。
N-(2-(4-甲氧基苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(4)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.72(s，3H)，3.91(dd，J＝5.2，10.8Hz，2H)，4.12(t，J＝4.8Hz，2H)，6.74-6.80(m，4H)，7.21(brs，1H)，8.95(d，J＝2.0Hz，2H)，9.07(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.4，55.6，66.8，114.7，115.4，121.0，127.2，137.6，148.5，152.2，154.3，163.1；LC-MS(ESI，m/z)：361[M+H]+。
N-(2-(2-氯苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(5)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.97(dd，J＝5.2，10.4Hz，2H)，4.25(t，J＝5.2Hz，2H)，6.93-6.95(m，2H)，7.19-7.24(m，2H)，7.35(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)，8.98(d，J＝2.0Hz，2H)，9.12(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ34.9，63.0，109.7，116.2，117.7，118.2，122.3，123.1，125.5，132.6，143.7，148.7，157.9。
N-(2-(3-氯苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(6)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.97(dd，J＝5.6，10.8Hz，2H)，4.19(t，J＝4.8Hz，2H)，6.80-6.98(m，4H)，7.24(t，J＝8.0Hz，1H)，8.96(d，J＝2.0Hz，2H)，9.17(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.1，66.4，110.7，115.0，121.2，121.7，127.2，130.4，135.1，137.6，148.7，158.8，163.0。
N-(2-(4-氯苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(7)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.96(dd，J＝5.6，10.4Hz，2H)，4.17(t，J＝4.8Hz，2H)，6.78(brs，1H)，6.86(dd，J＝2.4，6.8Hz，2H)，7.23(dd，J＝2.0，6.8Hz，2H)，8.96(d，J＝2.4Hz，2H)，9.17(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.1，66.5，115.7，121.2，126.5，127.2，129.6，137.6，148.9，156.8，163.0。
N-(2-(2-氟苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(8)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.97(dd，J＝5.2，10.8Hz，2H)，4.25(t，J＝5.2Hz，2H)，6.91-7.06(m，4H)，7.39(brs，1H)，8.97(d，J＝2.0Hz，2H)，9.15(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.1，68.3，115.7，116.3(d，J＝20Hz，由于F)，121.1，122.3(d，J＝7Hz，由于F)，124.6(d，J＝5Hz，由于F)，127.3，137.6，146.2，148.6，152.8(d，J＝250Hz，由于F)，163.1；LC-MS(ESI，m/z)：350[M+H]+。
N-(2-(4-氟苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(9)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.88(dd，J＝5.2，10.8Hz，2H)，4.23(t，J＝5.2Hz，2H)，6.95-7.07(m，4H)，8.79(brs，1H)，9.07(t，J＝2.4Hz，1H)，9.11(d，J＝2.0Hz，2H)。
N-(2-(4-羟基苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(10)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.66(dd，J＝5.6，11.2Hz，2H)，4.06(t，J＝5.2Hz，2H)，6.65-6.68(m，2H)，6.76-6.80(m，2H)，8.91(brs，1H)，8.98(t，J＝2.0Hz，1H)，9.08(d，J＝2.4Hz，2H)，9.42(brs，1H)；13C NMR(100MHz DMSO-d6)δ40.1，66.9，116.2，116.4，121.5，128.2，137.4，148.8，151.8，152.0，163.1。
N-(2-(3-(三氟甲氧基)苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(11)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.89(dd，J＝5.6，11.2Hz，2H)，4.29(t，J＝5.6Hz，2H)，6.88(d，J＝6.0Hz，2H)，6.99(d，J＝8.0Hz，1H)，7.38(t，J＝8.4Hz，1H)，8.79(brs，1H)，9.05(d，J＝1.2Hz，1H)，9.08(d，J＝1.2Hz，2H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ39.9，66.7，107.8，113.1，113.6，120.9，127.6，130.9，137.8，148.9，150.1，160.2，163.0。
N-(2-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(12)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.88(dd，J＝10.8Hz，5.2Hz，2H)，4.27(t，J＝5.6Hz，2H)，7.03(dd，J＝7.2，2.0Hz，2H)，7.23(d，J＝8.8Hz，2H)，8.78(brs，1H)，9.04(d，J＝2.0Hz，1H)，9.08(d，J＝2.0Hz，2H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ40.0，66.8，115.7，120.9，122.7，127.6，137.8，142.7，142.8，148.9，157.9，163.1。
4-(2-(3,5-二硝基苯甲酰氨基)乙氧基)苯甲酸甲酯(13)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.81(s，3H)，3.91(t，J＝5.6Hz，2H)，4.33(t，J＝5.6Hz，2H)，7.00(t，J＝2.8Hz，1H)，7.03(t，J＝2.8Hz，1H)，7.90(t，J＝2.8Hz，1H)，7.92(t，J＝2.8Hz，1H)，8.78(brs，1H)，9.03(t，J＝2.4Hz，1H)，9.07(d，J＝2.4Hz，2H)；13CNMR(100MHz，丙酮-d6)δ39.9，51.3，66.5，114.4，120.9，123.0，127.6，131.5，137.8，148.9，162.8，163.0，166.1。
N-(2-(4-氨基苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺盐酸盐(14)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.67(d，J＝5.2Hz，2H)，4.15(t，J＝5.2Hz，2H)，7.03(d，J＝1.6Hz，2H)，7.29(d，J＝1.6Hz，2H)，8.91(d，J＝2.0Hz，1H)，9.04(d，J＝2.0Hz，2H)，9.52(brs，1H)，10.28(brs，3H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ40.1，66.1，115.4，120.8，124.3，124.5，127.5，136.7，148.1，157.8，162.4。
N-(2-(4-(叔-丁氧羰基氨基)苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(15)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ1.44(s，9H)，3.83(m，2H)，4.18(m，2H)，6.84(dd，J＝3.2，9.2Hz，2H)，7.40(d，J＝7.6Hz，2H)，8.15(brs，1H)，8.73(brs，1H)，9.03(t，J＝2.0Hz，1H)，9.08(d，J＝2.0Hz，2H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ27.8，40.1，66.4，78.9，114.8，119.9，120.9，127.6，133.3，137.9，148.8，153.2，154.4，163.0；LC-MS(ESI，m/z)：469[M+Na]+。
N-(2-(4-甲氧基苯氧基)乙基)-3-硝基苯甲酰胺(16)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.69(s，3H)，3.81(dd，J＝5.2，10.4Hz，2H)，4.06(t，J＝5.6Hz，2H)，6.73-6.78(m，4H)，7.48(brs，1H)，7.53(t，J＝8.0Hz，1H)，8.13(d，J＝7.6Hz，1H)，8.24(d，J＝10.4Hz，1H)，8.56(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ39.8，55.4，66.7，114.4，115.2，121.9，125.8，129.5，133.1，135.7，147.8，152.3，153.9，165.2。
N-(2-(2-氟苯氧基)乙基)-3-硝基苯甲酰胺(17)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.92(dd，J＝5.6，10.8Hz，2H)，4.23(t，J＝4.8Hz，2H)，6.90-7.09(m，4H和brs，1H)，7.62(t，J＝8.0Hz，1H)，8.14(d，J＝8.0Hz，1H)，8.33(d，J＝8.0Hz，1H)，8.63(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ39.8，68.3，115.6，116.6(d，J＝18.6Hz，由于F)，122.3(d，J＝5.3Hz，由于F)，124.7(d，J＝4.5Hz，由于F)，126.0，129.7，133.0，135.8，146.3(d，J＝10.4Hz，由于F)，148.1，152.6(d，J＝245Hz，由于F)，165.2。
N-(2-(4-甲氧基苯氧基)乙基)苯甲酰胺(18)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.72(s，3H)，3.80(dd，J＝5.2，10.8Hz，2H)，4.05(t，J＝5.6Hz，2H)，6.78-6.83(m，4H)，7.03(brs，1H)，7.35-7.45(m，4H)，7.74(d，J＝11.2Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ39.4，55.4，67.1，114.5，115.2，126.8，128.3，131.3，134.1，152.4，153.9，167.6。
N-(2-(4-甲氧基苯氧基)乙基)-N-甲基-3,5-二硝基苯甲酰胺(19)
(两种旋转异构体，1：1)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.18(brs，3H)，3.65(brs，1H)，3.75(s，3H)，3.94(brs，1H)，4.03(brs，1H),4.27(brs，1H)，6.79-6.84(brd，4H)，8.55(brs，1H)，8.72(brs，1H)，9.04(br s，1H)。
N-乙基-N-(2-(4-甲氧基苯氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(20)
(两种旋转异构体，1：1)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.22-1.30(m，3H)，3.42(brs，1H)，3.63(brs，2H)，3.75(s，3H)，3.89(brs，1H)，4.01(brs，1H)，4.26(brs，1H)，6.80(br，4H)，8.53(brs，1H)，8.72(brs，1H)，9.04(brs，1H)。
N-(3-(4-甲氧基苯氧基)丙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(21)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.04-2.20(m，2H)，3.76(t，J＝6.0Hz，2H)，3.77(s，3H)，4.17(t，J＝5.2Hz，2H)，6.85-6.91(m，4H)，7.24(brs，1H)，8.96(d，J＝2.0Hz，2H)，9.16(t，J＝2.0Hz，1H)。
4-(3-(3,5-二硝基苯甲酰氨基)丙氧基)苯甲酸甲酯(22)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.21-2.24(m，2H)，3.77(dd，J＝6.0，12.0Hz，2H)，3.89(s，3H)，4.24(t，J＝5.6Hz，2H)，6.95(d，J＝8.8Hz，2H)，7.04(brs，1H)，8.00(d，J＝8.8Hz，2H)，8.96(d，J＝2.0Hz，2H)，9.16(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ28.4，39.3,52.0，67.2，113.9，121.1，123.3，127.0，131.8，137.8，148.6，161.9，162.5，166.6。
N-(3-(2-氟苯氧基)丙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(23)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.19-2.25(m，2H)，3.83(dd，J＝5.2，11.2Hz，2H)，4.27(t，J＝5.2Hz，2H)，6.90-7.11(m，4H)，7.50(brs，1H)，8.99(d，J＝2.0Hz，2H)，9.16(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ28.2，40.0，69.5，114.0，116.3(d，J＝18Hz，由于F)，120.9，121.8(d，J＝7.4Hz，由于F)，124.7(d，J＝3.7Hz，由于F)，127.2，127.3，138.1，147.3(d，J＝245Hz，由于F)，153.5，162.7。
方案3
合成N-(2-(苄氧基)乙基)-二硝基苯甲酰胺(B2)的一般方法
在0℃向2-(2-羟基乙基)异二氢吲哚-1,3-二酮(1.17mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中加入氢化钠(2.34mmol)和苄基溴(1.40mmol)，在室温搅拌得到的混合物。搅拌过夜后，加入蒸馏水(50mL)，通过过滤收集得到的沉淀，得到B1。
向B1(0.85mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中加入一水合肼(0.85mmol)，在氮气气氛中回流得到的混合物。3h后，将该反应混合物冷却至室温，真空浓缩。用二氯甲烷(10mL)沉淀残余物。通过Celite过滤出得到的沉淀，真空浓缩滤液，得到胺。
在0℃向胺在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三乙胺(113μl，0.81mmol)和苯甲酰氯(0.81mmol)，在室温搅拌得到的混合物。3h后，用二氯甲烷(30mL)稀释该反应混合物，用1M HCl水溶液(50mL)、饱和Na2CO3水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(3：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，从己烷和乙酸乙酯的混合物中重结晶，得到B2。
N-(2-(苄氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(24)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.68-3.72(m，4H)，4.55(s，2H)，6.75(brs，1H)，7.24-7.33(m，5H)，8.91(d，J＝2.0Hz，2H)，9.13(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.4，68.1，73.4，121.0，127.2，128.0，128.2，128.7，137.5，138.0，148.6，162.7；LC-MS(ESI，m/z)：346[M+H]+。
N-(2-(3-甲氧基苄氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(25)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.71-3.74(m，4H)，3.76(s，3H)，4.52(s，2H)，6.77-6.90(m，3H)，6.97(brs，1H)，7.23(t，J＝8.0Hz，1H)，8.91(d，J＝2.0Hz，2H)，9.12(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.5，55.2，68.2，73.1，113.1，113.6，120.0，120.9，127.2，129.6，137.8，139.1，148.5，159.7，162.8。
N-(2-(4-甲氧基苄氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(26)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.65-3.71(m，4H)，3.75(s，3H)，4.47(s，2H)，6.71(brs，1H)，6.84(dd，J＝6.8，2.0Hz，2H)，7.23(d，J＝8.4Hz，2H)，8.87(d，J＝2.4Hz，2H)，9.13(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.5，55.3，67.8，73.1，114.0，121.0，127.1，129.6，130.0，137.9，148.6，159.5，162.7。
N-(2-(4-氯苄氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(27)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.68-3.76(m，4H)，4.53(s，2H)，6.77(brs，1H)，7.25-7.32(m，4H)，8.91(d，J＝2.0Hz，2H)，9.15(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.4，68.3，72.6，121.1，127.2，128.8，129.2，134.0，136.0，137.8，148.6，162.7。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(28)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.68-3.76(m，4H)，4.52(s，2H)，6.79(brs，1H)，7.17-7.29(m，4H)，8.91(d，J＝2.0Hz，2H)，9.13(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.4，68.4，72.5，121.1，125.8，127.2，127.8，128.1，129,2，134.5，137.8，139.6，148.6，162.8。
N-(2-(4-氟苄氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(29)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.68-3.76(m，4H)，4.53(s，2H)，6.74(brs，1H),7.02-7.06(m，2H)，7.30-7.33(m，2H)，8.92(d，J＝2.0Hz，2H)，9.16(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.4，68.1，72.6，115.5(d，J＝22Hz，由于F)，121.1，127.1，130.0(d，J＝8.2Hz，由于F)，133.5(d，J＝3.0Hz，由于F)，137.8，148.6，162.5(d，J＝245Hz，由于F)，162.7。
N-(2-(2-氟苄氧基)乙基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(30)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.75(s，4H)，4.64(s，2H)，7.07-7.17(m，3H)，7.29-7.39(m，1H和brs.1H)，8.94(d，J＝2.0Hz，2H)，9.17(t，J＝2.0Hz，1H)。
3,5-二硝基-N-(2-(4-(三氟甲氧基)苄氧基)乙基)苯甲酰胺(31)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.72-3.76(m，4H)，4.54(s，2H)，7.13(d，J＝8.0Hz，2H)，7.31-7.35(m，2H和brs，1H)，8.94(d，J＝2.0Hz，2H)，9.08(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.4，68.4，72.2，120.9，121.0，127.2，129.1，136.3，137.7，148.4，148.7，148.9，162.9。
3,5-二硝基-N-(2-(3-(三氟甲基)苄氧基)乙基)苯甲酰胺(32)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.72-3.79(m，4H)，4.61(s，2H)，7.06(brs，1H)，7.45-7.55(m，4H)，8.93(d，J＝2.0Hz，2H)，9.10(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.4，68.7，72.4，121.0，124.1，124.6，124.7，127.2，129.0，130.6(q，J＝32Hz，由于F)，130.8，137.7，138.6，148.6，162.9。
4-((2-(3,5-二硝基苯甲酰氨基)乙氧基)甲基)苯甲酸甲酯(33)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.71-3.74(m，4H)，3.84(s，3H)，4.55(s，2H)，7.29(d，J＝8.0Hz，2H和brs，1H)，7.85(d，J＝8.0Hz，2H)，8.90(d，J＝2.0Hz，2H)，9.01(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.6，52.2，68.8，72.6，120.9，127.3，129.5，129.7，137.8，142.9，148.5，163.0，166.8。
4-((2-(3,5-二硝基苯甲酰氨基)乙氧基)甲基)苯甲酸(34)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.74(t，J＝5.2Hz，2H)，3.81(t，J＝5.2Hz，2H)，4.72(s，2H)，7.56(d，J＝8.4Hz，2H)7.72(brs，1H)，8.03(d，J＝8.4Hz，2H)，9.02(d，J＝2.0Hz，2H)，9.13(t，J＝2.0Hz，1H)。
N-(2-(苄氧基)乙基)苯甲酰胺(35)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.62-3.68(m，4H)，4.52(s，2H)，6.71(brs，1H)，7.24-7.49(m，8H)，7.73-7.76(m，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ39.7，68.8，73.1，126.9，127.8，128.4，131.3，134.5，137.8，167.5。
N-(2-(3-(三氟甲基)苄氧基)乙基)苯甲酰胺(36)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.63-3.70(m，4H)，4.56(s，2H)，6.72(brs，1H)，7.37-7.53(m，6H)，7.58(s，1H)，7.74-7.76(m，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ39.7，69.3，72.3，124.2，124.3，124.6，126.9，128.5，128.9，130.8，131.5，134.4，139.0，148.6，167.6。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)苯甲酰胺(37)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.62-3.69(m，4H)，4.49(s，2H)，6.71(brs，1H)，7.17-7.50(m，7H)，7.75-7.77(m，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ39.7，69.0，72.2，125.6，126.8，127.6，127.8，128.4，129,7，131.3，134.3，139.9，167.4。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3,5-二氟苯甲酰胺(38)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.64-3.69(m，4H)，4.52(s，2H)，6.54(brs，1H)，6.95(tt，J＝2.4，11.2Hz，1H)，7.19-7.33(m，6H)。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3,5-二氯苯甲酰胺(39)
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ3.13(t，J＝5.2Hz，2H)，3.67(t，J＝5.2Hz，2H)，4.55(s，2H)，7.27–7.29(m，3H)，7.42(s，1H)，7.46，(s，1H)，7.81(s，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.6，67.2，73.2，127.0，128.7，128.8，128.9，130.7，131.0，135.4，135.5，141.4，142.7，171.5。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3,5-双(三氟甲基)苯甲酰胺(40)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.64–3.68(m，4H)，4.49(s，2H)，6.89(brs，1H)，7.15(d，J＝3.6Hz，1H)，7.21–7.24(m，2H)，7.27(s，1H)，7.95(s，1H)，8.18(s，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.3，68.37，72.5，121.6，125.0，125.1，125.7，127.8，128.1，129.9，132.0，134.5，136.6，139.8，164.8。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(41)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.63(d，J＝3.6Hz，2H)，3.65(d，J＝3.6Hz，2H)，3.81(s，3H)，4.49(s，2H)，6.51(brs，1H)，7.01(dd，J＝8.0Hz，2.4Hz，1H)，7.16(d，J＝4.4Hz，1H)，7.28(m，3H)，7.25–7.34(m，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ39.9，55.5，69.2，72.5，112.4，117.8，118.7，125.8，127.8，128.0，129.6，129.9，134.5，136.0，140.0，159.9，167.5。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-4-甲氧基苯甲酰胺(42)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.62–3.66(m，4H)，3.82(s，3H)，4.49(S，2H)，6.48(brs，1H)，6.89(d，J＝8.8hz，2H)，7.17(t，J＝4.4Hz，2H)，7.24(m，1H)，7.32(s，1H)，7.71(d，J＝8.8Hz，2H)13C NMR(100MHz，CDCl3)δ39.8，55.5，69.4，72.4，113.8，125.7，126.8，127.8，128.0，128.8，129.8，134.5，140.1，162.2，167.1。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(43)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.62–3.68(m，4H)，4.49(s，2H)，6.62(brs，1H)，7.15(dd，J＝1.2，8.8Hz，1H)，7.22–7.23(m，2H)，7.36(t，J＝1.2Hz，2H)，7.43(t，J＝8.4Hz，1H)，7.63(dd，J＝1.2，4.4Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.0，69.0，72.4，119.3，120.1，123.8，125.1，125.7，127.8，128.0，129.9，130.1，134.5，136.6，140.0，149.4，166.1。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-4-(三氟甲基)苯甲酰胺(44)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.62–3.68(m，4H)，4.49(s，2H)，6.71(brs，1H)，7.14–7.17(m，1H)，7.23–7.24(m，2H)，7.3(s，1H)，7.64(d，J＝8.0Hz，2H)，7.83(d，J＝8.0Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.0，68.9，72.4，125.6(q，J＝3.7Hz)，125.8，127.5，127.8，128.1，129.9，138.1，133.4，134.5，137.7，140.0，166.4。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺(45)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.62(m，4H)，4.46(s，2H)，6.96(brs，1H)，7.14–7.27(m，4H)，7.47(t，J＝7.2Hz，1H)，7.68(d，J＝3.2Hz，1H)，7.89(d，J＝3.2Hz，1H)，8.01(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.0，68.9，72.3，122.4，124.1，125.7，127.7，127.9，128.0，129.1，129.8，130.3，130.8，134.4，135.2，140.0，166.3。
3-(2-(3-氯苄氧基)乙基氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(46)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.62–3.69(m，4H)，3.89(s，3H)，4.48(s，2H)，6.71(brs，1H)，7.15–7.16(m，1H)，7.21–7.24(m，2H)，7.28(s，1H)，7.47(t，J＝4.0Hz，1H)，7.97(d，J＝4.8Hz，1H)，8.11(d，J＝4.8Hz，1H)，8.35(t，J＝1.6Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.0，52.4，69.0，72.4，125.7，127.7，127.8，128.0，128.9，129.8，130.5，131.8，132.4，134.4，134.8，140.0，166.3，166.6。
