CN107064498B

CN107064498B - 用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN107064498B
Application number: CN201710122036.0A
Authority: CN
Inventors: 曾谷城; 汪华
Original assignee: GUANGZHOU YIDAI PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd; National Sun Yat Sen University
Current assignee: GUANGZHOU YIDAI PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2019-03-22
Anticipated expiration: 2034-12-17
Also published as: CN107121546A; CN107121546B; WO2016095273A1; CN104597239A; CN104597239B; CN107102137A; CN107064498A

Abstract

本发明提供一种用于结核分枝杆菌感染检测的抗原刺激物、及含有该抗原刺激物的试剂盒，本发明还提供上述抗原刺激物在检测结核分枝杆菌感染的试剂中进行应用。所述抗原刺激物包含如序列表中序列1～11所示的多肽中的至少一种多肽或其类似物，这些多肽分别来源于结核特异性抗原多肽ESAT‑6和结核特异性抗原多肽CFP‑10。本发明所提供的抗原刺激物能够有效刺激结核感染患者的外周血T淋巴细胞产生IFN‑γ，从而能够高灵敏和高特异的诊断结核感染，并且不受BCG接种或者其他基础性疾病的影响。

Description

用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物、试剂盒及其应用

本申请为申请号201410790793.1、申请日2014.12.17、发明名称“用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物、试剂盒及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医学检验领域，具体涉及一种用于结核分枝杆菌感染检测的抗原刺激物及其应用、及含有该抗原刺激物的试剂盒。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的一类严重危害人类健康的传染病。虽然结核分枝杆菌最初感染人体的呼吸系统，但是它能扩散至人体几乎所有的器官并且导致相应的疾病发生。据估计，全球大约有1/3的人口感染了结核分枝杆菌，并且每年有800万新发感染病例，每年有200万人死于结核病。我国的结核疫情和结核分枝杆菌感染情况都相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二。

所述的结核分枝杆菌感染，通常是指患有活动性结核或潜伏性结核感染的人群，也可以是健康接触者。机体在感染结核分枝杆菌后，有少数发展为活动性结核，表现出相应的临床症状，如发热、咳嗽、咳痰、胸片异常等。大多数人感染后无相应的临床症状，但是机体无法清除全部的结核分枝杆菌，即为潜伏性结核感染。潜伏性结核感染者在免疫力低下等情况下可发展为活动性结核病。

结核病的早期诊断对于有效控制结核病的进展和结核分枝杆菌的传播具有重要意义。目前诊断结核感染的方法有限，主要包括结核分枝杆菌素皮肤实验(TST)、痰涂片、痰细菌培养、放射性X光片、血清学抗体抗原免疫检测以及PCR和核酸杂交法等。结核分枝杆菌感染引起的T细胞γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(interferon-gamma release assay，IGRA)是近年发展起来的新方法，可用于诊断活动性结核病和结核潜伏感染。已经得到美国FDA批准上市的T-SPOT.TB试剂盒(Oxford Immunotec Limited，Aingdon，United Kingdom)和QuantiFERON-TB Gold试剂盒都是基于IGRA原理，以RD1区基因编码的结核抗原特异性蛋白-6KD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和10KD培养滤过蛋白(CFP-10)为刺激源，通过检测外周血中结核特异性释放IFN-γ的T淋巴细胞来诊断结核感染，敏感度和特异性都较高。

目前诊断结核感染的传统方法存在较多缺点和不足，结核分枝杆菌素皮肤实验(TST)所使用的结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)中含有许多分枝杆菌种类(包括致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD诊断结核病的特异性差，不能准确区分PPD实验结果阳性究竟是因为BCG接种、接触环境中多种非结核分枝杆菌后的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染所致。痰涂片方法虽然简单易行，但是很大一部分结核病人痰里面并不一定有结核分枝杆菌(所谓的“痰阴”结核)。所以，痰涂片培养办法具有诊断阳性率低、易漏检、痰细菌培养周期长、培养成功率低(只有80％左右)等缺点。痰标本的核酸成分检测不仅面临“痰阴结核”的诊断困境而且程序复杂、容易出现假阳性。因此，免疫学技术就成了结核分枝杆菌感染诊断的重要方法。

