CN103323585B

CN103323585B - 一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN103323585B
Application number: CN201310224728.8A
Authority: CN
Inventors: 陈善真; 李其昌; 卢迈新; 石和荣; 贾爱卿; 可小丽; 罗均; 李庆勇; 刘志刚; 李中圣; 陈克宏; 田珂; 刘小琴
Original assignee: GUANGDONG HAID ANIMAL HUSBANDRY VETERINARY RESEARCH INSTITUTE Co Ltd; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: GUANGDONG HAID ANIMAL HUSBANDRY VETERINARY RESEARCH INSTITUTE Co Ltd; Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2013-06-06
Filing date: 2013-06-06
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2033-06-06
Also published as: CN103323585A

Abstract

本发明公开了一种用于检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法。所述ELISA试剂盒包括包被抗原、兔抗鱼IgM二抗、HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液；所述包被抗原为鱼类无乳链球菌全菌蛋白或无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白，其中ScpB蛋白片段序列为与SEQ ID NO:1至少80%同源的序列；通过鱼特异性IgM的制备、兔抗鱼IgM抗体的制备、抗原的制备、试剂盒组装等步骤制备而成。本发明所述的检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒，用于检测鱼类无乳链球菌IgM抗体，具有高特异性。

Description

一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于动物疫病血清学诊断技术领域，具体涉及一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法。

背景技术

从30年代开始，人们就应用血清学方法诊断细菌性和病毒性鱼病，对鱼病早期诊断起到了很大的作用。近十多年来，由于人、兽医诊断新技术的渗透，细菌学、病毒学和组织病理学的诊断方法正逐步被快速、准确的血清学诊断技术所取代。目前常采用的主要方法有：血清中和试验、酶联免疫吸附试验、凝集反应、沉淀反应（琼脂扩散、免疫对流电泳等）、补体参与的反应、免疫标记检测方法(免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫测定法)以及免疫电镜等。此外花环试验、移动抑制试验、巨噬细胞吞噬功能试验等体外细胞免疫测定法也曾用来进行鱼类免疫学诊断。

随着现代免疫学、分子生物学的发展，酶联免疫吸附技术（ELISA）在水产方面也得到应用。ELISA是一种应用非常广泛的血清学检测方法，其需要的血清量少，非常适用于鱼类血清抗体水平检测。大量的试验结果表明该方法操作简便、快速、特异性和灵敏性强，并且可以通过目测判定试验结果，该方法在我国各级兽医检测部门已应用多年，适宜于大规模检测，可在基层推广使用。Shelby等2001年首次将这一方法应用于检测海豚链球菌疫苗对条纹杂交鲈免疫的效果。Wenbin等2009年也利用ELISA检测接种海豚链球菌灭活疫苗后的大菱虾的血清抗体水平，发现抗体水平的OD值有明显升高。在诊断方面，通过测定病鱼的血清抗体，也可以确定自然发病鱼类的病原。

许多证据表明，鱼类与哺乳类一样也有细胞免疫和体液免疫两种类型的特异性免疫反应。人所共识哺乳动物具有五类免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgE、IgD，而鱼类中主要的免疫球蛋白之一IgM在鱼类的特异性免疫应答中发挥重要作用。目前人们已从许多鱼类中分离得到免疫球蛋白，无颌鱼类免疫球蛋白表达量很少，有颌鱼类血清中的免疫球蛋白在血液中的相对水平较哺乳动物的高。鱼类的IgM不仅存在于血清中,还存在于皮肤、肠粘液、胆汁和卵中。

鱼和哺乳动物一样，抗原进入机体后有一段潜伏期，这时血清中的抗体很少或没有，鱼类对病原体的免疫保护力也很低。在适宜条件下，抗原刺激一段时间后在鱼类的肾脏和脾中产生相应的抗体，然后释放到血液中。此类抗体是针对抗原产生的特异性抗体，即是针对IgM的免疫球蛋白，如果能对该类抗体进行检测，那对鱼类疾病的快速诊断及鱼类口服疫苗的抗体评估有着十分重要的应用价值。

