CN101493454A - 结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒及其制作方法和应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结核病和结核分枝杆菌感染者的诊断试剂盒及其制作方法和应用方法。是利用编码15个氨基酸(G4S1)3的linker，将结核分枝杆菌特异抗原Rv3875和Rv3874的编码基因(SEQ.ID.NO.6)串联起来后，插入大肠杆菌表达载体，并在大肠杆菌中实现了Rv3875和Rv3874融合蛋白的高效表达和纯化。该重组蛋白至少包含了8个可用于细胞免疫诊断的T细胞表位，并以该蛋白为基础结合人IFN－γ的酶联免疫分析技术，建立了全血IFN－γ释放分析方法的诊断试剂盒以及诊断方法，可以用于结核病和结核杆菌感染者的早期、特异性诊断和筛检。

Description

结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒及其制作方法和应用方法

技术领域

本发明涉及结核病病人和结核杆菌感染者的快速、早期和特异的检测方法，特别是一种结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒及其制作方法和应用方法。

背景技术

结核病是主要经呼吸道传播的、严重危害我国和全世界的重要传染病之一。据世界卫生组织估计，全世界有超过1/3的结核杆菌感染者，其中的10％在其一生中可以发展成为结核病病人。因此，筛检感染者在结核病的防治甚至最终的消灭中扮演中极其重要的作用[CDC.MMWR 44(1995)1-17.]。

现有的诊断技术对结核杆菌感染者的诊断非常难。近几十年来，临床上采用结核菌素试验(TST)来诊断结核杆菌感染者。但TST活性成份是纯蛋白衍生物(PPD)，该成份是一种混合物，且非结核分枝杆菌特异的。其检测结果可被现在临床上广泛使用的疫苗——卡介苗免疫所干扰[P.Andersen，et al.Lancet356(2000)1099-1104.]。从1921年发明卡介苗到现在为止，全世界已有35亿人接种卡介苗。因此TST对感染者的诊断价值受到很大的影响。

对结核病病人的诊断技术包括痰涂片抗酸染色或痰菌培养，阳性率仅40％-60％左右；肺部X射线检查肺部病理改变也仅在具有典型的临床症状后才能诊断；其他血清学诊断方法和分子诊断方法缺乏特异性，假阳性率高。因此，必须尽快研究结核病和结核杆菌感染者的早期、快速、特异和敏感的诊断方法。

发明内容

本发明是针对上述诊断方法的困难和不足之处，提出一种结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断方法，可实现对结核病病人和感染者早期、快速、特异的诊断，在阻断结核病的传播和流行，对结核病的控制具有重大意义。

本发明是基于以下原理来实现的。结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人体的免疫系统识别，激活机体的T细胞免疫应答，分泌产生IFN-γ，后者发挥抗结核感染作用。部分T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次与结核杆菌相遇后，会再次分泌产生IFN-γ，发挥抗结核感染作用。抗原特异的IFN-γ产生量与机体是否感染或发病密切相关。因此如果采用结核杆菌特异的抗原在体外刺激感染者和患者的T细胞，可诱导这些T细胞产生高水平的结核杆菌抗原特异的IFN-γ，而非结核杆菌感染者或非结核病患者产生的IFN-γ的量与未用抗原刺激产生的量相近，从而实现诊断的目的。

因此发现并寻找结核杆菌特异性抗原的鉴定对发展新一代的诊断试剂具有重要价值和意义。结核杆菌和卡介苗比较基因组学的研究揭示了卡介苗缺失了几个区(regions of difference，RD)，其中之一命名为RD1区[M.A.Behr，et al.Science 284(1999)1520-1523.]。进一步研究证实RD1区集中在结核杆菌复合体(人型结核杆菌、牛型结核杆菌)，而在世界各地的卡介苗菌株中全部缺失[P.Andersen，et al.Lancet 356(2000)1099-1104.M.A.Behr，et al.Vaccine 17(1999)915-922.]。大量的研究证实RD1区编码的抗原Rv3875，是结核杆菌培养过程中早期产生的分泌性蛋白质，相对分子质量6kDa，或24kDa，9.9kDa等，主要是由于该蛋白在自然情况下以多聚体形式存在。该蛋白能够刺激强的迟发性变态反应和诱导结核病人和他们的接触者的外周血产生高水平的IFN-γ[P.W.Roche，et al.Clin.Exp.Immunol.103(1996)226-232.P.W.Roche，et al.Scand.JImmunol..43(1996)662-670.M.J.Elhay，et al.Infect Immun.66(1998)3454-3456.R.M.Nakamura，et al.Int.J.Tuberc.Lung Dis.2(1998)541-46.]。进一步发现，能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答的表位分别是是位于该蛋白的以下肽段[H.M.Vordermeier，etal.Clin.diag.Lab.Immunol.，(3)2001，571-578]，即：

