CN117327662A - 一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用 - Google Patents

一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用。本发明的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023170，本发明的杂交瘤细胞株能够无限增殖并持续产生抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体；本发明的抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体可以特异性识别罗非鱼免疫球蛋白IgM，为探究罗非鱼免疫球蛋白IgM抗体和IgM+B细胞提供特异性强且高效的抗体工具；本发明的抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体还可以可制成用于检测抗无乳链球菌IgM抗体和抗杀鱼爱德华氏菌IgM抗体的产品，为罗非鱼病原菌感染与防治提供更准确可靠的评价和检测技术。

Description

一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用。
背景技术
尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）具有分布广、适应强、生长快、易饲养、产量高、肉质好等优势，高密度集约化的鱼类养殖模式显著提高了产量和经济效益，而养殖规模的扩大和单位水体养殖鱼类的增加，同时也导致了养殖自身污染加剧和环境质量下降，致使种质退化，病害频发。寻找科学有效的鱼病防治方法有助于增加渔业产量，提高产品质量，从而实现渔业养殖可持续健康发展。
疫苗可刺激罗非鱼免疫系统产生抗特定病原的抗体，使鱼体在真正接触到该病原体时刻迅速产生免疫反应，降低感染和死亡率，保障罗非鱼渔业养殖业持续绿色健康发展。注射免疫是渔用疫苗最主要的免疫方式，激活鱼体的体液免疫和细胞免疫反应，使提高免疫保护率。有效的抗体效价是评价疫苗保护力的重要指标之一，含量最高的免疫球蛋白IgM是硬骨鱼体液免疫应答的重要组成部分。硬骨鱼IgM以分泌的四聚体形式（secreted IgM,sIgM）和膜表面的单聚体（membrane IgM, mIgM）存在。通过制备抗罗非鱼IgM的单克隆抗体，分析病原菌感染或免疫接种过程中血清的特异性抗体，同时监测抗体分泌细胞的变化规律，评价疫苗的免疫效果。
然而，目前市面上还未有能同时检测罗非鱼IgM+ B细胞和血清免疫球蛋白IgM商品化抗体，这严重阻碍了罗非鱼疫苗接种对罗非鱼免疫效果的评价，以及罗非鱼养殖户养殖过程对鱼体健康的监测与免疫诊断工作。因此，亟需制备特异性强的抗罗非鱼IgM单克隆抗体，为深入了解罗非鱼体液免疫应答规律和建立罗非鱼疫苗免疫效果的评价标准体系提供有力的工具。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供的一种杂交瘤细胞株，于2023年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023170。
第二方面，本发明提供的一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，由第一方面所述的保藏编号为CCTCC NO：C2023170的杂交瘤细胞株分泌产生。
第三方面，本发明提供的一种如第一方面所述的单克隆抗体在制备检测罗非鱼免疫球蛋白IgM产品中的应用。
第四方面，本发明提供的一种用于罗非鱼检测的试剂盒，包括第一方面所述的单克隆抗体。
所述试剂盒采用的检测方法包括流式细胞术、酶联免疫法、蛋白质印迹法、间接免疫荧光法中的至少一种。
第五方面，本发明提供的一种如第一方面所述的单克隆抗体在制备检测抗无乳链球菌IgM抗体产品中的应用。
第六方面，本发明提供的一种如第一方面所述的单克隆抗体在制备检测抗杀鱼爱德华氏菌IgM抗体产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明的杂交瘤细胞株能够无限增殖并持续产生抗罗非鱼免疫球蛋白IgM单克隆抗体；