无乳链球菌的C5a肽酶简称ScpB（Streptococcal C5a Peptidase from Group BStreptococcus)，ScpB可以裂解人C5a补体的His-67，阻止其与中性粒细胞的结合，抑制炎症反应，是介导细菌粘附和入侵靶细胞及引起机体免疫反应的重要蛋白。也是目前发现的细菌较大的表面蛋白，其存在于各类血清型的无乳链球菌菌株中。研究表明，人源无乳链球菌的ScpB蛋白由1150个氨基酸组成，前31个为信号肽，紧邻的68个为蛋白前肽。此外，该蛋白还含有N端裂解C5a的蛋白酶活性区、蛋白酶相关区、纤维结合素结合区以及C端细胞壁锚定、穿膜结构等五个功能区。细菌主要通过纤维结合素结合区（Fn）与宿主细胞的纤维结合素受体结合，实现粘附和定植宿主细胞的第一步。同时，酶活性区可以裂解补体C5a，阻断C5a趋化中性粒细胞的作用，达到抑制炎症目的。

目前，动物实验证实ScpB蛋白对小鼠具有较好的免疫保护作用，并且由于该蛋白存在于所有血清型的无乳链球菌菌株中，高度保守，具有较好的免疫原性，且其分解补体C5a的作用明确，因而成为无乳链球菌疫苗的主要候选成分之一，同时也成为构建ELISA试剂盒的一个优选抗原。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒，用于检测鱼类无乳链球菌IgM抗体，具有高特异性。

本发明的另一目的在于提供一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法。

为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下：

一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒，包括包被抗原、兔抗鱼IgM二抗、HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液；所述包被抗原为鱼类无乳链球菌全菌蛋白或无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白，其中ScpB蛋白片段序列为与SEQ ID NO:1序列至少80%同源的序列。

上述方案中，所述兔抗鱼IgM二抗是通过分离培养的无乳链球菌对健康鱼类攻毒，收集鱼血清，纯化IgM抗体，然后免疫兔子，免疫两次后采血收集血清，然后利用Protein G亲和层析柱纯化而得。

为实现本发明的另一个目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：

1）鱼特异性IgM的制备：对健康鱼注射无乳链球菌菌液，攻毒后，采集攻毒鱼血清，用IgM纯化试剂盒纯化鱼血清中的特异性IgM；

2）兔抗鱼IgM二抗的制备：纯化后的鱼特异性IgM作为抗原注射免疫兔子，免疫两次后采集兔血清，兔血清用Protein G亲和层析柱纯化，备用；

3）抗原的制备：获取鱼类无乳链球菌全菌蛋白或无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白包被抗原；

4）试剂盒组装：将步骤2）中的兔抗鱼IgM抗体、步骤3）中的抗原、以及HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液组装成ELISA试剂盒。

上述方法中，所述步骤3）中鱼类无乳链球菌全菌蛋白包被抗原是通过以下方法获得：无菌培养无乳链球菌菌液，离心后收集菌液沉淀，无菌PBS重悬洗涤，并重复离心洗涤2-5次；沉淀重悬振荡混匀后，进行超声破碎；超声后离心处理，取上清作为包被抗原。

在上述方案的基础上，作为本发明的一种优选实施方式，所述超声破碎的方式采用超声4s，停6s相互间隔的方式，超声振幅35%，超声时间为25min，直到菌液透明为止，整个超声过程在冰浴中进行。

