CN107446052A

CN107446052A - 多功能复合超分子纳米纤维自组装体系及其应用

Info

Publication number: CN107446052A
Application number: CN201710436059.9A
Authority: CN
Inventors: 钟超; 安柏霖; 崔孟奎
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2017-12-08

Abstract

本发明提供了多功能复合超分子纳米纤维自组装体系及其应用。所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，其特征在于，包含至少一种与功能蛋白R结合的FUS LC。FUS LC可以通过基因工程结合各种功能蛋白而不影响其组装纤维的能力，缓慢的纤维生长能力以及多样性的功能蛋白使这种淀粉样蛋白纤维可以实现结构可控以及功能的多样化。

Description

多功能复合超分子纳米纤维自组装体系及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白自组装，基因工程技术和多功能超分子材料领域，特别是涉及利用一种自组装蛋白质分子制作结构复杂的多功能复合材料的方法及应用。

背景技术

超分子泛指一类利用氢键、疏水作用力、π-π共轭以及范德华力等微弱的非共价相互作用将大量单体聚集在一起并维持相对稳定结构的物质¹。在自然界中广泛存在，通过调控离散单体自组装形成功能化一维纳米纤维材料，比如生命体内维持细胞生存并协助细胞运动的微管及肌动纤维，即是通过单体与单体间微弱的氢键作用力，自组装形成的一维纳米纤维材料。调控单体自组装形成超分子纳米结构不仅有助于生命体中小分子物质发挥特定功能，而且在高分子化学，纳米科技以及材料科学领域也具备深刻的科学启迪意义。在此引导下，人类已经发展出多种多样的超分子自组装体系，并且在仿生矿化^2，3，纳米电子器件^4，5，再生医学^6，7以及能源材料^8，9等领域取得众多的突破。

当前人工的超分子材料体系主要是基于合成的可自组装的化合物小分子以及天然蛋白质或者人为设计的短肽，比如①利用合成的小分子自组装形成活性可控的纳米纤维¹⁰；②利用基因工程化的蚕丝蛋白发展嵌段纳米纤维¹¹；③通过可迅速形成纤维的凝胶因子发展自分类纤维网络¹²；④借助烷基化多肽这类双亲性分子制作功能性纤维材料²；⑤通过β折叠的多肽构建多功能性纳米纤维¹³；⑥依靠基因工程的淀粉样蛋白自组装形成生物纳米材料¹⁴。然而以上这些方法所制备的纳米纤维结构，却不能够很好的兼顾结构与功能性的统一，往往是实现了结构的多样化却忽视了其作为材料应具备的功能性，因而其实用价值大打折扣。

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发明内容

本发明的目的是设计一种兼顾结构与功能的超分子自组装体系，以及利用该体系制作结构复杂且功能多样的超分子纳米材料的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，其特征在于，包含至少一种与功能蛋白R结合的FUS LC蛋白(R-FUS LC，R为功能蛋白，FUS LC为纤维自组装蛋白)。

优选地，所述的功能蛋白R含有荧光蛋白，黏性蛋白，氢化酶，固氮酶或者甲烷单加氧酶中的至少一种。

优选地，所述的功能蛋白R含有组氨酸标签Histag、Spycatcher、绿色荧光蛋白EGFP、红色荧光蛋白mCherry、光激活荧光蛋白mMaple3和PAtagRFP、贻贝足丝蛋白Mefp3和Mefp5、贻贝足丝蛋白Mefp3和Mefp5、贻贝足丝蛋白Mgfp3和Mgfp5、甲烷单加氧酶、镍铁氢化酶、铁铁氢化酶以及固氮酶中的至少一种。

优选地，所述的R为His、mMaple3、PAtagRFP、EGFP、Spycatcher、mefp5、 mCherry、CFP以及EGFP中的至少一种。

优选地，所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系还包含至少一种由与功能蛋白R结合的FUS LC蛋白形成的纳米纤维。

一种用于构建上述多功能复合超分子纳米纤维自组装体系的载体，其特征在于，包含至少一种能够表达上述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系的载体。

优选地，所述的载体包括pHis-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC， pHis-mCherry-FUSLC，pHis-mMaple3-FUS LC，pHis-PAtagRFP-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher与pHis-EGFP-FUS LC-mefp5质粒中的至少一种。

一种超分子纳米材料，其特征在于，利用上述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系制成。

优选地，所述的超分子纳米材料为单组份纳米纤维、无规共聚纳米纤维、嵌段纳米纤维、自分类纳米纤维、纳米物件修饰和定向组装的纳米纤维中的至少一种。

更优选地，所述的纳米物件为Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点、Co-NTA 修饰的金纳米颗粒、Co-NTA修饰的CdS纳米棒以及Spytag修饰的金纳米颗粒中的至少一种。

本发明还提供了一种利用上述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系制作超分子纳米材料的方法，其特征在于，包括将多功能复合超分子纳米纤维自组装体系浓缩，于4℃或室温条件下静置过夜，得到超分子纳米纤维。

本发明还提供了上述的超分子纳米材料在生物催化、生物标记、制备生物材料、生物防伪和生物粘性材料以及生物医药和能源领域中的应用。

本发明基于哺乳动物核内蛋白FUS(fused in sarcoma)的一段可缓慢自组装形成纳米纤维的蛋白序列(216个氨基酸，氨基酸种类较单一，又称为低复杂度序列LC)，利用基因工程使其结合多样的功能蛋白R，通过控制不同的纤维生长条件，制作结构复杂且功能多样的超分子纳米材料。

R包括组氨酸标签Histag、Spycatcher、绿色荧光蛋白EGFP、红色荧光蛋白mCherry、光激活荧光蛋白mMaple3和PAtagRFP以及贻贝粘性蛋白mefp5等。

纤维生长条件包括几种FUS LC功能蛋白单体的随机生长体系、纤维成核点的诱发体系以及基于FUS LC与CsgA纤维生长速度差异的自分类体系。

该发明提供了上述的FUS-R功能蛋白的构建，提纯以及表征方法，表达质粒分别为pHis-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC，pHis-mCherry-FUS LC， pHis-mMaple3-FUS LC，pHis-PAtagRFP-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher 与pHis-EGFP-FUS LC-mefp5。

本发明证明了上述基于功能化FUS LC的随机共聚物、嵌段共聚物以及自分类的纳米纤维体系，并以这些体系为模板实现了不同纳米颗粒在纤维上的多样的排列组装模式。此外本发明也验证了所制作的多功能复合纳米材料在生物胶粘剂以及生物防伪领域的应用。

本发明可同时组装几种携带不同功能蛋白的FUS LC单体形成无规共聚的多功能纳米结构；可根据此淀粉样蛋白纤维协同增长的机理，在蛋白单体溶液中加入纤维种子促进纤维增长，形成多嵌段纳米纤维；可基于FUS LC较慢的纤维生长速度(≈10小时)，配合使用纤维生长速度较快(≈2小时)的功能化CsgA蛋白，组装形成自分类多功能纳米纤维网络；可以融合各种结合无机纳米材料的功能短肽，通过对纤维结构的控制，实现特定位置绑定各种无机纳米材料(包括纳米金，量子点，半导体纳米棒)，用在催化和纳米电子领域；所得的纳米纤维，可以融合各种结合无机纳米材料的功能短肽，通过对纤维结构的控制，实现特定位置绑定各种无机纳米材料(包括纳米金，量子点，半导体纳米棒)，用在催化和纳米电子领域。本发明所述的多功能纳米纤维材料可用于生物催化、生物标记、制备生物材料、生物防伪和生物粘性材料以及生物医药和能源领域中的应用。所述的多功能纳米纤维材料以不同比例混合，不同尺度、图形阵列图案化应用于防伪生物材料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明通过基因工程手段对FUS LC进行基因融合，从而引入具有功能可调的肽段或蛋白质，由于形成纳米纤维结构，相应的功能蛋白的稳定性也大大提高。

2.FUS LC具有较缓慢的纤维生长速度，因而可以调控不同的单体添加顺序实现复杂的纳米结构，结合不同的功能性蛋白，从而实现纳米材料结构与功能的统一。

3.可以利用基因工程整合多种粘性蛋白，结合FUS LC蛋白可成凝胶的特点，发展水下胶黏水凝胶。

4.利用FUS超分子纤维的不同聚合结构，以及蛋白质分子的图案化技术，将其应用于防伪领域，实现多种手段，不同尺度检测级别的防伪。

5.FUS超分子纤维可以融合各种结合无机纳米材料的功能短肽，通过对纤维结构的控制，实现特定位置绑定各种无机纳米材料(包括纳米金，量子点，半导体纳米棒)，用在催化和纳米电子领域。

