CN103819557B

CN103819557B - 一种阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103819557B
Application number: CN201410089162.7A
Authority: CN
Inventors: 陆兆新; 李远宏; 陈启明; 曹林; 吕凤霞; 别小妹
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2034-03-12
Also published as: CN103819557A

Abstract

本发明公开了一种阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体及其制备方法与应用，抗体针对的抗原为阪崎肠杆菌外膜蛋白A（Outer？Membrane？Protein？A，OmpA）；本发明提供了针对OmpA抗原的多克隆抗体为基础研制的检测阪崎肠杆菌的酶联免疫检测试剂盒和免疫磁珠-PCR检测试剂盒。本发明提供的阪崎肠杆菌的酶联免疫检测试剂盒和免疫磁珠-PCR检测试剂盒可用于食品、临床及环境检测领域中阪崎肠杆菌的免疫学检测，具有精确性高、灵敏度高、操作简便、处理量大等特点，适合大量样本的筛查。

Description

一种阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及食源性病原微生物检测领域中的多克隆抗体的制备与应用，具体涉及一种阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

阪崎肠杆菌（Enterobactersakazakii）是一类周生鞭毛、能运动、无芽孢的革兰阴性细菌，在一定条件下可引起人和动物致病。阪崎肠杆菌原称黄色阴沟杆菌(YellowPigmentedEnterobactercloacae)，2008年Iverson依据生理生化特性将该菌划分为一个新的属——克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）。目前国际上公认的克罗诺杆菌属细菌共有7个种，包括C.sakazakii、C.malonaticus、C.dublinensis、C.muytjensii、C.turicensis、C.condimenti和C.universalis等，其中C.sakazakii、C.malonaticus和C.turicensis与新生儿致病密切相关。

阪崎肠杆菌能引起各年龄段人群的感染，特别是新生儿、婴幼儿及免疫力低下的人群。因能引起严重的新生儿脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎，并可能遗留严重的神经系统后遗症，死亡率高达40%-80%。2002年国际食品微生物标准化委员会把阪崎肠杆菌列为“严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的一种致病菌。阪崎肠杆菌的外膜蛋白A（OutermembraneproteinA，OmpA）在遗传上具有较高的保守性，并且暴露于菌体表面，具有高的免疫原性，不仅可激发机体的体液免疫，而且还可诱导细胞介导的免疫应答，因而可作为一种良好的免疫原。

目前，国内外检测阪崎肠杆菌的方法有生理生化鉴定和分子生物学检测法。微生物快速检测技术是食源性致病菌检测方法的发展趋势，其中基于抗原抗体反应的免疫学检测技术具有良好的发展前景。酶联免疫吸附检测方法(Enzyme-linkedimmuosorbentassay，ELISA)是目前免疫学检测方法中应用最为广泛，技术最为成熟的方法。然而，目前尚未有针对阪崎肠杆菌开发的ELISA检测试剂盒，因此迫切需要一种能够应用于食品安全检测领域中的阪崎肠杆菌ELISA检测试剂盒。此外，免疫磁珠富集技术在食源性致病菌快速检测领域中的发展迅速。免疫磁珠富集技术能够从环境、临床和食品样品中富集致病菌等病原体，提供灵敏、快速、有效的富集分离方法，具有广阔的发展前景。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体，并基于该抗体设计出了阪崎肠杆菌ELISA检测试剂盒和免疫磁珠-PCR检测试剂盒，用于检测样本中是否存在阪崎肠杆菌。

技术方案

一种阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体，所述多克隆抗体为将阪崎肠杆菌标准菌株C.sakazakiiATCC29544的基因片段扩增，酶切，构建到表达载体pET-32a（+）中，得到重组质粒pET32a（+）-OmpA，再将重组质粒转化到大肠杆菌中，培养、诱导筛选得到正确表达的重组质粒pET-32a（+）-OmpA，再将该重组质粒转化大肠杆菌BL₂₁(DE3)感受态细胞，培养、诱导表达，鉴定分离纯化得到重组OmpA蛋白，将该蛋白免疫动物而获得。

