CN1580276A - 一种高通量抗结核杆菌药物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种高通量抗结核杆菌药物的筛选方法，在含有25～60mMHEPES、0.2～2mM NADPH、2～10mM Mg2+、0.4～2mM dTDP－Glc、0.05～0.2mg/mlRmlB酶蛋白、0.02～0.08mg/ml RmlC酶蛋白、0.01～0.15mg/mlRmlD酶蛋白的溶液中加入药物，20～30℃培育，测定OD值，检测340nm下吸光值的变化，根据体系吸光值的变化，确定所加入物质是否是以结核杆菌细胞壁为靶点的药物。本发明的优点为：药筛模型可于酶标仪上酶标板内进行反应，药物用量少，速度快，是高通量的药筛模型，筛选得到的抗结核新药将具有高药效性、高度专一性并且无毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及结核杆菌药物，具体地说是一种高通量抗结核杆菌药物的筛选方法。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起人类结核病的致病菌。结核病，尤其是肺结核，在历史上曾经是一种烈性传染病，由于医药科技的发展，结核病一度不再被认为是难治之症；然而自1985年以来，全球结核病疫情大有卷土重来之势，结核病的发病率及由此引起的死亡率都在显著增加；据世界卫生组织(WHO)统计，每年全世界约有八百万人患肺结核病，其中两百万人死于该病，全世界三分之一的人口已被结核分枝杆菌所感染，其中10％感染者可能成为肺结核病的患者。WHO已宣布全球结核病疫情处于紧急状态，并指出结核病现在已经成为人类传染病中的第一杀手。造成全球结核病疫情回升的主要原因是具多耐药性的结核分枝杆菌菌株(MDR-TB)的出现；因此，对于治疗结核病的有效新药的研制迫在眉睫。
目前，开发新的抗生素的战略是：寻找靶标(酶蛋白)→克隆目标基因→证明靶标的重要性(基因敲除)→表达目标酶蛋白→建立酶催化反应方法→建立高通量药物筛选方法及分析酶蛋白的晶体结构→开发新的抗生素。因此，RmlB，RmlC，RmlD酶是开发抑制结核分枝杆菌生长抗生素的理想靶标。
结核分枝杆菌细胞壁可作为新药开发的靶标，因为细胞壁是分枝杆菌赖以生存的结构基础(文献1：Young，D.B.and K.Duncan(1995)，Prospectsfor new interventions in the treatment and prevention of mycobacterial disease，Annual Review of Microbiology 49：641-673)。目前国外对分枝杆菌细胞壁的结构及其生物合成已有较深入的研究；其细胞壁核心部分主要由聚阿拉伯糖聚半乳糖、肽聚糖以及分枝菌酸三种成分组成(参见图1所示)(文献2：McNeil，M.(1996)，Target preclinical drug development for Mycobacteriumavium complex：a biochemical approach，In：Mycobacterium avium-ComplexInfection，pp 263-283，Edited by Korvick，J.A.and C.A.Benson，MarcelDekker，Inc.，New York)；分枝菌酸和聚阿拉伯糖聚半乳糖通过衔接双糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共价连接到肽聚糖大分子上，因此衔接双糖是一个重要的结构成分(参见图2所示)；衔接双糖中的鼠李糖残基的供体为dTDP-鼠李糖；结核分枝杆菌中有四种酶催化由底物葡萄糖-1-磷酸合成dTDP-鼠李糖的过程(文献3：Ma，Y.，Mills，J.，A.，Belisle，J.T.，et al.(1997)，Determination of the pathway for rhamnose biosynthesis inmycobacteria：cloning，sequencing and expression of the Mycobacteriumtuberculosis gene encoding α-D-glucose-1-phosphate thymidylyltransferase，Microbiology 143：937-945)，并且在分枝杆菌中不存在dTDP-鼠李糖生物合成的补救代谢途径。
由于人体中不存在鼠李糖分子，鼠李糖可作为研发新一代抗结核药物的重要靶标。对鼠李糖生物合成催化机理的深入研究将有助于建立筛选合成阻断剂的方法，以筛选抗结核新药。
发明内容
