JP7479078B2 - 光切断性タンパク質を含むエクソソーム及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、光切断性タンパク質(photocleavable protein)を含むエクソソーム及びその用途に関し、より具体的には、標的タンパク質及び光切断性タンパク質であるmMaple3を含む融合タンパク質が含有されたエクソソーム及びその用途に関する。
現在の殆どのタンパク質治療法は細胞膜タンパク質をターゲットにする。しかし、多くの疾病の病原因子は主に細胞の内部に存在し、このような病原因子をターゲットにするためには治療学的タンパク質を細胞内に伝達する技術が必要である。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは、光切断性タンパク質であるmMaple3が細胞内に伝達しようとする標的タンパク質に結合された融合タンパク質が含有されたエクソソームに光を照射する場合、前記mMaple3が切断されて安全且つ効率的にエクソソーム内の標的タンパク質をターゲット細胞内に伝達できることを確認し、それに基づいて本発明を完成した。
上記の目的を達成するため、本発明は、標的タンパク質及びmMaple3を含む融合タンパク質が含有されたエクソソームを提供する。
前記光を照射したエクソソームをターゲット細胞に処理する段階と、を含む、試験管内(in vitro)標的タンパク質の細胞内伝達方法を提供する。
(b)前記光を照射したエクソソームをターゲット細胞に処理する段階と、
(c)前記ターゲット細胞内でmMaple3が蛍光を発する場合、タンパク質候補薬物が細胞内に伝達されたと確認する段階と、を含む、細胞内伝達用タンパク質候補薬物のスクリーニング方法を提供する。
(S2)前記増幅された標的タンパク質及びmMaple3のcDNAを一つのcDNAに結合し、標的タンパク質及びmMaple3を含む融合タンパク質をコーディングするcDNAを製造する段階;
(S3)前記融合タンパク質をコーディングするcDNAをベクターに導入した後、細胞にトランスフェクションして融合タンパク質を発現させる段階。
(S2)前記増幅された標的タンパク質及びmMaple3のcDNAを一つのcDNAに結合し、標的タンパク質及びmMaple3を含む融合タンパク質をコーディングするcDNAを製造する段階;
(S3)前記融合タンパク質をコーディングするcDNAをエクソソーム産生細胞にトランスフェクションし、細胞培養培地からエクソソームを分離及び精製する段階。
本発明によるエクソソームは、青色蛍光タンパク質(TagBFP)、光切断性タンパク質(mMaple3)、及びエクソソーム特異的マーカータンパク質(CD9)を含む融合タンパク質が含有されており、前記エクソソームに405nmの光を照射する場合、光切断性タンパク質であるmMaple3が切断されてエクソソーム内の青色蛍光タンパク質をターゲット細胞内に伝達することができる。また、Cre融合タンパク質(Cre-mMaple3-CD9)が含有されたエクソソームに405nmの光を照射する場合、エクソソーム内のCreタンパク質を動物の臓器内に伝達することができる。したがって、本発明による光切断性タンパク質を含むエクソソームは、多様な治療学的タンパク質を細胞内で安全且つ効率的に伝達することで、タンパク質治療分野に有用に利用することができると期待される。
[図1]本発明の一具現例による標的タンパク質(青色蛍光タンパク質)と光切断性タンパク質とエクソソーム特異的マーカータンパク質とを結合させた融合タンパク質の構造及びその特徴を図式化した図である。
本発明は、標的タンパク質及びmMaple3を含む融合タンパク質が含有されたエクソソームを提供する。
(S2)前記増幅された標的タンパク質及びmMaple3のcDNAを一つのcDNAに結合し、標的タンパク質及びmMaple3を含む融合タンパク質をコーディングするcDNAを製造する段階;
(S3)前記融合タンパク質をコーディングするcDNAをベクターに導入した後、細胞にトランスフェクションして融合タンパク質を発現させる段階。
(S2)前記増幅された標的タンパク質及びmMaple3のcDNAを一つのcDNAに結合し、標的タンパク質及びmMaple3を含む融合タンパク質をコーディングするcDNAを製造する段階;
(S3)前記融合タンパク質をコーディングするcDNAをエクソソーム産生細胞にトランスフェクションし、細胞培養培地からエクソソームを分離及び精製する段階。