T-SPOT.TB试剂盒和QuantiFERON-TB Gold试剂盒成份复杂、价格昂贵、成本极高，严重制约了其用于数以百万计的活动性结核患者以及数以亿计的结核潜伏感染人群进行大规模结核筛查与诊断。另外，这些试剂盒中包含的抗原肽极为复杂而且并非主要根据中国人的主要组织相容性抗原进行抗原肽的设计、筛查与验证，所以适用性与使用效果需要更进一步提升。公开号为CN 102516356 A的中国专利申请从抗原Rv3615c筛选出8-11个连续的多肽片段作为刺激源，采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)诊断结核感染，但是其灵敏度只有64％，远远达不到商品化试剂盒的要求。公开号为CN 102297968 A的中国专利申请采用的抗原刺激物是结核分枝杆菌ESAT-6抗原和CFP-10抗原的9条多肽的组合，并且使用了IFN-γ、TNF-α、IL-2、MIG和IP-10五种抗体包裹的磁珠，同时检测细胞培养上清的五种细胞因子，这就造成了其检测方法和结果分析的复杂性，并且需要使用流式细胞仪，增加了检测的成本，限制了其推广使用。公开号为CN 103604933 A的中国专利申请是基于TNF-α细胞因子ELISA检测活动性结核病的试剂盒，该试剂盒使用的抗原刺激物是ESAT-6和CFP-10整条蛋白，然而由于整条蛋白的空间构象可能会阻碍有效的抗原表位与T淋巴细胞表面的识别分子结合，并且其含有其他的抗原表位可能会产生负向调节，影响细胞因子的分泌，造成该试剂盒对潜伏感染结核的诊断效果较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于结核分枝杆菌感染检测的抗原刺激物、及含有该抗原刺激物的试剂盒。本发明所提供的抗原刺激物能够有效刺激结核感染患者的外周血T淋巴细胞产生IFN-γ，从而能够高灵敏和高特异的诊断结核感染，并且不受BCG接种或者其他基础性疾病的影响。

本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物，其包含如序列表中序列1～11所示的多肽中的至少一种多肽或其类似物。氨基酸序列如序列1～11所示的多肽，序列如下：

SEQ ID NO.1：AGIEAAASAIQGNVTSI

SEQ ID NO.2：YQGVQQKWDATATELNNALQNL

SEQ ID NO.3：RTISEAGQAMASTEGNVTGMFA

SEQ ID NO.4：MAEMKTDAATLAQEAGNF

SEQ ID NO.5：GAAGTAAQAAVVRFQEAA

SEQ ID NO.6：VVRFQEAANKQKQELDEI

SEQ ID NO.7：YQGVQQKWDATATELNNALQ

SEQ ID NO.8：ISEAGQAMASTEGNVTGMFA

SEQ ID NO.9：MAEMKTDAATLAQEA

SEQ ID NO.10：AAGTAAQAAVVRFQE

SEQ ID NO.11：VRFQEAANKQKQELD

其中，SEQ ID NO.1～3、及SEQ ID NO.7～8来源于结核特异性抗原多肽ESAT-6，SEQ ID NO.4～6及SEQ ID NO.9～11来源于结核特异性抗原多肽CFP-10。

