CN101008029A - 以结核杆菌异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物筛选模型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以结核杆菌异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物筛选模型，以及利用所述筛选模型筛选靶向持留菌的新型抗结核药物的方法。

Description

以结核杆菌异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物筛选模型

发明领域

本发明涉及一种以结核杆菌异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物筛选模型，以及利用所述筛选模型筛选靶向持留菌的新型抗结核药物的方法。

发明背景

近年来，结核病(TB)卷土重来，全球约20亿人口感染了结核杆菌，每年出现800万新病例，200万人死亡；我国有近4亿多人口感染了结核菌，受感染者中有10％会发病，在未来10年可能将有3000万人发生TB，控制结核病疫情成为当务之急。

结核杆菌的持留(persistence)和耐药(resistance)，是当前实现有效控制结核病的两大障碍。由于持留结核菌的存在，使结核病疗程漫长，即便是采用最好的DOTS疗法，至少要6个月的时间，冗长的疗程不仅使病人难于遵守既定的疗法，增加了患者的痛苦和负担，更重要的是，漫长的疗程是导致耐药菌不断出现的主要原因。耐药结核菌的快速增长，越来越威胁了人类对结核病的控制，使全球处于结核病紧急状态。

因此，研制靶向持留菌的抗结核药物，缩短结核病疗程，不仅可减少患者的痛苦和负担，对于控制耐药结核菌的产生和蔓延，实现对结核病的有效控制，具有更加重大的意义。

临床研究表明，在结核病化疗的前两周，绝大多数的结核杆菌便能被杀死，剩余的6个月则是用来杀灭持留菌。宿主免疫反应以及现有的抗结核病药物能迅速杀死生长状态的结核杆菌，对处于非生长状态的持留菌却无能为力；当宿主免疫系统受到伤害时，持留菌可能转为生长状态，快速生长繁殖，并获得毒力，重新致病。

2000年，Jacobs教授领导的联合小组等在Nature杂志上揭示了持留菌长期存在的机理：结核杆菌被巨噬细胞吞噬后，利用宿主正常的免疫反应，在巨噬细胞内转为持留状态，躲过免疫系统地攻击和抗结核病药物的杀伤，再通过乙醛酸循环途径获取能量，维持其在宿主体内的长期持留存在。这一突破性的基础研究成果，为研制靶向持留菌的新型抗结核药物提供理论基础。

乙醛酸循环是只存在于少数植物和微生物体内的一种代谢途径，真核生物中不存在该代谢途径，异柠檬酸裂解酶(isocitratelyase，ICL)是乙醛酸循环途径中的关键酶，Mckinney教授的研究证明了异柠檬酸裂解酶对结核菌的持留性起决定性作用，敲除ICL基因的结核杆菌在小鼠体内迅速被杀灭，不再具有持留性。这一研究结果为研制缩短结核病疗程的新药，提示出一个理想的抗结核药物作用靶点。

本发明人通过建立以异柠檬酸裂解酶为靶点的新型高通量药物筛选模型，首次实现了从大量来源的微生物的代谢产物及其他来源的化合物中定向、高通量筛选靶向持留菌的新型抗结核药物，意在获得具有高选择毒性、作用机制独特、有应用前景的新型抗结核病药物，为缩短结核病疗程，降低患者的痛苦和负担，避免耐药结核菌的大量出现，做出自己的贡献。

国外的研究者针对持留结核杆菌开展了相当多的基础研究，并取得了令人瞩目的研究成果：阐明了持留状态结核分枝杆菌在宿主体内长期潜伏存在的机理，证明了异柠檬酸裂解酶在结核杆菌持留性中期关键作用；从巨噬细胞中分离得到了异柠檬酸裂解酶，并在结核分枝杆菌中对其进行了克隆与表达；确定了ICL的精细结构，测定了两种具有体外活性的ICL酶抑制剂与结核杆菌ICL形成的复合物的结构。国外著名的药物研究机构，如Glaxo Wellcome，正在将ICL作为靶点进行抗结核药物的设计工作，尚未获得靶向持留菌的TB药物。

