CN111471695A - 牛支原体免疫磁珠的制备方法 - Google Patents

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马红霞
翟志超
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Abstract

本发明公开了一种牛支原体P48基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种牛支原体P48抗原蛋白，它是由所述的一种牛支原体P48基因表达的蛋白；一种抗牛支原体多克隆抗体，它是以上述的一种牛支原体P48抗原蛋白为抗原制备的多克隆抗体；一种抗牛支原体免疫磁珠的制备方法；结果表明，1）NHS磁性微球在偶联缓冲液为2‑吗啉乙磺酸（MES）、抗体浓度为200μg/mL时抗体的偶联效率最高；2）所制备免疫磁珠在15min之内能够富集到牛支原体，最低富集浓度分别为菌浓度为10‑3CCU/mL，具有良好的特异性和灵敏性。

Description

牛支原体免疫磁珠的制备方法
技术领域
本发明属于免疫磁珠制备技术领域，具体涉及牛支原体免疫磁珠的制备方法。
背景技术
牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）属于原核生物界（Prokaryotes），柔壁菌门（Periphyta）柔膜体纲（Choroids）支原体目（Mycoplasma）支原体科（Mycoplasmaceae），其在支原体属中属于致病性较强的物种之一我国在1983由黎济申首次报道从牛乳分离出牛支原体后，此后2008年，辛九庆等首次从患有牛肺炎的肺脏中分离得到该病原微生物。牛支原体能够引起牛的肺炎、乳腺炎、关节炎、生殖器官和角膜炎等疾病，其引发的疾病多发生于经长途运输的育肥架子牛，给我国畜牧养殖业造成了较严重的经济损失。
由于牛支原体为苛养菌，对其分离培样时，极为耗时，不利于临床的诊断和治疗。对于牛支原体的病原学诊断包括病原的分离鉴定，其可以作为权威的诊断方法。但是病原的分离鉴定方法极为严格且分离难度大，周期长，不适合作为快速诊断的牛支原体的方法，主要是因为将患病组织接种于固体培养基上，培养数天。牛支原体血清学检测主要测定是体内抗体的含量来进行诊断的，Ball等创建的夹心ELISA诊断技术，目前已经成为商品化的诊断技术。
对于病原微生物的分离检测来说，常规的方法对于一些病原微生物来说存在一定的难度，且耗时较长，但是免疫磁珠技术具有灵敏性高、快速和特异性好的优点，因此其能够快速的从复杂的背景中将病原微生物分离出来，提高对目标物的检出率，大大的缩短检测时间。这相对于常规的分离检测来说，免疫磁珠技术主要缩短了对病原菌的前期处理的时间。因此，在国内外有许多学者都利用免疫磁珠应用于病原微生物的分离。
免疫磁珠不仅能应用于细胞和病原微生物领域，还有其他领域：核酸的分离纯化、蛋白质的分离纯化、靶向药物等领域。除此之外免疫磁珠技术还能与其他技术结合能够提高检测效率和检测限：免疫磁珠技术和PCR技术、电化学技术、ATP生物发光技术，ELISA技术等。而利用免疫磁珠对蛋白质的分离纯化则是因为免疫磁珠具有比表面积大，偶联容量大的特点，且能够与目标蛋白质发生可逆行的结合。与常规的蛋白质分离机相比较而言，其具有简便、蛋白损耗少的特点。
发明内容
本发明目的是为解决牛支原体检测时间长、检出率低的问题，而提供牛支原体免疫磁珠的制备方法。
一种牛支原体P48基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
一种牛支原体P48抗原蛋白，它是由上述的一种牛支原体P48基因表达的蛋白。
一种抗牛支原体多克隆抗体，它是以上述的一种牛支原体P48抗原蛋白为抗原制备的多克隆抗体。
一种抗牛支原体免疫磁珠的制备方法，它包括：
1）蛋白溶液的配制:取上述的抗牛支原体多克隆抗体用MES缓冲液溶解，配成浓度为1mg/mL的蛋白溶液；将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用；
2）取50 μL磁珠于1.5 mL离心管中；
3）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；
4）加1 mL 2~8ºC的预冷的 Washing Buffer A于1.5 mL 离心管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀；
5）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；
6）加500 μL蛋白溶液于离心管中，涡旋30 s，使其混合均匀；
7）将离心管管涡旋15 s，反应前30 min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2 h；
