CN111575299A

CN111575299A - 牛荚膜a型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法

Info

Publication number: CN111575299A
Application number: CN202010390465.8A
Authority: CN
Inventors: 马红霞; 孔令聪; 翟志超; 齐杰
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2020-08-25

Abstract

本发明公开了一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因表达的蛋白；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白制备的；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法；本发明在筛选选牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的特异性抗原的基础上，通过其制备的多克隆抗体与磁性微球进行偶联制备免疫磁珠，对免疫磁珠的特异性和敏感性等方面进行检测，以构建一种能快速富集分离牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌的方法，提高兽医临床诊治效率。

Description

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法

技术领域

本发明属于免疫磁珠制备技术领域，具体涉及牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法。

背景技术

牛呼吸系统疾病是是由多种病原所引起牛呼吸系统疾病的总称，该病已在全世界发生和流行，给畜牧养殖业造成了严重经济损失在我国，牛呼吸系统疾病始于2008年，此后在我国多地相继报道，其平均病死率为10%，最高可达40%以上，给我国的养牛业带来了巨大危害。

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是引起牛呼吸系统疾病（Bovine respiratorydisease）的主要病原。牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌所引起的巴氏杆菌病是一种能感染多种动物及人类的传染性疾病，对畜牧养殖业带来了巨大的危害。其引发的疾病多发生于经长途运输的育肥架子牛，给我国畜牧养殖业造成了较严重的经济损失。目前对于巴氏杆菌感染的诊断方法主要是通过病原学、分子生物学、血清学三个方面。病原学诊断主要利用实验室微生物诊断，通过对病原菌的分离鉴定来确定病原菌。而利用分子生物学技术对巴氏杆菌的诊断主要是通过PCR、基因芯片和DNA指纹技术等方式进行确定，就目前的诊断技术来说，PCR技术是检测巴氏杆菌的主要方法，通过对巴氏杆菌的16SrRNA和KMT1基因进行扩增来判定^[61]。黄海燕等根据plpE基因所建立的PCR方法经过临床的实验说明，其具有一定的可靠性和实用性^[62]，Townend则利用基因消减的方法建立了一种PCR方法^[63]，Hricinova等建立一种多重PCR的方法^[64]，除了单纯的利用PCR 技术进行诊断之外，肖国生等所建立的基因芯片检测方法可以检测出猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和巴氏杆菌^[65]，同时程亚楼所建立的基因芯片检测方法也能够检测巴氏杆菌^[66]。除了病原学和分子生物学方法来诊断的巴氏杆菌外，还可以利用血清学来进行诊断。血清学诊断的主要方法就是酶联免疫吸附法（ELISA）。

目前治疗由牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌所引起的呼吸系统疾病主要采用抗微生物药物，但近年来相关研究表明，牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌已对兽医临床常用药物产生了不同程度的耐药性，因其耐药性产生而造成的抗感染失败已屡见不鲜。为此，对牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌引发疾病的治疗需依赖药物敏感性检测筛选敏感药物，但牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌为苛养菌，分离周期非常长，为此，急需构建牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌快速富集分离方法，以加快其分离、鉴定及药物敏感性检测时间，具有重要意义。

免疫磁珠富集技术通过抗原抗体的特异性结合和纳米磁珠的在磁场的作用下能发生磁响应性对目标物质进行富集和分离的原理，具有灵敏度高、特异性强、分离速度快的优点，为快速富集和分离牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌提供了可能。

发明内容

本发明目的是为解决牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌检测周期长的问题，而提供一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌快速富集的牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠及其制备方法。

一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因表达的蛋白。

一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白制备的。

一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法，它包括：

1）蛋白溶液的配制:取上述的抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，MES缓冲液溶解，配成浓度为1mg/mL的蛋白溶液；将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用；

2）取50 μL磁珠于1.5 mL离心管中；

3）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；

4）加1 mL 2~8ºC的预冷的 Washing Buffer A于1.5 mL 离心管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀；

5）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；

6）加500 μL蛋白溶液于离心管中，涡旋30 s，使其混合均匀；

7）将离心管管涡旋15 s，反应前30 min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2 h；

8）采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；

9）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；

10）重复“步骤 9”操作四次；

11）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管管涡旋15 s，反应前30min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s。此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2h；