本发明的目的是提供一种高度专一性并且无毒副作用高通量抗结核杆菌药物的筛选方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
在含有25～60mM HEPES、0.2～2mM NADPH、2～10mM Mg2+、0.4～2mMdTDP-Glc、0.05～0.2mg/mlRmlB酶蛋白、0.02～0.08mg/ml RmlC酶蛋白、0.01～0.15mg/ml RmlD酶蛋白的溶液中加入中药、藏药、天然产物的有效成分或组合化学产物，20～30℃培育，以水调零，在340nm处测定OD值(每隔10min)，检测340nm下吸光值的变化根据体系吸光值的变化，确定所加入物质是否是以结核杆菌细胞壁为靶点的药物。
此过程是以RmlB、C、D酶蛋白为靶标，以dTDP-葡萄糖为底物，纯化的RmlB、C和D酶蛋白与dTDP-葡萄糖进行酶促反应，并在反应体系中加入NADPH；酶促反应发生后，在产物dTDP-鼠李糖生成的同时NADPH被转化为NADP，导致NADPH在340nm的光吸收值下降。如果某些化合物在反应中阻止产物dTDP-鼠李糖的生成并减少NADP的生成，可以得知这些化合物对酶活性有抑制作用，根据这个酶活性测定方法，根据加入中药、藏药及天然产物的有效成分以及组合化学产物后RmlB、C和D酶的活性大小或有无建立了抗结核药物的模型。
RmlC酶蛋白通过如下方法制得，从结核分枝杆菌基因组文库中调出rmlC基因，然后利用pET表达系统构建pET16b-Tb rmlC，转化在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中；菌株经过超声破碎细胞，离心，取上清液，利用pET表达载体上的组氨酸标记，采用组氨酸-Ni+亲和层析技术纯化得到RmlC酶蛋白；
RmlD酶蛋白是通过如下方法制得，从结核分枝杆菌基因组文库中调出rmlD基因，然后利用pET表达系统构建pET16b-Tb rmlD，转化在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中；菌株经过超声破碎细胞，离心，取沉淀，利用30-100％(较好为66％)浓度乙酸溶出RmlD酶蛋白(形成包涵体)，而后用较低浓度的乙酸对其透析，最后利用pET表达载体上的组氨酸标记，采用组氨酸-Ni+亲和层析技术纯化得到RmlD酶蛋白，用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度以及其分子量。
本发明具有如下优点：
1.本发明建立了结核杆菌细胞壁为靶点的药物筛选模型。rmlB、C、D是结核杆菌的生长相关基因，其基因所表达的蛋白(酶)是结核杆菌细胞壁形成过程中必需的；本发明从结核分枝杆菌基因组文库中克隆了rmlC、D基因，其编码dTDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖3，5表异构酶(RmlC)及dTDP-4-酮基-鼠李糖还原酶(RmlD)，并在大肠杆菌中表达了结核分枝杆菌的RmlC、D酶蛋白，建立了酶催化反应测试方法；RmlB、C、D酶是开发抑制结核分枝杆菌生长抗生素的理想靶标。
2.本发明筛选得到的抗结核新药将具高度专一性并且无毒副作用。结核分枝杆菌细胞壁可作为新药开发的靶标，因为细胞壁是分枝杆菌赖以生存的结构基础，目前国外对分枝杆菌细胞壁的结构及其生物合成已有较深入的研究；其细胞壁核心部分主要由聚阿拉伯糖聚半乳糖、肽聚糖以及分枝菌酸三种成分组成；分枝菌酸和聚阿拉伯糖聚半乳糖通过衔接双糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共价连接到肽聚糖大分子上，因此衔接双糖是一个重要的结构成分；由于人体中不存在鼠李糖分子，鼠李糖可作为研发新一代抗结核药物的重要靶标；对鼠李糖生物合成催化机理的深入研究将有助于建立一种筛选合成阻断剂的方法，以筛选抗结核新药。所选的靶酶RmlB、C和D酶为人体缺乏的酶，以后研发的抗结核新药将对人体无害，克服了抗菌药物也杀害正常细胞的缺点。
3.本发明利用结核杆菌生长过程中所必须的3个酶为药筛靶标，扩大了药物筛选的范围，如某化合物抑制其中任意一个或几个酶的活性，该化合物即可能是具有抑制结核杆菌生长的物质；因为所选的靶酶为结核分枝杆菌生存所必需的，保证了将来研发的抗结核新药具有高药效性。
4.本发明所建立的药筛模型可于酶标仪上酶标板内进行反应，药物用量少，速度快，是高通量的药筛模型。
附图说明