4-(2-(3-氯苄氧基)乙基氨基甲酰基)苯甲酸甲酯(47)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.62–3.66(m，4H)，3.90(s，3H)，4.48(s，2H)，6.65(brs，1H)，7.14–7.17(m，1H)，7.22(d，J＝5.2Hz，2H)，7.30(s，1H)，7.78(d，J＝8.0Hz，2H)，8.04(d，J＝8.0Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.0，52.4，69.0，72.4，125.7，127.1，127.8，128.1，129.9，132.7，134.5，138.4，140.0，160.3，166.7。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3-硝基苯甲酰胺(48)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.64(m，4H)，4.45(s，2H)，7.13–7.23(m，5H)，7.53(m，1H)，8.08(d，J＝6.8Hz，1H)8.22(d，J＝6.8Hz，1H)，8.54(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.1，68.7，72.2，122.0，125.6，125.9，127.5，127.8，129.7，129.8，133.1，134.2，136.0，139.9，148.0，165.3。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-4-硝基苯甲酰胺(49)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.63(m，4H)，4.45(s，2H)，6.97(brs，1H)，7.12–7.25(m，4H)，7.87(d，J＝6.4Hz，2H)，8.15(d，J＝6.4Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.1，68.7，72.2，123.6，125.6，127.5，127.9，128.2，129.7，134.3，139.9，140.0，149.4，165.6。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3-氟苯甲酰胺(50)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.56–3.61(m，4H)，4.43(s，2H)，6.66(brs，1H)，7.10–7.12(m，2H)，7.18–7.19(m，2H)，7.25(s，1H)，7.30–7.31(m，1H)，7.41–7.45(m，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ39.9，69.0，72.4，114.3(d，J＝23.0Hz，由于F)，118.4(d，J＝20.8Hz，由于F)，122.4(d，J＝3.0Hz，由于F)，125.7，127.7，128.0，129.8，130.2(d，J＝8.2Hz，由于F)，134.5，136.7(d，J＝6.7Hz，由于F)，140.0，163.0(d，J＝245Hz，由于F)，166.3(d，J＝3.0Hz，由于F)。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3-氯苯甲酰胺(51)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.64(m，4H)，4.49(s，2H)，6.52(brs，1H)，7.17(d，J＝3.2Hz，1H)，7.24(s，2H)，7.31–7.36(m，2H)，7.44(d，J＝3.6Hz，1H)，7.59(d，J＝7.6Hz，1H)，7.73(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.0，69.1，72.5，125.1，125.8，127.5，127.8，128.1，129.9，130.0，131.6，134.6，134.9，136.3，140.0，166.3。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-4-羟基苯甲酰胺(52)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.64(s，4H)，4.48(s，2H)，6.57(brs，1H)，6.84(dd，J＝2.0，8.8Hz，2H)，7.17(d，J＝3.2Hz，1H)，7.23(d，J＝3.2Hz，2H)，7.31(s,1H)，7.60(dd，J＝2.0，8.8Hz，2H)，8.22(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.0，69.1，72.5，115.7，125.4，125.8，127.8，128.1，129.0，129.9，134.5，140.0，160.2，168.2。
N-(2-(3-氯苄氧基)乙基)-3-羟基苯甲酰胺(53)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.65(m，4H)，4.49(s，2H)，6.64(brs，1H)，6.98(d，J＝8.0Hz，1H)，7.13(d，J＝8.0Hz，1H)，7.17–7.26(m，5H)，7.30(s，1H)，7.50(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ40.0，69.1，72.5，115.1，117.8，119.3，125.9，127.3，128.1，129.9，130.0，134.6，135.4，139.9，157.2，168.0。
方案4
合成苯氧基-吡咯烷-1-基-甲酮(C2)的一般方法
在0℃向(S)-3-吡咯烷醇(10mmol)和三乙胺(11mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液中加入苯甲酰氯(8.67mmol)。使该反应温度达到室温。2h后，用二氯甲烷(50mL)稀释该反应混合物，然后用0.5M HCl水溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(2：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，得到C1。
在室温向C1(1.07mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入ADDP(1.28mmol)、三苯膦(1.28mmol)和苯酚(1.28mmol)。搅拌过夜后，用二氯甲烷(30mL)稀释该反应混合物，用1M HCl水溶液(50mL)、饱和Na2CO3水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(2：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，从己烷和乙酸乙酯的混合物中重结晶，得到C2。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(54)
(两种旋转异构体，1：1之比)，m.p.124-125℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.11-2.19(m，1H)，2.30-2.34(m，1H)，3.54-3.64(m，1H)，3.72&3.76(s，3H)，3.81-3.99(m，3H)，4.86-4.94(m，1H)，6.74-6.84(m，4H)，8.68&8.75(d，J＝1.6Hz，2H)，9.05&9.08(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.6，32.4，45.2，47.7，52.8，54.8，55.8，55.9，75.7，115.0，117.1，117.3，120.1，120.2，127.7，127.9，139.9，140.0，148.6，150.4，150.8，154.8，154.8，164.7，165.1；LC-MS(ESI，m/z)：388[M+H]+。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(4-氟苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(55)
(两种旋转异构体，1：1之比，75％)，淡黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.15-2.37(m，2H)，3.56-3.63(m，1H)，3.79-3.97(m，3H)，4.91-4.99(m，1H)，6.76-7.03(m，4H)，8.71&8.76(d，J＝1.6Hz，2H)，9.08&9.10(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.9，32.3，45.1，47.7，52.7，54.8，75.5，77.0，116.2，116.5，116.9，117.0，117.1，120.1，120.2，127.7，127.8，139.8，139.9，148.6，152.6，152.9，157.9(d，J＝245Hz，由于F)，164.7，165.0。
(R)-N-(4-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基氧基)苯基)乙酰胺(56)
(两种旋转异构体，1：1之比，63％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ1.96&1.99(s，3H)，2.03-2.27(m，2H)，3.45-3.50(m，1H)，3.69-3.83(m，3H)，4.83-4.91(m，1H)，6.64&6.74(d，J＝8.8Hz，2H)，7.26&7.33(d，J＝8.8Hz，2H)，8.58&8.65(d，J＝2.0Hz，2H)，8.95-8.99(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ23.3，23.4，29.7，32.0，45.0，47.6，52.6，54.6，75.0，76.4，115.8，115.9，120.0，121.9，127.4，127.5，127.6，127.7，132.4，132.5，139.4，148.4，152.8，153.1，165.0，165.3，169.7。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(57)
(两种旋转异构体，6：4之比，67％)，白色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.20-2.40(m，2H)，3.59-3.66(m，1H)，3.84-4.00(m，3H)，4.97-5.05(m，1H)，6.83&6.92(d，J＝8.8Hz，2H)，7.12&7.18(d，J＝8.8Hz，2H)，8.73&8.77(d，J＝2.0Hz，2H)，9.09&9.11(d，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.8，32.2，45.1，47.6，52.6，54.7，75.2，76.7，116.4，120.1，122.8，127.7，127.8，139.6，139.7，143.4，148.5，155.0，155.2，164.7，164.9。
(R)-4-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基氧基)苯甲酸甲酯(58)
(两种旋转异构体1：1之比)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.21-2.37(m，2H)，3.57-3.65(m，1H)，3.85&3.87(s，3H)，3.89-3.99(m，3H)，5.03-5.11(m，1H)，6.82&6.91(d，J＝7.2Hz，2H)，7.93&7.99(d，J＝7.2Hz，2H)，8.70&8.75(s，2H)，9.07&9.09(s，1H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ22.1，30.0，32.4，45.2，47.7，52.2，52.8，54.8，74.9，76.3，115.0，120.36，123.7，123.8，127.8，127.9，132.0，139.7，148.6，160.2，160.5，164.7，166.7。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(2-氟苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(59)
(两种旋转异构体1：1之比)，1H NMR(400MHz，CD3OD)δ2.26-2.33(m，2H)，3.62-3.97(m，3H)，4.00&4.36(s，1H)，5.06&5.21(s，1H)，7.11&7.27(m，4H)，8.78&8.83(d，J＝2.0Hz，2H)，9.01&9.04(d，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CD3OD)δ29.9，31.9，44.9，52.3,54.4，77.2，78.7，116.62，116.67，116.80，116.85，117.8(d，J＝20Hz，由于F)，120.04(d，J＝3.7Hz，由于F)，122.5，122.6，122.70，122.77，125.1，125.15(d，J＝3.7Hz，由于F)，127.80(d，J＝7.4Hz由于F)，127.9，139.8，153.6(d，J＝244Hz，由于F)，165.4，165.5。
(S)-4-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基氧基)苯甲酸甲酯(60)
(两种旋转异构体1：1之比)，1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ2.21-2.29(m，2H)，3.58&3.61(s，1H)，3.69&3.71(s，3H)，3.73-4.02(m，3H)，4.99&5.06(s，1H)，6.77-6.94(m，4H)，8.73&8.77(s，2H)，8.96&8.99(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.9，31.9，44.1，44.7，52.2，54.2，55.1，55.2，76.0，77.5，114.82，114.88，117.2，119.6，127.7，127.8，140.5，148.7，151.1，151.3，154.7，164.6，164.7。
(S)-(3,5-二硝基苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(61)
(两种旋转异构体1：1之比)，1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ2.19-2.28(m，2H)3.60-4.01(m，4H)，4.98&5.06(s，1H)，6.76-6.94(m，4H)，8.73&8.76(s，2H)，8.95&8.99(s，1H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ31.9，44.7，52.2，54.2，55.0，55.1，65.8，75.9，77.5，114.81，114.87，117.2，119.6，127.7，127.8，128.6，129.8，140.4，148.7，151.3，154.7，164.6，164.7。
(S)-N-(4-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基氧基)苯基)乙酰胺(62)
(两种旋转异构体1：1之比)，1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ1.99(s，3H)，2.22-2.28(m，2H)，3.54-4.06(m，3H)，5.04&5.11(s，1H)，6.80&6.90(d，J＝8.8Hz，1H)，7.46-7.70(m，4H，brs，1H)，8.73&8.76(s，2H)，8.95&8.99(s，1H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ24.1，24.2，30.0，32.2，45.2，47.7，52.7，54.7，75.1，76.6，115.9，120.0，120.1，127.7，127.8，128.7，128.8，131.6，132.0，132.4，132.6，132.7，132.8，139.7，148.4，153.1，165.0，169.1。
(S)-4-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基氧基)苯甲酸(63)
(两种旋转异构体1：1之比)，1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ2.31-2.42(m，2H)，3.61-3.65(m，1H)，3.75-4.06(m，3H)，5.19&5.28(s，1H)，7.02&7.13(d，J＝8.8Hz，2H)，7.98&8.06(d，J＝8.8Hz，2H)，8.72&8.78(d，J＝2.0Hz，2H)，9.02&9.05(s，1H)。
(S)-(3,5-二硝基苯基)(3-(2-氟苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(64)
(两种旋转异构体，1：1之比)，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.14-2.24(m，2H)，3.50-3.88(m，4H)，4.98&5.08(s，1H)，6.86-7.15(m，4H)，8.65&8.69(s，2H)，8.88&8.92(s，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ29.1，31.1，44.1，51.5，53.6，76.4，77.9，115.7，115.8，115.9，116.0，117.1(d，J＝22.3Hz，由于F)，119.2(d，J＝3.7Hz，由于F)，121.7，121.83，121.88，121.9，124.2(d，J＝3.7Hz，由于F)，127.0，139.0，144.1，144.4，148.0，152.8(d，J＝242.6Hz，由于F)，164.6，164.7。
(R)-(3-(2-氟苯氧基)吡咯烷-1-基)(苯基)甲酮(65)
(两种旋转异构体1：1之比)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.02-2.24(m，2H)，3.51-3.91(m，4H)，4.85&4.98(s，1H)，6.86-7.09(m，4H)，7.36-7.48(m，3H)，7.52(d，J＝5.2，1H)，7.53(d，J＝5.2Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.3，32.4，44.3，47.5，52.1，54.8，78.0，79.0，116.8，117.0，117.9，118.6，122.6，122.7，122.9，123.0，124.6(d，J＝3.7Hz由于F)，127.2，127.4，128.5，(d，J＝3.7Hz，由于F)，130.1，130.3，136.7，136.9，144.7(d，J＝20.1Hz由于F)，153.8(d，J＝245.6Hz，由于F)，155.2，170.0，170.2。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(苯基)甲酮(66)
(两种旋转异构体，1：1之比)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.99-2.21(m，2H)，3.48-3.66(m，2H)，3.68&3.73(s，3H)，3.79-3.89(m，2H)，4.74&4.96(s，1H)，6.71(s，2H)，6.76(s，2H)，7.34&7.36(d，J＝5.6Hz，3H)，7.46&7.52(d，J＝5.2Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.2，32.3，44.4，47.6，52.1，54.8，55.8，55.9，76.0，114.9，115.0，117.1，117.3，127.3，127.4，128.50，128.54，130.1，130.2，136.8，137.0，150.9，151.1，154.5，154.6，169.9，170.2；LC-MS(ESI，m/z)：298.1[M+H]+。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-羟基吡咯烷-1-基)甲酮(67)
(两种旋转异构体，1：1之比)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.98-2.11(m，2H)，3.23(brs，1H)，3.37-3.48(m，1H)，3.61-3.79(m，3H)，4.47&4.56(s，1H)，8.62&8.67(s，2H)，8.99-9.00(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ33.0，34.9，45.1，47.6，55.5，57.5，69.4，70.9，120.1，120.2，127.8，139.8，139.9，148.5，165.1，165.3。
(R)-(3-(3-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(3-甲氧基苯基)甲酮(68)
(两种旋转异构体，1：1之比，85％)，淡黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.97–2.22(m，2H)，3.48–3.65(m，2H)，3.68&3.71(s，3H)，3.73&3.76(s，3H)，3.79–3.89(m，2H)，4.74–4.84(m，1H)，6.70–6.80(m，4H)，6.86–6.92(m，1H)，6.99&7.01(s，1H)，7.04&7.08(s，1H)，7.21–7.28(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.2，32.3，44.5，47.7，52.2，54.8，55.6，55.8，76.0，112.6，112.8，114.9，115.0，116.1，116.6，117.1，117.2，119.4，119.6，129.27，129.32，138.1，150.9，151.1，154.5，159.7，169.8。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(3-甲氧基苯基)甲酮(69)
(两种旋转异构体，1：1之比，83％)，淡黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.97–2.22(m，2H)，3.48–3.65(m，2H)，3.68&3.71(s，3H)，3.73&3.76(s，3H)，3.79–3.89(m，2H)，4.72–4.84(m，1H)，6.70–6.80(m，4H)，6.86–6.92(m，1H)，6.99–7.08(m，2H)，7.21–7.28(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.2，32.1，44.4，47.6，52.1，54.4，55.33,55.62，75.8，113.4，114.7，116.9，128.63，128.75，129.16，129.32，131.9，150.9，154.3，160.9，169.48，169.79。
(R)-3-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-羰基)苯甲酸甲酯(70)
(两种旋转异构体，1：1之比，87％)，淡黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.99–2.24(m，2H)，3.45–3.65(m，2H)，3.67&3.71(s，3H)，3.75–3.82(m，2H)，3.86&3.87(s，3H)，4.74–4.86(m，1H)，6.72&6.80(m，4H)，7.40–7.67(m，1H)，7.66&7.71(d，J＝7.6Hz，1H)，8.04(t，J＝9.0Hz，1H)，8.13&8.19(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.9，32.0，44.3，47.3,52.2，54.5，55.5，55.6，75.7，114.7，114.8，116.9，117.0，128.1，128.2，128.5，128.6，130.9，134.0，131.5，131.6，136.8，136.9，150.5，150.7，154.33，154.38，166.6，168.6，168.9。
(R)-4-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-羰基)苯甲酸甲酯(71)
(两种旋转异构体，1：1之比，85％)，淡黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.98–2.11(m，1H)，2.15–2.25(m，1H)，3.42–3.67(m，2H)，3.68&3.71(s，3H)，3.77–3.81(m，1H)，3.83–3.88(m，1H)，3.86&3.88(s，3H)，4.73–4.86(m，1H)，6.69–6.75(m，2H)，6.80(s，2H)，7.51(d，J＝8.0Hz，1H)，7.57(d，J＝8.4Hz，1H)，8.00(d，J＝8.4Hz，1H)，8.03(d，J＝8.4Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.9，32.0，44.2，47.2，51.9，52.2，54.3,55.5，55.6，75.6，114.7，114.8，116.8，117.0，127.0，127.1，129.5，129.6，131.2，131.3，140.7，140.8，150.5，150.7，154.3，154.4，168.7，168.9。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(3-(三氟甲基)苯基)甲酮(72)
(两种旋转异构体，1：1之比，82％)，淡黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.04–2.15(m，1H)，2.21–2.30(m，1H)，3.48–3.67(m，2H)，3.72&3.75(s，3H)，3.78–3.90(m，2H)，4.79–4.90(m，1H)，6.74–6.83(m，4H)，7.48–7.55(m，1H)，7.64–7.82(m，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.0，32.1，44.5，47.5，52.2，54.6，55.7，55.8，75.8，114.8，114.9，117.0，117.2，124.2，124.3，129.0，129.1，130.4，130.6，137.3，137.4.150.6，150.8，154.5，154.6，168.3，168.6。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(4-(三氟甲基)苯基)甲酮(73)
(两种旋转异构体，1：1之比，55％)，淡黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.03–2.06(m，1H)，2.20–2.25(m，1H)，3.49–3.70(m，2H)，3.72&3.75(s，3H)，3.81–3.88(m，2H)，4.72&8.89(m，1H)，6.74–6.83(m，4H)，7.23–7.50(m，4H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.0，32.2，44.5，47.5，52.2，54.6，55.7，55.8，75.8，76.8，114.9，117.0，117.2，119.8，120.1，122.5，122.6，125.6，125.8，130.0，130.1，138.5，149.1，150.6，150.9，154.5，168.2。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(3-(三氟甲氧基)苯基)甲酮(74)
(两种旋转异构体，1：1之比，67％)，黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.01–2.23(m，2H)，3.43–3.68(m，2H)，3.69&3.72(s，3H)，3.72–3.83(m，2H)，4.75–4.88(m，1H)，6.72–6.82(m，4H)，7.58–7.66(m，4H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.1，30.1，32.2，38.9，44.6，47.6，52.2，54.7，55.8，75.9，114.9，115.0，117.1，117.3，125.5，125.6，127.7，128.8，150.8，151.0，154.6，154.7，168.5，168.6。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(3-硝基苯基)甲酮(75)
(两种旋转异构体，1：1之比，84％)，黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.00–2.24(m，2H)，3.48–3.56(m，1H)，3.68&3.72(s，3H)，3.73–3.88(m，3H)，4.79–4.89(m，1H)，6.71–6.83(m，4H)，7.52–7.59(m，1H)，7.81&7.87(d，J＝7.6H，1H)，8.22(t，J＝9.8Hz，1H)，8.32&8.38(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.8，32.0，44.5，47.4，52.2，54.5，55.5，55.6，75.6，77.0，114.7，114.8，116.9，117.0，122.2，122.3，124.6，124.7，129.6，133.1，133.2，138.0，138.1，147.8，150.4，150.6，154.3，154.4，166.9，167.2。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(4-硝基苯基)甲酮(76)
(两种旋转异构体，1：1之比，73％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.01–2.31(m，2H)，3.44–3.69(m，2H)，3.72&3.75(s，3H)，3.80–3.90(m，2H)，4.79-4.90(m，1H)，6.72–6.82(m，4H)，7.63&7.70(d，J＝8.0Hz，2H)，8.22&8.24(d，J＝8.2Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.2，31.9，44.3，47.2，52.0，55.5，75.5，76.7，114.7，114.8，116.8，116.9，123.5，128.0，128.2，128.6，142.4，142.5，148.4，150.3，150.6，154.3，154.4，167.3，167.6。
(R)-(3-氟苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(77)
(两种旋转异构体，1：1之比，78％)，淡黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.01–2.11(m，1H)，2.12–2.42(m，1H)，3.48–3.69(m，2H)，3.71&3.74(s，3H)，3.78–3.87(m，2H)，4.76–4.88(m，1H)，6.72–6.82(m，4H)，7.05–7.36(m，4H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.9，32.0，44.3，47.4，52.0，54.5，55.6，75.7，114.4，114.8，116.9，117.1，122.8，122.9，130.1，130.2，138.6，138.7，150.6，150.8，154.4，154.5，162.4(d，J＝245Hz，由于F)，168.3，168.5。
(R)-(3-氯苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(78)
(两种旋转异构体，1：1之比，87％)，淡黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.01–2.24(m，2H)，3.47–3.69(m，2H)，3.71&3.74(s，3H)，3.78–3.86(m，2H)，4.75–4.88(m，1H)，6.73–6.82(m，4H)，7.26–7.42(m，3H)，7.46&7.52(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.9，32.0，44.3，47.4，52.0，54.5，55.6，55.7，75.7，76.7，114.7，114.8，116.6，117.1，125.1，125.3，127.3，127.4，129.7，129.8，130.0，130.1，134.3，138.2，138.3，150.5，150.7，154.4，168.1，168.4
(R)-(3-羟基苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(79)
(两种旋转异构体，1：1之比，53％)，白色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.96–2.25(m，2H)，3.53–3.74(m，2H)，3.77&3.81(s，3H)，3.83–3.94(m，2H)，4.73&4.87(m，1H)，6.72–6.82(m，4H)，6.85–6.98(m，2H)，7.08–7.20(m，2H)，8.21(brs，1H)；
(R)-(4-羟基苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(80)
(两种旋转异构体，1：1之比，37％)，白色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.03–2.32(m，2H)，3.59–3.71(m，2H)，3.74&3.76(s，3H)，3.79–3.93(m，2H)，4.80–4.91(m，1H)，6.75–6.84(m，4H)，7.21–7.24(m，2H)，7.56&7.62(d，J＝8.0Hz，2H)，8.01&8.03(brs，1H)。
(R)-(4-羟基-3-硝基苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(81)
(两种旋转异构体，1：1之比，63％)，黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.01–2.14(m，1H)，2.25–2.27(m，1H)，3.56–3.65(m，2H)，3.72&3.74(s，3H)，3.81–3.91(m，2H)，4.81-4.89(m，1H)，6.76(m，4H)，7.16(t，J＝9.4Hz，1H)，7.78&7.84(d，J＝8.4Hz，1H)，8.29&8.37(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.9，31.8，45.0，47.6，52.6，54.9，55.9，115.1，117.2，117.3，120.4，124,7，125.0，128.8，133.1，136.9，137.0，151.0，154.7，156.4，166.9，167.3。
