JP2013505713A - エキソソームに結合した目的のポリペプチドの分泌を可能にする新規キメラポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにその使用 - Google Patents
エキソソームに結合した目的のポリペプチドの分泌を可能にする新規キメラポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013505713A JP2013505713A JP2012530319A JP2012530319A JP2013505713A JP 2013505713 A JP2013505713 A JP 2013505713A JP 2012530319 A JP2012530319 A JP 2012530319A JP 2012530319 A JP2012530319 A JP 2012530319A JP 2013505713 A JP2013505713 A JP 2013505713A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- domain
- membrane
- polypeptide
- chimeric polypeptide
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 621
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 441
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 417
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 246
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 74
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 248
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 227
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 198
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 181
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 81
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 176
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 103
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 85
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 50
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 50
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 claims description 47
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 40
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 38
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 38
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 32
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 32
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 31
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 claims description 31
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 claims description 26
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 26
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 23
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 23
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 22
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 20
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 20
- 108010007100 Pulmonary Surfactant-Associated Protein A Proteins 0.000 claims description 19
- 102100027773 Pulmonary surfactant-associated protein A2 Human genes 0.000 claims description 19
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 19
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims description 19
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims description 18
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 18
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 17
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims description 17
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 16
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 16
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 16
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 16
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 15
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 15
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 13
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 12
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 12
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 12
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 11
- NRZWYNLTFLDQQX-UHFFFAOYSA-N p-tert-Amylphenol Chemical compound CCC(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 NRZWYNLTFLDQQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 claims description 9
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims description 8
- 125000002686 geranylgeranyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 7
