CN103525829B - 一种可用于结核感染诊断的结核分枝杆菌重组抗原的制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种编码结核分枝杆菌重组抗原的重组DNA、包含所述重组DNA的表达载体、所述重组DNA编码的结核分枝杆菌重组抗原，以及所述重组DNA和重组抗原的制备方法和用途。本发明还提供了包含所述重组抗原的试剂、组合物和试剂盒，它们能特异性地检测结核分枝杆菌感染。本方法不会发生交叉反应，可以用于检测结核分枝杆菌抗原特异性的血清IgG抗体，为其他试剂盒的开发提供一种方便、高灵敏度、准确性和稳定性的免疫检测方法，该方法使用仪器简单，技术操作相对容易掌握。

Description

一种可用于结核感染诊断的结核分枝杆菌重组抗原的制备

技术领域

本发明提供了一种结核分枝杆菌重组抗原及其制备方法，本发明还提供了一种结核分枝杆菌的诊断试剂盒，能特异性地检测结核分枝杆菌感染，涉及基因工程技术和免疫诊断技术。

背景技术

结核病目前依旧是21世纪严重危及人类健康的疾病,其中移民、HIV感染和耐药是21世纪全球结核病控制所面临的三大难题。据世界卫生组织（WHO）估计,目前全球已有20亿人感染结核分枝杆菌（MTB），平均每1秒钟就有1个新感染者出现,每年新发结核病人达800万～1000万，300万人死于结核病，是死亡率最高的感染性疾病。全世界95％以上的结核病人在发展中国家，我国是全球结核病负担最严重的22个国家之一，新发病例占全球的16％，结核病患者的人数居世界第二位，有近半数人口（5.5亿）感染结核菌，包括活动性结核病人450万人，占全球病人总数的1/4，每年13万人死于结核感染。近些年来，虽然我国在结核防治方面取得了一定的成绩，但目前我国传染性肺结核的患病率仍居高不下，因此，我国已将结核病列为重点控制的重大疾病之一。

提高结核感染的诊断方法，对于防控结核病，具有重要意义。目前针对结核感染的传统诊断方法，主要包括抗酸染色法、分离培养法、结核的血清学诊断、结核菌素的皮肤接种实验以及结核抗原诱导的干扰素释放实验等。其中，抗酸染色法主要根据结核分枝杆菌的细胞壁中具有大量的脂质成份，容易被石炭酸复红染液染成红色，该染色虽然具有一定的特异性，但敏感性较差，据统计，40～60%的肺结核患者以及75%的肺外结核患者，其结核分枝杆菌的抗酸染色结果显示为假阴性，因此很难满足临床要求。结核菌的分离培养法是将痰液、支气管灌洗液、胸腹腔积液等在特定的培养基（如改良罗式培养基）中培养，可以较为特异性地鉴别结核分枝杆菌，但该方法耗时较长，一般需4～8周的时间，往往会造成病情的延误，此外，该方法无法用于检测菌阴性肺结核，因此使用起来也具有很大局限性。结核菌素皮肤试验（PPD），其基本原理是通检测感染者对结核菌素皮内接种所引起的迟发型变态反应（IV型超敏反应），反应越强，表示结核感染可能性越大，但由于PPD中含有许多分枝杆菌（包括致病性分枝杆菌、环境中非致病性分枝杆菌和卡介苗）共同的抗原，PPD皮试阳性并不能鉴别是因为结核分枝杆菌复合群感染，还是接触环境中非结核分枝杆菌或卡介苗接种后造成的致敏。因此，PPD皮试诊断结核病的特异性差，用该方法进行结核病流行病学抽样调查获得的结核菌感染率是不准确的，并不能真正反映人群中结核菌感染的实际状况。