图1中A为分枝杆菌中dTDP-鼠李糖(dTDP-Rhamnose)的合成代谢途径示意图：RmlA，α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶；RmlB，dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱氢酶；RmlC，dTDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖3，5表异构酶；RmlD，dTDP-4-酮基-鼠李糖还原酶；Wbbl，鼠李糖基转移酶；B为分枝杆菌细胞壁的核心结构示意图，其中分枝菌酸(Mycolic acid)与聚阿拉伯糖(Arabinan)和聚半乳糖(Galactan)通过L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺衔接双糖(Linker)共价连接到肽聚糖(Peptidoglycan)上；C为结核分枝杆菌中分别编码RmlA、B、C和D酶蛋白的rmlA、B、C、D基因在基因组中的位置。
图2为NADPH减少法检测分枝杆菌中dTDP-葡萄糖转变成dTDP-鼠李糖的反应谱图；在体外模拟分枝杆菌中dTDP-葡萄糖(dTDP-Glc)在RmlB，RmlC，RmlD三种酶的催化下生成dTDP-鼠李糖(dTDP-Rhamnose)的反应过程，伴随着NADPH的减少，NADP的生成。反应体系中加入dTDP可抑制反应的进行。其中NADPH在340nm下有吸光值，OD340值的下降表明反应的发生。
具体实施方式
应用现代分子生物学技术从结核分枝杆菌基因组文库中克隆了rmlB，rmlC，rmlD基因，并在大肠杆菌中表达了结核分枝杆菌的RmlB，RmlC，RmlD酶蛋白，超声破碎细胞，离心，取上清液(因RmlD酶蛋白形成了包涵体，取沉淀，而后采用变性再复性的方法制备)，利用pET表达载体上的组氨酸标记，采用组氨酸-Ni+亲和层析技术纯化得到RmlB、RmlC、RmlD酶蛋白。测定得到的酶液中酶的浓度，建立了RmlB、C和D酶反应体系。
实施例1 rmlC基因的克隆
应用现代分子生物学技术，设计5’
CATATGAAAGCACGCGAACTCG3’、5’
CTCGAGGGTGCCGCGCATCTCCCC 3’基因片断为引物，从结核分枝杆菌基因组文库中利用PCR扩增rmlC基因，扩增产物连接到pMD18-T载体上，重组质粒转化Novablue并筛选鉴定，纯化rmlC基因片段，测序，rmlC与pET16b连接，连接产物rmlC-pET16b转化DH5α并鉴定，阳性质粒转化大肠杆菌BL21。
实施例2 rmlD基因的克隆
应用现代分子生物学技术，设计5’
CATATGGCGGGCAGGTCAGAAAGGC 3’、5’
CTCGAGTCAGTCACGCGTTGAGGGTAACCG 3’基因片断为引物，从结核分枝杆菌基因组文库中利用PCR扩增rmlD基因，扩增产物连接到pMD18-T载体上，重组质粒转化Novablue并筛选鉴定，纯化rmlD基因片段，测序，rmlD与pET16b连接，连接产物rmlD-pET16b转化DH5α并鉴定，阳性质粒转化大肠杆菌BL21。
实施例3 RmlC酶蛋白的诱导表达与分离纯化
取少量所得菌株(冷冻保存)pET16b-Tb rmlC in BL21(DE3)于3ml LB液体培养基内摇床培养，25℃，转速150rpm，过夜，OD值约为0.6～0.7时取出，从中再取少量接入200ml LB液体培养基内，培养至OD值约为0.6～0.7时加入0.1mM IPTG([PTG为异丙基-β-D硫代半乳糖苷)，继续培养3hr，取出，离心，弃上清，沉淀用1×Binding Buffer(8×＝40mM imidazole，4MNaCl，160mM Tris-HclpH7.9)重悬(加入1mM的PMSF)，超声破碎细胞，离心，取上清，利用pET表达载体上的组氨酸标记，采用组氨酸-Ni+亲和层析技术(在此亲和层析用的为Novagen公司的His Bind Kits试剂盒，是一较成熟的纯化带组氨酸标记酶蛋白的方法)纯化得到RmlC酶蛋白，用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度以及其分子量。RmlC酶蛋白分子量为22299.1Kda。
实施例4 RmlD酶蛋白的诱导表达与分离纯化
取少量所得菌株(冷冻保存)pET16b-Tb rmlD in BL21(DE3)于3ml LB液体培养基内摇床培养，37℃，转速150rpm，过夜，OD值约为0.6～0.7时取出，从中再取少量接入200ml LB液体培养基内，培养至OD值约为0.6～0.7时加入5mM IPTG，继续培养10hr，取出，离心，弃上清，沉淀用1×BindingBuffer(8×＝40mM imidazole，4M NaCl，160mM Tris-HclpH7.9)重悬(加入1mM的PMSF)，超声破碎细胞，离心，取沉淀，利用66％浓度乙酸溶出RmlD酶蛋白(形成包涵体)，而后用较低浓度的乙酸对其透析，最后利用pET表达载体上的组氨酸标记，采用组氨酸-Ni+亲和层析技术(在此亲和层析用的为Novagen公司的His Bind Kits试剂盒，是一较成熟的纯化带组氨酸标记酶蛋白的方法)纯化得到RmlD酶蛋白，用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度以及其分子量。RmlD酶蛋白分子量为32030.5Kda。