8）采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；
9）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；
10）重复“步骤 9”操作四次；
11）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管管涡旋15 s，反应前30min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2h；
12）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；
13）加1 mL超纯水于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；
14）加1 mL Storage Buffer于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次；
15）加入500 μL Storage Buffer 于离心管中，充分混合，4ºC保存备用。
本发明提供了一种牛支原体P48基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种牛支原体P48抗原蛋白，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；一种抗牛支原体多克隆抗体，它是以上述的一种牛支原体P48抗原蛋白为抗原制备的多克隆抗体；一种抗牛支原体免疫磁珠的制备方法；结果表明，1）NHS磁性微球在偶联缓冲液为2-吗啉乙磺酸（MES）、抗体浓度为200μg/mL时抗体的偶联效率最高；2）所制备免疫磁珠在15min之内能够富集到牛支原体，最低富集浓度分别为菌浓度为10-3CCU/mL，具有良好的特异性和灵敏性。
附图说明
图1 P48基因扩增结果；A：牛支原体P48基因部分片段扩增结果；M：DL1000 DNAMARKER；1-3：分别为牛支原体P48基因扩增的P48-1（279bp）片段、P48-2（487bp）片段、P48-3（609bp）片段；B：牛支原体P48基因部分片段扩增结果；M：DL1000 DNA MARKER；1-2：分别为牛支原体P48基因扩增的P48-4（80bp）片段、P48-5（86bp）片段；C：为牛支原体P48基因全长扩增结果。M：DL1000 DNA MARKER；1：牛支原体P48基因全长（1407bp）；
图2重组质粒pET32a-P48的双酶切鉴定；A：重组质粒pET-32a-P48双酶切结果。M1：DLλHindd III DNA MARKER；M2：DL2000 DNA MARKER；1：双酶切后重组质粒pET-32a-P48结果；2：未双酶切后重组质粒pET-32a-P48结果；
图3 重组P48蛋白表达产物SDS-PAGE分析；A：重组P48蛋白表达产物SDS-PAGE分析。M：低分子量蛋白Maker；1：pET32a空载的表达产物；2：未诱导的BL21（pET32a-P48）菌液；3:诱导的BL21（pET32a-P48）菌液；4：诱导的BL21（pET32a-P48）的上清；5：诱导的BL21（pET32a-P48）的沉淀；
图4 重组P48蛋白纯化SDS-PAGE分析；A：重组P48蛋白纯化SDS-PAGE分析；M：低分子量蛋白Maker；1：穿出产物；2：20mmol洗脱产物；3-5:50mmol洗脱产物；6-7：100mmol洗脱产物；8：200mmol洗脱产物；
图5 多克隆抗体纯化SDS-PAG凝胶电泳分析；M：低分子量蛋白Maker；1：纯化后抗体；
图6 不同偶联缓冲液条件下偶联抗体的浓度；
图7 抗体的偶联率随抗体浓度的变化示意图；
图8免疫磁珠富集牛支原体的PCR扩增结果；A：免疫磁珠富集牛支原体的PCR扩增结果。M：DL2000 DNA MARKER；1-4：免疫磁珠分别富集15min、30min、45min、60min的PCR扩增结果；
图9 免疫磁珠富集牛支原体的特异性的PCR扩增结果；A：免疫磁珠富集牛支原体的PCR结果。M：DL2000 DNA MARKER；1：M.bovis菌液的扩增结果；2：M.bovis和Pm混合菌液的扩增结果；3：M.bovis和salmonella混合菌液的扩增结果；4：M.bovis和E.coli混合菌液的扩增结果；5：M.bovis和T.pyogenes混合菌液的扩增结果；6：M.bovis和S.aureus混合菌液的扩增结果；7：Pm菌液的扩增结果；8：salmonella菌液的扩增结果；9：E.coli菌液的扩增结果；10：T.pyogenes菌液的扩增结果；11：S.aureus菌液的扩增结果；
图10 免疫磁珠富集牛支原体的敏感性的PCR扩增结果；A：免疫磁珠富集牛支原体的敏感性的PCR扩增结果。M：DL2000 DNA MARKER；1-11：各个稀释倍数下的PCR扩增结果，依次分别为稀释100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011。
