CN102871992A - 3,5-二硝基苯甲酰胺在制备抗结核药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及3,5-二硝基苯甲酰胺在制备抗结核药物中的应用。本发明选择结核分枝杆菌生长非必需但与其致病性密切相关的ESX-1分泌系统为药物靶点，构建抗结核病药物高通量筛选模型，利用该模型首次筛选出既能降低结核分枝杆菌的致病性又不抑制其体外生长，即不易诱发耐药的新型抗结核活性化合物--3,5-二硝基苯甲酰胺，为进一步研究该化合物在抗结核药物的临床应用奠定了基础。

Description

3,5-二硝基苯甲酰胺在制备抗结核药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物的新用途，具体地说，涉及3,5-二硝基苯甲酰胺在制备抗结核药物中的应用。

背景技术

目前，抗结核药物在临床上的滥用现象，使结核菌耐药性的问题日益突出，而曾使肺结核的死亡率降低了80%的抗结核药物现在对大多数的肺炎球菌都无效。据统计，在我国结核病每年新发病例145万，每年新发肺结核患者的耐多药（对利福平和异烟肼两种或两种以上抗结核药物耐药）率为8.32%，广泛耐药（几乎对所有的抗结核药物都耐药）率为0.68%。因此，寻找新的抗结核药物是目前抗结核工作的重点。而在抗结核药物研发中，多数的药物作用靶点，都是从抑制结核菌的生存为出发点，而采用该模式筛选到的抗结核药物，很容易使结核菌在药物的选择压力下，产生对药物的耐受。所以，寻找不容易导致耐药产生的新靶点，并以此为靶点筛选出活性化合物，给结核病的治疗提供了新思路。

以结核分枝杆菌ESX-1分泌系统为靶点，开展抗结核药物的研究。ESX-1分泌系统（Ⅶ型分泌系统）主要由RD1(region of difference1)区编码，包括9个基因(Rv3871～Rv3879c)，全长约9.5kb。该基因区在BCG疫苗株和一些非致病性结核分枝杆菌如田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti）中是缺失的，因此，该基因区在体外不影响结核菌的生长。但是在体内，结核分枝杆菌的ESX-1分泌系统介导多种毒力因子的分泌，在结核杆菌的致病性中起着关键作用，ESX-1分泌系统参与了结核分枝杆菌与宿主细胞的结合，引起细胞溶解，促进肉芽肿的形成，抑制吞噬体成熟；同时能够调节宿主细胞的相关免疫反应，对减少感染的巨噬细胞的细胞因子分泌反应起重要作用。如果将完整的RD1区整合入BCG疫苗株中，整合株在小鼠肺内的持留或增殖能力大大增强，并且也增强了其在宿主细胞内的存活能力。在ESX-1系统中，Rv3869、Rv3870和Rv3877分别有1、3和11个跨膜区，这三种蛋白同ESX-1分泌系统具有ATP酶活性的Rv3871共同形成一个膜结合的ESX-1分泌复合体，Rv3871与CFP-10的C末端信号肽结合，将CFP-10和ESAT-6转运到胞外。CFP-10和ESAT-6通常以二聚体的形式存在，CFP-10的C端具有信号序列，其C末端的七个氨基酸是CFP-10蛋白分泌所必须的，它还可以介导异源蛋白的分泌，如果将泛素的C末端连接这七个氨基酸，泛素能够被分泌至胞外。

以ESX-1分泌系统为靶点，寻找能够抑制该系统发挥功能，又不抑制分枝杆菌生长的抗结核药物，这样既可以降低结核菌的毒力和细胞内的生存力，又能够减少产生耐药性的可能性。相对结核分枝杆菌而言，海分枝杆菌生长速度相对较快、存在ESX-1分泌系统且生物安全性较高，目前已广泛用于结核病发病机制的研究。选择内源性表达ESX-1分泌系统的海分枝杆菌为模式生物，以CFP-10与荧光素酶（Luciferase简称LUC）融合作为报告基因，构建外源表达CFP-10和荧光素酶融合蛋白的重组海分枝杆菌，建立ESX-1分泌系统抑制剂的筛选模型。