(R)-(3,5-二氯苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(82)
(两种旋转异构体，1：1之比，85％)，淡黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.02-2.10(m，1H)，2.20-2.25(m，1H)，3.47–3.70(m，2H)，3.72&3.74(s，3H)，3.75-3.85(m，2H)，4.78-4.87(m，1H)，6.74-6.82(m，4H)，7.34-7.41(m，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.9，32.0，44.4，47.4，52.1，54.4，55.6，55.7，75.5，114.8，116.9，125.6，125.7，130.0，135.1，139.2，139.3，150.4，150.7，154.4，154.5，166.7，167.0。
(R)-(3,5-二氟苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(83)
(两种旋转异构体，1：1之比，75％)，黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.01–2.27(m，2H)，3.48–3.67(m，2H)，3.71&3.74(s，3H)，3.77–3.85(m，2H)，4.78-4.88(m，1H)，6.73–6.87(m，5H)，6.99&7.06(d，J＝5.6Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.8，32.0，44.4，47.3,52.1，54.9，55.6，75.6，105.3，105.4，110.3，110.4，110.5，110.7，114.8，116.9，117.1，150.2，154.9，162.4(d，J＝250Hz，由于F)，162.5(d，J＝250Hz，由于F)，167.0，167.3。
(R)-(3,5-双(三氟甲基)苯基)(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(84)
(两种旋转异构体，1：1之比，65％)，黄色液体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.08–2.14(m，1H)，2.24–2.29(m，1H)，3.47–3.67(m，2H)，3.71&3.74(s，3H)，3.76–3.91(m，2H)，4.81–4.91(m，1H)，6.74–6.83(m，4H)，7.90–8.12(m，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.8，32.1，44.6，47.4，52.3,54.5，55.6，75.6，114.8，114.9，116,9，117.2，123.7，124.3，127.5，127.7，131.1，132.1，138.5，138.6，150.4，150.7，154.5，154.7，166.5，166.8。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(吡啶-3-基)甲酮(85)
(两种旋转异构体，1：1之比，82％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.00–2.10(m，1H)，2.16–2.24(m，1H)，3.48–3.58(m，1H)，3.64–3.73(m，1H)，3.67&3.69(s，3H)，3.73–3.85(m，2H)，4.75–4.85(m，1H)，6.69–6.78(m，4H)，7.25–7.31(m，1H)，7.78&7.83(d，J＝7.6Hz，1H)，8.57–8.61(m，1H)，8.71&8.77(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.7，31.9，44.3，47.2，51.9，54.4，55.49，55.53，75.5，114.66，114.69，116.8，116.9，123.1，123.2，132.3，134.8，134.9，147.9，148.1，150.39，150.63，150.83，150.89，154.2，154.3，167.0，167.3。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(吡啶-4-基)甲酮(86)
(两种旋转异构体，1：1之比，79％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.04–2.23(m，2H)，3.46–3.67(m，2H)，3.70&3.72(s，3H)，3.73–3.90(m，2H)，4.78–4.88(m，1H)，6.76–6.82(m，4H)，7.34(s，1H)，7.40(s，1H)，8.66(d，J＝13.2Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.6，31.7，44.0，46.8，51.7，53.9，55.3,55.4，75.3，114.5，114.6，116.7，116.8，120.9，121.0，143.6，143.7，149.7，150.2，154.1，154.2，166.9，167.1。
(R)-4-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-羰基)吡啶1-氧化物(87)
(两种旋转异构体，1：1之比，97％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.03-2.11(m，1H)，2.21–2.26(m，1H)，3.50–3.68(m，2H)，3.70&3.72(s，3H)，3.74–3.88(m，2H)，4.79–4.87(m，1H)，6.70–6.81(m，4H)，7.25–7.41(m，2H)，8.17–8.20(m，1H)，8.29&8.35(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.8，32.0，44，7，47.3,52.3,54.4，55.7，75.4，114.8，116.9，117.0，124.5，126.0，126.1，135.7，135.8，137.9，138.1，140.1，150.3，154.5，154.5，164.1，164.3。
(R)-4-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-羰基)吡啶-1-氧化物(88)
(两种旋转异构体，1：1之比，95％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.03-2.10(m，1H)，2.22–2.27(m，1H)，3.52–3.68(m，2H)，3.70&3.72(s，3H)，3.76–3.83(m，2H)，4.80–4.87(m，1H)，6.70–6.79(m，4H)，7.40(d，J＝6.4Hz，1H)，7.47(d，J＝6.8Hz，1H)，8.13–8.18(m，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.7，32.1，44.7，47.3,52.4，54.4，55.6，75.4，114.8，116.9，125.0，125.1，132.9，133.0，139.1，150.3，150.6，154.4，154.6，165.3。
(R)-(3-(4-甲氧基苯氧基)吡咯烷-1-基)(嘧啶-5-基)甲酮(89)
(两种旋转异构体，1：1之比，84％)，淡黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.03–2.13(m，1H)，2.23–2.28(m，1H)，3.52–3.67(m，2H)，3.69&3.72(s，3H)，3.78–3.88(m，2H)，4.79–4.89(m，1H)，6.70–6.80(m，4H)，8.56&8.91(s，2H)，9.20&9.22(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.8，32.1，44.7，52.3,54.4，55.6，55.7，75.5，114.8，116.9，117.0130.2，130.3，150.3，150.6，154.5，154.6，155.5，155.6，159.4，159.5，164.5。
(3,5-二硝基苯基)(4-羟基哌啶-1-基)甲酮(90)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ1.50-1.56(m，2H)，1.80-1.90(m，2H)，3.30-3.42(m，2H)，3.63(brs，1H)，3.94-4.05(m，3H)，8.61(d，J＝2.0Hz，2H)，8.95(d，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ33.7，34.5，39.5，44.9，66.0，119.1，127.4，140.2，148.8，165.1。
4-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)哌啶-4-基氧基)苯甲酸甲酯(91)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ1.84(brs，2H)，1.96(brs，2H)，3.31(brs，1H)，3.59-3.74(m，2H)，3.77(s，3H)，3.84-3.96(m，1H)，4.63-4.66(m，1H)，6.81-6.85(m，2H)，7.87-7.90(m，2H)，8.50(d，J＝2.0Hz，2H)，8.97(d，J＝2.0Hz，1H)。
(3,5-二硝基苯基)(4-(4-甲氧基苯氧基)哌啶-1-基)甲酮(92)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.85-1.98(m，4H)，3.35(brs，1H)，3.68-3.80(m，2H)，3.73(s，3H)，3.93(brs，1H)，4.49(brs，1H)，6.79(d，J＝8.4Hz，2H)，6.84(d，J＝8.4Hz，2H)，8.57(s，2H)，9.03(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.0，31.2，39.3，44.6，55.8，71.9，115.0，117.9，119.8，127.5，139.6，148.7，150.8，154.6，165.4。
N-(4-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)哌啶-4-基氧基)苯基)乙酰胺(93)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.62-1.96(m，4H)，1.97(s，3H)，3.48(m，3H)，3.93(brs，1H)，4.56(s，1H)，6.89(d，J＝8.4Hz，2H)，7.44(d，J＝8.4Hz，2H)，8.64(s，2H)，8.33(s，1H)，9.74(s，1H)；
(3,5-二硝基苯基)(4-(2-氟苯氧基)哌啶-1-基)甲酮(94)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.70-2.10(m，4H)，3.39-4.11(m，4H)，4.59(m，1H)，6.86-6.92(m，1H)，7.01-7.15(m，3H)，8.60(d，J＝2.0Hz，2H)，8.89(d，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ31.1，31.9，45.5，49.6，75.0，117.6(d，J＝18.6Hz，由于F)，119.5，120.5，123.3(d，J＝6.7Hz，由于F)，126.0(d，J＝3.7Hz，由于F)，128.6，140.6，146.1，149.8，154.8(d，J＝242.6Hz，由于F)，166.9。
(3,5-二硝基苯基)(4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲酮(95)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.02-3.12(m，4H)，3.62(brs，2H)，3.82(s，3H)，3.87(brs，2H)，6.85-6.95(m，4H)，8.68(d，J＝2.0Hz，2H)，8.96(d，J＝2.4Hz，1H)；LC-MS(ESI，m/z)：387[M+H]+。
(3,5-二硝基苯基)(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)甲酮(96)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.08-3.17(m，4H)，3.68(brs，2H)，3.71(s，3H)，3.88(brs，2H)，6.82(d，J＝8.8Hz，2H)，6.93，(d，J＝8.8Hz，2H)，8.69(d，J＝2.0Hz，2H)，8.98(d，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ42.4，47.7，50.5，50.9，54.9，114.4，118.8，119.3，127.7，139.9，145.6，148.8，154.5，165.2；LC-MS(ESI，m/z)：387[M+H]+。
(4-(2-氯苯基)哌嗪-1-基)(3,5-二硝基苯基)甲酮(97)
1H NMR(400MHz，丙酮-d6)δ3.09-3.17(m，4H)，3.70(brs，2H)，3.94(brs，2H)，7.07(t，J＝7.6Hz，1H)，7.18(d，J＝8Hz，1H)，7.30(t，J＝8Hz，1H)，7.41(d，J＝8Hz，1H)，8.72(s，1H)，9.00(s，1H)；13C NMR(100MHz，丙酮-d6)δ43.3，48.7，51.6，52.1，120.0，122.0，125.3，128.5，128.9，129.4，131.4，140.6，149.6，149.8，166.1；LC-MS(ESI，m/z)：391[M+H]+。
方案5
合成叔丁基-苄氧基吡咯烷-1-甲酸酯(D1)的一般方法
在0℃向(R)-叔丁基3-羟基吡咯烷-1-甲酸酯(3.2mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中加入氢化钠(3.2mmol)和苄基溴(3.2mmol)，在室温搅拌得到的混合物。搅拌过夜后，加入蒸馏水(50mL)，通过过滤收集得到的沉淀，得到D1。
合成苄氧基-吡咯烷基-苯基甲酮(D2)的一般方法
将D1(0.43mmol)溶于三氟乙酸(5mL)，在室温搅拌。1h后，真空浓缩该反应混合物，得到胺。在0℃向胺的二氯甲烷溶液(5mL)中加入三乙胺(0.51mmol)和苯甲酰氯(0.51mmol)，在室温搅拌得到的混合物。3h后，用二氯甲烷(30mL)稀释该反应混合物，用1M HCl水溶液(30mL)、饱和Na2CO3水溶液(30mL)和盐水(30mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(3：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，从己烷和乙酸乙酯的混合物中重结晶，得到D2。
(R)-(3-(苄氧基)吡咯烷-1-基)(3,5-二硝基苯基)甲酮(98)
(两种旋转异构体，1：1之比，23％)，白色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.18–2.29(m，2H)，3.53–3.58(m，1H)，3.76–3.93(m，3H)，5.12-5.37(m，3H)，7.34–7.44(m，5H)，8.67&8.73(d，J＝1.6Hz，2H)，9.08&9.09(d，J＝1.6Hz，1H)。
((R)-3-(3-氯苄氧基)吡咯烷-1-基)(3,5-二硝基苯基)甲酮(99)
(两种旋转异构体3：1之比，75％)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.93–2.21(m，2H)，3.38–3.83(m，4H)，4.13–4.47(m，1H)，4.99&5.07(s，1H)，5.17&5.29(s，1H)，7.07–7,29(m，4H)，8.64&8.69(s，2H)，8.98(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.8，32.2，45.1，47.6，52.3,54.8，70.3，70.4，76.4，78.0，120.0，120.1，125.5，125.6，127.5，127.7，127.8，127.9，128.1，129.9，134.5，134.6，139.7，139.8，139.9，148.5，164.7，164.8。
((R)-3-(2-氟苄氧基)吡咯烷-1-基)(3,5-二硝基苯基)甲酮(100)
(两种旋转异构体1：1之比)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.02–2.30(m，2H)，3.50&3.52(s，1H)，3.63–3.94(m，3H)，4.24&4.33(s，1H)，4.48&4.56(d，J＝12.0Hz，1H)，4.65(s，1H)，6.99–7.44(m，4H)，8.69&8.75(s，2H)，9.10(s，1H)。
((R)-3-(3-(三氟甲基)苄氧基)吡咯烷-1-基)(3,5-二硝基苯基)甲酮(101)
(两种旋转异构体2：1之比)，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.06–2.29(m，2H)，3.53&3,55(s，1H)，3.78–3.96(m，3H)，4.27&4.35(s，1H)，4.51&4.62(d，J＝12.4Hz，1H)，4.65(s，1H)，7.47–7.62(m，4H)，8.69&8.74(s，2H)，9.07(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.7，32.1，45.1，47.7，52.4，54.9，70.4，70.5，76.7，78.2，120.1，124.1，124.3，124.83，124.87，127.7，127.8，129.2，130.8，130.9，138.7，138.8，139.7，139.8，148.5，165.0。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(吡啶-4-基甲氧基)吡咯烷-1-基)甲酮(102)
(两种旋转异构体，1：1之比，75％)，棕色油状物；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.99–2.24(m，2H)，3.49–3.92(m，4H)，4.20–4.28(m，1H)，4.41–4.61(m，2H)，7.14–7.24(m，2H)，8.49–8.56(m，2H)，8.67&8.70(d，J＝1.6Hz，2H)，9.04(d，J＝1.6Hz，1H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ29.7，32.3，45.1，47.6，52.3,54.8，69.4，69.5，76.9，78.5，120.1，121.6，121.7，121.8，127.7，127.8，139.8，139.9，146.6，146.8，148.5，150.1，150.2，164.7。
方案6
合成氨基吡咯烷基-苯基-甲酮(E3)的一般方法
在冰浴中向(S)-(+)-N-Boc-3-吡咯烷醇(2.67mmol)和三乙胺(4.01mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液中加入甲磺酰氯(4.01mmol)，再在4℃搅拌得到的混合物。2h后，用二氯甲烷(50mL)稀释残余物，用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱(2：1己烷/乙酸乙酯)法纯化粗产物，得到E1。
在100℃搅拌E1(0.75mmol)和胺(3.75mmol)的溶液。搅拌过夜后，将残余物溶于二氯甲烷(30mL)，用水(30mL)和盐水(30mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(1：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，得到E2。
向E2(0.96mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液中加入三氟乙酸(0.5mL)。3h后，真空除去溶剂。将该反应混合物溶于二氯甲烷(20mL)，冷却至0℃。加入三乙胺(4.83mmol)和苯甲酰氯(1.05mmol)。2h后，用二氯甲烷(20mL)稀释残余物，用水(40mL)和盐水(40mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(1：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，得到E3。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(4-甲氧基苯基氨基)吡咯烷-1-基)甲酮(103)
(两种旋转异构体，1：1之比，63％)，棕色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ1.93–2.01(m，1H)，2.14–2.30(m，1H)，3.26–3.30&3.44–3.50(m，1H)，3.54–3.72(m，2H)，3.61&3.68(s，3H)，3.80–3.91(m，1H)，3.95–4.05(m，1H)，6.43&6.55(d，J＝8.8Hz，2H)，6.62&6.70(d，J＝8.8Hz，2H)，8.58&8.67(d，J＝2.4Hz，2H)，8.95-8.99(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ30.4，32.4，45.2，47.9，52.6，53.0，54.4，55.0，55.8，55.9，115.0，115.1，115.2，115.3，120.1，127.6，127.7，139.6，140.5，140.7，148.5，148.6，152.8，152.9，165.2，165.4。
(R)-(3-(4-丁氧基苯基氨基)吡咯烷-1-基)(3,5-二硝基苯基)甲酮(104)
(两种旋转异构体，1：1之比，54％)，棕色固体；m.p.118–120℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.83–0.98(m，3H)，1.39–1.52(m，2H)，1.61–1.76(m，2H)，2.02–2.05(m，1H)，2.24–2.41(m，1H)，3.33–3.37&3.50–3.63(m，2H)，3.66–4.13(m，6H)，6.47&6.60(d，J＝8.4Hz，2H)，6.70&6.78(d，J＝8.4Hz，2H)，8.66&8.74(s，2H)，9.05&9.08(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.0，14.1，19.4，19.5，30.9，31.6，31.7，32.9，45.3，47.9，52.8，53.4，54.6，55.2，68.5，68.6，115.0，115.2，116.0，116.2，120.2，127.8，127.9，139.9，140.1，140.4，148.6，152.7，164.9，165.1。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(4-苯氧基苯基氨基)吡咯烷-1-基)甲酮(105)
(两种旋转异构体，1：1之比，60％)，棕色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ2.00–2.06(m，1H)，2.18–2.35(m，1H)，3.32–3.35&3.48–3.54(m，1H)，3.61–3.78(m，2H)，3.82–4.12(m，2H)，6.47&6.60(d，J＝8.8Hz，2H)，6.77–6.97(m，5H)，7.17，7.24(m，2H)，8.63&8.69(d，J＝1.6Hz，2H)，9.01&9.04(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ30.6，32.5，45.3，47.9，52.3,53.0，54.0，55.1，114.5，114.8，117.4，117.5，120.2，121.3，121.4，122.4，122.5，127.7，127.8，129.7，139.6，142.8，143.0，148.6，148.8，165.2，165.3。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(4-羟基苯基氨基)吡咯烷-1-基)甲酮(106)
(两种旋转异构体，1：1之比，83％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.78–1.89(m，1H)，2.03–2.15(m，1H)，3.12–3.17(m，1H)，3.37–3.45(m，1H)，3.52–3.95(m，3H)，5.15–5.23(m，1H)，6.36–6.56(m，4H)，8.38&8.44(brs，1H)，8.64&8.67(s，2H)，8.81&8.84(s，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ29.6，31.3，44.6，46.9，51.6，51.9，53.3,54.1，113.8，114.2，115.6，115.7，119.4，127.4，127.5，139.6，139.7，140.3，140.4，148.0，148.1，148.5，148.7，164.2。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(苯基氨基)吡咯烷-1-基)甲酮(107)
(两种旋转异构体，1：1之比，80％)，红色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ1.99–2.04(m，1H)，2.17–2.33(m，1H)，3.28–3.31&3.57-3.95(m，4H)，4.04–4.11(m，1H)，6.46–6.48(m，1H)，6.59–6.70(m，2H)，7.02–7.14(m，2H)，8.60&8.67(s，2H)，8.98&9.01(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ30.3，32.2，45.1，47.8，51.7，52.8，53.3,54.9，113.2，113.5，118.3，118.4，120.0，127.6，127.7，129.4，139.5，146.3，146.4，148.4，148.5，165.1，165.3。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(吡啶-2-基氨基)吡咯烷-1-基)甲酮(108)
(两种旋转异构体，1：1之比，70％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.00–2.44(m，2H)，3.38–4.11(m，4H)，4.38&4.50(m，1H)，6.36&6.44(d，J＝8.4Hz，1H)，6.57&6.64(t，J＝6.0Hz，1H)，7.37&7.44(t，J＝7.8Hz，1H)，7.98&8.11(d，J＝5.2Hz，1H)，8.67&8.73(s，2H)，9.05&9.09(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.4，32.6，45.1，47.7，51.7，52.9，55.3，76.7，101.8，108.3，113.7，119.9，127.7，137.5，137.7，147.8，147.9，148.3，148.4，157.2，157.4，164.8，164.9。
(R)-(3-(环己基氨基)吡咯烷-1-基)(3,5-二硝基苯基)甲酮(109)
(两种旋转异构体，1：1之比，69％)，淡黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ0.99–1.35(m，6H)，1.60–1.98(m，5H)，2.15–2.32(m，1H)，2.39–2.57(m，1H)，3.24–3.60(m，2H)，3.63–3.73(m，2H)，3.81–3.91(m，1H)，8.73&8.78(s，2H)，9.10(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ24.7，24.8，24.9，25.6，25.7，30.6，32.4，33.3，33.4，45.2，47.7，52.6，54.5，54.8，54.9，55.1，119.7，127.4，127.5，139.5，148.3，164.9，165.0。
(R)-N-环己基-N-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(110)
(两种旋转异构体，1：1之比，15％)，白色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.01–1.22(m，3H)，1.62–1.86(m，6H)，2.18–2.26(m，1H)，2.74–2.89(m，1H)，3.30–3.35(m，1H)，3.50–3.78(m，2H)，3.97–4.19(m，4H)，8.51&8.56(s，2H)，8.74(s，2H)，9.09-9.10(m，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ24.8，24.9，25.3，25.5，27.3，30.0，31.8，45.6，48.7，48.9，50.0，53.6，54.8，60.5，119.8，120.0，126.7，127.8，139.8，140.1，140.2，140.4，148.6，148.2，164.4，164.7，166.6，166.7。
(R)-(3-(4-甲氧基苯基氨基)吡咯烷-1-基)(苯基)甲酮(111)
(两种旋转异构体，1：1之比，75％)，淡黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.84–1.88(m，1H)，2.08–2.32(m，1H)，3.26–3.34&3.49–4.03(m，5H)，3.69&3.72(s，3H)，6.48&6.50(d，J＝6.4Hz，2H)，6.71&6.76(d，J＝6.4Hz，2H)，7.36–7.51(m，5H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.7，32.5，44.5，47.7，52.6，52.7，54.2，55.2，55.8，55.9，114.7，114.9，115.0，127.2，128.3，130.1，136.7，140.8，141.0，152.6，170.0。
(R)-(3-(3-氯苄基氨基)吡咯烷-1-基)(3,5-二硝基苯基)甲酮(112)
(两种旋转异构体，1：1之比，32％)，为淡黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ1.83–1.89(m，1H)，2.01–2.08&2.14–2.19(m，1H)，2.75(brs，1H)，3.15–3.19&3.35–3.83(m，7H)，7.05–7.23(m，4H)，8.58&8.67(d，J＝2.0Hz，2H)，8.97–8.99(m，1H)；13CNMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ30.4，32.1，45.2，47.7，51.2，51.4，52.4，54.9，55.2，57.5，119.8，126.0，126.2，127.2，127.3，127.5，127.6，127.8，128.0，129.7，129.8，134.1，134.2，139.5，139.6，141.3，141.7，148.2，148.3，164.7，164.8。
(R)-N-(3-氯苄基)-N-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基)-3,5-二硝基苯甲酰胺(113)
(两种旋转异构体，1：1之比，44％)，白色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.26–2.35(m，2H)，3.56–4.05(m，4H)，4.57–4.65(m，3H)，7.06–7.15(m，2H)，7.24–7.35(m，2H)，8.50–8.62(m，4H)，8.97–9.02(m，2H)；LC-MS(ESI，m/z)：599[M+H]+。
(R)-(3-(苄基氨基)吡咯烷-1-基)(3,5-二硝基苯基)甲酮(114)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.59(brs，1H)，1.87-1.94(m，1H)，2.06-2.24(m，1H)，3.20(dd，J＝4.8，10.4Hz，0.5H)，3.46-3.89(m，6.5H)，7.15-7.36(m，5H)，8.63(d，J＝2.0Hz，1H)，8.71(d，J＝2.0Hz，1H)，9.03(t，J＝2.0Hz，0.5H)，9.06(t，J＝2.0Hz，0.5H)。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(3-(三氟甲基)苄基氨基)吡咯烷-1-基)甲酮(115)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.51(brs，1H)，1.89-1.94(m，1H)，2.10-2.28(m，1H)，3.24(dd，J＝5.2，10.0Hz，0.5H)，3.45-3.92(m，6.5H)，7.40-7.61(m，4H)，8.65(d，J＝2.0Hz，1H)，8.72(d，J＝2.0Hz，1H)，9.06(t，J＝2.0Hz，0.5H)，9.08(t，J＝2.0Hz，0.5H)。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(2-氟苄基氨基)吡咯烷-1-基)甲酮(116)
(两种旋转异构体，1：1之比，75％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.89–1.94(m，1H)，2.11–2.25(m，1H)，3.22–3.89(m，7H)，6.93&7.02(t，J＝8.6Hz，2H)，7.20&7.33(m，2H)，8.66&8.72(d，J＝2.0Hz，2H)，9.06(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.7，32.5，45.3，47.8，51.3,51.5，52.7，55.1，55.4，57.7，115.1，115.3，119.8，119.9，127.6，127.7，129.4，129.6，135.4，135.5，139.8，148.3，148.4，162.0(d，J＝245Hz，由于F)，162.1(d，J＝245Hz，由于F)，164.5，164.6。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(2-氟苄基氨基)吡咯烷-1-基)甲酮盐酸盐(117)