12）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；

13）加1 mL超纯水于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；

14）加1 mL Storage Buffer于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次；

15）加入500 μL Storage Buffer 于离心管中，充分混合，4ºC保存备用。

本发明提供了一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQID NO.1所示；一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它的碱基序列如序列表SEQ IDNO.2所示；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由上述的一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白制备的；一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法；本发明在筛选选牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的特异性抗原的基础上，通过其制备的多克隆抗体与磁性微球进行偶联制备免疫磁珠，对免疫磁珠的特异性和敏感性等方面进行检测，以构建一种能快速富集分离牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌的方法，提高兽医临床诊治效率。

附图说明

图1 Pm1基因扩增结果；M：DL1000 DNA MARKER；1：牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌Pm1基因（150bp）；

图2 重组质粒pET32a-Pm1的双酶切鉴定；B：重组质粒pET-32a-Pm1双酶切结果。M1：DLλHindd III DNA MARKER；M2：DL2000 DNA MARKER；1：未酶切后重组质粒pET-32a-Pm1结果；2：双酶切后重组质粒pET-32a-Pm1结果；

图3 重组Pm1蛋白表达产物SDS-PAGE分析；M：低分子量蛋白Maker；1：未诱导的BL21（pET32a-Pm1）菌液；2:诱导的BL21（pET32a-Pm1）菌液；3：诱导的BL21（pET32a-Pm1）的上清；4：诱导的BL21（pET32a-Pm1）的沉淀；

图4 重组Pm1蛋白纯化SDS-PAGE分析；M：低分子量蛋白Maker；1-2：穿出产物；3:20mmol洗脱产物；4：50mmol洗脱产物；5：100mmol洗脱产物；6：200mmol洗脱产物；

图5 多克隆抗体纯化SDS-PAG凝胶电泳分析；M：低分子量蛋白Maker；1：纯化后抗体；

图6 不同偶联缓冲液条件下偶联抗体的浓度；

图7 抗体的偶联率随抗体浓度的变化示意图；

图8 免疫磁珠富集牛巴氏杆菌的PCR扩增结果；M：Trans2K Plus DNA MARKER；1-2：免疫磁珠分别富集15min的PCR扩增结果；3-4：免疫磁珠分别富集30min的PCR扩增结果；5-6：免疫磁珠分别富集45min的PCR扩增结果；7-8：免疫磁珠分别富集60min的PCR扩增结果；

图9 免疫磁珠富集牛荚膜A型巴氏杆菌的PCR结果。M：Trans2K Plus DNA MARKER；1：Pm菌液的扩增结果；2-3：Pm和E.coli混合菌液的扩增结果；4-5：Pm和salmonella混合菌液的扩增结果；5-6Pm和S.aureus混合菌液的扩增结果；7-8：Pm和T.pyogenes混合菌液的扩增结果；

图10 免疫磁珠富集牛荚膜A型巴氏杆菌的敏感性的PCR扩增结果。M：Trans2K PlusDNA MARKER；1-10；各个稀释倍数下的PCR扩增结果，依次分别为稀释10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹。

具体实施方式

实施例1 牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因的克隆

将设计的引物序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，并添加BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，引物序列见表1所示；以牛荚膜A型巴氏杆菌基因组为模板进行Pm1基因的克隆；反应条件见表2；50μL PCR反应体系：

模板DNA 4.0μL

上游引物（20pmol/μL） 1.0μL

下游引物（20pmol/μL） 1.0μL

10×Ex Taq Buffer（Mg2＋Plus） 5.0μL

dNTP Mixture（各 2.5mM） 4.0μL

Ex Taq（5U/μL） 0.6μL

ddH20 34.4μL。

将PCR产物经1%和0.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪检测PCR扩增结结果；用胶回收试剂盒将PCR产物按照胶回收试剂盒说明进行回收，并与pmd-18T载体进行连接，16℃连接过夜，将连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有氨苄抗性的选择性平板上培养12-14h，挑取单个阳性菌落进行PCR扩增，同时提取质粒并进行双酶切验证，将上述正确的菌株，送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。

结果：以牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因组为模板，用引物Pm1-F和Pm1-R扩增得到大小为150bp见图1所示。

实施例2 牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌蛋白的表达载体的构建

对上述测序正确的菌株和含有pET32a（+）空质粒的菌株提取质粒并用BamHⅠ和XhoⅠ两种限制酶进行双酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌Pm1目的基因条带和pET32a（+）空质粒条带；用T4连接酶将Pm1基因和pET32a（+）载体在16℃条件下进行连接；连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。在含有氨苄抗性的选择性平板上培养12-14h，挑取单个菌落，提取质粒并进行双酶切验证，将上述正确的菌株，送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。

