CN109115741A - 一种多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测病原微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物检测领域，具体公开了一种多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测病原微生物，并对作用于微生物的抗生素进行筛选，该“化学鼻”传感器包括多色荧光蛋白和季铵盐化的磁性纳米颗粒。基于上述“化学鼻”传感器，多色荧光蛋白信号猝灭，而后与待测病原微生物竞争结合，多色荧光蛋白游离发出荧光信号，再根据荧光信号的变化差异，得到不同微生物的响应信号；进一步地，“化学鼻”传感器与经抗生素作用的待测微生物竞争结合，对抗生素进行筛选。本发明的“化学鼻”传感器操作简单、使用方便，灵敏度高、稳定性强，可用于病原微生物及其作用抗生素的快速检测和筛选，能够为微生物感染、抗生素鉴别以及疾病诊断等方面提供参考和借鉴。

Description

一种多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测病原微生物
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体地说，涉及一种多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测病原微生物并响应经抗生素作用的微生物从而对抗生素实现筛选。
背景技术
微生物包括细茵、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，分布广泛，其生命活动与人类的日常生活和生产息息相关。食品、健康、医药、工农业、环保、能源开发等诸多领域都离不开微生物的贡献。但是，自然界中除了对人类有益的微生物外，还有一部分会引起人类和动植物的病理性损伤，这类微生物称为“病原微生物”。由病原微生物引起的疾病不仅威胁着我国及其他发展中国家，也在威胁着发达国家，其引起的传染病具有传染性强、传播速度快、病死率高、危害大等特点，至今仍威胁着人类和动植物的健康。
要对病原微生物进行有效控制，最关键的就是对其快速有效的检测与诊断。传统的检测方法主要根据细菌的生理生化特征，经过前增菌、选择性平板分离、生物化学鉴定等步骤，从取样到确定结果需要3-5天，检测周期长，操作繁琐，工作量大。利用抗原抗体反应的特异性，对细菌进行鉴别，已有了半个多世纪的历史，但是微生物抗体的筛选十分繁琐，并且最终的检测特异性不高。当然，随着分子生物学检测技术的不断完善和发展，采用PCR技术针对病原微生物开展的快速检测方法得到迅速发展，但是，其样品需要特殊处理，有较高的技术要求且不容易分析结果。
生物传感器是近数十年发展起来的一种新型传感器，其通过探针的专一识别功能，可在复杂的有机、生化样品中对目标化合物进行快速分析，甚至具有可对生物活体进行分析的独特优势。因其具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、可在复杂体系中进行在线连续监测等优点，已经广泛应用到了微生物快速检测的领域。
与此同时，纳米技术的发展推进了探究纳米材料在生物传感器中的应用。纳米技术的两大效应——量子尺寸效应和表面效应更将生物传感器的性能提高到了一个新的水平。与传统的生物传感器相比，以纳米材料作为检测探针的生物传感器呈现出体积更小、检测速度更快、灵敏度更高和可靠性更好等优异性能。
磁性 Fe3O4纳米粒子作为研究较多的纳米材料之一，除了一般纳米材料所具有的两大效应之外，还具有超顺磁性、良好的生物相容性、较高的导电性和无毒副作用等优点。这使得生物传感器的检测灵敏度得到显著提高，生化反应时间明显缩短，检测通量显著增加，为其在纳米生物传感器领域提供了广阔的应用前景。
而“化学鼻”作为纳米生物传感器的一个重要分支，其传感机制取决于一系列荧光染料与生物靶点结合导致光学信号变化或位移，从而形成类似指纹识别的信息，通过选择性的相互作用建立一种有效的选择模式，对复杂的底物或者变化进行高通量的区分和判别。因此，“化学鼻”传感器已广泛应用于生物化学分析、医学诊断、环境监测、食品安全等领域。
本专利中采用一种多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测病原微生物，并使其来筛选作用于微生物的抗生素。
发明内容
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测病原微生物，其特征在于，包括：多色荧光蛋白和季铵盐化的磁性纳米颗粒。
上述的“化学鼻”传感器中，多色荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白。
上述的多色荧光蛋白中，作为优选，蓝色荧光蛋白的激发/发射波长为380/450nm，绿色荧光蛋白的激发/发射波长为480/510nm，红色荧光蛋白的激发/发射波长为555/585nm。
上述的多色荧光蛋白，作为优选，蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白的混合比例为1:1:1，且均溶液PBS缓冲液。
上述的“化学鼻”传感器中，季铵盐化的磁性纳米颗粒，作为优选，苯基官能团的季铵盐化的磁性纳米颗粒，采用以下方式制备得到：通过化学共沉淀法制备得到磁性Fe3O4纳米粒子，进一步通过加入硅烷偶联剂（APS）活化纳米磁性颗粒表面，最后通过加入苯甲醛得到。
上述的苯基官能团的季铵盐化的磁性纳米颗粒，作为优选，其直径为1~10nm。
上述的“化学鼻”传感器中，对作用于微生物的抗生素进行筛，作为优选，其微生物包括代表革兰式阳性菌的金黄葡萄球菌和代表革兰式阴性菌的大肠杆菌。
上述的“化学鼻”传感器中，对作用于微生物的抗生素进行筛，抗生素包括；广谱抗生素和窄谱抗生素
上述的抗生素中，广谱抗生素，包括：氨苄青霉素、盐酸克林霉素、头孢噻肟钠、硫酸卡那霉素、氯霉素、新霉素、土霉素、青霉素G、利福平。
上述的抗生素中，窄谱抗生素，包括：盐酸万古霉素、杆菌肽锌、硫酸粘杆菌素、硫酸链霉素。
本发明具有下述有益技术效果：
1.本发明所建立的多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测方法与生物传感器相比，具有高度亲和力和高度选择性，可以简化分析检测步骤，缩短分析时间，实现了病原微生物的快速、简单、灵敏的检测。对于快速检测领域的微生物检测方面，具有非常好的应用前景。
2.磁性Fe3O4纳米颗粒具有超顺磁性、良好的生物相容性、较高的导电性和无毒副作用等优点。同时，制备成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时分离目标菌体便捷，在很大程度上提高了检测的准确性。
3. 本发明所建立的多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测方法不仅能用于病原微生物的检测，同时也能对作用于微生物的抗生素进行筛选。能够为微生物感染、抗生素鉴别以及疾病诊断等方面提供参考和借鉴。
附图说明：
图1为多色荧光蛋白与磁性纳米粒子形成“化学鼻”传感器检测微生物示意图；
图2为多色荧光蛋白与磁性纳米粒子形成“化学鼻”传感器对作用于微生物的抗生素进行筛选的示意图；
图3多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测浓度为5×108 cfu mL-1伤寒沙门菌（E.typhi）、粪肠球菌（E.faecalis）、大肠杆菌（E.coli）、肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae）、单增李斯特氏菌（L.monocytogenes）、奇异变形菌（P.mirabilis）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、痢疾志贺菌（S.dysenteriae）、金黄葡萄球菌（S.aureus）、酿脓链球菌（S.pyogenes）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）;
