JP2019528674A - タンパク質をロードしたエキソソームを含む組成物、並びにその調製及び送達のための方法 - Google Patents

タンパク質をロードしたエキソソームを含む組成物、並びにその調製及び送達のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、カーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法、エキソソームを調製するためのベクター、該方法によって調製されたカーゴタンパク質を含むエキソソーム、それによって調製されたエキソソームを使用することによってカーゴタンパク質をサイトゾルにロードする方法に関する。本発明によって提供される、カーゴタンパク質を含むエキソソームの調製方法によれば、カーゴタンパク質をロードしたエキソソームを高収率で生成することができ、そのため、それを、エキソソームを使用して、疾患治療で広く使用することができる。【選択図】図５

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は2016年9月30日出願の韓国特許出願第10-2016-0126335号、2016年9月30日出願の韓国特許出願第10-2016-0126921号、2016年9月30日出願の韓国特許出願第10-2016-0126961号、2016年10月4日出願の韓国特許出願第10-2016-0127486号、2016年10月13日出願の韓国特許出願第10-2016-0132616号、2017年2月10日出願の韓国特許出願第10-2017-0018637号に由来する便益を主張するものであり、その各々の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、タンパク質をロードしたエキソソームを含む組成物、光特異的結合タンパク質を使用してカーゴタンパク質をロードしたエキソソームを調製する方法、及びそれによって調製されたエキソソームを使用してカーゴタンパク質をサイトゾルに送達する方法に関する。
人体は約200種類の100兆個の細胞で構成され、そこでは、様々なタンパク質の作用によって生理活性が調節されて、生命が維持される。
細胞はリン脂質で構成される二層構造の膜で取り囲まれており、この膜は、細胞中への外来性物質の侵入をブロックする。これまでに開発されたタンパク質薬物の大半は、細胞膜を通過して細胞に入ることができず、生理作用を示すために、細胞の外部に作用するか、細胞膜上の受容体に作用して、細胞中にシグナルを伝えることができる。
サイトゾルは、お互いに相互作用して生理活性を調節する多くのタンパク質を有する。したがって、細胞の内部、すなわちサイトゾルの内部にタンパク質薬物を送達することさえできれば、より効果的に細胞活性が制御されると思われる。
最近、細胞膜を介して細胞中にカーゴタンパク質を直接送達する方法を確立するために研究が活発に進められている。カーゴタンパク質と細胞膜を通過するペプチドであるタンパク質導入ドメイン(PTD)の組換えタンパク質が調製され、投与される場合、これは、細胞膜を通ってサイトゾルに入ることができる(図１)。PTDは、HIV-1 TAT、HSV VP22、Antp、dfTAT及びHph-1で例示される。PTDとカーゴタンパク質を組み合わせて調製される融合タンパク質は、組換えタンパク質として生成され、この時、分離プロセスが必要となる。しかし、このプロセスは、タンパク質のリフォールディングが正しく行われず、活性が低下し、タンパク質が非特異的に移行され、in vivoで免疫反応を引き起こす危険性が大きく、コストが高く、収率が低いという点において問題がある。
様々なナノ粒子と結合したカーゴタンパク質は、エンドサイトーシスによって細胞膜を通ってサイトゾルに入ることができる(図２)。この時、ナノ粒子は、金NP、リポソームNP、磁性NP及びポリマーNPなどで例示される。カーゴタンパク質からのナノ粒子の分離は細胞のリソソームで主に起こるので、カーゴタンパク質はリソソーム内部で分解されて、その活性を失う。又は、ナノ粒子がサイトゾルでカーゴタンパク質から分離され難く、ナノ粒子の毒性が別の問題になり得る。
エキソソームは、50〜200nmのサイズの膜構造を有する小さな小胞であり、これは細胞間シグナリングのためのタンパク質、DNA及びRNAを含んで、細胞から外へ分泌される。
エキソソームは、赤血球の成熟化の最終段階で細胞内タンパク質を排出することによって赤血球のヘモグロビンのみを残すプロセスで最初に見つかった。電子顕微鏡下での観察から、エキソソームは原形質膜から直接的に分離されないが、多小胞体(MVB)と呼ばれる細胞内の特定の区画から細胞外に放出されることが確認された。すなわち、MVBが原形質膜と融合している場合に、そのような小胞は細胞の外部に放出され、これはエキソソームと呼ばれる(図3)。
エキソソーム生成の分子メカニズムは、はっきりとは明らかにされていないが、Bリンパ球、Tリンパ球、樹状細胞、巨核球、及びマクロファージ、幹細胞、及び腫瘍細胞を含めた様々な免疫細胞が、これらが生きている場合に、エキソソームを生成及び分泌することが知られている。
エキソソームは、様々な細胞内タンパク質、DNA及びRNAを含む。こうしたエキソソームに含まれる、細胞から外へ分泌される物質は、融合又はエンドサイトーシスによって他の細胞に再導入され得、細胞間のメッセンジャーとして働くことができる。エキソソームに含まれている場合に細胞から外へ分泌されるそのような物質を分析することによって、特定の疾患を診断することができる。
エキソソームは様々な種類のマイクロRNAも含む。それらの有無及び存在量を検出することによって疾患を診断する方法が報告されている(KR 10-2010-0127768A)。国際特許公開第WO2009-015357A号は、癌患者由来の試料(血液、唾液、涙など)中のエキソソームを検出することによって、特定の疾患を予測及び診断する方法を記載している。特に、特定の疾患(肺疾患)を有する患者から得たエキソソームが分析され、特定のマイクロRNAと肺疾患の間の関連性が具体的に記載されている。エキソソームに含まれる特定のタンパク質を使用することによって、肺疾患に加えて、腎疾患を診断する方法を確立するために、研究がさらに進められている。
エキソソームは抗原も含み得る。抗原提示細胞(APC)では、抗原ペプチドが、多嚢胞体（polycystic body）を含む膜構造を有する細胞内区画中のMHC(主要組織適合抗原複合体)クラスII分子にロードされる。したがって、そこに由来するエキソソームは抗原ペプチドMHCクラスII複合体も含む。したがって、エキソソームは、CD4+Tリンパ球に抗原ペプチドを提示するための免疫原担体として働き、それによって、Tリンパ球の増殖などの免疫応答を誘導することができる。免疫応答を刺激することができる分子、例えば、MHCクラスI及び熱ショックタンパク質(HSP)はエキソソーム中に集中しているため、エキソソームを使用して、癌又は自己免疫疾患の治療のために免疫応答を増大又は低下させることができる。
本発明はカーゴタンパク質をロードしたエキソソームを含む組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は、光特異的結合タンパク質を使用してカーゴタンパク質をロードしたエキソソームを調製する方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、エキソソームを使用してカーゴタンパク質をサイトゾルに送達する方法を提供する。
KR 10-2010-0127768A 国際特許公開第WO2009-015357A号
カーゴタンパク質とタンパク質導入ドメイン（PTD）の組換えタンパク質を介してカーゴタンパク質を送達する方法（Steven R. et al. Protein transduction: unrestricted delivery into all cells Trends in Cell Biology, 2000）を示す図である。 エンドサイトーシスを介して、ナノ粒子とカーゴタンパク質の複合体を使用してサイトゾルにカーゴタンパク質を送達する方法(Munish Chanana et al. Physicochemical properties of protein-coated gold nanoparticles in biological fluids and cells before and after proteolytic digestion. Angew. Chem. Int. Ed. 2013)を示す図である。 エキソソームが多小胞体(MVB)から分離及び放出されるプロセス(Graca Raposo and Willem Stoorvogel. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Cell Biology 200(4), 373-383, 2013)を示す図である。 ターゲッティングされたエキソソームを介してin vivoでsiRNAを送達することによって癌を治療する方法(Alvarez-Erviti, L. et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature Biotechnology 29, 341-345, 2011)を示す図である。 本発明による光遺伝学的に設計されたタンパク質保持エキソソーム(optogenetically-designed protein-carrying exosomes)(EXPLOR)の調製方法を示す図である。 EXPLORに対する光照射を停止した場合に、エキソソームの内部でカーゴタンパク質と光特異的結合タンパク質の融合タンパク質を分離するプロセスを示す図である。 CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子を導入した形質転換HEK293T細胞における、青色光照射によるmCherryタンパク質の細胞内位置の変化を示す図である。 本発明によるEXPLORを得るための実験手順を示す図である。 青色光の強度に応じてエキソソームに捕捉されたカーゴタンパク質(mCherryタンパク質)含量の変化の測定結果を示す図である。 カーゴタンパク質(mCherry)を含むエキソソームで標的細胞(HT1080)を処理した後の標的細胞へのカーゴタンパク質の導入に関する調査結果を示す図であり、左側はエキソソームで処理していない標的細胞を示し、右側はエキソソームで処理した標的細胞を示す。 (a)カーゴタンパク質(mCherry)を含むエキソソームで標的細胞(HT1080)を処理した後の標的細胞へのカーゴタンパク質の導入に関する調査結果を示す蛍光画像、及び(b)エキソソーム処理によって誘導されるアポトーシス細胞の比の比較結果を示すグラフのセットである。 GIGANTEA-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-FKF1LOVを導入した形質転換HEK293T細胞における、青色光照射によるmCherryタンパク質の細胞内位置の変化を示す図である。 蛍光イメージングによって測定した、ルシフェラーゼ-mCherry融合タンパク質の発現(a)並びに生成細胞におけるルシフェラーゼ活性及び分子数(b)を示す図である。対照:無処理のHEK293T細胞、オーバー:ルシフェラーゼ-mCherry-CRY2を単独で導入したHEK293T細胞、XP:エキソソームローディング技法用に設計された市販のベクターであるXPACK(Systems Biosciences)を使用することによってXPACK-ルシフェラーゼ-mCherryを導入したHEK293T細胞、EXPLOR:本発明によるルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9を導入したHEK293T細胞。 生成されたエキソソームにおけるルシフェラーゼ活性(a)及び分子数(b)を示す図である。NEG:無処理のHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、オーバー:ルシフェラーゼ-mCherry-CRY2を導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、XP:エキソソームローディング技法用に設計された市販のベクターであるXPACK(Systems Biosciences)を使用することによってXPACK-ルシフェラーゼ-mCherryを導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、EXPLOR:本発明によるルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9を導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、オン:200μWの青色光照射下で72時間培養することによって生成されたエキソソーム、オフ:光がない条件下で72時間培養することによって生成されたエキソソーム。 上記で生成されたエキソソームにおける、カーゴタンパク質のローディング効率を示す図である。 エキソソームを使用する標的細胞(HeLa)へのカーゴタンパク質の移行効率を示す図である。対照:無処理のHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、オーバー:ルシフェラーゼ-mCherry-CRY2を導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、XP:エキソソームローディング技法用に設計された市販のベクターであるXPACK(Systems Biosciences)を使用することによってXPACK-ルシフェラーゼ-mCherryを導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、EXPLOR:本発明によるルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9を導入したHEK293T細胞で生成されたエキソソーム、オン:200μWの青色光照射下で72時間培養することによって生成されたエキソソーム、オフ:光がない条件下で72時間培養することによって生成されたエキソソーム。 HEK293T細胞におけるルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 HEK293T細胞におけるCre-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 Cre:EXPLORを用いた処理がpCAG-loxP-STOP-loxP-ZsGreenを一過的に遺伝子導入したHT1080細胞においてZsGreenの発現を誘導したことを示す図である（スケールバー、40μm）。ネガティブ:EXPLOR:陰性対照としての、creをロードしていないエキソソーム、Cre:EXPLOR:Creをロードしたエキソソーム、及びpcMV-Cre:陽性対照としてのpCMV-Creベクターの遺伝子導入。 Cre:EXPLORを用いた処理により、pCAG-loxP-STOP-loxP-ZsGreenを一過的に遺伝子導入したHela細胞において、ZsGreenの発現が誘導されたことを示す図である（スケールバー、40μm）。陰性:EXPLOR:陰性対照としての、creをロードしていないエキソソーム、Cre:EXPLOR:Creをロードしたエキソソーム、及びpcMV-Cre:陽性対照としてのpCMV-Creベクターの遺伝子導入。 Cre:EXPLORを用いた処理により、pCAG-loxP-STOP-loxP-ZsGreenを一過的に遺伝子導入した初代ラット胎児神経細胞において、ZsGreenの発現が誘導されたことを示す図である（スケールバー、100μm）。対照:EXPLOR:陰性対照としてのcreをロードしていないエキソソーム、及びCre:EXPLOR::Creをロードしたエキソソーム。 Cre:EXPLORを用いた処理により、pCAG-loxP-STOP-loxP-eNpHR3.0-EYFP遺伝子を有する遺伝子導入マウスにおいて、ZsGreenの発現が誘導されたことを示す図である（スケールバー、500μm）。対照:EXPLOR:陰性対照としての、creをロードしていないエキソソーム、Cre:EXPLOR::Creをロードしたエキソソーム、Hip：海馬、及びTh:視床。 pCAG-loxP-STOP-loxP-eNpHR3.0-EYFP遺伝子を有する遺伝子導入マウスにおけるNEuN/GFAPに対する免疫組織化学の結果を示す図である。ピンク色：神経細胞特異的核タンパク質、NEuN陽性神経細胞、及び赤色：グリア繊維性酸性タンパク質、GFAP陽性アストロサイト細胞。対物レンズ、40x。スケールバー、20μm。 HEK293T細胞におけるCas9-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 Cas9をロードしたエキソソームの生成のために使用されるDNA構築物の生成を示す図である。 エキソソームに捕捉されたカーゴタンパク質（CRISPR-Cas9タンパク質）の含量の測定結果を示す図である。 HEK293T細胞におけるGBA-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 GBA-mCh-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9を一過的に遺伝子導入したHEK293T細胞、ラット初代アストロサイト、ヒト初代アストロサイト並びにゴーシェ繊維芽細胞における内在性GBA及びGBA-mcherry-CRY2融合タンパク質の発現を示す図である。 エキソソームに捕捉されたカーゴタンパク質（GBAタンパク質）の含量の測定結果を示す図である。 エキソソームに捕捉されたカーゴタンパク質（GBAタンパク質）であるβ-グルコセレブロシダーゼの酵素活性測定結果を示す図である。Exo-未処理：HEK293T由来エキソソーム、Exo-GBA：β-グルコセレブロシダーゼを含むエキソソーム。 ゴーシェ病患者由来繊維芽細胞へのGBA-エキソソームの処理の結果を示す図であり、GBA-エキソソーム処理により、β-グルコセレブロシダーゼ欠損細胞において、該酵素活性が有意に誘導されたことを示す。 PTENをロードしたエキソソームの生成のために使用されるDNA構築物、及びPTENをロードしたエキソソームを安定的に発現する細胞の生成を示す図である。 HEK293T細胞におけるルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 ルシフェラーゼ分子数に基づく定量的ルシフェラーゼ活性測定結果を示す図である。 HEK293T細胞におけるPrxI/II-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。Prx I:ペルオキシレドキシンI、Prx II:ペルオキシレドキシンII。 H2O2誘導性酸化ストレス及び細胞毒性におけるPrxI/IIをロードしたエキソソームの保護効果を示す図である。無し：H2O2処理群、Cre:EXPLOR: Creをロードしたエキソソーム、Prx I:EXPLOR: PrxIをロードしたエキソソーム、及びPrxII:EXPLOR: PrxIIをロードしたエキソソーム。 HEK293T細胞におけるMyoD-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 MyoDをロードしたエキソソームの脂肪由来幹細胞への処理の結果を示す図であり、MyoD-エキソソーム（クローン#A6）処理により6日後に細胞増殖が誘導されたことを示す。 p53をロードしたエキソソームを安定的に発現する細胞の作製を示す図である。 エキソソームに捕捉されたカーゴタンパク質（p53タンパク質）の含量の測定結果を示す図である。安定な細胞: p53をロードしたエキソソームを安定的に発現する細胞、mcherry: mcherryをロードしたエキソソーム、p53: p53をロードしたエキソソーム。 ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用した、p53の転写活性の測定結果を示す図であり、p53をロードしたエキソソームを用いた処理により、ドキソルビシンを処理したHeLa細胞において、p53の転写活性が誘導されたことを示す。 HMGB1をロードしたエキソソームの生成に使用されるDNA構築物、及びHMGB1をロードしたエキソソームを安定的に発現する細胞の生成を示す図である。 HEK293T細胞におけるsrIκB-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 srIκB-mCherry:EXPLORを用いた処理により、HeLa細胞において、NF-κB p65サブユニットの腫瘍壊死因子-α誘導性移行及びDNA結合が有意に低下したことを示す図である。 srIκBをロードしたエキソソームの関節リウマチ動物モデルへの投与後の、疾患進行の分析を示す図である。 LPS誘導性敗血症モデルにおいて、srIκBをロードしたエキソソームを処理した群の生存曲線を示す図である。エキソソーム無し：LPS単独で処理した群、未処理のエキソソーム：HEK293T由来エキソソームで処理した群、srIκBエキソソーム：srIκBをロードしたエキソソームで処理した群。 HEK293T細胞におけるpYSTAT3イントラボディ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 pYSTAT3イントラボディをロードしたエキソソームを使用した、標的細胞へのpYSTAT3イントラボディの細胞内送達を示す図である。 HEK293T細胞におけるBax-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 Baxをロードしたエキソソームを用いた処理により、HeLa細胞において、ミトコンドリアからのシトクロムcの急速な放出が誘導されたことを示す図である。 HEK293T細胞におけるAIMP-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。 エキソソームに捕捉されたカーゴタンパク質（AIMPタンパク質）の含量の測定結果を示す図である。 HEK293T細胞におけるmCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9の発現位置を示す図であり、これらが発現に対して同じ場所を共有することを示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、カーゴタンパク質をロードしたエキソソームを含有する組成物を提供する。
別の実施形態では、本発明は光特異的結合タンパク質を使用してカーゴタンパク質をロードしたエキソソームを調製する方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明はエキソソームを使用してカーゴタンパク質をサイトゾルに送達する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、エキソソーム特異的マーカーとカーゴタンパク質で構成される融合タンパク質を含むエキソソームの大量生成方法を提供する。
本発明は、光特異的結合タンパク質のペアを使用することによる、エキソソームの膜から分離したカーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法を提供する。
本発明はまた、エキソソーム調製用に使用可能なエキソソーム調製用ベクターを提供する。
本発明はさらに、上記エキソソームを使用することによってカーゴタンパク質をサイトゾルに導入する方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、カーゴタンパク質をロードしたエキソソームを含む医薬組成物、及びそれを調製する方法を提供する。
好ましい実施形態では、カーゴタンパク質はNF-κBを阻害するスーパーリプレッサーIκBタンパク質、Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）、ペルオキシレドキシンI、ペルオキシレドキシンII、creリコンビナーゼ、Cas9（CRISPR結合タンパク質9）、Cpf1（プレボテラ属（Prevotella）及びフランシセラ属（Francisella）由来CRISPR 1）又はGBA（β-グルコセレブロシダーゼ）である。
本発明は、カーゴタンパク質の送達によってin vivoで様々な疾患の治療に使用することができる該カーゴタンパク質を含むエキソソームを提供する。例えば、抗癌活性を有するタンパク質又はsiRNAを含むようにエキソソームを調製し、次いで、癌治療のために癌細胞に処理することができる（図４）。
疾患治療のために使用されるカーゴタンパク質を含むエキソソームでは、エキソソームは、カーゴタンパク質を適切にロードするために効率的に調製される必要がある。韓国特許公開第2004-0015508号は、特定の抗原を含むエキソソームを調製する方法を記載している。正確に言えば、これはエキソソームを使用することによってカーゴタンパク質を放出する方法(特定の抗原をコードする遺伝子を宿主細胞株に挿入し、導入した遺伝子のタンパク質を細胞株中で安定して発現させ、このタンパク質を、エキソソームを介して細胞外に放出させる)及びワクチンとしてエキソソームを使用する方法を記載している。