- -1 DNA Chemical class 0.000 claims description 7
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 7
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 7
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 7
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 5
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 4
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 3
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 125000004030 farnesyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 claims 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims 1
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 claims 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007849 functional defect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 86
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 37
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 37
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 35
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 34
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 33
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 33
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 29
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 28
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- 101500007118 Bovine leukemia virus Transmembrane protein Proteins 0.000 description 23
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 22
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 20
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 19
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 19
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical group O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 19
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 18
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 18
- 101150057799 Lamp3 gene Proteins 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 15
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 15
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 101100386053 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-3 gene Proteins 0.000 description 13
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 13
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 102100030552 Synaptosomal-associated protein 25 Human genes 0.000 description 12
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 12
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 12
- 108040000979 soluble NSF attachment protein activity proteins Proteins 0.000 description 12
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 11
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 10
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 9
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 9
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 8
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 7
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 7
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 7
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 7
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 7
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 7
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 7
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 230000028973 vesicle-mediated transport Effects 0.000 description 7
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 6
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 6
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 6
- 102100039715 Endogenous retrovirus group K member 6 Gag polyprotein Human genes 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 4
- 108010061299 CXCR4 Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000012000 CXCR4 Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 4
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 4
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 229930192649 bafilomycin Natural products 0.000 description 3