(两种旋转异构体，1：1之比，92％)，白色固体；1H NMR(400MHz，CD3OD+D2O)δ2.24–2.35(m，1H)，2.48–2.63(m，1H)，3.48–4.34(m，7H)，7.13&7.24(t，J＝8.6Hz，2H)，7.47&7.58(q，J＝7.0Hz，2H)，8.73&8.8(d，J＝2.0Hz，2H)，9.16(brs，1H)；13CNMR(100MHz，CD3OD+D2O)δ28.1，29.7，45.5，50.6，50.7，51.9，56.6，57.7，81.1，117.0，117.1，127.7，128.6，128.7，133.2，133.3，139.0，147.1，149.7，167.5，167.6。
(R)-(3,5-二硝基苯基)(3-(吡啶-4-基甲基氨基)吡咯烷-1-基)甲酮(118)
(两种旋转异构体，1：1之比，69％)，黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.80(br，1H)，1.88–2.23(m，2H)，3.23–3.89(m，7H)，7.17&7.26(d，J＝5.2Hz，2H)，8.45&8.52(d，J＝5.6Hz，2H)，8.65&8.69(d，J＝2.0Hz，2H)，9.04(t，J＝2.0Hz，1H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ30.2，32.4，44.7，47.7，52.4，54.8，55.9，76.0，115.0，115.1，117.2，117.4，124.4，124.5，127.0，129.1，130.6，130.8，137.5，137.7，150.8，151.0，154.7，154.8，168.5，168.8。
方案7
合成(R)-N-苯甲酰基吡咯烷基-苯甲酰胺(F5)的一般方法
向F1(3.77mmol)在DMF(15mL)中的溶液中加入叠氮化钠(11.00mmol)，将得到的混合物温至70℃。3h后，真空除去溶剂，溶于乙酸乙酯(50mL)，用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(1：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，得到F2。
向F2(2.68mmol)的溶液中加入10％钯/活性炭，在氮气气氛中搅拌过夜。使用cellite545过滤该反应混合物，真空浓缩得到的滤液，得到F3。
在冰浴中向F3(0.77mmol)和三乙胺(1.16mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入苯甲酰氯(1.00mmol)。使该反应混合物达到室温。2h后，用二氯甲烷(20mL)稀释该反应混合物，用水(30mL)和盐水(30mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过硅胶快速柱色谱法(2：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗产物，得到F4。
向F4(0.59mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三氟乙酸(0.5mL)，在室温搅拌。3h后，真空除去溶剂。将粗产物溶于二氯甲烷(10mL)，加入三乙胺(0.41mL，2.96mmol)。将该反应混合物冷却至0℃，然后加入3,5-二氯苯甲酰氯(0.65mmol)。使得到的混合物达到室温。2h后，真空除去溶剂，通过硅胶快速柱色谱法(1：1己烷/乙酸乙酯)纯化粗残余物，得到F5。
(R)-N-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基)-3-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(119)
(两种旋转异构体，1：1之比，67％)，淡黄色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.07–2.18(m，1H)，2.29–2.40(m，1H)，3.49–3.60(m，1H)，3.68–3.76(m，1H)，3.87–3.98(m，2H)，4.60–4.74(m，1H)，7.19–7.60(m，5H)，8.51&8.59(s，2H)，8.91&8.96(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ29.9，32.5，45.3，48.0，49.2，50.8，51.9，54.8，119.9，120.0，120.2，124.3，125.7，127.6，130.2，135.7，136.0，139.4，148.4，148.5，149.2，164.9，165.0，166.5，166.6。
(R)-N-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基)-4-甲氧基苯甲酰胺(120)
(两种旋转异构体，1：1之比，0.19g，76％)，白色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.08–2.15(m，1H)，2.35–2.47(m，1H)，3.47–4.08(m，4H)，3.81&3.84(s，3H)，4.62–4.64&4.77–4.78(m，1H)，6.45&6.50(brs，1H)，6.82&6.88(d，J＝8.4Hz，2H)，7.62&7.72(d，J＝8.4Hz，2H)，8.62&8.71(s，2H)，9.04&9.08(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ30.0，32.8，45.2，48.0，48.9，50.5，52.2，55.2，55.6，60.6，113.9，120.2，125.6，126.1，127.7，127.8，129.0，139.5，148.5，162.7，164.9，165.0，167.4。
(R)-3-氯-N-(1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基)苯甲酰胺(121)
(两种旋转异构体，1：1之比，66％)，淡黄色固体；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.94–2.20(m，2H)，3.33–3.83(m，4H)，4.42–4.55(m，1H)，7.43–7.60(m，2H)，7.71–7.90(m，2H)，8.66&8.69(d，J＝2.0Hz，2H，brs，1H)，8.83-8.86(m，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ29.3，31.5，44.6，47.0，48.4，49.9，51.1，53.3，119.4，119.5，126.2，126.3，127.0，127.1，127.5，130.2，130.3，131.1，133.0，133.1，136.1，136.3，139.5，139.6，148.0，164.0，164.1，165.0，165.1。
(S)-1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基甲磺酸酯(122)
(两种旋转异构体，1：1之比，92％)，白色固体；m.p.138–140℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.25–2.46(m，2H)，3.03&3.10(s，3H)，3.59–3.67&3.75–4.03(m，4H)，5.28–5.40(m，1H)，8.68&8.73(s，2H)，9.08(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ31.1，33.6，38.9，39.0，44.7，47.2，53.3,55.3，78.2，78.6，120.5，127.8，127.9，139.3，148.7，164.8，165.0；LC-MS(ESI，m/z)：360[M+H]+。
(R)-1-(3,5-二硝基苯甲酰基)吡咯烷-3-基甲磺酸酯(123)
(两种旋转异构体，1：1之比，89％)，白色固体；1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ2.16–2.32(m，2H)，2.94&3.02(s，3H)，3.50–3.91(m，4H)，5.19–5.30(m，1H)，8.58&8.63(s，2H)，8.97(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ30.7，33.1，38.3，38.4，44.5，46.9，53.0，55.0，78.5，79.0，120.1，127.6，139.0，148.4，164.9，165.0。
实施例7：吡啶并嘧啶酮化合物的衍生
根据如下概括的方法(方案8-10)进行吡啶并嘧啶酮化合物(骨架VIII；参见表3)衍生。使用上述测定法检验得到的衍生物的抑制活性且将结果概括在表4中。
方案8
合成G1的一般方法
将2-氨基-3-甲基吡啶(1.0mmol)溶于丙二酸二乙酯(1.0mmol)。将该溶液加热至170℃12h。冷却后，将深色残余物与CH2Cl2(10mL)一起研磨。通过过滤收集残留淡黄色固体，用CH2Cl2洗涤，得到G1。
合成G2的一般方法
在0℃向DMF(2.0mL)中加入POCl3(3.0mmol)。将该混合物在0℃搅拌40min后，加入G1(1.0mmol)在DMF(2.0mL)中的溶液，在80℃搅拌1h。冷却该混合物，真空浓缩。用水稀释残余物，用CH2Cl2(10mLⅹ3)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，浓缩。通过快速柱色谱法纯化残余物，得到G2。
合成G3的一般方法
向G2(1.0mmol)在THF(2.0mL)中的搅拌溶液中加入Et3N(2.0mmol)。将该混合物冷却至0℃。5min后，滴加胺(1.0mmol)，将该混合物在室温搅拌过夜。用CH2Cl2(10mL)稀释该反应混合物，用盐水(10mL)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到G3。
合成G4的一般方法
将G2(0.5mmol)溶于10.4mL叔丁醇和2.5mL2-甲基-2-丁烯。滴加亚氯酸钠(4.59mmol)和磷酸二氢钠(3.46mmol)在4.2mL水中的溶液。将该反应混合物在室温搅拌过夜。然后真空除去挥发性成分，将残余物溶于10ml水，用2个10ml部分己烷萃取。用HCl(水溶液)将水层酸化至pH＝3，用10mL部分二氯甲烷萃取。用20mL冷水洗涤合并的有机层，干燥，浓缩，得到G4。
由G3合成G5的一般方法
将G3(36.6μmol)溶于760μl叔丁醇和180μl2-甲基-2-丁烯。滴加亚氯酸钠(335μmol)和磷酸二氢钠(253μmol)在300μl水中的溶液。将该反应混合物在室温搅拌过夜。然后真空除去挥发性成分，将残余物溶于10ml水，用2个10ml部分己烷萃取。用HCl(水溶液)将水层酸化至pH＝3，用10mL部分二氯甲烷萃取。用20mL冷水洗涤合并的有机层，干燥，浓缩，得到G5。
由G4合成G5的一般方法
向G4(1.0mmol)在DMF(2.0mL)中的搅拌溶液中加入Et3N(2.0mmol)和胺(1.5mmol)，将该混合物在60℃搅拌过夜。用CH2Cl2(10mL)稀释该反应混合物，用盐水(10ml)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过从己烷与二氯甲烷混合物中重结晶纯化粗产物，得到G5。
合成G6的一般方法
在室温将2-氨基-3-甲基吡啶(4.0mmol)在CH2Cl2(3mL)和无水吡啶(1mL)中的溶液中滴加到3-氯-3-氧代-丙酸乙酯(5.3mmol)在CH2Cl2(3mL)中的搅拌溶液中(伴随放出白烟的放热反应在添加过程中出现)。将得到的温热混合物在室温搅拌30min，然后倾入30mL冷水；在搅拌下谨慎加入过量的碳酸钠，将该混合物在室温再搅拌1h。然后收集有机层，用CH2Cl2将水相萃取几次。用水洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到G6。
合成G7的一般方法
将G6(1.83mmol)、POCl3(0.5mL)和多磷酸(137mg)混合物在搅拌下、在130℃加热3h。冷却后，加入无水乙醇，将该混合物回流30min，然后冷却。用碳酸钠水溶液处理该混合物，用CH2Cl2(10mLⅹ3)萃取尽。用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并层,，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到G7。
合成G8的一般方法
向G6(1mmol)在DMF(0.96mL)中的溶液中加入碳酸钾(5.0mmol)，然后加入苯酚(1.94mmol)。在100℃12h后，将该溶液冷却至23℃。用H2O(50mL)洗涤该反应混合物，用CH2Cl2(20mLⅹ3)萃取水层。用1N HCl(20mLⅹ2)洗涤合并的有机层，过滤，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到G8。
合成G9的一般方法
在0℃向DMF(2.0mL)中加入POCl3(3.0mmol)。将该混合物在0℃搅拌40min后，加入G8(1.0mmol)在DMF(2.0mL)中的溶液，在80℃搅拌1h。冷却该混合物，真空浓缩。用水稀释残余物，用CH2Cl2(10mLⅹ3)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，浓缩。通过快速柱色谱法纯化残余物，得到G9。
3-(3-甲基吡啶-2-基氨基)-3-氧代丙酸乙酯(124)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.25(t，J＝7.0Hz，3H)，2.25(s，3H)，3.45(s，2H)，4.20(q，J＝7.2Hz，2H)，7.47(d，J＝8.4Hz，1H)，8.03(d，J＝8.4Hz，1H)，8.07(s，1H)，9.67(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ13.9，17.7，42.6，61.7，113.8，129.3，138.8，147.6，148.8，163.5，168.4。
2-羟基-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(125)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.48(s，3H)，5.44(s，1H)，7.20(t，J＝7.0Hz，1H)，7.87(d，J＝6.8Hz，1H)，8.84(d，J＝6.8Hz，1H)，11.52(brs，1H)。
2-羟基-8-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(126)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.50(s，3H)，4.88(s，1H)，7.20–7.24(m，2H)，8.85(d，J＝6.8Hz，1H)，11.98(br s，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ20.6，80.3，114.4，117.1，127.7，146.7，153.5，155.3，162.3。
2-氯-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(127)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.57(s，3H)，6.45(s，1H)，7.12(t，J＝7.0Hz，1H)，7.68(d，J＝6.8Hz，1H)，8.93(d，J＝6.8Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.0，102.3，115.8，125.7，134.7，136.9，150.0，157.6，157.9。
2-氯-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(128)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.64(s，3H)，7.30(t，J＝7.0Hz，1H)，7.92(d，J＝7.2Hz，1H)，9.10(d，J＝6.4Hz，1H)，10.42(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.7，107.3，117.7，127.0，135.6，140.6，150.0，156.4，160.2，187.1。
2-氯-8-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(129)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.59(s，3H)，7.24(d，J＝7.2Hz，1H)，7.52(s，1H)，9.09(d，J＝7.2Hz，1H)，10.40(s，1H)。
2-氯-7-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(130)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.32(s，3H)，7.49(d，J＝8.8Hz，1H)，7.78(d，J＝8.8Hz，1H)，8.79(s，1H)，10.16(s，1H)。
2-氯-6-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(131)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.11(s，3H)，6.98(d，J＝7.2Hz，1H)，7.51(d，J＝8.8Hz，1H)，7.79(t，J＝8.0Hz，1H)，10.29(s，1H)。
9-甲基-4-氧代-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(132)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.44(s，3H)，6.89(t，J＝6.8Hz，1H)，7.11(t，J＝7.2Hz，1H)，7.34(t，J＝7.6Hz，2H)，7.62(d，J＝6.4Hz，1H)，7.76(d，J＝8.0Hz，2H)，8.80(d，J＝6.8Hz，1H)，10.27(s，1H)，11.67(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.1，94.6，113.6，121.8，124.2，125.9，128.7，133.6，138.1，138.9，152.5，153.8，160.2，190.2。
2-(3-氯苯基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(133)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.50(s，3H)，6.97(t，J＝6.8Hz，1H)，7.08(d，J＝8.0Hz，1H)，7.25(t，J＝8.0Hz，1H)，7.42(d，J＝8.0H，1H)，7.69(d，J＝6.8Hz，1H)，8.18(s，1H)，8.84(d，J＝6.8Hz，1H)，10.27(s，1H)，11.72(brs，1H)。
9-甲基-4-氧代-2-(3-(三氟甲氧基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(134)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.50(s，3H)，6.99(t，J＝7.0Hz，1H)，7.36(t，J＝8.0Hz，1H)，7.42(d，J＝8.0Hz，1H)，7.70(d，J＝6.8Hz，1H)，8.16(s，1H)，8.88(d，J＝8.0Hz，1H)，10.32(s，1H)，11.86(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.0，94.7，114.2，114.7，116.5，119.7，126.1，129.7，133.8，139.4，139.7，149.4，152.6，157.0，160.1，190.4。
9-甲基-4-氧代-2-(3-(三氟甲基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(135)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.49(s，1H)，6.98(t，J＝6.8Hz，1H)，7.37(d，J＝7.6Hz，1H)，7.45(d，J＝7.6Hz，1H)，7.61(d，J＝8.0Hz，1H)，7.70(d，J＝6.0Hz，1H)，8.61(s，1H)，8.87(d，J＝6.8Hz，1H)，10.30(s，1H)，11.85(brs，1H)。
2-(4-叔丁基苯基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(136)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.32(s，9H)，2.48(s，3H)，6.89(t，J＝7.0Hz，1H)，7.37(d，J＝8.4Hz，1H)，7.62(d，J＝6.8Hz，1H)，7.73(d，J＝8.8Hz，1H)，8.81(d，J＝7.2Hz，1H)，10.30(s，1H)，11.68(br s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.2，31.3，34.3，94.6，113.5，121.4，125.6，125.9，133.6，135.6，138.8，147.2，152.6，156.7，160.4，190.2。
2-(3-氯苄基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(137)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.40(s，3H)，4.80(d，J＝6.0Hz，2H)，6.87(t，J＝7.0Hz，1H)，7.24-7.26(m，3H)，7.37(s，1H)，7.59(d，J＝6.8Hz，1H)，8.79(d，J＝7.2Hz，1H)，10.34(brs，1H)，10.30(s，1H)。
9-甲基-2-吗啉代-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(138)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.30(s，3H)，3.65(d，J＝2.4Hz，4H)，3.72(d，J＝3.2Hz，4H)，6.74–6.77(m，1H)，7.49(d，J＝6.8Hz，1H)，8.62(d，J＝7.2Hz，1H)，10.01(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.6，49.5，67.0，95.9，112.9，125.7，133.0，138.1，150.5，158.4，162.3，186.2
2-(4-(2-氯苯基)哌嗪-1-基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(139)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.41(s，3H)，3.19(t，J＝4.8Hz，4H)，3.92(t，J＝4.6Hz，4H)，6.82(t，J＝7.0Hz，1H)，6.98(t，J＝7.6Hz，1H)，7.04(d，J＝7.2Hz，1H)，7.21(t，J＝7.6Hz，1H)，7.36(d，J＝7.6Hz，1H)，7.55(d，J＝6.4Hz，1H)，8.73(d，J＝6.8Hz，1H)，10.15(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.6，49.3,51.4，96.1，112.7，120.5，124.0，125.8，127.6，128.8，130.6，133.0，137.8，148.7，150.5，158.6，162.5，186.4。
2-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(140)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.43(s，3H)，3.05(t，J＝5.8Hz，2H)，4.03(t，J＝5.8Hz，2H)，4.73(s，2H)，6.78(t，J＝7.0Hz，1H)，7.06–7.17(m，4H)，7.52(d，J＝6.8Hz，1H)，8.70(d，J＝7.6Hz，1H)，10.21(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.6，28.7，46.3,52.0，96.1，112.5，125.8，126.2，126.6，128.4，133.0，133.9，134.6，137.5，150.3，158.6，162.3，186.7。
2-(异丁基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(141)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.95(d，J＝4Hz，6H)，1.90(m，1H)，2.37(s，3H)，3.41(t，J＝6.8Hz，2H)，6.76(t，J＝6.8Hz，1H)，7.24–7.52(m，1H)，8.69(dd，J＝0.8，7.2Hz，1H)，9.67(brs，1H)，10.22(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.9，20.4，28.7，48.1，94.4，112.5，125.9，133.2，138.1，152.8，159.5，160.7，190.2。
2-(二乙氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(142)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.25(t，J＝6.8Hz，6H)，2.36(s，3H)，3.65(q，J＝6.8Hz，4H)，6.72(t，J＝6.8Hz，1H)，7.47(d，J＝6.8Hz，1H)，8.65(d，J＝6.4Hz，1H)，10.12(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ13.2，17.7，45.3，96.2，112.2，125.8，133.0，137.3，150.2，158.5，162.6，186.9。
2-(环己基甲基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(143)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.93–1.02(m，2H)，1.11–1.25(m，3H)，1.57–1.77(m，6H)，2.36(s，3H)，3.43(t，J＝6.0Hz，2H)，6.75(t，J＝7.2Hz，1H)，7.50(d，J＝7.2Hz，1H)，8.67(d，J＝6.8Hz，1H)，9.65(brs，1H)，10.21(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.9，26.0，26.5，31.1，38.2，47.0，94.4，112.5，125.8，133.2，138.0，152.8，159.4，160.6，190.2
2-氯-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(144)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.58(s，3H)，7.53(t，J＝7.0Hz，1H)，8.14(d，J＝7.2Hz，1H)，8.97(d.J＝6.8Hz，1H)，13.53(brs，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ16.7，108.1，117.1，125.6，133.3，138.7，148.2，152.0，154.6，163.9。
2-氯-7-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(145)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.49(s，3H)，7.76(d，J＝8.8Hz，1H)，8.11(d，J＝8.8Hz，1H)，8.89(s，1H)，13.46(br s，1H)。
2-氯-6-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(146)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.00(s，3H)，7.19(d，J＝7.6Hz，1H)，7.52(d，J＝8.0Hz，1H)，7.92(t，J＝8.0Hz，1H)，13.35(br s，1H)。
9-甲基-4-氧代-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(147)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.50(s，3H)，6.70(dd，J＝6.8，7.2Hz，1H)，7.15(dd，J＝7.2，7.2Hz，1H)，7.37(dd，J＝7.2，7.6Hz，2H)，7.65(d，J＝6.8Hz，1H)，7.76(d，J＝8.4Hz，2H)，8.76(d，J＝7.2Hz，1H)，11.70(brs，1H)，14.31(s，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(148)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.55(s，3H)，7.04(t，J＝7.0Hz，1H)，7.12(d，J＝8.0Hz，1H)，7.28(J＝8.0Hz，1H)，7.71(d，J＝8.0Hz，1H)，8.17(s，1H)，8.79(d，J＝7.6Hz，1H)，11.78(brs，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-8-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(149)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.49(s，3H)，6.93(d，J＝7.6Hz，1H)，7.12(d，J＝7.6Hz，1H)，7.25–7.29(m，2H)，7.46(d，J＝7.2Hz，1H)，7.96(s，1H)，8.76(d，J＝7.2Hz，1H)，11.72(br s，1H)，14.19(s，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-7-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(150)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.41(s，3H)，7.12(d，J＝8.0Hz，1H)，7.27(t，J＝8.6Hz，1H)，7.41(d，J＝8.8Hz，1H)，7.47(d，J＝7.6Hz，1H)，7.96(s，1H)，8.68(s，1H)，11.70(br s，1H)，14.28(s，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-6-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(151)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.03(s，3H)，6.70(d，J＝6.8Hz，1H)，7.10(d，J＝8.0Hz，1H)，7.23–7.27(m，2H)，7.44(d，J＝8.0Hz，1H)，7.56(t，J＝8.0Hz，1H)，7.91(s，1H)，11.76(br s，1H)，14.37(s，1H)。
2-(3-氟苯基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(152)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.54(s，3H)，6.81–6.87(m，1H)，7.03(t，J＝7.2Hz，1H)，7.28–7.31(m，2H)，7.71(d，J＝6.8Hz，1H)，7.89(d，J＝10.4Hz，1H)，8.79(d，J＝7.2Hz1H)，11.83(b s，1H)，14.26(br s，1H)。
9-甲基-4-氧代-2-(3-(三氟甲基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(153)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.54(s，3H)，7.05(t，J＝7.0Hz，1H)，7.40(d，J＝7.6Hz，1H)，7.47(t，J＝8.0Hz，1H)，7.61(d，J＝8.0Hz，1H)，7.73(d，J＝6.8Hz，1H)，8.58(s1H)，8.81(d，J＝6.8Hz，1H)，11.91(br s，1H)。
9-甲基-4-氧代-2-(3-(三氟甲氧基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(154)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.58(s，3H)，7.00(d，J＝8.0Hz，1H)，7.05(t，J＝7.0Hz，1H)，7.36(t，J＝8.0Hz，1H)，7.42(d，J＝8.0Hz，1H)，7.72(d，J＝6.8Hz，1H)，8.09(s，1H)，8.81(d，J＝7.2Hz，1H)，11.89(br s，1H)，14.26(br s，1H)。
9-甲基-2-(3-硝基苯基氨基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(155)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.60(s，3H)，7.40(t，J＝7.0Hz，1H)，7.73(t，J＝8.2Hz，1H)，7.96(d，J＝7.6Hz，1H)，8.02(d，J＝7.6Hz，1H)，8.13(d，J＝6.8Hz，1H)，8.90(d，J＝7.2Hz，1H)，9.33(s，1H)，11.84(br s，1H)，14.43(br s，1H)。