优选的，所述抗原刺激物由序列表中序列1及序列7～8所示的多肽或其类似物组成；或者，所示抗原刺激物由序列表中序列9～11所示的多肽或其类似物组成。

最为优选的，所述抗原刺激物由序列表中序列1～3所示的多肽或其类似物组成；或者，所述抗原刺激物由序列表中序列4～6所示的多肽或其类似物组成。采用这种优选方式，其检测效果最佳，检测灵敏度最佳，对结核感染疑似标本的检测阳性符合率高达89％，阴性符合率高达100％。采用优选的抗原刺激物，对大范围志愿者的标本进行测试，可以有效避免其他非结核分枝杆菌导致的肺部感染对结果的干扰，从而有效识别结核分枝杆菌感染，因此具有高度的灵敏性与特异性。另外，我们的试剂盒阳性符合率(灵敏性与特异性)明显高过现有专利技术，现有的一些专利技术的灵敏度大致是60％左右(这样的灵敏度在临床上难正常使用)。另外，本专利试剂盒可以对大规模未知人群进行结核筛查，从实施例4(图5、图6)可以看出，可以从37个未知人中筛查出1个结核患者，排除肿瘤、其他肺部感染、流感等疾病的干扰，具有高度的特异性与灵敏性，从而可以适用于大规模人群普查，该特点对于在中国进行结核患者筛查显得尤为重要，且其诊断灵敏性与特异性显著优于现有专利技术。

所述类似物，是指其特性与所述多肽相同，包括其同样可以与抗体特异性地结合，这种同源肽通常具有至少70％的同源性，优选至少90％、95％的同源性。其不同一般来自于氨基酸残基的替换、插入、缺失和修饰，可发生在序列的N端、C端或其他任何位置上。

本发明所述的多肽可以通过现有的化学合成法合成，也可以通过本领域技术人员所掌握的基因工程技术制备得到，一种具有代表性的方法是用固相合成法制得上述多肽，其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复(缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC(叔丁氧羰基)保护的称为BOC固相合成法，α-氨基用FMOC(9-芴甲氧羰基)保护的称为FMOC固相合成法。

本发明提供的抗原刺激物可应用于结核分枝杆菌感染的检测，其基本检测原理是：通过本发明提供的抗原刺激物，刺激结核分枝杆菌宿主的T细胞，然后检测T细胞释放的细胞因子，以确定T细胞是否识别这些多肽或类似物，从而间接的反映宿主是否感染过结核分枝杆菌。

本发明提供的抗原刺激物可在制备用于检测结核分枝杆菌感染的试剂中进行应用。

本发明还提供一种用于检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，其包含如上文所述的抗原刺激物，及捕获抗体、检测抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)显色底物。

进一步的，所述捕获抗体为抗人IFN-γ的单克隆抗体，所述检测抗体为生物素标记的抗人IFN-γ的抗体。

试剂盒中还包括阳性对照刺激物和阴性对照试剂，阳性对照所选用的抗原对绝大多数个体的T细胞均能产生应答，如市售的PHA(植物血凝素)，阴性对照不加入抗原成分，选用培养基或其他缓冲液。

本发明另一方面提供一种体外检测结核分枝杆菌感染的方法，将前文所述的抗原刺激物和结核分枝杆菌宿主的T细胞相接触，通过检测T细胞分泌的细胞因子，确定T细胞是否识别所述抗原刺激物，从而间接的反映宿主是否感染过结核分枝杆菌。

所述宿主是指人或其他哺乳动物，所述其他哺乳动物如灵长类动物，牛、羊、猪、小鼠和大鼠等啮齿动物。

所述的T细胞通常在体内被来自结核分枝杆菌的抗原预先致敏，这些被抗原致敏的T细胞通常存在于宿主的外周血液中，也可存在于肺泡灌洗液、胸水、脑脊液、淋巴结或其他包含T细胞的组织部位。此T细胞可以是CD4⁺T细胞，也可以是CD8⁺T细胞。在所述方法中，可使T细胞在体外或在体内与肽(抗原刺激物)接触，并可在体外或体内确定T细胞是否识别肽。通常，通过测定T细胞在肽的存在下的状态变化或测定T细胞是否与肽结合，来确定T细胞是否识别该肽。T细胞的状态变化可以是T细胞开始分泌物质或分泌增加，如细胞因子，特别是IFN-γ、IL-2或TNF-α。优选测定IFN-γ的分泌。通常可通过使这些物质与特异性的结合作用物结合并检测该结合物与这些物质的复合体的存在，来检测所述的物质。特异性结合作用物一般是抗体，比如单克隆抗体或者多克隆抗体，一般可从市场购买或者使用标准技术制备。测定细胞因子的方法通常是领域内常用的方法，如ELISA(酶联免疫吸附试验)、ELISPOT(酶联免疫斑点试验)、Immunobloting(免疫印迹法)、细胞内细胞因子染色、T细胞增殖实验等。