图4多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测浓度为5×106 cfu mL-1伤寒沙门菌（E.typhi）、粪肠球菌（E.faecalis）、大肠杆菌（E.coli）、肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae）、单增李斯特氏菌（L.monocytogenes）、奇异变形菌（P.mirabilis）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、痢疾志贺菌（S.dysenteriae）、金黄葡萄球菌（S.aureus）、酿脓链球菌（S.pyogenes）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）;
图5多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测浓度为5×104 cfu mL-1伤寒沙门菌（E.typhi）、粪肠球菌（E.faecalis）、大肠杆菌（E.coli）、肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae）、单增李斯特氏菌（L.monocytogenes）、奇异变形菌（P.mirabilis）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、痢疾志贺菌（S.dysenteriae）、金黄葡萄球菌（S.aureus）、酿脓链球菌（S.pyogenes）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）;
图6多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测抗生素（利用金黄葡萄球菌作为来源）；
图7多色荧光磁性化学鼻传感器快速筛选抗生素机制热图（利用金黄葡萄球菌作为来源）；
图8多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测抗生素（利用大肠杆菌作为来源）；
图9多色荧光磁性化学鼻传感器快速筛选抗生素机制热图（利用大肠杆菌作为来源）。
具体实施方法：
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
“化学鼻”传感器构建：浓度分别为（100 n M）的蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白与苯基官能团的季铵盐化的磁性纳米颗粒进行滴定反应，直到三种荧光强度减少到最低值。即可以获得荧光聚合物-磁性“化学鼻”传感器。
实施例2：
伤寒沙门菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108 cfuml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定伤寒沙门菌的种类。
伤寒沙门菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定伤寒沙门的种类。
伤寒沙门菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定伤寒沙门菌的种类。
实施例3：
粪肠球菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108 cfuml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定粪肠球菌的种类。
粪肠球菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定粪肠球菌的种类。
粪肠球菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定粪肠球菌的种类。
实施例4：
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108 cfuml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定大肠杆菌的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定大肠杆菌的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定大肠杆菌的种类。
实施例5：
肺炎克雷伯氏菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定肺炎克雷伯氏的种类。
肺炎克雷伯氏菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106 cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定肺炎克雷伯氏的种类。
肺炎克雷伯氏菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104 cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定肺炎克雷伯氏的种类。
实施例6：
单增李斯特氏菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定单增李斯特氏菌的种类。
单增李斯特氏菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106 cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定单增李斯特氏菌的种类。
单增李斯特氏菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104 cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定单增李斯特氏菌的种类。
实施例7：
奇异变形菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108 cfuml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定奇异变形的种类。
奇异变形菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定奇异变形的种类。
奇异变形菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定奇异变形的种类。
实施例8：
铜绿假单胞菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定铜绿假单胞菌的种类。
铜绿假单胞菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106 cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定铜绿假单胞菌的种类。
铜绿假单胞菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104 cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定铜绿假单胞菌的种类。
实施例9：
痢疾志贺菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108 cfuml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定痢疾志贺菌的种类。
痢疾志贺菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定痢疾志贺菌的种类。