（2）本发明的抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体可以特异性识别罗非鱼免疫球蛋白IgM，为探究罗非鱼免疫球蛋白（特异性）IgM抗体和IgM+ B细胞提供特异性强且高效的抗体工具；
（3）本发明的抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体还可以可制成用于检测抗无乳链球菌IgM抗体和抗杀鱼爱德华氏菌IgM抗体的产品，为罗非鱼病原菌感染与防治提供更准确可靠的评价和检测技术。
附图说明
图1为罗非鱼血清IgM蛋白纯化后SDS-PAGE凝胶电泳检测结果，图中，M表示蛋白大小marker，泳道1和2分别为纯化后2 μg和0.2 μg蛋白；
图2为采用流式细胞术检测罗非鱼头肾IgM+细胞的百分比结果；
图3为免疫印迹Western-blot检测结果，其中，M表示蛋白大小marker，泳道1为罗非鱼血清稀释样品；
图4为罗非鱼血清总IgM抗体检测结果；
图5为无乳链球菌感染后罗非鱼血清特异性IgM抗体变化情况；
图6为杀鱼爱德华氏菌感染后罗非鱼血清特异性IgM抗体变化情况。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例和效果例所用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例和效果例所用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
本发明所用罗非鱼购买自广东罗非鱼良种养殖场，体重为50 ±10g，饲养于华南师范大学生物园水产动物养殖场，稳定养殖2周后开始实验。
实施例1
一、罗非鱼血清免疫球蛋白IgM的纯化
（1）罗非鱼用MS-222麻醉剂麻醉后尾部静脉采血，于4℃下放置过夜，以500 × g的转速离心取上清液，将上清液过孔径为0.45 μm的滤膜，得到罗非鱼血清，将所得的罗非鱼血清保存于-20℃的环境中，备用。
（2）将Protein-A琼脂糖填料（来自于金斯瑞，中国）装入重力柱，弃去填料浸泡液后，重力柱用Tris-HCl缓冲溶液（浓度为100 mM，pH=8.0）平衡，将所得的罗非鱼血清用Tris-HCl缓冲溶液（浓度为1 M，pH=8.0）按照罗非鱼血清：Tris-HCl缓冲溶液=10：1的体积比稀释后过重力柱，然后用10倍重力柱容积的Tris-HCl缓冲溶液（浓度为100 mM，pH=8.0）洗去柱中未结合的血清成分，再用10倍重力柱容积的Tris-HCl缓冲溶液（浓度为10 mM，pH=8.0）洗去柱中未结合的血清成分，最后用甘氨酸溶液（浓度为1 M，pH=3.0）洗脱结合在柱子中的罗非鱼IgM蛋白，收集罗非鱼IgM蛋白洗脱液，将与洗脱液相同体积的Tris-HCl缓冲溶液（浓度为1 M，pH=8.0）加入洗脱液中进行中和，用PBS缓冲溶液（pH=7.3）透析12 h，经PEG20000浓缩，得到罗非鱼IgM蛋白浓缩物，-20℃保存备用。
用分光光度计Nanodrop 2000对蛋白浓度进行测定，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测蛋白纯化效果。
由图1可知，在变形还原条件下，IgM呈现重链和轻链两条主带，重链大小约为75kD，轻链大小约为27 kD。
二、鼠抗罗非鱼IgM单克隆抗体制备
1、小鼠免疫
（1）将罗非鱼IgM蛋白浓缩物与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比混合，得到混合药剂；
（2）每隔10天将混合药剂腹腔注射入雌性Balb/c小鼠（购买自广东省医学实验动物中心，6~8周），共注射四次，第一次注射剂量为50 μg/只，第二次注射剂量为30 μg/只，第三次注射剂量为25 μg/只，第四次注射剂量为25 μg/只。
（3）于第四次注射后的第5天，在小鼠尾部取血进行ELISA检测效价，效价达到1/10000以上进行融合准备；细胞融合前三天对小鼠进行加强免疫注射，注射方式为尾部静脉注射和腹腔注射，尾部静脉注射的剂量为10 μg/只，腹腔注射的剂量为10 μg/只。
2、阳性杂交瘤细胞株及单克隆抗体的获得