2-(3-(甲氧羰基)苯基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(156)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.57(s，3H)，3.92(s，3H)，7.052(t，J＝6.8Hz，1H)，7.43(t，J＝8.0Hz，1H)，7.71(t，J＝7.0Hz，2H)，7.82(d，J＝8.0Hz，1H)，8.79(d，J＝6.8Hz，1H)，8.83(s，1H)，11.83(br s，1H)，14.28(br s，1H)。
2-(3-羟基苯基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(157)
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ2.55(s，3H)，6.61(d，J＝8.0Hz，1H)，7.15–7.24(m，3H)，7.34(s，1H)，7.88(d，J＝6.8Hz，1H)，8.82(d，J＝7.2Hz，1H)。
2-(4-羟基苯基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(158)
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ2.45(s，3H)，6.81(d，J＝8.8Hz，2H)，7.10(t，J＝7.0Hz，1H)，7.57(d，J＝8.8Hz，1H)，7.81(d，J＝6.8Hz，1H)，8.78(d，J＝7.2Hz，1H)，11.26(br s，1H)。
2-(4-叔丁基苯基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(159)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.33(s，9H)，2.49(s，3H)，6.95(t，J＝7.0Hz，1H)，7.37(d，J＝7.2Hz，2H)，7.63(d，J＝5.6Hz，1H)，7.69(d，J＝6.8Hz，2H)，8.71(d，J＝6.8Hz，1H)，11.64(br s，1H)14.31(br s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.2，31.3，34.4，85.3，114.1，121.3，125.5，125.7，133.6，135.4，138.2，147.4，150.2，157.0，161.8，169.7。
2-(3-氯苄基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(160)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.38(s，3H)，4.83(d，J＝6.0Hz，2H)，7.17(t，J＝7.0Hz，1H)，7.32–7.40(m，3H)，7.50(s，1H)，7.89(d，J＝6.8Hz，1H)，8.68(d，J＝7.2Hz，1H)，9.82(d，J＝6.2Hz，1H)，14.25(br s，1H)。
2-(二乙氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(161)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.32(t，J＝6.8Hz，6H)，2.41(s，3H)，3.68(q，J＝6.8Hz，4H)，6.67(t，J＝7.2Hz，1H)，7.38(d，J＝6.8Hz，1H)，8.71(d，J＝7.2Hz，1H)，14.08(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ13.8，17.8，45.4，96.2，112.2，125.8，133.0，137.3，150.2，158.5，162.6，171.6。
2-(异丁基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(162)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.97(d，J＝6.8Hz，6H)，1.93–1.99(m，1H)，2.40(s，3H)，3.43(t，J＝6.4Hz，2H)，6.84(t，J＝7.2Hz，1H)，7.53(d，J＝6.4Hz，1H)，8.62(d，J＝7.6Hz，1H)，9.52(brs，1H)，14.12(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.9，20.4，28.7，48.6，84.8，113.2，125.7，133.2，137.5，150.5，159.7，162.0，169.9。
2-(环己基甲基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(163)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.98–1.05(m，2H)，1.13–1.24(m，3H)，1.60–1.79(m，6H)，2.42(s，3H)，3.45(t，J＝6.4Hz，2H)，6.83(t，J＝7.2Hz，1H)，7.54(d，J＝6.8Hz，1H)，8.62(d，J＝7.2Hz，1H)，9.57(brs，1H)，14.13(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.0，26.0，26.2，31.2，38.2，47.4，84.8，113.2，125.7，133.2，137.5，150.5，159.6，162.0，170.0。
2-(环己基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(164)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.19–1.42(m，5H)，1.56–1.60(m，2H)，1.70–1.76(m，2H)，1.94–1.98(m，2H)，2.38(s，3H)，6.79(t，J＝6.8Hz，1H)，7.51(d，J＝6.8Hz，1H)，8.56(d，J＝6.8Hz，1H)，9.42(d，J＝6.8Hz，1H)，14.14(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.8，24.7，25.7，32.6，50.0，84.7，113.1，125.6，133.1，137.4，150.5，158.5，162.0，169.9。
2-(环戊基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(165)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.54–1.67(m，4H)，1.73–1.78(m，2H)，2.04–2.10(m，2H)，2.42(s，3H)，4.51(q，J＝6.8Hz，1H)，6.83(t，J＝6.8Hz，1H)，7.53(d，J＝6.8Hz，1H)，8.59(d，J＝6.8Hz，1H)，9.47(d，J＝6.8Hz，1H)，14.15(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.0，24.1，33.3,53.0，84.8，113.3，125.7，133.3，137.5，150.5，158.9，162.0，169.9。
2-(环庚基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(166)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.23–1.57(m，4H)，1.59–1.68(m，4H)，1.69–1.74(m，2H)，1.98-2.04(m，2H)，2.43(s，3H)，4.30–4.36(m，1H)，6.83(t，J＝6.8Hz，1H)，7.53(d，J＝6.8Hz，1H)，8.64(d，J＝6.8Hz，1H)，9.53(d，J＝6.8Hz，1H)，14.19(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.0，24.6，28.1，34.7，52.3，84.8，113.1，125.8，133.2，137.4，150.4，158.3，162.1，170.0。
2-(1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(167)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.51(s，9H)，1.61–1.65(m，2H)，2.01–2.03(m，2H)，2.42(s，3H)，2.99–3.05(m，2H)，3.98–4.00(m，2H)，4.26–4.33(m，1H)，6.88(t，J＝7.2Hz，1H)，7.58(d，J＝6.8Hz，1H)，8.67(d，J＝7.2Hz，1H)，9.56(d，J＝6.8Hz)，14.12(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.9，28.6，31.6，48.5，66.4，79.9，85.0，113.5，125.9，133.2，137.8，150.6，154.9，158.9，162.0，169.9。
2-(2-(4-氟苯氧基)乙氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(168)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.44(s，3H)，4.01(t，J＝5.6Hz，2H)，4.15(t，J＝5.6Hz，2H)，6.83–6.96(m，5H)，7.59(d，J＝6.8Hz，1H)，8.68(d，J＝7.2Hz，1H)，9.81(brs，1H)，14.01(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.0，40.5，67.1，85.3，113.6，115.8，115.9，116.0，116.1，125.9，133.2，137.9，150.6，154.8，159.8，161.9，169.7。
9-甲基-4-氧代-2-(2-(4-(三氟甲氧基)苯氧基)乙氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(169)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.44(s，3H)，4.03(t，J＝5.6Hz，2H),4.18(t，J＝5.6Hz，2H)，6.90(d，J＝9.2Hz，2H)，6.91(t，J＝6.8Hz，1H)，7.11(d，J＝9.2Hz，2H)，7.60(d，J＝6.8Hz，1H)，9.70(d，J＝7.2Hz，1H)，9.82(brs，1H)，14.08(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.0，40.5，66.9，77.4，85.4，113.7，115.7，122.6，126.0，133.2，138.0，155.8，157.6，159.9，162.0，169.0，170.4。
9-甲基-2-吗啉代-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(170)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.42(s，3H)，3.65(t，J＝4.8Hz，4H)，3.74(t，J＝4.8Hz，4H)，6.86(t，J＝6.8Hz，1H)，7.51(d，J＝6.8Hz，1H)，8.67(d，J＝6.8Hz，1H)，13.98(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.1，58.4，64.8，97.5，113.6，124.6，132.6，136.0，148.1，160.5，161.7，171.3。
2-(3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(171)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.45(s，3H)，3.03(t，J＝5.8Hz，2H)，4.08(m，2H)，4.73(m，2H)，6.83(t，J＝7.0Hz，1H)，7.06–7.18(m，4H)，7.52(d，J＝6.8Hz，1H)，8.60(d，J＝7.2Hz，1H)，13.73(br s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.6，28.5，46.1，52.4，86.4，113.0，125.5，126.1，126.2，126.6，128.4，132.9，133.7，134.4，136.8，148.1，159.9，163.2，165.3。
2-(4-(2-氯苯基)哌嗪-1-基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(172)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.44(s，3H)，3.19(t，J＝4.8Hz，4H)，3.96(m，4H)，6.87(t，J＝7.0Hz，1H)，6.98(t，J＝7.6Hz，1H)，7.02(d，J＝8.4Hz，1H)，7.20(t，J＝7.8Hz，1H)，7.36(d，J＝8.0Hz，1H)，7.55(d，J＝6.8Hz，1H)，8.66(d，J＝7.2Hz，1H)，13.74(br s，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-8-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(173)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.34(s，3H)，2.53(t，J＝4.8Hz，4H)，3.54(t，J＝4.8Hz，4H)，6.34(d，J＝2.8Hz，1H)，6.55(dd，J＝2.8，8.4Hz，1H)，7.04(d，J＝7.2Hz，1H)，7.22(t，J＝8.0Hz，1H)，7.49(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，7.86(t，J＝2.0Hz，1H)，8.53(d，J＝8.4Hz，1H)，11.5(s，1H)，14.18(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ46.1，46.4，54.4，83.6，98.8，105.1，120.0，121.9，124.0，128.8，129.9，134.4，139.9，151.4，155.6，158.2，161.8，170.2。
方案9
合成H1的一般方法
将2-氨基-3-甲基吡啶(1.0mmol)溶于乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(1.0mmol)。将该溶液加热至170℃，持续12h。冷却后，将深色残余物与EtOAc(10mL)一起研磨。通过过滤收集残留的淡黄色固体，用EtOAc洗涤，得到H1。
合成H2的一般方法
向H1(0.43mmol)在H2O(3.0mL)和EtOH(1.0mL)中的搅拌溶液中加入LiOH(0.86mmol)。将该混合物在室温搅拌3h。用CH2Cl2(10mL)稀释该反应混合物，用1N HCl(10ml)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到H2。
合成H3的一般方法
在0℃向H1(0.38mmol)在THF(2.0mL)中的搅拌溶液中加入LiAlH4(0.57mmol)。将该反应混合物在0℃搅拌3h。反应完成后，滴加1N NaOH(2mL)。用CH2Cl2(10mL)稀释该混合物，用H2O(10ml)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到H3。
合成H4的一般方法
在0℃向H3(95μmol)在CH2Cl2(1.0mL)中的搅拌溶液中加入NaHCO3(285μmol)和Dess-Martin Periodinane(114μmol)。将该混合物在0℃搅拌1h。过滤出该反应混合物，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到H4。
合成H5的一般方法
向2-氨基-吡啶(10.6mmol)在二甲苯(10.0mL)中的搅拌溶液中加入乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(21.2mmol)。将该混合物在140℃搅拌3hr。反应完成后，通过过滤收集残留淡黄色固体，用乙醚洗涤，得到H5。
合成H6的一般方法
在0℃向H5(0.42mmol)在THF(5.0mL)中的搅拌溶液中加入三乙胺(0.63mmol)和对甲苯磺酰氯(0.46mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。反应完成后，用CH2Cl2(40mL)稀释该混合物，用1N HCl(50ml)、饱和NaHCO3(50ml)和盐水(50ml)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到H6。
合成H7的一般方法
在0℃向H6(0.25mmol)在THF(1.2mL)中的搅拌溶液中加入三乙胺(0.5mmol)和胺(0.26mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。反应完成后，用CH2Cl2(10mL)稀释该混合物，用1N HCl(10ml)、饱和NaHCO3(10ml)和盐水(10ml)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到H7。
合成H8的一般方法
向H7(0.27mmol)在乙二醇(3.0mL)中的搅拌溶液中加入甲胺(2N的THF溶液1.3mL)。将该混合物在150℃搅拌3hr。向该反应混合物中加入乙酸乙酯(10mL)，通过过滤收集残留的淡色固体，用EtOAc洗涤。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到H8。
合成H9的一般方法
向H5(2.13mmol)在MeOH(8.0mL)中的搅拌溶液中加入Pd/C(113mg)。将该混合物在室温下、在H2气气氛中搅拌3h。反应完成后，过滤出该反应混合物，真空浓缩。使粗产物从EtOAc和己烷(1：4)中重结晶，得到H9。
合成H10的一般方法
在0℃向H9(0.42mmol)在CH2Cl2(5.0mL)中的搅拌溶液中加入三乙胺(0.63mmol)和对甲苯磺酰氯(0.46mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。反应完成后，用CH2Cl2(40mL)稀释该混合物，用1NHCl(50ml)、饱和NaHCO3(50ml)和盐水(50ml)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过快速柱色谱法(己烷：EtOAc＝1：2)纯化粗产物，得到H10。
合成H11的一般方法
在0℃向H10(0.25mmol)在THF(2.0mL)中的搅拌溶液中加入三乙胺(0.5mmol)和胺(0.37mmol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。反应完成后，用CH2Cl2(10mL)稀释该混合物，用1N HCl(10ml)、饱和NaHCO3(10ml)和盐水(10ml)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过快速柱色谱法(己烷：EtOAc＝1：1)纯化粗产物，得到H11。
合成H12的一般方法
将G3(1.0mmol)、胺(1.1mmol)和三乙胺(2.0mmol)在THF(2mL)中的溶液回流1h，冷却至室温。将溶剂蒸发至干，用CH2Cl2(20mLⅹ3)萃取。
用5％碳酸氢钠洗涤该反应混合物。干燥有机层(MgSO4)，过滤，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到H12。
合成H13的一般方法
在室温向G3(1.1mmol)、胺(1.0mmol)在CH2Cl2(5mL)中的溶液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(2.0mmol)和冰醋酸(2.0mmol)，历经20h。向该反应混合物中加入饱和氯化铵溶液，搅拌10min。用CH2Cl2(20mL)萃取该反应混合物。干燥有机层(MgSO4)，过滤，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到H13。
9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(174)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.39(t，J＝7.2Hz，3H)，2.62(s，3H)，4.39(q，J＝7.2Hz，2H)，7.20(t，J＝7.2Hz，1H)，7.77(d，J＝7.2Hz，1H)，9.05(s，1H)，9.16(d，J＝7.2Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)14.6，18.2，61.2，105.3，116.8，127.0，135.9，138.2，155.3，158.4，165.0，189.1。
9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(175)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.56(s，3H)，7.12(t，J＝6.8Hz，1H)，7.79(d，J＝6.8Hz，1H)，8.87(s，1H)，9.21(d，J＝7.2Hz)，14.13(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.3，110.9，117.1，128.1，137.6，141.1，155.0，157.1，158.3，171.3。
3-(羟甲基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(176)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.51(s，3H)，3.27(brs，1H)，4.66(s，2H)，7.01(t，J＝6.8Hz，1H)，7.51(d，J＝6.8Hz，1H)，8.32(s，1H)，8.87(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)18.2，44.1，111.2，117.9，127.1，135.7，139.8，153.9，155.6，158.2。
9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(177)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.63(s，3H)，7.29(t，J＝7.2Hz，1H)，7.86(d，J＝7.2Hz，1H)，8.85(s，1H)，9.14(d，J＝7.2Hz，1H)，10.33(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.2，110.9，117.5，126.7，136.5，139.5，153.1，155.6，158.1，188.5。
2-羟基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(178)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.42(t，J＝7.2Hz3H)，4.45(q，J＝7.2Hz，2H)，7.13(ddd，J＝1.2，6.8，7.2Hz，1H)，7.49(d，J＝8.8Hz，1H)，7.82–7.86(m，1H)，9.00(d，J＝7.2Hz，1H)，13.64(brs，1H，NH)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.2，62.3，87.1，115.3，125.1，128.7，140.3，148.4，152.6，155.5，171.7。
2-羟基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸(179)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.50(s，3H)，6.70(dd，J＝6.8，7.2Hz，1H)，7.15(dd，J＝7.2，7.2Hz，1H)，7.37，(dd，J＝7.2，7.6Hz，1H)，7.65(d，J＝6.8Hz，1H)，7.76(d，J＝8.4Hz，1H)，8.76(d，J＝7.2Hz，1H)，11.70(brs，1H)，14.31(s，1H)。
4-氧代-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(180)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.45(t，J＝7.2Hz，3H)，4.44(q，J＝7.2Hz，2H)，6.93(dd，J＝6.8，6.8Hz，1H)，7.29–7.36(m，3H)，7.65–7.68(m，3H)，8.97(d，J＝7.2Hz，1H)，11.39(brs，1H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ14.4，61.0，85.5，113.6，122.5，124.2，124.5，128.4，128.6，138.4，139.0，151.6，155.9，159.5，169.6。
2-(3-羟基苯基氨基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(181)
1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ1.38(t，J＝7.0Hz，3H)，4.37(q，J＝7.2Hz，2H)，6.56–6.58(m，1H)，6.92(dd，J＝6.8，7.2Hz，1H0，7.05(d，J＝8.4Hz，1h0，7.12(dd，J＝8.0，8.0Hz，1H)，7.26(m，1H)，7.31(d，J＝8.8Hz，1H)，7.66(dd，J＝7.2，7.6Hz，1H)，8.90(d，J＝7.2Hz，1H)，11.22(brs，1H)。
2-(2-羟基苯基氨基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(182)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.45(t，J＝7.2Hz，3H)，4.45(q，J＝6.8Hz，2H)，6.90(dd，J＝7.2，8.0Hz，1H)，7.05–7.08(m，2H)，7.13(dd，J＝7.6，8.4Hz，2H)，7.37(d，J＝8.4Hz，1H)，7.81(dd，J＝7.6，8.0Hz，1H)，9.03(d，J＝6.8Hz，1H)，11.52(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)14.4，61.3，114.7，120.1，120.5，122.9，124.4，127.0，127.1，129.0，140.8，149.3，151.1，158.6，169.5。
2-(3-硝基苯基氨基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(183)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.46(t，J＝6.4Hz，3H)，4.45(q，J＝7.2Hz，2H)，7.05(ddd，J＝1.2，6.8，6.8Hz，1H)，7.43(d，J＝8.8Hz，1H)，7.47(dd，J＝8.0，8.4Hz，2H)，7.77–7.82(m，2H)，7.93–7.96(m，1H)，8.97–8.98(m，1H)，9.04(dd，J＝0.8，7.2Hz，1H)，11.74(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)14.4，61.3，86.1，114.5，116.9，118.4，124.7，127.4，128.6，129.2，139.8，148.5，151.5，155.7，159.5，169.6。
4-氧代-2-苯氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(184)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.38(t，J＝7.2Hz，3H)，4.42(q，J＝7.2Hz，2H)，7.15–7.17(m，3H)，7.24(d，J＝6.4Hz，1H)，7.36-7.41(m，3H)，7.77(ddd，J＝1.6，6.8，6.8Hz，1H)，9.10(dd，J＝0.8，6.8Hz，1H)；)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.2，61.3，115.7，121.8，125.3，128.5，129.2，128.7，150.3，152.5，156.7，164.1，165.0。
2-(3-氟苯氧基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(185)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.37(t，J＝7.0Hz，3H)，4.40(q，J＝6.8Hz，2H)，6.91–6.98m，3H)，7.19(ddd，J＝1.2，7.2，7.2Hz，1H)，7.32–7.36(m，1H)，7.39(d，J＝8.8Hz，1H)，7.78–7.82(m，1H)，9.10(d，J＝6.8Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.2，61.4，94.6，109.8，110.0，112.2，112.4，115.9，117.5，117.6，125.3，128.5，129.8，129.9，139.9，150.3，153.3，156.6，161.6，163.8，164.0，164.5。
4-氧代-2-(3-(三氟甲基)苯氧基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(186)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.39(t，J＝7.2Hz，3H)，4.43(q，J＝7.0Hz2H)，7.21(dd，J＝6.8，6.8Hz，1H)，7.38(d，J＝8.0Hz，2H)，7.47–7.52(m，2H)，7.81(dd，J＝7.2，8.4Hz，1H)，9.12(d，J＝6.8Hz，1H)。
2-氯-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸甲酯(187)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.56(s，3H)，3.93(s，3H)，7.19(t，J＝7.2Hz，1H)，7.75(d，J＝6.8Hz，1H)，8.91(d，J＝7.2Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.1，52.8，108.0，116.7，126.1，134.9，138.3，149.1，155.1，155.2，164.2。
2-(3-氯苯基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸甲酯(188)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.51(s，3H)，3.99(s，3H)，6.94(t，J＝7.0Hz，1H)，7.09(d，J＝7.6Hz，1H)，7.27(d，J＝8.4Hz，1H)，7.41(d，J＝8.0Hz，1H)，7.64(d，J＝6.8Hz，1H)，8.18(s，1H)，8.91(d，J＝7.2Hz，1H)，11.52(br s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ18.0，52.1，85.3，113.7，119.6，121.9，123.5，126.4，129.4，133.2，134.1，138.4，139.9，151.0，156.2，158.6，170.1。
2-(3-氯苄基氨基)-9-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸甲酯(189)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.35(s，3H)，3.92(s，3H)，4.77(d，J＝6.0Hz，2H)，6.80(t，J＝6.8Hz，1H)，7.20-7.24(m，3H)，7.34(s，3H)，7.50(d，J＝6.8Hz，1H)，8.82(d，J＝7.2Hz，1H)，9.69(br s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.8，44.4，51.8，84.6，112.6，125.5，126.4，127.2，127.7，129.7，132.7，134.3，137.6，141.1，151.3，156.4，160.8，170.1。
2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(190)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.36(t，J＝7.2Hz，3H)，1.82–1.93(m，4H)，2.86(t，J＝6.8Hz，2H)，3.84(t，J＝6.0Hz，2H)，4.39(q，J＝7.2Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.4，18.9，21.9，32.2，43.0，62.4，90.9，159.8，165.1，171.7，173.5。
4-氧代-2-(甲苯磺酰氧基)-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(191)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.25(t，J＝7.2Hz，3H)，1.79–1.91(m，4H)，2.41(s，3H)，2.79(t，J＝6.4Hz，2H)，3.84(t，J＝6.4Hz，2H)，4.25(q，J＝7.2Hz，2H)，7.31(d，J＝8.0Hz，2H)，7.89(d，J＝8.0Hz，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.2，18.8，21.6，21.9，31.8，43.6，61.9，104.2，129.1，129.7，134.2，145.8，159.4，160.8，162.0，162.2。