实施例5 一种高通量抗结核杆菌药物筛选模型—RmlB、C和D酶反应体系的建立
一种高通量抗结核杆菌药物筛选模型的建立方法，如表1，其中HEPES(pH7.6)为50mM，NADPH为1mM，MgCl2为100mM，dTDP为100mM，dTDP-Glc为10mM，RmlB酶蛋白为0.5mg/ml，RmlC酶蛋白为0.5mg/ml，RmlD酶蛋白为0.1mg/ml，总体积为50μl。反应在96孔酶标板上进行，在无振荡的情况下于室温下培育，以水调零，每隔10min在340nm处测定OD值，在有dTDP的体系里，OD值无明显变化，无dTDP的体系里，OD值变化较为明显(如图)，加入中药、藏药及天然产物的有效成分或组合化学产物后，在无dTDP的体系里，OD值无明显变化，则表明该化合物具有抑制RmlB、C、D催化dTDP-葡萄糖形成dTDP-鼠李糖的反应，因此此化合物有可能是以结核杆菌细胞壁为靶点的一种药物。
实施例6 一种高通量抗结核杆菌药物筛选模型—RmlB、C和D酶反应体系的建立
一种高通量抗结核杆菌药物筛选模型的建立方法，如表1，其中HEPES(pH7.6)为70mM，NADPH为5mM，MgCl2为300mM，dTDP为300mM，dTDP-Glc为30mM，RmlB酶蛋白为1mg/ml，RmlC酶蛋白为1.5mg/ml，RmlD酶蛋白为0.8mg/ml，总体积为50μl。反应在96孔酶标板上进行，在无振荡的情况下于室温下培育，以水调零，每隔10mim在340nm处测定OD值，在有dTDP的体系里，OD值无明显变化，无dTDP的体系里，OD值变化较为明显(如图)，如加入中药、藏药及天然产物的有效成分或组合化学产物后，在无dTDP的体系里，OD值无明显变化，则表明该化合物具有抑制RmlB、C、D催化dTDP-葡萄糖形成dTDP-鼠李糖的反应，因此此化合物有可能是以结核杆菌细胞壁为靶点的一种药物。
实施例7 一种高通量抗结核杆菌药物筛选模型—RmlB、C和D酶反应体系的建立
一种高通量抗结核杆菌药物筛选模型的建立方法，如表1，其中HEPES(pH7.6)为100mM，NADPH10mM，MgCl2为500mM，dTDP为500mM，dTDP-Glc为50mM，RmlB酶蛋白为2mg/ml，RmlC酶蛋白为2mg/ml，RmlD酶蛋白为1.5mg/ml，总体积为50μl。反应在96孔酶标板上进行，在无振荡的情况下于室温下培育，以水调零，每隔10min在340nm处测定OD值，在有dTDP的体系里，OD值无明显变化，无dTDP的体系里，OD值变化较为明显(如图)，如加入中药、藏药及天然产物的有效成分或组合化学产物后，在无dTDP的体系里，OD值无明显变化，则表明该化合物具有抑制RmlB、C、D催化dTDP-葡萄糖形成dTDP-鼠李糖的反应，因此此化合物有可能是以结核杆菌细胞壁为靶点的一种药物。
表1
| Reagent(concentration ofreagent) | no dTDPcontrol well | dTDPcontrol well | typical well with acompound to be screened |
| HEPES(50mM pH7.6) | 23μl | 23μl | 21μl |
| NADPH(1mM) | 10μl | 10μl | 10μl |
| MgCl2(100mM) | 1μl | 1μl | 1μl |
| RmlB | 5μl | 5μl | 5μl |
| RmlC | 2μl | 2μl | 2μl |
| RmlD | 4.5μl | 4.5μl | 4.5μl |
| dTDP(100mM)in DMSO | 0μl，just add2.5μl DMSO | 2.5μl | 0μl，just add 2.5μlDMSO |
| Compound to bescreened(in DMSO) | 0μl | 0μl | 2μl |
| dTDP-GLC(10mM) | 2μl | 2μl | 2μl |
| total | 50μl | 50μl | 50μl |
Claims (6)