一种以上所述的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体的制备方法，采用如下步骤进行：

步骤一，扩增阪崎肠杆菌标准菌株C.sakazakiiATCC29544的基因片段；

步骤二，用连接酶将步骤一扩增得到产物与pMD19-T克隆载体进行连接，得到pMD19-T-OmpA重组质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，培养并诱导筛选得到正确的pMD19-T-OmpA重组质粒；

步骤三，将步骤二筛选得到的正确的pMD19-T-OmpA重组质粒酶切后回收目的片段，构建到表达载体pET-32a（+）中，得到重组表达质粒pET32a（+）-OmpA，转化大肠杆菌感受态细胞，培养并筛选鉴定得到含有正确重组质粒的大肠杆菌菌株；

步骤四，将步骤三鉴定得到的正确的重组表达质粒pET-32a（+）-OmpA转化宿主菌大肠杆菌BL₂₁(DE3)感受态细胞，于LB培养基中进行培养，诱导表达，鉴定后进行分离纯化，得到重组OmpA蛋白；

步骤五，将步骤四得到的重组OmpA蛋白进行动物免疫试验，经特异性验证，分离纯化抗血清，得到阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体。

所述的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体的制备方法，步骤一中扩增阪崎肠杆菌OmpA的基因片段的引物对可以为OmpA-SF和OmpA-SR，其中OmpA-SF为SEQIDNO.1所示，OmpA-SR为SEQIDNO.2所示。

所述的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体的制备方法，步骤二中所述大肠杆菌感受态细胞优选为大肠杆菌DH5α感受态细胞；所述连接酶优选为T4DNA连接酶，培养并诱导筛选的过程优选为将扩增得到的核酸片段pMD19-T克隆载体于16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有X-Gal、IPTG、含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，倒置，37℃培养过夜，挑取白色菌落于含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基，振荡培养，提取质粒，对重组质粒分别进行酶切鉴定和PCR鉴定，将筛选出的阳性克隆进行测序分析，测序正确的即为所需重组质粒。

所述的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体的制备方法，所述大肠杆菌感受态细胞优选为大肠杆菌DH5α感受态细胞；培养并筛选鉴定过程可以为将转化后的大肠杆菌涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，倒置，37℃培养过夜，挑取阳性克隆接种于50mL含50μg/mLAmp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，收集细菌提取质粒，进行PCR及双酶切鉴定，得到含有正确重组质粒的大肠杆菌菌株。

所述的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体的制备方法，步骤五中动物免疫试验的过程可以为以步骤四纯化得到的蛋白为免疫原，对成年雌性新西兰大白兔采用6点皮下注射法进行免疫，免疫前1周取新西兰大白兔耳缘静脉血，分离血清作为阴性对照，每次免疫时取免疫原与等量的弗氏佐剂制成混合乳化剂，首次免疫后分别于第14、28和42天再加强免疫一次，免疫剂量为1.0mL/次，免疫过程中，定期从免疫兔子的耳缘静脉采血，分离血清，检测血清中抗体效价。

一种阪崎肠杆菌免疫检测试剂盒，含有以上所述的阪崎肠杆菌多克隆抗体。

一种阪崎肠杆菌免疫磁珠-PCR检测试剂盒，含有以上所述的阪崎肠杆菌多克隆抗体。

以上所述的阪崎肠杆菌免疫检测试剂盒在检测阪崎肠杆菌中的用途。

以上所述的阪崎肠杆菌免疫磁珠-PCR检测试剂盒在检测阪崎肠杆菌中的用途。

有益效果

本发明以阪崎肠杆菌OmpA为抗原通过基因克隆以及动物免疫的方法筛选并分离纯化出阪崎肠杆菌OmpA的多克隆抗体，并且利用该抗体设计出了阪崎肠杆菌ELISA检测试剂盒和免疫磁珠-PCR检测试剂盒。