具体实施方式
实施例1 牛支原体基因的克隆
将设计的引物序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，并添加BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，引物序列见表1所示；以牛支原体基因组为模板进行P48基因的克隆；反应条件见表2；50μL PCR反应体系：
模板DNA 4.0μL
上游引物（20pmol/μL） 1.0μL
下游引物（20pmol/μL） 1.0μL
10×Ex Taq Buffer（Mg2＋Plus） 5.0μL
dNTP Mixture（各 2.5mM） 4.0μL
Ex Taq（5U/μL） 0.6μL
ddH20 34.4μL。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 660194DEST_PATH_IMAGE002
将PCR产物经1%和0.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪检测PCR扩增结结果；用胶回收试剂盒将PCR产物按照胶回收试剂盒说明进行回收，并与pmd-18T载体进行连接，16℃连接过夜，将连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有氨苄抗性的选择性平板上培养12-14h，挑取单个阳性菌落进行PCR扩增，同时提取质粒并进行双酶切验证，将上述正确的菌株，送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。
结果：以牛支原体的基因组为模板，用引物P48-1-R和P48-2-F扩增得到大小为279bp的P48-1片段；用引物P48-2-R和P48-3-F扩增得到大小为487bp的片段P48-2；用引物P48-3-R和P48-4-F扩增得到大小为609bp的P48-3片段，如图1A所示；用引物P48-4-R和P48-5-F扩增得到大小为80bp的P48-4片段；用引物P48-5-R和P48-1-F扩增得到大小为86的P48-5片段。见图1B所示；以A、B、C、D、E为模板，用引物P1和R1扩增得到大小为1407bp的P48基因全长见如图1C所示。
实施例2 牛支原体蛋白的表达载体的构建
对上述测序正确的菌株和含有pET32a（+）空质粒的菌株提取质粒并用BamHⅠ和XhoⅠ两种限制酶进行双酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收牛支原体P48目的基因条带和pET32a（+）空质粒条带；用T4连接酶将P48基因和pET32a（+）载体在16℃条件下进行连接；连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。在含有氨苄抗性的选择性平板上培养12-14h，挑取单个菌落，提取质粒并进行双酶切验证，将上述正确的菌株，送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。
将构建的重组表达质粒pET32a-P48进行双酶切（BamHⅠ和XhoⅠ）验证；将酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，可获得1407bp大小的目的基因条带，如图2所示；表明重组表达质粒构建成功。
实施例3 重组P48蛋白的表达和纯化
将正确的菌株提取质粒并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，在含有氨苄抗性的选择性平板上培养12-14h。选取重组正确的菌株于含有氨苄抗性的LB的液体培养基中，37℃、220r/min培养过夜。将培养过夜的菌液按照1：100的比例接种于300mL的培养基中，培养至菌液OD值达到0.4～0.6，加入终浓度为1mmol/L的ITPG，16℃诱导过夜后，将菌体在8000r/min、4℃条件下，离心10min。菌体用灭菌的PBS洗涤数次后，菌体用20ml的PBS重悬，置于冰上进行超声破碎。之后对破碎产物在12000 r/min、4℃条件下离心。取离心后的上清和沉淀进行SDS聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）蛋白鉴定。将重组菌pET32a-P48在37℃培养至OD值为0.6加入ITPG诱导剂，在16℃条件下培养12h；将菌体离心后重悬进行破碎后吸取上清和沉淀。将诱导前的菌液、诱导后的菌液、上清、沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳分析；表达出大小为62.28KDa的可溶性的重组P48蛋白；如图3所示。