1.一种高通量抗结核杆菌药物的筛选方法，其特征在于：在含有25～60mM HEPES、0.2～2mM NADPH、2～10mM Mg2+、0.4～2mM dTDP-Glc、0.05～0.2mg/mlRmlB酶蛋白、0.02～0.08mg/ml RmlC酶蛋白、0.01～0.15mg/mlRmlD酶蛋白的溶液中加入中药、藏药、天然产物的有效成分或组合化学产物，20～30℃培育，测定OD值，检测340nm下吸光值的变化，根据体系吸光值的变化，确定所加入物质是否是以结核杆菌细胞壁为靶点的药物。
2.按照权利要求1所述高通量抗结核杆菌药物的筛选方法，其特征在于：所述RmlC、RmlD酶蛋白是通过如下方法制得，将含有rmlC、rmlD基因利用pET表达系统转化在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，得到的pET16b-Tb rmlC-BL21(DE3)、pET16b-Tb rmlD-BL21(DE3)菌株在IPTG诱导下可表达出RmlC、RmlD酶蛋白。
3.按照权利要求2所述高通量抗结核杆菌药物的筛选方法，其特征在于：所述的rmlC、rmlD基因是利用基因工程的方法克隆获得，具体过程如下，从结核分枝杆菌基因组文库中利用PCR扩增rmlC、rmlD基因，扩增产物连接到pMD18-T载体上，重组质粒转化Novablue并筛选鉴定，纯化基因片段，测序，rmlC、rmlD与pET16b连接，连接产物转化DH5α并鉴定，阳性质粒转化大肠杆菌BL21。
4.按照权利要求3所述高通量抗结核杆菌药物的筛选方法，其特征在于：所述的rmlC引物为基因片断为5’CATATGAAAGCACGCGAACTCG3’、5’CTCGAGGGTGCCGCGCATCTCCCC3’；rmlD引物为基因片断为5’CATATGGCGGGCAGGTCAGAAAGGC3’、5’CTCGAGTCAGTCACGCGTTGAGGGTAACCG 3’。
5.按照权利要求2所述高通量抗结核杆菌药物的筛选方法，其特征在于：所述的RmlC酶在大肠杆菌中诱导表达的条件是：25～37℃，用IPTG0.1～2mM诱导表达2～6小时，超声破碎细胞，离心，取上清液，利用pET表达载体上的组氨酸标记，采用组氨酸-Ni+亲和层析技术纯化得到RmlC酶蛋白。
6.按照权利要求2所述高通量抗结核杆菌药物的筛选方法，其特征在于：所述的RmlD酶在大肠杆菌中诱导表达的条件是：25～37℃，用IPTG0.1～2mM诱导表达2～10小时，超声破碎细胞，离心，取沉淀，利用30-100％浓度乙酸溶出RmlD酶蛋白，而后用较低浓度的乙酸对其透析，最后利用pET表达载体上的组氨酸标记，采用组氨酸-Ni+亲和层析技术纯化得到RmlD酶蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03133615 CN1580276A (zh) | 2003-07-30 | 2003-07-30 | 一种高通量抗结核杆菌药物的筛选方法 |
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| CN 03133615 CN1580276A (zh) | 2003-07-30 | 2003-07-30 | 一种高通量抗结核杆菌药物的筛选方法 |
Publications (1)
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| CN1580276A true CN1580276A (zh) | 2005-02-16 |
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| CN (1) | CN1580276A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103983627A (zh) * | 2008-06-17 | 2014-08-13 | 韩国巴斯德研究所 | 作为抗结核病药的吡啶并嘧啶化合物 |
| CN101906461B (zh) * | 2009-06-03 | 2016-05-25 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物的方法 |
-
2003
- 2003-07-30 CN CN 03133615 patent/CN1580276A/zh active Pending
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| CN101906461B (zh) * | 2009-06-03 | 2016-05-25 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 筛选靶向结核杆菌细胞壁核心合成与组装的药物的方法 |
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