6.利用基因工程可以引入各种生物催化酶蛋白到FUS LC，实现绿色催化，并在能源和可持续性技术方面有潜在引用。

附图说明

图1为重组FUS LC蛋白的特性描述，FUS LC蛋白首先聚集形成液滴，之后单体缓慢自组装形成功能性纳米纤维，浓密的纳米纤维通过物理交联形成温度可逆的水凝胶。

图2为构建的重组FUS LC融合质粒的图谱；

图3为构建的重组CsgA以及mCherry-Spycatcher融合质粒的图谱；

图4为各种重组FUS LC的纳米纤维AFM形貌，a为FUS LC纳米纤维，b为 EGFP-FUSLC纳米纤维，c为mCherry-FUS LC纳米纤维，d为mMaple3-FUS LC 纳米纤维，e为PAtagRFP-FUS LC纳米纤维，f为EGFP-FUS LC-Spycatcher纳米纤维，g为EGFP-FUS LC-mefp5纳米纤维。

图5为各种重组FUS LC的纳米纤维荧光显微镜观察图。a为EGFP-FUS LC纳米纤维，b为mCherry-FUS LC纳米纤维，c为mMaple3-FUS LC纳米纤维，d 为PAtagRFP-FUS LC纳米纤维，e为EGFP-FUS LC-Spycatcher纳米纤维，f为 EGFP-FUS LC-mefp5纳米纤维。

图6为各种重组FUS LC纳米纤维的XRD衍射，a为FUS LC纳米纤维的XRD， b为EGFP-FUS LC纳米纤维的XRD，c为mCherry-FUS LC纳米纤维的XRD， e为mMaple3-FUS LC纳米纤维的XRD，f为PAtagRFP-FUS LC纳米纤维的 XRD。

图7为FUS LC，EGFP-FUS LC，mCherry-FUS LC三种纳米纤维的圆二色谱。

图8为重组FUS LC的凝胶试验。a中高浓度的mCherry-FUS LC与b中的 EGFP-FUSLC可以形成温度响应的可逆水凝胶，而c中的mMaple3-FUS LC与d 的PAtagRFP-FUS LC却易形成沉淀。

图9为无规共聚物状重组FUS LC纳米纤维的AFM形貌及荧光表征。a，b，c 分别指EGFP-FUS LC：mCherry-FUS LC单体比例为3∶1，1∶1以及1∶3时形成的纳米纤维AFM形貌图。d为上述无规共聚物重组FUS LC的荧光显微镜观察图。

图10为EGFP-FUS LC：mCherry-FUS LC单体比例为3∶1，1∶1以及1∶3形成的无规共聚纳米纤维的圆二色谱图a与XRD衍射图b。

图11为有无纤维成核点时反应FUS LC淀粉样蛋白单体自组装的ThT生长曲线。

图12为嵌段纳米纤维的荧光纤维观察图及数量分布图。a为Stage 1(EGFP-FUS LC纤维：mCherry-FUS LC单体＝1∶3)时形成的纳米纤维的荧光显微镜观察图，b 为Stage 2(Stage 1纤维：EGFP-FUS LC单体＝1∶3)时形成的纳米纤维的荧光显微镜观察图，c为Stage3(Stage 2纤维：mCherry-FUS LC单体＝1∶3)时形成的纳米纤维的荧光显微镜观察图，d为EGFP-FUS LC纤维：mCherry-FUS LC单体分别为1∶3，1∶6，1∶9时的嵌段纤维数目统计图，e为Stage 1，Stage 2，Stage 3时的嵌段纤维数目统计图。

图13为EGFP-FUS LC纤维：mCherry-FUS LC单体比例为1∶3，1∶6以及1∶9形成的嵌段纳米纤维的圆二色谱图a与XRD衍射图b。

图14为由重组CsgA与FUS LC形成的自分类纳米纤维网络。a为自分类纳米纤维的AFM形貌图，b为荧光观察图

图15为基于重组FUS LC纳米纤维的纳米颗粒定向组装图。a为量子点，金纳米颗粒以及纳米棒在单组分FUS LC纳米纤维上的绑定AFM与TEM图，b为金纳米颗粒与纳米棒在无规共聚纳米纤维上的特异性定向组装，c为金纳米颗粒在嵌段纳米纤维上的的特异性定向组装，d为金纳米颗粒以及量子点在自分类纳米纤维网络上的的特异性定向组装。

图16为基于EGFP-FUS LC和mCherry-FUS LC单体的不同自组装结构的纤维的涂层。其在紫外光下表现出荧光特性，在荧光显微镜下可以分辨出两种荧光纤维的简单混合，嵌段共聚，无规共聚的结构，其荧光发射光谱皆表现为和单体一致的红绿荧光的叠加。

图17为基于EGFP-FUS LC和mCherry-FUS LC单体的不同自组装结构的纤维的图案化。宏观上可以在印在不同的材料表面，如金属铝，无机玻璃片，有机聚对苯二甲酸乙二醇酯表面，展示出包含防伪信息的二维码，微观上用显微镜可以观察到微米或纳米尺度的简单图形的阵列，如三角形，圆形阵列。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作进行各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明提供的基因工程超分子自组装功能蛋白技术主要是针对FUS LC蛋白进行基因融合或改造，制作出基于FUS LC的多种功能化重组基因R-FUS LC， R为功能基团。

如图1所示，纯化后的R-FUS LC重组蛋白具备较缓慢的纤维生长速度。首先，在体外蛋白聚集形成蛋白液滴(liquid droplets)，液滴局部高浓度的单体聚集有利于融合蛋白β折叠形成功能化的纳米纤维；在低温以及较高蛋白浓度下，密集的纤维之间的物理交联促使该蛋白溶液发生相转变形成功能可控的可逆水凝胶。R代表图中描述的几类功能基团，包括可结合金属的短肽Histag、可与短肽Spytag特异性识别的蛋白Spycatcher，也有粘性蛋白Mefp5以及荧光蛋白 EGFP，mCherry，PAtagRFP和mMaple3等，可在生物催化、生物防伪和生物粘性材料等领域有应用。

以下实施例中，如无特殊说明，PCR扩增及PCR鉴定采用的反应体系(50μl) 包括以下成份：

PCR反应条件为：98℃预变性20s，98℃10s，58℃30s，72℃45s，35个循环，最后72℃延伸5min，以去离子水为阴性对照。

以下实施例中，如无特殊说明，使用的LB培养基购自(中国台湾生工，L001-1 kg)抗生素溶液的配制方法为：羧苄青霉素(macklin，C805408)配制成100mg/ml 的水溶液于-20℃保存，使用时抗生素终浓度为50ng/ml。

以下实施例中，如无特殊说明，使用的裂解液，清洗液，洗脱液，透析液配方如下：

(1)裂解液：

50mM Tris-HCI(pH＝7.5)

500mM NaCI

20mM BME(β-巯基乙醇)

1％Tween-20

(2)清洗液：

20mM Tris-HCI(pH＝7.5)

500mM NaCI

20mM BME(β-巯基乙醇)

1％Tween-20

40mM咪唑

(3)洗脱液：

20mM Tris-HCI(pH＝7.5)

500mM NaCI

20mM BME(β-巯基乙醇)

1％Tween-20

400mM咪唑

(4)透析液：

20mM Tris-HCI(pH＝7.5)

200mM NaCI

20mM BME(β-巯基乙醇)

1％Tween-20

0.5mM EDTA

其中Tris-HCI购自Promega，NaCI购自国药，BME购自安耐吉，Tween-20 购自BBI，咪唑购自安耐吉化学，EDTA购自Amresco。

以下实施例中所用到的大肠杆菌BL21(DE3)，可从TransGene Biotech (Beijing)购买，目录号为CD601。

以下实施例中所用到的pHis-FUS LC，pHis-mCherry-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC以及pHis-CFP-FUS LC质粒已在申请日前于非专利文献 (Cell-free Formation of RNAGranules：Low Complexity Sequence Domains Form Dynamic Fibers withinHydrogels.2012，Cell，Volume 149，Issue 4，11May 2012， Pages 753-767.Masato Kato，Tina W.Han，Steven L.McKnight)中公开，美国西南医学院的McKnight教授课题组已将上述质粒馈赠给本申请人，现由申请人保存，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放上述质粒。

pET11d-CsgA表达质粒已在申请日前于非专利文献(Allen Y Chen，UrartuO.S.Seker，Michelle Y Lu，Robert J Citorik，Timothy Lu.Synthesizing andPatterning Tunable Multiscale Materials with Engineered Biofilms.2014.NatureMaterials)中公开，MIT的Timothy.K.Lu课题组已将上述质粒馈赠给本申请人，现由申请人保存，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放上述质粒。

实施例1：功能性FUS LC蛋白的构建、表达及提纯

构建R-FUS LC表达质粒，在BL21(DE3)大肠杆菌内转入R-FUS LC表达质粒，使其表达R-FUS LC融合蛋白，R为功能蛋白。

本发明利用了一系列表达R-FUS LC的融合质粒，融合了带有不同功能化基团的肽段蛋白质，质粒图谱如图2所示。其中pHis-FUS LC，pHis-mCherry-FUS LC，pHis-CFP-FUSLC以及pHis-EGFP-FUS LC质粒来源于美国西南医学院的McKnight教授课题组馈赠，FUS LC的氨基酸序列见SEQ ID NO：1，EGFP的氨基酸序列见SEQ ID NO：2，mCherry的氨基酸序列见SEQ ID NO：3，CFP的氨基酸序列见SEQ ID NO：4，Histag的氨基酸序列见SEQ ID NO：10，以pHis-mMaple3-FUS LC，pHis-PAtagRFP-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher， pHis-EGFP-FUS LC-mefp5以pHis-EGFP-FUS LC质粒为基础，插入目的基因片段。构建上述所需的表达质粒，其涉及的主要步骤包括：