P.1-16............................................................MTEQQWNFAGIEAAAS

P.9-24............................................................AGIEAAASAIQGNVTS

P.17-32..........................................................AIQGNVTSIHSLLDEG

P.57-72..........................................................KWDATATELNNALQNL

P.80-95..........................................................GQAMASTEGNVTGMFA

RD1区编码的另外一个抗原Rv3874，也是结核杆菌培养过程中早期产生的分泌蛋白质，相对分子质量10kDa，也是一种强免疫原性蛋白。能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答的T细胞表位分别是位于该蛋白的以下肽段[H.M.Vordermeier，etal.Clin.diag.Lab.Immunol.，(3)2001，571-578]，即：

P1.1-18........................................................MAEMKTDAATLAQEAGNF

P2.13-28.......................................................QEAGNFERISGDLKTQ

P4.55-72.......................................................VVRFQEAANKQKQELDEI

P7.75-92........................................................NIRQAGVQYSRADEEQQQ

P8.85-100......................................................RADEEQQQALSSQMGF

因此，本发明所选用的抗原Rv3875和Rv3874具有结核病特异诊断的上述潜在的T细胞表位，并构成本发明抗原选择的依据。

首先由于这些蛋白的分子量较小，从结核杆菌的培养物中直接分离纯化较为困难；国外尽管采用合成肽的方法来解决上述困难，肽合成的成本非常高，由此建立的临床应用试剂盒的成本大大增加。最后，单独通过基因工程技术获得上述抗原的表位，由于体外和体内的差异，表达的产物如国内外已经报道的，也容易因为形成包涵体而失去蛋白质的活性。

为了克服这些困难和缺陷，本发明提出的重组蛋白，就是将已经公开的，已知的Rv3875和Rv3874(均来源于美国GenBanK数据库)的基因连接在一起，克隆入大肠杆菌表达载体进行工程化表达，然后进一步大规模纯化重组蛋白。可集中两种抗原的T细胞表位和免疫原性的优势，达到优势互补，为临床大规模生产应用奠定了基础。

尽管国内外已有研究报道用上述蛋白作为结核病患者的血清学诊断，但由于Rv3875和Rv3874蛋白含有大量上述的T细胞表位，主要刺激机体的细胞免疫应答，因而将上述蛋白作为抗原检测患者体内的产生的相应抗体实现诊断结核病的目的并未达到。本发明和这些研究报道有显著和本质的区别。在获得本发明提出的特异重组蛋白的基础之上，本发明进一步提出全血IFN-γ释放分析方法，该方法是通过分析结核杆菌抗原特异的细胞免疫应答而诊断结核病患者和结核病感染者，并建立了结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒。

本发明提出的试剂盒由两部分组成，一是结核杆菌特异抗原Rv3875-Rv3874融合蛋白，该蛋白的氨基酸序列特征为SEQ.ID.No.6，并且至少包含本发明题及的两种以上的T细胞表位，这些T细胞表位分别位于该蛋白氨基酸组成的第1位到第16位(P.1-16：MTEQQWNFAGIEAAAS)；第9位到第24位(P.9-24：AGIEAAASAIQGNVTS)；第17位到第32位(P.17-32：AIQGNVTSIHSLLDEG)；第52位到第72位(P.57-72：KWDATATELNNALQNL)；第80位到第95位(P.80-95：GQAMASTEGNVTGMFA)；第111位到第129位(P111-129：MAEMKTDAATLAQEAGNF)；第123位到第137位(P123-137：QEAGNFERISGDLKTQ)；第165位到第182位(P165-182：VVRFQEAANKQKQELDEI)；第185位到第202位(P185-202：NIRQAGVQYSRADEEQQQ)；第195位到第210位(P195-210：RADEEQQQALSSQMGF)。二是市场上广泛销售的双抗原夹心法人IFN-γELISA检测试剂盒(如国内深圳达科为生物技术公司，晶美生物技术公司等)。