本发明的一个实施方案中，采用ELISPOT方法来检测T细胞分泌IFN-γ。预先包被在固相载体上的IFN-γ单克隆抗体先与IFN-γ结合形成复合物，该复合物再与生物素标记的第二IFN-γ抗体结合，然后辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与生物素特异性结合，最后通过酶和底物的显色反应形成斑点，从而反映出被激活的T细胞数量。方法中所述T细胞可以是体外分离的，当然，也可以是未加工过的或者是体内的。在一个实施方案中，从外周血或其他样本中分离单核细胞，将包括T细胞和APC(抗原递呈细胞)，APC是一种能将肽递呈到T细胞的细胞。在一个实施方案中，将肽本身直接加入包含了T细胞和APC的实验中。在这样的试验中，APC可将肽递呈给T细胞。当使用被T细胞识别而无需由APC递呈的肽时，APC不是必需的。

肽与T细胞接触的时间长短可以根据用于测定肽识别的方法而变化。具有代表性的是，在各实验中加入10⁵～10⁷的外周血单核细胞(PBMC)，优选2.5×10⁵～10⁶。当将肽直接加入实验中时，其浓度是0.1～100μg/ml，优选1～10μg/ml。T细胞与肽一起孵育的典型时间是16～36小时。

本发明提供的抗原刺激物及含有这种特定抗原刺激物的试剂盒，可以有效地在体外检测结核分枝杆菌感染，而不受接种BCG(卡介苗)的影响，具有较高的敏感性和特异性，既适用于结核分枝杆菌感染临床诊断也适用于大规模人群的结核分枝杆菌感染筛查。本发明提供的试剂盒根据中国人主要组织相容性复合体设计、筛查验证结核分枝杆菌优势抗原多肽，在中国地区使用效果更理想，具有高特异性与高灵敏度，此外本发明与国外试剂盒相比，价格低廉，更适合于在中国及发展中国家推广。

本发明提供的IFN-γ-ELISPOT试剂盒在临床应用中，经检测55例结核分枝杆菌高度疑似感染者血液标本，诊断为结核分枝杆菌感染的病人41例，而经痰涂片、痰细菌培养、胸片以及临床症状被综合确诊为结核病的病人46例，其阳性符合率达89.1％；用本发明的IFN-γ-ELISPOT试剂盒诊断为非结核病的患者9例，经痰涂片、痰细菌培养、胸片结果以及临床症状诊断全部为阴性结果，其阴性符合率达到100％。本发明提供的试剂盒在结核诊断中的具有很好的临床适用性，且特异性好、灵敏性高，与其他诊断技术的符合率高。

附图说明

图1：为本发明IFN-γ-ELISPOT结核诊断试剂盒的优势多肽验证结果：(A)本试剂盒结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.1～3刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为123)；(B)本试剂盒结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.4～6刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为62)；(C)阴性对照(斑点数为0)；(D)阳性(PHA)对照(斑点数为801)；(E)是不加细胞的背景对照。

图2：为本发明IFN-γ-ELISPOT结核诊断试剂盒的优选多肽验证结果：图2中A为多肽抗原SEQID NO.1与SEQID NO.7～8联合刺激结果(斑点数为160)，B为本产品本试剂盒结核特异性多肽抗原肽SEQ IDNO.9～11刺激细胞后结果(斑点数为146)，C为阴性对照(斑点数为0)，D为阳性对照(PHA)刺激结果(斑点数为783)，E为不加细胞的背景对照(斑点数为0)。

图3：为一例结核疑似患者的本IFN-γ-ELISPOT试剂盒诊断结果：(A)阴性对照(斑点数为1)；(B)ESAT-6非免疫优势多肽刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为5)；(C)结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.1～3刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为22)；(D)本产品结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.4～6刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为19)；(E)PHA阳性对照刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为475)。

