CN107746876B - 一种鼠李糖乳杆菌免疫磁珠电化学传感器检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，一种鼠李糖乳杆菌免疫磁珠电化学传感器检测方法。本发明方法是用带有鼠李糖乳杆菌特异性菌毛亚基SpaA抗体的免疫磁珠结合电化学传感器对益生菌产品中鼠李糖乳杆菌进行定量检测。本发明方法操作简便、无需培养，检测周期2‑3小时，便于推广使用，适合益生菌产品及发酵产品中鼠李糖乳杆菌的快速定量检测和质量评价。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种能够特异性识别鼠李糖乳杆菌的免疫磁珠，以及基于磁珠的电化学传感器检测方法，该技术能够对复杂体系中的鼠李糖乳杆菌进行富集和快速定量检测，检测过程无需增殖培养，操作简单，检测限达到1.53×103CFU/mL,优于传统检测方法，并且检测周期由传统的5-6天缩短为2-3小时。该方法可用于益生菌产品及环境样品中活性鼠李糖乳杆菌的快速分离和定量检测。
背景技术
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是目前公认的益生性乳杆菌，具有保持肠道微生态平衡，抑制有害细菌生长，消除过敏等生理功能。目前含有鼠李糖乳杆菌的益生菌产品种类繁多，包括酸奶、酸乳酪、乳酸菌饮料、酸豆奶、益生菌口服液、片剂、胶囊、粉末剂等，但生产厂家设备条件和技术水平千差万别，质量参差不齐，许多产品存在活菌数不达标、种属标识不符等质量问题。准确测定益生菌产品中鼠李糖乳杆菌及其活菌数量是评估益生菌制剂质量与功效的主要依据。但目前检测和鉴定鼠李糖乳杆菌的活菌数仍缺乏快速准确的方法。传统检测方法易受培养条件等因素影响，检测周期达到5-6天；基于PCR技术的分子生物学方法虽然具有较高的灵敏度，但是操作复杂，需要昂贵的仪器，无法满足实际生产流通中快速、大规模检测要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种益生菌产品中鼠李糖乳杆菌的快速定量检测方法，该方法应用免疫磁珠结合电化学传感器检测技术，检测过程无需增殖培养，操作简单，检测周期2-3小时，检测精确度优于目前使用的传统方法，为益生菌产品质量和功能评价提供一种快速、廉价的检测技术。
在乳酸菌种属中，目前发现只有鼠李糖乳杆菌表面存在菌毛结构，SpaA是菌毛结构中最为保守的蛋白亚基，因此SpaA是鼠李糖乳杆菌潜在的特异性靶抗原。
本发明一种益生菌产品中鼠李糖乳杆菌的免疫磁珠电化学传感器检测方法，是用鼠李糖乳杆菌特异性免疫磁珠结合电化学传感器对益生菌产品中鼠李糖乳杆菌进行定量检测；所述的鼠李糖乳杆菌特异性免疫磁珠是带有鼠李糖乳杆菌特异性菌毛亚基SpaA抗体的磁珠。
其步骤包括：
1)鼠李糖乳杆菌特异性菌毛亚基SpaA的表达、纯化及多克隆抗体制备；
2)鼠李糖乳杆菌特异性免疫磁珠的制备；
3)免疫磁珠富集结合电化学传感器对益生菌产品中鼠李糖乳杆菌进行定量检测。
本发明中所述的鼠李糖乳杆菌特异性菌毛亚基SpaA抗体，是通过E.coli原核表达的SpaA蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，获得SpaA特异性抗体。具体包括以下步骤：
(1)扩增SpaA目的基因：根据GenBank中SpaA序列(GenBank登录号：NC_013198.1)，设计上游引物P1序列：5′-CCGCCATGGGCATGAAAAAGACAATTG-3′(SEQ ID NO.1)，下游引物P2序列：5′-AATCTCGAGGAAACCATTGCGGCGCT-3′(SEQ ID NO.2)，在上下游引物分别引入Nco I和Xho I限制性酶切位点。以鼠李糖乳杆菌基因组DNA为模版进行PCR扩增，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，59℃退火1min，72℃延伸2min，30次循环；72℃延伸10min。