对于表达质粒pHis-mMaple3-FUS LC以及pHis-PAtagRFP-FUS LC的构建，利用限制性内切酶NcoI(Thermo/Fermentas，货号：FD0574)与BamHI(Life，货号：FD0054)按照常规方法切除表达质粒pHis-EGFP-FUS LC中的EGFP基因并使质粒线性化，针对表达质粒pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher与pHis-EGFP-FUS LC-mefp5的构建，利用限制性内切酶XhoI(Thermo/Fermentas，货号FD0694) 按照常规方法使表达质粒pHis-EGFP-FUS LC线性化，根据R片段与酶切后的表达载体的基因序列设计适用于吉布森连接(Gibbson Assembly)的上下游特异引物。

分别PCR扩增构建各质粒所用的mMaple3片段、PAtagRFP片段、Spycatcher 片段和mefp5片段，所用的引物如下：

1)对于构建质粒pHis-mMaple3-FUS LC，mMaple3片段的正向引物 pHis-mMaple3-FUS LC-F和反向引物pHis-mMaple3-FUS LC-R分别为： pHis-mMaple3-FUS LC-F(SEQ IDNO：13)和pHis-mMaple3-FUS LC-R(SEQ ID NO：14)。以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的mMaple3基因 (mMaple3基因序列为已知序列，记载在文献Characterizationand development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.2014.PNAS.8452-8457，Siyuan Wang，Xiaowei Zhuang中)为PCR模板，对应氨基酸序列分别见SEQ ID NO：5，构建得到的质粒图谱见图2。

2)对于构建质粒pHis-PAtagRFP-FUS LC：引物为pHis-PAtagRFP-FUS LC-F(SEQID NO：15)和pHis-PAtagRFP-FUS LC-R(SEQ IDNO：16)。。PCR 以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的PAtagRFP基因(PAtagRFP基因序列为已知序列，记载在文献(Brightmonomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells.J.Am.Chem.Soc.132，6481-6491(2010).SubachF.V.，Patterson G.H.，Renz M.，Lippincott-Schwartz J.，Verkhusha V.V中)为模板，PAtagRFP氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：6，构建得到的质粒图谱见图2。

3)对于构建pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher质粒：引物为pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher-F(SEQ ID NO：17)和pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher-R(SEQ ID NO：18)。PCR以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的Spycatcher基因 (Spycatcher基因序列为已知序列，记载在文献Superglue from bacteria：unbreakable bridges for proteinnanotechnology.Trends Biotechnol，2014，32， 506-512.Gianluca Veggiani，BijanZakeri，and Mark Howarth.中)为模板，Spycatcher 的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：7。构建得到的质粒图谱见图2。

4)对于构建pHis-EGFP-FUS LC-mefp5质粒：引物为pHis-EGFP-FUS LC-mefp5-F(SEQ ID NO：19)和pHis-EGFP-FUS LC-mefp5-R(SEQ ID NO：20)。 PCR以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的mefp5基因(Mefp5的基因序列为已知序列，记载在文献Strongunderwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibers.NatureNanotechnol，2014，858-866.Chao Zhong，Collin M.Stultz，Timothy K.Lu.中)为模板，mefp5的氨基酸序列见序列列表 SEQ ID NO：8。

各步PCR结束后，用DNA电泳分离目标条带，使用TransGen(北京)凝胶回收试剂盒并按照说明书中记载的操作步骤回收目标基因的DNA片段。

表达载体的构建及目标菌株的获取：

(1)表达载体的构建：将PCR扩增回收的目标片段(mMaple3片段、 PAtagRFP片段、Spycatcher片段和mefp5片段)分别和上述的经酶切并线性化后的pHis-EGFP-FUS LC载体(pHis-EGFP-FUS LC载体序列见SEQ ID NO：12)，用Gibson Assembly(NEB，E2611L)连接得到表达载体，根据各片段的长度和浓度，按所需比例分别加至EP管中。反应体系在50℃中恒温孵育连接1小时。 Gibson assembly(NEB，E2611L)反应体系如下：

(2)将所得的表达载体以及pHis-FUS LC，pHis-mCherry-FUS LC， pHis-CFP-FUSLC以及pHis-EGFP-FUS LC分别按照常规方法转化DH5α(康为世纪CW08085)后，采用提质粒试剂盒(天根DP103)按操作说明提取质粒，由苏州金唯智公司测序后，鉴定重组质粒正确。

(3)将重组质粒用常规的化学转化法转入大肠杆菌感受态BL21 DE3 (TransGeneBiotech CD601)中，涂带有50μg/ml羧苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜。

(4)挑选得到的单克隆，接种到含50μg/ml羧苄青霉素抗性的LB培养基中，经菌落PCR鉴定(目标基因的菌落PCR引物为SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：20相对应的引物，相应的目标基因的氨基酸序列见SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：8)是否含有目的基因片段(R片段)，如扩出条带则证明质粒转化成功。

重组R-FUS LC蛋白的诱导表达及提纯步骤如下：

(1)挑取含有目标质粒(pHis-mMaple3-FUS LC，pHis-PAtagRFP-FUS LC， pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher，pHis-EGFP-FUS LC-mefp5、pHis-FUS LC， pHis-mCherry-FUSLC，pHis-CFP-FUS LC以及pHis-EGFP-FUS LC)的BL21 DE3 大肠杆菌接种到100ml含有50μg/ml羧苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃摇荡培养过夜。

(2)取10ml过夜培养的菌液按1∶100比例接种到1L含50μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基中37℃摇荡培养至OD₆₀₀在0.5-1.0之间。

(3)加入1ml 0.5M IPTG到(2)所述菌液中，16℃摇荡诱导过夜。

(4)诱导后的菌液离心收集菌体，称取菌体质量置于-80℃冷藏。

(5)每克菌体加入10ml裂解液，并添加溶菌酶(BBI Life Sciences)至终浓度0.4mg/ml，震荡均匀，并4℃静置半小时。

(6)利用超声细胞破碎仪(Fisher Scientific，model：FB120)裂解细胞，超声功率为30％，时间间隔为开3秒，关8秒，共计超声30分钟。

(7)35000g离心一小时去除菌体沉淀保留上清，在上清中加入Ni-NTA柱子(General Electric Company，货号：17057501)并置于旋转摇床结合30分钟。

(8)利用重力层析柱(BBI，镍柱)提取蛋白，将上述蛋白溶液加入到重力层析柱，并用200-300ml清洗液清洗重力层析柱。

(9)用20-30ml洗脱液在重力层析柱中洗脱重力层析柱上结合的目标蛋白 (pHis-mMaple3-FUS LC，pHis-PAtagRFP-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher，pHis-EGFP-FUSLC-mefp5、pHis-FUS LC，pHis-mCherry-FUS LC， pHis-CFP-FUS LC以及pHis-EGFP-FUSLC)，并收集流下的目标蛋白溶液，利用 Nanodrop 2000测定蛋白浓度。

实施例2：单组分重组FUS LC纳米纤维的制备及表征

一种多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，包含实施例1中得到的 pHis-mMaple3-FUS LC，pHis-PAtagRFP-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher， pHis-EGFP-FUS LC-mefp5、pHis-FUS LC，pHis-mCherry-FUS LC，pHis-CFP-FUS LC以及pHis-EGFP-FUSLC蛋白中的一种。

利用上述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系制备单组分重组FUS LC 纳米纤维：

将实施例1中得到的目标蛋白(pHis-mMaple3-FUS LC，pHis-PAtagRFP-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher，pHis-EGFP-FUS LC-mefp5、pHis-FUS LC， pHis-mCherry-FUS LC，pHis-CFP-FUS LC以及pHis-EGFP-FUS LC)分别浓缩至 40μM，于4℃(也可为室温条件下)静置过夜可得到大量由目标蛋白自组装产生的超分子纳米纤维，但此时体系内仍然有未完全反应的单体；(2)将所得的超分子纳米纤维体系装入30KD透析袋中并置于透析液中透析过夜，去除游离的蛋白单体，得到纯净的纳米纤维溶液。

利用所得的纳米纤维溶液进行重组FUS LC纳米纤维的表征：

(1)AFM测纤维表面形貌：

200μl上述的透析过夜的纳米纤维溶液滴于平整的云母片上，在室温下静置10分钟，用300ml去离子水冲洗样品并用氮气吹干。用AFM的接触模式测样品表面的形貌。pHis-FUS LC、pHis-mCherry-FUS LC、pHis-mMaple3-FUS LC， pHis-PAtagRFP-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher，pHis-EGFP-FUS LC-mefp5以及pHis-EGFP-FUS LC蛋白形成的纳米纤维的表面形貌如图4所示。