- XDHNQDDQEHDUTM-UHFFFAOYSA-N bafliomycin A1 Natural products COC1C=CC=C(C)CC(C)C(O)C(C)C=C(C)C=C(OC)C(=O)OC1C(C)C(O)C(C)C1(O)OC(C(C)C)C(C)C(O)C1 XDHNQDDQEHDUTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000323 DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 2
- 102000003915 DNA Topoisomerases Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001076418 Homo sapiens Interleukin-1 receptor type 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 2
- 101100342486 Oryza sativa subsp. japonica KSL10 gene Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 108020005088 Superhelical DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006655 lysosomal degradation pathway Effects 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 2
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 2
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BQCIDUSAKPWEOX-UHFFFAOYSA-N 1,1-Difluoroethene Chemical compound FC(F)=C BQCIDUSAKPWEOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150098072 20 gene Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 101100165655 Arabidopsis thaliana BRO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000712892 Arenaviridae Species 0.000 description 1
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- FRPHFZCDPYBUAU-UHFFFAOYSA-N Bromocresolgreen Chemical compound CC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C(=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 FRPHFZCDPYBUAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 102000035183 Clathrin adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005769 Clathrin adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100030953 Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 4 Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 108700002856 Coronavirus Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108010078339 DNA alkyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 235000019739 Dicalciumphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 101710170658 Endogenous retrovirus group K member 10 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710186314 Endogenous retrovirus group K member 21 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710162093 Endogenous retrovirus group K member 24 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710094596 Endogenous retrovirus group K member 8 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710177443 Endogenous retrovirus group K member 9 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017964 Gastrointestinal infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 108010083930 HIV Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006481 HIV Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000777387 Homo sapiens C-C motif chemokine 3 Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100007597 Homo sapiens CPSF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101100082597 Homo sapiens PDCD6IP gene Proteins 0.000 description 1
- 101001010819 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001010823 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102100026016 Interleukin-1 receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150048357 Lamp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000712902 Lassa mammarenavirus Species 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001417534 Lutjanidae Species 0.000 description 1