上述方法中，所述步骤3）中无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白包被抗原是通过以下方法获得：从鱼无乳链球菌ScpB全长蛋白获取与SEQ ID NO:1序列至少80%同源性的序列；在scpB-1两端分别加上酶切位点EcoR I和Xho I，将克隆质粒导入表达载体pET32a(+)中，获得重组质粒，然后将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中，0.7mM IPTG诱导重组蛋白表达，经纯化后获得无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白包被抗原。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：由于鱼类的IgM抗体不同于其他动物的IgM抗体，不能通过通用的试剂盒来检测，因此本发明建立一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒。本发明采用特异性的兔抗鱼IgM抗体作为二抗，并采用超声破碎的无乳链球菌全菌上清或重组表达ScpB蛋白作为包被抗原，全菌抗原包含无乳链球菌菌体的大部分蛋白，在检测过程中可以充分地与鱼血清中的特异性IgM抗体结合，具有较强的特异性，而ScpB蛋白为选自无乳链球菌的保守序列，该区段序列保守且抗原表位丰富，特异性更强。因此本发明的检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒具有更好特异性。

下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为实施例1的临床样本检测结果图；

图2为实施例2的临床样本检测结果图。

具体实施方式

实施例1

一种检测罗非鱼无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒，包括包被抗原、HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液；所述包被抗原为罗非鱼无乳链球菌全菌蛋白或无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白，其中ScpB蛋白片段序列为SEQ ID NO:1；其还包括兔抗罗非鱼IgM二抗；该试剂盒是通过以下方法制备而成的：

1）罗非鱼特异性IgM的制备：对健康罗非鱼注射无乳链球菌菌液（1×10⁸CFU/mL），攻毒一周后，采集攻毒鱼血清，用IgM纯化试剂盒纯化罗非鱼血清中的特异性IgM；

2）兔抗鱼IgM抗体的制备：用纯化后的罗非鱼IgM作为抗原注射免疫兔子，共免疫两次，第一次免疫，将0.42mg的纯化后的罗非鱼IgM稀释至1mL与弗氏完全佐剂1:1（v/v）混合乳化，在兔子背部皮下多点注射免疫；一免两周后二免，免疫的抗原剂量为0.4mg IgM，与弗氏不完全佐剂1:1（v/v）混合乳化，二免后一周采集兔血清，测血清中的抗体效价；将制备好的兔血清用Protein G亲和层析柱纯化，备用；

3）罗非鱼无乳链球菌全菌抗原的制备：无菌培养无乳链球菌菌液，8000rpm/min，离心10min，收集菌液沉淀，无菌PBS重悬洗涤，重复离心洗涤3次。沉淀重悬振荡混匀后，进行超声破碎，超声方式：超声4s，停6s，振幅35%，超声25min，直到菌液透明为止，整个过程在冰浴中进行；超声后用10000rpm/min离心15min，取上清，然后测定蛋白浓度（3.2mg/ml），作为ELISA检测的包被抗原；

4）组装试剂盒：将步骤2）中的兔抗鱼IgM抗体、步骤3）中的抗原、以及HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液组装成ELISA试剂盒。

实施例2

3）无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白包被抗原的制备：从罗非鱼无乳链球菌ScpB全长蛋白获取SEQ ID NO:1序列片段；在scpB-1两端分别加上酶切位点EcoR I和Xho I，将克隆质粒导入表达载体pET32a(+)中，获得重组质粒，然后将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中，0.7mM IPTG诱导重组蛋白表达，经纯化后获得无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白包被抗原；