结果：将构建的重组表达质粒pET32a-Pm1进行双酶切（BamHⅠ和XhoⅠ）验证；将酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，可获得150bp大小的目的基因条带，如2所示。表明重组表达质粒构建成功。

实施例3 重组Pm1蛋白的表达和纯化

将正确的菌株提取质粒并转化到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，在含有氨苄抗性的选择性平板上培养12-14h。选取重组正确的菌株于含有氨苄抗性的LB的液体培养基中，37℃、220r/min培养过夜。将培养过夜的菌液按照1：100的比例接种于300mL的培养基中，培养至菌液OD值达到0.4～0.6，加入终浓度为1mmol/L的ITPG，16℃诱导过夜后，将菌体在8000r/min、4℃条件下，离心10min。菌体用灭菌的PBS洗涤数次后，菌体用20ml的PBS重悬，置于冰上进行超声破碎。之后对破碎产物在12000 r/min、4℃条件下离心。取离心后的上清和沉淀进行SDS聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）蛋白鉴定。将重组菌pET32a-PM1在37℃培养至OD值为0.6加入ITPG诱导剂，在16℃条件下培养12h；将菌体离心后重悬进行破碎后吸取上清和沉淀。将诱导前的菌液、诱导后的菌液、上清、沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳分析；表达出大小为26KDa的可溶性的重组Pm1蛋白；如图3所示。

采用同样的方法，对诱导表达的Pm1蛋白，收集菌体，超声破碎，离心获取上清，之后将上清用0.45μm的滤膜进行抽滤，除去杂质；同时将各种缓冲液（PBS、水及各种浓度的咪唑）也用0.45μm的滤膜进行抽滤；在进行样品上样前，先用平衡缓冲液对镍离子亲和层析柱进行平衡，待平衡后，对样品进行上样，上样结束后，再次用平衡缓冲液对镍柱进行平衡，洗掉未结合在镍柱上的成分，之后用各种不同的咪唑浓度的缓冲液进行洗脱，通过观察紫外吸收峰值，在各梯度下洗脱样品的峰值进行收集，之后将各梯度下的洗脱产物进行SDS聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）蛋白鉴定。

对于可溶性表达的重组Pm1蛋白采用镍离子亲和柱进行纯化，将菌体破碎后的上清，上样结束后，用PBS缓冲液对镍柱进行平衡，带平衡结束后，按照20mmol咪唑、50mmol咪唑、100mmol咪唑、200mmol咪唑对镍柱进行洗脱，保存各个浓度下的洗脱液，并同时将各梯度下的洗脱产物进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。如图4，可知重组的Pm1蛋白在100mmol咪唑条件下获得目的蛋白且杂带较少。

实施例4 Pm1多克隆抗体的制备及纯化

一、制备

将纯化正确的洗脱产物用50KD的超滤管在4000r/min、4℃条件下，对洗脱产物进行离心，待洗脱液全部离尽后，再用PBS缓冲液对超滤管上滤膜的蛋白进行悬浮，之后将浓缩后的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）蛋白鉴定，并同时对浓缩的蛋白采用BCA方法对蛋白进行测定。

新西兰大白兔在进行适应性饲养一周后，用纯化及浓缩后的Pm1蛋白作为免疫原，对新西兰大白兔进行免疫。采用背部皮下多点免疫的方式进行免疫；每只兔子的免疫剂量为1mg，首免和二免间隔两周，之后每隔一周免疫一次。首免采用完全弗氏佐剂与抗原进行等体积混合乳化的方式进行，之后采用不完全弗氏佐剂与抗原进行等体积混合乳化的方式进行；三免后，耳静脉采血，分离血清，采用间接ELISA方法检测血清效价；四免结束后，采用将动颈脉取血的方法，获取全部血液，分离血清，并分装-80℃保存。

二、兔多克隆抗体效价的测定

取四免后的兔子血清，采用间接ELISA方法与纯化的P48蛋白进行抗体效价测定；如表3所示，牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌Pm1蛋白的抗体效价达到1:128 000。

二、多克隆抗体的纯化及浓度的测定

将获取的血清采用Protien A琼脂糖纯化树脂进行纯化，具体步骤如下所示：

1）样品制备：上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液1:1对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品在结合/洗涤缓冲液中透析过夜；