3,5二硝基苯甲酰胺又名硝苯酰胺，一般用作抗球虫药，优点是抗药性产生得较慢，而对于其抗结核的作用从未有过报道。

发明内容

本发明的目的是提供3,5-二硝基苯甲酰胺在制备抗结核药物中的应用。

为了实现本发明目的，本发明通过构建外源表达来自于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中的CFP-10蛋白和报告蛋白的融合蛋白的重组海分枝杆菌，以该重组菌作为针对ESX-1分泌系统的抗结核病药物高通量筛选模型，向含有该重组菌的培养液中加入一定浓度的3,5-二硝基苯甲酰胺，培养一段时间后离心取上清测定报告蛋白的表达量或活性，以此来评价3,5-二硝基苯甲酰胺对ESX-1分泌系统的抑制活性。

前述的报告蛋白为荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶、β-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶或荧光蛋白家族中的成员，优选报告蛋白为荧光素酶。

进一步地，本发明提供一种抗结核药物，其有效成分为3,5-二硝基苯甲酰胺。任选含有药用赋形剂。优选所述抗结核药物为液体剂型、注射剂型、片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊剂等。

本发明选择结核分枝杆菌生长非必需但与其致病性密切相关的ESX-1分泌系统为药物靶点，构建抗结核病药物高通量筛选模型，利用该模型首次筛选出既能降低结核分枝杆菌的致病性又不抑制其体外生长，即不易诱发耐药的新型抗结核活性化合物--3,5-二硝基苯甲酰胺，为进一步研究该化合物在抗结核药物的临床应用奠定了基础。

附图说明

图1为本发明重组质粒pMV261-LUC-CFP-10的结构示意图。

图2为本发明阳性化合物IMB-BZ的活性分析，其中A和C为抑制胞外荧光素酶分泌的活性，B为抑菌活性。

图3为本发明阳性化合物IMB-BZ对Raw 264.7细胞的毒性。

图4A和B为感染了海分枝杆菌的巨噬细胞Raw 264.7的抗酸染色结果。

图5为本发明阳性化合物IMB-BZ对海分枝杆菌生长的抑制，其中，A为加药48h、96h后CFU值，B为加药48h、96h后涂布平板结果。

图6为本发明阳性化合物IMB-BZ的细胞内抗海分枝杆菌活性，其中，A为随着药物浓度的增加，细胞内海分枝杆菌的存活率逐渐下降，B为涂布平板结果；C为感染48h、72h、96h后海分杆菌在细胞内的存活率，D为涂布平板结果；E为阳性化合物IMB-BZ对海分枝杆菌M株以及三个突变株M3、M7和M8生长的抑制，F为涂布平板结果。

图7为本发明阳性化合物IMB-BZ对ESX-1分泌系统的底物CFP-10分泌的影响，其中，M为DMSO对照组，M+为给药IMB-BZ50μM组，以Hsp65表达水平为内参评价阳性药物作用效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施中使用的质粒pMV261已在C.K.Stover等，New use ofBCG for recombinant vaccines.Nature 1991,351:456-460中公开，该质粒由法国UniversitéMontpellier ⅡLaurent博士惠赠。

实施例1抗结核病药物高通量筛选模型的构建

1.1质粒pMV261-LUC-CFP-10的构建

以质粒pGL4（购自Promega公司）为模板，以5′-TTCCGAATTCATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA-3′为上游引物，以5′-CTTCATCTCTGCCATCACGGCGATCTTG-3′为下游引物进行PCR扩增得到LUC片段，以结核分枝杆菌基因组DNA为模板,以5′-CAAGATCGCCGTGATGGCAGAGATGAAG-3′为上游引物，以5′-AATTAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3′为下游引物得到CFP-10片段,再以LUC和CFP-10为模板,以5′-TTCCGAATTCATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGA-3′为上游引物，以5′-AATTAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3′为下游引物进行PCR扩增得到LUC-CFP-10片段，在质粒pMV261上的酶切位点EcoR Ⅰ和HindⅢ之间插入此片段，得到重组质粒，命名为pMV261-LUC-CFP-10（重组质粒的结构如图1所示，其核苷酸序列如Seq ID No:7所示）。