本发明制备的阪崎肠杆菌OmpA抗原的多克隆抗体特异性强，纯度及效价高（大于1.1×10⁵），可长期保存，适用于阪崎肠杆菌的免疫学检测。

本发明提供的阪崎肠杆菌酶联免疫检测试剂盒和免疫磁珠-PCR检测试剂盒，操作简便，处理量大，适合大量样本的筛查，可以明显的缩短检测周期，提高检测效率。将其应用于食品及环境检测领域中阪崎肠杆菌的免疫检测，将具有精确性高、灵敏度高等特点，因而具有应用广阔的前景。

附图说明

图1为OmpA基因PCR产物电泳图谱，其中M为1kbDNA梯度条带；1和2为PCR扩增的目标片段。

图2为重组OmpA蛋白亲和层析图谱。

图3为表达产物的SDS-PAGE分析，其中，M为蛋白marker；1为不含pET-32a的大肠杆菌BL₂₁(DE3)诱导表达的全菌总蛋白（空载体诱导表达）；2为含pET-32a的重组大肠杆菌IPTG诱导的全菌总蛋白；3为重组菌诱导表达0h细胞破碎液上清；4为重组菌诱导表达16h细胞破碎液上清；5-9为重组菌诱导表达16h后细胞破碎液上清，分别对应图3中收集到的1、2、3、4、5号样品。

图4为阪崎肠杆菌多克隆抗体亲和层析图谱。

图5为亲和层析纯化阪崎肠杆菌多克隆抗体的SDS-PAGE分析图，其中M为蛋白marker；P为亲和层析纯化阪崎肠杆菌多克隆抗体。

图6为免疫磁珠-PCR检测婴幼儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌，其中M为蛋白marker；P为阳性菌株对照(C.sakazakiiATCC29544)；N为阴性对照（ddH₂O）；1-15为婴幼儿配方奶粉样本。

具体实施方式

实施例1

阪崎肠杆菌OmpA原核表达载体的构建及其蛋白的分离纯化

1.目的基因OmpA的扩增

参照GenBank中公布的阪崎肠杆菌OmpA的核苷酸序列（GQ845410.1）设计引物OmpA-SF（CCGGAATTCCGGATGAAAAAGACGGCTATC下划线部分为EcoRⅠ位点，SEQIDNO.1）和OmpA-SR（CCCAAGCTTGGGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTAC下划线部分为HindⅢ,SEQIDNO.2）扩增OmpA基因。

以阪崎肠杆菌标准菌株C.sakazakiiATCC29544的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：10×pfuBuffer（含15mMMg²⁺）5μL，dNTP（2.5μM）4μL，引物OmpA-SF（2.5μM）2μL，引物OmpA-SR（2.5μM）2μL，DNA模板1μL，pfu（2.5U/μL）1μL，加ddH₂O补齐至50μL。PCR反应条件是：预变性94℃，3min；变性温度94℃，40s；退火温度55℃，50s；延伸温度72℃，2min；35个循环后，72℃延伸10min。OmpA基因的PCR扩增PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，并回收产物。PCR产物电泳图谱如图1所示，可以看出在1kb左右有一条清晰、单一的电泳条带，表明用本发明方法可以将阪崎肠杆菌OmpA基因扩增出来。

2.目的基因的克隆与测序

用T4DNA连接酶将PCR产物与pMD19-T克隆载体于16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素（含50μg/mLAmp）的LB平板上，倒置，37℃培养过夜。次日挑取白色菌落于液体LB培养基（含50μg/mLAmp），振荡培养，提取质粒。对重组质粒分别进行酶切鉴定和PCR鉴定，将鉴定出的阳性克隆进行测序分析，筛选得到正确的pMD19-T-OmpA重组质粒。