2）柱和树脂的平衡：用五倍柱体积的结合/洗涤缓冲液进行平衡；

3）样品纯化：将样品加入到平衡好的树脂中，以缓慢流速流出，收集流出液；

4）用10~15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液洗脱非特异性吸附的杂蛋白，收集流出液；

5）用5~10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱蛋白。收集流出液，即目的蛋白组分；

6）依次使用3倍柱体积的结合缓冲液，5倍柱体积的去离子水，5倍柱体积的20%乙醇洗涤树脂。树脂加入相同体积的 20%乙醇，保存在 2~8°C，不要冻存；

7）柱的再生：10 ml洗脱缓冲液洗涤，然后用5 ml结合/洗涤缓冲液平衡，即可再次使用；

用上述方法将所制备的P48的多克隆抗体的血清进行纯化，将纯化出的抗体进行SDS聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）蛋白鉴定，同时对纯化的多可克隆抗体采用BCA的方法进行浓度测定。

结果：将纯化的IgG进行SDS-PAGE凝胶电泳分析其纯度，IgG经SDS-PAGE凝胶电泳后，会发生变性，因此出现两条链，一条重链，大小约为50KDa-70KDa，一条轻链，大小约为25KDa（如图5所示）。

实施例5 牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备

牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备，具体操作步骤如下：

1）蛋白溶液的配制:取适量待偶联蛋白（牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌Pm1多克隆抗体）用Coupling Buffer 溶解，配成浓度为0.1-3.0 mg/mL的蛋白溶液。将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用；

2）取50 μL磁珠于1.5 mL离心管中；

3）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；

5）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；

6）加500 μL蛋白溶液于离心管中，涡旋30 s，使其混合均匀；

8）采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；

10）重复“步骤 9”操作四次；

12）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；

实施例6 免疫磁珠偶联条件优化实验

1、磁性微球偶联抗体的最佳缓冲液的确定

将纯化好的的抗体分别用PBS、MES、NaHCO3和H3BO3溶解稀释；同时将这4种蛋白溶液分别按照实施例5的方法与磁珠进行偶联，待和抗体偶联结束后，将实施例5步骤8）的穿出液，采用BCA的方法进行检测穿出液蛋白浓度。利用间接的方法计算磁珠上偶联的抗体的偶联量：偶联量=偶联前抗体浓度-偶联后抗体浓度。

采用BCA方法对偶联前抗体的浓度进行检测，并将在四种缓冲液（PBS、MES、NaHCO₃、H₃BO₃）下的抗体浓度调整至同一浓度(1mg/mL)；将200μl的抗体与50μl（10mg/mL）的磁珠进行偶联，待偶联结束后，再次用BCA法对偶联后的抗体浓度进行检测，之后通过抗体的偶联量（偶联前抗体的浓度—偶联后的抗体的浓度）来判断出抗体与磁珠最佳的偶联缓冲液，如图6所示，可知在磁珠量为50μl（10mg/mL）抗体浓度为1mg/mL的条件下，抗体在缓冲液为MES时，磁珠偶联的抗体最多，Pm1蛋白的偶联抗体浓度约为500μg/mL。

2、磁性微球偶联抗体的最佳偶联浓度的确定

将筛选出的最佳蛋白溶液按照抗体浓度为50μg /ml、10μg /ml、200μg /ml、400μg /ml、800μg /ml、1600μg /ml、3200μg /ml的浓度分别与磁珠进行偶联，待和抗体偶联结束后，将实施例5步骤8）的穿出液，采用BCA的方法进行检测穿出液蛋白浓度；通过偶联率确定最佳偶联缓冲液：偶联率=（偶联前抗体浓度-偶联后抗体浓度）/偶联前抗体浓度；结果如图7所示。可知抗体在抗体浓度为200μg/mL时，偶联率最高，Pm1蛋白的抗体偶联率约为96%。

实施例7 免疫磁珠性能的评价

一、免疫磁珠捕获牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌时间的确定

将浓度为10⁵CFU/mL的牛荚膜A型巴氏杆菌的菌液里分别加入已经制备好的免疫磁珠。室温孵育15min、30min、45min、60min。孵育结束后，将含有混合液的离心管置于磁力架上，弃去上清，并用PBS洗涤免疫磁珠3～5次，之后再用50μL的PBS将免疫磁珠悬浮。将悬浮起的免疫磁珠混合液分别加入到BHI培养基里培养，通过观察牛荚膜A型巴氏杆菌的培养基上菌落的数量以及挑取单个菌落进行PCR鉴定的两种方式来确定牛荚膜A型巴氏杆菌的时间。