图4：所示为一例结核疑似患者的本IFN-γ-ELISPOT试剂盒多肽序列1、7～11的诊断结果。图4中(A)为阴性对照(斑点数为1)，图4(B)是ESAT-6非免疫优势多肽刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为4)，图4(C)是结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.1与SEQIDNO.7～8刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为38)，图4(D)是本产品结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.9～11刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为43)，图4(E)是PHA阳性对照刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为330)。

图5：为利用本发明IFN-γ-ELISPOT试剂盒对37个志愿者进行结核筛查的结果。

图6：为图5中红色框所显示为其中一例IFN-γ-ELISPOT结核检测提示为结核阳性的结果：(A)阴性对照(斑点数为1)；(B)ESAT-6非免疫优势多肽刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为6)；(C)结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.1～3刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为17)；(D)本产品结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.4～6刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为9)；(E)PHA阳性对照刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为466)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域的常规方法。实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市售常规生化试剂，实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1：结核特异性T细胞优势抗原表位多肽的制备及IFN-γ-ELISPOT结核分枝杆菌感染诊断试剂盒的开发

通过生物信息学分析，以及体外检测T细胞免疫反应来设计和筛选T细胞优势抗原表位，包括以下步骤：

(1)通过生物信息学技术及相应数据库如ProPred、MacVestor、Preotean等，对RD1区编码的蛋白ESAT-6和CFP-10的T细胞抗原表位进行预测，同时分析其与不同HLA分型之间的识别关系。

(2)结合生物学分析结果，以Overlap(重叠序列)方法设计并优选出9条ESAT-6多肽和11条CFP-10多肽，每一条多肽包含9～22个氨基酸。

(3)收集结核病人血液标本，每份2～5ml。结核病人入选标准为：有咳嗽、咳痰症状，胸片结果异常，痰涂片或痰细菌培养阳性，且接受结核治疗时间小于三周，HIV检测阴性。

(4)用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(PBMC)，PBMC经5～10mlPBS或PRMI1640洗涤2次后，重悬于含10％胎牛血清(FBS，Life公司)的RPMI1640培养基(Life公司)，并计算细胞数量。

(5)ELISPOT法检测T细胞接受刺激后释放的IFN-γ，具体步骤为：在带PVDF膜的96孔板(Millipore公司)上包被人IFN-γ单克隆抗体(ebioscience公司)过夜，RPMI1640+10％FBS封闭后每孔加入2.5×10⁵个细胞及多肽，阳性对照组加入植物血凝素(PHA)，阴性对照组加入培养基或用于溶解多肽的溶解试剂，另外一组不加细胞作为背景对照。培养箱中孵育22小时，洗板后依次加入生物素标记的抗人IFN-γ抗体，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物显色，在PVDF膜上形成肉眼可见的红色斑点。结果在ELISPOT读板机上读取。结果判定：斑点数≥10个，且大于2倍阴性对照孔斑点数判断为阳性结果；斑点数＜10个，或小于2倍阴性对照孔斑点数判断为阴性结果。

(6)结果分析：根据多肽对结核病人刺激反应后阳性结果的频率，最终筛选得到3条ESAT-6优势抗原表位多肽SEQ ID NO.1～3(其氨基酸序列可参见序列表中序列1～3)，2条ESAT-6优选抗原表位多肽SEQ ID NO.7～8(其氨基酸序列可参见序列表中序列7～8)，3条CFP-10优势抗原表位多肽SEQ ID NO.4～6(其氨基酸序列可参见序列表中序列4～6)，3条CFP-10优选抗原表位多肽SEQ ID NO.9～11(其氨基酸序列可参见序列表中序列9～11)。图1为多肽1～6筛查的一个典型的IFN-γ-ELISPOT结果。其中图1(A)为本试剂盒结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.1～3联合刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为123)，图1(B)为本试剂盒结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.4～6联合刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为62)，图1(C)为阴性对照(斑点数为0)，图1(D)为阳性(PHA)对照(斑点数为801)，图1(E)是不加细胞的背景对照。图2为序列1、7～11的多肽筛查的一个典型的IFN-γ-ELISPOT结果。图2A为多肽抗原肽SEQ ID NO.1与SEQID NO.7～8联合刺激结果(斑点数为160)，图2B为本产品本试剂盒结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.9～11联合刺激细胞后结果(斑点数为146)，图2C为阴性对照(斑点数为0)，图2D为阳性对照(PHA)刺激结果(斑点数为783)，图2E为不加细胞的背景对照(斑点数为0)。