3.重组表达载体的构建和鉴定

经筛选得到的pMD19-T-OmpA重组质粒经EcoRⅠ/HindⅢ双酶切后回收目的片段，并与表达载体pET-32a（+）于16℃连接过夜，构建重组表达质粒pET32a（+）-OmpA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于氨苄青霉素的LB平板上（含50μg/mLAmp），倒置，37℃培养过夜。挑取阳性克隆接种于50mLLB培养基中（含50μg/mLAmp）37℃振荡培养过夜，收集细菌提取质粒，进行PCR及双酶切鉴定，得到含有正确重组质粒的大肠杆菌菌株。

4.重组蛋白的诱导表达及鉴定

将鉴定得到的重组表达载体pET-32a（+）-OmpA转化宿主菌大肠杆菌BL₂₁(DE3)感受态细胞，涂布于Amp的LB平板上（含50μg/mLAmp），倒置，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于液体LB培养基中（含有葡萄糖0.2%（w/v），Amp50μg/mL），30℃100r/min培养过夜。取5mL种子液接种到100mL新鲜液体LB培养基中（含有葡萄糖0.2%（w/v），Amp100μg/mL），37℃180r/min至OD₆₀₀值约为0.6时，加IPTG至终浓度为1mM，在16℃条件下，诱导15h左右。同时设阴性对照，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。阳性菌株进行大量诱导，超声裂解破碎后，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE，对融合蛋白进行可溶性分析。可溶性分析证实大肠杆菌BL₂₁（DE3）表达的OmpA蛋白部分可溶性表达，SDS-PAGE分析表明在上清和沉淀均含有重组蛋白。为了保证重组蛋白的生物学活性，后续试验中纯化了细胞破碎液上清液中的重组蛋白。

5.阪崎肠杆菌OmpA的分离与纯化

将诱导表达后10~18h后的菌液离心后，菌体用结合缓冲液重悬，超声碎菌体后取上清，用GEHealthcare公司的HistrapHP亲和层析柱纯化，并采用GE公司的Akta快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化重组蛋白。用起始结合缓冲液A以1.00mL/min的流速将HisTrapHP柱平衡5min，上样1-50mL，结合洗脱缓冲液B，采用等度洗脱的方式将重组OmpA蛋白洗脱下来。洗脱程序如表1所示。重组OmpA蛋白的亲和层析图谱结果如图2所示，主要有2个洗脱蛋白峰。收集不同洗脱浓度的洗脱液，将洗脱液进行SDS-PAGE分析。结果发现重组OmpA主要集中在第2个洗脱峰，即当洗脱缓冲液A为20%，洗脱缓冲液B为80%时，重组OmpA被大量洗脱下来。洗脱峰2的SDS-PAGE分析结果如图3所示，结果表明亲和层析纯化后获得了纯度较高的重组OmpA蛋白。通过考马斯亮蓝比色法测定亲和层析纯化后的重组OmpA蛋白，然后将浓度较高的重组OmpA蛋白收集合并，再经HiTrapDesalting脱盐柱脱盐和30KDa超滤管浓缩后保存于-20℃备用。

表1.镍柱亲和层析洗脱程序

洗脱浓度（mM）	柱体积（CV）	B%
			10	5	0
40	5	10
			250	5	80
300	5	100

所述的结合缓冲液（A）为20mMPBS，0.5MNaCl，10mM咪唑，pH8.0；所述的洗脱缓冲液（B）为20mMPBS，0.5MNaCl，300mM咪唑，pH8.0。

实施例2

阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体的制备：

1.动物免疫

以纯化的阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA（2.0mg/mL）为免疫原，对6只成年雌性新西兰大白兔采用6点皮下注射法（靠近淋巴结的腋下、背部、腹股沟各两侧）进行免疫。免疫前1周取新西兰大白兔耳缘静脉血，分离血清作为阴性对照（Neg）。每次免疫时取免疫原与等量的弗氏佐剂制成混合乳化剂，首次免疫后分别于第14、28和42天再加强免疫一次，免疫剂量为1.0mL/次，免疫方案见表2。免疫过程中，定期从免疫兔子的耳缘静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法检测血清中抗体效价。