1.2海分枝杆菌的培养

取冻存的海分枝杆菌ATCC 927（购自美国典型培养物保藏中心），加入7H9液体培养基（购自BD公司）中，28℃，180r/min培养活化。用接种环蘸少许菌液，在7H11固体培养基（购自BD公司）平板上划线，28℃静置培养数天后挑取单菌落于7H9液体培养基中，28℃，180r/min振摇培养A₆₀₀（600nm处的吸光度值）约0.8。

1.3重组海分枝杆菌的构建

1.3.1海分枝杆菌感受态细胞的制备

将培养至A₆₀₀约0.8的海分枝杆菌菌液置于冰浴30min后，4℃，8000r/min离心15min收集菌体，并用预冷的10%甘油洗涤4次后重悬于1ml 10%甘油中，即得到海分枝杆菌感受态细胞。

1.3.2重组质粒的电穿孔转化

取1μg重组质粒加入到500μl感受态细胞中，以空白质粒pMV261作为对照，充分混匀，冰浴30min后转入预冷的直径为2mm电穿孔杯中，在电压2.5kV，电容50μF，电阻720Ω的条件下进行电穿孔转化，脉冲时间4ms，放电完毕后立即冰浴10min。将转化后的海分枝杆菌转入不含抗生素的7H9液体培养液中于28℃，180r/min培养4-5小时后，取200μl涂布于含有50μg/ml卡那霉素（购自Sigma公司）的7H11固体培养基平板表面，于28℃静置培养5-7d，筛选阳性克隆。将含有质粒pMV261-LUC-CFP-10的重组海分枝杆菌命名为MM-pMV261-LUC-CFP-10。

1.4待筛选的药物化合物样品的制备

化合物样品：将10mg纯品化合物溶于1ml DMSO中，用50%DMSO稀释到1mg/ml，取2μl作用于198μl菌体上清中，使其终浓度为10μg/ml。

发酵液样品：菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物接入盛有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃，190rpm旋转摇床培养4d。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用1ml的DMSO溶解。取10μl加10μl水倍比稀释，取2μl作用于198μl菌体上清中。

1.5样品活性检测

将培养至A₆₀₀约为0.8的重组海分枝杆菌离心收集菌体，换新的培养基稀释A₆₀₀约为0.1，按以下分组进行操作。

空白对照组：加入2μl 50%DMSO于198μl海分枝杆菌（ATCC927）中。

实验组分为两组：

对照组：加入2μl 50%DMSO于198μl重组海分枝杆菌（MM-pMV261-LUC-CFP-10）菌液中，以此来反映DMSO对LUC-CFP-10分泌的影响。

样品组：取待筛选的样品2μl于198μl上述重组海分枝杆菌菌液中，该组反映筛选样品对ESX-1分泌系统的抑制程度，同时反映对菌体生长的抑制程度。

96孔板密封培养48h后离心收集上清，吸取20μl上清至白色酶标板中，加入50μl荧光素酶底物（购自Promega公司）测定荧光素酶活性，并测定A₆₀₀。

1.6数据处理

分泌效率＝（样品组－空白对照组）∕（对照组－空白对照组）×100%

抑制率=100－分泌效率

1.7测试样品对重组海分枝杆菌体外生长的影响。

为了获得能抑制ESX-1系统的分泌效率，但是对重组海分枝杆菌的生长抑制作用却很小，因此不易产生耐药的活性化合物，将已加入样品并且培养了48小时的重组海分枝杆菌取100μl测定其A₆₀₀，以此来监测测试样品对重组海分枝杆菌生长状况的影响。

实验数据用x±s表示,显著性分析采用Excel软件中的数据分析工具进行t检验(n≥3)。

1.8测试样品对LUC酶活性的影响

ESX-1系统是结核分枝杆菌及海分枝杆菌等引发致病性的重要分泌系统，许多重要的毒力蛋白都是通过该分泌系统分泌到胞外。为了得到抑制ESX-1分泌系统分泌效率的活性化合物，以期能降低结核分枝杆菌的毒力。将接种时加入样品并培养了48小时的重组海分枝杆菌，离心吸取上清20μl于白色酶标板中，加入50μl底物测定Luciferase活性。