しかし、エキソソームは細胞内で自然に形成される。したがって、たとえエキソソームを内在的に生成する細胞にカーゴタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたとしても、それによって、発現したタンパク質を含むエキソソームを調製することは非常に難しい。
本発明は、カーゴタンパク質を含むエキソソームをより効率的に調製する方法を提供する。その結果、本発明者らは、エキソソームを高濃度で内在的に生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーとカーゴタンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって、カーゴタンパク質を含むエキソソームを効率的に調製することに成功した(図５)。
上記の方法によれば、カーゴタンパク質はエキソソームの膜に結合している。したがって、エキソソーム特異的マーカーとカーゴタンパク質とのペアで構成される融合タンパク質を、エキソソームを高濃度で生成する細胞で発現させ、続いて、照射して、融合タンパク質の連結を誘導する。次いで、エキソソーム特異的マーカーの作用によって、エキソソームの内部に融合タンパク質を導入する。導入後に照射が終了すると、エキソソームの内部で融合タンパク質がカーゴタンパク質と光特異的結合タンパク質に分離する。その結果、融合タンパク質から分離した遊離カーゴタンパク質を含むエキソソームを効率的に調製することができる(図６)。
本発明においてエキソソームにロードされるカーゴタンパク質には、限定されないが、天然又は非天然タンパク質、トランケートされた形態又は変異した形態が挙げられる。カーゴタンパク質の例は、限定されないが、以下の表に記載される。
＜酵素＞
酵素は生体において化学反応を加速する生物学的触媒分子である。酵素はその基質に結合し、その活性化エネルギーを低下させることにより反応速度を増大させる。酵素は以下のように分類することができる：プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、加水分解酵素、キナーゼ、ホスファターゼ及び他の種類の酵素。
本発明においてエキソソームにロードされる標的タンパク質は、酵素及びその制御因子を含む。標的タンパク質の例は、限定されないが、以下の説明に記載される。
-プロテアーゼ及びその阻害因子
MMP及びTIMP
マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）は、マトリキシン（matrixin）としても公知であり、カルシウム依存性亜鉛含有エンドペプチダーゼである。MMPはすべての種類の細胞外マトリックスタンパク質を分解することが可能であり、細胞表面受容体の切断、アポトーシスリガンド（FASリガンドなど）の放出及びケモカイン/サイトカインの不活性化に関与することが公知である。MMPはまた、細胞の増殖、移動（接着/分散）、分化、血管新生、アポトーシス及び宿主防御などの細胞の振る舞いにおいて主要な役割を果たすと考えられている。
マトリックスメタロプロテイナーゼは、特定の内在的なメタロプロテイナーゼ組織阻害因子（tissue inhibitors of metalloproteinase; TIMP）によって阻害され、TIMPは4つのプロテアーゼ阻害因子：TIMP1、TIMP2、TIMP3及びTIMP4のファミリーを含む。
MMPとTIMPのバランスは、形態形成、血管新生、組織修復、硬変、関節炎及び転移などの様々な生理的又は病理学的過程に付随する組織リモデリングにおいて重要な役割を果たす。MMP-2及びMMP-9は転移において重要であると考えられている。MMP-1は、関節リウマチ及び変形性関節症において重要であると考えられている。MMPとTIMPの間のバランスの調節不全はまた、急性及び慢性の心血管系疾患に特徴的である。
MMP及びTIMPを含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。MMP又はTIMPをロードしたエキソソームは、関節リウマチを含むMMP関連疾患を治療するために使用され得る。
カスパーゼ及びその阻害因子
カスパーゼ（システイン-アスパラギン酸プロテアーゼ、システインアスパルターゼ又はシステイン依存性アスパラギン酸指向性プロテアーゼ）はアポトーシス、ピロトーシス及びネクロトーシスを含むプログラム細胞死において必須の役割を果たすプロテアーゼ酵素のファミリーである。これらの形態の細胞死はストレスシグナル及び病原性攻撃から生体を防御するために重要である。カスパーゼはまた炎症において役割を有し、pro-IL1βなどの炎症性サイトカインを直接プロセシングする。これらは感染細胞又は組織への免疫細胞のリクルートを可能にするシグナル分子である。細胞増殖、腫瘍抑制、細胞分化、神経の発生及び軸索ガイダンス並びに老化など、カスパーゼには他の同定された役割がある。
カスパーゼ欠損は腫瘍形成の原因であると同定されている。異常増殖する細胞において細胞死を誘導することにより反応し得るカスパーゼなどのアポトーシスタンパク質の変異と共に、細胞増殖に対する制限を除く細胞周期遺伝子の変異を含む要因の組み合わせにより、腫瘍増殖が発生し得る。
反対に、カスパーゼ-3などの一部のカスパーゼの過剰活性化は、過剰なプログラム細胞死につながり得る。これは、アルツハイマー病など、神経細胞が失われるいくつかの神経変性疾患において見られる。炎症性シグナルのプロセシングに関与するカスパーゼはまた疾患に関係する。これらのカスパーゼの活性化が不十分であれば、適切な免疫応答が活性化され得ないため、生体の感染感受性が上昇し得る。カスパーゼが細胞死及び疾患において果たす複合的役割は、カスパーゼを薬剤ターゲットとして使用することに関する研究につながっている。例えば、炎症性カスパーゼ-1は自己免疫疾患の発症と関連づけられている。
カスパーゼ及びその阻害因子を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。カスパーゼ又はその抑制因子をロードしたエキソソームは、神経変性疾患又は自己免疫疾患を含むカスパーゼ関連疾患を治療するために使用され得る。
カテプシン及びその阻害因子
カテプシンはすべての動物並びに他の生物において見出されるプロテアーゼである。このファミリーには、その構造、触媒機構、及びそれが切断するタンパク質によって区別される、約12種類のメンバーがある。メンバーの大部分がリソソームにおいて見出される低pHで活性化される。したがって、このファミリーの活性は、ほぼすべてがこれらのオルガネラ内にある。
カテプシンは、癌、脳卒中、アルツハイマー病、関節炎、エボラ、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、慢性歯周炎、膵臓炎、及び円錐角膜を含むいくつかの眼障害に関連づけられている。特に癌については、カテプシンDはマイトジェンであり、ケモカインを減衰させて抗腫瘍免疫応答を減弱し、樹状細胞の機能を阻害する。カテプシンB及びLはマトリックスの分解及び細胞浸潤に関与する。
カテプシン及びその阻害因子を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。カテプシン又はその阻害因子をロードしたエキソソームは、癌及びアルツハイマー病を含む様々なカテプシン関連疾患を治療するために使用され得る。
-ヌクレアーゼ
Creリコンビナーゼ
CreリコンビナーゼはP1バクテリオファージから単離されたタンパク質であり、2つの異なるloxP領域を検出して組換えを誘導する。loxPは34bpのDNA断片であり、両端の2つの13bpのパリンドローム配列と中央の8bpの非対称コアスペーサーで構成される。Creリコンビナーゼはパリンドローム配列に結合し、切断後にDNAのスペーサー領域を変化させ、次いでDNAを組換える。2つの異なるlowP領域間のDNA配列の除去又は反転はスペーサーの方向性に基づく。除去又は反転は、lowP領域の方向が同一又は反対である場合にそれぞれ起こる。
[CreリコンビナーゼによるDNA欠失]
Creリコンビナーゼ利用の代表例の1つは、特定の遺伝子の変異時期及び発現組織を阻害し得るコンディショナルノックアウトマウスである。この技術は、特定の標的遺伝子の前と終わりの間にloxPを挿入したマウスを作製し、Cre発現遺伝子導入マウスと交配するか又は特定の細胞に直接Creリコンビナーゼを処理することにより、ある単離された細胞において特定の標的遺伝子を除去することである。コンディショナルノックアウトマウスは、胚発生の初期においては致死性となるそのような遺伝子を、胚発生の後期又は成体において発現させることにより、特定の遺伝子の機能を確認するために有効である。
本発明は、creリコンビナーゼタンパク質をロードしたエキソソームを提供し、creリコンビナーゼタンパク質が標的細胞のサイトゾルに送達されたことを確認した。この結果は、creリコンビナーゼタンパク質をロードした本発明のエキソソームがコンディショナルな遺伝子操作のために使用され得ることを示す。
Crispr/Cas9
CRISPR-Cas9は、遺伝子の特異的な領域を制限することによりDNA矯正を可能にするRNAベースの人工制限酵素である。近年、遺伝子工学の鍵となる要素として特に注目されている。
CRISPRはある種のパリンドローム配列であり、クラスター化され一定間隔で配置された短いパリンドローム反復（Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats）の省略形であり、最初に観察された細菌の獲得免疫系である。第1に、Cas9タンパク質は侵入したウイルスを認識し制限する。次に制限されたウイルス配列はCRISPR配列に挿入され、ウイルスとCRISPRの混合配列はRNAとして転写される。このRNAはCas9複合体の形成に使用される。この過程の後、転写された「CRISPR+ウイルス配列」はCas9と組み合わされ、Cas9単独よりも速く、侵入した同じウイルスを除去する。この機構は、Cas9複合体と標的配列を組み合わせて標的配列を制限することによって、遺伝子工学に応用され得る。
Cpf1は前述の改変エンドヌクレアーゼCRISPR-Cas9システムに由来するCas9タンパク質と似た機能を有するタンパク質である。以下の図のように、Cpf1は、Cas9と異なるプロトスペース隣接モチーフ（protospace adjacent motif）（PAM）配列を認識する。それはCas9によって認識されない領域に対して使用することができ、短いcrispr RNA（crRNA）単独で機能し得るため特により実用的である。Cas9の場合には、tacrRNAが追加で必要である。
[Cas9及びCpf1タンパク質の比較]
本発明は、Cas9又はCpf1タンパク質をロードしたエキソソームを提供し、Cas9又はCpf1タンパク質が標的細胞のサイトゾルに送達されたことを確認した。この結果は、Cas9又はCpf1タンパク質をロードした本発明のエキソソームがDNA配列の一部を除去、付加又は変更するために使用され得ることを示す。
カスパーゼ活性化DNase
カスパーゼ活性化DNase（Caspase-Activated DNase）（CAD）又はDNA断片化因子サブユニットベータ（DFFB）は、ヒトにおいてDFFB遺伝子によりコードされるタンパク質である。それはアポトーシス中にDNAを破壊し、細胞分化を促進する。それは通常はICADにより阻害される不活性単量体である。これは二量体化前に切断される。
アポトーシスは、哺乳類の発生中に、毒性があり、及び/又は不要である細胞を除去する細胞死の過程である。アポトーシスの過程は、細胞及び核の収縮及び断片化並びに染色体DNAのヌクレオソーム単位への分解を伴う。DNA断片化因子（DNA fragmentation factor）（DFF）は、40-kD（DFFB）及び45-kD（DFFA）サブユニットのヘテロ二量体タンパク質である。DFFAはカスパーゼ-3の基質であり、アポトーシス中にDNA断片化の引き金を引く。DFFは、DFFAがカスパーゼ-3によって切断されると活性化する。DFFAの切断断片は、DFFの活性成分であるDFFBから解離する。DFFBはアポトーシス中にDNA断片化とクロマチン凝集の両方の引き金を引くことが見出されている。
カスパーゼ活性化DNaseを含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。カスパーゼ活性化DNaseをロードしたエキソソームは、様々なシステムにおいてアポトーシスを制御するために使用され得る。
-加水分解酵素
ベータ-グルコセレブロシダーゼを含むリソソーム酵素
リソソーム蓄積症は、生まれつきのリソソーム欠損により、リソソームによって分解される物質が蓄積することによる疾患である。一般的なリソソーム蓄積症の1つは、リソソーム酵素であるベータ-グルコセレブロシダーゼ（GBA）の遺伝的欠損によって誘発されるゴーシェ病である。
GBAを欠いていると、マクロファージのリソソームでグルコセレブロシダーゼ/グルコシルスフィンゴシンの蓄積によって、肝臓、脾臓及び骨髄などで機能障害が誘発される。また、貧血、血小板減少及び白血球減少などの血液系異常、ゲパトリエンタルニー（gepatolientalny）、オステオクラシア（osteoclasia）並びに中枢神経損傷などが誘発される。
ゴーシェ病の現在の治療は、静脈注射によってGBAアナログであるセレザイムを注射する酵素補充療法である。しかし、これらの種類のタンパク質薬剤には、血中の短い半減期、抗体産生による低効率、リソソームへの送達の困難性、神経原性ゴーシェ病への応用不可能性などの様々な不都合がある。
本発明は、GBA（β-グルコセレブロシダーゼ）タンパク質をロードしたエキソソームを提供し、GBA（β-グルコセレブロシダーゼ）タンパク質が標的細胞のサイトゾルに送達されたことを確認した。この結果は、GBA（β-グルコセレブロシダーゼ）タンパク質をロードした本発明のエキソソームはゴーシェ病の治療のために使用され得ることを示す。
-キナーゼ及びホスファターゼ
マイトジェン活性化キナーゼ：p38 MAPキナーゼ
p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼは、サイトカイン、紫外照射、熱ショック及び浸透圧ショックなどのストレス刺激に対して応答するマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）のクラスである。p36 MAPキナーゼは、細胞分化、アポトーシス及びオートファジーに関与する。
p38 MAPキナーゼ（MAPK）はサイトカイン及びストレスに対する細胞応答を制御するシグナリングカスケードに関与する。p38阻害因子は、自己免疫疾患及び炎症性過程への潜在的治療効果を求めて探索されている。
p38 MAPK及びその阻害因子を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。p38 MAPK又はその阻害因子をロードしたエキソソームは、自己免疫疾患を含むp38 MAPK関連疾患を治療するために使用され得る。
阻害因子カッパBキナーゼ（IKK）
IκBキナーゼ（IKK）は、細胞応答を炎症に広げることに関与する酵素複合体である。IκBキナーゼ酵素複合体は、上流のNF-κBシグナル伝達カスケードの一部である。IκBα（カッパBの阻害因子）タンパク質は、NF-κBタンパク質の核局在シグナル（NLS）をマスクし、細胞質においてそれを不活性状態で隔離したまま維持することによって、NF-κB転写因子を不活性化する。IKKは抑制性IκBαタンパク質をリン酸化する。このリン酸化は、NF-κBからのIκBαの解離をもたらす。遊離したNF-κBは核内へ移行し、少なくとも150個の遺伝子の発現を活性化し、その一部は抗アポトーシス性である。
IκBキナーゼ活性は、リンパ球免疫制御において基本的役割を果たす核内因子-κB（NF-κB）ファミリーの転写因子のメンバーの活性化に必須である。古典的NF-κB経路の活性化は、病原体表面に発現されるリポ多糖（LPS）、又は腫瘍壊死因子（TNF）若しくはインターロイキン-1（IL-1）などの炎症促進性サイトカインの放出を含む、様々な炎症促進性刺激による刺激に反応して開始する。免疫細胞刺激に続いて、シグナル伝達カスケードがIKK複合体の活性化につながり、このイベントは相同キナーゼサブユニットであるIKK-α及びIKK-βへのNEMOの結合を特徴とする。
炎症性刺激に反応して機能的に適応性であるが、様々な疾患状態において、NF-κBシグナリングの脱制御が検証されてきた。構成的IKKに媒介されたIκBαのリン酸化の結果として増大したNF-κB活性は、アテローム性動脈硬化、喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患及び多発性硬化症の発達において観察されてきた。具体的には、構成的NF-κB活性は、分子レベルでは持続性炎症シグナリングを促進し、これは表現型上は慢性的な炎症として現れる。さらに、同時にアポトーシスを抑制し、持続的なリンパ球の成長と増殖を促進するNF-κBの能力は、多くの種類の癌へのその密接な結びつきを説明する。
IKKを含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。IKKをロードしたエキソソームは、癌を含むNF-κB関連疾患を治療するために使用され得る。
PTENホスファターゼ
ホスファターゼ及びテンシンホモログ（Phosphatase and tensin homolog）（PTEN）は、腫瘍抑制タンパク質として同定される。この遺伝子の変異は、多くの癌の発達におけるステップである。このタンパク質はテンシン様ドメイン並びに2重特異性プロテインチロシンホスファターゼのものに似た触媒ドメインを含有する。多くのプロテインチロシンホスファターゼと異なり、このタンパク質はホスホイノシチド基質を優先的に脱リン酸化する。それは、細胞内のホスファチヂルイノシトール-3,4,5-三リン酸の細胞内レベルを負に制御し、Akt/PKBシグナリング経路を負に制御することにより腫瘍抑制因子として機能する。
PTENの喪失又は変異は、癌、非癌性新生物及び自閉症に密接に関連する。特に腫瘍発達中では、酵素活性を不活性化するPTENの変異及び欠失が発生し、増加した細胞増殖及び減少した細胞死をもたらす。PTENの頻繁な遺伝的不活性化は、神経膠芽腫、子宮内膜癌及び前立腺癌において発生し、低下した発現は、肺癌及び乳癌などの多くの他の腫瘍の種類において見出される。その上、PTEN変異はまた、癌への様々な遺伝性素因を引き起こす。
PTEN遺伝子の変異は、カウデン症候群のように、過誤腫と呼ばれる非癌性腫瘍の発達を特徴とする、いくつかの他の障害を引き起こす。これらの障害は、バナヤン・ライリー・ルバルカバ症候群及びプロテウス様症候群を含む。合わせてPTEN変異により引き起こされる障害はPTEN過誤腫腫瘍症候群（PTEN hamartoma tumor syndrome）、又はPHTSと呼ばれる。これらの症候群の原因変異は、結果として生じるタンパク質を非機能性にするか又は消失させる。欠損したタンパク質により、細胞は無制御に分裂し、損傷した細胞が死ぬことを妨げ、これは腫瘍増殖につながり得る。
PTENを含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。PTENをロードしたエキソソームは、様々な種類の癌を治療するために使用され得る。
ヤヌスキナーゼ
ヤヌスキナーゼ（JAK）は、JAK-STAT経路を介してサイトカイン媒介性シグナルを伝達する細胞内非受容体型チロシンキナーゼのファミリーである。I型及びII型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは触媒キナーゼ活性を有しないため、JAKファミリーのチロシンキナーゼに依存してそのシグナル伝達経路に関与する下流タンパク質をリン酸化し活性化する。受容体がそのそれぞれのサイトカイン/リガンドと付随した後、それは立体構造変化を起こし、2つのJAKを、互いにリン酸化し合うために十分な程度に近づける。JAKの自己リン酸化はそれ自身の中で立体構造変化を誘導し、STAT（シグナル伝達因子及び転写活性化因子（Signal Transducer and Activator of Transcription））と呼ばれる転写因子をさらにリン酸化し活性化することによって細胞内シグナルを伝達することを可能にする。活性化したSTATは受容体から解離し二量体を形成した後、細胞核へ移行し、そこで選ばれた遺伝子の転写を制御する。
JAK/STATシグナリング経路を使用する分子の一部の例は、コロニー刺激因子、プロラクチン、成長ホルモン、及び多くのサイトカインである。JAK阻害因子は、乾癬、関節リウマチ、真性多血症、脱毛症、本態性血小板血症、潰瘍性大腸炎、骨髄線維症及び白斑を伴う骨髄化生の治療のために開発中である。
JAK及びその阻害因子を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。JAK又はその阻害因子をロードしたエキソソームは、癌を含むJAK関連疾患を治療するために使用され得る。
-その他
ユビキチンリガーゼ
ユビキチンリガーゼ（E3ユビキチンリガーゼとも呼ばれる）は、ユビキチンをロードしているE2ユビキチン結合酵素をリクルートし、タンパク質基質を認識し、E2からタンパク質基質へのユビキチンの移行を助けるか又は直接触媒するタンパク質である。ユビキチンは、イソペプチド結合により標的タンパク質上のリジンに結合される。E3リガーゼは標的タンパク質とE2酵素の両方と相互作用し、したがってE2に基質特異性を与える。
E3リガーゼによるユビキチン化は細胞交通、DNA修復及びシグナリングなどの様々な領域を制御し、細胞生物学において非常に重要である。E3リガーゼはまた細胞周期制御において鍵となるプレイヤーであり、サイクリン並びにサイクリン依存性キナーゼ阻害因子タンパク質の分解を媒介する。
E3ユビキチンリガーゼはホメオスタシス、細胞周期及びDNA修復経路を制御し、その結果、多くのこれらのタンパク質は、有名なところではMDM2、BRCA1及びフォンヒッペル-リンダウ腫瘍抑制因子を含む、様々な癌に関与している。例えば、MDM2の変異は、（とりわけ）胃癌、腎細胞癌及び肝癌において、Sp1転写因子へのそのプロモーターの親和性を増大させることによりMDM2濃度を脱調節し、MDM2 mRNAの転写の増大を引き起こすことが見出されている。
ユビキチンリガーゼを含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。ユビキチンリガーゼをロードしたエキソソームは、癌を含むユビキチン化関連疾患を治療するために使用され得る。
ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼは、生物発光を生成する酸化酵素のクラスの総称であり、通常は発光タンパク質から区別される。ルシフェラーゼは、顕微鏡法において且つレポーター遺伝子として、蛍光タンパク質と同じ用途の多くにおいて、バイオテクノロジーの中で幅広く使用されている。しかし、蛍光タンパク質と異なり、ルシフェラーゼは外的な光源を必要としないが、消費される基質であるルシフェリンの添加を必要とする。
すべてのルシフェラーゼは、酸化還元酵素（EC 1.13.12.-）として分類され、これは、それらが酸素分子の取り込みに際して単一のドナーに作用することを意味する。ルシフェラーゼは関連のない多くの様々なタンパク質ファミリーに由来しているため、いずれの機構もルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせに依存するものの、統一的な機構はない。しかし、これまで特徴づけされたすべてのルシフェラーゼ-ルシフェリン反応は、何らかの段階で酸素分子を必要とすることが示されている。
生物学研究においては、ルシフェラーゼは、目的のプロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む遺伝学的構築物を遺伝子導入した細胞において、転写活性を調べるためのレポーターとして一般に使用されている。加えて、特定の酵素の活性によりルシフェリンに変換される発光前駆分子（pro-luminescent molecule）は、共役型又は2段階ルシフェラーゼアッセイにおいて酵素活性を検出するために使用され得る。そのような基質は、とりわけカスパーゼ活性及びシトクロムP450活性を検出するために使用されてきた。ルシフェラーゼはまた、細胞生存率アッセイにおいて、又はキナーゼ活性アッセイのために、細胞ATPレベルを検出するために使用され得る。ルシフェラーゼはビオチン化によりATPセンサータンパク質として働き得る。ビオチン化により、ルシフェラーゼはストレプトアビジン-ビオチン複合体への結合により細胞表面上に固定化される。これにより、ルシフェラーゼは細胞からのATPの放出を検出することができ、生物発光を通してATPのリアルタイム放出を有効に示す。ルシフェラーゼはその上、タンパク質の配列中の特定のアミノ酸残基を変えて発光強度を増大させることによって、ATP検出の感度を増大させることができる。
全動物イメージング（in vivo又は場合によりex vivoイメージングと呼ばれる）は、ルシフェラーゼ発現細胞株の注入を使用して行うことができる。異なる種類の細胞（例えば、骨髄幹細胞、T細胞）をルシフェラーゼを発現するように操作することができ、これにより感度の良い電荷結合素子カメラ（CCDカメラ）を使用して生きた動物の内部を非侵襲的に可視化することを可能にする。この手法は、動物モデルにおける腫瘍形成及び治療に対する腫瘍の反応を追跡するために使用されてきた。