表2.免疫方案

免疫时间（d）	免疫剂量（mL）	佐剂类型及添加量（mL）
			1	1.0	1.0完全弗氏佐剂
14	1.0	1.0不完全弗氏佐剂
			28	1.0	1.0不完全弗氏佐剂
42	1.0	1.0不完全弗氏佐剂

2.效价测定

间接ELISA检测抗血清效价

多抗血清采用间接ELISA方法检测，以l0⁷CFU/mL热灭活抗原包被酶标板，按照间接ELISA方法检测血清抗体效价，阴性对照用兔正常血清，根据反应结果确定抗体的效价。

（1）包被：用0.05MpH9.6的碳酸氢钠缓冲溶液将阪崎肠杆菌全菌体抗原稀释成l0⁷cfu/mL包被96孔板，每孔包被量为100μL，4℃过夜。

（2）封闭：用PBST洗涤液（内含0.05%Tween-20的0.01MpH7.4磷酸盐缓冲溶液）洗涤酶标板3次，每次3min，再添加封闭液（质量浓度为1%的BSA）100μL，37℃温育2h。

（3）加抗体：以PBST洗涤液洗涤酶标板3次，每次3min，然后将倍比稀释的血清分别用抗体稀释液做1:1000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、l:160000、l:320000、l:640000倍稀释，横排加到酶标板中每孔100μL，正常兔血清同样倍数稀释作为阴性对照，一排加PBS做空白对照，37℃温育lh。

（4）加酶标二抗：以PBST洗涤液洗涤酶标板3次，每次3min，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体，每孔100μL，37℃温育lh。

（5）加显色底物溶液：以PBST洗涤液洗涤酶标板3次，每次3min，再加入TMB底物溶液（购自invitrogen公司）100μL，室温避光反应5min。

（6）终止反应及OD₄₅₀值测定:每孔滴加50μL终止液（2MH₂SO₄）终止反应，酶标仪测定450nm下的吸光值。（效价判定：在一定条件下，抗血清经过一系列稀释与定量的抗原反应，当阳性血清吸光值大于2.1倍阴性血清的对照吸光值时血清的稀释倍数）。

3.免疫血清特异性验证

（1）间接ELISA法

以热灭活方法处理粘质沙雷氏菌、肠炎沙门氏菌、凝结芽抱杆菌、金黄葡萄球菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌BL₂₁（DE3），大肠杆菌DH5α包被酶标板，运用间接ELISA方法检测，每种菌做3个重复，同时设置阴性对照（未经免疫的新西兰大白兔血清，Neg）和阳性对照（经ATCC29544OmpA抗原免疫的新西兰大白兔血清）。结果粘质沙雷氏菌、肠炎沙门氏菌、凝结芽抱杆菌、金黄葡萄球菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌DH5α的OD值均小于0.4，为阴性。大肠杆菌BL₂₁（DE3）OD值为0.450，有微弱的交叉反应，说明制备的阪崎肠杆菌的特异性较高。

（2）凝集试验

分别吸取20μL生理盐水、1:16阪崎肠杆菌免疫血清，1:32阪崎肠杆菌免疫血清置于载玻片不同区域，再分别加入粘质沙雷氏菌、肠炎沙门氏菌、凝结芽抱杆菌、金黄葡萄球菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌BL₂₁（DE3）、大肠杆菌DH5α和阪崎肠杆菌菌液20μL置于上述载玻片上，静置5~10min，观察是否有小凝块形成。