应用实施例1：实施例2所述的罗非鱼无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒的应用

1.确定抗原的最佳包被浓度及羊抗兔HRP的最佳稀释倍数

1）首先固定血清及兔抗鱼IgM纯化抗体的稀释度来确定抗原的最佳包被浓度及羊抗兔HRP的最佳稀释度；

2）以抗原最佳包被浓度和羊抗兔HRP最佳稀释度进行ELISA反应，确定血清及兔抗鱼IgM纯化抗体的最佳稀释倍数。

具体操作步骤如下：

(1)包被：抗原用包被液稀释后，100μL/孔，加入96孔聚苯乙烯酶联反应板，4℃包被过夜，每孔加250μL洗涤液，洗涤3次后甩干；

(2)封闭：每孔加封闭液150μL，37℃封闭1h，甩干，每孔加250μL洗涤液进行洗涤，洗3次；

(3)加样：血清用抗体稀释液稀释，每孔加入100μL，25℃孵育30min，甩干，每孔加250μL洗涤液进行洗涤，洗6次；

(4)加兔抗鱼IgM抗体：兔抗鱼IgM抗体用抗体稀释液稀释，100μL/孔加样，作用30min，洗涤同上；

(5)加HRP标记的羊抗兔抗体：HRP标记的羊抗兔抗体用抗体稀释液稀释，100μL/孔，25℃作用30min，洗涤同上；

(6)加显色液：每孔加入新配制的显色液100μL，室温避光显色10min；

(7)加入终止液：每孔加入50μL终止液终止反应；

(8)测OD值：自动酶联检测仪测定各孔OD450nm值，检测的具体内容及结果见表1和表2。

表1

表1的结果显示：通过上述方法确定抗原的最佳包被浓度为1:200，HRP的稀释度为1:2000。

表2

表2的结果显示：通过上述方法确定血清及兔抗鱼IgM纯化抗体的最佳稀释倍数分别为1:80和1:250。

2.临床样品的检测

采用上述ELISA试剂盒检测攻毒后4个月的免疫鱼血清，共检测注射免疫组、高浓度浸泡免疫组、中浓度浸泡免疫组、低浓度浸泡免疫组和未经免疫处理的对照组5个组罗非鱼血清4个月内血清抗体水平的变化趋势，结果见图1。由图1检测结果可见，各免疫组和对照组之间的血清抗体水平表现出差异，相对免疫保护率越高的免疫组，血清中抗体水平也越高，并且都高于对照组。免疫组在攻毒前、免疫结束后一周和免疫结束后两周，血清抗体水平呈上升趋势。这说明建立的ELISA方法可以对罗非鱼血清抗体具有较高的特异性。

应用实施例2：实施例2所述的罗非鱼无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒的应用

1.抗原、兔抗鱼IgM抗体的最佳稀释浓度的确定：

用棋盘(checkerboard)滴定法确定抗原和兔抗鱼IgM抗体的最佳工作浓度，然后再以最佳稀释度的抗原包被酶标板，确定羊抗兔HRP的最佳稀释度。

用pH9.6的碳酸盐缓冲液将蛋白分别稀释为1:800、1:1600和1:3200三个浓度，从左到右依次包被于96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；次日，洗涤和封闭后，将阴、阳性血清分别1:50稀释加于反应孔中，100μL/孔，兔抗IgM抗体做1:500、1:1000、1:2000三个稀释度，自上而下分别加入以上的反应孔中，100μL/孔，组成方阵，室温孵育30min，按操作程序进行操作。羊抗兔HRP1：2000倍稀释，进行ELISA试验。在酶标仪上于450nm处测各孔的OD值，阴性血清OD_450nm记为N，各阳性检测孔的OD_450nm记为S。比较阴阳性血清的OD_450nm值，当二者比率（即S/N）最大，且阴性血清OD₄₅₀值为小于0.2，阳性血清的OD₄₅₀值大于0.5时的抗原和兔抗鱼IgM抗体的稀释浓度为最佳工作稀释浓度。

具体操作步骤如下：

(7)加入终止液：每孔加入50μL终止液终止反应；

(8)测OD值：自动酶联检测仪测定各孔OD₄₅₀nm值，OD₄₅₀检测结果见表3和表4。

表3

由表3可见，抗原作1：1600倍稀释，兔抗鱼IgM抗体1：1000倍稀释时，S/N值最大。因此，抗原最佳稀释度是1:1600，兔抗鱼IgM抗体的最佳稀释度为1:1000。

表4

抗体稀释度	1:1000	1:2000	1:4000	1:8000
					阴性血清	0.280	0.234	0.182	0.154
阳性血清	1.569	1.306	1.145	0.956