结核感染的血清学检测是通过测定结核抗原特异性的IgG、IgM及IgA抗体发展起来的免疫学诊断方法，该方法简便易行，快速又无需特殊精密仪器，不但可以用于诊断肺结核，也可用于肺外结核感染的诊断，对于结核感染的初筛及鉴定具有重要意义。但是目前，结核血清学检测技术中存在的主要问题是如何结核特异性抗原的选择和使用，目前常用的抗原成份主要包括LAM抗原、A60、38kD、14KD、TBGL抗原、Ag85、早期分泌抗原ESAT6和组织培养离析蛋白CFP‐10等；但是，在结核血清学诊断过程中，使用上述单一抗原成份所取得的检测结果并不理想，使用多种“鸡尾酒”抗原诊断，则有助于提高结核血清学诊断的特异性和敏感性；此外，选择结核分枝杆菌特异性的抗原成份，以排除环境中非致病性分枝杆菌和卡介苗交叉抗原的污染，也有利用于进一步提高血清学诊断的敏感性和特异性。结核特异性抗原诱导的干扰素释放实验（IGRA），是国际上近年来发展起来的针对结核菌特异性的T淋巴细胞的一种检测手段，主要的原理是通过体外分离PBMC，经结核分枝杆菌特异性抗原刺激，通过检测淋巴细胞释放IFN‐γ　的水平，从而判定机体是否受到结核分枝杆菌的感染，该方法对于菌阴性结核、肺外结核以及隐性结核的感染，具有重要的诊断意义。目前国际上新发展起来的结核杆菌感染的体外筛选技术，主要使用了这一技术原理。其中分别包括来自英国的T.SPOT.TB系统和来自于澳大利亚的QuaitiFERON‐TBGold系统，两种技术主要使用了两种结核相关抗原，ESAT6抗原和CFP‐10抗原，其检测敏感性分别为88%和76%，以上述两种抗原为基础发展结核的体外诊断技术，虽然具有较好的应用前景，但如需进一步提高结核感染的诊断效率，还依赖于获得新的、更为特异性的结核分枝杆菌的抗原成份。

ESPC抗原，是一种结核分枝杆菌产生的特异性分泌抗原成份，与ESAT6抗原和CFP‐10抗原相类似，ESPC抗原也是受RD1基因区调控的；ESPC抗原具有多个重要的抗原表位，可以被CD4+及CD8+T淋巴细胞所识别，与其他的结核分枝杆菌抗原相比，ESPC抗原的抗原特异性表现的更强，研究发现，ESPC抗原与卡介苗BCG抗原无明显的共同抗原成份。ESPC抗原是一种免疫优势抗原，无论是对于活动性肺结核，还是隐性肺结核，在ESPC抗原的刺激下，机体所产生的结核特异性CD4+T淋巴细胞都可以大量分泌干扰素及白细胞介素2，从而诱导机体产生免疫保护；因此，以ESPC抗原为基础，可以开展出用于诊断结核感染的检测试剂盒。如将ESPC抗原与其他结核特异性抗原配合使用，可以显著提高结核感染的诊断效率，提高其检测的敏感性和特异性。

发明内容

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌重组蛋白，本发明的另一目的是提供该结核分技杆菌重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种编码结核分技杆菌重组蛋白ESPC的重组DNA,其DNA序列如图1或SEQIDNO.1所示，其所编码的结核分枝杆菌重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明提供了一种结核分枝杆菌的重组蛋白表达载体，其含有图1或SEQIDNO.1所示的重组DNA。

本发明提供了一种结核分枝杆菌的重组蛋白表达载体pET‐32a‐ESPC，其结构如图2所示，该表达载体的建立是通过将图1所示的ESPC的重组DNA克隆到pET32a表达载体中制备而成。

本发明建立了一种用于制备ESPC抗原的方法，通过将表达载体pET‐32a‐ESPC转化受体菌BL‐21(DE3)，通过IPTG诱导，经金属螯合层析及凝胶过滤层析分离，可制备出ESPC重组抗原。