在建立结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒的基础上，本发明进一步提出两步的检测方法。一是抗原特异的IFN-γ释放阶段：具体包括采集受试者的外周静脉血3ml，加入24孔板中的两个孔(1ml/孔)；在采血后6h之内，分别加入用稀释盐水溶液稀释到特定浓度的结核杆菌特异重组蛋白Rv3875-Rv3874(终浓度5-20微克/ml)，等体积的生理盐水(阴性对照)和PHA(终浓度5微克/ml，阳性对照)；混匀后，37度静止放置20-24h；收集培养上清中的血浆。二是抗原特异的IFN-γ检测阶段：具体的方法是按照市售的双抗原夹心法人IFN-γELISA检测试剂kit中的说明，检测上述血浆中IFN-γ的含量。

本发明提出的结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断具有以下优势：

诊断需要的时间短，较为快速，共需要时间1-2天。而结核杆菌培养诊断需时间1-2月，TST检测需要3天。

早期诊断。由于结核杆菌一旦感染人体，首先就会被机体的免疫系统所识别，激活体液和细胞免疫应答，发生时间在感染后1-2个月，因此利用我们的细胞免疫学检测方法即可作出诊断。X光片诊断只有在感染者肺部出现明显的病理改变后才可作出诊断，这通常需要很长的时间。抗原抗体检测法也只有在疾病症状处于活动期的情况下检测，但环境中分枝杆菌广泛存在，其与结核杆菌的共同抗原，可干扰实验的诊断结果。

特异诊断。由于采用的是结核杆菌特异性的抗原，只与结核杆菌感染人体后产生的免疫记忆T细胞起反应，因而产生的干扰素是结核杆菌抗原特异性的IFN-γ。

敏感性高。与TST检测相比，结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断的敏感性为100％，特异性高达83.3％，具有良好的诊断符合率(k＝0.70)。

因此，本发明提出结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒及其制备方法和应用方法，对结核病的控制和消灭具有重要意义。

附图说明

图1本发明的Rv3875-Rv3874的表达载体pPro610的结构示意图。

图2Rv3875-Rv3874在大肠杆菌中的高效表达和纯化的SDS-PAGE分析。其中M代表蛋白质分子量标准，1代表重组蛋白Rv3875-Rv3874的纯化，2-7代表杂蛋白的去除过程，8代表IPTG诱导前的工程菌裂解产物，9-10分别代表IPTG诱导后4h和6h的工程菌裂解产物。

图3本发明诊断方法rCE-WBIA与TST诊断的结果比较。rCE-WBIA诊断的敏感性为100％，特异性为89％。

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实施方法，通常是按照实验室技术常规或市场公开销售的试剂盒的说明书进行。

具体实施方式：

实施例1本发明的目的基因的扩增和表达载体的构建

(1)首先：设计引物扩增Rv3875和Rv3874

Rv3875上游：GCGGATCCATGACAGAGCAGCAGTG(SEQ.ID.NO.2)

说明：单下划线代表：BamHI酶切位点

Rv3875下游：

TGCGAACATCCCAGTGACGTTGCCTTC(SEQ.ID.NO.3)

说明：双下划线代表：linker基因序列

Rv3874上游：

ATGGCAGAGATGAAGACCGATG(SEQ.ID.NO.4)

说明：双下划线代表：linker基因序列

Rv3874下游：CCAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAG(SEQ.ID.NO.5)

说明：单下划线代表HindIII酶切位点

以结核杆菌标准毒株(H37Rv)基因组DNA为模板，用以上引物分别进行扩增CFP21和MPT64，PCR反应条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，60℃复性1分钟，72℃延伸45秒，30个循环；72℃延伸5分钟。PCR产物用纯化试剂盒纯化。

(2)扩增融合基因Rv3875-Rv3874和克隆入pProEXHTb质粒

利用基因拼接(GeneSOEing)方法，以Rv3875和Rv3874 PCR产物混合物为模板，用Rv3875的上游引物和Rv3874的下游引物进行扩增Rv3875-Rv3874融合基因(SEQ.ID.NO.1)，PCR反应条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，60℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。PCR产物用纯化试剂盒纯化。。PCR产物经纯化后，用BamHI和HindIII双酶切，克隆构建在质粒pProEXHTb中，建立表达载体pPro610。酶切鉴定pPro610，证实构建成功。表达载体pPro610的结构示意图见图1。

具体实施例2重组蛋白Rv3875-Rv3874(SEQ.ID.NO.6)在大肠杆菌中的高效表达

将构建好的表达载体pPro610转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行高效表达。其步骤为：活化菌体，移入1升LB培养基中摇2-3小时后，经IPTG(1mM)37℃诱导不同时间。离心收集菌体，加2×SDS加样缓冲液，沸水浴3分钟，表达产物经12.5％SDS-PAGE电泳检测证实。结果见图2。将该菌种保存于甘油中即为工程菌。