4-氧代-2-(苯基氨基)-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(192)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.40(t，J＝7.2Hz，3H)，1.80–1.92(m，4H)，2.80(t，J＝6.8Hz，2H)，3.87(t，J＝6.0Hz，2H)，4.36(q，J＝7.2Hz，2H)，7.08(t，J＝7.2Hz，1H)，7.29(t，J＝7.2Hz，2H)，7.53(d，J＝7.6Hz，2H)，11.2(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.6，19.2，22.2，32.2，42.4，61.0，88.4，122.9，124.4，128.8，138.4，160.5，160.8，162.2，169.8。
2-(3-氯苯基氨基)-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(193)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.32(t，J＝7.2Hz，3H)，1.76–1.88(m，4H)，2.76(t，J＝6.8Hz，2H)，3.78(t，J＝6.0Hz，2H)，4.29(q，J7.06(dd，J＝7.2Hz，2H)，J＝1.2，8.0Hz，1H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.51(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)，7.58(d，J＝2.0Hz，1H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ14.3，18.6，22.1，32.1，42.6，61.1，81.4，111.2，111.7，113.0，128.4，140.4,149.6，158.7，161.12，163.2，170.4
4-氧代-2-(3-(三氟甲基)苯基氨基)-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(194)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.45(t，J＝7.2Hz，3H)，1.88–1.97(m，4H)，2.87(t，J＝6.4Hz，2H)，3.93(t，J＝5.6Hz，2H)，4.41(q，J＝7.2Hz，2H)，7.35(t，J＝7.2Hz，1H)，7.35(d，J＝7.6Hz，1H)，7.67(d，J＝7.6Hz，1H)，8.05(s，1H)，11.2(s，1H)；
2-(2-羟基苯基氨基)-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(195)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.40(t，J＝7.2Hz，3H)，1.81–1.94(m，4H)，2.65(t，J＝6.8Hz，2H)，3.65(t，J＝6.0Hz，2H)，4.18(q，J＝6.8Hz，2H)，6.85(t，J＝7.2Hz，1H)，7.00(d，J＝7.2Hz，1H)，7.06–7.12(m，2H)，9.98(s，1H)，11.3(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.6，18.8，21.9，31.6，42.6，61.3，88.4，120.2，120.7，124.5，127.1，127.2，149.1，159.4，159.5，163.0，169.6。
2-(3-羟基苯基氨基)-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(196)
1H NMR(400MHz，CDCl3+MeOD-d4)δ1.26(t，J＝7.2Hz，3H)，1.71–1.81(m，4H)，2.72(t，J＝6.4Hz，2H)，3.74(t，J＝6.4Hz，2H)，4.23(q，J＝7.2Hz，2H)，6.47(d，J＝7.6Hz，1H)，6.88(d，J＝8.0Hz，1H)，6.99(d，J＝8.0Hz，1H)，7.02(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3+MeOD-d4)δ14.2，18.8，21.9，31.8，42.4，60.9，79.8，109.8，111.6，114.0，129.4，139.4,149.7，159.3，160.2，163.1，169.6
2-(4-羟基苯基氨基)-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(197)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.21(t，J＝7.2Hz，3H)，1.67–1.80(m，4H)，2.65(t，J＝6.8Hz，2H)，3.65(t，J＝6.0Hz，2H)，4.18(q，J＝7.2Hz，2H)，6.68(d，J＝8.8Hz，2H)，7.25(d，J＝8.8Hz，2H)，9.29(s，1H)，10.7(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.9，18.9，21.9，32.1，42.3，60.4，87.2，115.7，125.0，130.1，154.9，159.4，160.6，163.3，169.6。
2-(3-氯-4-氟苯基氨基)-9-甲氧基-N-甲基-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺(198)
mp＝218℃(分解)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.97(d，J＝4.8Hz，3H)，4.41(s，3H)，6.89(dd，J＝7.2Hz，7.2Hz，1H)，6.97(dd，J＝1.2Hz，8.0Hz，1H)，7.05(dd，J＝8.8Hz，8.8Hz，1H)，7.40–7.44(m，1H)，8.46–8.51(m，2H)，8.82(d，J＝2.0Hz，1H)，12.98(s，1H)；
(E)-2-(3-氯苯基氨基)-3-((环己基亚氨基)甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(199)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.23–1.37(m，3H)，1.41–1.50(m，2H)，1.56–1.59(m，1H)，1.73–1.76(m，4H)，3.16–3.22(m，1H)，6.85(ddd，J＝1.2，6.8，6.8Hz，1H)，6.94(ddd，J＝0.8，1.2，8.0Hz，1H)，7.14(dd，J＝8.0，8.0Hz，1H)，7.38(ddd，J＝0.8，1.2，8.0Hz，1H)，7.54–7.58(m，1H)，7.90–7.91(m，1H)，8.83(s，1H)，8.85(dd，J＝0.8，1.2Hz，1H)，13.40(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ24.4，25.6，34.9，68.4，91.6，113.4，119.2，121.2，123.0，124.7，127.6，129.5，134.2，137.6，140.8，150.6，156.3，157.0，158.3。
(E)-2-(3-氯苯基氨基)-3-((3-氯苯基亚氨基)甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(200)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.01(dd，J＝0.8，1.2，8.0Hz，1H)，7.28(d，J＝8.4Hz，1H)，7.29(dd，J＝2.0，4.0Hz，1H)，7.33(d，J＝8.0Hz，1H)，7.44(d，J＝8.8Hz，1H)，7.52(ddd，J＝0.8，1.2，8.0Hz，1H)，7.17–7.76(m，1H)，8.02–8.04(m，1H)，8.98(dd，J＝0.8，6.8Hz，1H)，9.17(s，1H)，12.94(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ92.6，114.0，119.5，119.8，121.8，123.9，125.0，125.7，128.0，129.7，130.2，134.4，134.8，138.7，140.1，151.3，151.8，157.0，158.0，158.9。
2-(3-氯苯基氨基)-3-((环戊基氨基)甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(201)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.54–1.57(m，2H)，1.74–1.83(m，4H)，2.05–2.08(m，2H)，3.23–3.24(m，1H)，4.19(s，2H)，6.93–6.98(m，2H)，7.11–7.15(m，1H)，7.32(d，J＝8.4Hz，1H)，7.51(dd，J＝2.0，8.4Hz，1H)，7.61–7.65(m，1H)，7.74–7.75(m，1H)，8.73(d，J＝7.2Hz，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-3-((环己基氨基)甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(202)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.20–1.35(m，4H)，1.66–1.72(m，2H)，1.86–1.89(m，2H)，2.23–2.39(m，2H)，3.12–3.18(m，1H)，6.93(ddd，J＝1.2，6.8，7.2Hz，1H)，6.99(ddd，J＝0.8，1.2，7.6Hz，1H)，7.20(dd，J＝8.0，8.0Hz，1H)，7.25(d，J＝8.8Hz，1H)，7.52–7.57(m，1H)，7.61(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)，7.84–7.85(m，1H)，8.76(d，J＝6.4Hz，1H)，9.77(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ24.6，25.0，41.2，57.9，88.9，114.6，119.2，121.1，122.8，124.6，127.3，129.4，133.7，137.3，140.8，149.6，157.2，158.8。
2-(3-氯苯基氨基)-3-((环庚基氨基)甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(203)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.40–1.59(m，6H)，1.72–1.81(m，4H)，2.18–2.23(m，2H)，3.07–3.12(m，1H)，4.05(m，2H)，6.82(ddd，J＝1.2，6.8，6.8Hz，1H)，6.91(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)，7.14(dd，J＝8.0，8.0Hz，1H)，7.44–7.49(m，2H)，7.78–7.80(m，1H)，8.70(d，J＝6.8Hz，1H)，10.00(brs，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ23.8，32.3，41.5，59.7，89.7，114.2，118.7，120.6，122.4，124.4，127.2，129.3，133.7，136.8，140.9，149.4，157.2，158.2。
2-(3-氯苯基氨基)-3-((异丙基氨基)甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(204)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.25(s，3H)，1.26(s，3H)，2.30–3.06(m，1H)，4.05(s，2H)，6.87(dd，J＝6.4，7.2Hz，1H)，6.95(d，J＝7.2Hz，1H)，7.17(dd，J＝8.0，8.0Hz，1H)，7.32(d，J＝8.8Hz，1H)，7.41(d，J＝8.0Hz，1H)，7.54(dd，J＝7.2，7.2Hz，1H)，7.81(s，1H)，8.83(d，J＝6.8Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ22.1，41.7，48.9，91.5，113.7，118.2，120.1，122.2，124.6，127.5，129.5，134.1，136.2，141.2，149.5，157.4，157.8。
2-(3-氯苯基氨基)-3-((环己基氨基)甲基)-8-(4-甲基哌嗪-1-基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(205)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.20–1.34(m，3H)，1.71–1.91(m，3H)，1.92–2.04(m，2H)，2.20(s，3H)，2.23–2.36(m，6H)，3.04–3.10(m，5H)，4.01(s，2H)，5.87(s，1H)，6.55(s，J＝8.0hz，1H)，6.90(d，J＝8.0Hz，1H)，7.14(t，J＝8.0Hz，1H)，7.62(d，J＝7.6Hz,1H)，7.84(s，1H)，8.46(d，J＝7.6Hz，1H)，9.59(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ24.9，25.3，30.2，41.2，46.1，46.3,54.2，58.4，86.2，98.9，106.5，119.3，121.0，122.3，128.3，129.5，133.9，141.9，150.8，154.8，157.7，158.9。
方案10
合成J1的一般方法
在室温向醛(0.9mmol)在甲醇(0.5mL)中的溶液中加入NaBH4(1.35mmol)。搅拌1h后，用二氯甲烷(10mL)稀释该反应混合物，用盐水(10ml)洗涤。用MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过从己烷和乙酸乙酯混合物中重结晶纯化粗产物，得到J1。
合成J2的一般方法
向酯(0.06mmol)在THF(1.0mL)中的搅拌溶液中加入LiAlH4(0.09mmol)。将该反应混合物在室温搅拌1hr。反应完成后，滴加H2O(0.1mL)。过滤出该反应混合物，真空浓缩。通过快速柱色谱法纯化粗产物，得到J2。
合成J3的一般方法
在0℃向J1或J2(0.19mmol)在CH2Cl2(0.6mL)中的搅拌溶液中加入三乙胺(0.38mmol)和苯甲酰氯(0.28mmol)。将该反应混合物在室温搅拌1h。反应完成后，用CH2Cl2(10mL)稀释该混合物，用盐水(10ml)洗涤。用无水MgSO4干燥有机层，真空浓缩。通过快速柱色谱法(己烷：EtOAc＝2：1)纯化粗产物，得到J3。
3-(羟甲基)-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(206)
1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ4.80(s，2H)，6.87–6.90(m，1H)，8.03(dd，J＝7.2，7.6Hz，1H)，7.27(dd，J＝7.6，8.0Hz，2H)，7.53–7.58(m，3H)，8.36(brs，1H)，8.82(d，J＝6.8Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ56.0，94.80，94.85，113.8，121.1，121.2，123.2，123.3，124.5，127.5，128.6，136.4，138.9，139.0，149.7，157.1，158.0，158.1。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并-[1,2-a]嘧啶-4-酮(207)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.95(d，J＝6.4Hz，2H)，6.93(t，J＝6.8Hz，1H)，7.05(d，J＝8.0Hz，1H)，7.38(t，J＝4.4Hz，2H)，7.42(s，1H)，7.63(t，J＝6.8Hz，1H)，7.81(t，J＝1.6Hz，1H)，8.20(s，1H)，8.92(d，J＝7.2Hz，1H)，
2-(3-氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-醛(208)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.94(s，2H)，6.94(t，J＝6.0Hz，2H)，7.17(d，J＝8.0Hz，1H)，7.43(d，J＝8.8Hz，2H)，7.63(t，J＝7.2Hz，2H)，7.70(d，J＝9.2Hz，1H)，8.26(s，1H)，8.93(d，J＝7.2Hz，1H)。
3-(羟甲基)-2-(3-(三氟甲基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(209)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.99(s，2H)，6.99(d，J＝6.0Hz，2H)，7.32(d，J＝8.0Hz，1H)，7.43(d，J＝7.6Hz，2H)，7.69(brs，2H)，8.06(s，1H)，8.27(s，1H)，8.96(d，J＝7.6Hz，1H)。
3-(羟甲基)-2-(3-(三氟甲氧基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(210)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.95(d，J＝6.4Hz，2H)，6.84(t，J＝6.8Hz，1H)，6.92(d，J＝6.8Hz，1H)，7.30-7.34(m，3H)，7.59(t，J＝7.2Hz，1H)，7.86(s，1H)，8.36(s，1H)，8.87(d，J＝6.4Hz，1H)，
3-(3-(羟甲基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-2-基氨基)苯甲酸甲酯(211)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.92(s，3H)，4.99(d，J＝6.4Hz，2H)，6.96(t，J＝7.2Hz，1H)，7.38-7.42(m，2H)，7.63(t，J＝7.8Hz，1H)，7.75(d，J＝7.6Hz，1H)，7.88(d，J＝8.0Hz，1H)，8.21(s，1H)，8.25(brs，1H)，8.96(d，J＝7.6Hz，1H)。
3-(3-(羟甲基)-4-氧代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-2-基氨基)苯甲酸(212)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.73(s，1H)，5.74(s，2H)，7.19(t，J＝7.2Hz，1H)，7.38-7.42(m，2H)，7.45(d，J＝7.6Hz，1H)，7.86(t，J＝8.4Hz，1H)，8.00(d，J＝8.0Hz，1H)，8.19(s，1H)，8.82(s，1H)，8.89(d，J＝6.8Hz，1H)。
2-(4-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(213)
1H NMR(400MHz，DMSO)δ4.05(d，J＝7.2Hz，2H)，7.37(d，J＝8.8Hz，2H)，7.44(d，J＝8.8Hz，1H)，7.75(d，J＝6.8Hz，2H)，7.88(t，J＝8.8Hz，1H)，8.81(s，1H)，8.88(d，J＝6.4Hz，1H)。
2-(2-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(214)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.01(d，J＝5.6Hz，2H)，6.97-7.01(m，3H)，7.26-7.29(m，1H)，7.42(t，J＝8.8Hz，2H)，7.66(t，J＝7.2Hz，1H)，8.41(t，J＝5.2Hz，1H)，8.53(s，1H)，8.99(d，J＝6.8Hz，1H)。
3-(羟甲基)-2-(3-羟基苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(215)
1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ4.81(s，2H)，6.53(d，J＝8.0Hz，1H)，6.99(dd，J＝6.8，6.8Hz，1H)，7.04(d，J＝8.0Hz，1H)，7.12(dd，J＝6.8，6.8Hz，1H)，7.18(s，1H)，7.42(d，J＝9.6Hz，1H)，7.64(dd，J＝6.8，8.8Hz，1H)，8.88(d，J＝7.2Hz，1H)。
3-(羟甲基)-2-(4-羟基苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(216)
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ4.83(s，2H)，6.77(dd，J＝2.0，8.8Hz，2H)，7.04(dd，J＝6.8，6.8Hz，1H)，7.32(d，J＝8.8Hz，1H)，7.34–7.67(m，2H)，7.67–7.73(m，1H)，8.84(d，J＝6.8Hz，1H)。
3-(羟甲基)-2-(2-羟基苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(217)
1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ3.71(s，1H)，4.86(s，2H)，6.88(ddd，J＝1.6，7.6，8.0Hz，1H)，6.93(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，6.98(ddd，J＝1.6，7.2，8.0Hz，1H(，7.05(ddd，J＝1.2，6.8，6.8Hz,.1H)，7.43(d，J＝8.8Hz，1H)，7.69–7.73(m，2H)，8.91(dd，J＝0.8，6.8Hz，1H)。
2-(2,6-二氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(218)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.03(d，J＝6.0Hz，2H)，6.96(t，J＝7.2Hz，1H)，7.16(t，J＝7.6Hz，2H)，7.2(s，1H)，7.39(d，J＝8.0Hz，2H)，7.56(t，J＝7.6Hz，1H)，7.77(s，1H)，8.96(d，J＝7.2Hz，1H)。
2-(3,5-二氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(219)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.97(d，J＝6.0Hz，2H)，7.01-7.04(m，2H)，7.50(t，J＝6.8Hz，1H)，7.60(s，2H)，7.71(t，J＝8.4Hz，2H)，8.24(s，1H)，8.98(d，J＝7.2Hz，1H)。
2-(3,5-二氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(220)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.99(d，J＝6.0Hz，2H)，6.52(t，J＝8.8Hz，1H)，7.05(t，J＝5.6Hz，2H)，7.29(d，J＝2.0Hz，2H)，7.51(s，1H)，7.72(t，J＝7.6Hz，1H)，8.30(s，1H)，8.99(d，J＝6.4Hz，1H)。
2-(2,6-二甲基苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(221)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.23(s，6H)，5.02(d，J＝6.4Hz，2H)，6.92(t，J＝6.8Hz1H)，7.12(s，3H)，7.20(d，J＝8.8Hz，1H)，7.33(s，1H)，7.53(t，J＝6.8Hz，1H)，8.94(d，J＝6.4Hz，1H)。
3-(羟甲基)-2-苯氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(222)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.31(brs，1H)，4.86(s，2H)，7.03–7.09(m，3H)，7.13–7.18(m，1H)，7.28–7.34(m，3H)，7.58–7.62(m，1H)，8.94–8.96(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ56.0，99.7，115.2，121.7，125.1，125.3，127.4，129.3，136.8，149.2，152.8，159.6，164.0。
2-(3-氟苯氧基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(223)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.62(brs，1H)，4.78(s，2H)，6.78–6.85(m，3H)，7.02(ddd，J＝1.2，6.8，7.2Hz，1H)，7.18–7.23(m，1H)，7.25(d，J＝9.2Hz，1H)，7.57-7.62(m，1H)，8.89(d，J＝6.8Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ55.3，99.7，109.4，109.6，111.7，111.9，115.2，117.2，117.3，125.0，127.3，129.7，129.8，137.0，149.0，153.5，153.6，159.4，161.4，163.6，163.8。
2-(3-氯苯氧基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(224)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.51(t，J＝6.4Hz，1H)，4.79(d，J＝6.4Hz，2H)，6.95–6.98(m，1H)，7.04(dd，J＝6.8，7.2Hz，1H)，7.08–7.10(m，1H)，7.20(dd，J＝8.4，8.8Hz，1H)，7.27(d，J＝8.8Hz，1H)，7.59–7.63(m，1H)，8.919dd，J＝0.4，7.2Hz，1H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ53.3,55.4，99.7，115.3，120.1，122.2，125.1，127.4，129.8，134.3，137.0，153.2，159.2，163.6。
3-(羟甲基)-2-(苯基氨基)-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(225)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.85–1.93(m，4H)，2.15(s，2H)，2.84(t，J＝6.8Hz，2H)，3.87(t，J＝6.2Hz，2H)，7.06(t，J＝7.0Hz，1H)，7.26(t，J＝7.0Hz，2H)，7.51(d，J＝7.4Hz，2H)，11.2(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.6，19.2，22.2，32.2，42.4，88.4，122.9，124.4，128.8，138.4，160.5，160.8，162.2。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(226)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.23–1.34(m，2H)，1.38–1.51(m，4H)，2.35–2.41(m，2H)，3.98–4.05(m，2H)，4.12(s，2H)，7.17–7.22(m，2H)，7.31(t，J＝2.0Hz，1H)，7.36(t，J＝8.0Hz，1H)，7.77(s，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ15.1，23.1，31.4，42.4，59.2，61.4，65.7，122.8，123.9，125.6，131.6，134.3，139.4，157.9，164.3
3-(羟甲基)-2-(3-(三氟甲基)苯基氨基)-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(227)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.19–1.38(m，2H)，1.48–1.54(m，2H)，1.70–1.73(m，2H)，2.38(t，J＝12.8Hz，1H)，3.98–4.06(m，2H)，4.13(s，2H)，7.47(d，J＝7.6Hz，1H)，7.52(d，J＝8.8Hz，1H)，7.55–7.59(m，2H)，7.83(s，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ14.3，22.2，30.5，41.5，58.4，77.9，119.8，121.2，127.0，129.8，130.1，(d，J＝26.8由于CF3)，138.2，146.1，157.1，163.6，169.1。
3-(羟甲基)-2-(2-羟基苯基氨基)-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(228)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.78–1.94(m，4H)，2.13–2.23(m,，2H)，2.61(t，J＝6.0Hz，1H)，3.98–4.05(m，2H)，4.12(s，2H)，6.81(t，J＝7.2Hz，1H)，6.89(d，J＝7.2Hz，1H)，6.98–7.12(m，2H)，10.11(s，1H)，11.3(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.3，21.4，31.3，42.1，61.1，87.7，121.2，126.4，128.3，128.6，151.1，161.3，162.5，163.7，169.4。
3-(羟甲基)-2-(3-羟基苯基氨基)-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(229)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.41–1.61(m，4H)，1.62–1.77(m，2H)，2.72(t，J＝10.0Hz，1H)，3.78–3.95(m，2H)，4.17(s,2H)，6.43(d，J＝7.6Hz，1H)，6.81(d，J＝8.0Hz，1H)，6.87(d，J＝8.0Hz，1H)，6.98(t，J＝2.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ14.2，21.8，31.9，42.4，60.1，79.8，109.8，111.6，114.0，129.4，139.4，149.7，159.3，160.2，163.1。
3-(羟甲基)-2-(4-羟基苯基氨基)-6,7,8,9-四氢-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(230)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.21–1.45(m，4H)，1.63–1.71(m，2H)，2.34(t，J＝12.8Hz，1H)，3.98–4.05(m，2H)，4.19(s，2H)，6.75(d，J＝8.8Hz，2H)，7.00(d，J＝8.8Hz，2H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ14.9，21.9，32.1，42.3，60.4，87.2，115.7，125.0，130.1，154.9，159.4，160.6，163.3。
3-(羟甲基)-9-甲基-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(231)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.40(s，3H)，2.97(brs，1H)，4.93(s，2H)，6.89(t，J＝6.8Hz，1H)，7.11(t，J＝7.2Hz，1H)，7.34(t，J＝7.6Hz，2H)，7.62(d，J＝6.4Hz，1H)，8.02(d，J＝8.0Hz，2H)，8.73(d，J＝6.8Hz，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(232)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.43(s，3H)，3.06(t，J＝6.4Hz，1H)，4.92(d，J＝6.4Hz，2H)，6.69(d，J＝7.0Hz，1H)，7.03(d，J＝7.6Hz，1H)，7.23(t，J＝8.0Hz，1H)，7.29(d，J＝8.0Hz，1H)，7.44(d，J＝6.8Hz，1H)，8.03(s，1H)，8.38(s，1H)，8.71(d，J＝7.2Hz，1H)。