采用同样的方法，对诱导表达的P48蛋白，收集菌体，超声破碎，离心获取上清，之后将上清用0.45μm的滤膜进行抽滤，除去杂质；同时将各种缓冲液（PBS、水及各种浓度的咪唑）也用0.45μm的滤膜进行抽滤；在进行样品上样前，先用平衡缓冲液对镍离子亲和层析柱进行平衡，待平衡后，对样品进行上样，上样结束后，再次用平衡缓冲液对镍柱进行平衡，洗掉未结合在镍柱上的成分，之后用各种不同的咪唑浓度的缓冲液进行洗脱，通过观察紫外吸收峰值，在各梯度下洗脱样品的峰值进行收集，之后将各梯度下的洗脱产物进行SDS聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）蛋白鉴定。
对于可溶性表达的重组P48蛋白采用镍离子亲和柱进行纯化，将菌体破碎后的上清，上样结束后，用PBS缓冲液对镍柱进行平衡，带平衡结束后，按照20mmol咪唑、50mmol咪唑、100mmol咪唑、200mmol咪唑对镍柱进行洗脱，保存各个浓度下的洗脱液，并同时将各梯度下的洗脱产物进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。如图4，可知重组的P48蛋白在200mmol咪唑条件下获得目的蛋白且杂带较少。
实施例4 P48多克隆抗体的制备及纯化
一、制备
将纯化正确的洗脱产物用50KD的超滤管在4000r/min、4℃条件下，对洗脱产物进行离心，待洗脱液全部离尽后，再用PBS缓冲液对超滤管上滤膜的蛋白进行悬浮，之后将浓缩后的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）蛋白鉴定，并同时对浓缩的蛋白采用BCA方法对蛋白进行测定。
新西兰大白兔在进行适应性饲养一周后，用纯化及浓缩后的P48蛋白作为免疫原，对新西兰大白兔进行免疫。采用背部皮下多点免疫的方式进行免疫；每只兔子的免疫剂量为1mg，首免和二免间隔两周，之后每隔一周免疫一次。首免采用完全弗氏佐剂与抗原进行等体积混合乳化的方式进行，之后采用不完全弗氏佐剂与抗原进行等体积混合乳化的方式进行；三免后，耳静脉采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测血清效价；四免结束后，采用将动颈脉取血的方法，获取全部血液，分离血清，并分装-80℃保存。
二、兔多克隆抗体效价的测定
取四免后的兔子血清，采用间接ELISA方法与纯化的P48蛋白进行抗体效价测定；如表3所示，牛支原体P48蛋白的抗体效价达到1：64 000。
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
二、多克隆抗体的纯化及浓度的测定
将获取的血清采用Protien A琼脂糖纯化树脂进行纯化，具体步骤如下所示：
1）样品制备：上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液1:1对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品在结合/洗涤缓冲液中透析过夜；
2）柱和树脂的平衡：用五倍柱体积的结合/洗涤缓冲液进行平衡；
3）样品纯化：将样品加入到平衡好的树脂中，以缓慢流速流出，收集流出液；
4）用10~15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液洗脱非特异性吸附的杂蛋白，收集流出液；
5）用5~10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱蛋白。收集流出液，即目的蛋白组分；
6）依次使用3倍柱体积的结合缓冲液，5倍柱体积的去离子水，5倍柱体积的20%乙醇洗涤树脂。树脂加入相同体积的 20%乙醇，保存在 2~8°C，不要冻存；
7）柱的再生：10 ml洗脱缓冲液洗涤，然后用5 ml结合/洗涤缓冲液平衡，即可再次使用；
用上述方法将所制备的P48的多克隆抗体的血清进行纯化，将纯化出的抗体进行SDS聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）蛋白鉴定，同时对纯化的多可克隆抗体采用BCA的方法进行浓度测定。
结果：将纯化的IgG进行SDS-PAGE凝胶电泳分析其纯度，IgG经SDS-PAGE凝胶电泳后，会发生变性，因此出现两条链，一条重链，大小约为50KDa-70KDa，一条轻链，大小约为25KDa（如图5所示）。
实施例5 牛支原体免疫磁珠的制备
牛支原体免疫磁珠的制备，具体操作步骤如下：
1）蛋白溶液的配制:取适量待偶联蛋白（牛支原体P48多克隆抗体）用Coupling Buffer溶解，配成浓度为0.1-3.0 mg/mL的蛋白溶液。将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用；
2）取50 μL磁珠于1.5 mL离心管中；