（1）在IgM蛋白加强免疫注射后的第3天，取小鼠脾脏与SP2/0进行细胞融合，主要过程包括：采用断颈法处死小鼠，取小鼠脾脏，弃去明显的脂肪组织后，用注射器反复抽打脾脏使脾脏细胞释放，红细胞裂解液去除红细胞，取处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0与脾脏细胞比值调整为1/10，混合后用PEG-2000溶液（PEG-2000溶液中PEG-2000的质量浓度为50%）进行细胞融合，利用HAT筛选培养基筛选融合后的细胞。
（2）细胞融合大约7天后观察细胞生长状态并进行半换液处理，不吹散培养孔中细胞，于融合后第十天，利用高参数流式细胞仪LSR Fortessa对融合细胞进行阳性筛选，筛选出阳性孔，将阳性孔中的细胞移至24孔板中扩大培养，然后再次检测，并同时进行Western-Blot检测，检测结果为阳性；然后将扩大培养所得的细胞进行两次有限稀释，获得阳性杂交瘤细胞株悬液；所述稀释包括依次进行的从左往右3倍稀释，从上往下2倍稀释。
从左往右3倍稀释的操作具体为：在96孔板第一行，第一个孔加入150 μL含有20000个扩大培养所得细胞的培养基，第一行从左往右，剩下的每孔加入100 μL培养基（不含细胞）；完成后从第一个孔取出50 μL含有约6700个扩大培养所得细胞的培养基与相邻第二个孔培养基混匀后，混匀后再取50 μL含有约2200个扩大培养所得细胞的培养基与第三孔混匀，以此依次完成至第一排最后一孔。
从上往下2倍稀释的具体操作为：除去第一行已有培养基和细胞，剩下的96孔板，每孔中加入50 μL培养基（不含细胞）。利用12孔排枪，从第一行各孔中分别取出50 μL含有细胞的培养基，与第二行对应孔中含有细胞的培养基混匀后，从第二行各孔分别取出50 μL含有细胞的培养基，再分别与第三行对应孔中含有细胞的培养基混匀，以此依次操作至最后一行，取出的50 μL培养基（含有细胞）弃去。96孔板加入培养基（不含细胞）至每孔最终培养基体积为200 μL。
在稀释过程中，含有细胞的培养基是由扩大培养后的细胞用培养基稀释获得的。在稀释过程中，所用的培养基为含有1 × HAT，20%胎牛血清FBS的RPMI-1640培养基。
（3）阳性杂交瘤细胞株冻存方式为：900 μL含有阳性杂交瘤细胞（细胞数量为2×106个）的培养基与100 μL DMSO混合，保存于容积为2 mL的细胞冻存管，置于梯度降温盒，放于-80℃冰箱过夜，第二天转移至液氮罐冻存，并送至中国典型培养物保藏中心（位于中国武汉大学）保藏，保藏编号为CCTCC NO：C20232170，分类命名为杂交瘤细胞株On_2B5（Hybridoma cell line On_2B5）。
（4）单克隆抗体的获得及鉴定：
将液体石蜡以0.5 mL/只的注射量注射入雄性Balb/c小鼠（6-8周龄）的腹腔，注射7~8天后，将含有阳性杂交瘤细胞的培养基（培养基中阳性杂交瘤细胞的浓度为2×106个/mL）以0.5 mL/只的注射量注射入雄性Balb/c小鼠的腹腔，待注射8~14天后小鼠腹腔鼓起来后，断颈处死小鼠，并收集小鼠腹水；
步骤（3）和步骤（4）中含有阳性杂交瘤细胞的培养基采用下述方法获得：从步骤（2）所得的阳性杂交瘤细胞株悬液中挑出阳性杂交瘤细胞，然后用培养基稀释获得的，步骤（3）稀释所用培养基为含有20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，步骤（4）稀释所用培养基为RPMI-1640培养基。
使用Protein A亲和层析介质（来自于金斯瑞）对所得的腹水进行抗体IgG纯化，纯化过程参考介质的说明书，即将腹水样品上柱，收集流穿液后加入Glycine-HCl溶液（pH=3.0，浓度为0.1 M）洗脱，收集含有单克隆抗体的洗脱液，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测洗脱液中抗体的纯度。
使用Thermo Scientific™ Pierce小鼠抗体快速分型试剂盒检测洗脱液所含IgG的亚型，具体过程参考试剂盒的说明书。
抗体亚型鉴定结果表明，本发明制备的鼠抗罗非鱼IgM重链单克隆抗体亚类为IgG1。
下述效果例中的，On_2B5抗体是指按照实施例1的方法获得的抗体。
效果例1
采用流式细胞术检测罗非鱼头肾淋巴门（lymphoid gate, L gate）和髓系门（granulocyte-macrophage gate, G-M gate），On_2B5稀释比为1:4000（抗体浓度为1 mg/mL）。