(2)荧光显微镜观察目标蛋白纤维：

取2μl 40μM或0.04μM(40μM溶液稀释1000倍)的上述的纳米纤维溶液于干净的载玻片，在样品上面平置盖玻片，并用指甲油密封玻片制成样品。样品置于正置荧光显微镜下，以63倍物镜观察纤维荧光。选用488nm EGFP激发光波长激发样品pHis-EGFP-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher， pHis-EGFP-FUS LC-mefp5，采用595nm波长激发光激发pHis-mCherry-FUS LC，利用405nm光线活化pHis-mMaple3-FUS LC与pHis-PAtagRFP-FUSLC并分别以488nm与595nm激发光激发荧光蛋白并采集数据，荧光数据如图5所示。

(3)X-ray衍射实验测纤维二级结构：

取上述的纳米纤维溶液静置一周后，10000g离心10分钟收集纤维沉淀，将沉淀用去离子水清洗三次，利用XRD测纳米纤维的二级结构(图6)，与圆二色谱实验相同，X-ray也证明了重组纳米纤维具备β-sheet二级结构。

(4)圆二色谱实验测纤维二级结构：

利用上述的透析过夜的纳米纤维溶液继续在去离子水中透析过夜，取透析后的样品利用圆二色谱仪测其纤维二级结构，pHis-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC， pHis-mCherry-FUS LC的圆二色谱数据如图7所示，与pHis-FUS LC蛋白形成的纳米纤维相比，证明这些重组蛋白纤维都具备β-sheet二级结构。

(5)重组FUS LC纳米纤维相转变成凝胶实验：

将pHis-mCherry-FUS LC与pHis-EGFP-FUS LC，pHis-mMaple3-FUS LC， pHis-PAtagRFP-FUS LC蛋白形成的纳米纤维溶液分别浓缩至800μM于4℃静置过夜，结果如图8所示，pHis-mCherry-FUS LC与pHis-EGFP-FUS LC可以形成可逆的水凝胶，而pHis-mMaple3-FUS LC与pHis-PAtagRFP-FUS LC由于缺乏增溶性蛋白标签(例如EGFP与mCherry)极易形成蛋白沉淀，而失去成胶能力。

实施例3：双组分无规共聚物状重组FUS LC纳米纤维的制备及表征

一种多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，包含实施例1中得到的 pHis-EGFP-FUS LC与pHis-mCherry-FUS LC蛋白。

鉴于实施例2中证明的pHis-EGFP-FUS LC与pHis-mCherry-FUS LC蛋白超强的纤维生长与凝胶生成能力，将相同物质的量浓度(40μM)的实施例1得到的pHis-EGFP-FUS LC与pHis-mCherry-FUS LC蛋白单体溶液按照1∶3，1∶1 以及3∶1比例混合在一起形成所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系在 4℃静置(或透析过夜)使其自组装形成重组FUSLC纳米纤维(图9a，9b，9c)。正置荧光显微镜表征如图9d所示，可以证明随着pHis-mCherry-FUS LC与 pHis-EGFP-FUS LC组分比值扩大，所生成的复合纤维的颜色也在由偏绿色逐渐趋向红色，说明该体系所得到的纳米纤维是两种重组FUS LC单体自组装的结果，这种纳米纤维称之为双组分无规共聚物状重组FUS LC纳米纤维。圆二色谱与 X-ray实验也证明这种无规共聚物状纳米纤维依然具备很强的β-sheet(图10)。

实施例4：多嵌段重组FUS LC纳米纤维的制备及表征

淀粉样蛋白一般具备种子诱发单体聚集的性质，为了证明FUS LC纤维种子能否加速FUS LC单体的自组装，一种专用于淀粉样蛋白的染料ThT被用来检测 FUS LC的生长速度，具体操作如下所示：

①取2ml按照实施例1方法所得的刚纯化的pHis-FUS LC蛋白溶液(20 μM)分为两组，每组1ml，一组加入10μl成熟的pHis-FUS LC蛋白形成的纤维溶液(按照实施例2中记载的方法得到)(20μM)，编号A，另一组加入10μl 去离子水，编号B；

②取20μl 1mM ThT染料加入A与B中至终浓度20μM，并混合均匀；

③将A与B各分为5组分别加至96孔板的孔道内，每个孔道200μl；

④将96孔板加至酶标仪，利用495nm波长激光检测50小时，测样品A 与B纤维的生长曲线。

结果如图11所示，加入pHis-FUS LC蛋白形成的纤维种子可以加速pHis-FUS LC蛋白单体的自组装近4个小时，这不仅证明了FUS LC纤维增长符合协同机理，也证明了基于重组FUS LC多嵌段纳米纤维的可行性。

一种多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，包含实施例1中得到的pHis-EGFP-FUS LC蛋白以及由实施例1中得到的pHis-mCherry-FUS LC蛋白形成的纳米纤维；或包含实施例1中得到的pHis-mCherry-FUS LC蛋白以及由实施例1中得到的pHis-EGFP-FUS LC蛋白形成的纳米纤维。

基于重组R-FUS LC多嵌段纳米纤维的制备：

①纯化并浓缩实施例1制得的pHis-EGFP-FUS LC或pHis-mCherry-FUS LC 蛋白溶液至(40μM)，置于4℃一周(或透析过夜)使其自组装完全；

②纯化并浓缩pHis-EGFP-FUS LC或pHis-mCherry-FUS LC蛋白溶液至(40 μM)，分别对应加入①中的pHis-mCherry-FUS LC或pHis-EGFP-FUS LC蛋白形成的纳米纤维溶液，调节纤维种子与蛋白单体比例为1∶3，1∶6，1∶9，形成多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，置于4℃一周(或透析过夜)使其形成纳米纤维。以pHis-EGFP-FUS LC蛋白形成的纳米纤维为成核点，加入 pHis-mCherry-FUS LC蛋白单体的荧光显微镜观察以及嵌段纤维比重统计结果如图12a以及图12d所示，可以在荧光显微镜下清晰观察到红色与绿色交替的二嵌段与三嵌段纤维，而且随着纤维种子比例的升高(从1∶9至1∶3)，嵌段纤维在总纤维数目的比重也在上升(从52％至77.1％)，证明了实验的可控性，圆二色谱实验与X-ray实验(图13)也证明了重组FUS LC纳米纤维β-sheet二级结构。

③pHis-EGFP-FUS LC蛋白形成的纤维：pHis-mCherry-FUS LC单体比例为 1∶3的混合溶液置于4℃一周(或透析过夜)使其形成纳米纤维，可得到最多三嵌段的纳米结构，该纤维溶液编号Stage 1，取1ml Stage 1纤维溶液(40μM)加入3 ml pHis-EGFP-FUS LC蛋白单体溶液(40μM)置于4℃一周或透析过夜，可得到至多五嵌段的纳米纤维结构(图12b)，该溶液称为Stage 2，取Stage 2纤维溶液1ml继续添加3倍体积等浓度的pHis-mCherry-FUSLC蛋白单体溶液，可以得到至多七嵌段的纳米纤维(图12c)，该溶液称为Stage 3，从Stage1到Stage 3，利用纤维种子成核促增长机制，逐渐改变不同功能性单体的添加顺序，可以实现多嵌段多功能自组装纳米材料的制备。

实施例5：自分类纳米纤维的制备及表征

从ThT曲线可知(图11)，FUS LC具有较缓慢的纤维自组装速度，纳米纤维一般在10小时左右开始缓慢增长，而另一种大肠杆菌功能性淀粉样蛋白CsgA 却具备极高的自组装活性，可以在2-3小时形成大量淀粉样纤维(ThT图)。由于FUS LC与CsgA各自蛋白序列的保守以及纤维增长速度的差异，因而利用这两种淀粉样蛋白发展自分类多功能纳米纤维材料具备理论可行性。

重组CsgA及mCherry-Spycatcher的构建表达及纯化：

对于构建质粒pHis-CsgA-Spytag：引物为pHis-CsgA-Spytag-F(SEQ ID NO：21)和pHis-CsgA-Spytag-R(SEQ ID NO：22)。质粒图谱见图3。CsgA的氨基酸序列见序列列表SEQID NO：9。

对于构建质粒pHis-mCherry-Spycatcher：引物为pHis-mCherry-Spycatcher-F(SEQ ID NO：23)和pHis-mCherry-Spycatcher-R(SEQ ID NO：24)，质粒图谱见图3。

表达载体的构建：

针对pHis-CsgA-Spytag的构建，以pET11d-CsgA为模板，利用相应的引物 (SEQ IDNO：21与SEQ ID NO：22)进行PCR反应扩增得到目的片段 CsgA-Spytag。PCR结束后，用DNA电泳分离目标条带，使用TransGen(北京) 凝胶回收试剂盒并按照说明书中记载的操作步骤回收目标基因CsgA-Spytag的 DNA片段。