2-((3-氯苯基)(甲基)氨基)-3-(羟甲基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(233)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.51(s，3H)，4.09(t，J＝6.8Hz，1H)，4.12(d，J＝7.2Hz，2H)，6.95(t，J＝7.0Hz，1H)，7.04–7.06(m，2H)，7.20(t，J＝8.4Hz，1H)，7.54(d，J＝6.8Hz，1H)，8.84(d，J＝7.2Hz，1H)。
2-((3-氯苯基)(甲基)氨基)-3-(甲氧基甲基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(234)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.49(s，3H)，3.01(s，3H)，4.04(s，3H)，6.91(t，J＝7.0Hz，1H)，7.08(d，J＝8.4Hz，1H)，7.12(d，J＝7.2Hz，1H)，7.20(s，1H)，7.26(t，J＝8.0Hz，1H)，7.52(d，J＝6.8Hz，1H)，8.86(d，J＝7.2Hz，1H)。
3-(羟甲基)-9-甲基-2-(3-(三氟甲氧基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(235)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.40(s，3H)，3.15(t，J＝6.2Hz，1H)，4.93(d，J＝6.4Hz，1H)，6.67(t，J＝7.0Hz，1H)，6.91(d，J＝8.0Hz，1H)，7.25-7.27(m，1H)，7.32(t，J＝8.2Hz，1H)，7.43(d，J＝6.8Hz，1H)，7.98(s，1H)，8.51(s，1H)，8.72(d，J＝6.8Hz，1H)。
3-(羟甲基)-2-(3-羟基苯基氨基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(236)
1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ2.44(s，3H)，4.75(s，2H)，6.45(dd，J＝2.4，8.0Hz，1h)，6.84(dd，J＝6.8，6.8Hz，1H)，7.06(dd，J＝8.0，8.4Hz，1H)，7.11(dd，J＝2.0，2.4Hz，1H)，7.17(dd，H＝2.0，8.0Hz，1H)，7.45(d，J＝6.8Hzm1H)，8.72(d，J＝7.2Hz，1H)。
3-(羟甲基)-2-(4-羟基苯基氨基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(237)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.40(s，3H)，4.94(d，J＝4.8Hz，1H)，6.81-6.84(m，3H)，7.46(d，J＝7.2Hz，1H)，7.50(d，J＝8.8Hz，2H)，7.84(s，1H)，8.82(d，J＝7.2Hz，1H)。
2-(4-叔丁基苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(238)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.34(s，9H)，2.40(s，3H)，3.07(t，J＝6.2Hz，1H)，4.91(d，J＝6.4Hz，2H)，6.61(t，J＝6.8Hz，1H)，7.34(d，J＝7.2Hz，2H)，7.38(d，J＝6.8Hz，1H)，8.21(br s，1H)，8.69(d，J＝7.2Hz，H)。
2-(3-氯苄基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(239)
1H NMR(400MHz，CDCl3+CD3OD)δ2.31(s，3H)，3.02(s，1H)，4.68(d，J＝5.6Hz，2H)，4.70(s，2H)，6.70(dd，J＝5.6，6.0Hz，1H)，6.74(dd，J＝6.8，7.2Hz，1H)，7.11–7.20(m，3H)，7.31(s，1H)，7.38(d，J＝6.8Hz，1H)，8.66(d，J＝6.8Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3+CD3OD)δ17.7，44.2，44.3，55.8，93.1，93.2，112.6，125.4，125.5，126.9，127.5，129.5，132.6，134.0，134.9，141.7，149.45，149.47，157.4，159.10，159.16。
3-(羟甲基)-2-(异丁基氨基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(240)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.96(d，J＝6.8Hz，6H)，1.88–1.95(m，1H)，2.34(s，3H)，3.13(brs，1H)，3.32(t，J＝6.0Hz，2H)，4.78(d，J＝6.0Hz，2H)，6.08(brs，1H)，6.72(t，J＝6.8Hz，1H)，7.37(d，J＝6.8Hz，1H)，8.66(d，J＝6.8Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.9，20.5，28.9，48.6，57.1，92.5，112.1，126.0，132.5，134.6，149.6，157.1，159.5。
2-(二乙氨基)-3-(羟甲基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(241)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.22(t，J＝6.8Hz，6H)，2.35(s，3H)，3.41(s，1H)，3.63(q，J＝6.8Hz，4H)，4.44(s，2H)，6.65(t，J＝7.2Hz，1H)，7.31(d，J＝6.8Hz，1H)，8.68(d，J＝7.2Hz，1H)13C NMR(100MHz，CDCl3)δ13.9，17.7，44.0，67.0，92.2，111.7，125.8，132.5，134.4，148.1，160.7，160.8。
2-(环己基甲基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(242)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.95–0.98(m，2H)，1.18–1.23(m，3H)，1.58–1.79(m，6H)，2.42(s，3H)，3.27(t，J＝6.4Hz，2H)，3.85(brs，1H)，4.74(m，2H)，6.21(t，J＝7.2Hz，1H)，6.68(d，J＝6.8Hz，1H)，7.33(d，J＝7.2Hz，1H)，8.57(d，J＝7.2Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.9，26.2，26.7，31.3，38.4，47.5，56.9，92.8，112.0，126.0，132.3，134.5，149.4，156.9，159.5。
3-(羟甲基)-9-甲基-2-吗啉代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(243)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.01(brs，1H)，2.43(s，3H)，3.62(t，J＝4.8Hz，4H)，3.78(t，J＝4.8Hz，4H)，4.62(s，2H)，6.85(t，J＝6.8Hz，1H)，7.46(d，J＝6.8Hz，1H)，8.76(d，J＝6.8Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.9，49.7，58.9，67.1，95.5，113.3，125.2，133.4，135.0，148.2，160.6，161.7。
3-(羟甲基)-9-甲基-2-吗啉代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮盐酸盐(244)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.43(s，3H)，3.42(s，1H)，3.62(t，J＝4.8Hz，4H)，3.78(t，J＝4.8Hz，4H)，4.62(s，2H)，6.85(t，J＝6.8Hz，1H)，7.46(d，J＝6.8Hz，1H)，8.76(d，J＝6.8Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ17.9，49.7，58.9，67.1，98.5，113.3，125.2，133.4，135.0，148.2，160.6，161.7。
7-溴-2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(245)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.78(s，2H)，5.37(s，1H)，7.12(dd，J＝1.6Hz，8.4Hz，1H)，7.32(d，J＝8.0Hz1H)，7.42(dd，J＝1.6Hz，8.4Hz，1H)，7.54(dd，J＝0.8Hz，8.0Hz，1H)，7.64(d，J＝8.0Hz1H)，7.91(d，J＝2.0Hz，1H)，8.47(s，1H)，8.71(s，1H)；
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-7-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(246)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.86(s，3H)，4.70(s，2H)，5.22(s，1H)，7.02(dd，J＝0.8Hz，8.0Hz，1H)，7.28–7.32(m，1H)，7.41(dd，J＝1.2Hz，9.6Hz，1H)，7.58(dd，J＝0.8Hz，8.0Hz，1H)，7.64–7.68(m，1H)，7.87(d，J＝2.0Hz，1H)，8.36(s，1H)，8.69(s，1H)
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(247)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.92(s，3H)，4.62(s，2H)，5.07(s，1H)，6.71(d，J＝2.8Hz，1H)，6.83(dd，J＝2.8Hz，8.0Hz，1H)，7.01(d，J＝8.0Hz，1H)，7.28(dd，J＝8.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，7.62(d，J＝8.0Hz，1H)，7.76(d，J＝2.0Hz，1H)，8.62(s，1H)，8.71(d，J＝8.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)54.8，57.3，93.8，101.5，109.3，120.0，120.9，122.5，129.5，130.7，133.4，142.2，151.9，156.9，157.8，166.2。
8-氯-2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(248)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.68(s，2H)，5.14(brs，1H)，7.03(dd，J＝1.2，8.0Hz，1H)，7.19(dd，J＝2.4，7.6Hz，1H)，7.28(t，J＝8.0Hz，1H)，7.54，(d，J＝2.0Hz，1H)，7.58(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)，7.57(t，J＝2.0Hz，1H)，8.78(d，J＝8.0Hz，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-(甲基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(249)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.81(s，3H)，3.85(s，2H)，6.02(s，1H)，6.32(d，J＝7.6Hz，1H)，6.93(d，J＝2Hz，1H)，7.12(t，J＝8.0Hz，1H)，7.38(d，J＝8.0Hz，1H)，7.81(s，1H)，8.42(s，1H)，9.93(s，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-8-(二乙氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(250)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.23(t，J＝6.8Hz，6H)，3.44(q，J＝6.8Hz，4H)，3.99(s，2H)，4.82(t，J＝2.1Hz，1H)，6.29(d，J＝2.1Hz，1H)，6.54(dd，J＝2.4，8.4Hz，1H)，6.92(d，J＝2Hz，1H)，7.21(t，J＝8.0Hz，1H)，7.81(d，J＝2.4Hz，1H)，8.06(t，J＝2.0Hz，1H)，8.85(d，J＝8.4Hz，1H)，9.71(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ12.7，20.0，44.7，92.8，97.1，104.0，118.9，120.7，121.9，128.5，129.5，134.1，142.8，150.6，151.9，158.3，159.2。
3-(羟甲基)-8-吗啉代-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(251)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.43(s，4H)，3.67(s，4H)，4.59(d，J＝5.2Hz，2H)，5.05，(t，J＝4.8Hz，1H)，6.41(d，J＝2.0Hz，1H)，6.95(t，J＝7.2Hz，1H)，7.00(dd，J＝2.8，8.4Hz，1H)，7.25(t，J＝8.0Hz，2H)，7.64(d，J＝7.6Hz，2H)，8.38(s，1H)，8.69(d，J＝8.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ46.5，55.1，66.3，91.5，99.1，105.4，121.3，122.6，128.5，129.1，140.9，151.4，155.0，156.7，158.5。
2-(3-氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-吗啉代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(252)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.46(s，4H)，3.68(s，4H)，4.59(d，J＝5.2Hz，2H)，5.06，(t，J＝5.2Hz，1H)，6.47(d，J＝2.4Hz，1H)，6.74(t，J＝7.2Hz，1H)，7.03(dd，J＝2.8，8.0Hz，1H)，7.26(t，J＝7.2Hz，1H)，7.64(d，J＝8.0Hz，1H)，7.79(d，J＝12.4Hz，1H)，8.52(s，1H)，8.60(d，J＝8.0Hz，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ45.8，54.2，65.6，91.3，98.4，105.0，108.0(d，J＝20Hz，由于F)，116.0，128.0，129.8(d，J＝10Hz，由于F)，142.1(d，J＝11Hz，由于F)，150.6，154.4，156.1，157.4，161.0，163.3。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-吗啉代-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(253)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.45(t，J＝5.6Hz，4H)，3.69(t，J＝5.6Hz，4H)，4.58(d，J＝5.2Hz，2H)，5.01(t，J＝5.2Hz，1H)，6.42(d，J＝2.8Hz，1H)，6.98(d，J＝8.0Hz，1H)，7.05(dd，J＝2.8，8.0Hz，1H)，7.26(t，J＝8.0Hz，1H)，7.64(d，J＝8.0Hz，1H)，7.80(t，J＝2.0Hz，1H)，8.48(s，1H)，8.60(d，J＝8.0Hz，1H)；13CNMR(100MHz，DMSO-d6)δ45.4，53.6，65.7，84.7，98.6，105.3，117.8，118.7，119.8，127.1，130.2，129.2，141.8，149.7，153.0，155.3，157.4；LC-MS(ESI，m/z)：386[M+H]+。
3-(羟甲基)-8-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(254)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.34(s，3H)，2.52(t，J＝5.2Hz，4H)，3.43(t，J＝5.2Hz，4H)，4.88(s，2H)，5.28(s，1H)，6.37(s，1H)，6.55(d，J＝8.0Hz，1H)，7.05(t，J＝7.2Hz，1H)，7.33(t，J＝7.6Hz，2H)，7.60(d，J＝7.6Hz，2H)，7.91(s，1H)，8.64(d，J＝8.0Hz，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-(4-甲基哌嗪-1-基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(255)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.14(s，3H)，2.38(t，J＝4.4Hz，4H)，3.45(t，J＝4.4Hz，4H)，3.56(s，2H)，6.41(d，J＝2.4Hz，1H)，6.95(dd，J＝1.6，8.0Hz，1H)，7.01(dd，J＝2.4，8.0Hz，1H)，7.27(t，J＝8.0Hz，1H)，7.50(d，J＝1.6Hz，1H)，8.0(d，J＝8.0Hz，1H)，10.4(s，1H)，14.18(s，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ45.6，51.6，54.0，55.0，85.3，98.3，105.1，117.7，118.5，121.0，127.9，130.3，133.0，142.1，150.8，154.1，156.4，157.8；LC-MS(ESI，m/z)：400[M+H]+。
2-(3-氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-(4-甲基哌嗪-1-基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(256)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.35(s，3H)，2.54(t，J＝4.4Hz，4H)，3.48(t，J＝4.8Hz，4H)，4.87(s，2H)，5.23(s，1H)，6.42(s，1H)，6.60(d，J＝8.4Hz，1H)，6.73(t，J＝8.4Hz，1H)，7.12(d，J＝8.4Hz，1H)，7.19(d，J＝8.4Hz，1H)，7.71-7.75(m，1H)，8.04(s，1H)，8.71(d，J＝8.0Hz，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(257)
无色固体，mp235℃(分解)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.42(s，3H)，4.07(q，J＝7.2Hz，2H)，7.03(d，J＝8.8Hz，2H)，7.26(t，J＝8.0Hz，2H)，7.46(d，J＝8.4Hz，1H)，7.84(t，J＝2.0Hz，1H)，8.79(d，J＝7.2Hz，2H)。
2-(4-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(258)
无色固体，mp227℃(分解)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.42(s，3H)，4.10(s，2H)，6.85(d，J＝7.2Hz，1H)，7.23-7.28(m，4H)，7.87(d，J＝6.8Hz，2H)，8.94(d，J＝7.6Hz，1H)。
2-(4-氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(259)
无色固体，mp232℃(分解)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.42(s，3H)，4.12(s，2H)，6.85(d，J＝6.8Hz，1H)，7.05(t，J＝8.4Hz，2H)，7.21(s，1H)，7.31-7.38(m，2H)，7.85(q，J＝4.8Hz，2H)，8.94(d，J＝7.2Hz，1H)。
2-(3,4-二氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(260)
无色固体，mp230℃(分解)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.44(s，3H)，4.09(s，2H)，6.89(d，J＝7.2Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.36(d，J＝8.8Hz，1H)，7.76(d，J＝8.4Hz，1H)，8.24(d，J＝2.4Hz，1H)，8.95(d，J＝7.2Hz，1H)，9.71(s，1H)。
2-(3-氯-4-氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-8-甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(261)
无色固体，mp225℃(分解)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.43(s，3H)，4.09(s，2H)，6.88(d，J＝7.2Hz，1H)，7.11(t，J＝8.8Hz，1H)，7.27(s，1H)，7.69-7.73(m，1H)，8.12(d，J＝6.8Hz，1H)，8.95(d，J＝7.2Hz，1H)，9.71(s，1H)。
9-氯-2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(262)
无色固体，mp230℃(分解)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.95(d，J＝6.0Hz，2H)，6.80(t，J＝7.2Hz，1H)，7.06(d，J＝8.0Hz，1H)，7.27(d，J＝8.4Hz，1H)，7.46(d，J＝8.0Hz，1H)，7.78(d，J＝7.2Hz，1H)，8.18(t，J＝2.4Hz，1H)，8.43(s，1H)，8.81(d，J＝7.2Hz，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-(三氟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(263)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.77(s，2H)，7.11–7.13(m，1H)，7.32(dd，J＝7.2，7.2Hz，1H)，7.35(dd，J＝8.0，8.0Hz，1H)，7.48–7.50(m，1H)，8.13–8.14(m，1H)，8.41(d，J＝7.2Hz，1H)，9.12(dd，J＝1.2，7.2Hz，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-9-氟-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(264)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.76(s，1H)，5.31(brs，1H)，7.11–7.13(m，1H)，7.18-7.23(m，1H)，7.38(dd，J＝8.0，8.0Hz，1H)，7.63–7.65(m，1H)，7.86(dd，J＝8.4，8.8Hz，1H)，8.12-8.13(m，1H)，8.73(d，J＝7.2Hz，1H)，8.96(brs，1H)。
2-(4-氯苯基氨基)-9-氟-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(265)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.72(s，2H)，5.30(brs，1H)，7.15–7.20(m，1H)，7.41–7.44(m，2H)，7.79–7.82(m，2H)，7.84–7.86(m，1H)，8.72(d，J＝7.2Hz，1H)，8.92(brs，1H)。
9-氟-2-(4-氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(266)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.75(s，2H)，5.25(brs，1H)，7.13–7.25(m，3H)，7.73–7.77(m，2H)，7.80–7.85(m，1H)，8.72(d，J＝7.2Hz，1H)，8.84(brs，1H)。
2-(3-氯-4-氟苯基氨基)-9-氟-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(267)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.74(s，2H)，5.24(brs，1H)，7.18–7.22(m，1H)，7.39–7.44(m，1H)，7.65–7.69(m，1H)，7.83–7.87(m，1H)，8.20–8.22(m，1H)，8.72(d，J＝7.2Hz，1H)，8.91(brs，1H)。
2-(3,4-二氟苯基氨基)-9-氟-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(268)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.75(s，2H)，5.26(brs，1H)，7.17–7.22(m，1H)，7.39–7.49(m，1H)，7.84–7.88(m，1H)，8.08–8.14(m，1H)，8.73(m，J＝7.2Hz，1H)，8.93(brs，1H)。
2-(3,4-二氯苯基氨基)-9-氟-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(269)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.75(s，2H)，5.27(brs，1H)，7.19-7.23(m，1H)，7.60(d，J＝8.8Hz，1H)，7.7(dd，J＝2.8，8.8Hz，1H)，7.85–7.89(m，1H)，8.83(d，J＝2.8Hz，1H)，8.73(d，J＝8.8Hz，1H)，9.00(brs，1H)。
2-(1H-吲哚-5-基氨基)-9-氟-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(270)
m.p＝184-185℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.70(d，J＝5.2Hz，2H)，5.18(t，J＝5.2Hz，1H)，6.35(s，1H)，7.00–7.04(m，1H)，7.23(dd，J＝2Hz，8.8Hz，1H)，7.28–7.32(m，2H)，7.68(dd，J＝8Hz，J＝8Hz，1H)，7.82(s，1H)，8.61(s，1H)，8.64(d，J＝6Hz，1H)，10.98(s，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)55.2，94.6，101.7(d，J＝5.2Hz，由于F)，111.6，112.1(d，J＝7.4Hz，由于F)，113.7，118.0，119.8(d，J＝17.1Hz，由于F)，124.2(d，J＝4.4Hz，由于F)，126.5，128.2，131.9，133.5，151.6，154.1，156.3，157.6。
3-(羟甲基)-9-甲氧基-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(271)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.93(s，3H)，4.71(d，J＝5.2Hz，2H)，5.29(t，J＝5.2Hz，1H)，6.97–7.01(m，1H)，7.06–7.10(m，1H)，7.27–7.32(m，3H)，7.83(d，J＝8.4Hz，2H)，8.47(d，J＝7.2Hz，1H)，8.68(s，1H)。
3-(羟甲基)-9-甲氧基-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-硫酮(272)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.98(s，3H)，4.11(d，J＝7.2Hz，2H)，6.88(t，J＝8.0Hz，2H)，7.04(t，J＝7.2Hz，1H)，7.31(t，J＝7.2Hz，2H)，7.82(d，J＝7.6Hz，2H)，7.98(s，1H)，8.59(d，J＝5.6Hz，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)26.9，57.1，94.2，111.8，112.7，119.9，121.1，123.3，128.9，139.8，143.7，151.3，155.6，158.6。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(273)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.94(s，3H)，4.68(s，2H)，6.99(d，J＝7.6Hz，1H)，7.09(dd，J＝7.2Hz，J＝7.2Hz，1H)，7.25–7.29(m，2H)，7.56(d，J＝8.0Hz，1H)，8.42(s，1H)，8.45(d，J＝6.8Hz，1H)，8.77(s，1H)。
2-(4-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(274)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.90(s，3H)，4.65(d，J＝5.2Hz，2H)，5.19(t，J＝5.2Hz，1H)，7.03(dd，J＝7.2Hz，7.6Hz，1H)，7.23(d，J＝7.6Hz，1H)，7.29(d，J＝8.8Hz，2H)，7.85(d，J＝9.2Hz，2H)，8.42(d，J＝7.2Hz，1H)，8.72(s，1H)。
2-(4-氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(275)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.91(s，3H)，4.69(d，J＝5.2Hz，2H)，5.19(t，J＝5.2Hz，1H)，7.06(t，J＝6.8Hz，1H)，7.13(t，J＝8.8Hz，1H)，7.25(d，J＝7.6Hz，1H)，7.83–7.86(m，1H)，8.45(dd，J＝1.2Hz，7.2Hz，1H)，8.66(s，1H)。
3-(羟甲基)-9-甲氧基-2-(4-(三氟甲氧基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(276)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.96(s，3H)，4.67(d，J＝4.0Hz，2H)，5.20(s，1H)，7.07(dd，J＝7.2Hz，J＝7.2Hz，1H)，7.23(s，1H)，7.27(d，J＝8.0Hz，2H)，7.95(dd，J＝8.8Hz，J＝8.8Hz，2H)，8.45(d，J＝7.6Hz，1H)，8.78(s，1H)。
3-(羟甲基)-9-甲氧基-2-(4-(三氟甲基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(277)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.97(s，3H)，4.72(s，2H)，5.32(s，1H)，7.14，(dd，J＝7.2Hz，7.2Hz，1H)，7.33(d，J＝7.6Hz，1H)，7.64(d，J＝8.8Hz，2H)，8.11(d，J＝8.8Hz，2H)，8.49(d，J＝7.2Hz，1H)，9.09(s，1H)。
2-(3-氯-4-氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(278)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.95(s，3H)，4.69(d，J＝4.8Hz，2H)，5.16(t，J＝4.8Hz，1H)，7.10(dd，J＝7.2Hz，7.2Hz，1H)，7.30(dd，J＝0.8Hz，8.0Hz，1H)，7.32(dd，J＝9.2Hz，9.2Hz，1H)，7.61–7.65(m，1H)，8.46(dd，J＝0.8Hz，7.2Hz，1H)，8.59(dd，J＝2.8Hz，7.2Hz，1H)，8.76(s，1H)。
2-(3,4-二氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(279)