3）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；
4）加1 mL 2~8ºC的预冷的 Washing Buffer A于1.5 mL 离心管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀；
5）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；
6）加500 μL蛋白溶液于离心管中，涡旋30 s，使其混合均匀；
7）将离心管管涡旋15 s，反应前30 min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2 h；
8）采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；
9）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；
10）重复“步骤 9”操作四次；
11）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管管涡旋15 s，反应前30min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2h；
12）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；
13）加1 mL超纯水于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；
14）加1 mL Storage Buffer于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次；
15）加入500 μL Storage Buffer 于离心管中，充分混合，4ºC保存备用；
实施例6 免疫磁珠偶联条件优化实验
1、磁性微球偶联抗体的最佳缓冲液的确定
将纯化好的的抗体分别用PBS、MES、NaHCO3和H3BO3溶解稀释；同时将这4种蛋白溶液分别按照实施例5的方法与磁珠进行偶联，待和抗体偶联结束后，将实施例5步骤8）的穿出液，采用BCA的方法进行检测穿出液蛋白浓度。利用间接的方法计算磁珠上偶联的抗体的偶联量：偶联量=偶联前抗体浓度-偶联后抗体浓度。
采用BCA方法对偶联前抗体的浓度进行检测，并将在四种缓冲液（PBS、MES、NaHCO3、H3BO3）下的抗体浓度调整至同一浓度(1mg/mL)；将200μl的抗体与50μl的磁珠缓冲液（磁珠浓度为10mg/mL）进行偶联，待偶联结束后，再次用BCA法对偶联后的抗体浓度进行检测，之后通过抗体的偶联量（偶联前抗体的浓度—偶联后的抗体的浓度）来判断出抗体与磁珠最佳的偶联缓冲液，如图6所示，可知在磁珠缓冲液量为50μl（10mg/mL）、抗体浓度为1mg/mL的条件下，抗体在缓冲液为MES时，磁珠偶联的抗体最多，其中P48蛋白的抗体在50μl（10mg/mL）的偶联抗体的浓度约为400μg/mL。
2、磁性微球偶联抗体的最佳偶联浓度的确定
将筛选出的最佳蛋白溶液按照抗体浓度为50μg /ml、10μg /ml、200μg /ml、400μg /ml、800μg /ml、1600μg /ml、3200μg /ml的浓度分别与磁珠进行偶联，待和抗体偶联结束后，将实施例5步骤8）的穿出液，采用BCA的方法进行检测穿出液蛋白浓度；通过偶联率确定最佳偶联缓冲液：偶联率=（偶联前抗体浓度-偶联后抗体浓度）/偶联前抗体浓度；结果如图7所示。可知抗体在抗体浓度为200μg/mL时，偶联率最高，P48蛋白的抗体偶联率约为70%。
实施例7 免疫磁珠性能的评价
一、免疫磁珠捕获牛支原体时间的确定
将浓度为105CCU/mL的牛支原体的菌液里分别加入已经制备好的免疫磁珠；室温孵育15min、30min、45min、60min；孵育结束后，将含有混合液的离心管置于磁力架上，弃去上清，并用PBS洗涤免疫磁珠3～5次，之后再用50μL的PBS将免疫磁珠悬浮；将悬浮起的免疫磁珠混合液分别加入到牛支原体培养基里培养，通过观察牛支原体的培养基的颜色变化和菌液PCR鉴定两种方式来确定捕获牛支原体的时间；
结果：将富集后的牛支原体培养48h后，观察牛支原体，同时再将颜色变黄的培养基离心富集菌体，以牛支原体基因组为模板，采用PCR对牛支原体的特异性引物oppD/F进行扩增；如图8所示，免疫磁珠在与牛支原体富集15min，富集到菌株即是牛支原体，综合以上两个判定条件，即可判定免疫磁珠在与牛支原体富集15min，就能富集到牛支原体。
二、免疫磁珠的特异性的确定
在浓度为105CCU/ml的牛支原体中，分别加入培养好大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌和巴氏杆菌；在上述混合菌液里分别加入已将制备好的免疫磁珠，室温孵育后，将含有混合液的离心管置于磁力架上，弃去上清，并用PBS洗涤免疫磁珠3～5次，之后再用50μL的PBS将免疫磁珠悬浮；将悬浮起的免疫磁珠混合液加入到牛支原体培养基里培养，通过观察牛支原体的培养基的颜色变化和菌液PCR鉴定两种方式来确定捕获牛支原体的时间。