对pHis-EGFP-FUS LC质粒用NdeI(Thermo/Fermentas，货号：FD0584) 与XhoI(Thermo/Fermentas，货号：FD0694)位点酶切去除基因片段EGFP与FUS LC，用GibsonAssembly(NEB，E2611L)将目的片段CsgA-Spytag与线性化后的质粒连接。Gibsonassembly(NEB，E2611L)反应体系如下：

针对pHis-mCherry-Spycatcher的构建，以苏州金唯智生物有限公司按照常规方法合成的Spycatcher基因(Spycatcher基因序列为已知序列，记载在文献 Superglue frombacteria：unbreakable bridges for protein nanotechnology.Trends Biotechnol，2014，32，506-512.Gianluca Veggiani，Bijan Zakeri，and Mark Howarth. 中)为模板(氨基酸序列见SEQ ID NO：7)，利用相应的引物(SEQ ID NO：23与 SEQ ID NO：24)进行PCR反应扩增得到目的片段Spycatcher。PCR结束后，用 DNA电泳分离目标条带，使用TransGen(北京)凝胶回收试剂盒并按照说明书中记载的操作步骤回收目标基因Spycatcher的DNA片段。

对pHis-mCherry-FUS LC质粒用BamHI(Life，货号：FD0054)与XhoI (Thermo/Fermentas，货号：FD0694)位点酶切去除基因片段FUS LC，用Gibson Assembly(NEB，E2611L)将目的片段Spycatcher与线性化后的质粒连接，根据各片段的长度和浓度，按所需比例分别加至EP管中。反应体系在50℃中恒温孵育连接1小时。Gibson assembly(NEB，E2611L)反应体系如下：

(1)表达载体转化DH5α(康为世纪CW08085)后，采用提质粒试剂盒(天根DP103)提取质粒，由苏州金唯智公司测序后，鉴定重组质粒正确。

(2)将重组质粒用化学转化法转入大肠杆菌感受态BL21DE3(TransGene BiotechCD601)中，涂带有50μg/ml羧苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜。

(3)挑选得到的单克隆，接种到含50μg/ml羧苄青霉素抗性的LB培养基中，经菌落PCR鉴定(针对pHis-CsgA-Spycatcher的菌落PCR，引物为SEQ ID NO：21与SEQ ID NO：22，对于pHis-mCherry-Spycatcher，相应的引物为SEQ ID NO：23与SEQ ID NO：24)是否含有目的基因片段(R片段)，如扩出条带则证明质粒转化成功。

重组CsgA蛋白的诱导表达及提纯步骤如下：

1)挑取含有目标质粒的BL21DE3大肠杆菌接种到100ml含有50μg/ml 羧苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃摇荡培养过夜。

2)取10ml过夜培养的菌液按1∶100比例接种到1L含50μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基中37℃摇荡培养至OD₆₀₀在0.5-1.0之间。

3)加入1ml 0.5M IPTG到(2)所述菌液中，37℃摇荡诱导1小时。

4)诱导后的菌液离心收集菌体，称取菌体质量置于-80℃冷藏。

5)每克菌体加入10ml盐酸胍溶液(配方：50mM KPI，8M盐酸胍，pH＝7.2) 置于旋转摇床裂解过夜。

6)35000g离心一小时去除菌体沉淀保留上清，在上清中加入Ni-NTA柱子(GeneralElectric Company，货号：17057501)并置于旋转摇床结合30分钟。

7)利用重力层析柱(镍柱)提取蛋白，将上述蛋白溶液加入到重力层析柱，并用200-300ml清洗液清洗重力层析柱。

8)用20-30ml洗脱液在重力层析柱中洗脱重力层析柱上结合的目标蛋白，并收集流下的目标蛋白溶液，利用Nanodrop 2000测定蛋白浓度。

pHis-mCherry-Spycatcher蛋白的诱导表达及提纯步骤如实施例1所示。

自分类纳米纤维的制备：

取纯化的R-FUS LC与CsgA-R蛋白单体按物质的量比10∶1混合，并置于 4℃(或透析)过夜。以EGFP-FUS LC与CsgA自分类纳米纤维为例，80μM pHis-EGFP-FUS LC蛋白与8μMpHis-CsgA-Spytag蛋白按体积比1∶1混合均匀并在透析液中透析过夜，得到EGFP-FUS LC/CsgA自分类纳米纤维溶液。

自分类纳米纤维的表征：

①AFM表征：

取200μl透析后的EGFP-FUS LC/CsgA自分类纳米纤维溶液滴于平整的云母片静置10分钟，用300ml去离子水冲洗样品并用氮气吹干，利用AFM接触模式扫样品表面形貌，结果如图14a所示，平均高度为8nm的pHis-EGFP-FUS LC 蛋白形成的纤维与2-3nm高的pHis-CsgA-Spytag蛋白形成的纤维交叉分布，说明两类单体自组装形成彼此的纳米纤维而互不干扰。

②荧光显微镜表征：

为了能在荧光显微镜下分开自分类的FUS LC与CsgA纳米纤维，80μM pHis-EGFP-FUS LC蛋白与8μM pHis-CsgA-Spytag蛋白按体积比1∶1混合均匀并在透析液中透析过夜形成自分类纳米纤维。由于Spytag可以特异性的与 Spycatcher蛋白发生共价连接，因而在混合溶液中加入0.1μM pHis-mCherry-Spycatcher蛋白使之特异性与pHis-CsgA-Spytag蛋白结合，便于荧光显微镜观察。荧光观察结果如图14b所示，可观察到团聚的绿色的重组FUSLC纤维与红色的CsgA-Spytag-Spycatcher-mCherry纳米纤维，在稀释的样品中可以观察到两者单根纤维，这些结果都证明了自分类纳米纤维体系的可行性。

实施例6：基于复杂纳米结构的纳米颗粒定向组装

为实现用纳米物件对重组FUS LC纤维的修饰和定向组装，本发明一方面利用Co-NTA配体与重组蛋白FUS LC上面的6xHis标签特异性的结合，将被 Co-NTA修饰后的量子点，金纳米颗粒，以及纳米棒定向组装到重组FUS LC纳米结构上(图15a)，另一方面借助Spytag与Spycatcher之间特异的共价结合，将被Spytag修饰的金纳米颗粒绑定在FUS LC-Spycatcher纤维上面(图15a)。这两方面技术联合运用，可以实现纳米颗粒在复杂纳米结构的定向组装。

合成如下纳米物件，其中，HS-NTA配体，Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点，金纳米颗粒，CdS纳米棒的制备可参照专利CN106698332A。

HS-NTA的合成：

溴乙酸(8.34g，60mmol)溶于30mL的2M的氢氧化钠溶液得到溴乙酸溶液，N6-Cbz-L-赖氨酸(Cbz-lys)(8.4g，30mmol)溶于45mL的2M的氢氧化钠溶液得到Cbz-lys溶液。在冰浴条件下将Cbz-lys溶液逐滴加到溴乙酸溶液中，室温搅拌过夜。加热到70℃，反应2h后冷至室温。加入1M的HCl溶液使其完全沉淀，并将沉淀重新溶解在100mL的1M氢氧化钠溶液中。最后重新加入1M的HCl溶液使其完全沉淀，抽滤并干燥，得到9.55g的Cbz-NTA。

在三口烧瓶中加入Cbz-NTA(6g，15mmol)和Pd/C(钯碳)催化剂(10％， 0.6g)，然后加入100mL的甲醇。在H₂氛围下室温搅拌过夜。过滤得到甲醇溶液，沉淀用40mL的去离子水溶解并抽滤得到水溶液。将甲醇溶液和水溶液旋干，然后将产物重新溶解于20mL去离子水中，加入乙醇直到溶液变浑浊，然后将其置于-20℃冷却析出，过滤并干燥得到3.4g的NH₂-NTA。

将NaHCO₃(1g，11.9mmol)和硫代丁内酯(0.6g，5.9mmol)溶于10mL 的去离子水中，然后加入NH2-NTA(1g，3.8mmol)。反应混合液72℃搅拌过夜，然后冷至室温。加入大约1mL的乙酸将pH调到3左右，旋蒸并使其在乙醇中重新结晶，抽滤并用乙醇和戊烷分别洗三次，干燥产物得到1.26g的 HS-NTA。

Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点的制备：

CdO(282.5mg，2.2mmol)和OA(油胺，10mL)的混合液脱气并在氮气保护条件下加热至150℃，然后加入40mL的ODE(1-18烯)并且加热至305℃。将Se(42.6mg，0.54mmol)和S(1.9mg，0.06mmol)溶于0.6mL的TOP(三辛基膦)中，然后迅速注入反应混合液。反应混合液维持在305℃反应90s以促进 CdSeS壳的生长，然后逐滴加入十二硫醇(0.59mL，3.4mmol)，反应混合液降至 270℃。Zn(OAc)₂(1.049g，5.72mmol)溶于OA(8mL)和ODE(2mL)的混合液中，注入反应混合液，然后S(0.432g，13.5mmol)溶于TOP(7mL)中，快速注入反应混合液中，反应在270℃保持10min以促进完全成壳。得到的量子点溶于正己烷中并用无水乙醇洗三遍，得到CdSeS@ZnS量子点，重悬于20mL正己烷中保存。1mL的乙醇加入1mL(10μmol/mL)的CdSeS@ZnS量子点溶液中，离心，弃上清，并重悬于15mL的二氯甲烷。然后加入20mg/mL HS-NTA 甲醇溶液(1mL，pH＝13)，缓慢搅拌2min，加入9mL的PBS溶液，分出水相并用0.2μm的滤膜过滤，所得溶液为具有NTA配体的CdSeS@ZnS量子点。在 (500nmmol/mL)的具有NTA配体的CdSeS@ZnS量子点的水溶液(1mL)中加入(20μL)的50mM的CoCl₂溶液，得到具有Co-NTA配体修饰的CdSeS@ZnS 量子点。

Co-NTA修饰的8nm金纳米颗粒合成：

在ODE(10mL)，OAm(10mL)and HAuCl_4.3H₂O(0.1g，0.254mmol)的混合液中加入30mg的粒径为6nm的金纳米颗粒(参照专利CN106698332A合成)，氮气保护条件下搅拌使其溶解。反应液加热至80℃，反应2h。反应液迅速冷至室温并加入60mL的丙酮沉淀得到产物，产物溶于20mL的正己烷中并用40mL 的乙醇洗涤，得到粒径为8nm的金纳米颗粒，最后重悬于30mL的正己烷中保存备用。将1mL(3.3mg/mL)上述合成的8nm的金纳米颗粒(OAm-capped AuNPs)溶液加入2mg/mL HS-NTA的PBS溶液(10mL)。反应混合液室温搅拌过夜，分出水相并用0.2μm的滤膜过滤，所得固体为含有NTA配体的8nm的金纳米颗粒溶液。取1mL上述含NTA配体的金纳米颗粒溶液加入20μL的50mM 的CoCl₂溶液，得到具有Co-NTA配体修饰的金纳米颗粒。

Co-NTA修饰的CdS纳米棒的合成：

先合成硫化镉种子：将0.100g氧化镉，0.603g磷酸正十八酯和3.299g三正辛基氧膦混合到一起，放于20ml双颈瓶中，将体系抽真空充氮气，反复三到五次，然后加热到300℃，持续30分钟使得氧化镉溶解。将溶液冷却到120℃，抽真空30分钟，充入氮气然后加热到320℃。当温度稳定之后，将硫溶液(将 0.179g六甲基二硅硫烷溶于3g三正辛基膦中)快速注入到上述反应液中。纳米颗粒在250℃生长7.5分钟，然后将反应体系冷却然后快速注入甲苯终止反应。硫化镉种子用甲醇沉淀。然后用体积比为2∶1的甲苯甲醇混合液洗两次，沉淀溶解在三正辛基膦中。硫化镉种子在408nm处有吸收，在408nm处的摩尔吸光度(ε)为3.96x105cm^-1M^-1。

硫化镉纳米棒的合成：混合0.086g氧化镉，3g三正辛基氧膦，0.290g磷酸正十八酯，0.080g己基磷酸于一个二十毫升双颈瓶中，然后在120℃抽真空。溶液在氮气保护的环境下加热到350℃并持续30分钟。然后加入1.5毫升三正辛基膦。当溶液温度稳定在350℃时，快速注入含有硫化镉种子的溶液(将0.124 g硫和8×10^-8mol硫化镉种子溶于1.5毫升三正辛基膦中)，反应8分钟之后，将反应液冷却，用体积比为1∶1∶1的丙酮、甲苯和甲醇的混合液沉淀。然后沉淀先用甲苯溶解，用辛胺清洗；然后加入甲醇使纳米晶沉淀，将沉淀出的纳米晶体用氯仿溶解，用壬酸清洗；最后用乙醇沉淀，得到硫化镉纳米棒。沉淀用甲苯溶解，避光保存在4℃冰箱。

Co-NTA修饰硫化镉纳米棒的制备：1mL的乙醇加入1mL(10μmol/mL) 的上述合成的(5mmol/L)CdS纳米棒溶液中，离心，弃上清，并重悬于15mL 的二氯甲烷。然后加入20mg/mLHS-NTA甲醇溶液(1mL，pH＝13)，缓慢搅拌2min，加入9mL的PBS溶液，分出水相并用0.2μm的滤膜过滤，所得溶液为含有NTA配体的CdS纳米棒。取1mL上述含NTA配体的CdS纳米棒颗粒溶液加入20μL的50mM的CoCl₂溶液，得到具有Co-NTA配体修饰的CdS纳米棒。

Spytag修饰的8nm金纳米颗粒(Spytag-AuNPs)的制备：8nm金纳米颗粒的制备如上所述，在ODE(10mL)，OAm(10mL)and HAuCl4.3H₂O(0.1g，0.254 mmol)的混合液中加入30mg的粒径为6nm的金纳米颗粒，氮气保护条件下搅拌使其溶解。反应液加热至80℃，反应2h。反应液迅速冷至室温并加入60mL 的丙酮沉淀得到产物，产物溶于20mL的正己烷中并用40mL的乙醇洗涤，得到粒径为8nm的金纳米颗粒，最后重悬于30mL的正己烷中保存备用。取1mg合成的Spytag短肽(氨基酸序列：CCGGGSAHIVMVDAYKPTK，SEQ ID NO：11) 加入10mlPBS溶解完全，加入300μl上述金纳米颗粒溶液，在室温下搅拌5小时，用0.2μm的滤膜过滤，所得溶液为含有Spytag修饰的金纳米颗粒。

Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点，金纳米颗粒，CdS纳米棒在含6xHis标签的重组FUS LC纳米纤维上的定向组装及表征：

以实施例2制备的pHis-mCherry-FUS LC蛋白形成的纳米纤维为例，进行如下实验：

对于Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点对纳米纤维的绑定，取1μl pHis-mCherry-FUS LC蛋白形成的纳米纤维溶液(40μM)加入49μl PBS缓冲液稀释50倍，加入5μl Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点(1mM)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合30分钟即可。

对于Co-NTA修饰的金纳米颗粒对纳米纤维的绑定，取1μl pHis-mCherry-FUS LC蛋白形成的纳米纤维溶液(40μM)加入49μl PBS缓冲液稀释50倍，加入5μl Co-NTA修饰的金纳米颗粒溶液(1mM)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合30分钟即可。

对于Co-NTA修饰的CdS纳米棒对纳米纤维的绑定，取1μl pHis-mCherry-FUS LC蛋白形成的纳米纤维溶液(40μM)加入49μl PBS缓冲液稀释50倍，加入10μl Co-NTA修饰的纳米棒溶液(1mM)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合30分钟即可。

Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点，金纳米颗粒，CdS纳米棒在含6xHis 标签的重组FUS LC纳米纤维上的TEM制样过程：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，BZ10024a)上静置10min，用滤纸吸干。取10μl的含40mM 咪唑的清洗液(清洗液配方：20mM Tris-HCIpH7.5，500mM NaCI，20mM BME， 40mM咪唑)滴于铜网上清洗样品，去除Co-NTA的非特异性吸附，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl的(2.5mg/ml) 醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤30分钟，即可使用TEM观察样品。图15a分别证明了Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点，金纳米颗粒，CdS纳米棒在纳米纤维上面的定向组装。

Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点，金纳米颗粒，CdS纳米棒在含6xHis 标签的重组FUS LC纳米纤维上的AFM制样过程：取40μl结合后的样品加清洗液至200μl，200μl溶液滴于平整的云母片静置30分钟，用300ml去离子水冲洗样品并用氮气吹干，利用AFM接触模式扫样品表面形貌。图15a分别证明了Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点，金纳米颗粒，CdS纳米棒在纳米纤维上面的定向组装。

Spytag修饰的金纳米颗粒在R-FUS LC-Spycatcher纳米纤维上的定向组装及表征

以pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher与Spytag-AuNPs的绑定为例，取1μl实施例2制备的pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher蛋白形成的纳米纤维溶液(40μM) 加入49μlPBS缓冲液稀释50倍，加入50μl Spytag修饰的金纳米颗粒(0.3mM) 溶液，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合2小时。

TEM表征：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，BZ10024a)上静置10min，用滤纸吸干。取10μl的PBS缓冲液滴于铜网上清洗样品，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl的(2.5mg/ml) 醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤30分钟，即可使用TEM观察样品，图15a显示金纳米颗粒均匀的绑定在纳米纤维上面。

AFM表征：取40μl结合后的样品加PBS缓冲液至200μl，200μl溶液滴于平整的云母片静置30分钟，用300ml去离子水冲洗样品并用氮气吹干，利用 AFM接触模式扫样品表面形貌。图15a显示金纳米颗粒均匀的绑定在纳米纤维上面。