m.p＝231℃(分解)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.92(s，3H)，4.66(s，2H)，5.17(brs，1H)，7.07(dd，J＝7.2Hz，7.2Hz，1H)，7.26–7.33(m，2H)，7.39–7.41(m，1H)，8.34–8.40(m，1H)，8.44(d，J＝7.2Hz，1H)，8.74(s，1H)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ54.1，56.8，95.2，109.1，113.4，116.0(d，J＝3.8Hz，由于F)，116.8，118.7，137.5(d，J＝9.7Hz，由于F)，143.2(d，J＝11.9Hz，由于F)，145.6，147.5(d，J＝13.4Hz，由于F)，149.9(d，J＝13.4Hz，由于F)，150.6，155.5。
2-(3-氯-4-羟基苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(280)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.93(s，3H)，4.68(s，2H)，5.14(s，1H)，6.99(d，J＝8.4Hz，1H)，7.06(dd，J＝7.2Hz，7.2Hz，1H)，7.26(dd，J＝1.2Hz，8.0Hz，1H)，7.38(dd，J＝1.2Hz，8.0Hz，1H)，8.25(d，J＝2.8Hz，1H)，8.45(dd，J＝1.2Hz，7.2Hz，1H)，8.52(s，1H)，9.79(s，1H)。
2-(3,4-二氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(281)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.93(s，3H)，4.66(d，J＝5.2Hz，2H)，5.16(d，J＝5.2Hz，1H)，7.09(t，J＝7.2Hz，1H)，7.29(d，J＝6.8Hz，1H)，7.48(d，J＝8.8Hz，1H)，7.64(dd，J＝2.8Hz，8.8Hz，1H)，8.44(d，J＝7.2Hz，1H)，8.67(d，J＝2.8Hz，1H)，8.82(s，1H)。
3-(羟甲基)-9-甲氧基-2-(4-甲基-3-(三氟甲基)苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(282)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ2.49(t，J＝2.0Hz，3H由于CF3)，3.93(s，3H)，4.70(d，J＝4.8Hz，2H)，5.19(t，J＝4.8Hz，1H)，7.10(t，J＝7.2Hz，1H)，7.29(dd，J＝1.2Hz，8.0Hz，1H)，7.32(d，J＝8.4Hz，1H)，7.74(dd，J＝1.6Hz，8.0Hz，1H)，8.46(dd，J＝1.2Hz，6.8Hz，1H)，8.81(s，1H)，8.85(d，J＝2.0Hz，1H)。
2-(4-氟-3-(三氟甲基)苯基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(283)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.92(s，3H)，4.68(d，J＝5.2Hz，2H)，5.12(t，J＝5.2Hz，1H)，7.07(dd，J＝7.2Hz，7.2Hz，1H)，7.27(d，J＝7.2Hz，1H)，7.37–7.42(m，1H)，7.86–7.88(m，1H)，8.43(d，J＝7.2Hz，1H)，8.87(s，1H)，8.99–9.00(m，1H)。
2-(2,3-二氢-1H-茚-5-基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(284)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ1.97–2.05(m，2H)，2.79(t，J＝7.6Hz，2H)，2.85(t，J＝7.6Hz，2H)，3.92(s，3H)，4.69(d，J＝5.6Hz，2H)，5.26(t，J＝5.6Hz，1H)，7.04(dd，J＝7.2Hz，1H)，7.12(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝0.8Hz，7.6Hz，1H)，7.46(dd，J＝2.0Hz，8.0Hz，1H)，7.82(s，1H)，8.45(dd，J＝1.2Hz，7.2Hz，1H)，8.59(s，1H)。
2-(苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(285)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.91(s，3H)，4.68(d，J＝5.2Hz，2H)，5.21(t，J＝5.2Hz，1H)，5.98(s，2H)，6.84(d，J＝8.4Hz，1H)，7.05–7.07(m，1H)，7.26(dd，J＝1.2Hz，8.0Hz，1H)，7.82(d，J＝2.0Hz，1H)，8.46(d，J＝2.0Hz，1H)，8.45(dd，J＝1.2Hz，7.2Hz，1H)，8.56(s，1H)。
2-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己二烯-6-基氨基)-3-(羟甲基)-9-甲氧基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(286)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.92(s，3H)，4.19–4.24(m，4H)，4.67(d，J＝5.2Hz，2H)，5.19(t，J＝5.2Hz，1H)，6.77(d，J＝8.8Hz，1H)，7.05(dd，J＝7.2Hz，7.2Hz，1H)，7.12(dd，J＝2.4Hz，8.4Hz，1H)，7.26(d，J＝6.8Hz，1H)，7.64(d，J＝2.4Hz，1H)，8.46(dd，J＝2.0Hz，7.2Hz，1H)，8.47(s，1H)。
3-(羟甲基)-9-甲氧基-2-(1-甲基-1H-吲哚-5-基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(287)
m.p＝195-197℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.82(s，3H)，3.97(s，3H)，4.77(d，J＝5.2Hz，2H)，5.28(t，J＝5.2Hz，1H)，6.42(d，J＝3.0Hz，1H)，7.09(dd，J＝7.2，7.6Hz，1H)，7.28–7.30(m，1H)，7.33(d，J＝3.0Hz，1H)，7.41(d，J＝8.8Hz，1H)，7.46(dd，J＝2.0，8.8Hz，1H)，8.18(d，J＝2.0Hz，1H)，8.52(dd，J＝1.2，6.8Hz，1H)，8.62(br s，1H)。
3-(羟甲基)-9-甲氧基-2-(1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(288)
m.p＝186℃(分解)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.87(s，3H)，3.98(s，3H)，4.79(d，J＝5.6Hz，2H)，5.31(t，J＝5.6Hz，1H)，7.08(dd，J＝7.2，7.2Hz，1H)，7.28(dd，J＝0.8，7.6Hz，1H)，7.50(d，J＝8.8Hz，1H)，7.56(dd，J＝2.0，8.8Hz，1H)，8.13(s，1H)，8.34(d，J＝1.6Hz，1H)，8.53(dd，J＝0.8，7.2Hz，1H)，8.73(br s，1H)。
3-(羟甲基)-9-甲氧基-2-(1-甲基-1H-吲唑-5-基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(289)
m.p＝205℃(分解)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.40(s，3H)，4.08(s，3H)，4.78(d，J＝4.8Hz，2H)，5.28(t，J＝5.0Hz，1H)，7.12(dd，J＝7.2，7.6Hz，1H)，7.32(1H，J＝1.2，7.6Hz，1H)，7.62(d，J＝9.0Hz，1H)，7.68(dd，J＝2.0，9.0Hz，1H)，8.04(m，1H)，8.07(d，J＝1.2Hz，1H)，8.53(dd，J＝1.2，6.8Hz，1H)，8.75(br s，1H)。
9-(二氟甲氧基)-2-(4-氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(290)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.67(d，J＝5.2Hz，2H)，5.14(t，J＝5.2Hz，1H)，7.07–7.11(m，3H)，7.17(t，J＝74Hz由于F2，1H)，7.63–7.69(m，3H)，8.71(d，J＝7.2Hz，1H)，8.75(s，1H)。
2-(4-氯苯基氨基)-9-(二氟甲氧基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(291)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.69(d，J＝5.6Hz，2H)，5.23(t，J＝5.2Hz，1H)，7.13(dd，J＝7.2Hz，7.2Hz，1H)，7.23(t，J＝74Hz，1H，由于F2)，7.30–7.33(m，2H)，7.72–7.75(m，3H)，8.75(dd，J＝1.2Hz，7.2Hz，1H)，8.86(s，1H)；
9-(二氟甲氧基)-2-(3,4-二氟苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(292)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.70(d，J＝5.2Hz，2H)，5.22(s，1H)，7.16(dd，J＝7.2Hz，J＝7.2Hz，1H)，7.26(t，J＝74Hz，由于F2，1H)，7.33–7.38(m，2H)，7.75(d，J＝7.2Hz，1H)，8.12(dd，J＝7.6Hz，12.8Hz，1H)，8.76(d，J＝6.8Hz，1H)，8.90(s，1H)；LC-MS(ESI，m/z)：370[M+H]+。
2-(3,4-二氯苯基氨基)-9-(二氟甲氧基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(293)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.68(s，2H)，5.19(s，1H)，7.15(t，J＝7.2Hz，1H)，7.24(t，J＝74Hz，由于F2，1H)，7.47–7.57(m，2H)，7.72(d，J＝7.2Hz，1H)，8.32(d，J＝2.4Hz，1H)，8.73(dd，J＝1.6Hz，7.2Hz，1H)，8.92(s，1H)。
2-(3-氯-4-氟苯基氨基)-9-(二氟甲氧基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(294)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.68(d，J＝4.0Hz，2H)，5.18(s，1H)，7.15(dd，J＝7.2Hz，7.2Hz，1H)，7.24(t，J＝74Hz，1H，由于F2)，7.32(dd，J＝9.2Hz，9.2Hz，1H)，7.50–7.54(m，1H)，7.73(d，J＝7.6Hz，1H)，8.22(dd，J＝2.8Hz，6.8Hz，1H)，8.74(dd，J＝1.2Hz，7.2Hz，1H)，8.86(s，1H)。
2-(1H-吲哚-5-基氨基)-9-(二氟甲氧基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(295)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.72(d，J＝4.8Hz，2H)，5.23(t，J＝4.8Hz，1H)，6.34(s，1H)，7.05–7.09(m，1H)，7.23(dd，J＝8.8Hz，8.8Hz，1H)，7.25(t，J＝74.4Hz，1H由于F2)，7.31–7.33(m，2H)，7.68(d，J＝7.2Hz，1H)，7.93(s，1H)，8.70(s，1H)，8.73(d，J＝1.2Hz，1H)，10.99(s，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-6,8-二甲基-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(296)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.32(s，3H)，2.40(s，3H)，3.55(s，2H)，6.78(s，1H)，7.06(d，J＝2.0Hz，1H)，7.21(dd，J＝8.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，7.39(d，J＝8.4Hz，1H)，7.69(d，J＝2.0Hz，1H)，7.71(s，1H)，9.60(s，1H)；LC-MS(ESI，m/z)：330[M+H]+。
7,9-二氯-2-(3-氯苯基氨基)-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(297)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ4.65(s，2H)，5.70(d，J＝7.6Hz，1H)，7.29(dd，J＝8.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，7.57(dd，J＝8.0Hz，J＝8.0Hz，1H)，8.25(s，1H)，8.32(d，J＝2.0Hz，1H)，8.76(d，J＝2.0Hz，1H)。
2-(3-氯苯基氨基)-7,9-二氟-3-(羟甲基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-4-酮(298)
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.69(d，J＝4.8Hz，2H)，5.31(t，J＝4.8Hz，1H)，7.06(dd，J＝1.2Hz，8.0Hz，1H)，7.32(t，J＝8.0Hz，1H)，7.56(dd，J＝1.2Hz，8.0Hz，1H)，8.02(s，1H)，8.18–8.23(m，1H)，8.68(t，J＝2.0Hz，1H)，8.90(s，1H)。
(4-氧代-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-基)甲基苯甲酸酯(299)
m.p＝178-179℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ5.66(s，2H)，6.96(ddd，J＝1.2，1.2，6.8Hz，1H)，7.06–7.10(m，1H)，7.33–7.44(m，5H)，7.53–7.56(m，1H)，7.61–7.65(m，1H)，7.72(m，2H)，8.12(dd，J＝1.2，8.4Hz，1H)，9.14(brs，1H)。
乙酸(4-氧代-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-基)甲酯(300)
m.p＝160-161℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ2.13(s，3H)，6.92(dd，J＝6.8，7.2Hz，1H)，7.04–7.08(m，1H)，7.30–7.37(m，3H)，7.59–7.66(m，3H)，8.91(brs，1H)，8.94(d，J＝7.2Hz，1H)。
异丁酸(4-氧代-2-(苯基氨基)-4H-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-基)甲酯(301)
m.p＝161-163℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.17(d，J＝7.2Hz，6H)，2.62–2.65(m，1H)，6.94(dd，J＝6.8，7.2Hz，1H)，7.04–7.08(m，1H)，7.31–7.38(m，3H)，7.60–7.67(m，3H)，8.95(brs，1H)，8.95(d，J＝6.8Hz，1H)。
实施例8：有关二硝基苯甲酰胺化合物的其他研究
内部再合成两种有代表性的分子化合物4和24并且在初级巨噬细胞中进行常规基于CFU的活性测试(图7)。对两种化合物观察到使用三种不同细胞系感染后5天与使用INH观察到的类似的10-倍CFU数量减少。这证实了本系列化合物的功效。
为了处理毒性问题，用化合物4和24测试一组5种来源于不同身体组织的细胞系。将细胞与递增量的化合物一起温育并且在共温育5天后使用刃天青评价细胞存活率。通过将采用包含DMSO的孔测定的刃天青荧光取为参比物测定细胞毒性百分比。将50％细胞死亡的浓度定义为最低毒性浓度(MTC50)。化合物4和24均未显示对该组细胞系的细胞毒性，从而启示该系列化合物是富有希望的抗肺结核新药(表5)。
为了洞察化合物4和24活性的可能特异性，进行广谱抗菌分析且该分析显示这些二硝基苯甲酰胺衍生物的效果主要限于放线菌，其中对分枝杆菌观察到的有效活性最大(表5)。具有特别重要性的是，测试的DNB对多药物耐药性(MDR)和广泛药物耐药性(XDR)临床分离物也具有高度活性，从而启示它们可以相对于目前抗肺结核化合物对不同靶标具有作用。
对化合物4和24测定结核分枝杆菌H37Rv的突变频率。递增数量的细菌生长在补充了不同浓度化合物的7H10琼脂培养基上。6周生长后，计数菌落以评价自发突变频率比例(表7)。就化合物4而言，分别在0.2μg/ml和3.2μg/ml发现1×10-6和1×10-8耐药性频率。自发突变率由此被计算为1×10-7。就化合物24而言，在0.2μg/ml和3.2μg/ml的突变频率分别为7×10-7和1×10-8，相当于3.5×10-7的平均频率。总之，这些值优于对INH-耐药性突变体观察到的突变频率(3×10-6)。这些结果由此证实这类化合物导致低突变频率。
实施例9：有关吡啶并嘧啶酮化合物的其他研究
表6显示一种有代表性的化合物133对不同分枝杆菌种类的最小抑制浓度(MIC)。尽管对快速生长的耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)mc2没有效果，但是能够抑制典型实验室菌株例如H37Rv、H37Ra和BCG Pasteur，其中MIC为2μM。更重要的是，还测试了133对分枝杆菌临床分离物菌株的抗菌活性。对多药物耐药性(MDR-TB)和广泛药物耐药性(XDR-TB)分离物菌株的MIC值在微摩尔范围。
为了处理毒性问题，用化合物133测试一组7种来源于不同身体组织的细胞系。将细胞与递增量的化合物一起温育并且在共温育5天后使用刃天青评价细胞存活率。通过将采用包含DMSO的孔测定的刃天青荧光取为参比物测定细胞毒性百分比。将50％细胞死亡的浓度定义为最低毒性浓度(MTC50)。化合物133直到100μM也未显示对全部测试细胞系的细胞毒性(表6)。由抗结核活性与细胞毒性之比组成的选择性指数由此对胞外和胞内分枝杆菌而言高于50，从而启示该系列化合物是富有希望的抗肺结核新药。
进一步证实该系列化合物对初级巨噬细胞的效果。预先与化合物232一起温育的宿主细胞与DMSO对照相比包含更少量细菌且在感染后第5天时更为充足，如图8所示。对化合物133得到类似数据(数据未显示)。然后在感染后7天进行常规CFU测定以便对剩余细菌接种量定量。对两种化合物均观察到对人和小鼠细胞的与使用INH观察到的类似的CFU数量10-倍减少(图8)。这证实了该系列化合物的功效。
对化合物264测定结核分枝杆菌H37Rv的突变频率。递增数量的细菌生长在补充了不同浓度化合物的7H10琼脂培养基上。6周生长后，计数菌落以评价自发突变频率比例(表7)。化合物264分别在0.4和0.8μg/ml产生3.4×10-6和8×10-6的耐药性频率，且在1.6μg/ml和3.2μg/ml产生2×10-8的耐药性频率。因此，将自发突变率计算为7×10-7。总之，这些值优于对INH观察到的突变频率(2.9×10-6)。这些结果由此证实该类化合物导致低突变频率。
对TB药物研发而言的最新挑战之一在于鉴定对顽固性细菌具有活性的化合物。尽管潜在细菌的位置和状态仍然处于争论中，但是通常对分枝杆菌顽固性共有的推定在于结核分枝杆菌能够在巨噬细胞中存活延长时间期限，且不同于其他细菌，它们能够主动复制。结核分枝杆菌的吞噬体内分布是复杂的；大量不同的基因超表达且定时调节，且还依赖于环境因素。综上所述，这使得难以鉴定一种可以选作理想靶标的特异性结核因子。因此，基于非靶标细胞的测定是研究胞内结核分枝杆菌抑制剂的关键工具。
杆菌生长抑制剂在巨噬细胞内的研究因如下因素而长期受限：繁琐CFU铺板，慢杆菌生长、安全性要求和设置适合感染条件的困难。作为结果，这种手段始终用作初步选择对体外胞外生长具有活性的化合物的初步选择后的二次测定。由于自动化共焦显微镜检查的到来，上述举出的限制可以得到重新解决且发明人证实了大规模化合物筛选的可行性。决定进行悬浮液巨噬细胞分批感染以便将步骤减至最少并且满足安全性要求。为了这一目的，谨慎关注除去胞外未吞噬的分枝杆菌。设定在洗涤步骤过程中使用的离心条件以便仅回收感染细胞并且弃去大部分胞外细菌。通过显微镜检查，发明人证实未结合的分枝杆菌代表了总细菌接种量的10％以下(数据未显示)。分枝杆菌能够独立于宿主细胞生长且由此任何剩余的胞外杆菌均可以显著危害发明人模型的有效性。为了这一目的，再向方案中加入阿米卡星处理步骤以便进一步消除任何剩余的分枝杆菌。因此，由于使用了最佳方案，所以截至到加入化合物为止，几乎不存在未吞噬的残留分枝杆菌。得到的结果还证实它特别对使用化合物处理测量的胞内分枝杆菌具有效果。实际上，发明人观察到使用已知难以透入细胞的抗生素利福平的抑制作用弱。利福平在胞内测定中的MIC比体外生长测定50-倍可再现的减少证实靶向的细菌不在胞外。另外，在两种测定之间未观察到MIC差异。类似地，还鉴定了能够在基于表型的细胞测定、但不在体外生长测定中抑制分枝杆菌生长的化合物。此外，化合物与预先感染细胞混合这一事实应减少鉴定主要感染抑制的机会。然而，仍然将这种化合物鉴定为相邻细胞感染的阻断剂。
与常规CFU-铺板法相比，基于显微镜检查的荧光细菌检测对在死亡与活杆菌之间区分不具有充分敏感性，因为GFP信号稳定几天。实际上，在高浓度INH、利福平或活性化合物下，始终存在显然被感染的10％的细胞，这与最初感染比类似。令人意外的是，在铺板这种样品后CFU未恢复。由于潜在杆菌能够恢复生长这一事实(Cho等人，2007)，显微镜检查检测的杆菌必定是死亡的杆菌而不是潜在杆菌。因此，发明人的测定法检测了干扰杆菌在巨噬细胞中生长的化合物。
正如充分确立和证实的(图1a)，巨噬细胞能够支持高细菌接种量，其终止于包括大部分细胞质且最终导致巨噬细胞死亡。显然，当结核分枝杆菌与BCG(卡介苗)相比是病原体，甚至在高MOI下也不能诱导大量细胞毒性(数据未显示)。将这点考虑进去，决定在感染后第5天设定数据获取，此时DMSO样品中的细胞数相对于抗生素保护的对照组显著减少。因此，监测细胞数是能够使发明人证实化合物的抗菌活性的额外参数。
不同于基于直接荧光的测定，对基于图像的测定的分析证实变化更为显著。测定生物学固有的几个参数部分解释了通常对HTS验证可接受的较低Z’-值。剩余的荧光死亡杆菌不具有对Z’-值的过多影响，而DMSO对照组的感染比的变化似乎引起差异。另外的重要性在于如下事实：在感染时，巨噬细胞具有迁移倾向，由此产生不均匀的图像组(图2a)。然而，初步筛选的目的在于鉴定在20μM浓度下具有完全活性的化合物。因此，为了该目的，对感染比(INH/DMSO)的正Z’值视为可接受的值。根据本发明命中化合物的选择的验证的最佳证据来源于随后的系列稀释分析，其中证实了几乎100％的命中化合物。对每一命中化合物而言，得到用于感染比以及在细胞数方面无毒性化合物的恰好拟合的剂量响应曲线。此外，细胞数带来了对结果的额外证实，它完全不依赖于绿色荧光发射和GFP表达。
发现显然对胞内和体外结核分枝杆菌生长具有活性的化合物是最富有希望的。分离自该库的最佳抑制剂在与INH相同范围内具有抑制活性。其他结构活性相关性研究促使确定其活性是否可以改善。在使用这种基于表型细胞的模型的另一种研究过程中，对具有已知体外抗菌功效的化合物得到了降至ng/mL等级的MIC，显示可以通过本发明的测定法鉴定具有MIC低于INH的化合物(数据未显示)。最大限度关注的是仅在胞内细菌测定中具有活性的化合物，因为它们可能具有不依赖于感染菌株的新作用机制，从而启示它们还可以对无法医治的多药物耐药性(MDR)-株具有活性。
上述结果共同显示使用自动化荧光显微镜检查监测结核分枝杆菌生长是高度肯定的和可靠的并且该方法能够快速筛选有效的抗TB化合物。
本发明的优选实施方案如下：
1.具有式VIII的化合物：
其中
m是0、1、2或3；
X3选自CH2、O、S和NH；
X4选自卤化物、烷基、OR23，SR24和NR25R26；
R20选自酰基、烷氧基、烷基、烷基氨基、烷基羧酸、芳基羧酸、烷基羧酸烷基酯、亚烷基、烷基醚、烷基羟基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧酸，氰基、环烷基、羧酸、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、卤代烷基醚、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基和氢，它们中任意一个任选被取代；
R21和R22各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷基醚、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基醚、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代；
R23选自酰基、烷基、烷基氨基、亚烷基、炔基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、环烷基、酯、醚、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、氢、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代；
R24选自烷基、烷基芳基、亚烷基、炔基、芳基、环烷基、酯、卤素、卤代烷基、杂芳基、杂环烷基和氢，它们中的任意一个任选被取代；且
R25和R26各自独立地选自酰基、烷基、氨基烷基、亚烷基、烷硫基、炔基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、环烷基、酯、醚、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、卤代烷基醚、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基和氢，它们中的任意一个任选被取代。
2.实施方案1的化合物，其具有式VIIIa：
其中
X5选自CH2，C＝O和C＝S；
Z1和Z2各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷基醚、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基醚，芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基和氢，或两个基团彼此连接成5或6元环、杂环和杂芳基环，它们中的任意一个任选被取代；
R27和R28各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷基醚，烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基醚，芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代；
R29和R30各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷基醚，烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基醚、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，或两个基团彼此连接成5或6元环、杂环、芳基和杂芳基环，它们中的任意一个任选被取代。
3.实施方案1的化合物，其具有如实施例7所示的式125-301之一，优选如表4中所示的132-135、137、139-140、147、151-152、160、163、173、180、184-185、193、195、199-201、204、206-222、224、226、229、231-243、245-278、280-286和290-301。
4.化合物，其具有通式II：
其中
R5和R6各自独立地选自酰基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、环烷基、酯、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、磺酸、磺酸盐、磺酸酯和磺酰基，它们中的任意一个任选被取代，且
R7、R8和R9各自独立地选自烷氧基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、酰氨基、氨基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、氰基、环烷基、酯、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、羟基、氢、硝基、硫代、磺酸、磺酸盐、磺酸酯、磺酰基和磺酰基氨基，它们中的任意一个任选被取代。
5.实施方案4的化合物，其中R5和R6连接，具有通式IIa：
其中
n是0、1、2或3；
Y和Z各自独立地选自CH2、CHOR10、CHNR10R11、CR10R11和NR10；且
R10和R11各自独立地选自酰基、烷基、烷基氨基、亚烷基、烷硫基、炔基、芳基、芳基烷氧基、芳基氨基、芳硫基、羧基、环烷基、酯、卤代烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基氨基、杂环烷基、氢、磺酸、磺酸盐、磺酸酯和磺酰基，它们中的任意一个任选被取代。
6.实施方案4的化合物，其具有如表2中所示的通式II的式之一和如实施例6所示的式1-123之一，优选如表4中所示的1-24、26-34、54、56、58-61、63-64、67、90-101、103-105、107-109、112、114-116和118-121。
7.化合物，其具有如表3中所示的通式I、III-VII和IX-XX之一。
8.实施方案1-7任一项的化合物，用于治疗细菌感染。
9.实施方案1-6任一项的化合物，用于治疗细菌感染。
10.实施方案1-7任一项的化合物，用于治疗肺结核。
11.实施方案1-6任一项的化合物，用于治疗肺结核。
12.药物组合物，其包含实施方案1-7任一项的化合物。
13.药物组合物，其包含实施方案1-6任一项的化合物。
14.治疗肺结核的方法，其包括对有此需要的人施用适量的实施方案1-7任一项的化合物。
15.治疗肺结核的方法，其包括给有此需要的人施用适量的实施方案1-6任一项的化合物。
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                                        表3
活性范围:+++表示＜5uM,++表示在5b-20uM之间，+表示＞20uM
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                                 表4
INH：异烟肼，RIF：利福平，Strep：链霉素，R：耐药性。1从切除的肺组织或痰样本中分离临床分离物，所述组织或样本采集自2003年10月－2007年3月的National Masan Tuberculosis Hospital的活动性肺结核住院患者。                       表5
INH：异烟肼，RIF：利福平，Strep：链霉素，R：耐药性。1从切除的肺组织或痰样本中分离临床分离物，所述组织或样本采集自2003年10月－2007年3月的National Masan Tuberculosis Hospital的活动性肺结核住院患者。NE：至相当于320μM的100μg/mL无效果。对来自CHU d’Angers，France的临床分离物完成抗菌谱。
                                      表6
ND：未做；-：无菌落
-：无菌落
                                    表7

Claims (13)

1.筛选方法，其包括下列步骤：
(a)用经荧光标记的结核分枝杆菌分批感染宿主细胞；
(b)除去游离的未结合的分枝杆菌；
(c)将待测试的化合物添加到多孔板上；
(d)将感染了经荧光标记的结核分枝杆菌的所述宿主细胞接种入包含所述化合物的所述多孔板；
(e)温育包含感染了经荧光标记的结核分枝杆菌的宿主细胞和所述化合物的所述多孔板；
(f)荧光标记所述宿主细胞；
(g)使用自动化共焦显微镜检查分析所述多孔板。
2.权利要求1的方法，其中所述筛选方法寻找干扰在所述宿主细胞内结核分枝杆菌繁殖的化合物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞为巨噬细胞，优选地活巨噬细胞。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述自动化共焦荧光显微镜检查测量胞内分枝杆菌生长。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中步骤(g)包括，对于每一种化合物，测量：
-总宿主细胞数目，例如总巨噬细胞数目；
-被感染的宿主细胞的百分比；和/或
-感染抑制百分比。
6.权利要求5的方法，其中：
(i)低的(总)细胞数目表明了所述化合物的毒性和/或在巨噬细胞内结核分枝杆菌的不受限制的生长；
(ii)高的(总)细胞数目表明了所述化合物是非毒性的并且阻止分枝杆菌生长。
7.前述权利要求中任一项的方法，其包括使用选自下列中的至少一个的对照：
-替代步骤(c)中的化合物，添加具有已知的抗结核病活性的化合物(作为阳性对照)，例如异烟肼、利福平、乙硫异烟胺或莫西沙星；
-替代步骤(c)中的化合物，添加DMSO或抗生素对照(作为阴性对照)。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述结核分枝杆菌用GFP进行标记。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述宿主细胞用SYTO60进行标记。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(b)之后，用抗生素，优选地阿米卡星进行温育。
11.前述权利要求中任一项的方法，其用于大规模化学品库的高流通量筛选(HTS)。
12.在权利要求1至11中任一项的方法之中鉴定出的化合物，其干扰在宿主细胞内，优选地在宿主巨噬细胞内结核分枝杆菌的繁殖。
13.权利要求12的化合物，其由下式所示：
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