本发明还提供包含有ESPC抗原的组合物或检测试剂盒，所述组合物或检测试剂盒可用于结核感染的检测。

本发明具体技术方案如下：

（1）ESPC基因的获取：根据GeneBank登陆的人结核分枝杆菌H37Rv基因组序列(GI:448814763)为模板，设计并合成针对ESPC基因的特异性引物，用于扩增ESPC基因片段；其中，引物P1（SEQIDNO.3）和P2（SEQIDNO.4）分别带有EcoI和HindIII的酶切位点，其序列如下：

引物P1：GGAATTCCATATGACGGAAAACTTGACCGTCCAG

EcoI

引物P2：CCCAAGCTTTCAGGTAAACAACCCGTCGATAGC

HindIII

PCR反应的总体系为50ul，体系如下：10×PCR扩增缓冲液10ul，4种dNTP混合物各200umol/L，引物各100pmol，模板DNA1ug，TaqDNA聚合酶2.5u，Mg2+1mmol/L；反应条件为，95℃预变性5分钟后，再按下列参数进行PCR扩增反应，具体条件为:94℃45sec,55℃45sec,72℃90sec,共进行30个循环，最后一个循环结束后继续在72℃延伸10min，利用1%的琼脂糖凝对其进行分析鉴定。

（2）表达载体的构建：以上述反应条件为基础，扩增ESPC基因，将扩增产物用凝胶回收试剂盒回收(Qiagen公司生产)，将ESPC基因用EcoI及HindIII酶进行切割，后插入到原核表达载体pET32a的相应位点中，制备出重组表达质粒pET‐32a‐ESPC,该载体携带有ESPC基因与trxA基因的融合序列；

（3）ESPC重组抗原的表达：将重组表达质粒pET‐32a‐ESPC转入受体菌BL21(DE3)中，在2YT培养基中，在37℃中摇瓶中以110rpm的速度连续震荡培养至OD600达到1.5,加入1mMIPTG继续培养4h，离心收集细菌，用含有20mMHepes的pH7.5TBS缓冲液洗涤后，再用超声波破碎细菌，5000rpm离心10分钟，收集菌体蛋白悬液；

（4）ESPC重组抗原的纯化：利用Qiagen公司生产的Ni–NTA固定化金属螯合层柱，按照产品说明书要求，采用亲和层析法，分离ESPC重组抗原；得到的纯化蛋白经Millipore的蛋白超滤系统超滤浓缩后，再用GE公司生产的AKTA蛋白层析系统，经SephacrylS‐100柱层析进行蛋白的再次分离纯化，收集目标蛋白。

（5）ESPC重组抗原的鉴定：利用Pierce公司生产的BCA(BicinChoninicAcid)试剂盒，通过570nm分光光度仪对其进行测定，鉴定蛋白浓度；利用聚丙烯酰胺凝胶电脉技术及Westernblotting技术，对制备出的ESPC重组蛋白进行纯度鉴定及特异性鉴定；

（6）结核细胞免疫功能的检测：以ESPC重组蛋白为目标抗原，通过抗原诱导的T细胞激活及干扰素的产生，对待测结核血液标本进行分析测定，具体的方法参见实施例1；

（7）结核血清抗体的检测：以ESPC重组蛋白为目标抗原，通过直接包被ELISA板，可以特异性地检测结核分枝杆菌感染者血清IgG抗体，用于进行结核感染的血清学检测，具体的方法参见实施例2；

以上检测操作方法与现有的技术操作基本相同，本发明具有以下优点：

1、提供的ESPC抗原为结核特异性抗原，该抗原成份与卡介菌BCG不具备共同抗原成份，因此不会发生交叉反应；

2、重组ESPC抗原具有多个T细胞免疫的识别表位，可以诱导抗原特异性T淋巴细胞的活化，从而判定结核的感染，特别是针对结核的隐性感染；

3、制备的重组ESPC抗原为一种融合蛋白，含有ESPC优势抗原序列及Trx.Tag、His.Tag两种纯化标签，便用对表达产物进行纯化鉴定；

4、重组ESPC抗原具有多个体液免疫反应的识别位点，可以用于检测结核分枝杆菌抗原特异性的血清IgG抗体，本方法的建立可以为其他试剂盒的开发提供一种方便、高灵敏度、准确性和稳定性的免疫检测方法，该方法使用仪器简单，技术操作相对容易掌握。