纳米颗粒在无规共聚物状复合纳米纤维上的定向组装及表征

无规共聚物以实施例3所得的pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher蛋白与 pHis-mCherry-FUS LC蛋白单体比例1∶1的纳米纤维为例，取1μl该纳米纤维溶液(40μM)加入49μlPBS缓冲液稀释50倍，加入50μl Spytag修饰的金纳米颗粒溶液(0.3mM)以及5μl Co-NTA修饰的CdS纳米棒(1mM)或CdSeS@ZnS 量子点(1mM)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合2小时即可。

TEM表征：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，BZ10024a)上静置 10min，用滤纸吸干。取10μl的含40mM咪唑的清洗液滴于铜网上清洗样品，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl 的(2.5mg/ml)醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤30分钟，即可使用TEM观察样品，图15b显示金纳米颗粒与CdS纳米棒均匀的绑定在该无规共聚物状复合纳米纤维上面。

纳米颗粒在嵌段纳米纤维上的定向组装及表征

嵌段共聚物以实施例4中制得的pHis-mCherry-FUS LC纤维种子与 pHis-EGFP-FUS-Spycatcher蛋白单体比例1∶3形成的纳米纤维为例，取1μl该纳米纤维溶液(40μM)加入49μl PBS缓冲液稀释50倍，加入50μl Spytag修饰的金纳米颗粒溶液(0.3mM)以及5μlCo-NTA修饰的CdS纳米棒(1mM)或 CdSeS@ZnS量子点(1mM)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合2小时即可。

TEM表征：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，BZ10024a)上静置10min，用滤纸吸干。取10μl的含40mM咪唑的清洗液滴于铜网上清洗样品，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl 的(2.5mg/ml)醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤 30分钟，即可使用TEM观察样品，图15c显示Spytag修饰的金纳米颗粒部分的绑定在纳米纤维上面，这与嵌段纳米纤维的特征是吻合的。

纳米颗粒在自分类纳米纤维上的定向组装及表征

自分类纳米纤维以实施例5中制备的EGFP-FUS LC/CsgA自分类纳米纤维溶液(EGFP-FUS-Spycatcher与CsgA-His蛋白单体比例10∶1)，取1μl该纳米纤维溶液加入49μlPBS缓冲液稀释50倍，加入50μl Spytag修饰的金纳米颗粒(0.3 mM)溶液以及5μl Co-NTA修饰的CdS纳米棒(1mM)或CdSeS@ZnS量子点 (1mM)，轻轻吹打混合均匀，置于室温结合2小时即可。

TEM表征：取10μl结合后样品，滴于铜网(中镜科仪，BZ10024a)上静置10min，用滤纸吸干。取10μl的含40mM咪唑的清洗液滴于铜网上清洗样品，迅速用滤纸吸干，重复操作三次，再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl 的(2.5mg/ml)醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干，然后置于汞灯下烘烤 30分钟，即可使用TEM观察样品，图15d显示Spytag修饰的金纳米颗粒绑定在较粗的FUS LC纳米纤维上面，而Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点则有规律的分布在细小且卷曲的CsgA纤维上面，这与自分类纳米纤维的特征是基本吻合的。

实施例7：基于不同聚合结构的纳米纤维的涂层及图案化防伪材料

本实施例利用①实施例2得到的pHis-mCherry-FUS LC蛋白形成的纤维以及pHis-CFP-FUS LC蛋白形成的纤维1∶1简单混合，②按照实施例3中方法将 pHis-mCherry-FUS LC蛋白以及pHis-CFP-FUS LC蛋白按比例1∶1无规共聚所得纤维，③按照实施例4中的方法将pHis-mCherry-FUS LC蛋白纤维溶液(2mg/ml) 以及pHis-CFP-FUS LC蛋白单体(2mg/ml)双组份按体积比例1∶3混合所得嵌段纤维分别作为防伪材料进行如下实验。

防伪材料的涂布与表征

取2mg/ml防伪材料100微升滴在圆形玻璃片表面，在4000rpm转速下旋涂40s，重复以上步骤一次即可得到涂布了纳米纤维涂层的玻璃片。将玻璃片放在365nm紫外灯下可以看到三种防伪材料均表现出黄色的荧光(图16)。用正置荧光显微镜观察玻璃片上的纤维涂层，可以分别看到单组分纳米纤维对应的红色和绿色荧光纤维的简单混合，双组份无规共聚纳米纤维对应的黄色荧光纤维，双组份嵌段共聚纳米纤维对应的红色和绿色嵌段的荧光纤维。用400nm纳米波长的光激发玻璃片表面的涂层材料，都会激发出波长477nm的绿色荧光发射峰和610nm的红色荧光发射峰，而不是混合的用肉眼看到的黄色荧光发射峰。本方法以不同的防伪识别手段来鉴别。

防伪材料的图案化及表征

用20mm×20mm的红胶印章分别蘸取不同的防伪材料(2mg/ml)，压印在铝箔，玻璃片和聚对苯二甲酸乙二醇酯膜表面，在365nm紫外灯下观察可以看到携带信息的二维码，或用荧光显微镜观察并保存二维码，将其转化为灰度图片反向后即可通过图象输入设备或光电扫描设备自动识读处理信息(如图17)。用聚二甲基硅氧烷纳米印章分别蘸取不同的防伪材料，压印在玻璃片表面，在荧光显微镜下观察，可以分辨出其纳米级别的三角形阵列或圆形阵列。本手段以不同的尺度的防伪图案来识别。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海科技大学

<120> 多功能复合超分子纳米纤维自组装体系及其应用

<160> 24

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列 FUS LC

<400> 1

Met Ala Ser Asn Asp Tyr Thr Gln Gln Ala Thr Gln Ser Tyr Gly Ala

1 5 10 15

Tyr Pro Thr Gln Pro Gly Gln Gly Tyr Ser Gln Gln Ser Ser Gln Pro

20 25 30

Tyr Gly Gln Gln Ser Tyr Ser Gly Tyr Ser Gln Ser Thr Asp Thr Ser

35 40 45

Gly Tyr Gly Gln Ser Ser Tyr Ser Ser Tyr Gly Gln Ser Gln Asn Thr

50 55 60

Gly Tyr Gly Thr Gln Ser Thr Pro Gln Gly Tyr Gly Ser Thr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Gly Ser Ser Gln Ser Ser Gln Ser Ser Tyr Gly Gln Gln Ser Ser

85 90 95

Tyr Pro Gly Tyr Gly Gln Gln Pro Ala Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ser

100 105 110

Tyr Gly Ser Ser Ser Gln Ser Ser Ser Tyr Gly Gln Pro Gln Ser Gly

115 120 125

Ser Tyr Ser Gln Gln Pro Ser Tyr Gly Gly Gln Gln Gln Ser Tyr Gly

130 135 140

Gln Gln Gln Ser Tyr Asn Pro Pro Gln Gly Tyr Gly Gln Gln Asn Gln

145 150 155 160

Tyr Asn Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn

165 170 175

Tyr Gly Gln Asp Gln Ser Ser Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

180 185 190

Gly Tyr Gly Asn Gln Asp Gln Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr

195 200 205

Gly Gln Gln Asp Arg Gly

210

<210> 2

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列EGFP

<400> 2

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala

225 230 235 240

Gly

<210> 3

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列mCherry

<400> 3

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala Gly

225 230 235

<210> 4

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列CFP

<400> 4

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Ala Ile Ser Asp Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala

225 230 235 240

Gly

<210> 5

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列mMaple3

<400> 5

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Thr Ile Met Ser Val Ile Lys Pro Asp

1 5 10 15

Met Lys Ile Lys Leu Arg Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe

20 25 30

Val Ile Glu Gly Glu Gly Ser Gly Lys Pro Phe Glu Gly Ile Gln Thr

35 40 45

Ile Asp Leu Glu Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp

50 55 60

Ile Leu Thr Thr Ala Phe His Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr

65 70 75 80

Pro Arg Lys Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr

85 90 95

Ser Trp Glu Arg Ser Met Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Cys Asn Ala

100 105 110

Thr Asn Asp Ile Thr Met Glu Glu Asp Ser Phe Ile Asn Lys Ile His

115 120 125

Phe Lys Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Arg

130 135 140

Thr Val Gly Trp Glu Val Ser Thr Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly

145 150 155 160

Val Leu Lys Gly Asp Val Lys Met Lys Leu Leu Leu Lys Gly Gly Ser

165 170 175

His Tyr Arg Cys Asp Phe Arg Thr Thr Tyr Lys Val Lys Gln Lys Ala

180 185 190

Val Lys Leu Pro Lys Ala His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu

195 200 205

Ser His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val

210 215 220

Ala Arg Asn Ser Thr Asp Ser Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 6

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列PAtagRFP

<400> 6

Met Ser Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu

1 5 10 15

Gly Thr Val Asn Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly

20 25 30

Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Val Val Glu Gly

35 40 45

Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr

50 55 60

Gly Ser Ser Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Trp

65 70 75 80

Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr

85 90 95

Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp

100 105 110

Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser

115 120 125

Asn Gly Pro Val Met Lys Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Pro Ser Thr