(2)构建重组表达载体：挑取菌落PCR鉴定为阳性的单菌落至LB液体培养基(含50μg/mL Kana)37℃，振荡培养12-16h，抽提质粒pET28-a。利用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，染色拍照；将双酶切鉴定结果正确的重组质粒进行测序，利用DNASTAR软件对测序结果和GenBank中报道的SpaA序列进行比对，分析表明重组质粒中的SpaA基因序列；将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28-SpaA。
(3)SpaA蛋白的表达与鉴定：将重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28-SpaA接种于10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；按照2％的接种量接入50mL TB培养液(含50μg/mL Kana)中，37℃，200rpm培养至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度分别为0.06mmol/L的IPTG诱导培养5h，离心收集菌体加入等体积PBS重悬，超声破碎细菌，收集包涵体应用Ni-NTA层析柱对重组蛋白进行分离纯化SpaA蛋白；收集穿透液用SDS-PAGE电泳分析重组蛋白，并割取目的条带，送至商业化生物技术公司进行质谱鉴定。
本发明应用上述重组SpaA蛋白为抗原免疫新西兰白兔，制备了SpaA多克隆抗体。具体步骤为：取健康新西兰白兔在新环境下预养一周后进行耳缘静脉采血，分离血清作为抗血清效价检测时的阴性对照。将纯化的重组SpaA与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，腹部皮下多点注射新西兰白兔，初次免疫剂量为1.0mg/只；分别于第4周、第5周、第6周进行加强免疫(免疫计量为的1/2)；最后一次加强免疫完成5d后，耳静脉取血。将收集的血液于4℃放置2h，以3000r/min的转速离心10min，收集抗血清，-20℃保存。
本发明通过共价键交联法将上述SpaA多克隆抗体固定在羧基化的磁珠表面，制备成一种免疫磁珠。制备方法特征在于：取2mg羧基修饰磁珠PM3-020于1.5mL离心管中，用500μL MEST洗涤2次磁分离弃去上清。加入新配制的200μL 5mg/mL EDC和200μL 5mg/mL NHS混匀，37℃活化30min磁分离弃去上清。加入500μL MEST混匀，将磁珠转移至新的离心管中，用500μL MEST洗涤2次得到活化磁珠。向活化磁珠中加入SpaA多抗，用PBST(0.01mol/L，pH7.4)溶液调节总体积至500μL轻轻混匀，37℃偶联3h磁分离弃去上清，加入1mL PBST(pH7.4，含1％BSA)重悬磁珠，37℃封闭45min，用500μL PBST洗涤3次加入200μL PBST(pH 7.4)含0.02％NaN3，0.5％BSA)重悬4℃保存备用。
本发明应用免疫磁珠结合免疫传感器检测，建立了一种鼠李糖乳杆菌的快速定量检测方法。方法特征在于：将磁性玻碳电极(Φ＝5mm)依次用0.2-0.5μm，0.02-0.05μm的Al2O3抛光粉打磨，然后用无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干，4℃保存备用。取500μL梯度稀释的鼠李糖乳杆菌悬液样品与10μL免疫磁珠混合，37℃孵育60min，磁分离2min后弃上清，磁珠用500μL PBST洗涤3次；加入10μL HRP标记SpaA多抗，PBST补充至200μL，37℃孵育60min，磁分离2min后弃上清；用500μL PBST洗涤3次后，滴加至打磨好的磁性玻碳电极上，在CHI660E电化学工作站进行电化学检测；检测采用三电极体系：磁性玻碳电极(Φ＝5mm)作为工作电极，铂丝与饱和甘汞电极(SCE)分别用作对电极和参比电极；反应体系为含有1mmol/L H2O2和1mmol/L对苯二酚的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)。扫描范围为-0.25V-0.25V，脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为50ms，扫描速率为60mV/s；分析测定样品电流的响应值和样品中鼠李糖乳杆菌浓度的对应关系，绘制标准曲线，确定线性范围，所有测量均在室温下进行。