检测结果如图2所示，淋巴门和髓系门分别存在分群明显的两群IgM+细胞，淋巴门IgM+细胞的比例约为19.9%，髓系门IgM+细胞的比例约为8.33%。
效果例2
采用免疫印迹Western-blot检测的具体步骤为：
（1）在变性还原条件下，进行纯化后的罗非鱼血清IgM蛋白SDS-PAGE凝胶电泳。
（2）剪取与SDS-PAGE胶大小一致的PVDF膜，于甲醇浸泡活化后，用Western-blot装置将PVDF膜与SDS-PAGE胶制备成三明治结构转移至电泳槽，并将电泳槽埋于冰盒内，100 V转膜50 min；
（3）转膜结束后取出PVDF膜，加入封闭液（含有10%BSA的PBS溶液）置于4℃冰箱，封闭过夜；
（4）加入On_2B5一抗（即On_2B5抗体），用稀释液按照抗体与稀释液的质量比为1:2000的比例稀释，获得一抗稀释液，一抗稀释液中On_2B5抗体的浓度为1 mg/mL，37℃孵育1h；
（5）弃去一抗（即弃去液体成分）后，用洗涤液洗膜3次，每次10 min，将一抗清洗干净后，加入二抗稀释液（商品化的HRP标记的羊抗鼠IgG，二抗稀释液中二抗浓度为1 mg/mL，用稀释液按照抗体与稀释液的质量比为1:4000的比例稀释），37℃孵育1 h；
（6）弃去二抗（即弃去液体成分）后，用洗涤液洗膜3次，每次10 min；换用超纯水，将膜泡于其中；
（7）加ECL发光液并于天能Tanon5500化学发光成像分析系统拍照保存。
在本效果例中，洗涤液为含0.1%Tween-20及1%BSA的PBS缓冲溶液，稀释液为含1%BSA的PBS缓冲溶液。
检测结果如图3所示，On_2B5单克隆抗体所抗罗非鱼IgM为IgM重链，条带单一，表明On_2B5所分泌的罗非鱼IgM单克隆抗体能特异性识别罗非鱼IgM。
效果例3
进一步探究按照实施例1的方法所获得的单克隆抗体On_2B5能否用于ELISA检测血清IgM，本发明实施例开展了罗非鱼血清总IgM抗体检测，总IgM抗体ELISA检测步骤包括：
（1）用磷酸盐缓冲液PBS稀释On_2B5为2 μg/mL，100 μL每孔包被酶标板，置于4℃冰箱孵育过夜；
（2）弃去抗体包被液，使用封闭液（含0.05% Tween-20，1%BSA的PBS缓冲溶液）封闭，200 μL每孔，置于室温1 h；
（3）弃去酶标板中的液体后，加入洗涤液200 μL，每孔洗3次；酶标板第一孔加入150 μL稀释液，从上往下，同一列剩余每孔加入100 μL稀释液，完成后，在加有150 μL稀释液的第一个孔加入1.5 μL健康罗非鱼血清混匀后，取出50 μL加入下一行相邻孔，依次往下稀释（即相邻1:3倍稀释），最后一行作为空白对照不加稀释血清，室温孵育1 h；
（4）弃去酶标板中的液体后，用洗涤液200 μL每孔洗3次，用稀释液将生物素标记的On_2B5抗体稀释至抗体的浓度为1 μg/mL（生物素标记On_2B5使用生物素标记试剂盒，购买于武汉福因德公司），100 μL每孔，室温孵育1 h；
（5）弃去鼠抗罗非鱼IgM单抗后，用洗涤液200 μL每孔洗3次，加用稀释液（含有1%BSA的PBS缓冲溶液）稀释1000倍体积后的HRP标记的链霉亲和素（购买自Biotech公司），50μL每孔，室温孵育1 h；
（6）弃去HRP标记的链霉亲和素后，用洗涤液200 μL每孔洗3次，每孔加入100 μLTMB显色液（TMB溶液浓度为10 mg/mL，0.11 M柠檬酸钠缓冲液 pH 5.5，显色液为0.1 mLTMB溶液+9.9 mL柠檬酸钠缓冲液+5 μL质量浓度为0.03%的H2O2溶液，现配现用），室温避光反应10 min；
（7）每孔加入50 μL反应终止液（2 M H2SO4溶液)，加入后将酶标板放至酶标仪，于450 nm波长下检测吸光值。
在本效果例中，洗涤液为含0.1%Tween-20、0.1%BSA的PBS缓冲溶液，稀释液为含1%BSA的PBS缓冲溶液。
按照上述方法检测不同罗非鱼血清加入剂量下，吸光度的变化情况。
结果如图4所示，随着血清体积的升高，检测到的IgM抗体吸光度逐渐增大，当检测血清体积为0.0041 μL时，血清IgM抗体的吸光度检测结果仍显示为阳性，表明制备所得的鼠抗罗非鱼IgM抗体On_2B5灵敏度极高。
效果例4
选择健康的罗非鱼随机分为两组，一组为对照组，另外一组为感染组；对照组腹腔注射200 μL无菌PBS溶液；感染组腹腔注射无乳链球菌（S. agalactiae）菌液（活菌浓度为2×107 CFU/mL），注射剂量为100 μL/尾；