130 135 140

Glu Lys Leu Lys Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu Gly Arg Val Asp Met

145 150 155 160

Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu Ile Cys Asn Phe Lys Thr

165 170 175

Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Arg Arg Leu Glu Ile Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu

195 200 205

Thr Tyr Trp Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Ser Asp Leu

210 215 220

Pro Ser Lys Leu Gly His Lys Leu Asn

225 230

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列Spycatcher

<400> 7

Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly

1 5 10 15

Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys

20 25 30

Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg

35 40 45

Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val

50 55 60

Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala

65 70 75 80

Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn

85 90 95

Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala

100 105 110

His Ile Asp

115

<210> 8

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列mefp5

<400> 8

Met Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr

1 5 10 15

His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly

20 25 30

Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr

35 40 45

Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His

50 55 60

Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser

65 70 75

<210> 9

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列CsgA

<400> 9

Met Gly Val Val Pro Gln Tyr Gly Gly Gly Gly Asn His Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Asn Asn Ser Gly Pro Asn Ser Glu Leu Asn Ile Tyr Gln Tyr Gly

20 25 30

Gly Gly Asn Ser Ala Leu Ala Leu Gln Thr Asp Ala Arg Asn Ser Asp

35 40 45

Leu Thr Ile Thr Gln His Gly Gly Gly Asn Gly Ala Asp Val Gly Gln

50 55 60

Gly Ser Asp Asp Ser Ser Ile Asp Leu Thr Gln Arg Gly Phe Gly Asn

65 70 75 80

Ser Ala Thr Leu Asp Gln Trp Asn Gly Lys Asn Ser Glu Met Thr Val

85 90 95

Lys Gln Phe Gly Gly Gly Asn Gly Ala Ala Val Asp Gln Thr Ala Ser

100 105 110

Asn Ser Ser Val Asn Val Thr Gln Val Gly Phe Gly Asn Asn Ala Thr

115 120 125

Ala His Gln Tyr

130

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列Histag

<400> 10

His His His His His His

1 5

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列CC-Spytag

<400> 11

Cys Cys Gly Gly Gly Ser Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys

1 5 10 15

Pro Thr Lys

<210> 12

<211> 6819

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-EGFP-FUS LC质粒

<400> 12

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600

gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660

ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720

agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780

agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840

tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960

cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020

aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140

tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520

cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580

gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640

gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700

catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760

tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820

ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880

tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940

ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000

aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060

gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120

tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180

acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240

cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300

cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360

gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420

cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480

gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540

tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600

atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720

gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780

tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840

cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900

tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960

atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020

atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080

tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140

cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200

aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260

ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320

tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380

tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440

gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500

gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560

gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620

ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680

taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740

ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800

atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860

tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920

gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980

gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040

aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100

ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc 5160

cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgtcg tactaccatc 5220

accatcacca tcacgattac gatatcccaa cgaccgaaaa cctgtatttt cagggcgcca 5280

tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg 5340

gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg 5400

gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 5460

tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 5520

agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct 5580

tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg 5640

tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca 5700

agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg 5760

gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg 5820

accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact 5880

acctgagcac ccagtccaaa ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc 5940

tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaaggcgg 6000

gtaccatgga tccggcctca aacgattata cccaacaagc aacccaaagc tatggggcct 6060

accccaccca gcccgggcag ggctattccc agcagagcag tcagccctac ggacagcaga 6120

gttacagtgg ttatagccag tccacggaca cttcaggcta tggccagagc agctattctt 6180

cttatggcca gagccagaac acaggctatg gaactcagtc aactccccag ggatatggct 6240

cgactggcgg ctatggcagt agccagagct cccaatcgtc ttacgggcag cagtcctcct 6300

accctggcta tggccagcag ccagctccca gcagcacctc gggaagttac ggtagcagtt 6360

ctcagagcag cagctatggg cagccccaga gtgggagcta cagccagcag cctagctatg 6420

gtggacagca gcaaagctat ggacagcagc aaagctataa tccccctcag ggctatggac 6480

agcagaacca gtacaacagc agcagtggtg gtggaggtgg aggtggaggt ggaggtaact 6540

atggccaaga tcaatcctcc atgagtagtg gtggtggcag tggtggcggt tatggcaatc 6600

aagaccagag tggtggaggt ggcagcggtg gctatggaca gcaggaccgt ggatagctcg 6660

agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt 6720

tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct 6780

tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 6819

<210> 13

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-mMaple3-FUS LC-F

<400> 13

gaccgaaaac ctgtattttc agggcgccat gggcatggtg agcaaaggcg aggag 55

<210> 14

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-mMaple3-FUS LC-R

<400> 14

tagctttggg ttgcttgttg ggtataatcg tttgaggcgg atcccgagcc accgccaccc 60

ttatagagtt cgtccatgc 79

<210> 15

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-PAtagRFP-FUS LC-F

<400> 15

tcccaacgac cgaaaacctg tattttcagg gcgccatgag cgagctgatt aagga 55

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-PAtagRFP-FUS LC-R

<400> 16

ttgcttgttg ggtataatcg tttgaggccg gatccatggt attaagcttg tgccccagtt 60

<210> 17

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher-F

<400> 17

agcggtggct atggacagca ggaccgtgga ggtggcggtg gcagtggcgg tggcggttcg 60

atggttgata ccttatca 78

<210> 18

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher-R

<400> 18

cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttagtca atatgagcgt caccttt 57

<210> 19

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-EGFP-FUS LC-mefp5-F

<400> 19

agcggtggct atggacagca ggaccgtgga ggtggcggtg gcagtggcgg tggcggttcg 60

agcagtgaag aatataaa 78

<210> 20

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-EGFP-FUS LC-mefp5-R

<400> 20

cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttatgaa gagccaccat agtattt 57

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-CsgA-Spytag-F

<400> 21

aattttgttt aactttaaga aggagatata catatgggtg ttgttcctca gta 53

<210> 22

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-CsgA-Spytag-R

<400> 22

atctcagtgg tggtggtggt ggtgctcgag gtatttggtg ggtttatatg catcgaccat 60

aacgatgtgc gcactgccac cgccaccgct 90

<210> 23

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-mCherry-Spycatcher -F

<400> 23

acgagctgta caaggcgggt accatggatc cgggtggcgg tggatccggt ggcggtggat 60

ccatggttga taccttatca gg 82

<210> 24

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列pHis-mCherry-Spycatcher -R

<400> 24

agcagccgga tctcagtggt ggtggtggtg gtgctcgagg tcaatatgag cgtcacctt 59

Claims

1.一种多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，其特征在于，包含至少一种与功能蛋白R结合的FUS LC蛋白。

2.如权利要求1所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，其特征在于，所述的功能蛋白R含有荧光蛋白，黏性蛋白，氢化酶，固氮酶或者甲烷单加氧酶中的至少一种。

3.如权利要求1所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系，其特征在于，所述的功能蛋白R含有组氨酸标签Histag、Spycatcher、绿色荧光蛋白EGFP、红色荧光蛋白mCherry、光激活荧光蛋白mMaple3和PAtagRFP、贻贝足丝蛋白Mefp3和Mefp5、贻贝足丝蛋白Mefp3和Mefp5、贻贝足丝蛋白Mgfp3和Mgfp5、甲烷单加氧酶、镍铁氢化酶、铁铁氢化酶以及固氮酶中的至少一种。

4.一种用于构建上述多功能复合超分子纳米纤维自组装体系的载体，其特征在于，包含至少一种能够表达权利要求1-3中任一项所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系的载体。

5.如权利要求4所述的用于构建上述多功能复合超分子纳米纤维自组装体系的载体，其特征在于，包括pHis-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC，pHis-mCherry-FUS LC，pHis-mMaple3-FUS LC，pHis-PAtagRFP-FUS LC，pHis-EGFP-FUS LC-Spycatcher与pHis-EGFP-FUS LC-mefp5质粒中的至少一种。

6.一种超分子纳米材料，其特征在于，利用权利要求1-3中任一项所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系制成。

7.如权利要求6所述的超分子纳米材料，其特征在于，所述的超分子纳米材料为单组份纳米纤维、无规共聚纳米纤维、嵌段纳米纤维、自分类纳米纤维、纳米物件修饰和定向组装的纳米纤维中的至少一种。

8.如权利要求6所述的超分子纳米材料，其特征在于，所述的纳米物件为Co-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点、Co-NTA修饰的金纳米颗粒、Co-NTA修饰的CdS纳米棒以及Spytag修饰的金纳米颗粒中的至少一种。

9.一种利用权利要求1-3中任一项所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系制作权利要求6-8中任一项所述的超分子纳米材料的方法，其特征在于，包括将权利要求1-3中任一项所述的多功能复合超分子纳米纤维自组装体系浓缩，于4℃或室温条件下静置过夜，得到超分子纳米纤维。

10.权利要求6-8中任一项所述的超分子纳米材料在生物催化、生物标记、制备生物材料、生物防伪和生物粘性材料以及生物医药和能源领域中的应用。