本発明は、ルシフェラーゼタンパク質をロードしたエキソソームを調製し、ルシフェラーゼタンパク質が標的細胞のサイトゾルへ送達されたことを確認した。その結果は、ルシフェラーゼタンパク質をロードした本発明のエキソソームが、細胞生存率アッセイ、キナーゼアッセイ及び全動物イメージングに使用され得ることを示す。
ペルオキシレドキシン
ペルオキシレドキシン（Prx）は、細胞質における代表的な抗酸化酵素であり、哺乳類細胞において水溶性タンパク質の0.1〜0.8%を得る。Prxは細胞内で2e-を受け取ることによりヒドロペルオキシドをH2OおよびROH-に還元する役割を有する。Prxはまた、H2O2（nmol濃度）の形成及び除去に関与することにより細胞の増殖、分化、死及び細胞シグナル伝達にも関与する。Prxはより具体的にはシステインアミノ酸の数に基づいて1-Cys Prx、又は2-Cys Prxに分類される。さらに2-Cys prxは、構造上及び機構上の違いに基づき「典型」又は「非典型」に細分される。3種のPrxすべてが、Cys-SOH形成の第2過程から酸化還元に違いを有する。Prx I〜Prx IVは典型2-Cys Prxであり、Prx Vは非典型2-Cys Prcであり、Pcx VIは1-Cys Prxである。2-Cys Prxの一部は多量体を形成する。
Prx I及びIIは、細胞内H2O2濃度を制御することによって、成長因子及びTNF-αにより生じた受容体シグナリング経路活性化に関与する。具体的には、Prx IIは、血清飢餓、セラミド及びエトポシド（epotoside）などの細胞死誘導因子の刺激から細胞を保護する役割を有する。
正常細胞では、Prx Iは、PTENホスファターゼの活性を、その酸化を阻害することによって維持する役割を有する。しかし、酸化ストレスが増大した場合には、不可逆的酸化によりPTENからPrxが分離されることを通して、PTENの活性はH2O2によって阻害される。結果的に、それはAktなどの細胞増殖シグナルの持続的活性化を通じて腫瘍を誘発する。
細胞内のPrxの量的変化は、疾患と顕著な関連を有する。癌の発達、動脈硬化、呼吸器炎症、骨粗鬆症、肥満及び変性認知症の過程では、活性酸素種の量的変化が密接な結びつきを有する。
本発明は、ペルオキレドキシンI又はペルオキレドキシンIIタンパク質をロードしたエキソソームを提供し、ペルオキレドキシンI又はペルオキレドキシンIIタンパク質が標的細胞のサイトゾルに送達されたことを確認した。その結果は、ペルオキレドキシンI又はペルオキレドキシンIIタンパク質をロードした本発明のエキソソームが活性酸素関連疾患の治療のために使用できることを示す。
＜転写因子＞
転写因子は真核生物においてDNAからのmRNA転写を制御するタンパク質である。転写因子は、基本的な転写制御、生体の発生、細胞間シグナル又は環境への反応、細胞周期制御及び発病に関連している。
本発明におけるエキソソームにロードされる標的タンパク質は、転写因子及びその制御因子（エンハンサー又は阻害因子）を含む。標的タンパク質の例は、限定されないが、以下の説明に記載される。
-転写因子及びその制御因子
NF-kB制御因子、スーパーリプレッサーIkB
NF-κBは炎症反応を誘発する主要な転写因子であり、様々な種類の細胞、特に免疫細胞において、炎症関連遺伝子の発現を制御する。したがって、免疫細胞において過剰に活性化したNF-κBシグナリング経路を選択的に阻害することは、関節リウマチ、敗血症及び乾癬などの不治の慢性炎症疾患に対する有効な治療戦略となり得る。その上、NF-κBの活性化は、抗アポトーシス因子の発現を上昇することによりアポトーシスを阻害する役割を有する。この役割により、癌におけるNF-κBシグナリング経路の持続的活性化は、抗癌剤耐性の原因であり、ひいては抗癌剤の治療効果を減少させる。
多くのNF-κBは、正常細胞において、NF-κBの阻害タンパク質であるIκBとの結合により不活性期にある。TNF-α及びLPSなどの様々な刺激により活性化されるＩκBキナーゼ（IKK）複合体はＩκBをリン酸化する。リン酸化されたＩκBは次にユビキチン化されて最終的にプロテアソームにより分解される。ＩκBの分解により、ＩκBに結合したNF-κB（p50/p65）は核膜を通過する。通過後、それは核内において標的遺伝子のプロモーター領域に結合することによりmRNA転写を活性化する。これは、iNOS、COX-2、NO、PGE2、TNF-α及びIL-1などのサイトカイン及び炎症メディエーターの転写を誘導する免疫応答の重要な要素である（Lappas et al., Biol. Reprod. 67:668673, 2002）。
ＩκBのS32A及びS36A変異型であるスーパーリプレッサーＩκBは、ＩκBによりリン酸化されずプロテアソームにより分解されないため、NF-kBを持続的に阻害できる。したがって、それは、様々な炎症性疾患の治療法として大きな可能性を有する。
本発明はスーパーリプレッサーＩκBタンパク質をロードしたエキソソームを提供し、スーパーリプレッサーＩκBタンパク質が標的細胞のサイトゾルに送達されたことを確認した。その結果は、スーパーリプレッサーＩκBタンパク質をロードした本発明のエキソソームが炎症性疾患の治療のために使用され得ることを示す。
MyoD
MyoDは筋肉分化を制御する上で重要な役割を果たすタンパク質である。MyoDは、筋原性制御因子（MRF）として公知のタンパク質のファミリーに属する。MyoDは数百の筋肉遺伝子プロモーターとの結合相互作用を有し、筋芽細胞の増殖を可能にすることが公知である。またMyoDの主要機能の1つは、p21及びミオゲニンの転写を増強することにより、細胞周期から細胞を脱することである。
MyoDタンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。MyoDをロードしたエキソソームは、筋芽細胞関連疾患を治療するために使用され得る。
Tbx18（T-ボックス転写因子18）
Tbx18は、胚発生において重要な役割を果たす転写因子の進化上保存されたファミリーのメンバーをコードする。Tbx18はDNA結合性T-ボックスドメインの存在を特徴とし、脊椎動物特異的Tbx1サブファミリーに属する。Tbx18はT-ボックスファミリーの転写活性化因子に拮抗することにより転写抑制因子として働く。Tbx18は、心臓及び冠血管、尿管並びに脊柱を含む、組織及び器官における様々な発生過程において必要である。それはまた、洞房結節（SAN）の頭部領域においても必要である。
Tbx18の導入は、特定の不整脈の治療として心筋細胞において遺伝子をオンにする方法である。健康な心臓では、洞房結節細胞は心臓ペースメーカーとして働き、心臓を規則的なリズムで拍動させる。洞不全症候群における問題は、SA節が適切に機能せず、不規則な心拍を生じていることである。アデノウイルスを使用してTbx18を心房筋細胞に発現させると、心房筋細胞が心拍を開始するSA節細胞へと変換される。Tbx18は不整脈を治癒することができる遺伝子治療の多くの形態のうちの1つであり得る。
Tbx18タンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。Tbx18タンパク質をロードしたエキソソームは、洞不全症候群を治療するために使用され得る。
p53
腫瘍タンパク質p53は、ゲノム変異を防止することによりゲノムの安定性を保存するため、ゲノムの保護者として公知である。p53は、DNAが持続的な損傷を有する場合にDNA修復タンパク質を活性化し得る。その上、p53は、DNA損傷を認識すると、細胞周期をG1/S制御点に留めることにより増殖を停止し得る。DNA損傷を受けて回復不能である場合には、p53はアポトーシスを誘導し得る。最後に、p53は短いテロメアに対する老化応答に必須である。p53は、DNA損傷、酸化ストレス、浸透圧ショック、リボヌクレオチド欠乏及び無秩序な癌遺伝子発現を含む、無数のストレス因子に応じて活性化される。
p53が損傷すると、腫瘍抑制は大きく損なわれる。p53遺伝子の機能的なコピーを1つだけ受け継ぐ人々は、成年期の初期に腫瘍を発達させる可能性が最も高い。p53の量の増加が、腫瘍の治療又はその拡大の予防のための解決法と思われ得る。
p53タンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。p53タンパク質をロードしたエキソソームは、様々な種類の癌の治療のために使用され得る。
HMGB1（高移動度グループボックス1タンパク質（High mobility group box 1 protein））
HMGB1は、ヒストンのように最も重要なクロマチンタンパク質に含まれる。核内では、HMGB1はヌクレオソーム、転写因子及びヒストンと相互作用する。この核タンパク質はDNAを組織化し、転写を制御する。結合の後、HMGB1はDNAを折り曲げ、これにより他のタンパク質の結合が促進される。それはまたヌクレオソームと相互作用し、収納されたDNAをほどき、クロマチンを再構築する。
HMGB1は、リーダー無し分泌経路を通じて、免疫細胞により分泌される。活性化したマクロファージおよび単球は炎症のサイトカインメディエーターとしてHMGB1を分泌する。HMGB1を中和する抗体は、関節炎、大腸炎、虚血、敗血症などにおける損傷及び組織傷害に対する保護を与える。
HMGB1タンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。HMGB1タンパク質をロードしたエキソソームは、炎症性疾患の治療のために使用され得る。
NeuroD1
神経原性分化1（Neurogenic differentiation 1）は、β2とも呼ばれ、NeuroD型の転写因子である。それは、Eボックス含有プロモーターコンセンサスコア配列5'-CANNTG-3'への結合により転写活性化を媒介する。それは、いくつかの細胞分化経路の制御に寄与される。それは、初期の網膜神経節細胞、内耳感覚神経細胞、及び小脳又は海馬の歯状回細胞層を形成する顆粒細胞、膵臓の内分泌島細胞、並びに小腸の腸内分泌細胞の形成を促進する。
NeuroD1タンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。NeuroD1タンパク質をロードしたエキソソームは、神経細胞発生の制御のために使用され得る。
腫瘍関連マクロファージ（tumor-associated marcophage）（TAM）はマクロファージ系列に属する細胞の一種である。それらは、腫瘍塊に近い近傍又はその中に見出される。TAMは、循環単球又は常在性組織マクロファージに由来し、多くの腫瘍型のストローマ中に見出される主要な白血球浸潤を形成する。TAMは、乳癌、卵巣癌、ある種の神経膠芽腫及びリンパ腫における予後不良、大腸及び胃癌における良好な予後、並びに肺及び前立腺癌における予後不良及び良好な予後の両方に結び付けられてきた。
TAMは、M1及びM2の2つの主要な表現型に分類される。M1 TAMは癌の進行を抑制し、一方、M2 TAMはそれを促進する。いくつかの転写因子はM2マクロファージのM1マクロファージへの移行に関連している。本発明におけるエキソソーム中にロードされる標的タンパク質は、マクロファージのM2からM1への転換に関連する転写因子を含む。標的タンパク質の例は、限定されないが、以下の説明に記載される。
IRF5
IRF5は、転写因子の群であるインターフェロン制御因子のメンバーである。それは、ウイルス媒介性のインターフェロン活性化、並びに細胞成長、分化、アポトーシス及び免疫系活性の調節において役割を有する。IRF5は、DNA又は他のタンパク質と直接相互作用することにより機能する。
IRF5はマクロファージが炎症を促進するか又は阻害するかを制御する分子スイッチとして働く。マクロファージにおけるIRF産生をブロックすれば、幅広い範囲の自己免疫疾患の治療に役立つことが可能であり、IRF5レベルを上方調節すれば、免疫系が弱いか又は損傷している人々の治療に役立つことが可能である。
IRF5タンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。IRF5タンパク質をロードしたエキソソームは、様々な種類の癌の治療のための、M2からM1へのマクロファージの移行のために使用され得る。
IRF3
IRF3は転写因子の群であるインターフェロン制御因子のメンバーである。IRF3は機能ドメインとして核外移行シグナル、DNA結合ドメイン、C末端IRF結合ドメイン及びいくつかの制御部位を含む。それは、非感染細胞の細胞質において不活性な形態で見出される。ウイルス感染、2本鎖RNA又はtoll様受容体シグナリングに際し、それはIKBKE及びTBK1キナーゼによりリン酸化される。これは二量体化及び核局在につながる。IRF3はマクロファージにおける別々の遺伝子発現プログラムを活性化し得る。
IRF3タンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。IRF3タンパク質をロードしたエキソソームは、様々な種類の癌の治療のための、M2からM1へのマクロファージの移行のために使用され得る。
STAT1
シグナル伝達因子及び転写活性化因子1（Signal transducer and activator of transcription 1）は転写因子であり、STATタンパク質ファミリーのメンバーである。STAT1は、インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子又はインターロイキン6などのいくつかのリガンドにより活性化され得る。
I型IFNの細胞表面受容体への結合に続き、Jakキナーゼが活性化し、STAT1及びSTAT2をリン酸化する。STATは二量体化し、ISGF3G/IRF-9と付随し、ISGF3転写因子と名付けられた複合体を形成する。ISGF3は、IFNにより刺激される応答エレメントに結合し、IFNにより刺激される遺伝子の転写を活性化する。
II型IFNへの反応では、STAT1はチロシン及びセリンがリン酸化される。それはホモ二量体を形成し、IFNガンマにより活性化される配列に結合し、標的遺伝子の発現を駆動し、細胞抗ウイルス状態を誘導する。
STAT1タンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。STAT1タンパク質をロードしたエキソソームは、様々な種類の癌の治療のために使用され得る。
SOCS3
サイトカインシグナリングの抑制（Suppression of cytokine signaling）は、STAT誘導性STAT阻害因子のメンバーである。STAT誘導性STAT阻害因子は、サイトカインシグナリングの、サイトカイン誘導性の負の制御因子である。SOCS3は、IL6、IL10及びIFN-ガンマのような様々なサイトカインにより誘導される。
SOCS3の過剰発現は脂肪組織及び肝臓においてインスリンシグナリングを阻害するが、筋肉においては阻害しない。しかし、マウスの骨格筋におけるSOCS3の欠失は、肥満から保護する。SOCS3はまた、セラミド合成の増加の結果として、レプチン耐性及びインスリン耐性の両方に寄与する。研究は、SOCS遺伝子の除去により肥満におけるインスリン耐性が防がれることを示す。SOCS3タンパク質はJAK2キナーゼに結合することができ、JAK2キナーゼの活性を阻害する。
SOCS3タンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。SOCS3タンパク質をロードしたエキソソームは、様々な種類の癌の治療のために使用され得る。
＜抗体＞
抗体は、「Y」の形をした抗体の先端のFabの可変領域を介して、その特異的抗原を認識し結合するタンパク質である。抗体は標的抗原タンパク質に結合することによりその活性を抑制することができる。
本発明におけるエキソソームにロードされる標的タンパク質は抗体及び抗体関連ペプチドを含む。標的タンパク質の例は、限定されないが、以下の説明に記載される。
-抗体及び関連ペプチド
pySTAT3イントラボディ
STAT（シグナル伝達因子及び転写）は、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5（STAT5A及びSTAT5B）並びにSTAT6として同定されている転写因子である。STAT3タンパク質はC末端のトランス活性化ドメインを有する（STAT3の主要リン酸化部位のためのチロシン705及びセリン727残基）。チロシンリン酸化及びその後のSTAT3の二量体化は核への輸送と転写活性化を促進する。
JAK/STAT3シグナリング経路は、インターフェロンシグナリングの増殖因子に誘導される活性化において認められ、増殖、分化、アポトーシス、血管新生、発癌及び免疫に関与する。したがって、STAT3タンパク質は、抗癌剤開発のための単独薬剤又は併用療法として良い標的になり得る。
本発明はpYSTAT3イントラボディをロードしたエキソソームを調製し、pYSTAT3イントラボディが標的細胞のサイトゾルに送達されたことを確認した。その結果は、pYSTAT3イントラボディをロードした本発明のエキソソームが癌の治療のために使用され得ることを示す。
＜その他＞
-アポトーシス関連タンパク質
アポトーシス（プログラム細胞死）は、様々な因子により損傷した細胞を除去するための過程であり、アポトーシスの異常は腫瘍形成性を誘導する。この理由に基づき、腫瘍のアポトーシスを誘導することに関する研究が、腫瘍除去戦略として活発に進歩してきた。細胞委縮によるクロマチン凝縮、アポトーシス体形成、及びDNA断片化はアポトーシスの性質である。アポトーシスは、2つの異なる経路により誘導される。1つはミトコンドリアを介する内因性経路であり、他方は細胞死受容体を介する外因性経路である。アポトーシスは、例えばアポトーシス促進性Bcl-2ファミリーの活性化、プロカスパーゼの分割及びポリADP-リボースポリメラーゼ（PARP）の断片化などにより、様々に制御される。特にシステインプロテアーゼに属するカスパーゼは、正常に増殖する細胞において酵素前駆体（pro-enzyme）であり、アポトーシス誘導シグナルにより活性化され、次いでPARPなどのカーゴタンパク質を関与させることを通じてアポトーシスにおいて重要な役割を有する。
多くのアポトーシス刺激は、Bcl-2及びBcl-XLなどのアポトーシスのアゴニスト及びアンタゴニストを含む相同なタンパク質群をコードするBcl-2遺伝子ファミリーのメンバーによって制御される経路を通じて、哺乳類細胞のアポトーシスを誘導する。これらのメンバーは、区別して制御されるのにも関わらず、配列相同ドメインを共有する。アポトーシスでは、bcl-2及びBax（タンパク質レベルでBcl-2と21%同一）の抗アポトーシス又はアポトーシス促進性の作用は、Bcl-2のBaxへの比率により異なって形成されるホモ及びヘテロ二量体によって制御される。
アポトーシス促進性タンパク質：Bax
Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）はBcl-2タンパク質ファミリーの1つであり、所謂Bcl-2様タンパク質4である。前述のBaxは、ミトコンドリアの外膜に結合し、そのC末端4残基はミトコンドリアの膜間空間に突き出しており、アポトーシスを活性化する役割を有する。前述のタンパク質に関する具体的情報及びその遺伝子の塩基配列はNCBIで公知である（GenBank:NM_001291428、NP_001278357など）。
Baxは、アポトーシス促進性タンパク質を合成する、Bcl-2遺伝子ファミリーのうちの1つである。Baxは変異型p53によりその転写を阻害される。Bax塩基配列の挿入又は欠失は、血液、大腸及び直腸（lectal）癌の細胞株においてBaxの発現が顕著に減少する原因であることはよく公知である。
Baxは、発生中の神経細胞のアポトーシス、リンパ及び生殖系のホメオスタティックな平衡状態、DNA損傷による細胞死、虚血再灌流の損傷などに関与することが公知である。
本発明は、Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）タンパク質をロードしたエキソソームを提供し、Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）タンパク質が標的細胞のサイトゾルに送達されたことを確認した。その結果は、Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）タンパク質をロードした本発明のエキソソームが癌の治療のために使用され得ることを示す。
抗アポトーシスタンパク質：BcL-xL
BCL2様1遺伝子にコードされるB細胞リンパ腫エキストララージ（B-cell lymphoma-extra-large）（Bcl-xL）はミトコンドリアにおける膜貫通分子である。それは、Bcl-2ファミリータンパク質のメンバーであり、カスパーゼの活性化および究極的にはプログラム細胞死につながるシトクロムcなどのミトコンドリア含有物の放出を防ぐことにより抗アポトーシスタンパク質として働く。
生存促進性及び抗生存性Bcl-2ファミリータンパク質の相対量が、細胞が細胞死を起こすかどうかを決定するということは、アポトーシスの分野においてよく確立された概念である。より多くのBcl-xLが存在すれば、細孔はアポトーシス促進性分子に対して非通過性であり、細胞は生存する。Bcl-2と同様に、Bcl-xLは、腫瘍抑制因子であるp53の機能を阻害することにより癌細胞の生存に関係づけられてきた。
Bcl-xLタンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。Bcl-xLタンパク質をロードしたエキソソームは、アポトーシスの制御のために使用され得る。
-その他
多機能シグナル分子：AIMP（アミノアシルtRNA合成酵素相互作用多機能タンパク質）
アミノアシルtRNA合成酵素複合体相互作用多機能タンパク質1（AIMP1）は、多合成酵素複合体の非触媒成分である。細胞質アルギニルtRNA合成酵素の触媒活性を刺激する。炎症性サイトカイン活性を有する。SMURF2への結合によるSMURF2の安定化、及びそのSMAD7に媒介される分解を阻害することによって、TGFベータシグナリングを負に制御する。グルコースレベルが低い場合にグルカゴン分泌の誘導によりグルコースホメオスタシスに関与する。皮膚の線維芽細胞増殖及び創傷修復を促進する。
低濃度では内皮細胞の移動を、高濃度では内皮細胞のアポトーシスを誘導することにより、血管新生において役割を果たす。樹状細胞の成熟及び単球の細胞接着を誘導する。PSMA7との相互作用によりHIF-1Aを分解することによって、内皮細胞の反応を調節する。
アミノアシルtRNA合成酵素複合体相互作用多機能タンパク質2（AIMP2）は、アミノアシルtRNA合成酵素複合体の構築及び安定性に必要である。MYCの転写活性化因子であるFUBP1のユビキチン化及び分解を媒介し、肺胞II型細胞分化に必要なMYC下方調節をもたらす。常染色体劣性若年性パーキンソン症、特発性パーキンソン病及びびまん性レビー小体病に罹患した脳に蓄積する。
AIMP1及びAIMP2タンパク質を含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。AIMP1又はAIMP2タンパク質をロードしたエキソソームは、多機能制御のために使用され得る。
蛍光タンパク質（mCherry、GFP）
蛍光タンパク質は、自身のポリペプチド配列内の3アミノ酸の配列から可視的な波長の発色団を自立して形成できる特有の性質を共有する、構造的に相同なクラスのタンパク質のメンバーである。改変型蛍光タンパク質をコードする遺伝子（又は遺伝子キメラ）を生細胞に導入し、その後蛍光顕微鏡を使用して遺伝子産物の位置及び動態を可視化することは、生物学者にとって一般的な研究上の慣行である。
蛍光タンパク質の最も一般的な用途は、生細胞において特定のオルガネラ又は組換えタンパク質の局在及び動態のイメージングに利用することを含む。特定のオルガネラのイメージングのためには、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、その特定のオルガネラに局在することが公知のタンパク質又はペプチドをコードするcDNAに融合するために、標準的分子生物学手法が使用される。この融合は、キメラ遺伝子が単一ポリペプチドとして発現され、ターゲティングモチーフと蛍光タンパク質の間に共有結合を生じるように行われる。好適なプロモーターの制御下にキメラ遺伝子を含有するプラスミドは、哺乳類細胞に遺伝子導入するために使用され、この哺乳類細胞は次に遺伝子を発現して対応するキメラタンパク質を生成する。該キメラは標的オルガネラに局在し、したがってそれを蛍光にする。蛍光顕微鏡の使用により、オルガネラの形態、動態及び分布を時間の関数として画像化することができる。
mCherryは、ピークの励起/発光がそれぞれ587nm/610nmである単量体型蛍光性構築物である。それは光退色に抵抗性であり、安定である。それは、15分のt0.5で迅速に成熟するため、翻訳後すぐに可視化される。
緑色蛍光タンパク質（GFP）は、青色から紫外の範囲内の光に暴露されたときに明るい緑色蛍光を示す、238アミノ酸残基（26.9 kDa）で構成されるタンパク質である。多くの他の海洋生物が類似の緑色蛍光タンパク質を有するが、GFPは伝統的にクラゲのオワンクラゲ（Aequorea victoria）から最初に単離されたタンパク質を指す。オワンクラゲ由来のGFPは、主要な励起ピークを395nmの波長に有し、小さなピークを475nmに有する。その発光ピークは509nmであり、これは可視スペクトルにおける低めの緑色部分にある。