SEQIDNO.1、ESPC基因的核苷酸序列：

ATGACGGAAAACTTGACCGTCCAGCCCGAGCGTCTCGGTGTACTGGCGTCGCACCATGACAACGCGGCGGTCGATGCCTCCTCGGGCGTCGAAGCTGCCGCTGGCCTAGGCGAATCTGTGGCGATCACTCACGGTCCGTACTGCTCACAGTTCAACGACACGTTAAATGTGTACTTGACTGCCCACAATGCCCTGGGCTCGTCCTTGCATACGGCCGGTGTCGATCTCGCCAAAAGTCTTCGAATTGCGGCGAAGATATATAGCGAGGCCGACGAAGCGTGGCGCAAGGCTATCGACGGGTTGTTTACCTGASEQIDNO.2、ESPC氨基酸序列：

MTENLTVQPERLGVLASHHDNAAVDASSGVEAAAGLGESVAITHGPYCSQFNDTLNVYLTAHNALGSSLHTAGVDLAKSLRIAAKIYSEADEAWRKAIDGLFT

SEQIDNO3、ESPCPCR扩增引物序列：

引物P1：GGAATTCCATATGACGGAAAACTTGACCGTCCAG

SEQIDNO4、ESPCPCR扩增引物序列：

引物P2：CCCAAGCTTTCAGGTAAACAACCCGTCGATAGC

附图说明

图1是EspC基因的核苷酸序列；

图2是重组EspC基因表达载体的构建策略模式图，其方法是，通过将图1所示的EspC基因序列，插入到原核表达载体pET32a的EcoRI和HindIII酶切位点，使之与TrxA基因进行融合表达；

图3是pET32a‐EspC基因的表达产物，经金属螯合层析纯化后，利用SDS‐PAGE对其进行纯度鉴定，图中泳道1为蛋白Marker，泳道2为经分离纯化后的ESPC重组蛋白。

图4是利用纯化得到的ESPC重组蛋白，按实施例1的技术方法，诱导结核抗原特异性的T淋巴细胞增殖，通过检测T细胞活化过程中的II型干扰素的释放水平，进行结核感染的检测。图中左边部份(TBcase)为结核患者外周血T淋巴细胞在有/无ESPC抗原刺激的条件下，II型干扰素的释放水平，图中右边部份为健康对照个体(healthycontrol)外周血T淋巴细胞在有/无ESPC抗原刺激的条件下，II型干扰素的释放水平，图中P<0.01代表样本间具有明显的统计学差异，NS代表差异无统计学意义；

图5是利用纯化得到的ESPC重组蛋白，通过间接ELISA技术，检测结核抗原特异性IgG抗体水平，图中的左边部份代表健康的正常个体(Control)，图中的右边部份代表结核感染者(Case)。

具体实施方式

实施例1：利用ESPC重组抗原建立结核感染的细胞免疫功能检测方法

（1）所需试剂如下：

淋巴细胞分离液：比重是1.077的聚蔗糖‐泛影葡胺预混液；

IFN‐γ检测抗体：包括鼠抗人IFN‐γ包被抗体及HRP标记的鼠抗人IFN‐γ检测抗体；

IFN‐γ标准蛋白：重组人IFN‐γ重组蛋白；

培养基：RPMI1640培养基含双抗及10%胎牛血清；

显色剂：TMB显色液；

终止液：1N的H₂SO₄溶液；

（2）操作方法：

首先分离外周血单个核细胞，在试管中加入适量淋巴细胞分离液(聚蔗糖‐泛影葡胺预混液，分层液比重是1.077)，取待检肝素抗凝静脉血液标本2ml，缓慢加入到淋巴细胞分离液液面上层，保持界面的完整性，水平离心2000rpm×20分钟，吸取并收集单个核细胞(PBMC)，重悬于RPMI1640培养基中，经2000rpmX5min离心后，进行细胞计数，后按10^6细胞/ml重悬于RPMI1640培养基中，用于后续测定。