由于本发明采用鼠李糖乳杆菌SpaA特异性抗体制备的免疫磁珠，可以对益生菌产品中的鼠李糖乳杆菌细胞进行选择性吸附和分离，对低含量鼠李糖乳杆菌起到富集的效果；免疫磁珠和菌体细胞的复合体通过电化学传感器检测菌株含量，方法快速简单，结果稳定，整个过程无需常规增殖培养，检测限达到1.53×103CFU/mL,检测时间缩短为2-3小时；该方法适合大量的，菌种成分复杂的益生菌产品的质量检测和功能评价。
本发明以鼠李糖乳杆菌表面的菌毛蛋白SpaA作为识别靶点，通过E.coli原核表达的SpaA蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，获得了SpaA特异性抗体，应用共价键交联法将SpaA抗体和羧基修饰的磁珠偶联，制备了一种用于特异性捕获鼠李糖乳杆菌的免疫磁珠，并建立了相应的“磁性玻碳电极+复合物+HRP标记SpaA抗体”电化学信号检测体系，实现了样品中鼠李糖乳杆菌的快速定量检测。所建立的方法灵敏度好、选择性强、分析速度快，检测限达到1.53×103CFU/mL,优于传统检测方法，并且检测周期由传统的5-6天缩短为2-3小时；相比现有的PCR检测方法，该方法操作简便、设备更为廉价。更适合企业和基层食品质量监督机构作为评价益生菌产品质量的工具。
附图说明
图1：免疫磁珠捕获鼠李糖乳杆菌的透射电镜图，图A，免疫磁珠透射电镜结果；图B，免疫磁珠捕获鼠李糖乳杆菌透射电镜结果。
图2：免疫磁珠电化学传感器的表征图，图A为交流阻抗图的检测结果；图B为循环伏安图的检测结果，其中a为裸电极，b为裸磁珠，c为磁珠偶联SpaA抗体,d为免疫磁珠捕获鼠李糖乳杆菌复合物，e为辣根过氧化物酶标记后的免疫磁珠鼠李糖乳杆菌复合物。
图3：免疫磁珠电化学传感器对PBS中鼠李糖乳杆菌检测结果，图A，为不同浓度鼠李糖乳杆菌响应电流检测结果，其中，a为不含鼠李糖乳杆菌的空白对照，b为2.56×101CFUmL-1，c为2.56×102CFU mL-1，d为2.56×103CFU mL-1，e为2.56×104CFU mL-1，f为2.56×105CFU mL-1，g为2.56×106CFU mL-1，h为2.56×107CFU mL-1，i为2.56×108CFU mL-1，j为2.56×109CFU mL-1，k为2.56×1010CFU mL-1浓度的鼠李糖乳杆菌响应电流。图B为鼠李糖乳杆菌浓度在103-107CFU mL-1与电流信号的相关性曲线。
图4：免疫磁珠电化学传感器对牛乳中鼠李糖乳杆菌的检测结果，其中，a为1.53×103CFU mL-1，b为1.53×104CFU mL-1，c为1.53×105CFU mL-1。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
本发明试验用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，菌株号：LGG)，购自中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；纳米磁珠PM3-020购自上海博然生物科技有限公司。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
实施例1鼠李糖乳杆菌菌毛蛋白亚基SpaA基因的克隆、表达及纯化