本発明は、mCherry又はGFPタンパク質をロードしたエキソソームを調製し、mCherry又はGFPタンパク質が標的細胞のサイトゾルに送達されたことを確認した。その結果は、mCherry又はGFPタンパク質をロードした本発明のエキソソームが、生細胞又は動物においてエキソソーム及び連結タンパク質の局在及び動態のイメージングのために使用され得ることを示す。
核酸結合タンパク質（例えばRNP）
核タンパク質は、DNA又はRNAの核酸に構造的に付随する任意のタンパク質である。デオキシリボ核タンパク質（DNP）はDNA及びタンパク質の複合体である。プロトタイプとなる例は、ゲノムDNAが真核細胞核において8個のヒストンタンパク質のクラスターの周囲に巻かれクロマチンを形成する複合体である、ヌクレオソームである。プロタミンは精子形成の間にヒストンに取って代わる。この種の複合体におけるデオキシリボ核タンパク質は、相互作用して多タンパク質制御複合体を生じ、ここではその中に入るDNAが輪になり巻かれている。デオキシリボ核タンパク質はDNA複製及び転写の制御に関与する。
リボ核タンパク質（RNP）はRNAとタンパク質の複合体である。テロメラーゼ酵素、ヴォールトリボ核タンパク質、RNase P、hnRNP及び核内低分子RNP（snRNP）並びにリボソームはリボ核タンパク質である。リボ核タンパク質は保護の役割を果たす。mRNAは細胞内では遊離RNA分子としては決して存在しない。それらは常にリボ核タンパク質と付随しており、リボ核タンパク質複合体として機能する。
DNP又はRNPを含むエキソソームは、エキソソームを高濃度で生成する細胞において、エキソソーム特異的マーカーと標的タンパク質で構成される融合タンパク質を大規模に発現させることによって調製される。DNP又はRNPをロードしたエキソソームは、遺伝的制御又は核酸輸送エキソソームのために使用され得る。
本発明は、カーゴタンパク質を含有するエキソソームを使用することにより、カーゴタンパク質が標的細胞のサイトゾルに首尾よく送達されたことを確認した。それによって本発明は、サイトゾルにおいて細胞内シグナリングを効率的に制御することによって、エキソソームを使用して疾患を治療する方法を提供する。
本発明の別の目的は、エキソソームを活性成分として含有する、炎症性疾患を予防するか又は治療するための医薬組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、エキソソームを活性成分として含有する、癌を予防するか又は治療するための医薬組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、エキソソームを活性成分として含有する、酸素関連疾患を予防するか又は治療するための医薬組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、エキソソームを活性成分として含有する、標的遺伝子のコンディショナルノックアウトアリルを生成するための組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、エキソソームを活性成分として含有する、DNA配列を操作する組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、エキソソームを活性成分として含有する、ゴーシェ病を予防するか又は治療する医薬組成物を提供することである。
本発明者らは、様々な試みで、カーゴタンパク質を含むエキソソームを調製するための効率的な方法を開発するために研究した。その研究の過程で、本発明者らは、エキソソーム特異的マーカー(CD9、CD63、CD81及びCD82)に注目した。これらのマーカーは、テトラスパニンファミリーに属し、一般に、4回貫通型膜タンパク質である。本発明者らは、カーゴタンパク質がエキソソームの膜タンパク質上に結合した場合、カーゴタンパク質が比較的容易にエキソソームの内部に含まれるであろうと予測した。
エキソソームの膜上に特に豊富で、細胞膜を貫通することができるエキソソーム特異的マーカーとカーゴタンパク質で構成される融合タンパク質を、エキソソームを高濃度で内因的に生成する細胞で発現させることによって、カーゴタンパク質を含むエキソソームを大規模に生成することができる。
特に、カーゴタンパク質を含むエキソソームを調製するための本発明の方法は、エキソソーム特異的マーカーとカーゴタンパク質で構成される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、エキソソームを生成する細胞に導入することを特徴とする。
この時、調製したエキソソームでは、カーゴタンパク質はエキソソームの膜に包埋されたエキソソーム特異的マーカーと融合している。
前記カーゴタンパク質はエキソソームの膜タンパク質に結合しており、標的細胞に到達した後でさえも分離しない。この問題を解決するために様々な試みを行った。その結果、マーカータンパク質にカーゴタンパク質を一時的に結合することによって、カーゴタンパク質を含むエキソソームを調製するための技法を開発した。例えば、CIBN及びCRY2などの光特異的結合タンパク質を本明細書で使用することができる。特に、CIBNをマーカータンパク質のうちの1つであるCD9と融合した形態で発現させる。その一方で、CRY2とカーゴタンパク質の融合タンパク質をコードする遺伝子を、エキソソームを生成する細胞に導入する。エキソソーム生成細胞で発現するCIBN-CD9融合タンパク質は、CD9によってエキソソームの内部に含まれ得る。この時、細胞を青色LED光で照射すると、エキソソーム生成細胞で発現するカーゴタンパク質-CRY2融合タンパク質のCRY2ドメインは、CD9融合CIBNドメインに結合する。その結果、可逆的「カーゴタンパク質-CRY2-CIBN-CD9融合タンパク質」が生成される。この融合タンパク質は、CD9によってエキソソームの内部に含まれ得る。一旦カーゴタンパク質を含むエキソソームが生成され、青色LED光の照射が終了すると、CIBN-CRY2連結が破壊され、それによって、エキソソームの細胞膜から離れたカーゴタンパク質がエキソソーム中に残り、結果的にカーゴタンパク質を含むエキソソームが調製される(図５〜１０)。
本発明の方法によって調製されるこの種のエキソソームは、標的物質を含む従来のエキソソームとその効果が完全に異なる。従来のエキソソームは、エキソソームの内部にカーゴタンパク質をもたらすために、エキソソーム特異的マーカーに融合したものとして発現され、その結果、カーゴタンパク質は、たとえエキソソームの内部に含まれるとしても、遊離しておらず、エキソソームの膜に結合したものとしてもたらされ、これは、カーゴタンパク質はエキソソームの膜から分離され得ず、したがって、エキソソームが標的細胞の細胞膜に融合する場合だけ標的細胞に送達され得ることを示唆するものである。その上、エキソソームが標的細胞に融合した後でさえも、カーゴタンパク質はエキソソームの膜に結合したままであり、標的細胞においてカーゴタンパク質がその効果を示す確率は非常に低い。しかし、本発明のエキソソームは、遊離体として存在し、エキソソームの膜に結合していないカーゴタンパク質をもたらす。したがって、そのようなエキソソームが標的細胞のエンドサイトーシスによってサイトゾルに入る場合、これはエキソソームの膜に接着せず、エキソソームがその中で分解される場合、含まれているカーゴタンパク質はサイトゾルに送達され得、標的細胞のサイトゾル中を自由に移動でき、これは、カーゴタンパク質が、標的細胞サイトゾル中でその生理活性をともなって十分に活性であることを示唆するものである(図１１)。
照射する光の強度に応じてマーカータンパク質へのカーゴタンパク質の結合レベルを変えることができ、光の強度を調節することによって、エキソソーム中に集められるカーゴタンパク質の濃度を制御することができる。
光特異的結合タンパク質を使用することによってカーゴタンパク質を含むエキソソームを調製する方法はまだ報告されておらず、本発明者らが最初に提唱した。
特に、カーゴタンパク質を含むエキソソームを調製するための本発明の方法は、以下のステップで構成される:(a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質I)をコードするポリヌクレオペプチド、及びカーゴタンパク質と、第1の光特異的結合タンパク質に連結することができる第2の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質II)をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入するステップ、(b)第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の間の結合を引き起こすことができる光でエキソソーム生成細胞を照射するステップ、並びに(c)エキソソーム生成細胞中でエキソソームの生成が終わった後に照射を終了するステップ。
本発明では、用語「エキソソーム」は、多小胞体(MVB)と呼ばれる細胞内の特定の区画から生じ、細胞から放出又は分泌される原形質膜構造を有する小さな小胞を示す。
本発明では、エキソソームは、カーゴタンパク質それ自体を保持することによって標的の細胞又は組織にカーゴタンパク質を送達するための担体としての役割を果たす。この時、エキソソームによって保持されるカーゴタンパク質は、特定の疾患の治療又は診断に役立つように標的の細胞又は組織で働く。
本発明では、用語「エキソソーム生成細胞」は、エキソソームを生成することができる細胞を示す。
本発明では、エキソソーム生成細胞は限定されないが、好ましくは、Bリンパ球、Tリンパ球、樹状細胞、巨核球、マクロファージ、幹細胞及び腫瘍細胞などで例示される。例えば、本発明では、不死化細胞株の一種であるHEK293T細胞をエキソソーム生成細胞として使用した。
本発明では、用語「エキソソーム特異的マーカー」は、エキソソームの膜上に豊富なタンパク質を示す。
本発明では、エキソソーム特異的マーカーは、限定されないが、好ましくは、CD9、CD63、CD81及びCD82などで例示される。例えば、本発明の好ましい実施形態では、CD9をエキソソーム特異的マーカーとして使用した。CD9、CD63、CD81及びCD82は、カーゴタンパク質がエキソソームの膜タンパク質に結合している場合に、カーゴタンパク質がエキソソーム中に容易に存在できるようにする、4回貫通型膜タンパク質である。
本発明では、用語「光特異的結合タンパク質」は、光誘導性ヘテロ二量体形成タンパク質又は光誘導性ホモ二量体形成タンパク質とも呼ばれ、これは、特定の波長の光が照射される場合に、別のタンパク質と組み合わさることによってヘテロ二量体を形成することができる又は同種の別のタンパク質と組み合わさることによってホモ二量体を形成することができるタンパク質を示す。
本発明では、光特異的結合タンパク質は、限定されないが、好ましくは光誘導性ヘテロ二量体形成タンパク質又はCIB(クリプトクローム相互作用ベーシック-ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質)、CIBN(CIBのN末端ドメイン)、PhyB(フィトクロームB)、PIF(フィトクローム相互作用因子)、FKF1(フラビン結合、Kelchリピート、F-ボックス1)、GIGANTEA、CRY(クリプトクローム)及びPHR(フィトリアーゼ(phytolyase)相同領域)などで例示される。
特に、光特異的結合タンパク質が光誘導性ヘテロ二量体形成タンパク質である場合は、2種の光特異的結合タンパク質(第1及び第2の光特異的結合タンパク質)を使用することができる。第1の光特異的結合タンパク質がCIB又はCIBNである場合、第2の光特異的結合タンパク質はCRY又はPHRでもよい。第1の光特異的結合タンパク質がPhyBである場合、第2の光特異的結合タンパク質はPIFでもよい。第1の光特異的結合タンパク質がGIGANTEAである場合、第2の光特異的結合タンパク質はFKF1でもよい。
例えば、本発明の好ましい実施形態では、第1の光特異的結合タンパク質としてCIBNを使用し、第2の光特異的結合タンパク質としてCRY2を使用した。本明細書で使用する光の波長は、460〜490nmの青色光であった。光の強度は20〜50μWであった。
その一方で、エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される第1の融合タンパク質の発現を確認し、その位置を見つけるために、これにマーカータンパク質を融合することができる。例えば、本発明の好ましい実施形態では、蛍光タンパク質EGFPが、CIBNとCD9又はGIGANTEAとCDが一緒に連結している第1の融合タンパク質に挿入された。したがって、第1の融合タンパク質の発現パターン(発現及び発現レベル)並びに細胞内位置を、蛍光タンパク質EGFPを持つ第1の融合タンパク質の発現によって調べることができる。
本発明では、用語「カーゴタンパク質」は、エキソソームの内部にカーゴタンパク質を位置づけるための第2の光特異的結合タンパク質と結合した融合タンパク質として発現するタンパク質を示す。
本発明では、カーゴタンパク質は、細胞で発現した後にエキソソームによって保持され得る。カーゴタンパク質は限定されないが、好ましくは、疾患治療用タンパク質又は疾患診断用タンパク質である。例えば、本発明の好ましい実施形態では、蛍光を有するmCherryをカーゴタンパク質として使用した。
本発明におけるカーゴタンパク質の例は、限定されないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）タンパク質、メタロプロテイナーゼ組織阻害因子（tissue inhibitor of metalloproteinase; TIMP）タンパク質、カスパーゼタンパク質、カスパーゼ阻害タンパク質、カテプシンタンパク質又はカテプシン阻害タンパク質から選択され、
ここで、
MMPタンパク質は、限定されないが、MMP1タンパク質（配列番号１３）などであり；
TIMPタンパク質は、限定されないが、TIMP1タンパク質（配列番号１４）、TIMP2タンパク質（配列番号１５）、TIMP3タンパク質（配列番号１６）又はTIMP4タンパク質（配列番号１７）などであり；
カスパーゼタンパク質は、限定されないが、カスパーゼ1タンパク質（配列番号１８）、カスパーゼ2タンパク質（配列番号１９）、カスパーゼ3タンパク質（配列番号２０）、カスパーゼ4タンパク質（配列番号２１）、カスパーゼ5タンパク質（配列番号２２）、カスパーゼ6タンパク質（配列番号２３）、カスパーゼ7タンパク質（配列番号２４）、カスパーゼ8タンパク質（配列番号２５）、カスパーゼ9タンパク質（配列番号２６）、カスパーゼ10タンパク質（配列番号２７）、カスパーゼ11タンパク質（配列番号２８）、カスパーゼ12タンパク質（配列番号２９）、カスパーゼ13タンパク質（配列番号３０）又はカスパーゼ14タンパク質（配列番号３１）などであり；
カスパーゼ阻害タンパク質は、限定されないが、配列番号１８〜３１で表されるカスパーゼタンパク質を阻害するタンパク質、又はカスパーゼを阻害する任意のタンパク質などであり；
カテプシンタンパク質は、限定されないが、カテプシンAタンパク質（配列番号３２）、カテプシンBタンパク質（配列番号３３）、カテプシンCタンパク質（配列番号３４）、カテプシンDタンパク質（配列番号３５）、カテプシンEタンパク質（配列番号３６）、カテプシンFタンパク質（配列番号３７）、カテプシンGタンパク質（配列番号３８）、カテプシンHタンパク質（配列番号３９）、カテプシンKタンパク質（配列番号４０）、カテプシンL1タンパク質（配列番号４１）、カテプシンL2タンパク質（配列番号４２）、カテプシンOタンパク質（配列番号４３）、カテプシンSタンパク質（配列番号４４）、カテプシンWタンパク質（配列番号４５）又はカテプシンZタンパク質（配列番号４６）などであり；且つ
カテプシン阻害タンパク質は、限定されないが、配列番号３２〜４６で表されるカテプシンタンパク質を阻害するタンパク質、又はカテプシンを阻害する任意のタンパク質などである。
本発明におけるカーゴタンパク質の別の例は、限定されないが、Creリコンビナーゼ、Casタンパク質、カスパーゼ（pascase）活性化DNase（CAD）タンパク質、β-グルコセレブロシダーゼ（GBA）、p38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（PTEN）、ヤヌスキナーゼ（JAK）、ユビキチンリガーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシレドキシン（Prx）I若しくはII、NF-κB阻害タンパク質、MyoDタンパク質、Tbx18タンパク質、p53タンパク質、高移動度グループボックス1（HMGB1）タンパク質、神経原性分化1（Neuro-D1）タンパク質、インターフェロン制御因子5（IRF5）タンパク質、インターフェロン制御因子3（IRF3）タンパク質、シグナル伝達因子及び転写活性化因子1（Signal Transducer and Activator of Transcription 1; STAT1）タンパク質、サイトカインシグナリング抑制因子3（Suppressor of cytokine signaling 3; SOCS3）タンパク質、シグナル伝達因子及び転写活性化因子2（STAT2）タンパク質、リン酸化STAT3阻害タンパク質（pySTAT3）、Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）、B細胞リンパ腫エキストララージ（Bcl-xL）タンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素相互作用多機能タンパク質（AIMP）、mCherryタンパク質、緑色蛍光タンパク質（GFP）、又は核酸に結合する核タンパク質から選択され、
ここで、
Creリコンビナーゼは、DNA中でloxP部位を認識することによりloxP部位の間でDNAを組換え、限定されないが、配列番号９で表されるCreリコンビナーゼを含み；
Casタンパク質は、複合体をガイドRNAと結合させる場合にエンドヌクレアーゼ又はニッカーゼ活性を有する。一部の実施形態では、Casタンパク質は、配列番号１０で表されるCasタンパク質などのCas9タンパク質、その変異体又は配列番号１１で表されるアミノ酸などのCpf1タンパク質であり；
CADタンパク質は、配列番号４７で表されるアミノ酸などであり；
β-グルコセレブロシダーゼ（GBA）は、配列番号１２で表されるアミノ酸などであり；
p38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（p38 MAPK）タンパク質は、p38-α又はその変異体などであり、配列番号４８〜５１で表されるアミノ酸を含み；
阻害因子カッパBキナーゼ（IKK）タンパク質は、配列番号８３で表されるアミノ酸などであり；
核内因子-カッパB（NF-κB）タンパク質は、配列番号８４で表されるアミノ酸などであり；
ホスファターゼ及びテンシンホモログ（PTEN）タンパク質は配列番号５２で表されるアミノ酸などであり；
ヤヌスキナーゼ（JAK）タンパク質は、JAK1、JAK2、JAK3及びTYK2を含み、ここでJAK1タンパク質は配列番号５３で表されるアミノ酸などであり、JAK2タンパク質は配列番号５４で表されるアミノ酸などであり、JAK3タンパク質は配列番号５５で表されるアミノ酸などであり、TYK2タンパク質は配列番号５６で表されるアミノ酸などであり；ユビキチンリガーゼタンパク質はc-CBL、PRKN、RBX1、TRAF1及びMdm2を含み、ここでユビキチンリガーゼタンパク質は配列番号５７から６１で表されるアミノ酸などであり；
ルシフェラーゼタンパク質は配列番号６２で表されるアミノ酸などであり；
ペルオキシレドキシン（Prx）I若しくはIIは、酸化ストレスに由来する細胞傷害性を阻害する効果を有し、ここでペルオキシレドキシンIは配列番号７で表されるアミノ酸などであり、ペルオキシレドキシンIIは配列番号８で表されるアミノ酸であり；
NF-κB阻害タンパク質は、細胞質においてNF-κBと結合することによりこれを不活性化するスーパーリプレッサーIκBであり、ここでスーパーリプレッサーIκBタンパク質は、IκBのS32A及びS36A変異型であり、IκBキナーゼ（IKK）によってリン酸化されず、その結果NF-κBを持続的に阻害し得、NF-κB阻害タンパク質は配列番号１から５のうちの1つで表されるアミノ酸などであり、IκB-α、IκB-β、IκB-ε、BCL-3又はそれらの変異体によって例示され；
MyoDタンパク質は配列番号６３で表されるアミノ酸などであり；
Tbx18タンパク質は配列番号６４で表されるアミノ酸などであり；
p53タンパク質は配列番号６５で表されるアミノ酸などであり；
高移動度グループボックス1（HMGB1）タンパク質は配列番号６６で表されるアミノ酸などであり；
神経原性分化1（Neuro-D1）タンパク質は配列番号６７により代表されるアミノ酸などであり；
インターフェロン制御因子5（IRF5）タンパク質は配列番号６８で表されるアミノ酸などであり、
インターフェロン制御因子3（IRF3）タンパク質は配列番号６９で表されるアミノ酸などであり、
シグナル伝達因子及び転写活性化因子1（STAT1）タンパク質は配列番号７０で表されるアミノ酸などであり；
サイトカインシグナリング抑制因子3（SOCS3）タンパク質は配列番号７１で表されるアミノ酸などであり；
シグナル伝達因子及び転写活性化因子2（STAT2）タンパク質は配列番号７２で表されるアミノ酸などであり；
pySTAT3イントラボディ抗体タンパク質を含むリン酸化STAT3阻害タンパク質（pySTAT3）は、pySTAT3に結合してpySTAT3を不活性化し、配列番号７３で表されるアミノ酸などであるか、又はpySTAT3を阻害する任意のタンパク質であり；
Bax（Bcl2結合Xタンパク質）は配列番号６で表されるアミノ酸などであり；
B細胞リンパ腫エキストララージ（Bcl-xL）タンパク質は配列番号７４で表されるアミノ酸などであり；
アミノアシルtRNA合成酵素相互作用多機能タンパク質（AIMP）はAIMP1及びAIMP2を含み、ここでAIMP1タンパク質は配列番号７５で表されるアミノ酸などであり、AIMP2タンパク質は配列番号７６で表されるアミノ酸などであり；
mCherryタンパク質は配列番号７７で表されるアミノ酸などであり；
緑色蛍光タンパク質（GFP）は配列番号７８により代表されるアミノ酸などであり；
核酸に結合する核タンパク質は、DNAに結合するデオキシリボ核タンパク質（DNP）又はRNAに結合するリボ核タンパク質（RNP）であり、ここでDNPはRBBP4又はNAP1L4を含み、RNPはテロメラーゼ、異種性核リボ核タンパク質K（heterogenous nuclear ribonucleoprotein K）（HNRNPK）を含み、ここで核タンパク質は配列番号７９〜８２で表されるアミノ酸、ヌクレオソーム、プロタミン、核内低分子RNP（snRNP）若しくはその変異体、又は核酸に結合する任意のタンパク質などである。
本発明では、用語「培養」は、適切に制御された環境で細胞又は微生物を増殖させる方法を示す。
本発明では、形質転換体を1〜3日間培養し、次いで、培地を無血清培地に交換し、続いてさらに2〜5日間培養した。
本発明では、形質転換体を培養する方法は当業者に周知のもののうちのいずれかである。
本明細書では、前記培地は動物細胞培養に広く使用されている発表された培地を示し、市販の無血清培地、無タンパク質培地及び合成培地からなる群から選択することができる。
上記の無血清培地は動物細胞培養に使用され、ウシ胎児血清を含まず、SFM4CHO(HyClone)及びEX-Cell(JHR Bioscience)で例示される。インスリン様増殖因子I(IGF-I)、エタノールアミン、塩化第二鉄及びホスファチジルコリンを培地に加えることができるが、必ずしもこれらに限定されるとは限らない。
上記の無タンパク質培地は、動物由来タンパク質、とりわけ、特に少なくとも10kDaの分子量を有する高分子タンパク質が排除された動物細胞培養培地である。無タンパク質培地は、ProCHO(Lonza)及びPF-CHO(HyClone)でもよいが、必ずしもこれらに限定されるとは限らない。
上記の合成培地は、いかなる動物由来成分も含まず、代わりにすべてが定義された化学構造を有する成分を有する、動物細胞培養培地である。合成培地は、CDM4CHO(HyClone)、PowerCHO2CD(Lonza)及びCD-optiCHO(Life Technologies)でもよいが、必ずしもこれらに限定されるとは限らない。
本発明では、用語「第1の融合タンパク質」は、エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の間の結合によって作製される融合タンパク質を示す。
本発明では、第1の融合タンパク質に含まれるエキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の配置の順序は、第1の融合タンパク質がエキソソーム生成細胞で発現する場合に第1の光特異的結合タンパク質がエキソソームの内部に向かう方向に位置する限り限定されない。例えば、第1の光特異的結合タンパク質のN末端をエキソソーム特異的マーカーのC末端に結合することができる。
第1の融合タンパク質を構成するエキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質は互いに直接連結されるか、リンカーによって結合され得る。上記のリンカーは、第1の融合タンパク質がエキソソーム生成細胞で発現し、エキソソームの内部に向かう方向に位置する第1の光特異的結合タンパク質をもたらす限り限定されないが、好ましくは、アミノ酸で構成されるペプチドリンカー、より好ましくは、可動性ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは発現ベクターを使用することによって発現させることができ、ここでは、リンカーをコードする核酸が各ドメインをコードする他の核酸とインフレームで結合している。