结果：将富集完的牛支原体免疫磁珠分别加入到的牛支原体的培养基，培养48h，观察培养基的颜色变化单位，发现牛支原体和其他杂菌（大肠杆菌、沙门氏菌、牛荚膜A型巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌）的混合液用免疫磁珠富集后，培养基的颜色由红色变为黄色；而只有大肠杆菌、沙门氏菌、牛荚膜A型巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌的菌液用免疫磁珠富集后，培养基的的颜色并未发生变化。同时将上述的菌液提取基因组，以基因组为模板，采用PCR的方法对oppD/F进行扩增，获得1912bp的阳性条带，发生颜色变化的菌液与PCR结果为阳性的条带一一对映，说明免疫磁珠具有良好的特异性，如图9所示。
三、免疫磁珠的敏感性确定
将浓度为105CCU/ml的牛支原体和浓度为105CFU/mL，分别进行10倍倍比稀释，室温孵育后，将含有混合液的离心管置于磁力架上，弃去上清，并用PBS洗涤免疫磁珠3～5次，之后再用50μL的PBS将免疫磁珠悬浮；将悬浮起的免疫磁珠混合液分别加入到牛支原体培养基里培养，通过观察牛支原体的培养基的颜色变化和菌液PCR鉴定两种方式来确定捕获牛支原体的时间。
结果：将105CCU/mL的牛支原体进行10倍倍比稀释，共计稀释1010倍，用免疫磁珠富集稀释后的牛支原体进行培养48h后，观察每个稀释倍数的下的培养基的颜色变化单位，并同时对上述的菌液提取基因组，采用PCR的方法，对牛支原体的特异性引物oppD/F进行扩增，获得约为1912bp大小的阳性条带，且阳性条带的范围和培养基的颜色由红变黄的范围一致。如图10所示。
上述（捕获时间、特异性、敏感性确定实验）的PCR方法均为相同条件：
1）牛支原体的特异性引物oppD/F为：
oppD/F-F：TTTTAGCTCTTTTTGAACAAAT（22bp）
oppD/F-R：GGCTCTCATTAAGAATGTC（19bp）
2）PCR反应体系见表4；
3）反应条件：引物为oppD/F-F +oppD/F-R ，模板为M.bovis基因组，94℃5min, 94℃30s,55℃45s,72℃30s 30cycle, 72℃10min。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 牛支原体免疫磁珠的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1407
<212> DNA
<213> 牛支原体(Mycoplasma bovis)
<400> 1
atgaaaaaaa acaaattcta tctattttta ggagccgctc ctgttctatc agtgccattg 60
gttgctgctt catgtggtga taaatacttt aaagaaactg aagttgatgg agtgaaaact 120
gttacaacac tttcacacat cgtgtctcgt aaaggattaa aactaagaga tggtttaacc 180
gttgataatg caccaagggc agcatttata actgatgaag gatctgtgca tgatgaatca 240
ttcaatcaat ctggttgaga agcagttcat aaaatttcat atgaacttgg attagataag 300
gcgcaagtta gtggtaataa aaacttaaga aataaagttt acgaacctaa aaagggtgaa 360
ttagcatctt catacaaaaa cgctattgat agtagtttta gatacattgt tctttgtgga 420
tttactcaca aagcagcgct ttatggttta gaaccagaat acattaaaaa gattaaagat 480
aataatattg tctttattac tgttgacttt gatatccaac aagatgcaag cactggcgaa 540
cctgcagcaa aagcatttgt tgacaaaatt ggtcaaggac gcttaattcc tgtaatattt 600
gacactaaac aagctgcata tattgctggt cgtgctcttg ctgactactt ctcaaaaatt 660
tacaaggata atcctgaaaa acgtacaata ggtgccttcg gtggtattcc ttgaccagca 720
gtttctgact ttatagctgg tacattccaa ggtattattg actgaaataa agaacaccca 780