具体实施例3重组蛋白Rv3875-Rv3874的纯化

10000rpm离心10min收集诱导表达工程菌，分别将菌裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，结果上清中和沉淀中均有发现所需的重组蛋白，蛋白纯化的操作按照Ni-NTA纯化体系(Invitrogen，美国)说明书进行。简要概括步骤如下，50ml的菌液离心收集后重悬于8ml的盐酸胍裂解液(6M盐酸胍，20mM磷酸钠pH 7.8，500mM氯化钠)，冰浴超声破碎细菌后，于4℃进行3000rpm离心10min，上清加到用变性结合缓冲液(8M尿素，200mM PBS pH 7.8，500mM氯化钠)预处理的Ni-NTA树脂中。室温下孵育30min，结合柱用4ml的变性结合缓冲液(8M Urea，200mM PBS pH 7.8，500mM NaCl)洗两次，变性洗涤缓冲液(8M Urea，20mM PBS pH 6.0，500mM NaCl)洗两次，非变性洗涤缓冲液(20mM PBS，500mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0)洗四次，最后用8ml非变性洗脱缓冲液(20mM PBS，500mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0)洗脱。纯化过程中每步骤取上清10μl进行SDS-PAGE(12％)分析。将上清装入透析带中，分别用6M，4M，2M，1M，0.5M尿素洗液(每种尿素洗液中均含5mM Tris-Cl)各洗一次，最后用0M尿素(含Tris-Cl 0.6057g)洗两次，将透析液用真空冰冻干燥获得重组蛋白Rv3875-Rv3874冻干粉。-20℃储存备用。纯化过程及最终纯化的重组蛋白Rv3875-Rv3874的SDS-PAGE鉴定见图2。重组蛋白Rv3875-Rv3874的分子量为34kDa，纯度高达95％以上。定量采用BCA法，回收效率为150mg/L。

具体实施例4受检者外周血产生的Rv3875-Rv3874特异的IFN-γ的产生及其检测

采集数十例TST阴性和TST阳性的健康人群的新鲜肝素抗凝静脉血3ml。各取1ml全血置于24孔板中，1孔加重组蛋白Rv3875-Rv3874(5-20μg/ml)刺激。另外两孔为对照，分别加植物血凝素(PHA，5μg/ml)或生理盐水，混匀10min后，37℃孵育20-24h。每孔收集200μL血清，根据IFN-γ的ELISA检测试剂盒(如达科为公司或晶美公司等市售)的说明书进行血清中IFN-γ含量的检测。依据40例TST阴性人群用重组蛋白Rv3875-Rv3874刺激产生的血清IFN-γ的数值是250±100pg/ml(Mean±SD)，其均数的两倍数值确定为诊断标准(cut-off value)。可将76例受检人群分为四类(见图3)，即：TST阳性rCE-WBIA阳性(TST+rCE-WBIA+)者有8例；TST强阳性rCE-WBIA阳性(TST++rCE-WBIA+)者有8例；TST阴性rCE-WBIA阳性(TST-rCE-WBIA+)者有10例；TST阴性rCE-WBIA阴性(TST-rCE-WBIA-)者有50例。可见重组蛋白Rv3875-Rv3874可刺激受检人群外周血产生的IFN-γ分析技术(rCE-WBIA)诊断结核病感染者的敏感性为100％，特异性为83.3％，与TST诊断结果比较，显示良好的诊断一致性(k＝0.70)。因此，本发明提出的重组蛋白Rv3875-Rv3874及建立的新型全血IFN-γ释放分析诊断试剂盒和应用方法，必将在结核病和结核杆菌感染者诊断应用上具有重要意义。

此外，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动和技术修改，这些等价形式同样落于本申请的权利要求书所限定的范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>范雄林

<120>结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒及其制作方法和应用方法

<130>

<140>200810045220.0

<141>2008-01-21

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>633

<212>DNA

<213>编码rCE融合蛋白的核苷酸序列

<400>1

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccgcggcaagcgc aatccaggga     60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca   120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc   180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt   240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcaggtgg cggggaagc    300

ggcggtggcg gaagcggcgg tggcggcagc atggcagaga tgaagaccga tgccgctacc    360

ctcgcgcagg aggcaggtaa tttcgagcgg atctccggcg acctgaaaac ccagatcgac    420

caggtggagt cgacggcagg ttcgttgcag ggccagtggc gcggcgcggc ggggacggcc    480

gcccaggccg cggtggtgcg cttccaagaa gcagccaata agcagaagca ggaactcgac    540

gagatctcga cgaatattcg tcaggccggc gtccaatact cgagggccga cgaggagcag    600

cagcaggcgc tgtcctcgca aatgggcttc tga                                 633

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成序列(Artificial)