根据GenBank中登录的鼠李糖乳杆菌LGG菌毛亚基SpaA编码序列设计一对含有NcoI和Xho I限制性酶切位点的引物，委托上海生工生物工程有限公司合成。用改良CTAB法提取鼠李糖乳杆菌基因组DNA，应用PCR方法扩增SpaA基因，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性50s，59℃退火1min，72℃延伸2min，30次循环；72℃延伸10min。扩增产物大小为1005bp。利用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切质粒pET28-a和PCR扩增产物，试剂盒回收目的片段，并将酶切回收的载体和SpaA目的基因用T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，卡那霉素抗性筛选，挑取阳性转化子进行PCR和酶切鉴定；将双酶切鉴定结果正确的重组质粒进行测序验证，分析表明重组质粒中的SpaA基因序列；抽提重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28-SpaA。将重组菌接种于10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；按照2％的接种量接入50mL TB培养液(含50μg/mL Kana)中，37℃，200rpm培养至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度分别为0.06mmol/L的IPTG诱导培养5h，离心收集菌体加入等体积PBS重悬，超声破碎细菌，收集包涵体溶解后，通过Ni-NTA层析柱对重组蛋白进行分离纯化，收集重组蛋白，并送至商业化生物技术公司进行质谱鉴定。
PCR扩增结果显示在1000bp处出现特异性条带，将目的基因与载体连接构建原核表达载体，并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，对阳性克隆进行PCR、限制性酶切分析，结果显示目的基因已插入到表达载体中，序列测定所得拼接结果与已发表的鼠李糖乳杆菌LGG菌毛亚基SpaA核苷酸序列99％相似。将获得的重组E.coli BL21(DE3)/pET28-SpaA加入0.04mmol/L IPTG、37℃诱导2h后蛋白表达量最高，并且以包涵体的形式存在。包涵体蛋白用盐酸胍溶解后过Ni-NTA层析柱纯化，对咪唑洗脱缓冲液的穿透液进行SDS-PAGE分析，但导入空载体的菌株其洗脱液中未出现目的条带；导入重组载体的菌株在200和250mmol/L咪唑洗脱液中出现重组蛋白，于45K-66.2K之间有预期分子量大小的条带，经质谱鉴定，条带蛋白为鼠李糖乳杆菌LGG菌毛亚基SpaA。
实施例2重组SpaA菌毛蛋白多克隆抗体的制备
健康新西兰白兔在新环境下预养一周后进行耳缘静脉采血，分离血清作为抗血清效价检测时的阴性对照。将纯化的重组SpaA与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，腹部皮下多点注射新西兰白兔，初次免疫剂量为1.0mg/只；分别于第4周、第5周、第6周进行加强免疫(免疫计量为的1/2)；最后一次加强免疫完成5d后，耳静脉取血。将收集的血液于4℃放置2h，以3000r/min的转速离心10min，收集抗血清，利用Protein A对免疫后多抗血清亲和纯化，抗血清效价为1：160000，-20℃保存。
实施例3SpaA抗体免疫磁珠的制备及透射电镜观察
免疫磁珠制备
取2mg羧基修饰磁珠PM3-020于1.5mL离心管中，用500μL MEST洗涤2次磁分离弃去上清。加入新配制的200μL 5mg/mL EDC和200μL 5mg/mL NHS混匀，37℃活化30min磁分离弃去上清。加入500μL MEST混匀，将磁珠转移至新的离心管中，用500μL MEST洗涤2次得到活化磁珠。向活化磁珠中加入SpaA多抗，用PBST(0.01mol/L，pH 7.4)溶液调节总体积至500μL轻轻混匀，37℃偶联3h磁分离弃去上清，加入1mL PBST(pH 7.4，含1％BSA)重悬磁珠，37℃封闭45min，用500μL PBST洗涤3次，加入200μL PBST(pH 7.4)含0.02％NaN3，0.5％BSA)重悬，4℃保存备用。