- 108010009489 Lysosomal-Associated Membrane Protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000711828 Lyssavirus Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- HACHPVCYFLSKSB-UMJDSZQGSA-N ManNAz-DBCO-Pam3CSK4 Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(N[C@H](CSCC(COC(CCCCCCCCCCCCCCC)=O)OC(CCCCCCCCCCCCCCC)=O)C(N[C@H](CO)C(N[C@H](CCCCN)C(N[C@H](CCCCN)C(N[C@H](CCCCN)C(N[C@H](CCCCN)C(NCCC(N(C1)C2=CC=CC=C2C2N(C(N[C@H]([C@H](C3)O)[C@H]([C@@H]([C@@H](CO)O)O)O[C@@]3(C(O)=O)O)=O)N=NC2C2=C1C=CC=C2)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O)=O HACHPVCYFLSKSB-UMJDSZQGSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101001033265 Mus musculus Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001043827 Mus musculus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001076414 Mus musculus Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010058765 Oncogene Protein pp60(v-src) Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 101100434648 Petromyzon marinus SDS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000713137 Phlebovirus Species 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 102100033344 Programmed cell death 6-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241000710801 Rubivirus Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101150084279 TM gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108700030796 Tsg101 Proteins 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002535 acidifier Substances 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091005647 acylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical class O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000000225 bioluminescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003563 calcium carbonate Drugs 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229940095672 calcium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000007891 compressed tablet Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- NEFBYIFKOOEVPA-UHFFFAOYSA-K dicalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O NEFBYIFKOOEVPA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000390 dicalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940038472 dicalcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 108700010787 filovirus proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N gamma-cyhalothrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](\C=C(/Cl)C(F)(F)F)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007366 host health Effects 0.000 description 1
- 102000043726 human CCL3 Human genes 0.000 description 1
- 102000051957 human ERBB2 Human genes 0.000 description 1
- 102000057750 human ERBB3 Human genes 0.000 description 1
- 102000053810 human ERBB4 Human genes 0.000 description 1
- 102000055282 human IL1R1 Human genes 0.000 description 1
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000006303 immediate early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012729 immediate-release (IR) formulation Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 208000037799 influenza C Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960001708 magnesium carbonate Drugs 0.000 description 1
- 235000014380 magnesium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical class [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000036332 sexual response Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003412 trans-golgi network Anatomy 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
- (i)目的のペプチドまたはポリペプチド;
- (ii)膜内標的ドメイン;および
- (iii)膜タンパク質の細胞質ドメイン(CD)であって、真核細胞中で、膜小胞へ、特にエキソソーム形成小胞へ、および/または膜小胞の形成に関与する1または2以上の細胞区画へ、特に前記エキソソーム形成小胞へ、キメラポリペプチドを差し向けることができる前記ドメイン、あるいは、前記CDドメインの変異誘導体であって、基準CDドメインの配列中の置換、欠失および/または挿入で規定され、CDドメインの差し向け能力を保存している前記変異誘導体、ここで前記CDドメインまたはその変異誘導体は、モチーフYxxLおよびモチーフPxxP(配列中、xは任意の残基を示す)を少なくとも1つ含んでなる;
を含んでなるまたはそれから成るキメラポリペプチドであって;
ここで、前記キメラポリペプチド内に存在するドメイン、特にドメイン(i)、(ii)、および(iii)は、細胞質または核ドメインであり(例えば、ドメイン(i)および(iii)は細胞質ドメインであり)、そして前記キメラポリペプチドは、小胞体中への取り込みのためのシグナルペプチドを欠損しているものと理解される、ことを特徴とする前記キメラポリペプチドを提供する。本願で使用する用語「残基」は、アミノ酸残基を意味する。これらの残基は、省略された一文字コード(例えば、チロシン残基のY、ロイシン残基のL、プロリン残基のPおよび任意の残基のx)を使用して表示される。
−X1がC、SおよびLから選択され;および/または
−X2がS、I、V、MおよびLから選択され;および/または
−X3が、K、Q、H、F、CおよびSから選択される。
−以下の配列から選択される配列を含んでなるか、またはそれらから成り:M−G−x−x−K−S/C−K−x−KおよびM−G−x−x−K−S/C−K−x−K−x−x−x−x−R−R−R(配列中、xは任意の残基を示す);例えば、そのような配列は、(例えば、2位における)ミリスチン酸の付加を可能にし得る;または
−この配列の変異誘導体から成り、当該変異誘導体が細胞膜の脂質二重層に固定されるようになるこのドメインの能力を保存している。
PxxPxxxxPxxPxSxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxL;
PxxPxnPxxPxnSxYxxLxnPxxPExnYxxLxnPxxPDYxxL;
PxxPxxxxPxxPxSxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxLxxxx;および
PxxPxnPxxPxnSxYxxLxnPxxPExnYxxLxnPxxPDYxxLxxxx;
から選択される配列を含んでなるまたはこれから成り、配列中、xおよびxnは各々任意の残基および任意の1または2以上の残基を表わし、かつ、配列中、モチーフPxxPのうちの少なくとも1つがモチーフPSAPまたはPTAPである。
PxxPxxxxxxxxxxxxYxxL;
PxxPxxxxxxxxxxxDYxxL;
PxxPxxYxxxxxxxxxYxxL;
PxxPxxYxxxxxxxxDYxxL;
PxxPExYxxLxPxxPDYxxL;
PxxPxnYxxL;
PxxPxnDYxxL;
PxxPxnYxnYxxL;
PxxPxnYxnDYxxL;
PxxPExnYxxLxnPxxPDYxxL;
PxxPxxxxPxxPxxxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxL;
PxxPxnPxxPxnYxxLxnPxxPEXnYxxLxnPxxPDYxxL;
PxxPxxxxPxxPxxxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxLxxxx;および
PxxPxnPxxPxnYxxLxnPxxPEXnYxxLxnPxxPDYxxLxxxx、
から選択される配列を含んでなるまたはこれから成り、配列中、xおよびxnは各々任意の残基および任意の1または2以上の残基を表わし、かつ、配列中、モチーフPxxPのうちの少なくとも1つがモチーフPSAPまたはPTAPである。
−ペプチドまたは目的のポリペプチド;
−膜貫通型ドメイン;および
−細胞質ドメイン(CD)または当該CDドメインの変異誘導体、当該CDドメインおよびその変異誘導体は本願で規定されるとおりのものである;これらのドメインN末端部からC末端部に向かって以下の順で連続して配置される:目的のペプチドまたはポリペプチド−膜貫通型ドメイン−CDドメインまたはその変異誘導体;またはCDドメインまたはその変異誘導体−膜貫通型ドメイン−目的のペプチドまたはポリペプチド。
−膜タンパク質、特に膜貫通タンパク質の1もしくは2以上の膜ドメイン、または1もしくは2以上のこれらのドメインの断片、および/または
−膜タンパク質、特に膜貫通タンパク質の1もしくは2以上の細胞質ドメイン、または1もしくは2以上のこれらのドメインの断片、
を含んでなるか、またはこれらから成る。
−ポックスウイルス科(Poxviridae)、そして特にオルトポックス・ウイルス(Orthopoxvirus)属のものであって、特に天然痘ウイルス(smallpox virus)およびワクシニアウイルス(vaccinia virus)が含まれる;
−ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、特にヘルペスウイルス属のものであって、特にヘルペスウイルス1および2型、水疱瘡ウイルス(chicken pox virus)、エプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)、サイトメガロ・ウイルス(Cytomegalovirus)、およびヘルペスウイルス6、7、8型が含まれる;
−オルトミクソ・ウイルス科(Orthomyxoviridae)、特にインフルエンザA、BまたはC型ウイルス属のものであって、特にH5N1トリFluウイルスが含まれる;
−パラミクソウイルス科(paramyxoviridae)、特にパラミクソウイルス属のものであって、特にパラインフルエンザ(parainfluenzae)ウイルスおよびムンプスウイルス(mumps virus)が含まれ、また麻疹ウイルス(Morbillivirus)属のものであって、特に麻疹ウイルス(measles virus)が含まれ、並びに肺炎ウイルス属(Pneumovirus)のものであって、特に合胞体(syncytial)呼吸器系ウイルスが含まれる;
−ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、特にリッサ・ウイルス属(Lyssavirus)のものであって、特に狂犬病ウイルス(rabies virus)が含まれる;
−トガウイルス科(Togaviridae)、特にフラビ・ウイルス属(Flavivirus)のものであって、特に黄熱病ウイルス(yellow fever virus)およびC型肝炎ウイルス(hepatitis C virus)(HCV)が含まれ、アルファ・ウイルス属(Alphavirus)のものおよびルビ・ウイルス属(Rubivirus)のものであって、特に風疹ウイルス(Rubella virus)が含まれる;
−コロナウイルス科(Coronaviridae)、特にコロナウイルス(Coronavirus)属のものであって、特に呼吸器系および消化器系感染症、例えば重症急性呼吸器症候群(SARS)に関与するウイルスが含まれる;
−アレナ・ウイルス科(Arenaviridae)、特にアレナ・ウイルス(Arenavirus)属のものであって、特にラッサ熱ウイルス(Lassa virus)が含まれる;
−ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、特にブンヤ・ウイルス属(Bunyavirus)、ハンタ・ウイルス属(Hantavirus)、フレボウイルス属(Phlebovirus)のもの;並びに
−レトロウイルス科(Retroviridae)、特にレンチウイルス(Lentivirus)属のものであって、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV)が含まれる。
− 一方では、本発明のキメラポリペプチド(および/または1または2以上の任意の分解産物)、ここで、目的のペプチドまたはポリペプチドが細胞質タンパク質、例えば、抗原、Gタンパク質、酵素(例えば、1または2以上の標的細胞で欠損している細胞質酵素)、標的細胞に有害な効果、対照的に有益な効果を有し得る毒素またはその他の細胞質ペプチドまたはポリペプチド、あるいは特定の核酸に結合することができるペプチドまたはポリペプチドであり、そして本発明の当該キメラポリペプチドは、随意に、例えば一次フルオロフォアによってタグを付与される。
− もう一方では、追加のキメラポリペプチド(および/またはもしあれば1または2以上の分解産物)、ここで、目的のペプチドまたはポリペプチドは、例えば受容体(例えば、複数の膜ドメインを有する受容体、特にCXCR4またはGPR受容体)または標的細胞または特定のタイプの標的細胞(例えば、腫瘍細胞または代謝もしくは機能障害を有する細胞)を標的化する
のに使用できるその他のペプチドまたはポリペプチドであり、そして当該追加のキメラポリペプチドは、例えば、(一次フルオロフォアと異なる)二次フルオロフォアによって好ましくはタグを付与される。
− (例えば、酵素を加えることによって)標的細胞を処理する;
− 対照的に、標的細胞(例えば、腫瘍細胞)を破壊する;または
− 例えば、本発明のキメラポリペプチドの目的のペプチドまたはポリペプチドへの核酸の結合を検出することによって、診断をおこなう;
− 例えば本発明のキメラポリペプチドに存在する細胞質抗原に向けて、免疫応答を引き起こす;
− タンパク質をスクリーニングする、および/または(例えば、使用した2つのフルオロフォア間の任意のエネルギー移動を検出することにより)タンパク質間の任意の相互作用を分析する。
− 1もしくは2以上の追加のキメラポリペプチド;または
− 1もしくは2以上の追加の膜小胞(特に1もしくは2以上の相加エキソソーム)。
a)目的のペプチドもしくはポリペプチドを含んでなるポリペプチドをコードする、本発明の1または2以上のポリヌクレオチドを、エキソソーム産生細胞の中へ導入すること、あるいは、目的の当該ペプチドもしくはポリペプチドを含んでなるポリペプチド、および/またはこのポリペプチドの分解産物を含む本発明の1または2以上の膜小胞と、あるいは当該小胞に基づく組成物とエキソソーム産生細胞を接触させること;
b)当該エキソソーム産生細胞を培養すること;
c)前記エキソソーム産生細胞によって産生される膜小胞、特にエキソソームを回収すること。
a)アジュバントと結合させてまたは結合させずに、本発明の膜小胞、本発明の免疫原性組成物または本発明のポリヌクレオチドをヒトでない動物へ適当であれば繰り返し投与すること;並びに
b)1もしくは2以上の、目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができる、形成された抗体を回収すること。