用語「第2の融合タンパク質」は、第2の光特異的結合タンパク質とカーゴタンパク質が結合している融合タンパク質を示す。
本発明では、第2の融合タンパク質に含まれる第2の光特異的結合タンパク質とカーゴタンパク質の配置の順序は、エキソソーム生成細胞において第1の融合タンパク質の第1の光特異的結合タンパク質の領域と結合するように第2の融合タンパク質がエキソソームの内部に位置する限り限定されない。例えば、カーゴタンパク質のN末端を第2の光特異的結合タンパク質のC末端に結合することができる。
第2の融合タンパク質を構成する第2の光特異的結合タンパク質とカーゴタンパク質は互いに直接連結されるか、リンカーによって結合され得る。上記のリンカーは、エキソソーム生成細胞において第1の融合タンパク質の第1の光特異的結合タンパク質と結合するように第2の融合タンパク質がエキソソームの内部に位置する限り限定されないが、好ましくは、アミノ酸で構成されるペプチドリンカー、より好ましくは、可動性ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは発現ベクターを使用することによって発現させることができ、ここでは、リンカーをコードする核酸が各ドメインをコードする他の核酸とインフレームで結合している。
さらに、上記の各融合タンパク質は、1つ以上のアミノ酸残基が、その中に含まれる各ドメインの野生型アミノ酸配列のアミノ酸残基と異なる配列を有するポリペプチドを含むことができる。分子の全体的な活性の変化をともなわない、タンパク質及びポリペプチドにおけるアミノ酸交換は、当技術分野で周知である。最も一般的な交換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及びAsp/Glyの間で生じる。さらに、アミノ酸配列の変異又は改変によって、熱若しくはpHに対する構造安定性が増大した、又はタンパク質活性が増大したタンパク質が含まれ得る。
最後に、上記の融合タンパク質又は融合タンパク質を含む各ドメインのポリペプチドは、当業者によく知られている化学的ペプチド合成方法によって調製することができ、又は以下の方法によって調製することができる。各ドメインをコードする遺伝子をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によって増幅するか、当業者に周知の従来の方法によって合成する。遺伝子を発現ベクターにクローニングし、発現させる。
その一方で、各融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入することによって、各融合タンパク質をエキソソーム生成細胞で発現させることができる。この時、当業者によく知られている従来の方法によって、ポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入する。例えば、発現ベクターを導入に使用することができる。
本発明では、用語「発現ベクター」は、標的ペプチドを宿主細胞で発現させることができる組換えベクターである。このベクターは、遺伝子インサートを発現するように作動可能に連結される必須調節因子を含む遺伝子コンストラクトを示す。発現ベクターは、発現制御エレメント、例えば、開始コドン、終止コドン、プロモーター及びオペレーターを含む。開始コドン及び終止コドンは、一般に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部として理解される。これらは、遺伝子コンストラクトが導入される場合に働くはずであり、インフレームでコード配列に存在するはずである。ベクターのプロモーターは、構成的でもよいし、誘導的でもよい。
本発明では、用語「作動可能に連結される」は、通常通り機能する核酸発現調節配列及びカーゴタンパク質又はRNAをコードする核酸配列が機能的連結によって連結している状況を示す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすようにタンパク質又はRNAをコードする核酸配列に作動可能に連結される。発現ベクターとの機能的連結は、当業者に周知の組換えDNA技術によって達成することができ、特に、部位特異的なDNAの切断及び連結は、当業者に周知の従来の酵素を使用することによって達成することができる。
前記発現ベクターは、細胞培養培地からのタンパク質の分離を促進するために、融合ポリペプチドの放出のためのシグナル配列を含むことができる。挿入核酸配列の効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルが必要である可能性がある。これらのシグナルは、ATG開始コドン及びその隣接配列を含む。いくつかの場合には、ATG開始コドンを含み得る外来性翻訳制御シグナルを設けるべきである。これらの外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、様々な天然源及び合成源であり得る。適切な転写又は翻訳エンハンサーの導入によって、発現効率を増大させることができる。
本発明の好ましい実施形態では、発現ベクターは、エキソソームの内部へのカーゴタンパク質の挿入を確認するために、タグと結合したカーゴタンパク質を発現させることができる。本明細書のタグは、カーゴタンパク質の存在を確認するためのものであり、これは、第2の光特異的結合タンパク質の結合の領域と反対の領域に結合することができる。例えば、赤色蛍光タンパク質及び緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質が、カーゴタンパク質のC末端に結合するタグとして使用される。
上記のように調製されるカーゴタンパク質は、エキソソーム生成細胞で発現される。一旦エキソソームが生成されれば、蛍光タンパク質タグが検出されるかどうかを調べ、それによって、エキソソーム中のカーゴタンパク質の存在を確認することができる。
本発明では、用語「光」は、エキソソーム生成細胞で発現する第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質を一時的に結合するために照射する光を示す。
前述のように、第1の光特異的結合タンパク質はエキソソーム特異的マーカーと結合した第1の融合タンパク質として発現し、一方で、第2の光特異的結合タンパク質はカーゴタンパク質と結合した第2の融合タンパク質として発現する。光がエキソソーム生成細胞に照射されると、第1の光特異的結合タンパク質が第2の光特異的結合タンパク質と結合し、その結果、エキソソーム特異的マーカー-第1の光特異的結合タンパク質-第2の光特異的結合タンパク質-カーゴタンパク質を含む融合タンパク質複合体が一時的に形成される。エキソソーム生成細胞中でエキソソームが生成されると、カーゴタンパク質は、エキソソーム特異的マーカーによってエキソソームと連結することができる。この時、カーゴタンパク質がエキソソームの内部に現れ、エキソソームの生成後に光照射が停止すると、第1の光特異的結合タンパク質が第2の光特異的結合タンパク質から分離し、それによって、エキソソームに含まれるカーゴタンパク質が、エキソソームの一部としてエキソソームとともに放出されることになる。エキソソームの内部にカーゴタンパク質をより効率的に送達するために、継続的ではなく断続的に細胞に光が照射されることが好ましい。すなわち、光が断続的に照射される場合、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合及び分離が繰り返され、その結果、カーゴタンパク質がエキソソームに導入される確率が高まり得る。
その一方で、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合を誘導するのに十分な光の波長は、第1及び第2の光特異的結合タンパク質の種類によって変わる。第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合を誘導する光の波長はタンパク質の種類に依存する。したがって、適切な光の波長は、当業者に知られている通りに選択され得る。例えば、CRY2をCIBNに連結するためには、460〜490nmの波長の光が好ましい。光が10分未満照射されると、CRY2とCIBNは互いに分離される。PhyBがPIFと結合する場合は、650nmの波長の光が10分間照射される。750nmの波長の光が5分間照射される場合、PhyBとPIFは互いに分離される。FKF1がGIGANTEAと結合する場合は、460nmの波長の光が30分間照射される。本発明の好ましい実施形態では、CIBNとCRY2の結合を誘導するために、460〜490nmの波長の光を照射した。
本発明の好ましい実施形態では、CRY2/mCherry融合タンパク質及びCIB/CD9融合タンパク質を大量のエキソソームを生成する不死化細胞株であるHEK293Tで発現させた。その結果、サイトゾル中に均一に分布したmCherryタンパク質の分布は、青色光を照射した場合、細胞膜及びエンドソーム様構造体の膜の中にあることが分かった(図７)。FKF1/mCherry融合タンパク質及びGIGANTEA/CD9融合タンパク質をHEK293T細胞で発現させた場合、同様の結果が観察された(図１２)。CRY2/mCherry融合タンパク質及びCIBN/CD9融合タンパク質をHEK293T細胞で発現させ、続いて、光の強度を調節しながら青色光で照射した。その結果、20〜50μWの強度で光を照射した場合、エキソソーム中に集められるmCherryタンパク質のレベルが最も高かった(図９)。細胞から単離したエキソソームを、およそ250μg/mlの濃度でHT1080細胞に処理した。その結果、エキソソームは、HT1080細胞に対していかなる特定の細胞毒性も示さず、且つmCherryタンパク質がそのサイトゾルに送達されることが確認された(図１０)。
エキソソームへのカーゴタンパク質の導入効率及び標的細胞へのエキソソームの移行効率を従来の方法のものと比較するために、従来の方法についてXPACKベクターを使用し、CRY2/mCherry融合タンパク質及びCIBN/CD9融合タンパク質の発現ベクターをHEK293T細胞に導入した。次いで、エキソソーム中でのカーゴタンパク質の生成を比較した。その結果、本発明の方法の方法を使用した場合、導入効率が著しく高いことが確認された(図１５)。エキソソーム生成細胞から分離したエキソソームを標的細胞(HeLa)に処理して、カーゴタンパク質の発現を比較した。本発明の方法によって分離したエキソソームを使用した場合、標的細胞中において、カーゴタンパク質の発現が最も高かった(図１６)。
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明は、(a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の融合タンパク質(第1の融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドを含む第1の発現ベクター、並びに(b)カーゴタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することができるマルチクローニングサイト、及び上記の第1の光特異的結合タンパク質に連結される第2の光特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第2の発現ベクターを含む、エキソソームの生成のためのベクターを提供する。
本発明によって提供されるエキソソームの生成のためのベクターにおいて、エキソソーム特異的マーカー、第1の光特異的結合タンパク質、エキソソーム生成細胞、及び第2の光特異的結合タンパク質は上記と同様である。
本発明では、用語「エキソソーム生成のための形質転換細胞」は、第1の融合タンパク質を発現させることによってエキソソームを生成することができる細胞であって、エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の融合タンパク質(第1の融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドが導入されている細胞を示す。
本発明では、第2の発現ベクターは、第2の光特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び隣接したマルチクローニングサイトを含む。カーゴタンパク質をコードするポリヌクレオチドがマルチクローニングサイトに挿入される場合、これは、第2の光特異的結合タンパク質とカーゴタンパク質を含む融合タンパク質(第2の融合タンパク質)として発現する。
本発明によって提供されるエキソソームを調製するためのベクターは、エキソソーム生成のための形質転換細胞及び発現ベクターだけでなく、発現ベクターの導入、エキソソーム生成のための形質転換細胞の培養、並びにエキソソーム生成のための形質転換細胞から生成されたエキソソームの分離及び精製にも使用可能な1種以上の構成成分、溶液又は装置を含むことができる。例えば、発現ベクターの導入に適した緩衝液並びにエキソソーム生成のための形質転換細胞の培養に必要である培地及び容器をさらに含むことができる。
本発明では、用語「Casタンパク質」は、Casタンパク質がCRSPR RNA（crRNA）及びトランス活性化crRNA（trans-activating crRNA）（tracrRNA）と呼ばれる2つのRNAと複合体を形成する場合に、活性のあるエンドヌクレアーゼ又はニッカーゼを形成するCRISPR/Casシステムの必須タンパク質を示す。
本発明では、用語「ガイドRNA」は、Casタンパク質と複合体を形成することができ、Casタンパク質を標的DNAに導く標的DNA特異的RNAを示す。
本発明では、前述のガイドRNAは、CRISPR RNA（crRNA）及びトランス活性化crRNA（tracrRNA）の2つのRNA、又はcrRNA及びtracrRNAの必須部分を融合することによる単鎖RNA（sgRNA）により生成することができる。
前述のガイドRNAは、crRNA及びtracrRNAを含むデュアルRNAであってもよい。前述のガイドRNAがcrRNA及びtracrRNAの必須部分及び標的相補性部分を含むならば、任意のガイドRNAが本発明に適用されてもよい。前述のcrRNAは標的DNAにハイブリダイズし得る。
前述のガイドRNAは、デュアルRNAにおいて単鎖ガイドRNA又はcrRNAの5'端に1個以上の追加のヌクレオチドを含んでもよい。
望ましくは、前述のガイドRNAは、デュアルRNAにおいて単鎖ガイドRNA又はcrRNAの5'端に2個の追加のグアニンヌクレオチドを含んでもよい。ガイドRNAは、RNA又はガイドRNAをコードするDNAとして細胞又は生体に送達されてもよい。ガイドRNAは分離したRNAであるか、ウイルスベクターに含まれたRNAであるか、又はベクターにコードされていてもよい。望ましくは、前述のベクターは限定されないがウイルスベクター、プラスミドベクター又はアグロバクテリウムベクターであってもよい。
ガイドRNAをコードするDNAは、ガイドRNAをコードするDNA配列を含むベクターであってもよい。例えば、ガイドRNAは、単離したガイドRNA、又はガイドRNAをコードする配列及びプロモーターを含むプラスミドDNAを遺伝子導入することにより、細胞また生体に送達されてもよい。他の方法により、ガイドRNAは、ウイルスを介した遺伝子送達を使用して細胞又は生体に送達されてもよい。
ガイドRNAを単離RNAとして細胞又は生体に遺伝子導入する場合には、それは、産業において公知の任意のin vitro転写システムを使用することによるin vitro転写によって製造されてもよい。望ましくは、ガイドRNAは、ガイドRNAをコードする配列を含むプラスミドよりも単離RNAとして細胞に送達される。用語「単離RNA」は、本発明では「裸のRNA」に交換可能である。単離RNAはクローニング過程を必要としないという点で、それはコストと時間を節約できる。しかし、ガイドRNA遺伝子導入のためのプラスミドDNA又はウイルスを介した遺伝子送達の使用は、除外されない。
本発明は、カーゴタンパク質が含まれる本発明の方法により調製されるエキソソームを提供する。
別の態様では、本発明は上記の方法により生成されるエキソソームを提供し、ここでcreリコンビナーゼがエキソソームに含まれる。
別の態様では、本発明は上記の方法により調製されるエキソソームを提供し、ここでCas9タンパク質がそこに含まれる。
別の態様では、本発明は上記の方法により生成されるエキソソームを提供し、ここでGBA（β-グルコセレブロシダーゼ）タンパク質がそこに含まれる。
別の態様では、本発明は上記の方法により生成されるエキソソームを提供し、ここでペルオキレドキシン（Prx）Ｉ又はIIタンパク質がそこに含まれる。
別の態様では、本発明は、上記の方法により生成され、NF-κBを阻害するタンパク質を含むエキソソームを提供する。
別の態様では、本発明は上記の方法により調製されるエキソソームを提供し、ここでBax（Bcl-2結合Xタンパク質）タンパク質がそこに含まれる。
上記の方法によって調製されたエキソソームは、その原形質膜上のエキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(第1の融合タンパク質)、及び第1の光特異的結合タンパク質に結合することができる第2の光特異的結合タンパク質とカーゴタンパク質で構成される別の融合タンパク質(第2の融合タンパク質)を含む。したがって、そのようなエキソソームを標的組織細胞に処理する場合、エキソソームに含まれる第2の融合タンパク質は、原形質膜の融合を介して標的組織細胞のサイトゾルに送達され得る。
カーゴタンパク質を含む前記エキソソームは、in vivoでの様々な疾患の治療に使用することができる。例えば、カーゴタンパク質として抗癌活性を示すタンパク質ポリマー(例えば、抗体など)を含むエキソソームを調製し、次いで、これを癌細胞に処理する。すなわち、エキソソームを従来のリポソームよりも良く作用する生体適合性抗癌剤として使用することができる。
本発明はまた、NF-κB阻害タンパク質を有するエキソソームを含む、炎症性疾患の予防と治療のための医薬成分を提供する。
前述の炎症性疾患は、限定されないが、好ましくはアレルギー、皮膚炎、アトピー、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉頭炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、狼瘡、線維筋痛、乾癬性関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、腱周囲炎、筋炎、肝炎、膀胱炎、腎炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、急性および慢性炎症性疾患、敗血症及び潰瘍性大腸炎などにより例示される。
本発明の実験的実施例では、本発明者らは、TNF-αにより媒介される炎症抑制効果を確認するために、TNF-αにより活性化されたNF-κBの核への移行が、スーパーリプレッサーIκB:EXPLORをHela細胞に前処理することにより阻害されることを確認した（図４３左側）。その上、TNF-αにより活性化されたNF-κBのDNA結合の阻害が確認された（図４３右側）。また、本発明者らは、炎症抑制効果を確認するために、後眼窩に3回注入することによりコラーゲンによって関節炎を誘発されたマウスモデルにおいて、関節炎の症状が減少すること確認した。したがって本発明のスーパーリプレッサーIκB:EXPLORは炎症性疾患の予防及び治療のための医薬成分として使用され得る。
本発明はまた、Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）を有するエキソソームを含む、癌の予防と治療のための医薬成分を提供する。
前述の癌は、限定されないが、好ましくは乳癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部癌、皮膚又は脈絡膜メラノーマ、眼癌、腹膜癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門癌及び子宮頸癌などにより例示される。
本発明における実験的実施例では、本発明者らは、Bax::EXPLORをHela細胞に前処理することによりシトクロムc放出が増加することを確認した。したがって、Bax:EXPLORは癌の予防と治療のための医薬成分として使用され得る。
本発明はまた、ペルオキシレドキシン（Prx）I又はIIを有するエキソソームを含む、抗酸化のための医薬成分を提供する。
また、本発明は、ペルオキシレドキシン（Prx）I又はIIを有するエキソソームを含む、癌、動脈硬化症、呼吸器疾患、骨粗鬆症、肥満及び変性認知症によって例示される活性酸素種疾患の予防と治療のための医薬成分を提供する。
また、本発明は、ペルオキシレドキシン（Prx）I又はIIを有するエキソソームを含む、抗酸化のための化粧品成分を提供する。
また、本発明は、ペルオキシレドキシン（Prx）I又はIIを有するエキソソームを含む、皮膚のアンチエイジングのための化粧品成分を提供する。
本発明の実験的実施例では、本発明者らは、H2O2により誘発される酸化ストレスによる細胞毒性に対する抑制効果を確認するために、Prx I/II::EXPLORをHela細胞に前処理することにより酸化ストレスによる細胞毒性が統計学的に有意に阻害されることを確認した。したがって、Prx I/II::EXPLORは、抗酸化若しくは活性酸素種の予防及び治療のための医薬成分、又は抗酸化若しくは皮膚のアンチエイジングのための化粧品成分として使用され得る。
本発明はまた、Creリコンビナーゼを有するエキソソームを含む、標的遺伝子のコンディショナルノックアウトアリルを生成するための成分を提供する。
本発明の実験的実施例では、本発明者らは、Creリコンビナーゼの効果を確認するために、pCAG-loxP-STOP-loxP-ZsGreenをコードするDNAをHT1080及びHela細胞に遺伝子導入した後にZsGreenレポータータンパク質の発現を検出することにより、Cre::EXPLORを処理したHT1080細胞及びHeLa細胞においてZsGreenレポータータンパク質の発現を確認し、これは陽性対照としてpCMV-Creベクターを遺伝子導入したものと同じ結果だった（図１９ａ及び１９ｂ）。その上、本発明者らは、前述したものと同じ実験により、Cre::EXPORを処理した初代マウス胎児神経細胞でZsGreenの発現を確認することができた（図２０）。また、本発明者らは、Cre-EXPLORの機能をin vivoで確認するために、pCAG-lowP-STOP-loxP-eNpHR3.0-EYFP遺伝子導入マウスへのCre::EXPLORの腹外側注入の後に、Cre::EXPLOR処理した群でEYFPが発現されることを確認した（図２１）。さらに、Cre::EXPLORの標的細胞を確認するために、Cre::EXPLORは、免疫組織化学の結果におけるマージした神経細胞領域を通じて、マウス脳において主に神経細胞を標的にすることが確認された（図２２）。したがって、Cre::EXPLORは、標的遺伝子のコンディショナルノックアウトアリルを生成するための成分として使用され得る。
本発明はまた、Cas9タンパク質及び標的DNAに特異的なガイドRNA（gRNA）を有するエキソソームを含む、DNA配列を操作するための成分を提供する。
前述した成分は、限定されないが、好ましくは正常な配列上に変異を導入するか又は変異を校正する。変異は天然に発生した変異であってもよいし、病原微生物によって誘発されてもよい。言い換えれば、病原性微生物が検出され、生物学的試料が感染したことが明らかになる場合には、変異は病原性微生物の感染により発生する。病原性微生物は、限定されないが、ウイルス又は細菌であってもよい。
本発明における実験的実施例では、本発明者らは、CRISPR/Cas9タンパク質を含むエキソソームが高収率で調製され得ることを確認した。
本発明はまた、β-グルコセレブロシダーゼ（GBA）を有するエキソソームを含む、ゴーシェ病を治癒するための医薬成分を提供する。
本発明における実験的実施例では、本発明者らは、β-グルコセレブロシダーゼ（GBA）の活性は、ゴーシェ病患者由来の細胞にGBA:EXPLORを処理することにより回復することを確認した（図３０）。したがって、GBA::EXPLORは、ゴーシェ病を治療するための医薬成分として使用され得る。
本発明のカーゴタンパク質を含有するエキソソームを調製する方法によれば、カーゴタンパク質を含むエキソソームは高収率で調製され得る。また、カーゴタンパク質はエキソソームの膜から分離されてもたらされるため、疾患を治療するために幅広く適用され得る。
発明の形態
本発明の実際的且つ現在において好ましい実施形態は、以下の実施例において示されるように説明される。しかし、当業者は、この開示を考慮して、本発明の精神と範囲の中で改変及び改善を成し得ることが理解される。
[実施例１]
エキソソームの調製
<1-1>エキソソームの生成のためのCIBNとCRY2の結合の確認