前記光を照射したエクソソームをターゲット細胞に処理する段階と、を含む、試験管内(in vitro)標的タンパク質の細胞内伝達方法を提供する。
(b)前記光を照射したエクソソームをターゲット細胞に処理する段階と、
(c)前記ターゲット細胞内でmMaple3が蛍光を発する場合、タンパク質候補薬物が細胞内に伝達されたと確認する段階と、を含む、細胞内伝達用タンパク質候補薬物のスクリーニング方法を提供する。
1-1.融合タンパク質の製造
青色蛍光タンパク質(TagBFP)、光切断性タンパク質(mMaple3)及びエクソソーム特異的マーカータンパク質(CD9)を結合させた融合タンパク質(TagBFP-mMaple3-CD9)をコーディングするcDNAを製造し、製造したcDNAから翻訳される融合タンパク質の構造及びその特徴を図1に図式化して示し、前記TagBFP、mMaple3、及びCD9のそれぞれのアミノ酸配列、並びにそれをコーディングする遺伝子配列を下記の表1に示した。
Dendra2、mEos2、tdEos、mKikGR、及びKaedeなどの多様な種類の光切断性タンパク質(PAFP)及びmMaple3の特性を、従来文献(S.Wang、et al、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111、8452-8457(2014))を参考して比較することで、上記の他の光切断性タンパク質と比べてmMaple3が有する長所を確認した。
図3aに示したCIBN-CRY2システムは、二つの光特異的結合タンパク質を用いるため、常に二つのコンストラクトを使用しなければならず、この場合、細胞に発現時に二つのコンストラクトをコトランスフェクション(co-transfection)させねばならないため効率が低下する。例えば、トランスフェクション効率が80%である場合、二つのコンストラクトがすべて一細胞にトランスフェクションされる確率は64%になる。一方、図3bに示したmMapleシステムは、一つのコンストラクトを用いるため、より良い効率で細胞に発現させることが可能である。
HEK293T細胞を播種し、24時間後に実施例1-1の方法でTagBFP-mMaple3-CD9のcDNAをPEIを用いてトランスフェクションさせてHEK293T細胞に過剰発現させた後、405nmの光を照射して光による切断効果を、HEK293T細胞内で共焦点顕微鏡及びウェスタンブロットで確認した。
実施例2で融合タンパク質を過剰発現させたHEK293T細胞の培地から接線流濾過(tangential fluid filtration)システムを通じてエクソソームを分離及び精製した。
実施例3で分離した、融合タンパク質(TagBFP-mMaple3-CD9)が含有されたエクソソーム(+mMaple3エクソソーム)で標的タンパク質(TagBFP)の位置を確認するため、プロテアーゼ消化分析(protease digestion assay)を行った。
実施例3で分離した、融合タンパク質(TagBFP-mMaple3-CD9)が含有されたエクソソーム(+mMaple3エクソソーム)、及び対照群として、HEK293T細胞培養液から分離及び精製した特定タンパク質を含有しないエクソソーム(+ネガティブエクソソーム)に対し、405nmの光を照射してHEK293T細胞に処理した。
実施例3のような方法で分離した、Cre融合タンパク質(Cre-mMaple3-CD9)が含有されたエクソソームに405nmの光を処理し、Creタンパク質が伝達されるときに赤色蛍光タンパク質(tdTomato)が発現される遺伝子組換えマウスに投与した。
本発明による光切断性タンパク質を含むエクソソームは、多様な治療学的タンパク質を細胞内に安全且つ効率的に伝達することで、タンパク質治療分野に有用に利用できると期待される。
Claims (19)
- エクソソーム特異的マーカータンパク質としてCD9、光切断性タンパク質としてmMaple3、及び標的タンパク質を含む融合タンパク質が含有されたエクソソーム。
- 前記mMaple3が、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のエクソソーム。
- 前記mMaple3が、配列番号2の塩基配列を含む遺伝子によってコーディングされる、請求項1に記載のエクソソーム。
- 前記標的タンパク質が、細胞内に伝達しようとするタンパク質である、請求項1に記載のエクソソーム。