a)本発明の膜小胞、本発明の免疫原性組成物または本発明のポリヌクレオチドが、適当であればアジュバントと結合して投与された、そして適当であれば繰り返しの投与により投与された、(ヒトまたはヒトでない)宿主、例えばBalb/cマウスから得られた骨髄腫細胞、脾臓細胞に融合すること;
b)抗体の産生が可能な条件下で雑種細胞を培養および選択すること;
c)1もしくは2以上の、目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドに対するモノクローナル抗体を回収すること。
a)適当な場合にアジュバントと結合して、そして適当であれば繰り返される投与によって、本発明の膜小胞、本発明の免疫原性組成物または本発明のポリヌクレオチドを投与した(ヒトまたはヒトでない)宿主、例えばBalb/cマウスから得られた、造血細胞由来の、より具体的には血液細胞由来の抗体産生細胞、例えばリンパ球またはリンパ芽球を不死化すること;
b)抗体の産生が可能な条件下で不死化細胞を培養および選択すること;
c)1もしくは2以上の、目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドに対するモノクローナル抗体を回収すること。
a)本発明の膜小胞を、追加のキメラポリペプチド内に存在する当該目的のペプチドまたはポリペプチドと相互作用しやすい1または2以上の分子と接触させること;
b)当該目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは当該目的のペプチドまたはポリペプチドの断片および、1または2以上の当該分子との間の任意の相互作用を検出すること、が含まれる。
方法および装置
I.プラスミドDNAの調製:
A.細菌の形質転換:
コンピテントDH5α細菌(200μL)を、BLVウイルスの野生型または突然変異体CDTMをコードする試験した13個のDNAの各々の12.5ngを用いて、ヒートショックによって、並びにネガティブコントロールとして機能している挿入断片(pLPCX)の欠損しているプラスミドによって形質転換した。
得られた培養物を、速度3600rpm並びに温度4℃で20分間遠心分離した(GR 412, Jouan)。ペレットを25mLのSTET緩衝液(スクロース8%、トリトンX100 5%、トリス塩酸pH8、50mM、EDTA 50mM)に溶解し、500μLのリゾチーム(10mg/mL;Sigma)および250μLのRNA分解酵素(2mg/mL;Sigma)を添加した。そしてチューブを100℃で10分間インキュベートし、そして16000rpmで30分間遠心分離した。1mg/mLのタンパク質分解酵素K(Amresco)の存在下で、得られた上清を65℃で45分間インキュベートした。上清を除去し、そしてDNAを0.15ボリュームの酢酸ナトリウム(AcNa)3M、pH6および0.6ボリュームのイソプロパノ−ルで沈殿させた。この溶液を4℃、次いで15000rpmで15分間遠心分離した(Aventi 30, Beckman)。得られたペレットを、同様のパラメータを使用して再度遠心分離する前に、10mLのエタノールで洗浄した。得られた核酸を乾燥し、2mLのTE 1Xに溶解し、そして4℃で保存した。
STETマキシ調製は、大量のプラスミドを生成するために使用することができるが、純度を改善することが必要である。この目的のために、我々は2つのパスによってAX100カラムで14個の各プラスミドを精製した(Kit Nucleobond PC 100, Macherey Nagel)。イソプロパノ−ルでの沈殿の後、得られた精製されたプラスミドを500μLのTE1X中に溶解し、4℃で保存した。
各DNAタイプをアリコート50または100μgでチューブ内に置き、そしてプラスミドを滅菌するために層流式フードで、エタノール(EtOH)およびNaClを使用して沈殿を実施した。得られたペレットを100μgのプラスミドあたり200μLのTE1Xの量、すなわち濃度500ng/μLの量で溶解した。アリコート中のDNAの存在が、0.8%のアガロ−スゲル電気泳動によって確認された。
アリコートを、260nmの波長の分光光度法でアッセイした。サンプルを1/50まで希釈し、そして最終容積500μLでアッセイした。
制限酵素(New England Biolabs):HindIII/NotI pair、XbaI、AatII、PacI、SfoIでのこれら各々の20ngの消化によって、各プラスミドの同一性を確認した。各消化生成物のアガロ−スゲル電気泳動(0.8%)の後に、得られるバンドの数およびこれらの分子量に従ってプラスミドを識別した。
A.細胞培養:
HEK293細胞(ヒト胎児腎臓細胞)を、10%のウシ胎仔血清(FCS)および20μg/mLのゲンタマイシンを追加したDMEM培地(ダルベッコ変法イーグル培地)で、5%CO2の下で37℃で培養した。
形質導入するために、5×105細胞を9.6cm2ウェルごとに2mLの培地上に蒔いた(6ウェルプレート)。5%CO2の下、37℃でオーバーナイトで培養後、培地を抗生物質非含有の完全DMEMで交換した。
遺伝子導入の48時間後、細胞を0.5%のTNE−NP40緩衝液で溶解し、0.1mMのPMSFを添加した。遠心分離(14000rpm、15分、4℃;Eppendorf 5417R)による清澄後、可溶化物をブラッドフォード法を使用して分光光度法(595nmで)でアッセイした。
細胞を溶解する前に培地を回収し、そして温度4℃で20分間10000rpmでプレ遠心分離した(Aventi 30, Beckman)。次に得られた上清を温度4℃で2時間100000gで超遠心分離した(Optima LE-80K, Ti 50 rotor, Beckman)。得られたペレットを100μLのCB 1X中に溶解した。
得られたタンパク質サンプルを、ウエスタンブロットによって分析した:アクリルアミドゲル(12.5%)上で泳動および分離後、タンパク質を疎水性のPVDF膜(Immobillon-P, Millipore)上に移動した。
・一次抗体:BLV抗ウサギCDTM抗血清(希釈1/200)
・二次抗体:ペルオキシダーゼでタグ付与した抗ウサギIgG(希釈1/5000;Jackson Immuno Research, JIR)
・一次抗体:抗ヒトTFrマウスIgG(希釈1/200;Zymed)
・二次抗体:抗マウスIgG(希釈1/5000;JIR)
・一次抗体:
抗マウスCD8マウスIgG(19/178)(JIR)
抗マウスCD8ラットIgG(53/672)(JIR)
・二次抗体:
抗マウスIgG(JIR)
抗ラットIgG(JIR)
A.スライドの調製
層流式フード中で、カバースリップ型スライドをエタノール溶液中で滅菌し、次に1.9cm2ウェル(24ウェルプレート)中に置いた後に37℃で1時間ポリ−L−リジン(25μg/mL、Sigma)でコーティングした。PBSで洗浄後、スライドを1mLのPBS中で4℃で保存した。
「キメラ発現の分析」のセクションに記述の方法を使用して、HEK293細胞を培養し、そして形質導入した。形質導入の24時間後、細胞を35mLの完全DMEM中に溶解し、続いて滅菌し1ウェルあたり1mLの細胞希釈の量でコーティングしたスライドを含有する、1.9cm2のウェル(24ウェルプレート)中に分配した。従って、培養下にあった細胞を、37℃で5%CO2の下で24時間、インキュベートした。
次に、細胞をホルムアルデヒド溶液(4%)で30分間固定し、そしてトリトンX―100(最終0.2%)で透過処理した。PBSでの3×10分のすすぎの後、スライドを1mLのPBSを使用して4℃で保存した。
我々は様々な抗体を自由に使用でき、このことから免疫蛍光法による局在確認に複数のタグをテストすることができることが示された:
N°1:マウスIgG/抗マウスCD8(19/178)(JIR)+抗マウスIgG FITC(JIR)
N°2:マウスAscites/抗マウスCD8(19/178)(JIR)+抗マウスIgG FITC(JIR)
N°3:ラットIgG/抗マウスCD8(53/672)(JIR)+抗ラットIgG FITC(JIR)
N°4:ラットIgG(53/6.7)/抗マウスCD8 FITC(Pharmingen)
N°5:マウスIgG/抗ヒトCD63(Lamp3)(Zymed)+抗マウスIgG Cy3(Sigma)
N°6:マウスIgG/抗ヒトLamp1+抗マウスIgG Cy3(Sigma)
N°7:マウスIgG/抗ヒトTf2(Zymed)+抗マウスIgG Cy3(Sigma)
N°8:ウサギIgG/抗カベオリン(BD)+抗ウサギIgG TRITC(JIR)
エキソソームの形成プロセスの知識は不十分である。同様に、Envの細胞質ドメインに付随した機能は、特徴があまりない。本研究は、ウシ白血病ウイルス(BLV)モデルがエキソソーム形成およびウイルス粒子形成の現象の研究において良好なツールであり、そしてBLVのTMタンパク質(CDTM)の細胞質ドメインは「エキソソームディスプレー」によるワクチン接種の発達のために潜在的に重要なツールである、という仮説に基づく。