实验数据用x±s表示,显著性分析采用Excel软件中的数据分析工具进行t检验(n≥3)。

实施例23,5-二硝基苯甲酰胺的筛选

I材料与方法

1．阳性化合物的筛选

1．1培养时间的确定

将培养至A₆₀₀约为0.8的海分枝杆菌及重组海分枝杆菌5000g离心5min收集菌体，换新鲜苏通培养基稀释A₆₀₀约为0.1，分别接种到96孔板中，每个样品重复32孔，周边孔加水防止培养基蒸发，96孔板密封培养48h、72h、96h后离心收集上清，吸取20μl上清至白色酶标板中，加入35μl荧光素酶底物，测定荧光素酶活性。确定最佳培养时间，以此为依据，进行药物筛选。

1.2化合物样品的制备

化合物样品：将纯品化合物溶解于1ml DMSO，用50%DMSO稀释到2mM，取2μl作用于198μl菌体上清中，使其终浓度为20μM。

1.3重组海分枝杆菌荧光素酶活性的测定

将培养至A₆₀₀约为0.8的重组海分枝杆菌5000g离心5min收集菌体，换新鲜苏通培养基稀释A₆₀₀约为0.1。

药物筛选按以下分组进行操作：

1）空白对照组：加入2μl 50%DMSO于198μl海分枝杆菌中。

2）对照组：加入2μl 50%DMSO于198μl重组海分枝杆菌（MM-pMV261-LUC-CFP-10）菌液中，以此来反映DMSO对LUC-CFP-10分泌的影响。

3）样品组：取待筛选的样品2μl加入198μl上述重组海分枝杆菌菌液中，该组反映筛选样品对ESX-1分泌系统的抑制程度，同时反映对菌体生长的抑制程度。

4）96孔板密封培养48h后离心收集上清，吸取20μl上清至白色酶标板中，加入35μl荧光素酶底物，测定荧光素酶活性。

1.4测试样品对重组海分枝杆菌体外生长状况的影响

为了获得能抑制ESX-1系统的分泌效率，但是对重组海分枝杆菌的生长抑制作用却很小，因此不易产生耐药的活性化合物，将荧光值下降50%并且培养了48小时的重组海分枝杆菌重悬，取100μl测定其A₆₀₀，以此来监测测试样品对重组海分枝杆菌生长状况的影响，选择A₆₀₀下降小于10%的样品作为有意义的阳性化合物。

1.5非特异性阳性化合物的排除

将培养至A₆₀₀约为0.8的重组海分枝杆菌5000g离心5min收集菌体，取上清198μl于96孔板中，加入2μl挑选出的既可以使荧光素酶活性下降，又不影响菌体生长的阳性化合物，28℃放置2-3h，测定上清中荧光素酶活性。选择酶活性下降小于10%的阳性化合物作为筛选有意义的阳性化合物。

1.6数据处理

分泌效率＝（样品组－空白对照组）∕（对照组－空白对照组）×100%

抑制率=100－分泌效率

2．阳性化合物对重组海分枝杆菌中LUC-CFP-10分泌活性的影响

将重组海分枝杆菌置于3ml 7H9液体培养基培养A₆₀₀约为0.4左右，离心收集菌体，换新鲜的苏通培养基，培养A₆₀₀约为0.8左右，5000g离心5min，收集上清，加入到MWCO 30000离心超滤管（Amicon Ultra-4ml，Millipore）中，4000g离心25分钟，至终体积为100μl。将离心收集后的菌体细胞加入溶菌裂解液重悬，进行超声破碎，功率20%，超声5s，停8s，工作时间15min，5000g离心10分钟，去除未破碎的菌体及细胞碎片。将上述浓缩后的上清及超声破碎得到的菌体蛋白进行蛋白定量，定量后的所有样品加入SDS-PAGE上样缓冲液,振荡混匀,沸水浴煮10min,冷却后即可上样,进行Westernblot检测。

3．阳性化合物对重组海分枝杆菌体外有效抑制浓度的测定

阳性化合物的配制：称取阳性化合物，用DMSO配制成64m M的储存液，-20℃保存。使用时，将阳性化合物用DMSO倍比稀释成32mM、16mM、8mM、4mM、2mM和1mM。