CIBN-EGFP-CD9遺伝子を含むPcDNA3.1(+)ベクター及びmCherry-CRY2遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを、光がない条件下で、エキソソーム生成細胞であるHEK293T細胞に導入し、続いて24時間培養した。培地を無血清培地と交換し、続いて、さらに48時間培養した。培養が完了すると、460〜490nmの波長の青色光で細胞を照射した。共焦点顕微鏡を使用することによって、青色光照射の前後にmCherryで示される赤色蛍光の位置を確認した(図７)。
図７は、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子を導入した形質転換HEK293T細胞における、青色光照射によるmCherryタンパク質の細胞内位置の変化を示す蛍光画像である。図７に示すように、光特異的結合タンパク質のCIBNとCRY2の結合を引き起こすことができる青色光を照射する前は、mCherryタンパク質はサイトゾル中に均等に分布していた。しかし、青色光を照射した後は、mCherryタンパク質は膜に集中した。mCherryタンパク質のこのクラスター形成は光特異的結合タンパク質であるCIBNとCRY2の結合によって引き起こされると分析された。
<1-2>エキソソームの生成のためのGIGANTEAとFKF1の結合の確認
GIGANTEA-EGFP-CD9遺伝子を含むPcDNA3.1(+)ベクター及びmCherry-FKF1LOV遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを本実施例で使用した。細胞内のエキソソームを実施例<1-1>に記載されているものと同じ方法で確認した。(上記のFKF1LOV中のLOVは、FKF1タンパク質中の、光によって他のタンパク質に結合するドメインを示す、光-酸素-電圧ドメインの省略形であり、したがって、本明細書では、FKF1とFKF1LOVは実際同じである)。
実施例<1-1>と同様に、図１２に示すように、光特異的結合タンパク質のGIGANTEAとFKF1の結合を引き起こすことができる青色光を照射する前は、mCherryタンパク質はサイトゾル中に均等に分布していた。しかし、青色光を照射した後は、mCherryタンパク質は膜に集中した。mCherryタンパク質のこのクラスター形成は、光特異的結合タンパク質であるGIGANTEAとFKF1の結合によって引き起こされると分析された。
[実施例２]
エキソソーム生成及びエキソソーム生成への光強度の効果
CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子をそれぞれ含む各発現ベクターを、0、5、20、50及び200μWの強度で、460nmの波長のLED光下でHEK293T細胞に導入し、続いて、24時間培養した。次いで、培地を無血清培地と交換し、続いて、さらに48時間培養した。培養が完了すると、培養培地を分離し、これを遠心分離(3000×g、15分)して、細胞デブリを除いた上清を得た。ExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を上清の5倍量で得られた上清に加えた。混合した後、遠心分離(1500×g、30分)を行って、沈殿したエキソソームを得た。得られたエキソソームをPBSに懸濁し、エキソソームの懸濁液を得た。27-Gのニードルを備えたシリンジを使用して、このエキソソームの懸濁液を0.2μmのフィルターで濾過した。その結果、単一サイズのエキソソームを得た(図８)。次いで、溶解緩衝液を使用してエキソソームの溶解液を調製し、続いて免疫ブロッティングを行って、エキソソーム中のmCherryタンパク質の量を比較した(図９)。
図９は、青色光の強度に応じてエキソソームに捕捉されたカーゴタンパク質(mCherryタンパク質)含量の変化の測定結果を示す免疫ブロット分析の画像である。図９に示すように、20〜50μWの強度の青色光で細胞を照射した場合、カーゴタンパク質であるmCherryのエキソソーム中の量が最も高かった。上記の結果から、光特異的結合タンパク質の結合の過程で、細胞に照射する光の強度を制御することによって、エキソソームに捕捉されるカーゴタンパク質の含量を調節できることが確認された。
[実施例３]
エキソソーム処理の効果
CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子をそれぞれ含む各発現ベクターを50μWの強度で、460nmの波長のLED光下でHEK293T細胞に導入し、続いて、実施例２に記載されているものと同じ方法でエキソソームを抽出した。抽出したエキソソームを250μg/mlの濃度でHT1080細胞に24時間処理した。4%PFA及び0.01%GAを含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)を加えることによって、HT1080細胞を10%ゼラチンゲル上に固定した。液体窒素を使用することによって、ゼラチンゲル上に付着した細胞を1日冷却した。クライオウルトラミクロトームを使用することによって45nmにカットした薄切片を-120℃で得た。抗mCherry抗体及びプロテインA-金を使用することによって、この薄切片を免疫染色した。Tecnai G2 Spirit Twin TEMでmCherryタンパク質を観察した(図１０)。
図１０は、カーゴタンパク質(mCherry)を含むエキソソームで標的細胞(HT1080)を処理した後の標的細胞へのカーゴタンパク質の導入に関する調査結果を示す電子顕微鏡写真であり、左側はエキソソームで処理していない標的細胞を示し、右側はエキソソームで処理した標的細胞を示す。図１０に示すように、本発明のエキソソームで標的細胞を処理した場合に、カーゴタンパク質が標的細胞中に移行することが確認された。
[実施例４]
カーゴタンパク質を含むエキソソームの分析
CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmCherry-CRY2遺伝子をそれぞれ含む各発現ベクターを、50μWの強度で、460nmの波長のLED光下でHEK293T細胞に導入し、続いて、実施例２に記載されているものと同じ方法でエキソソームを抽出した。抽出したエキソソームを250μg/mlの濃度でHT1080細胞に24時間処理した。次いで、mCherryタンパク質の赤色蛍光を蛍光顕微鏡下で確認し、LDH細胞死アッセイによって、エキソソームで処理した細胞とエキソソームで処理していない細胞の間で死細胞の比を比較した(図１１)。
図１１は、(a)カーゴタンパク質(mCherry)を含むエキソソームで標的細胞(HT1080)を処理した後の標的細胞へのカーゴタンパク質の導入に関する調査結果を示す一連の蛍光画像、及び(b)エキソソーム処理によって誘導されるアポトーシス細胞の比の比較結果を示すグラフである。図１１に示すように、アポトーシスがエキソソーム処理によって誘導されなかったことが確認された。
[実施例５]
エキソソーム生成及び生成されたエキソソームへのカーゴタンパク質の導入効率の比較
<5-1>エキソソーム生成効率の確認
エキソソーム生成及び本発明によって生成されたエキソソームへのカーゴタンパク質の導入効率を従来の方法のものと比較するために、エキソソーム生成細胞におけるカーゴタンパク質の発現を、その中のルシフェラーゼ活性を測定することによって調べた。
従来の方法に従って、エキソソームローディング技法(XP)用に設計された市販のベクターであるXPACK(Systems Biosciences)を使用することによって、XPACK-ルシフェラーゼ-mCherryをHEK293T細胞に導入した。一方で、本発明の方法に従って、ルシフェラーゼ-mCherry-CRY2及びCIBN-EGFP-CD9をHEK293T細胞に導入した(EXPLOR)。次いで、両細胞のルシフェラーゼ活性を測定して、2つの方法の効率を比較した。ルシフェラーゼ活性は、製造者の指示書(ルシフェラーゼアッセイ試薬、Promega)に従って測定した。結果の検量線をプロットし、次いで、細胞中のエキソソームの数を定量的に算出した。
図１４に示すように、本発明の光特異的結合タンパク質CIBN及びCRY2を使用する方法は、従来の方法(XP)よりもエキソソームへの導入効率が有意に高かったことが確認された(図１４)。
<5-2>生成されたエキソソームにおけるカーゴタンパク質の発現
実施例<5-1>の細胞を72時間培養し、続いて、エキソソームを抽出した(ExoQuick-TC、Systems Biosciences)。従来の方法(XP)又は本発明の方法によって分離したエキソソームに含まれるカーゴタンパク質の濃度をその中のルシフェラーゼ活性を測定することによって間接的に比較した。図１５に示すように、本発明の方法は従来の方法よりも著しく大量のカーゴタンパク質を含むエキソソームを生成できたことが確認された(図１５)。
<5-3>カーゴタンパク質の導入効率の比較
カーゴタンパク質の導入効率(E)を、実施例<5-1>及び<5-2>で測定したルシフェラーゼ活性に基づいて、以下の数式によって計算した。
[数式1]
E=生成されたエキソソーム中のルシフェラーゼ活性の測定値/エキソソーム生成細胞中のルシフェラーゼ活性の測定値
図１５に示すように、本発明のCRY2とCIBNの結合を使用して生成されたエキソソームは、他の比較群のものよりも4〜120倍高い効率を示したことが確認された(図１５)。
[実施例６]
標的細胞へのエキソソームの移行効率の比較
エキソソームの移行効率を比較するために、カーゴタンパク質を含むエキソソームで標的細胞を処理した。特に、HeLa細胞を5×109個のエキソソームで24時間処理し、次いで、細胞で発現する蛍光強度を測定した。図１６に示すように、本発明のエキソソーム(EXPLOR)中の蛍光強度が著しく高かったことが確認された(図１６)。
したがって、本発明のエキソソームを使用する方法は標的細胞にカーゴタンパク質をより効率的に送達できたことが確認された。
実験的実施例
[実験的実施例１]
MMP（マトリックスメタロプロテイナーゼ）
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びMMP-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにMMPのエキソソーム内へのローディングが評価される。
MMPをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びMMP-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（Tangential Flow Filtration）（TFF）法により単離され精製される。
MMPをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な酵素活性を評価するために、MMPをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、MMPをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例２]
TIMP（メタロプロテイナーゼ組織阻害因子）
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びTIMP-mCherry-CRY2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにTIMPのエキソソーム内へのローディングが評価される。
TIMPをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びTIMP-mCherry-Cry2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
TIMPをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な酵素活性を評価するために、TIMPをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、TIMPをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例３]
カスパーゼ
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びカスパーゼ-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにカスパーゼのエキソソーム内へのローディングが評価される。
カスパーゼをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びカスパーゼ-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
カスパーゼをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な酵素活性を評価するために、カスパーゼをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、カスパーゼをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例４]
カテプシン
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びカテプシン-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにカテプシンのエキソソーム内へのローディングが評価される。
カテプシンをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びカテプシン-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
カテプシンをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な酵素活性を示すために、カテプシンをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、カテプシンをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例５]
Creリコンビナーゼ
<5-1> Creリコンビナーゼをロードしたエキソソーム（Cre::EXPLOR）の生成
A.エキソソームにおけるCreリコンビナーゼの確認
本発明者は、配列番号９として記録されるアミノ酸を有するCreリコンビナーゼのエキソソームへのローディングを確認するために、CIBN-EGFP-CD9及びCre-mCherry-Cry2を発現する細胞においてCIBN及びCRY2の結合を確認した。特に、HEK293Tエキソソーム生成細胞を、光がない条件でCIBN-EGFP-CD9遺伝子及びCre-mCherry-CRY2遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを遺伝子導入して24時間培養後、ウシ胎児血清（FBS）を含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で追加で48時間培養した。培養終了後、mCherry由来の赤色蛍光の位置を、488nm波長青色光の照射前後で共焦点顕微鏡により検証した。この実験は5回よりも多く行われた。
結果によれば、Cre-mCherry-CRY2（赤色）及びCIBN-EGFP-CD9の間の結合が確認された（図１８）。したがって、Creリコンビナーゼのエキソソームへのローディングが確認された。
B. Creリコンビナーゼをロードしたエキソソーム（Cre::EXPLOR）の生成
本発明者らは、Creリコンビナーゼをロードしたエキソソームを産生するために以下の実験を行った。
特に、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びCre-mCherry-CRY2遺伝子を含むベクターが、HEK293Tエキソソーム生成細胞に遺伝子導入され、これらの細胞は24時間培養された。24時間培養後、細胞は、その培地をウシ胎児血清（FBS）を含まないものに交換し、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、追加で48時間培養された。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。上清に5倍多い量のExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を加えて、4℃にて18時間混合した。懸濁されたエキソソームは、前述の上清とExoQuick-TCの混合物の遠心分離（1500×g、30分）によってエキソソームのペレットを懸濁することにより得られた（図８）。
その上、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びCre-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現するHEK293Tエキソソーム生成細胞は、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、48〜72時間、ウシ胎児血清を含まない培地で培養された。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。200nmより大きな粒子を上清から除くために、それを0.2μlのPES膜（Corning）により濾過した。接線方向流濾過（TFF）法が同じ上清に適用され、20nmより小さな粒子を除去し、濾液に由来するエキソソームを濃縮し精製した。Vivaflow 50-100 kDa PES memebrane（Sartorius）がTFFにおいて使用された。エキソソームは、1.5〜2大気圧のTFFのもと、濾液の回転により濃縮され精製された。次に、エキソソーム濃縮物から、Amicon Ultra-0.5（100kDa）（Millipore）フィルターでの遠心分離（10000〜14000 g、5分）により液体を除去した。最後に、エキソソームは、実験上の目的に好ましい緩衝液を用いて、逆方向遠心分離（10000〜14000 g、5分）により得られた。
<5-2> Creリコンビナーゼをロードしたエキソソーム（Cre::EXPLOR）によるCreリコンビナーゼ機能の確認
A. HT1080及びHeLa細胞でのCre::EXPLORの機能的な確認
CreリコンビナーゼはloxP領域でDNAを組換える機能を有する。本発明者らはCre::EXPLORの機能を検証するために以下の実験を行った。
特に、pCAG-loxP-STOP-loxP-ZsGreenをコードするDNAをHT1080及びHeLa細胞に遺伝子導入し、6時間後洗浄した。次に、0.25 mg/mlのCre::EXPLOR若しくはNegative::EXPLORで処理するか、又はpCMV-Creベクターを遺伝子導入した。48時間培養後、緑色蛍光を有するZsGreenの発現を検証した。ZsGreenの発現は、Cre::EXPLORで処理されたHT1080及びHeLa細胞で確認され、Negative::EXPLORで処理されたHT1080及びHeLa細胞とは異なっており、陽性対照のpCMV-Creベクター遺伝子導入の結果に類似していた（図１９ａ及び１９ｂ）。
B.初代ラット胎児神経細胞でのCre::EXPLORの機能の確認
以下の実験は、初代ラット胎児神経細胞でCre::EXPLORの機能を検証するために行われた。
特に、pCAG-loxP-STOP-loxP-ZsGreenをコードするDNAを初代ラット胎児神経細胞に遺伝子導入し、6時間後に洗浄した。次にこれらを0.15 mg/mlのCre::EXPLORのもと培養した。48時間の培養後、緑色蛍光を有するZsGreenの発現を検証した。この実験は少なくとも3回繰り返して行われ、それによって、ZsGreenの発現がCre::EXPLORで処理された初代ラット胎児神経細胞で確認された（図２０）。
C. in vivo遺伝子導入マウスでのCre::EXPLORの機能の確認
本発明者らは、Cre::EXPLORの機能をin vivoで確認するために以下の実験を行った。
特に、50μlのCre:EXPLOR（10 mg/mL）が、腹外側注入により、pCAG-loxP-STOP-loxP-eNpHR3.0-EYFP遺伝子導入マウスに注入された。注入後、4%ホルムアルデヒドにより固定された脳スライスから蛍光顕微鏡により画像化した。緑色蛍光はeNpHR3.0-EYFPの発現を示し、青色蛍光は細胞核を示す。Cre::EXPLORで処理されたマウスの不確帯（ZI）の神経細胞でのeNpHR3.0-EYFP発現が共焦点顕微鏡で検証され、それによって、EYFPの発現がpCAG-loxP-STOP-loxP-eNpHR3.0-EYFP遺伝子導入マウスのCre::EXPLORで処理された群で確認された（図２１）。
D.遺伝子導入マウスでのCre::EXPLOR標的細胞の確認
前述のin vivo実験におけるCre::EXPLORの特異的細胞ターゲッティングを確認するために、免疫組織化学を行った。NeuN抗体は神経細胞を特異的に染め、GFAP抗体はアストロサイトを特異的に染め、それによって、マージした領域が主に神経細胞であることを検証することにより、Cre::EXPLORがマウス脳において神経細胞を特異的に標的とすることを確認した（図２２）。
[実験的実施例６]
CRISPR-Cas9
<6-1> Cas9をロードしたエキソソーム（Cas9::EXPLOR）の生成
A.エキソソーム内のCas9の確認
本発明者らは、配列番号１０のアミノ酸に記録されるCas9のローディングを確認するために、CIBN-EGFP-CD9及びCas9-mCherry-CRY2を発現しCIBNとCRY2の結合を検証した。
図２３に記載されるように、Cas9-mCherry-CRY2を挿入されたpcDNA3.1(+)ベクターは11,890塩基対の長さを有し、3つのタンパク質部分は、NLS配列を5-端に有するCas9、mCherry及びクリプトクロム2からなり、それぞれ45及び27塩基対のリンカー配列を有する。各タンパク質部分は、それぞれ4194,699及び1497塩基対の長さを有する。
特に、HEK293Tエキソソーム生成細胞を、光がない条件でCIBN-EGFP-CD9遺伝子及びCas9-mCherry-CRY2遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを遺伝子導入して24時間培養後、ウシ胎児血清（FBS）を含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で追加で48時間培養した。培養終了後、mCherry由来の赤色蛍光の位置を、488nm波長青色光の照射前後で共焦点顕微鏡により検証した。この実験は5回よりも多く行われ、それによって、CIBN-EGFP-CD9が青色光刺激によりCas9-mCherry-CRY2に結合することを確認することにより、Cas9タンパク質がエキソソーム内にロードされる（図２３）。
B. Cas9をロードしたエキソソーム（Cas9::EXPLOR）の生成
本発明者らは、Cas9をロードしたエキソソームを産生するために以下の実験を行った。
特に、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びCas9-mCherry-CRY2遺伝子を含むベクターを、HEK293Tエキソソーム生成細胞に遺伝子導入し、これらの細胞は24時間培養された。24時間培養後、細胞は、その培地をウシ胎児血清（FBS）を含まないものに交換し、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、追加で48時間培養された。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。上清に5倍多い量のExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を加えて、4℃にて18時間混合した。懸濁されたエキソソームは、前述の上清とExoQuick-TCの混合物の遠心分離（1500×g、30分）によりエキソソームのペレットを懸濁することにより得られた（図８）。
その上、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びCas9-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現するHEK293Tエキソソーム生成細胞は、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、48〜72時間、ウシ胎児血清を含まない培地で培養された。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。200nmより大きな粒子を上清から除くために、それは0.2μlのPES膜（Corning）により濾過された。接線方向流濾過（TFF）法が同じ上清に適用され、20nmより小さな粒子を除去し、濾液に由来するエキソソームを濃縮し精製した。Vivaflow 50-100 kDa PES memebrane（Sartorius）がTFFにおいて使用された。エキソソームは、1.5〜2大気圧のTFFのもと、濾液の回転により濃縮され精製された。次に、エキソソーム濃縮物から、Amicon Ultra-0.5（100kDa）（Millipore）フィルターでの遠心分離（10000〜14000 g、5分）により液体を除去した。最後に、エキソソームは、実験上の目的に好ましい緩衝液を用いて、逆方向遠心分離（10000〜14000 g、5分）により得られた。エキソソーム内へのCas9のローディングが評価された（図２５）。