・1:pX2 CCC(野生型表現型)
・2:pX2 ACC
・3:pX2 CAC
・4:pX2 AAC
・5:pX2 CCA
・6:pX2 ACA
・7:pX2 CAA
・8:pX2 AAA
・9:pX3 CCC(野生型表現型)
・10:pX3 CAC
・11:pX4−C(野生型表現型)
・12:pX4−A
・13:pX4 stp(pX4 stpは単にED、tmDおよびCD8のCDTMのごく一部から構成される)、であった。
最初に、我々は13個の各DNAおよびネガティブコントロールとして機能する挿入断片を有しないベクター(pLPCX)を大量に産生した。我々の様々なプラスミドにより形質転換した細菌を培養後、続いて得られたDNAを連続してカラム上でSTET方法により精製した。そして得られたプラスミドの同一性は酵素消化によって確認した。
プラスミドDNAの完全性およびSTET調製の収率を確認するために、これらの各1μLおよび0.20μLの泳動をアガロ−スゲル(0.8%;図3を参照のこと)上で実施した。DNAの非分解が、均一のサイズの超らせんDNAの異なるバンドの存在により実証された。
STET方法により得られたDNAをカラム上で精製した;精製され得られたDNAの完全性を確認するために、保持され溶出された画分および保持されなかった画分をゲル電気泳動により分析した。図4に示されたゲルにより、超らせんDNAがカラム(EおよびE’)から溶出された純粋画分中には実際に存在し、しかしながら非保持画分(FT)では検出できないことが示された。
次に、精製されたDNAを分光光度法を使用してアッセイした。従って得られた濃度はアリコートに応じて、149μg/mL〜584μg/mLの間で変動した。エタノールでの沈殿後、当該アリコートのDNAをTE1X中に取り出し、そして同濃度に調製した。
1)一般的原理:
調製した14個のDNAの同一性を確認するために、これらを制限酵素HindIIIおよびNotI、XbaI、AatII、PacI並びにSfoIを使用した消化により全て確認したが、これらは各DNAのゲルプロファイルの異なる組合せとなる。消化生成物のアガロ−スゲル泳動(0.8%)により、得られたバンドの数およびサイズに応じて、表1に示すようにDNAを識別することができる(NB:サイズが100塩基対以下のバンドは、我々のゲル電気泳動像上では観察することができなかった):
突然変異体pX2 AACおよびpX2 CCAの識別に関して、得られたゲルを図6Aに示す。
・HindIII/NotIでの消化:2つのサンプル各々において、約7206bpで得られた単一バンドは、コンストラクトX2またはX4の存在と一致する。
・XbaIでの消化:2つのサンプル各々において、約6822(または6812)および367bpで得られている2つのバンドは、コンストラクトX2またはX3の存在と一致する。
・AatIIでの消化:
− サンプル4:得られている約3423bp(赤)の1つの特定のバンドは、次のX2プラスミドの1つの存在と一致する:pX2 CAC、pX2 AAC、pX2 CAAまたはpX2 AAA。
− サンプル5:得られている約4285bp(青)の1つの特定のバンドは、次のX2プラスミドの1つの存在と一致する:pX2 CCC、pX2 ACC、pX2 CCAまたはpX2 ACA。
− サンプル4:約2538bp(赤)の得られている1つの特定のバンドは、次のX2プラスミドの1つの存在と一致する:pX2 CCC、pX2 ACC、pX2 CAC、pX2 AAC。この結果は、AatIIによる消化のものと照合され、そして我々は次のプラスミドの1つの存在下にあったことを推測することができた:pX2 AACまたはpX2 CAC。
− サンプル5:約1839bp(黒)および699bp(緑)の得られている2つの特定のバンドは、次のX2プラスミドの1つの存在と一致する:pX2 CCA、pX2 ACA、pX2 CAA、pX2 AAA。この結果は、AatIIによる消化のものと照合され、次のプラスミドの1つの存在下にあったことを推測することができた:pX2 CCAまたはpX2 ACA。
各サンプルに関して、非超らせんDNApに一致する低い強度のバンドおよび超らせんDNAp(青)に一致する高い強度のバンドを得たが、これからPacIによる消化がこれらのサンプルにないことが示される。
DNAの調製のためのこのステップの間に、14個の精製プラスミドが各々数ミリグラムずつ得られ、酵素消化およびゲル分析による確認の後にこれらの同一性は全て確認された。さらに、全DNAを同濃度に調整した。
DNA発現を調べるために、各プラスミドの同量をHEK293細胞内に導入した。これにより発現されたタンパク質をゲル泳動により分析し、続いてPVDF膜上へ輸送した。そして当該膜は、抗ウサギCDTM血清およびペルオキシダーゼでタグ付与した二次抗ウサギ抗体を使用して明らかにした。
1)未精製の可溶化物の分析:
形質導入の48時間後、細胞を溶解し、得られた抽出物をブラッドフォード法を使用してアッセイした。これらの可溶化物由来の未精製タンパク質ブルート(brutes)の200μgを、ゲル泳動およびウエスタンブロットによって分析し、抗CDTM抗体で明らかにした(図7を参照のこと)。
・CD8−CDTMの存在に一致する50kDaの二重バンド(青)。2つのバンドは、CD8のグリコシル化の2つのレベルに一致する。
・未確定のオリジンの約20kDaのシグナル(赤)。
細胞可溶化物中のCD8−CDTMの検出閾値を低下させるために、大量の抽出物を使用し、CD8の外部ドメインの立体構造エピトープの特定のモノクローナル抗体での免疫沈降によってキメラを濃縮した。
・CD8−CDTMの存在と一致する55kDaの二重バンド(青);
・約66kDaで各サンプルで確認される、不明のシグナル;
・おそらく多量体が形成されたCD8−CDTMタンパク質の存在と一致する、66kDa以上の分子量を有する1または2以上のシグナル。
各キメラの特徴(tmD BLVの完全性、第三のシステイン残基の存在およびシステイン残基の数)を有する細胞可溶化物上でウエスタンブロットによって得られたデータの相互の関係を比較することによって、以下の表2を作成することができた。
使用した様々なDNAは2、3のヌクレオチドが相違するだけであった。従って、おそらく合成されたCD8−CDTMの量は同量であった。しかしながら、細胞可溶化物中のCDTMの発現の分析の間、形質導入48時間後に特定のキメラは検出不可能であったことが確認された。このシグナルの見られないことは、キメラタンパク質の一部の消失を反映するかもしれない。この消失は、これらのキメラの急速な分解、またはエキソソームの形態でのこれらの分泌のいずれかが原因であったのかもしれない。
形質導入の48時間後、培地を回収しエキソソームを分離するために遠心分離した。次に得られたペレットをゲル泳動およびウエスタンブロットで分析し、そして抗CDTM抗体で明らかにした(図9を参照のこと)。
培地の超遠心分離後に得られたシグナルは実際にエキソソーム中のキメラの存在に起因するものであり、CD8−CDTMを含有する細胞残屑の存在に起因するものではないということを確認するために、上述の方法に従ってショ糖密度勾配上での沈降によって得られたエキソソームのペレットを分析した。使用した細胞および小胞の組成に応じて1.13g/mL〜1.20g/mLの密度でエキソソームが浮遊した。超遠心分離での沈降後、700μLの画分中で勾配を除去した。TCAを使用してタンパク質を沈殿させ、ゲル泳動、続いてウエスタンブロットで分析し、そして細胞小胞(エンドソームまたはエキソソーム)の存在を検出するために抗CDTM抗体および抗トランスフェリン受容体(RTf)抗体で明らかにした。この分析は突然変異体pX4−CおよびpX4−Aに関して実施した(図10を参照のこと)。
Cys213を有するpX2を除いた、CDTMを含有する全突然変異体で、CD8−CDTMとエキソソームとの結合を検出した。pX4−CおよびpX4−A突然変異体は、エキソソーム中で非常に効率的にターゲティングされたと思われる。Cys213を有しないpX3およびpX2突然変異体もまたエキソソーム中で確認されたが、pX4−CおよびpX4−A突然変異体よりも少ない割合であった。
・BLVの膜貫通型ドメインの存在または非存在。
・Cys3の存在または非存在、である。
キメラpX2 CCC、pX2 ACC、pX2 CACおよびpX2 AACの検出がないことはエキソソームの分泌の増加に起因しないので、これがMVBタンパク質のリソソームへの局在化による分解に起因するか否かを調べた。
細胞区画においてCD8−CDTMの膜ターゲティングおよびこの局在性を評価するために、共焦点免疫蛍光顕微鏡を使用して観察を実施した。形質導入48時間後、細胞を固定し、様々な抗体を使用してタグ付与した。