针对每一个待检血液样本，在96孔细胞培养板中加，分别设立一个对照孔及实验孔，并向其中加入100ul的细胞悬液；在实验孔中，加入100ulESPC(10ug/ml)的重组抗原，在对照孔中加入等体积(100ul)的RPMI1640培养基，在37℃的培养箱中培养48小时，取细胞培养上清，用于后续检测实验。

取待检细胞培养基样品50ul，加入已包被有针对IFN‐γ抗体的酶标板中，室温孵育2小时，每块板中设有IFN‐γ标准品对照和空白对照，弃去板中的液体，用洗液洗板5次，加入生物素标记的抗IFN‐γ的抗体，室温孵育1小时后，再加入HRP标记的亲和素，室温孵育30分钟后，加入显色剂100ul，避光保存15分种后，加1N的H₂SO₄终止液50ul，用450nm波长的酶标仪测读OD值，判定实验结果。

实验结果的判定，主要是通过计算在有/无结核抗原刺激的条件下，同一细胞样本OD值的变化规律，其中，在结核抗原刺激下，细胞样本中IFN‐γ的含量超过100ug/ml为阳性结果；反应特异性的判定，主要通过测定无结核抗原刺激的样本中IFN‐γ的含量，应为50ug/ml以下，否则，判定该检测反应不具有特异性，需重新测定。

（3）敏感性及特异性检测：

用所建立的针对结核感染的细胞免疫学检测方法，分别对50例开放性结核患者血液样本(来自南京市胸科医院)，及50例正常健康对照个体(结核菌素实验结果阴性)进行测定，结果发现，50例结核患者外周血T淋巴细胞，在ESPC抗原的刺激下，可产生IFN‐γ的平均水平为385pg/ml，显著高于无ESPC抗原刺激的T淋巴细胞培养对照(38.6pg/ml)；相比之下，正常健康对照个体来源的外周血T淋巴细胞，在有/无ESPC抗原刺激的条件下，IFN‐γ的产生水平均处于较低水平(分别为41.5pg/ml和36.7pg/ml)，说明ESPC抗原刺激无法诱导正常健康个体的外周血T淋巴细胞产生大量IFN‐γ。通过单因素方差分析法，利用SPSS10.0统计学软件对其进行统计分析发现，上述实验结果在各组间比较均具有明显的统计学差异,P<0.01。所得结果如图4所示，以ESPC抗原进行结核细胞免疫功能检测的敏感性为71.5%，特异性为92.8%。

实施例2：利用ESPC重组抗原建立结核感染的血清学检测方法

（1）所需试剂如下：

样本稀释液：0.01MPBS,pH7.4

洗涤缓冲液：含有0.01MPBS及0.05%Tween20,pH7.4

封闭液：0.01MPBS缓冲液中含1%牛血清白蛋白BSA，PH7.4

酶标抗体：HRP标记的兔抗人IgG抗体，1：10000稀释

底物缓冲液：单组份TMB显色液，含有10ug/ml四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB)

终止液：1NH₂SO₄

（2）操作方法：

在96孔ELISA板中加入经样本稀释液稀释的100ul的ESPC抗原溶液(1ug/ml)，4℃包被过夜，培养板经洗涤缓冲液冲洗5次后，加入1%的牛血清白蛋白(BSA)封闭液封闭2小时，待检结核血浆/或血清标本按1:200的比例用PBS样本稀释液稀释，后加入至ELISA板中，采用洗涤缓冲液洗涤三次，加入1：10000稀释的HRP标记的兔抗人IgG酶标抗体，室温孵育1小时，再经洗涤缓冲液洗涤5次后，加入100μL的底物缓冲液，继续培养15分种后，用终止液终止反应，利用分光光度仪进行样本的OD值测定，在450nm波长范围内进行读数分析及结果判定。