将培养至A₆₀₀约为0.8的重组海分枝杆菌5000g离心5min收集菌体，换新鲜苏通培养基稀释至A₆₀₀约为0.1，接种到96孔板中，同时分别加入不同浓度的阳性化合物，使其终浓度分别为0μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM，周边孔加水防止培养基蒸发，96孔板密封培养48h后离心收集上清，吸取20μl上清至白色酶标板中，加入35μl荧光素酶底物，测定荧光素酶活性。

4．不同浓度阳性化合物对重组海分枝杆菌体外生长影响的测定

为验证不同浓度阳性化合物对重组海分枝杆菌体外生长的影响，将上述已加入化合物作用48h离心后的海分枝各孔中的菌体重悬，取100μl测定A₆₀₀。

5．阳性化合物体内活性的测定

5.1巨噬细胞Raw264.7细胞的培养

①细胞复苏

将液氮冻存细胞迅速投入37℃水浴，持续晃动，使其快速融化。800rpm离心3min，弃上清，吸取1ml含10%FBS的DMEM完全培养液重悬细胞，对细胞进行适当稀释后接种至细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO₂的培养箱中进行培养，次日更换培养液继续培养。

②细胞传代

当细胞生长至达瓶底面积70%~80%时，传代培养。传代时首先弃去原有培养基，加入适量0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(v：v=1:1)消化液。37℃消化约3min后弃去消化液，立即加入含10%FBS的DMEM培养液，用吸管反复轻轻吹打瓶皿底壁，使细胞完全脱离底壁且吹打使之分散为单个细胞悬液。再依据实验需要按适当比例接种细胞悬液于新的培养瓶内，置于37℃、5%CO₂培养箱中继续静置培养，传至2～3代用于后续实验。

③细胞冻存

取对数生长期生长状态良好的细胞，用胰酶消化后800rpm离心3min收集细胞，弃上清，加入含10%DMSO的FBS冻存液轻轻吹打后制成单细胞悬液，逐滴加入冻存管，封口，标记。放入冻存盒，-20℃放置1h，-80℃放置3h-4h后缓慢投入液氮中保存。

6.海分枝杆菌感染巨噬细胞

①巨噬细胞接种孔板的制备

取对数生长期生长状态良好的细胞，胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM培养液调整细胞浓度为2.0×10⁵个/ml，接种于24孔培养板中，每孔1ml。放入37℃、5%CO₂的培养箱中进行培养使细胞贴壁。

②实验用海分枝杆菌的制备

将培养至对数生长期的海分枝杆菌5000rpm离心10min收集菌体，PBS洗涤3次后，加入不含血清的DMEM培养液重悬，用玛瑙研钵适当研磨菌体后使其充分分散为单个菌，用紫外分光光度计测其A₆₀₀值，转换公式为A=4.5×10^-9×C。

③海分枝杆菌感染巨噬细胞

按感染复数为50的比例使海分枝杆菌感染巨噬细胞，37℃饱和湿度、5%CO₂条件下感染3h，将24孔板中的一孔细胞用胰酶消化后，取细胞悬液制成细胞涂片，用预冷的甲醇-醋酸(v:v=3:l)于4℃固定30min，做抗酸染色。显微镜下观察到细胞内有抗酸染色阳性的海分枝杆菌后，吸出原有细胞培养液，用无菌PBS洗涤细胞3次，更换含有200μg/ml庆大霉素的新鲜培养液，以除去未被吞噬的海分枝杆菌，无菌PBS洗涤细胞3次，加入1ml含不同药物浓度的DMEM完全培养基，置37℃、5%CO₂的培养箱中培养72h后，用胰酶将细胞消化下来，以含0.1%TritonX-100的PBS裂解细胞，用PBS将裂解后的细胞系列稀释涂布于不含抗性的LB平板上，每组样品最少4个稀释度。每个稀释度涂布3个平板，37℃静置培养6-8d，待菌落长出后计数CFU。

7.ESX-1分泌蛋白检测

①海分支杆菌的制备

将培养至对数生长期的海分枝杆菌3000rpm离心5min，收集菌体，PBS洗涤3次后，加入苏通（Sauton）培养基重悬，同时给药IMB-BZ50μM，以加入等体积DMSO的样品为对照，继续培养3~5天后收集样品。