痢疾志贺菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定痢疾志贺菌的种类。
实施例10：
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定金黄葡萄球菌的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106 cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定金黄葡萄球菌的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104 cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定金黄葡萄球菌的种类。
实施例11：
酿脓链球菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108 cfuml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定酿脓链球菌的种类。
酿脓链球菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定酿脓链球菌的种类。
酿脓链球菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定酿脓链球菌的种类。
实施例12：
副溶血弧菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×108 cfuml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定大肠杆菌的种类。
副溶血弧菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×106cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定副溶血弧菌的种类。
副溶血弧菌在LB培养基中37℃培养12h，再用PBS清洗三次并稀释至浓度为5×104cfu ml-1，取100µL上述菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定副溶血弧菌的种类。
实施例13：
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的氨苄青霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的盐酸克林霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的头孢噻肟钠，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的硫酸卡那霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的氯霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的新霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的土霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的青霉素G，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的利福平，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的盐酸万古霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
金黄葡萄球菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfuml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的杆菌肽锌，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
实施例14：
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的氨苄青霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的盐酸克林霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的头孢噻肟钠，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的硫酸卡那霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的氯霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的新霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的土霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的青霉素G，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的利福平，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的硫酸粘杆菌素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。
大肠杆菌在LB培养基中37℃培养12h。用LB培养基将菌液浓度稀释至106 cfu ml-1，取500µL上述菌液与500µL半抑制浓度的硫酸链霉素，培育12h后，用PBS清洗三次微孔板清洗三次。取100µL上述清洗后的菌液与100µL纳米传感器复合体,培育15min。用磁铁去除磁性颗粒或磁性颗粒-微生物复合物，用酶标仪测量三种荧光阵列响应信号。结合线性判别分析即可以确定抗生素的种类。

Claims (10)

1.一种多色荧光磁性化学鼻传感器快速检测病原微生物，其特征在于，包括：多色荧光蛋白和季铵盐化的磁性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的多色荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白。
3.根据权利要求2所述的多色荧光蛋白，其特征在于，蓝色荧光蛋白的激发/发射波长为380/450nm，绿色荧光蛋白的激发/发射波长为480/510nm，红色荧光蛋白的激发/发射波长为555/585nm。
4.根据权利要求2所述的多色荧光蛋白，其特征在于，蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白的混合比例为1:1:1，且均溶液PBS缓冲液。
5.根据权利要求1所述的季铵盐化的磁性纳米颗粒，其特征在于，苯基官能团的季铵盐化的磁性纳米颗粒，采用以下方式制备得到：通过化学共沉淀法制备得到磁性Fe3O4纳米粒子，进一步通过加入硅烷偶联剂（APS）活化纳米磁性颗粒表面，最后通过加入苯甲醛得到。
6.根据权利要求5所述的苯基官能团的季铵盐化的磁性纳米颗粒，其特征在于，其直径为1~10nm。
7.根据权利要求1所述的对作用于微生物的抗生素进行筛，其特征在于，其微生物包括代表革兰式阳性菌的金黄葡萄球菌和代表革兰式阴性菌的大肠杆菌。
8.根据权利要求1所述的对作用于微生物的抗生素进行筛，抗生素包括；广谱抗生素和窄谱抗生素。
9.根据权利要求8所述广谱抗生素，包括：氨苄青霉素、盐酸克林霉素、头孢噻肟钠、硫酸卡那霉素、氯霉素、新霉素、土霉素、青霉素G、利福平。
10.根据权利要求8所述窄谱抗生素，包括：盐酸万古霉素、杆菌肽锌、硫酸粘杆菌素、硫酸链霉素。
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