表3.阪崎肠杆菌免疫血清玻片凝集试验

菌株	来源	1:16	1:32
				粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)	CICC 10187	-	-
肠炎沙门氏菌 (Salmonella enteritidis)	CICC 21482	-	-
				凝结芽孢杆菌 (Bacillus coagulans)	CICC 20139	-	-
金黄葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)	AS 1.2465	-	-
				藤黄微球菌(Micrococcus aureus)	AS1.191	-	-
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)	AS1.1846	-	-
				阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)	ATCC 13047	-	-
大肠杆菌（Escherichia coli BL₂₁（DE3））	实验室保存	+	-
				大肠杆菌（Escherichia coli DH5α）	实验室保存	+	-
阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)	ATCC 29544	++	++
				阪崎肠杆菌(Cronobacter muytjensii)	ATCC 51329	++	++

注：“++”反应强度高；“+”反应强度较弱；“-”无法观测到凝结反应。

实验结果表明，本发明制备的阪崎肠杆菌多克隆抗体和常见的食源性病原微生物交叉反应不明显，说明该抗体具有较高的特异性，具备作为检测阪崎肠杆菌用检测抗体的潜力。

4.抗血清的分离及纯化

（1）分离：当免疫兔子抗体效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血，取血后在室温放置约2h使其凝固，转移到4℃沉淀过夜，第二天早上离心，10000g，10分钟，取上清分装。在血清中加入NaN₃至终浓度0.02%，分装后-20℃保存。

（2）硫酸铵法盐析沉淀法进行初步分离纯化

a．取抗血清样品10mL，加入10mLPBS缓冲液，于冰上用玻璃棒轻轻搅拌，缓慢、逐滴加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液20mL，使饱和硫酸铵溶液终浓度变为原来的50%，然后于4℃层析柜中静置12h。

b．4℃，10000g离心10min，弃上清，将沉淀物用12mLPBS溶液溶解，缓慢、逐滴加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液8mL，使饱和硫酸铵溶液终浓度变为原来的40%，然后于4℃层析柜中静置1h。

c．再次于4℃，10000g离心10min，弃上清，将沉淀物用13.4mLPBS溶液溶解，缓慢、逐滴加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液6.6mL，使饱和硫酸铵溶液终浓度变为原来的33%，然后于4℃层析柜中静置1h。

d．4℃，10000g离心10min，将沉淀用PBS溶液溶解，装入透析袋中。

e．于4℃层析柜中，用PBS进行透析，每隔2~3h换液一次，直至用BaCl₂检测透析液无白色沉淀为止。

（3）亲和层析法纯化抗体

采用GE公司的Akta快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化系统对上述步骤中获得的多克隆抗体做进一步分离纯化，纯化用购自GE公司的亲和层析柱（HiTrapproteinGHP）具体步骤如下：

a.准备收集管：向待收集部分加入100μLpH9.0的1mol/LTris-HCl。

b.纯化流程：首先用0.02mol/LpH7.6的磷酸缓冲液（10CV）平衡ProteinG亲和层析柱（1mLHiTrapProteinGHP），然后用注射器吸取2~20mL经饱和硫酸铵盐析的样品，通过加样环上样，流速为0.5mL/min，待样品完全进入层析柱后以同样的流速用0.02mol/LpH7.6的磷酸缓冲液（5~10CV）洗脱杂蛋白，杂蛋白洗脱完后再用0.1mol/LpH2.7的甘氨酸盐酸缓冲液（2~5CV）洗脱，流速为1mL/min，每管1mL收集洗脱液。经UV280nm检测收集到的第2个洗脱峰即为纯化的多抗。亲和层析图谱如图4所示。将亲和层析后将纯化的多克隆抗体通过30Kda的超滤管脱盐浓缩后，与等体积的甘油混匀，-20℃保存备用。

5.阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体检测

（1）蛋白含量测定

BCA法测定：使用酶标仪在562nm下测定本发明方法制备的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体的蛋白质含量，结果亲和层析法纯化后的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体含量为2.0g/mL。

（2）SDS-PAGE电泳检测

对本发明方法制备的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图5所示，约在60KD，25KD有两条清晰的条带，分别为轻、重链的特异条带，IgG分子量大约170KD。