②蛋白样品的制备

将在Sauton培养基中培养3~5天的海分支杆菌5000rpm离心10min，分别收集菌体和上清液。上清移入干净的EP管中，AmiconUltra-4（millipore）浓缩至100μl；菌体细胞中加入适量体积的分支杆菌菌体裂解液后，加入苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）至终浓度为100μg/ml，在冰水浴下超声破碎菌体，功率：20%，超声5s，间隔8s，作用70次，所得破碎细胞于4℃15000g离心15min，去除未破碎的菌体及细胞碎片。取上清加入1/4体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，振荡混匀，沸水浴煮10min后即可用于SDS-PAGE电泳。

③western-blot检测

SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜1h，PBST洗膜一次后，用含5%脱脂奶粉的PBST封闭1h，PBST洗膜一次，用含2%脱脂奶粉的PBST配制一抗、二抗。一抗孵育2h，PBST洗膜三次，每次10min，二抗孵育1h，PBST洗膜三次，每次10min，ECL显色，记录结果。

II结果

1.以ESX-1分泌系统为靶点的模型的应用

阳性化合物的筛选结果

利用以ESX-1分泌系统为靶点建立的筛选模型，得到具有抑制重组海分枝杆菌分泌活性的阳性化合物3,5-二硝基苯甲酰胺（IMB-BZ）。对阳性化合物IMB-BZ有效抑制浓度范围进行了测定。如图2A所示，在作用浓度为10μM时，IMB-BZ（相当于2.1μg/ml）明显地抑制胞外荧光素酶的分泌，且呈剂量依赖性。

为了排除分泌活性的下降是由于阳性化合物抑制了重组菌的生长的可能性，测定了阳性化合物对重组海分枝杆菌体外生长的影响。当药物浓度增加了十六倍（160μM）时，阳性化合物没有出现明显的抑菌活性（图2B），因此，筛得的化合物在体外几乎没有抑菌活性。因此，它对重组海分枝杆菌分泌荧光素酶的抑制作用并不是因为菌体的生长受到抑制而造成的。

为了进一步排除阳性化合物是荧光素酶抑制剂的可能性，在重组海分枝杆菌的上清中加入阳性化合物，作用一段时间后测定酶活性。如图2C所示，当浓度增大到160μM时，IMB-BZ对荧光素酶抑制作用不明显。

以上实验表明，筛得的化合物既抑制重组海分枝杆菌的分泌活性，又没有体外抑菌活性，可以作为较为理想的活性化合物去进行后续的实验。

2.阳性化合物细胞内抗海分枝杆菌活性的测定及其作用机制的研究

2.1阳性化合物作用于Raw 264.7细胞的毒性实验

首先采用CCK-8试剂盒测定了上述化合物的细胞毒性。如图3所示，当药物浓度达到160μM时，IMB-BZ未见明显毒性，因此可以用于体内实验进行下一步验证。

2.2阳性化合物IMB-BZ细胞内抗海分枝杆菌的活性

根据上述实验的结果，利用抑制ESX-1分泌系统活性较好而细胞毒性较低的化合物IMB-BZ进行后续研究。首先将海分枝杆菌感染巨噬细胞Raw 264.7，感染复数为50。抗酸染色显示巨噬细胞Raw 264.7可以有效吞噬海分枝杆菌（如图4A和B）。感染后，加入终浓度为10μM的IMB-BZ药物，分别在加药48h、96h后裂解细胞，释放胞内细菌，适当稀释后涂布平板，计数CFU。如图5A、5B所示，在加入药物48h和96h后，与未加药组相比，加药组的CFU均明显下降，表明IMB-BZ可以影响胞内的海分枝杆菌的生存。

为了定量评价IMB-BZ细胞内抗海分枝杆菌的活性，将不同浓度的化合物作用于感染了海分枝杆菌的巨噬细胞，72小时后，裂解细胞涂布平板。随着药物浓度的增加，细胞内海分枝杆菌的存活率逐渐下降（图6A、B所示），IC₅₀约为7.7μM。尽管IMB-BZ在体外并不抑制菌体的生长，而在体内却表现出明显的抑菌活性（IC₅₀为7.7μM）。为了进一步了解IMB-BZ的抗菌活性，将感染了海分枝杆菌的巨噬细胞分别用10μM药物处理24h、48h、72h、96h，同时，另外一组细胞分别在24h后更换同浓度的药物，以防止药物有效浓度的降低，保证药物的有效作用时间。每隔24h更换加药的培养基，感染48h、72h、96h后海分杆菌在细胞内的存活率低于未更换培养基组（图6C、D）。