感染组和对照组均于感染后的第3天、5天、8天和12天，分别尾静脉取血，收集血清用于ELISA检测免疫后特异性抗体的变化情况。
特异性IgM抗体ELISA检测步骤包括：
（1）病原菌主要毒力因子重组蛋白表达：表面免疫原性蛋白（Surfaceimmunogenic protein, Sip）是无乳链球菌主要的毒力因子之一，参与无乳链球菌的黏附、侵袭和免疫逃逸，在无乳链球菌致病过程中发挥重要作用，同时可刺激机体产生抗体，所产生的抗体具有中和无乳链球菌毒力因子和诱导吞噬细胞对无乳链球菌的免疫吞噬作用。于NCBI网站，查找无乳链球菌Sip（GenBank: HQ878436.1）并设计带有限制性酶切位点的蛋白表达引物：
Sip-F：GGATCCCAAGAAACAGATACGACGTG，
Sip-R：AAGCTTGTTAAAGGATACGTGAACGTG。
以无乳链球菌为模板，PCR克隆获得Sip序列，将获得的序列与pMD-18T载体连接后，测序确定序列无移码后，用对应的限制性核酸内切酶BamHI/HindIII将表达片段切下，跑胶回收，与用相同限制性核酸内切酶切割的表达载体pET-32a质粒连接，构建pET-32a-Sip重组表达质粒，利用大肠杆菌原核表达系统进行重组蛋白的表达与纯化，获得重组Sip蛋白。重组Sip蛋白经镍柱纯化透析后，保存于PBS缓冲液（pH=7.3），浓度为1 mg/mL，获得重组Sip抗原稀释液，该抗原稀释液可保存于-80℃冰箱备用。
（2）用磷酸盐缓冲液PBS稀释重组抗原Sip，获得重组抗原Sip稀释液（其中抗原的浓度为10 μg/mL），每孔50 μL包被于酶标板中，置于4℃冰箱孵育12 h；
（3）弃去酶标板中的液体，使用封闭液（含0.05% Tween-20及1%BSA的PBS缓冲溶液）封闭，每孔100 μL，置于室温1 h；
（4）弃去酶标板中的液体后，用洗涤液以每孔每次200 μL洗3次；用稀释液分别将对照组的血清和感染组的血清稀释50倍；酶标板中选择一行作为感染组，每孔加入100 μL稀释后的感染组血清；酶标板中选择一行作为对照组，每孔加入100 μL稀释后的对照组血清；酶标板中最后一行作为空白对照，不加稀释血清，而加的PBS缓冲溶液，加入量为100 μL/孔，室温孵育1 h；
（5）弃去检测样品后，用洗涤液以每孔每次200 μL的量洗3次；用稀释液将生物素标记的On_2B5抗体稀释为1 μg/mL，获得生物标记抗体稀释液；每孔加入50 μL生物标记抗体稀释液，室温孵育1 h；
（6）弃去酶标板中的液体后，用洗涤液以每孔每次200 μL的量洗3次；将加用稀释液稀释后的HRP标记的链霉亲和素（购买自Biotech公司），1:1000稀释，50 μL每孔，室温孵育1 h；
（7）弃去HRP标记的链霉亲和素后，用洗涤液200 μL每孔洗3次，每孔加入100 μLTMB显色液（TMB溶液的浓度为10 mg/mL，0.11 M柠檬酸钠缓冲液 pH 5.5，显色液为0.1mLTMB溶液 + 9.9 mL柠檬酸钠缓冲液 +5 μL质量浓度为0.03%的H2O2溶液，现配现用），室温避光反应30 min；
（8）每孔加入50 μL反应终止液（2 M H2SO4溶液)，加入后将酶标板放至酶标仪，于450 nm波长下检测吸光值。
在本效果例的步骤（3）至步骤（8）中，洗涤液为含0.1% Tween-20、0.1%BSA的PBS缓冲溶液；稀释液为含1%BSA的PBS缓冲溶液。
ELISA检测样品结果如图5所示。如图5所示，感染无乳链球菌后，检测到鱼体血清抗Sip无乳链球菌特异性抗体的浓度出现并逐渐上升。
效果例5
选择健康的罗非鱼随机分为两组，一组为对照组，另一组为感染组；对照组腹腔注射200 μL无菌PBS溶液；感染组腹腔注射杀鱼爱德华氏菌（E. piscicida）菌液（活菌浓度为1×108 CFU/mL），注射剂量为100 μL/尾；感染组和对照组均于注射后的第3天和7天，分别尾静脉取血，收集血清用于ELISA检测免疫后特异性抗体的变化情况。
特异性IgM抗体ELISA检测步骤包括：
（1）病原菌主要毒力因子重组蛋白表达：杀鱼爱德华氏菌重组抗原鞭毛蛋白Flagellin C（FliC）的蛋白为多种细菌的鞭毛蛋白，与细菌的运动功能关系密切。