结果的判定：在ELISA检测仪上，于450nm处以空白对照孔调零后测各孔OD值，以待测血清OD值/阴性对照OD值的均值>2.1作为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为该血清样品的抗体滴度。

重复性检测：以本发现所建立的ELISA反应，分别检测结核感染阳性和阴性的血清标本各一份，分别同时测定5孔，计算其批内变异系数；在不同时间点先后5次测定同一份血清标本，计算其批间差异；当批内及批间差异小于10%时，说明所建立的ELISA方法稳定性达到要求。

（3）检测结果：

1、敏感性与特异性鉴定：使用本发明制备的ESPC结核重组抗原，采用间接ELISA法，对98例已确诊的结核患者血清进行分析鉴定，同时，通过对102份正常健康个体的血清标本的分析测试，鉴定该方法在结核血清抗体检测中的敏感性和特异性。结果显示，本发明所建立的检测方法具有较好的稳定性，批内及批间差异均小于10%;利用该方法对血清样本的检测发现，得到的两组数据通过单因素方差分析法，利用SPSS10.0统计学软件对其进行统计分析发现，上述实验结果在各组间比较均具有明显的统计学差异,P<0.01。利用ESPC抗原进行结核血清抗体检测的敏感性为75.5%，特异性为84.3%（统计学结果见附图5）；其中，少部份正常健康对照个体出现阳性结果的可能性在于，这部份感染者可能曾经受到过结核菌的一过性感染，由于机体免疫功能的作用，结核菌在感染后自行消失，从未表现出临床症状。

Claims (1)

1.一种结核分枝杆菌重组抗原ESPC用于制备检测结核分枝杆菌感染的试剂的用途，其特征在于，所述试剂进行结核细胞免疫功能检测的敏感性为71.5％，特异性为92.8％；所述试剂进行结核血清抗体检测的敏感性为75.5％，特异性为84.3％；所述结核分枝杆菌重组抗原ESPC通过如下方法制备得到：

(1)ESPC基因的获取：以结核分枝杆菌H37Rv基因组序列为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，引物P1和P2分别带有EcoI和HindIII的酶切位点其序列如下所示：

引物P1：GGAATTCCATATGACGGAAAACTTGACCGTCCAG

引物P2：CCCAAGCTTTCAGGTAAACAACCCGTCGATAGC

所述pcr反应扩增条件为：95℃预变性5分钟后，94℃45sec,55℃45sec,72℃90sec,共进行30个循环，最后一个循环结束后继续在72℃延伸10min；

(2)表达载体的构建：所述表达载体是pET-32a-ESPC，其通过将步骤(1)获取的ESPC基因克隆到pET32a表达载体的EcoI和HindIII酶切位点而成；

(3)ESPC重组抗原的表达、纯化：将重组表达载体pET-32a-ESPC转化大肠杆菌BL-21(DE3)，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导培养，经金属螯合层析及凝胶过滤层析纯化而制备获得ESPC重组抗原；所述诱导培养条件为：在2YT培养基中，37℃摇瓶中以110rpm的速度连续震荡培养至OD600达到1.5,加入1mMIPTG继续培养4h；所述纯化条件为：利用Qiagen公司生产的Ni–NTA固定化金属螯合层柱，按照产品说明书要求，采用亲和层析法，分离ESPC重组抗原；得到的纯化蛋白经Millipore的蛋白超滤系统超滤浓缩后，再用GE公司生产的AKTA蛋白层析系统，经SephacrylS‐100柱层析进行蛋白的再次分离纯化，收集目标蛋白。