上述实验表明IMB-BZ抑制海分枝杆菌的ESX-1分泌系统及其在细胞内的生存，为了进一步验证此化合物的胞内抗菌活性是与ESX-1分泌系统有关的，研究了IMB-BZ对海分枝杆菌M株的ESX-1突变株M3(Mh3868::Tn)、M7(Mh3879::Tn)、M8(Mh3881::Tn)（海分枝杆菌M株、M3(Mh3868::Tn)、M7(Mh3879::Tn)和M8(Mh3881::Tn)由美国（旧金山）加州大学医学、微生物学和免疫学系的Eric J.Brown教授惠赠，A mycobacterial virulence gene cluster extending RD1 is requiredfor cytolysis,bacterial spreading and ESAT-6secretion.MolecularMicrobiology(2004)53(6),1677–1693)）的细胞内抗菌活性。已知Mh3879是ESX-1分泌系统的蛋白之一，Mh3868、Mh3881均属于extended RD1区（延长的RD1区），被证明对于海分枝杆菌发挥毒力起着重要作用。感染巨噬细胞后，加入10μM化合物作用72小时后，计数CFU（图6F），三株突变菌株在细胞内与野生株相比都有明显的生长缺陷，即胞内存活率均低于野生株的40%（图6E），加入10μM的活性化合物后，药物对于野生株在体内的生长有明显的抵制作用，而对于突变株而言，无论加药还是不加药，海分枝杆菌在细胞内的生长都没有明显的改变。这些实验结果表明，IMB-BZ在体内的抑制作用很可能是通过抑制ESX-1分泌系统来实现的。

2.3阳性化合物IMB-BZ对CFP-10分泌的影响

将培养至对数生长期的海分枝杆菌接入Sauton培养基中，同时给药IMB-BZ 50μM，以加入等体积DMSO的样品为对照，继续培养3~5天后收集样品，进行western-blot分析。结果如图7所示，当菌体蛋白中Hsp65表达水平相当的情况下，等体积的上清蛋白样品中约12kD位置处可看到明显条带，且加药组中蛋白水平明显低于DMSO组，表明阳性化合物IMB-BZ可抑制ESX-1分泌系统的底物CFP-10的分泌。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

Stanley SA,Raghavan S,Hwang WW，Cox JS.Acute infection and macrophagesubversion by Mycobacterium tuberculosis require a specialized secretion system.Proc Natl Acad Sci U S A 2003,100:13001-13006.Guinn KM,Hickey MJ,Mathur SK,Zakel KL,Grotzke JE,Lewinsohn DM,et al.Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10and forvirulence of Mycobacterium tuberculosis.Mol Microbiol 2004,51:359-370.Brodin P，Majlessi L,Marsollier L,de Jonge MI,Bottai D,Demangel C,et al.Dissection of ESAT-6system  1of Mycobacterium tuberculosis  and impact onimmunogenicity and virulence.Infect Immun 2006,74:88-98.

Pym AS,Brodin P，Brosch R,Huerre M,Cole ST.Loss of RD1contributed to theattenuation of the  live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG andMycobacterium microti.Mol Microbiol 2002,46:709-717.

Champion PA,Stanley SA,Champion MM,Brown EJ,Cox JS.C-terminal signalsequence promotes virulence factor secretion in Mycobacterium tuberculosis.Science2006,313:1632-1636.

Gao LY，Guo S,McLaughlin B,Morisaki H,Engel JN,Brown EJ.A mycobacterialvirulence gene cluster extending RD1 is required for cytolysis,bacterial spreading andESAT-6secretion.Mol Microbiol 2004,53:1677-1693.

Claims (4)

1.3,5-二硝基苯甲酰胺在制备抗结核药物中的应用。

2.一种抗结核药物，其有效成分为3,5-二硝基苯甲酰胺。

3.根据权利要求2所述的抗结核药物，任选含有药用赋形剂。

4.根据权利要求2或3所述的抗结核药物，其为液体剂型、注射剂型、片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊剂。

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