透射电镜观察
取500μL鼠李糖乳杆菌LGG调整菌液浓度为105CFU/mL于离心管中，加入10μL免疫磁珠，37℃，孵育60min，磁分离弃去上清，无菌PBS洗涤2次后重悬；取20μL重悬液滴于铜网上，吸附15min后取出铜网，在空气中自然干燥2-3min；在铜网上滴一滴2％的磷钨酸(PTA)水溶液进行染色，2min后取下，用吸水纸吸干水分，在空气中干燥5min，用透射电镜观察，选取清晰的图像进行拍照分析。
结果如图1所示，图A显示磁珠大小均匀，直径约在180nm；图B显示免疫磁珠附着于菌体表面，表明磁珠能够有效捕获悬液中的鼠李糖乳杆菌细胞。
实施例4免疫磁珠电化学传感器的表征检测
将磁性玻碳电极(Φ＝5mm)依次用0.2-0.5μm，0.02-0.05μm的Al2O3抛光粉打磨电极，然后用无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干4℃保存备用；取500μL鼠李糖乳杆菌LGG调整菌液浓度为105CFU/mL于离心管中，加入10μL免疫磁珠，37℃孵育60min；将离心管置于磁分离架上，磁分离2min后弃上清，用500μL PBST洗涤3次；加入10μL HRP标记SpaA多抗，PBST补充至200μL，37℃孵育60min，磁分离2min后弃上清；用500μL PBST洗涤3次后，滴加至打磨好的玻碳电极上进行电信号测定。电解液为含有2.5mmol Fe(CN)6 3-/4-的PBS缓冲溶液pH＝7.4。
结果如图2所示，随着电极表面的不断修饰，图A电阻值依次增大，图B峰电流依次降低。交流阻抗图和循环伏安图结果都表明免疫传感器捕获鼠李糖乳杆菌后能够产生显著的电信号。
实施例5PBS中的鼠李糖乳杆菌免疫磁珠电化学传感器检测结果
将磁性玻碳电极(Φ＝5mm)依次用0.2-0.5μm，0.02-0.05μm的Al2O3抛光粉打磨电极，然后用无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干4℃保存备用；取500μL梯度稀释后鼠李糖乳杆菌a-k(2.56×101-2.56×1010CFU mL-1)于离心管中，加入10μL免疫磁珠，37℃孵育60min。将离心管置于磁分离架上，磁分离2min后弃上清，用500μL PBST洗涤3次。加入10μL HRP标记SpaA多抗，PBST补充至200μL，37℃孵育60min，磁分离2min后弃上清。用500μLPBST洗涤3次后，滴加至打磨好的玻碳电极上进行电化学检测。电解液为含有1mmol/L H2O2和1mmol/L对苯二酚的PBS缓冲溶液pH＝7.4。扫描范围为-0.25V-0.25V，脉冲振幅为25mV，脉冲宽度为50ms，脉冲周期为500ms，电位增量为5mV，扫描速率为60mV/s。所有测量在室温下进行。
结果如图3所示，图A为不同浓度下的鼠李糖乳杆菌的响应电流。电流在a-h之间之间变化较为明显，表明菌株与磁珠结合产生的电流响应值与鼠李糖乳杆菌细胞浓呈正相关。图B为鼠李糖乳杆菌浓度在103-107CFU mL-1的标准曲线。线性方程Y＝4.8507X+19.585(Log CFU mL-1)R2＝0.991。最低检测限：22CFU mL-1。
实施例6牛奶样品中的鼠李糖乳杆菌免疫磁珠电化学传感器检测结果
选取添加不同浓度的鼠李糖乳杆菌的牛奶作为检测样品，取1mL无菌12％的脱脂牛奶，添加PBS(pH＝7.4)稀释至10mL样品。将样品分别添加不同浓度的鼠李糖乳杆菌a为1.53×103CFU mL-1、b为1.53×104CFU mL-1c为1.53×105CFU mL-1)。将磁性玻碳电极(Φ＝5mm)依次用0.2-0.5μm，0.02-0.05μm的Al2O3抛光粉打磨电极，然后用无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干4℃保存备用；取500μL添加了鼠李糖乳杆菌LGG的牛奶样品于离心管中，加入10μL免疫磁珠，37℃孵育60min；将离心管置于磁分离架上，磁分离2min后弃上清，用500μL PBST洗涤3次；加入10μL HRP标记SpaA多抗，PBST补充至200μL，37℃孵育60min，磁分离2min后弃上清；用500μL PBST洗涤3次后，滴加至打磨好的玻碳电极上进行电信号测定。电解液为含有2.5mmol Fe(CN)6 3-/4-的PBS缓冲溶液pH＝7.4。重复5次。