将富集后的牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌涂布到BHI培养上，培养12-16h后，培养基上有菌落生长，选取部分菌落进行菌落PCR验证，结果如图8所示。可见免疫磁珠在与牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌作用15min后，即可富集到牛巴氏杆菌。综上所述，免疫磁珠在与牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌作用15min，即可富集到牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌。

二、免疫磁珠的特异性的确定

在浓度为10⁵CFU/mL的巴氏杆菌分别加入培养好大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌，并同时设置阴性对照组即，只含有上述干扰菌，不含有目的菌。在上述混合菌液里分别加入已将制备好的免疫磁珠，室温孵育后，将含有混合液的离心管置于磁力架上，弃去上清，并用PBS洗涤免疫磁珠3～5次，之后再用50μL的PBS将免疫磁珠悬浮。将悬浮起的免疫磁珠混合液加入到BHI培养基里培养，通过挑取单个菌落进行PCR鉴定的两种方式来确定牛巴氏杆菌的时间。

将富集完牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌的免疫磁珠涂布到BHI固体培养基上，之后挑取部分菌落，以菌落为模板，采用PCR的方法对KMT1进行扩增，获得大小约为460bp的阳性条带。如图9所示。

三、免疫磁珠的敏感性确定

将浓度为10⁵CFU/mL的牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌，进行10倍倍比稀释，室温孵育后，将含有混合液的离心管置于磁力架上，弃去上清，并用PBS洗涤免疫磁珠3～5次，之后再用50μL的PBS将免疫磁珠悬浮。将悬浮起的免疫磁珠混合液加入到BHI培养基里培养，通过挑取单个菌落进行PCR鉴定的两种方式来确定牛巴氏杆菌的时间。

对牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌进行稀释到10⁹倍，然后用免疫磁珠对各个稀释倍数下的牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌进行富集，富集之后将免疫磁珠涂布到BHI固体培养基，待培养12h后，挑取菌落，采用PCR的方法，对牛荚膜A型巴氏杆菌地特异性用引物KMT1进行扩增，获得目的片段大小约为460bp的阳性条带，如图10所示，免疫磁珠能富集到最大稀释倍数为10⁴倍。

上述（捕获时间、特异性、敏感性确定实验）的PCR方法均为相同条件：

1）牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌特异性引物KMT1为：

KMT1-F：ATCCGCTATTTACCCAGTGG（20bp）

KMT1-R：GCTGTAAACGAACTCGCCAC（20bp）

2）PCR反应体系见表4；

3）反应条件：引物为KMT1-F+ KMT1-R，模板为pm基因组，94℃5min, 94℃30s,55℃45s,72℃30s 30cycle, 72℃10min。

。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 150

<212> DNA

<213> 牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)

<400> 1

ttattgtttt ttctccatac ctaaaacacc ccagtactgc tcagtactac cttggccgac 60

aagatatttg tttttttcac catttgtact attgatgaaa tgtaagtcca tttggaaacg 120

atgaggtgat gtggctcctt ttgttagtct 150

Claims

1.一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白，它是由权利要求1所述的一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌基因表达的蛋白。

3.一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，它是由权利要求2所述的一种牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌抗原蛋白为抗原制备的多克隆抗体。

4.一种抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌免疫磁珠的制备方法，它包括：

1）蛋白溶液的配制:取权利要求3所述的抗牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌多克隆抗体，MES缓冲液溶解，配成浓度为1mg/mL的蛋白溶液；将配制好的蛋白溶液于4ºC保存备用；

2）取50 μL磁珠于1.5 mL离心管中；

3）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；

5）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液；

6）加500 μL蛋白溶液于离心管中，涡旋30 s，使其混合均匀；

7）将离心管管涡旋15 s，反应前30 min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s;

此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2 h；

8）采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；

10）重复“步骤 9”操作四次；

11）加1 mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30 s，将离心管管涡旋15 s，反应前30min，每隔5 min 取下离心管涡旋15 s;

此后，每隔15 min，取下离心管管涡旋15 s，室温混合1~2h；

12）将离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液；

14）加1 mL Storage Buffer于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液;

重复该操作2次；