于NCBI网站，查找杀鱼爱德华氏菌FliC基因（GenBank: QBB13631.1）的特异性引物（带有限制性酶切位点）：
FliC-F：GAGCTCATGGCACAAGTAATC，
FliC-R：AAGCTTACGCAGCAGGGACAG。
以杀鱼爱德华氏菌为模板，PCR克隆获得FliC序列，将获得的序列与pMD-18T载体连接后，测序确定序列无移码后，用对应的限制性核酸内切酶Sacl/HindIII将表达片段切下，跑胶回收，与用相同限制性核酸内切酶切割的表达载体pET-32a质粒连接，构建pET-32a-FliC重组表达质粒，利用大肠杆菌原核表达系统进行重组蛋白的表达与纯化，获得重组FliC蛋白，重组FliC蛋白经镍柱纯化透析后，保存于PBS缓冲液（pH=7.3），浓度为1 mg/mL，得到重组FliC抗原稀释液，该抗原稀释液可保存于-80℃冰箱备用。
（2）用磷酸盐缓冲液PBS稀释重组抗原FliC，获得重组抗原FliC稀释液（其中抗原的浓度为10 μg/mL），每孔50 μL包被于酶标板中，置于4℃冰箱孵育12h；
（3）弃去酶标板中的液体，使用封闭液（含0.05% Tween-20及1%BSA的PBS缓冲溶液）封闭，每孔100 μL，置于室温1 h；
（4）弃去酶标板中的液体后，用洗涤液以每孔每次200 μL的量洗3次；用稀释液分别将对照组的血清和感染组的血清稀释50倍；酶标板中选择一行作为感染组，每孔加入100μL稀释后的感染组血清；酶标板中选择一行作为对照组，每孔加入100 μL稀释后的对照组血清；酶标板中最好一行作为空白对照，不加稀释血清，而加的PBS缓冲溶液，加入量为100μL/孔，室温孵育1 h；
（5）弃去检测样品后，用洗涤液以每孔每次200 μL的量洗3次；用稀释液将生物素标记的On_2B5抗体稀释为1 μg/mL，获得生物标记抗体稀释液；每孔加入50 μL生物标记抗体稀释液，室温孵育1 h；
（6）弃去酶标板中的液体后，用洗涤液以每孔每次200 μL的量洗3次；将加用稀释液稀释后的HRP标记的链霉亲和素（购买自Biotech公司），1:1000稀释，50 μL每孔，室温孵育1 h；
（7）弃去HRP标记的链霉亲和素后，用洗涤液200 μL每孔洗3次，每孔加入100 μLTMB显色液（TMB浓度为10 mg/mL，0.11 M柠檬酸钠缓冲液 pH 5.5，显色液为0.1 mL TMB +9.9 mL 柠檬酸钠缓冲液 +5 μL 0.03% H2O2 at 30%，现配现用），室温避光反应30 min；
（8）每孔加入50 μL反应终止液（2 M H2SO4)，加入后将酶标板放至酶标仪，于450nm波长下检测吸光值。
在本效果例的步骤（3）至步骤（8）中，洗涤液为含0.1% Tween-20及0.1%BSA的PBS缓冲溶液；稀释液为含1%BSA的PBS缓冲溶液。
ELISA检测样品结果如图6所示。如图6所示，感染杀鱼爱德华氏菌后同样出现抗FliC杀鱼爱德华氏菌特异性抗体。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，于2023年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023170。
2.一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO：C2023170的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测罗非鱼免疫球蛋白IgM产品中的应用。
4.一种用于罗非鱼检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求2所述的单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用的检测方法包括流式细胞术、酶联免疫法、蛋白质印迹法、间接免疫荧光法中的至少一种。
6.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测抗无乳链球菌IgM抗体产品中的应用。
7.一种如权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测抗杀鱼爱德华氏菌IgM抗体产品中的应用。
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