实施例2：本发明所开发的IFN-γ-ELISPOT结核分枝杆菌感染诊断试剂盒，包含：

(1)、抗原刺激物，为实施例1中所筛选出的氨基酸序列如序列表中序列1-11所示的多肽中一种或者两种以上多肽的组合，也可以为这些多肽的类似物；

(2)、捕获抗体，为抗人IFN-γ的单克隆抗体，可购自ebioscience公司；

(3)、检测抗体，为生物素标记的抗人IFN-γ的抗体；

(4)、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；

(5)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)显色底物；

(6)、阳性对照刺激物，为植物血凝素(PHA)；

(7)、阴性对照物，为培养基(例如RPMI1640+10％FBS)或用于溶解多肽的溶解试剂(例如DMSO)。

实施例3：本发明的IFN-γ-ELISPOT试剂盒应用于结核分枝杆菌感染疑似患者的临床诊断

目的：检验本发明的IFN-γ-ELISPOT结核分枝杆菌感染诊断试剂盒在结核诊断中的临床适用性、特异性、灵敏性及与其他诊断技术的符合率。

(1)收集55例结核分枝杆菌高度疑似感染者血液标本，每份2～5ml。

(2)用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(PBMC)，PBMC经5～10mlPBS或PRMI1640洗涤2次后，重悬于含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基，并计算细胞数量。

(3)ELISPOT法检测T细胞接受刺激后释放的IFN-γ，具体步骤为：在带PVDF膜的96孔板上包被人IFN-γ单克隆抗体过夜，RPMI1640+10％FBS封闭后每孔加入2.5×10⁵个细胞及多肽SEQ ID1～3多肽(或者优选多肽组合，为SEQ ID NO.1多肽与SEQ ID NO.7～8多肽的组合)或多肽SEQ ID4～6(或者优选多肽SEQ ID NO.9～11的组合)，阳性对照组加入植物血凝素(PHA)，阴性对照组加入10％FBS/1640培养基或溶解多肽的溶解试剂DMSO，另外一组不加细胞作为背景对照。培养箱中孵育22小时，洗板后依次加入生物素标记的抗人IFN-γ抗体，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物显色，在PVDF膜上形成肉眼可见的红色斑点。结果在ELISPOT读板机上读取。结果判定：斑点数≥10个，且大于2倍阴性对照孔斑点数判断为阳性结果；斑点数＜10个，或小于2倍阴性对照孔斑点数判断为阴性结果。

(4)结果分析：55例疑似结核分枝杆菌感染患者中，经痰涂片、痰细菌培养、胸片以及临床症状被综合确诊为结核病的病人46例，用本发明的IFN-γ-ELISPOT试剂盒诊断为结核分枝杆菌感染的病人41例，因此阳性符合率为89.1％；用本IFN-γ-ELISPOT试剂盒诊断为非结核病的患者9例，经痰涂片、痰细菌培养、胸片结果以及临床症状诊断全部为阴性结果，因此阴性符合率达到100％。图3所示为一例结核疑似患者的本IFN-γ-ELISPOT试剂盒诊断结果(该检测结果其所用试剂盒含有的抗原刺激物为多肽SEQ ID NO.1～3、或多肽SEQID NO.4～6)。图3(A)为阴性对照(斑点数为1)，图3(B)是ESAT-6非免疫优势多肽刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为5)，图3(C)是结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.1～3联合刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为22)，图3(D)是本产品结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.4～6联合刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为19)，图3(E)是PHA阳性对照刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为475)。图4所示为一例结核疑似患者的优选IFN-γ-ELISPOT试剂盒的诊断结果(该检测结果其所用试剂盒含有的抗原刺激物为多肽SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.7～8组合而成、或多肽SEQ ID NO.9～11组合而成)。图4(A)为阴性对照(斑点数为1)，图4(B)是ESAT-6非免疫优势多肽刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为4)，图4(C)是结核特异性多肽SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.7～8联合刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为38)，图4(D)是本产品结核特异性多肽抗原肽SEQ IDNO.9～11联合刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为43)，图4(E)是PHA阳性对照刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为330)。