结果如图4所示，免疫传感器的相对标准偏差(RSD)在2.80％-4.47％之间，回收率在91.74％-108.67％之间，表明免疫磁珠电化学传感器可以精准的用于牛乳中鼠李糖乳杆菌的检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 一种鼠李糖乳杆菌免疫磁珠电化学传感器检测方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgccatggg catgaaaaag acaattg 27
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatctcgagg aaaccattgc ggcgct 26
Claims (1)
1.一种牛乳中鼠李糖乳杆菌的免疫磁珠电化学传感器检测方法，其特征在于：用鼠李糖乳杆菌特异性免疫磁珠结合电化学传感器对牛乳中鼠李糖乳杆菌进行定量检测；所述的鼠李糖乳杆菌特异性免疫磁珠是带有鼠李糖乳杆菌特异性菌毛亚基SpaA抗体的磁珠；具体步骤是：
1)鼠李糖乳杆菌特异性菌毛亚基SpaA的表达、纯化及多克隆抗体制备；
2)鼠李糖乳杆菌特异性免疫磁珠的制备：取2mg羧基修饰磁珠PM3-020于1.5mL离心管中，用500μL MEST洗涤2次磁分离弃去上清；加入新配制的200μL 5mg/mL EDC和200μL 5mg/mL NHS混匀，37℃活化30min磁分离弃去上清；加入500μL MEST混匀，将磁珠转移至新的离心管中，用500μL MEST洗涤2次得到活化磁珠；向活化磁珠中加入SpaA多抗，用PBST0.01mol/L、pH 7.4溶液调节总体积至500μL轻轻混匀，37℃偶联3h磁分离弃去上清，加入1mL PBST、pH 7.4、含1％BSA重悬磁珠，37℃封闭45min，用500μL PBST洗涤3次加入200μLPBST、pH 7.4含0.02％NaN3、0.5％BSA重悬4℃保存备用；
3)免疫磁珠富集结合电化学传感器对牛乳中鼠李糖乳杆菌进行定量检测，操作步骤为：将磁性玻碳电极Φ＝5mm依次用0.2-0.5μm，0.02-0.05μm的Al2O3抛光粉打磨，然后用无水乙醇、超纯水依次超声清洗5min，氮气吹干，4℃保存备用；取500μL梯度稀释的鼠李糖乳杆菌悬液样品与10μL免疫磁珠混合，37℃孵育60min，磁分离2min后弃上清，磁珠用500μLPBST洗涤3次；加入10μL HRP标记SpaA多抗，PBST补充至200μL，37℃孵育60min，磁分离2min后弃上清；用500μL PBST洗涤3次后，滴加至打磨好的磁性玻碳电极上，在CHI660E电化学工作站进行电化学检测；检测采用三电极体系：磁性玻碳电极Φ＝5mm作为工作电极，铂丝与饱和甘汞电极分别用作对电极和参比电极；反应体系为含有1mmol/L H2O2和1mmol/L对苯二酚的PBS缓冲溶液；扫描范围为-0.25V至0.25V，脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为50ms，扫描速率为60mV/s；分析测定样品电流的响应值和样品中鼠李糖乳杆菌浓度的对应关系，绘制标准曲线，确定线性范围，所有测量均在室温下进行。
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| 基于铁磁性纳米材料的电化学生物传感器研究;赖国松;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 信息科技辑》;20090715;I140-75 * |
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