Cas9をロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行う。
機能的な活性を示すために、Cas9をロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、Cas9をロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例７]
カスパーゼ活性化DNase（CAD）
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びCAD-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにCADのエキソソーム内へのローディングが評価される。
CADをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びCAD -mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
CADをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行う。
機能的活性を示すために、CADをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、CADをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例８]
β-グルコセレブロシダーゼ
<8-1> GBAをロードしたエキソソーム（GBA::EXPLOR）の生成
A.エキソソーム内のGBAの確認
本発明者らは、配列番号１２のアミノ酸に記録されるGBAのローディングを確認するために、CIBN-EGFP-CD9及びGBA-mCherry-CRY2を発現しCIBNとCRY2の結合を検証した。
特に、HEK293Tエキソソーム生成細胞を、光がない条件でCIBN-EGFP-CD9遺伝子及びGBA-mCherry-CRY2遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを遺伝子導入して24時間培養後、ウシ胎児血清（FBS）を含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で追加で48時間培養した。培養終了後、mCherry由来の赤色蛍光の位置を、488nm波長青色光の照射前後で共焦点顕微鏡により検証した。この実験は5回よりも多く行われ、それによって、CIBN-EGFP-CD9が青色光刺激によりGBA-mCherry-CRY2に結合することを確認することによって、GBAタンパク質がエキソソーム内にロードされる（図２６）。
B. GBAをロードしたエキソソーム（GBA::EXPLOR）の生成
本発明者らは、GBAをロードしたエキソソームを産生するために以下の実験を行った。
具体的には、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びGBA-mCherry-CRY2遺伝子を含むベクターを、HEK293Tエキソソーム生成細胞に遺伝子導入し、これらの細胞を24時間培養した。24時間培養後、細胞は、その培地をウシ胎児血清（FBS）を含まないものに交換し、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、追加で48時間培養した。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。上清に5倍多い量のExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を加えて、4℃にて18時間混合した。懸濁されたエキソソームは、前述の上清とExoQuick-TCの混合物の遠心分離（1500×g、30分）によりエキソソームのペレットを懸濁することにより得られた（図８）。
その上、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びGBA-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現するHEK293Tエキソソーム生成細胞を、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、48〜72時間、ウシ胎児血清を含まない培地で培養した。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。200nmより大きな粒子を上清から除くために、それを0.2μlのPES膜（Corning）により濾過した。接線方向流濾過（TFF）法が同じ上清に適用され、20nmより小さな粒子を除去し、濾液に由来するエキソソームを濃縮し精製した。Vivaflow 50-100 kDa PES memebrane（Sartorius）がTFFにおいて使用された。エキソソームは、1.5〜2大気圧のTFFのもと、濾液の回転により濃縮され精製された。次に、エキソソーム濃縮物から、Amicon Ultra-0.5（100kDa）（Millipore）フィルターでの遠心分離（10000〜14000 g、5分）により液体を除去した。最後に、エキソソームは、実験上の目的に好ましい緩衝液を用いて、逆方向遠心分離（10000〜14000 g、5分）により得られた。
<8-2> GBAをロードしたエキソソームの生成細胞におけるGBA発現の測定
本発明者らは、GBAをロードしたエキソソームにおけるGBA発現を測定するためにウェスタンブロットを行った。
特に、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びGBA-mCherry-CRY2遺伝子を含むベクターを、HEK293Tエキソソーム生成細胞に遺伝子導入し、これらの細胞を24時間培養した。HEK293T細胞をMPER（哺乳類タンパク質抽出試薬）を使用して溶解し、タンパク質をウェスタンブロットにより分析した。ラット初代アストロサイト、ヒト初代アストロサイト、及びGBA遺伝子異常によりβ-グルコセレブロシダーゼが欠損しているゴーシェ病患者由来繊維芽細胞が、ウェスタンブロットを行うために溶解され、タンパク質をウェスタンブロットにより分析した。
その結果、内在性GBAは、ゴーシェ病患者由来繊維芽細胞を除き、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びGBA-mCherry-CRY2遺伝子を含むHEK293T細胞、ラット初代アストロサイト、ヒト初代アストロサイトにおいて観察された（図２７）。
その上、GBA-mCherry-CRY2融合タンパク質（151 kDa）が、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びGBA-mCherry-CRY2遺伝子を含むHEK293T細胞において観察され、これは、GBA-mCherry-CRY2融合タンパク質が、GBAをロードしたエキソソーム生成細胞においてよく発現していることを提示する（図２８）。
<8-3> GBAをロードしたエキソソーム（GBA::EXPLOR）によるゴーシェ病患者由来細胞でのGBA活性の確認
A.エキソソーム内でのGBAの酵素活性
本発明者は、エキソソーム内でのGBAのグルコセレブロシド分解活性を検証するためにβ-グルコセレブロシダーゼ酵素活性に関する実験を行った。
特に、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びGBA-mCherry-CRY2遺伝子を含むベクターを、HEK293Tエキソソーム生成細胞に遺伝子導入し、これらの細胞を24時間培養した。24時間培養後、細胞は、その培地をウシ胎児血清（FBS）を含まないものに交換し、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、追加で48時間培養した。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。上清に5倍多い量のExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を加えて、4℃にて18時間混合した。懸濁されたエキソソームは、前述の上清とExoQuick-TCの混合物の遠心分離（1500×g、30分）によりエキソソームのペレットを懸濁することにより得られた。
その上、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びGBA-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現するHEK293Tエキソソーム生成細胞を、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、48〜72時間、ウシ胎児血清を含まない培地で培養した。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。200nmより大きな粒子を上清から除くために、それは0.2μlのPES膜（Corning）により濾過された。接線方向流濾過（TFF）法が同じ上清に適用され、20nmより小さな粒子を除去し、濾液に由来するエキソソームを濃縮し精製した。Vivaflow 50-100 kDa PES memebrane（Sartorius）がTFFにおいて使用された。エキソソームは、1.5〜2大気圧のTFFのもと、濾液の回転により濃縮され精製された。次に、エキソソーム濃縮物から、Amicon Ultra-0.5（100kDa）（Millipore）フィルターでの遠心分離（10000〜14000 g、5分）により液体を除去した。最後に、エキソソームは、逆方向遠心分離（10000〜14000 g、5分）により得られた。エキソソームはMPER（哺乳類タンパク質抽出試薬）を使用して溶解し、タンパク質を分析した。
mCherryをロードしたエキソソームに比べて、GBAをロードしたGBA::EXPLORのβ-グルコセレブロシダーゼ酵素活性の増加が観察された。したがって、活性を有するGBAのエキソソームへのローディングが確認された（図２９）。
B.ゴーシェ病患者由来細胞でのβ-グルコセレブロシダーゼ（GBA）の酵素活性
本発明者らは、GBA::EXPLORで処理した場合に、ゴーシェ病患者由来細胞でβ-グルコセレブロシダーゼ酵素活性が回復することを確認するために、以下の実験を行った。
ゴーシェ病患者由来繊維芽細胞は60mmディッシュで2×105の密度で培養された。次に、mCherry::EXPLOR（2×109エキソソーム）又はGBA::EXPLOR（1.2×1010エキソソーム）で、無血清DMEM培地で培養されたゴーシェ病患者由来繊維芽細胞を処理した。GBA-mCh-CRY2の加水分解活性は、基質4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルコピラノシド（4-MUG;シグマ）を使用して蛍光を検出することにより測定された。酵素反応は、50 ulの0.15%（v/v）Triton X-100（シグマ）の細胞溶解液、0.8%（w/v）タウロコール酸ナトリウム（シグマ）、10mM 4-MUGを含む0.2mlの0.2Mクエン酸リン酸緩衝液（pH 0.5）で行われた。37℃で1時間インキュベーションした後、酵素活性は、100ulの0.1Mグリシン、0.1M NaOH（pH10.3）を使用して停止された。酵素反応産物である4-メチルウンベリフェロン（4-MU）は365nm励起、460nm発光の条件で測定された。
その結果、GBAをロードしたGBA::EXPLORで処理されたゴーシェ病患者由来細胞のβ-グルコセレブロシダーゼ酵素活性は回復した（図３０）。
[実験的実施例９]
マイトジェン活性化キナーゼ：p38 MAPキナーゼ
本発明者らは、488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びp38 MAPキナーゼ-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合を確認し、エキソソーム内へのp38 MAPキナーゼのローディングを確認する。
p38 MAPキナーゼをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びp38 MAPキナーゼ-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
p38 MAPキナーゼをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
p38 MAPキナーゼをロードしたエキソソームの標的細胞への処理により、機能的活性が示される。
p38 MAPキナーゼをロードしたエキソソームのi.p.又はi.v.による動物モデルへの投与によって、治療効果が示される。
[実験的実施例１０]
阻害因子カッパBキナーゼ（IKK）
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びIKK-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにIKKのエキソソーム内へのローディングが評価される。
IKKをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びIKK-mCherry-Cry2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
IKKキナーゼをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な活性を示すために、IKKをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、IKKをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例１１]
PTENホスファターゼ
本発明者らは、488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びPTEN-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにPTENのエキソソーム内へのローディングを確認した。
PTENをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びPTEN-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され（図３１）、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製された。
PTENキナーゼをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
PTENをロードしたエキソソームを標的細胞に処理することにより、機能的な活性が示される。
PTENをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与することによって、治療効果が示される。
[実験的実施例１２]
ヤヌスキナーゼ（JNK）
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びJNK-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにJNKのエキソソーム内へのローディングが評価される。
JNKをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びJNK-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
JNKをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な活性を示すために、JNKをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、JNKをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例１３]
ユビキチンリガーゼ
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びユビキチンリガーゼ-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにユビキチンリガーゼのエキソソーム内へのローディングが評価される。
ユビキチンリガーゼをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びユビキチンリガーゼ-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
ユビキチンリガーゼをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な活性を示すために、ユビキチンリガーゼをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、ユビキチンリガーゼをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例１４]
ルシフェラーゼ
本発明者らは、488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びルシフェラーゼ-mcherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにルシフェラーゼのエキソソーム内へのローディングを確認した（図３２）。
ルシフェラーゼをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びルシフェラーゼ-mcherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製された。
ルシフェラーゼ分子数に基づく定量的ルシフェラーゼ活性が分析された（図３３）。
[実験的実施例１５]
ペルオキシレドキシン
<15-1> Prx I又はPrx IIをロードしたエキソソーム（Prx I/II:EXPLOR）の生成
A.エキソソーム内のPrxI/IIの確認
本発明者らは、配列番号７又は８のアミノ酸に記録されるPrx I又はPrx IIのローディングを確認するためにCIBN-EGFP-CD9及びPrx I/II-mCherry-CRY2を発現しCIBNとCRY2の結合を検証した。
特に、HEK293Tエキソソーム生成細胞を、光がない条件でCIBN-EGFP-CD9遺伝子及びPrx I/II-mCherry-CRY2遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを遺伝子導入して24時間培養後、ウシ胎児血清（FBS）を含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で追加で48時間培養した。培養終了後、mCherry由来の赤色蛍光の位置を、488nm波長青色光の照射前後で共焦点顕微鏡により検証した。この実験は5回よりも多く行われ、それによって、青色光刺激によるPrx I/IIタンパク質の凝集が確認された（図３４）。したがって、Prx I/II-mCherry-CRY2（赤色）とCIBN-EGFP-CD9（緑色）の共局在（黄色）を確認することにより、Prx I/IIタンパク質はエキソソームにロードされた。
B.Prx I/II::EXPLORの生成
本発明者らは、Prx I/IIをロードしたエキソソームを産生するために以下の実験を行った。
特に、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びPrx I/II-mCherry-CRY2遺伝子を含むベクターを、HEK293Tエキソソーム生成細胞に遺伝子導入し、これらの細胞を24時間培養した。24時間培養後、細胞は、その培地をウシ胎児血清（FBS）を含まないものに交換し、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、追加で48時間培養された。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。上清に5倍多い量のExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を加えて、4℃にて18時間混合した。懸濁されたエキソソームは、前述の上清とExoQuick-TCの混合物の遠心分離（1500×g、30分）によりエキソソームのペレットを懸濁することにより得られた（図８）。
<15-2> Prx I/II::EXPLORによる酸化ストレス誘導性細胞毒性への阻害効果の確認
本発明者らは、Prx I/II::EXPLORによる酸化ストレス誘導性細胞毒性への阻害効果を確認するために以下の実験を行った。
特に、HeLa細胞の無血清培地を交換した後、100μg/mLのPrx I/II::EXPLORで処理して、18時間培養した。H2O2（0、0.5、1 mM）で処理し、追加で8時間培養した。細胞の生存率を分析するためにWSTアッセイを使用した。
Prx I/II::EXPLORの前処理により、酸化ストレス誘導性細胞毒性は有意に阻害された（図３５）。
[実験的実施例１６]
NF-κB
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びNF-κB-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにNF-κBのエキソソーム内へのローディングが評価される。
NF-κBをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びNF-κB-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
NF-κBをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な活性を示すために、NF-κBをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、NF-κBをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例１７]
MyoD
本発明者らは、488nm波長青色光のもとCIBN-EGFP-CD9及びMyoD-mcherry-Cry2を安定に発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合を確認したし（図３６）、またMyoDのエキソソーム内へのローディングを確認する。
MyoDをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びMyoD-mcherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製された。
MyoDをロードしたエキソソームの標的細胞への処理により、機能的活性が示された（図３７）。
[実験的実施例１８]
Tbx18（T-ボックス転写因子18）
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びTbx18-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにTbx18のエキソソーム内へのローディングが評価される。
Tbx18をロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びTbx18-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
Tbx18をロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な活性を示すために、Tbx18をロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、Tbx18をロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例１９]
p53
本発明者らは、488nm波長青色光のもとCIBN-EGFP-CD9及びp53-mcherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合（図３８）、及びPTENのエキソソーム内へのローディング（図３９）を確認した。
p53をロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びp53-mcherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製された。
p53をロードしたエキソソームの標的細胞への処理により、転写活性が示された（図４０）。
p53をロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与することによって、治療効果が示される。
[実験的実施例２０]
HMGB1
本発明者らは、488nm波長青色光のもとCIBN-EGFP-CD9及びHMGB1-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、及びHMGB1のエキソソーム内へのローディングを確認した（図４１）。