- 前記標的タンパク質が、疾患治療用タンパク質または疾患診断用タンパク質である、請求項4に記載のエクソソーム。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載のエクソソームを有効成分として含む、標的タンパク質の細胞内伝達用組成物。
- 前記標的タンパク質が、細胞内に伝達しようとするタンパク質である、請求項6に記載の標的タンパク質の細胞内伝達用組成物。
- 前記標的タンパク質が、疾患治療用タンパク質または疾患診断用タンパク質である、請求項7に記載の標的タンパク質の細胞内伝達用組成物。
- 請求項1に記載の融合タンパク質の製造方法であって、
(S1)CD9、mMaple3、及び標的タンパク質のcDNAをそれぞれ増幅させる段階と、
(S2)前記増幅されたCD9、mMaple3、及び標的タンパク質のcDNAを一つのcDNAに結合し、CD9、mMaple3、及び標的タンパク質を含む融合タンパク質をコーディングするcDNAを製造する段階と、
(S3)前記融合タンパク質をコーディングするcDNAをベクターに導入した後、細胞にトランスフェクションして融合タンパク質を発現させる段階と、を含む、融合タンパク質の製造方法。 - 前記(S2)段階は、前記(S1)段階で増幅させたCD9及びmMaple3のcDNAを一つのcDNA(CD9-mMaple3)に結合させた後、前記CD9及びmMaple3が結合された一つのcDNA(CD9-mMaple3)及び標的タンパク質のcDNAを一つのcDNA(CD9-mMaple3-標的タンパク質)に結合させることによって行われる、請求項9に記載の融合タンパク質の製造方法。
- 請求項1に記載のエクソソームの製造方法であって、
(S1)CD9、mMaple3、及び標的タンパク質のcDNAをそれぞれ増幅させる段階と、
(S2)前記増幅されたCD9、mMaple3、及び標的タンパク質のcDNAを一つのcDNAに結合し、CD9、mMaple3、及び標的タンパク質を含む融合タンパク質をコーディングするcDNAを製造する段階と、
(S3)前記融合タンパク質をコーディングするcDNAをエクソソーム産生細胞にトランスフェクションし、細胞培養培地からエクソソームを分離及び精製する段階と、を含む、エクソソームの製造方法。 - 前記(S2)段階は、前記(S1)段階で増幅させたCD9及びmMaple3のcDNAを一つのcDNA(CD9-mMaple3)に結合させた後、前記CD9及びmMaple3が結合された一つのcDNA(CD9-mMaple3)及び標的タンパク質のcDNAを一つのcDNA(CD9-mMaple3-標的タンパク質)に結合させることによって行われる、請求項11に記載のエクソソームの製造方法。
- 前記(S3)段階でのエクソソームの分離は、TFF、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、及びエクソソーム単離キットからなる群より選択された一つの方法を用いる、請求項11に記載のエクソソームの製造方法。
- CD9、mMaple3、及び標的タンパク質を含む融合タンパク質が含有されたエクソソームに光を照射する段階と、
前記光を照射したエクソソームをターゲット細胞に処理する段階と、を含む、試験管内標的タンパク質の細胞内伝達方法。 - 前記エクソソームに光を照射する段階を通じてエクソソーム内のmMaple3が切断される、請求項14に記載の試験管内標的タンパク質の細胞内伝達方法。
- 前記光が、401nm~480nmの波長を有する、請求項14に記載の試験管内標的タンパク質の細胞内伝達方法。
- (a)CD9、mMaple3、及びタンパク質候補薬物を含む融合タンパク質を含有するエクソソームに光を照射する段階と、
(b)前記光を照射したエクソソームを試験管内ターゲット細胞に処理する段階と、
(c)前記ターゲット細胞内でmMaple3が蛍光を発する場合、タンパク質候補薬物が細胞内に伝達されたと確認する段階と、を含む、細胞内伝達用タンパク質候補薬物の試験管内スクリーニング方法。 - 前記(a)段階で光を照射する場合、エクソソーム内のmMaple3が切断される、請求項17に記載の細胞内伝達用タンパク質候補薬物のスクリーニング方法。
- 前記光が、401nm~480nmの波長を有する、請求項17に記載の細胞内伝達用タンパク質候補薬物のスクリーニング方法。
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