实施例3

阪崎肠杆菌酶联免疫试剂盒及应用

以市售婴幼儿配方奶粉为例，用本发明组建的阪崎肠杆菌的酶联免疫试剂盒对食品中的阪崎肠杆菌进行检测。

一种检测阪崎肠杆菌的ELISA试剂盒，具体组分如下：

（1）包被有阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体的酶标板；

（2）辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体工作液；

（3）阪崎肠杆菌标准品溶液（浓度分别为10⁹CFU/mL、10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、0CFU/mL）；

（4）洗涤液（含有0.1%吐温20、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液）；

（5）底物显色液由A液（30%H₂O₂）和B液组成（质量浓度为1%的3,3',5,5'-四甲基苯丙胺溶液）。

（6）终止液（2MH₂SO₄溶液）。

具体步骤如下：

（1）取检样10g加入已预热至44℃装有90mLNB的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，37℃培养8h。

（2）设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品100μL；

（3）待测样本孔先加待测样本100μL，空白孔加入洗涤液100μL；

（4）随后每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，37℃水温育1h。

（5）洗涤液洗涤酶标板3次，每次3min。

（6）每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育10min。

（7）每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的吸光值。

（8）结果判定：绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

结果OD₄₅₀值为0.984，对照已知浓度的阪崎肠杆菌标准品绘制的标准曲线，样本中阪崎肠杆菌浓度约为10⁸CFU/mL，表明本发明提供的阪崎肠杆菌酶联免疫试剂盒可用于食品中阪崎肠杆菌的检测。

实施例4

阪崎肠杆菌免疫磁珠-PCR检测试剂盒及应用

以市售婴幼儿配方奶粉为例，用本发明组建的阪崎肠杆菌免疫磁珠-PCR检测试剂盒对食品中的阪崎肠杆菌进行检测

一种检测阪崎肠杆菌的免疫磁珠-PCR检测试剂盒，包括如下组分：

（1）阪崎肠杆菌免疫磁珠；

（2）特异性引物Esakr（SEQIDNO.3），Esakf（SEQIDNO.4）；

其中阪崎肠杆菌免疫磁珠液为在30~37℃条件下，取浓度为5~50μg/mL的阪崎肠杆菌多克隆抗体与一定量的磁珠偶联6~12h，得到阪崎肠杆菌免疫磁珠。

具体步骤如下：

（1）样品处理

取检样10g加入至装有90mLNB的锥形瓶中，轻轻摇动使其充分溶解，37℃条件下增菌培养8h。对于不能充分溶解混匀的样品用研钵研磨制成悬液。

（2）免疫磁珠捕获与分离

取20μL免疫磁珠液至1.5mL灭菌的离心管中，再加入100μL上述样品增菌培养液，充分混匀后于37℃，180r/min条件下震荡孵育30min，使阪崎肠杆菌与免疫磁珠充分接触。经孵育30min后，将离心管置于磁力架上静置2min，吸取上清液；然后加入1mL含0.85%NaCl（m/v）、0.5%BSA（m/v）的0.01MpH7.4的PBS缓冲液重悬洗涤免疫磁珠，再将离心管置于磁力架上静置2min，吸取上清液；重复洗涤3次后，加入100μL灭菌生理盐水重悬免疫磁珠。

（3）PCR检测食品样品中的克罗诺杆菌

取2μL免疫磁珠液作为模板进行PCR反应，检测样品中的克罗诺杆菌。阳性对照为经8h增菌培养的阪崎克罗诺杆菌ATCC29544菌液与免疫磁珠作用30min捕获分离的免疫磁珠液。阴性对照为不含模板DNA的ddH2O。PCR反应体系：2×PCRmix12.5μL，引物Esakr（SEQIDNO.3），（2.5μM）1μL，Esakf（SEQIDNO.4），（2.5μM）1μL，磁珠液5μL，Taq（1U/μL）1μL，加ddH2O补齐至25μL。反应条件：预变性94℃，2min；变性温度94℃，30s；退火温度58℃，40s；延伸温度72℃，1min；30个循环后，72℃延伸7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统下观察并拍照记录结果。