HMGB1をロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びHMGB1-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製された。
HMGB1をロードしたエキソソームの機能的解析を標的細胞で行う。
HMGB1をロードしたエキソソームの標的細胞への処理により転写活性が示される。
HMGB1をロードしたエキソソームのi.p.又はi.v.による動物モデルへの投与により、治療効果が示される。
[実験的実施例２１]
スーパーリプレッサーIκB
<21-1>スーパーリプレッサーIκBをロードしたエキソソーム（スーパーリプレッサーIκB:EXPLOR）の生成
A.エキソソームにおけるスーパーリプレッサーIκBの確認
本発明者らは、配列番号５のアミノ酸に記録されるスーパーリプレッサーIκBのローディングを確認するためにCIBN-EGFP-CD9及びスーパーリプレッサーIκB-mCherry-CRY2を発現しCIBNとCRY2の結合を検証した。
特に、HEK293Tエキソソーム生成細胞を、光がない条件でCIBN-EGFP-CD9遺伝子及びスーパーリプレッサーIκB-mCherry-CRY2遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを遺伝子導入して24時間培養後、ウシ胎児血清（FBS）を含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で追加で48時間培養した。培養終了後、mCherry由来の赤色蛍光の位置を、488nm波長青色光の照射前後で共焦点顕微鏡により検証した。この実験は5回よりも多く行われ、それによって、青色光刺激によるスーパーリプレッサーIκBタンパク質の凝集が確認された（図４２）。したがって、スーパーリプレッサーIκB-mCherry-CRY2（赤色）とCIBN-EGFP-CD9（緑色）の共局在（黄色）を確認することにより、スーパーリプレッサーIκBタンパク質はエキソソームにロードされた。
B.スーパーリプレッサーIκB::EXPLORの生成
本発明者らは、スーパーリプレッサーIκBをロードしたエキソソームを産生するために以下の実験を行った。
特に、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びスーパーリプレッサーIκB-mCherry-CRY2遺伝子を含むベクターを、HEK293Tエキソソーム生成細胞に遺伝子導入し、これらの細胞を24時間培養した。24時間培養後、細胞は、その培地をウシ胎児血清（FBS）を含まないものに交換し、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、追加で48時間培養された。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。上清に5倍多い量のExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を加えて、4℃にて18時間混合した。懸濁されたエキソソームは、前述の上清とExoQuick-TCの混合物の遠心分離（1500×g、30分）によりエキソソームのペレットを懸濁することにより得られた（図８）。
その上、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びスーパーリプレッサーIκB-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現するHEK293Tエキソソーム生成細胞は、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、48〜72時間、ウシ胎児血清を含まない培地で培養された。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。200nmより大きな粒子を上清から除くために、それを0.2μlのPES膜（Corning）により濾過した。接線方向流濾過（TFF）法が同じ上清に適用され、20nmより小さな粒子を除去し、濾液に由来するエキソソームを濃縮し精製した。Vivaflow 50-100 kDa PES memebrane（Sartorius）がTFFにおいて使用された。エキソソームは、1.5〜2大気圧のTFFのもと、濾液の回転により濃縮され精製された。次に、エキソソーム濃縮物から、Amicon Ultra-0.5（100kDa）（Millipore）フィルターでの遠心分離（10000〜14000 g、5分）により液体を除去した。最後に、エキソソームは、実験上の目的に好ましい緩衝液を用いて、逆方向遠心分離（10000〜14000 g、5分）により得られた。
<21-2>TNF-αを介したNF-κB活性の、スーパーリプレッサーIκB:EXPLORによる抑制効果の確認
本発明者らは、スーパーリプレッサーIκB:EXPLORを使用してTNF-αを介した抗炎症効果を確認するために以下の実験を行った。
特に、HeLaを100 mg/mLのmCherry:EXPLOR又はスーパーリプレッサーIκB-mCherry:EXPLORで処理した培養培地で3時間培養した。次にTNF-α（10ng/mL）を処理し、追加で30分間インキュベートした。４%パラホルムアルデヒドで固定後、NF-κB p65をAlexa Fluor 488コンジュゲート抗体で染色し、共焦点顕微鏡を使用して調べた。p65/c-Rel（NF-κB）の結合活性を測定するために、製造者のプロトコルに従って、TransAM NF-kB及びAP-1アッセイキット（ActiveMotif, Carlsbad, CA, USA）において核溶解液を使用した。データは平均±SEM（n=3）で提示され、Tukeyのpost hoc検定を使用して適用され、ANOVA検定により有意群（**、p < 0.01）を決定した。
スーパーリプレッサーIκB::EXPLORのHeLa細胞に対する前処理により、TNF-αにより活性化されるNF-κBの核への輸送及びNF-κBのDNA結合は阻害された（図４３）。
<21-3>コラーゲン誘導性関節炎動物モデルに対するスーパーリプレッサーIκB:EXPLORの抗炎症効果の確認
本発明者らは、コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルに対するスーパーリプレッサーIκB:EXPLORの抗炎症効果を確認するために以下の実験を行った。
特に、最も多く使用される関節リウマチモデルであるコラーゲン誘導性関節炎マウスモデルが、DBA/1の尾部皮下組織へウシII型コラーゲン及びアジュバントを注入することによる免疫化により作製された。スーパーリプレッサーIκB:EXPLORを、2日ごとに、2つのコラーゲン誘導性関節炎マウスモデルに対して、後眼窩に4回注入した。関節リウマチの症状の進行は、表３に記載される臨床スコアにより決定された。平均臨床スコアは、前述の表によるマウスの足に由来する臨床スコアの平均値である。
スーパーリプレッサーIκB:EXPLORをコラーゲン誘導性関節炎マウスモデルに対して後眼窩に注入した場合、関節リウマチマウスは症状の低下を示した（図４４）。
<21-4> LPS誘導性敗血症モデルに対するsrIkBをロードしたエキソソームの効果
その上、スーパーリプレッサーIκB:EXPLORをLPS誘導性敗血症マウスモデルに腹腔内注入した場合には、敗血症マウスは生存率の有意な増加を示した（図４５）。
[実験的実施例２２]
pySTAT3イントラボディ
本発明者らは、488nm波長青色光のもとCIBN-EGFP-CD9及びpySTAT3-mcherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、及びpySTAT3のエキソソーム内へのローディング（図４６）を確認した。
pySTAT3をロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びpySTAT3-mcherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製された。
pySTAT3をロードしたエキソソームの標的細胞への処理により、機能的活性が示される。
pySTAT3をロードしたエキソソームのi.p.又はi.v.による動物モデルへの投与によって、治療効果が示される。
[実験的実施例２３]
Bcl-2結合Xタンパク質
<23-1> Baxをロードしたエキソソーム（Bax::EXPLOR）の生成
A.エキソソームにおけるBaxの確認
本発明者らは、配列番号６のアミノ酸に記録されるBaxのローディングを確認するためにCIBN-EGFP-CD9及びBax-mCherry-CRY2を発現しCIBNとCRY2の結合を検証した。
特に、HEK293Tエキソソーム生成細胞を、光がない条件でCIBN-EGFP-CD9遺伝子及びBax-mCherry-CRY2遺伝子を含むpcDNA3.1(+)ベクターを遺伝子導入して24時間培養後、ウシ胎児血清（FBS）を含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で追加で48時間培養した。培養終了後、mCherry由来の赤色蛍光の位置を、488nm波長青色光の照射前後で共焦点顕微鏡により検証した。この実験は5回よりも多く行われ、それによって、青色光刺激によるBaxタンパク質の凝集が確認された（図４８）。したがって、Bax-mCherry-CRY2（赤色）とCIBN-EGFP-CD9（緑色）の結合を確認することにより、Baxタンパク質はエキソソームにロードされた。
B. Bax::EXPLORの生成
本発明者らは、Baxをロードしたエキソソームを産生するために以下の実験を行った。
特に、CIBN-EGRP-CD9遺伝子及びBax-mCherry-CRY2遺伝子を含むベクターを、HEK293Tエキソソーム生成細胞に遺伝子導入し、これらの細胞は24時間培養した。24時間培養後、細胞は、その培地をウシ胎児血清（FBS）を含まないものに交換し、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、追加で48時間培養した。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。上清に5倍多い量のExoQuick-TCエキソソーム沈殿溶液(System Biosciences、Mountain View、California、USA)を加えて、4℃にて18時間混合した。懸濁されたエキソソームは、前述の上清とExoQuick-TCの混合物の遠心分離（1500×g、30分）によりエキソソームのペレットを懸濁することにより得られた（図８）。
その上、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びBax-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現するHEK293Tエキソソーム生成細胞は、50μWの強度の488nm波長青色光のもと、48〜72時間、ウシ胎児血清を含まない培地で培養された。培養終了後、上清を除去した細胞デブリが、単離した培養培地から遠心分離（2000×g、15分）により産生された。200nmより大きな粒子を上清から除くために、それを0.2μlのPES膜（Corning）により濾過した。接線方向流濾過（TFF）法が同じ上清に適用され、20nmより小さな粒子を除去し、濾液に由来するエキソソームを濃縮し精製した。Vivaflow 50-100 kDa PES memebrane（Sartorius）がTFFにおいて使用された。エキソソームは、1.5〜2大気圧のTFFのもと、濾液の回転により濃縮され精製された。次に、エキソソーム濃縮物から、Amicon Ultra-0.5（100kDa）（Millipore）フィルターでの遠心分離（10000〜14000 g、5分）により液体を除去した。最後に、エキソソームは、実験上の目的に好ましい緩衝液を用いて、逆方向遠心分離（10000〜14000 g、5分）により得られた。
<23-2> Bax:EXPLORによるアポトーシスの確認
Baxはアポトーシス制御因子であり、したがってBAX過剰発現はミトコンドリア膜への結合によりシトクロムcを放出し、アポトーシスを誘導する。本発明者らはBax:EXPLORを使用してシトクロムcの排出を確認した。
特に、0.1 mg/mLのmCherry:EXPLOR又はBax:EXPLORを含有する培地中のHeLaを12時間培養した。4%パラホルムアルデヒドを使用して固定後、シトクロムcの排出を測定するために、HeLaをAlexa Fluor 647コンジュゲート抗体で染色し、共焦点顕微鏡を使用して画像化し、シトクロムcの比率を細胞数を数えることにより分析した（スケールバー、20μm）。データは平均±SEM（n=3）で示され、Tukeyのpost hoc検定を使用して適用され、ANOVA検定により有意群（**、p < 0.01）を決定した。
その結果、mCherry:EXPLOR処理したHeLaよりもBax:EXPLOR処理したHeLaにおいて、より多い量のシトクロムcの放出が観察された（図４９）。
[実験的実施例２４]
BcL-xL
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びBcL-xL-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びにBcL-xLのエキソソーム内へのローディングが評価される。
BcL-xLをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びBcL-xL-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
BcL-xLをロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な活性を示すために、BcL-xLをロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、BcL-xLをロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
[実験的実施例２５]
AIMP
本発明者らは、488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びAIMP-mcherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合（図５０）、並びにエキソソーム内へのAIMPのローディング（図５１）を確認した。
AIMPをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びAIMP-mcherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製された。
AIMPをロードしたエキソソームの標的細胞への処理により、機能的活性が示される。
AIMPをロードしたエキソソームのi.p.又はi.v.による動物モデルへの投与によって、治療効果が示される。
[実験的実施例２６]
mCherry（蛍光タンパク質）
本発明者らは、488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及びmcherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合（図５２）、並びにエキソソーム内へのAIMPのローディングを確認した。
mcherryをロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及びmcherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製された。
[実験的実施例２７]
核酸結合タンパク質
488nm波長青色光でのCIBN-EGFP-CD9及び核酸結合タンパク質-mCherry-Cry2を発現する細胞におけるCIBNとCRY2の結合、並びに核酸結合タンパク質のエキソソーム内へのローディングが評価される。
核酸結合タンパク質をロードしたエキソソームの大規模生成には、CIBN-EGFP-CD9遺伝子及び核酸結合タンパク質-mCherry-CRY2遺伝子を安定に発現する細胞が樹立され、エキソソームは培養上清から接線方向流濾過（TFF）法により単離され精製される。
核酸結合タンパク質をロードしたエキソソームの機能的解析は標的細胞で行われる。
機能的な活性を示すために、核酸結合タンパク質をロードしたエキソソームで標的細胞を処理する。
治療効果を示すために、核酸結合タンパク質をロードしたエキソソームをi.p.又はi.v.により動物モデルに投与する。
前述の説明に開示される概念及び特定の実施形態を本発明の同じ目的を実施するために他の実施形態を修正又は設計するための基礎として容易に利用できることを当業者なら理解するであろう。当業者はまた、そのような同等な実施形態は添付の特許請求の範囲に記載の本発明の精神及び範囲から逸脱しないことを理解するであろう。

Claims (21)

  1. 膜上にカーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法であって、
    a)エキソソーム特異的マーカーとカーゴタンパク質で構成される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入することによって、形質転換細胞を調製するステップ、
    b)ステップa)の形質転換細胞を培養するステップ、及び
    c)該カーゴタンパク質をエキソソーム膜の内部に分離するステップ
    を含む、大量生成方法。
  2. カーゴタンパク質が、NF-κBを阻害するスーパーリプレッサーIκBタンパク質、Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）、ペルオキシレドキシンI、ペルオキシレドキシンII、creリコンビナーゼ、Cas9（CRISPR結合タンパク質9）、Cpf1（プレボテラ属（Prevotella）及びフランシセラ属（Francisella）由来CRISPR 1）又はGBA（β-グルコセレブロシダーゼ）である、請求項１に記載のカーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
  3. エキソソーム生成細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、樹状細胞、巨核球、及びマクロファージ、幹細胞、及び腫瘍細胞からなる群から選択される1種以上の細胞である、請求項１に記載のエキソソームの大量生成方法。
  4. エキソソーム特異的マーカーがCD9、CD63、CD81又はCD82である、請求項１に記載のエキソソームの大量生成方法。
  5. カーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法であって、
    (a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質I)をコードするポリヌクレオペプチド、及びカーゴタンパク質と、第1の光特異的結合タンパク質に連結することができる第2の光特異的結合タンパク質で構成される融合タンパク質(融合タンパク質II)をコードするポリヌクレオチドをエキソソーム生成細胞に導入するステップ、
    (b)第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の間の結合を引き起こすことができる光でエキソソーム生成細胞を照射するステップ、並びに
    (c)エキソソーム生成細胞中でエキソソームの生成が終わった後に照射を終了するステップ
    を含む、大量生成方法。
  6. 第1の光特異的結合タンパク質が、CIB(クリプトクローム相互作用ベーシックヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質)、CIBN(CIBのN末端ドメイン)、PhyB(フィトクロームB)、PIF(フィトクローム相互作用因子)、FKF1(フラビン結合、Kelchリピート、Fボックス1)、GIGANTEA、CRY(クリプトクローム(chryptochrome))及びPHR(フィトリアーゼ相同領域)からなる群から選択される1種以上のタンパク質である、請求項５に記載のカーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
  7. 第1の光特異的結合タンパク質がCIB又はCIBNである場合、第2の光特異的結合タンパク質がCRY又はPHRであり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が460〜490nmの波長の光の照射によって達成される、請求項５に記載のカーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
  8. 第1の光特異的結合タンパク質がPhyBである場合、第2の光特異的結合タンパク質がPIFであり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が600〜650nmの波長の光の照射によって達成される、請求項５に記載のカーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
  9. 第1の光特異的結合タンパク質がGIGANTEAである場合、第2の光特異的結合タンパク質がFKF1であり、第1の光特異的結合タンパク質と第2の光特異的結合タンパク質の結合が460〜490nmの波長の光の照射によって達成される、請求項５に記載のカーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
  10. カーゴタンパク質が、NF-κBを阻害するスーパーリプレッサーIκBタンパク質、Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）、ペルオキシレドキシンI、ペルオキシレドキシンII、creリコンビナーゼ、Cas9（CRISPR結合タンパク質9）、Cpf1（プレボテラ属（Prevotella）及びフランシセラ属（Francisella）由来CRISPR 1）又はGBA（β-グルコセレブロシダーゼ）である、請求項５に記載のカーゴタンパク質を含むエキソソームの大量生成方法。
  11. 請求項１又は請求項５に記載の方法によって調製されたエキソソームを使用して、サイトゾルにタンパク質薬物を送達する方法。
  12. 活性成分として、請求項１又は請求項５に記載の方法によって調製されたエキソソームを含む、サイトゾルにタンパク質薬物を送達するための医薬組成物。
  13. (a)エキソソーム特異的マーカーと第1の光特異的結合タンパク質の融合タンパク質(第1の融合タンパク質)をコードするポリヌクレオチドを含む第1の発現ベクター、並びに
    (b)カーゴタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することができるマルチクローニングサイト、及び上記の第1の光特異的結合タンパク質に連結される第2の光特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む第2の発現ベクター
    を含む、エキソソームの生成のためのベクター。
  14. 第2の発現ベクターが、第2の光特異的結合タンパク質とカーゴタンパク質で構成される融合タンパク質(第2の融合タンパク質)をエキソソーム生成細胞において発現させるためのものである、請求項１３に記載のエキソソームの生成のためのベクター。
  15. 請求項１又は請求項５に記載の方法によって調製された、カーゴタンパク質を含むエキソソーム。
  16. 活性成分として請求項１又は請求項５に記載の方法により調製されたCreリコンビナーゼを含むエキソソームを含む、標的遺伝子のコンディショナルノックアウトアリルを生成するための組成物。
  17. 請求項１又は請求項５に記載の方法により調製されたCas9又はCpf1タンパク質を含むエキソソーム、及び標的DNA配列に特異的なガイドRNAを含む、DNA配列を操作する組成物。
  18. 活性成分として、請求項１又は請求項５に記載の方法により調製された、β-グルコセレブロシダーゼを含む薬学的有効量のエキソソームを投与するステップを含む、ゴーシェ病を治療又は予防する方法。
  19. 活性成分として、請求項１又は請求項５に記載の方法により調製された、ペルオキシレドキシンI又はペルオキシレドキシンIIタンパク質を含む薬学的効量のエキソソームを投与するステップを含む、活性酸素関連疾患を治療又は予防する方法。
  20. 活性成分として、請求項１又は請求項５に記載の方法により調製された、スーパーリプレッサーIκBタンパク質を含む薬学的有効量のエキソソームを投与するステップを含む、炎症性疾患を治療又は予防する方法。
  21. 活性成分として、請求項１又は請求項５に記載の方法により調製された、Bax（Bcl-2結合Xタンパク質）タンパク質を含む薬学的有効量のエキソソームを投与するステップを含む、癌を治療又は予防する方法。
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