本发明人通过建立以结核杆菌ICL为靶点的高通量药物筛选模型，从微生物代谢产物中筛选新型抗结核药物，在国内外均未见报道。

发明内容

本发明人以异柠檬酸裂解酶为靶点，用于抗结核药物，特别是靶向持留菌的高通量药物筛选模型。具体的，通过分子生物学方法，克隆表达结核分枝杆菌的异柠檬酸裂解酶，建立以异柠檬酸裂解酶为靶点、靶向持留菌的高通量药物筛选模型，利用我国丰富的微生物资源以及作为国家新药(微生物)筛选中心的优势，筛选靶向持留菌的新型抗结核药物。

具体的，本发明涉及一种以结核杆菌异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物筛选模型，所述筛选模型包括：1)由异柠檬酸、苯肼、MgCl₂、异柠檬酸裂解酶和衣康酸组成的阳性对照组，2)由异柠檬酸、苯肼、MgCl₂和异柠檬酸裂解酶组成的阴性对照组，以及3)由异柠檬酸、苯肼、MgCl₂、异柠檬酸裂解酶和待测微生物来源的发酵液组成的样品组，通过比较阳性对照组、阴性对照组和样品组在反应后324nm下的光吸收强度，用于以结核杆菌异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物筛选。

在本发明的优选实施方案中，其中阳性对照组中各组分的浓度分别为异柠檬酸4mM、苯肼4mM、MgCl₂ 5mM、异柠檬酸裂解酶1μg/ml、衣康酸2mM；阴性对照组中各组分的浓度分别为：异柠檬酸4mM、苯肼4mM、MgCl₂ 5mM、异柠檬酸裂解酶1μg/ml；样品组中各组分的浓度分别为：4mM、苯肼4mM、MgCl₂ 5mM、异柠檬酸裂解酶1μg/ml、待测微生物来源的发酵液5μl，其中所有组分均以50mM的MOPS的溶液(pH7.0)溶解。

本发明的另一方面还涉及一种利用上述筛选模型筛选抗结核药物之方法，包括如下步骤：

1)用候选微生物来源的发酵液组成的样品组以及相应的阳性对照组和阴性对照组37℃下反应15分钟，以终浓度为4M的尿素终止反应；

2)通过比较阳性对照组、阴性对照组和样品组在反应后324nm下的光吸收强度，筛选以结核杆菌异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物。

实施例1

利用所述筛选模型筛选微生物来源的样品以及判定方法

1.样品来源：由本室菌种组每周提供两百个发酵液样品。

2.样品设置：每块96孔板筛选80个样品，每孔80μl反应体系、5μl发酵液样品；同时各设置4组阳性对照和4组阴性对照。

3.在样品孔中分别加入5μl的待筛选发酵液，在阳性对照孔中加入5μl的衣糠酸(2mM)，在阴性对照孔中加入MOPS缓冲液(50mM，pH7.0)。

4.用8道微量进样器在各孔中加入40μl的异柠檬酸裂解酶溶液(酶浓度约为2μg/ml)，轻轻振荡，充分混合均匀。

5.用8道位量进样器在各孔中加入40μl的底物溶液(溶液中异柠檬酸、MgCl₂和苯肼的浓度均为8mM)，轻轻振荡，混合均匀。

6.将96孔板置于37℃，反应15分钟。

7.加入80μl 8M的尿素终止反应，使用Polarstar多功能检测仪检测324nm下光吸收强度的变化。

酶抑制率计算：

根据阴性对照、阳性对照和筛选样品的测定结果，规定酶抑制率的计算公式为：

阳性结果判断与复筛：

我们通常对抑制率大于50％的样品认定为阳性样品，需要对其进行复筛、三筛。经过复筛、三筛后得到的阳性样品则作为我们重点关注的样品，选取其中稳定性、活性较高的样品进行深入研究。