实施例4：本发明的IFN-γ-ELISPOT试剂盒在未知人群结核筛查中的适用性

目的：检验本发明IFN-γ-ELISPOT结核分枝杆菌感染诊断试剂盒(该实施例所用的试剂盒，其含有的抗原刺激物为多肽SEQ ID NO.1～3的组合、或多肽SEQ ID NO.4～6的组合)在大规模人群结核筛查中的适用性、特异性与灵敏性。

(1)收集37例HIV检测阴性的志愿者血液标本，每份2～3ml。这些人均接种过BCG疫苗。

(3)ELISPOT法检测T细胞接受刺激后释放的IFN-γ，具体步骤为：在带PVDF膜的96孔板上包被人IFN-γ单克隆抗体过夜，RPMI1640+10％FBS封闭后每孔加入2.5×10⁵个细胞及序列1～3多肽或序列4～6多肽，阳性对照组加入植物血凝素(PHA)，阴性对照组加入培养基或溶解多肽的溶解试剂，另外一组不加细胞作为背景对照。培养箱中孵育22小时，洗板后依次加入生物素标记的抗人IFN-γ抗体，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物显色，在PVDF膜上形成肉眼可见的红色斑点。结果在ELISPOT读板机上读取。结果判定：斑点数≥10个，且大于2倍阴性对照孔斑点数判断为阳性结果；斑点数＜10个，或小于2倍阴性对照孔斑点数判断为阴性结果。

(4)结果分析：图5是本IFN-γ-ELISPOT试剂盒应用于未知人群的结核检测部分结果，图5中红色框所显示为其中一例IFN-γ-ELISPOT结核检测提示为阳性的结果(可见图6)，其中图6(A)为阴性对照(斑点数为1)，图6(B)为ESAT-6非免疫优势多肽刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为6)，图6(C)为结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.1～3联合刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为17)，图6(D)为本产品结核特异性多肽抗原肽SEQ ID NO.4～6联合刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为9)，图6(E)为PHA阳性对照刺激细胞后的IFN-γ-ELISPOT结果(斑点数为466)，该结果提示该志愿者IFN-γ-ELISPOT结核检测阳性，也说明37例志愿者标本中有1例呈IFN-γ-ELISPOT结核检测阳性，后该志愿者经过进一步检测，证实为活动性结核分枝杆菌感染，说明本发明开发的IFN-γ-ELISPOT试剂盒可适用于大规模人群结核普查且不受BCG疫苗接种或其他基础性疾病等的影响。另外，对优选多肽序列7～11对类似的未知人群也进行了大规模的结核筛查实验，发现优选多肽序列7～11具有类似于多肽序列1～6对大规模人群进行结核筛查的特异性与灵敏性，在此不再赘述。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物，其特征在于，所述抗原刺激物由序列表中序列4～6所示的多肽组成。

2.权利要求1所述的抗原刺激物在制备用于检测结核分枝杆菌感染的试剂中的应用。

3.一种用于检测结核分枝杆菌感染的试剂盒，其特征在于，其包含如权利要求1所述的抗原刺激物，及捕获抗体、检测抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和3-氨基-9-乙基咔唑显色底物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体为抗人IFN-γ的单克隆抗体，所述检测抗体为生物素标记的抗人IFN-γ的抗体。