当HRP-羊抗兔作1:4000稀释时，S/N值最大。因此，HRP-羊抗兔的最佳稀释度是1:4000。

2.阴阳性临界值的确定

随机收集临床采集的无链球菌感染的罗非鱼血清，用现有的间接ELISA方法检测，计算出40份阴性血清的平均OD值和标准方差(SD)，阴、阳性临界值的确定公式为凡超过临界值的判为阳性，否则判为阴性；检测结果见表5。

表5

检测中阴性对照的OD_450nm值为0.095，阳性对照的OD_450nm值为1.006。由表5计算结果可知，40份阴性血清的平均OD值为0.239，标准方差（SD）为0.0747，因此，阴阳性临界值

3.临床样品检测

采用上述ELISA试剂盒检测攻毒后4个月的免疫鱼血清，共检测注射免疫组、高浓度浸泡免疫组、中浓度浸泡免疫组、低浓度浸泡免疫组和未经免疫处理的对照组5个组罗非鱼血清4个月内血清抗体水平的变化趋势，结果见图2。由图2可见，免疫组罗非鱼在受到免疫原刺激后机体产生大量抗体，抗体水平随着时间降低到一定水平后开始缓慢升高，并在攻毒后第58d，血清内抗体水平达到峰值，58d后又逐渐下降，而对照组一直保持较低的抗体水平。同样说明该ELISA方法，用于罗非鱼抗体水平的检测，具有很高的特异性。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

〈110〉广东海大畜牧兽医研究院有限公司；中国水产科学研究院珠江水产研究所

〈120〉一种检测鱼类无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒及其制备方法

〈130〉

〈160〉 1

〈170〉 PatentIn version 3.5

〈210〉 1

〈211〉 31701

〈212〉 DNA

〈213〉 ScpB蛋白

〈400〉 1

atgtatgtaa cagataagga caatacctca agcaaggttc acctgaacaa tgtttctgat 60

aaatttgaag taacagtaac agttcacaac aaatctgata agcctcaaga gttgtattac 120

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caaaaagaaa ctaaaaaata g 1701

Claims

1.一种检测罗非鱼特异无乳链球菌IgM抗体的ELISA试剂盒，包括包被抗原、兔抗罗非鱼抗无乳链球菌IgM抗体、HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液；所述包被抗原为罗非鱼无乳链球菌全菌蛋白或无乳链球菌ScpB蛋白片段的重组蛋白，其中ScpB蛋白片段序列为SEQ ID NO:1；该试剂盒是通过以下方法制备而成的：

1）罗非鱼特异性抗无乳链球菌IgM的制备：对健康罗非鱼注射1×10⁸ CFU /mL无乳链球菌菌液，攻毒一周后，采集攻毒鱼血清，用IgM纯化试剂盒纯化罗非鱼血清中的特异性抗无乳链球菌IgM；

2）兔抗罗非鱼抗无乳链球菌IgM抗体的制备：用纯化后的罗非鱼抗无乳链球菌IgM作为抗原注射免疫兔子，共免疫两次，第一次免疫，将0.42 mg的纯化后的罗非鱼抗无乳链球菌IgM稀释至1mL与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比混合乳化，在兔子背部皮下多点注射免疫；一免两周后二免，免疫的抗原剂量为0.4 mg IgM，与弗氏不完全佐剂按照1:1的体积比混合乳化，二免后一周采集兔抗罗非鱼抗无乳链球菌血清，测血清中的抗体效价；将制备好的兔血清用Protein G亲和层析柱纯化，备用；

4）组装试剂盒：将步骤2）中的兔抗罗非鱼抗无乳链球菌IgM抗体、步骤3）中的重组蛋白包被抗原、以及HRP标记的羊抗兔二抗、抗体稀释液、洗涤液、显色液、终止液组装成ELISA试剂盒。