通过上述模型筛选获得的这类药物与现有的靶向生长型结核菌的抗结核药物不同，具有全新的作用机制，并且有很好的选择毒性，能有效清除持留状态的结核杆菌，与现有的抗TB药物联合使用，可以大大缩短结核病疗程，不仅降低治疗费用，减轻患者的痛苦，而且可减少和避免耐药结核菌的产生与蔓延。

参考文献：

1.World Health Orgnization，Tuberculosis Fact Sheet(No.104)，2000，http://www.who.int/gtb/；

2.2000年全国第四次结核病调查资料；

3.Smith CV，Sharma V，Sacchettini JC，TB药物发现：解决持留性与耐性问题，Tuberculosis(Edinb).2004；84(1-2)；45~55；

4.Zhang Y，Amzel LM.结核药物靶点，Curr Drug Targets 2002；Apr；3(2)131~154；

5.Wayne LG，Sohaskey CD.结核分枝杆菌的非复制性持留，Annu Rev Microbiol2001；55：139~163；

6.Parrish NM，Dick JD，Bishai WR.Trends Microbiol 1998；6；107-112；

7.Flynn JL，Chan J，Infect Immun 2001；69；4195-4201；

8.O’Brien RJ，Nunn PP，Am J Respir Crit Care Med，2001；163；1055~1058；

9.Parrish NM，Dick JD，Bishai WR.结核分枝杆菌的潜伏机制，Trends Microbiol.，1998；6；107~112；

10.Ulrichs T，Kaufmann SH.分枝杆菌的持留与免疫，Front Biosci 2002；Feb1；7：d458~69；

11.McKinney JD，等人，分枝杆菌在巨噬细胞和小鼠中的持留需要乙醛酸旁路酶异柠檬酸裂解酶，Nature，2000，406：735~738；

12.Honer Zu，Bentrup K，等人，鸟分枝杆菌和结核分枝杆菌中异柠檬酸裂解酶的活性及表达的表征，J Bacteriol.，1999，181(23)：7161~7167；

13.Sharrrma V，等人，异柠檬酸裂解酶，一种结核分枝杆菌的持留因子的结构NatStruct Biol。，2000，7(8)：663~668

14.Miriam Jacob，科学家靶定传染性疾病的卷土重来，Genetic Engineering News，2001，21(10)：11(15)。

Claims (3)

1.一种以结核杆菌异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物筛选模型，所述筛选模型包括1)由异柠檬酸、苯肼、MgCl₂、异柠檬酸裂解酶和衣康酸组成的阳性对照组，2)由异柠檬酸、苯肼、MgCl₂和异柠檬酸裂解酶组成的阴性对照组，以及3)由异柠檬酸、苯肼、MgCl₂、异柠檬酸裂解酶和待测微生物来源的发酵液组成的样品组。

2.权利要求1所述的筛选模型，其中

阳性对照组中各组分的浓度分别为异柠檬酸4mM、苯肼4mM、MgCl₂5mM、异柠檬酸裂解酶1μg/ml、衣康酸2mM；

阴性对照组中各组分的浓度分别为：异柠檬酸4mM、苯肼4mM、MgCl₂5mM、异柠檬酸裂解酶1μg/ml；

样品组中各组分的浓度分别为：4mM、苯肼4mM、MgCl₂5mM、异柠檬酸裂解酶1μg/ml、待测微生物来源的发酵液5μl，

其中所有组分均以50mM的MOPS的溶液(pH7.0)溶解。

3.一种利用权利要求1所述筛选模型筛选抗结核药物之方法，包括如下步骤：

1)用候选微生物来源的发酵液组成的样品组以及相应的阳性对照组和阴性对照组37℃下反应15分钟，以终浓度为4M的尿素终止反应；

2)通过比较阳性对照组、阴性对照组和样品组在反应后324nm下的光吸收强度，筛选以结核杆菌异柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物。