<400>2

gcggatccat gacagagcag cagtg                                           25

<210>3

<211>72

<212>DNA

<213>人工合成序列(Artificial)

<400>3

gctgccgcca ccgccgcttc cgccaccgcc gcttccaccg ccacctgcga acatcccagt    60

gacgttgcct tc                                                        72

<210>4

<211>67

<212>DNA

<213>人工合成序列(Artificial)

<400>4

ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc ggcggtggcg gcagcatggc agagatgaag    60

accgatg                                                              67

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成序列(Artificial)

<400>5

ccaagctttc agaagcccat ttgcgag                                        27

<210>6

<211>210

<212>PRT

<213>rCE融合蛋白的氨基酸序列

<400>6

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

1               5                   10                  15

Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly

            20                  25                  30

Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser

        35                  40                  45

Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu

    50                  55                  60

Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly

65                  70                  75                  80

Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Gly

                85                  90                  95

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala

            100                 105                 110

Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn Phe

        115                 120                 125

Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val Glu Ser

    130                 135                 140

Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala

145                 150                 155                 160

Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys

                165                 170                 175

Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln

            180                 185                 190

Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met

        195                 200                 205

Gly Phe

    210

Claims (9)

1、本发明涉及结核病和结核分枝杆菌感染者的诊断试剂盒及在结核病和结核杆菌感染者的早期、快速和特异性诊断的应用方法。

2、根据权利要求1所述的建立诊断试剂盒，其原理是利用结核杆菌特异的抗原，刺激受检者的外周血并产生IFN-γ，按照市售的双抗原夹心法人IFN-γELISA检测说明，检测IFN-γ的浓度。因为结核病病人和结核分枝杆菌感染者可产生高水平的IFN-γ，达到对结核病和结核分枝杆菌感染者的诊断目的。

3、根据权利要求2所述建立的诊断试剂盒，其组成的特征在于包括以下组份：

(1)根据权利要求4所述的结核杆菌的特异重组蛋白；

(2)双抗原夹心法人IFN-γELISA检测试剂kit(市售)

4、根据权利要求3所述的一种结核杆菌特异重组蛋白，其特征在于组成该特异重组蛋白的成份包括结核分枝杆菌抗原Rv3875和Rv3874，其核苷酸的序列特征为SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列特征为SEQ.ID.NO.6。

5、如权利要求4所述的抗原，用于机体的细胞免疫应答检测，至少包含以下两种以上的T细胞表位，这些表位在SEQ.ID.NO.6中的位置和特征如下：P.1-16：MTEQQWNFAGIEAAAS；P.9-24：AGIEAAASAIQGNVTS；P.17-32：AIQGNVTSIHSLLDEG；P.57-72：KWDATATELNNALQNL；P.80-95：GQAMASTEGNVTGMFA；P111-129：MAEMKTDAATLAQEAGNF；P123-137：QEAGNFERISGDLKTQ；P165-182：VVRFQEAANKQKQELDEI；P185-202：NIRQAGVQYSRADEEQQQ；P195-210：RADEEQQQALSSQMGF。

6、如权利要求4所述的抗原Rv3875和Rv3874来源的细菌菌种，仅限于结核分枝杆菌的不同型别(人型和牛型)及由这些型别衍生的细菌菌株，以实现结核杆菌特异抗原的目的。

7、如权利要求4所述的结核杆菌特异重组蛋白的构建表达和纯化方法，其特征在于具体步骤如下：首先重组蛋白编码基因通过PCR技术从权利要求3所述的细菌DNA中扩增获得；其次将重组蛋白的编码基因，克隆构建在原核表达质粒中，并将上述质粒转化工程宿主菌大肠杆菌；最后进一步从表达该蛋白的大肠杆菌工程菌中分离纯化该蛋白。

8、如权利要求4所述建立该重组蛋白的工程菌的PCR扩增引物序列包括SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5。

9、根据权利要求1所述的结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒的应用方法，其特征在于该应用方法包括以下两大阶段：一是抗原特异的IFN-γ释放阶段：包括采集的样本为受检者的外周静脉血；用权利要求4所述的特异重组蛋白刺激外周血细胞，37度培养箱静止培养20-24h；收集培养上清中的血浆。二是抗原特异的IFN-γ检测阶段：按照市售的双抗原夹心法人IFN-γELISA检测试剂kit中的说明，检测上述血浆中IFN-γ的含量。

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