（4）结果判定

若样品PCR产物电泳出现929bp的扩增条带，同时阳性对照扩增出目的产物，而空白对照未扩增出目的片段，判定结果阳性；PCR扩增产物电泳无目的扩增条带，且阳性对照扩增产物电泳后出现目的片段，空白对照扩增产物电泳后没有出现目的片段，判定结果阴性。

实验结果表明：利用阪崎肠杆菌免疫磁珠-PCR检测试剂盒对15份婴幼儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌进行检测，阳性对照在929bp处扩增出特异性片段，而阴性对照未扩增出特异性条带，同时发现1份阳性样本（图6），14份阴性样本，整个免疫磁珠-PCR检测周期约为12h，准确率为100%。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体及其制备方法与应用

<130>1

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccggaattccggatgaaaaagacggctatc30

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cccaagcttgggttaagcctgcggctgagttac33

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gctytgctgacgagtggcgg20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atctctgcaggattctctgg20

Claims

1.一种阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体为将阪崎肠杆菌标准菌株C.sakazakiiATCC29544的基因片段扩增，酶切，构建到表达载体pET-32a（+）中，得到重组质粒pET32a（+）-OmpA，再将重组质粒转化到大肠杆菌中，培养、诱导筛选得到正确表达的重组质粒pET-32a（+）-OmpA，再将该重组质粒转化大肠杆菌BL₂₁(DE3)感受态细胞，培养、诱导表达，鉴定分离纯化得到重组OmpA蛋白，将该蛋白免疫动物而获得；

具体制备方法如下：

步骤一，通过引物OmpA-SF：CCGGAATTCCGGATGAAAAAGACGGCTATC和OmpA-SR：CCCAAGCTTGGGTTAAGCCTGCGGCTGAGTTAC扩增阪崎肠杆菌标准菌株C.sakazakiiATCC29544的基因片段；

2.根据权利要求1所述的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体，其特征在于，制备方法步骤二中所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞；所述连接酶为T4DNA连接酶，培养并诱导筛选的过程为将扩增得到的核酸片段pMD19-T克隆载体于16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有X-Gal、IPTG、含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，倒置，37℃培养过夜，挑取白色菌落于含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基，振荡培养，提取质粒，对重组质粒分别进行酶切鉴定和PCR鉴定，将筛选出的阳性克隆进行测序分析，测序正确的即为所需重组质粒。

3.根据权利要求1所述的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体，其特征在于，制备方法步骤三中所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞；培养并筛选鉴定过程为将转化后的大肠杆菌涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，倒置，37℃培养过夜，挑取阳性克隆接种于50mL含50μg/mLAmp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，收集细菌提取质粒，进行PCR及双酶切鉴定，得到含有正确重组质粒的大肠杆菌菌株。

4.根据权利要求1所述的阪崎肠杆菌OmpA多克隆抗体，其特征在于，制备方法步骤五中动物免疫试验的过程为以步骤四纯化得到的蛋白为免疫原，对成年雌性新西兰大白兔采用6点皮下注射法进行免疫，免疫前1周取新西兰大白兔耳缘静脉血，分离血清作为阴性对照，每次免疫时取免疫原与等量的弗氏佐剂制成混合乳化剂，首次免疫后分别于第14、28和42天再加强免疫一次，免疫剂量为1.0mL/次，免疫过程中，定期从免疫兔子的耳缘静脉采血，分离血清，检测血清中抗体效价。

5.一种阪崎肠杆菌免疫检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的阪崎肠杆菌多克隆抗体。

6.一种阪崎肠杆菌免疫磁珠-PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的阪崎肠杆菌多克隆抗体。

7.权利要求5所述的阪崎肠杆菌免疫检测试剂盒在检测阪崎肠杆菌中的用途。

8.权利要求6所述的阪崎肠杆菌免疫磁珠-PCR检测试剂盒在检测阪崎肠杆菌中的用途。