gaagctaaga ctaaatcatt aaataacaca attgaattaa aaacatcatt tacttctggt 840
gaacccgttg cagttgctgc tattaactca gtaattaagg ccacagcttc atatccagtt 900
gcaggatcat tatcttctga cacagctaaa gaaattaaga agttaggcga taaaaacaaa 960
ttcattattg gtgttgacgc tgaccaaaag aatgcattaa agggtcatag aatatttaca 1020
tcagttatga aattaattgg tcaagctgtt tataacgttt tagctgactt atactctcaa 1080
ggtgaaaata gtctatcgct tcaaccaggc tttgaaattg gtaaaaaaaa tggtgaggct 1140
aaagtatttg gttatggtga aaatgaagca agcaaatatg taggtgttgc aacttcagga 1200
ttattagact caaagaatga tgagattgct aataaagcat tggaagaagc tactaaatac 1260
tacgaaagta aaaaagcgga aattcaaaaa actttatcag gtcaattgga agaagctaaa 1320
aaagctttag gtacaaaatg accagaccaa cctgctgacc aatttgggaa aatgattaac 1380
tgattggcta aagaaacaca aaaatag 1407

Claims (4)

1. 一种牛支原体P48基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.一种牛支原体P48抗原蛋白，它是由权利要求1所述的一种牛支原体P48基因表达的蛋白。
3.一种抗牛支原体多克隆抗体，它是以权利要求2所述的一种牛支原体P48抗原蛋白为抗原制备的多克隆抗体。
4.一种抗牛支原体免疫磁珠的制备方法，它包括：
1）蛋白溶液的配制:取权利要求3所述的抗牛支原体多克隆抗体用MES缓冲液溶解，配成浓度为1mg/mL的蛋白溶液；将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用；
2）取50 μL磁珠于1.5 mL离心管中；
3）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；
4）加1 mL 2~8ºC的预冷的 Washing Buffer A于1.5 mL 离心管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀；
5）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；
6）加500 μL蛋白溶液于离心管中，涡旋30 s，使其混合均匀；
7）将离心管管涡旋15 s，反应前30 min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s；
此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2 h；
8）采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；
9）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；
10）重复“步骤 9”操作四次；
11）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管管涡旋15 s，反应前30min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s；
此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2h；
12）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；
13）加1 mL超纯水于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；
14）加1 mL Storage Buffer于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；
重复该操作2次；
15）加入500 μL Storage Buffer 于离心管中，充分混合，4ºC保存备用。
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