最初に、タグの各タイプ(方法および装置を参照のこと)を、pX4−CまたはpLPCXを発現している固定細胞上で可変の抗体希釈を使用してテストした。通常の免疫蛍光顕微鏡(ZEISS Axiovert 200 M)上で観察の後、様々な入手可能な抗体(「方法および装置」部分を参照のこと)をテストし、そしてこれらの有効性およびこれらの最適な希釈を測定した。複数の抗細胞内区画抗体が、ゼロまたは1つの特定のシグナルを有することが観察された。
・CD8−CDTMタグラベル:
ラットIgG(53/6.7)抗マウスCD8 FITC(Pharmingen、希釈1/50)
・Lamp3ラベル:
抗ヒトCD63(Lamp3)マウスIgG(Zymed、希釈1/50)+抗マウスIgG Cy3(Sigma、希釈1/500)
細胞の固定および我々の様々な抗体を使用したタグ付与の後、共焦点顕微鏡(ZEISS LSM 510)を使用してCD8−CDTMに由来するタグの分布およびLamp3との共局在を観察した。
HEK293細胞に48時間形質導入し、固定した。ZEISS LSM 510共焦点顕微鏡(X63 immersion objective)を使用して、観察を実施した。
pX4 stpを除く全サンプルに関して、大きく均一なCD8の核周囲のシグナルはほぼ常に核の周囲で発見された。細胞に存在するFITC蛍光の主要部を視覚化するために必要である強度パラメータは、この区域の飽和を生じた。このような飽和シグナルは、それほど有用でなく、特にLamp3との共局在の妥当性を測定するために、これらの区域の分析に焦点を合わせることによって強度の弱いパラメータを捕捉した。
・tmd BLVの存在または非存在;
・BLVのCDTMのN末端残基の存在または非存在;
・Cys3の存在または非存在、
である。
分析中に、キメラpX4 stpは、単に外部ドメインおよびCD8のtmdから構成され、効率よく原形質膜へターゲティングされることによりHEK293細胞中に蓄積することが示された。
最初の免疫付与トライアルを始める前に、BLV TMタンパク質の細胞質ドメインに位置する「モーター」の正確な特質を特定するために、BLV TMタンパク質の細胞質ドメインでの変異の18タイプの影響を実験した(図19を参照のこと):
− 13個の末端残基の欠失および第二のモチーフPxxPの2つのプロリン残基の置換(配列番号15および配列番号16;変異KM5);
− 13個のN末端残基の欠失および第三のPxxPモチーフの2つのプロリン残基の置換(配列番号17および配列番号18;変異KM8);
− 13個のN末端残基の欠失および第四のPxxPモチーフの一番目のプロリン残基の置換(配列番号19および配列番号20;変異KM11/1);
− 第四のPxxPモチーフの2つのプロリン残基の置換(配列番号21および配列番号22;変異KM11/3);
− 13個のN末端残基の欠失および第二のYxxLモチーフのチロシン残基の置換(配列番号25および配列番号26;変異KM9);
− 13個のN末端残基の欠失および第三のYxxLモチーフのチロシン残基の置換(配列番号27および配列番号28;変異KM13);
− 13個のN末端残基の欠失および第一のYxxLモチーフの前のセリン残基の置換(配列番号29および配列番号30;変異S);
− 13個のN末端残基の欠失および第二のYxxLモチーフ前に位置するグルタミン酸残基の置換(配列番号31および配列番号32;変異E);
− 13個のN末端残基の欠失および第三のYxxLモチーフの前に位置するアスパラギン酸残基の置換(配列番号33および配列番号34;変異D);
− 15個の残基まで切断された配列−13個のN末端残基および30個のC末端残基の欠失(配列番号37および配列番号38;変異KS6);
− 21個の残基まで切断された配列−13個のN末端残基および24個のC末端残基の欠失(配列番号39および配列番号40;変異KS8);
− 26個の残基まで切断された配列−13個のN末端残基および19個のC末端残基の欠失(配列番号41および配列番号42;変異KS9);
− 31個の残基まで切断された配列−13個のN末端残基および14個のC末端残基の欠失(配列番号43および配列番号44;変異KS10);
− 37個の残基まで切断された配列−13個のN末端残基および8個のC末端残基の欠失(配列番号45および配列番号46;変異KS12);
− 41個の残基まで切断された配列−13個のN末端残基および4個のC末端残基の欠失(配列番号47および配列番号48;変異KS14)。
A−PCRによる挿入断片の調製:
3つの置換突然変異体S(Ser→Ala)、D(Ac.Asp→Ala)およびE(Ac.Glut→Ala)を、以下の変異プライマーを利用の二重PCRを使用した定方向突然変異誘発によって得た:
5’CCCTAAACCCGATGCTGATTATCAGGCGTTGCTACCATCC 3’
−AへのプライマーS,逆方向:
5’CGCGGATGGTAGCAACGCCTGATAATCAGCATCGGGTTTA 3’
−AへのプライマーD,順方向:
5’CCACCAAGCCGGCATACATCAACCT 3’
−AへのプライマーD,逆方向:
5’TCGAAGGTTGATGTATGCCGGCTTGGT 3’
−AへのプライマーE,順方向:
5’GCTACCATCCGCGCCAGCGATCTAC 3’
−AへのプライマーE,逆方向:
5’GTAGATCGCTGGCGCGGATGGTA 3’。
A(25μL):増幅のためのDNAの10ng、10mMのdNTPの1μL(最終各々200μM)、10μMでの2つの順方向および逆方向プライマーの各々1.5μL(最終300nM)、滅菌水(qsp 25μL);および
B(25μL):5μLの「エキスパンドハイフィディリティ」緩衝液、15mMのMgCl2を有する10X(最終1.5mM)、0.75μLの「ハイフィディリティ」酵素混合物(最終2.6U)、滅菌水(qsp 25μL)。
− 二重鎖DNAを2分間94℃で変性させること;
− 変性(94℃、10秒)、ハイブリダイゼーション(50℃、15秒)および伸長(72℃、20秒)を4サイクル;
− 25サイクル:94℃で10秒、64℃で15秒、そして72℃で20秒;
− 72℃で7分間の最終伸長。
19個の各DNAを、ケモコンピテント(chemocompetent)細菌中への導入のためのTOPO−bluntクローニングキット(Invitrogen)のTOPOクローニングベクター中に連結させた(図20を参照のこと)。形質転換したクローンが選択され、DNA配列の全てがシークエンシングで確認された。
様々なPCR生成物の各々は、既に開口され平滑末端を有しカナマイシン耐性遺伝子を輸送するTOPO−BluntIIプラスミド中に取り込まれた。ケモコンピテントTop10細菌はこれらのプラスミドによって形質転換され、そしてLB/アガーディッシュ(100μg/mLのカナマイシン)上で培養した。ネガティブコントロールおよび他のコントロールとして機能する挿入断片のないTOPO−BluntIIプラスミド(1ngのPUC19プラスミド)を形質転換用のポジティブコントロールとして使用した。培養後、挿入断片を含むプラスミドまたはPUC19(ポジティブコントロール)によって形質転換された細菌のみが、選択的薬剤(抗生物質)の存在下で成長した。
クローニング結果から、プラスミドDNAの抽出を実施するために2〜10個のコロニーを増幅させた。各コンストラクトおよび各クローンにつき、約150ng/μLで100μLのプラスミドDNA量を得た。各精製に関して260nmでの吸収/280nmでの吸収の比率は1.8〜2の範囲に値を有し、これは調製物が純粋であることを証明している(1.8未満の値は、タンパク質混入を証明する)。
19個のコンストラクトを提供するために、19個の配列(1つの野生型および18個の変異型)各々を、マウスCD8α外部ドメインをコードする配列の下流に置いた。
pKSII−CD8αベクター(図22を参照のこと)を連続して制限酵素XbaIおよびNotIで消化し、挿入断片を取り入れることができた。一度消化が実施されると、プラスミドは脱リン酸化され、エタノールで沈殿し0.8%のアガロ−スゲル上で精製される。
XbaI−NotI制限酵素部位によって囲まれた様々な挿入断片をプラスミドと同様に同じ制限酵素で消化し、これらを取り込むことができた。
直線化したpKSII−CD8αプラスミドにDNAを挿入した:
キメラプラスミドが得られたことを確認するために、プラスミドDNAを2つの酵素、XhoI/NotIで消化し消化生成物の0.8%アガロ−スゲル上での泳動後、各突然変異体の様々なクローンをスクリーニングした。この二重の消化は、作成されたあらゆるキメラ遺伝子、すなわちCDTMと一致するCD8αを有するものを切除する。
発現ベクターpKSIIはこのサイズおよび制限酵素部位のため操作することは容易である一方で、真核細胞でのタンパク質発現はできない。それ故、pLPCX(Clontech Laboratories Inc.、図23を参照のこと)を選択したが、これはレトロウイルスのベクターを使用した形質移入および形質導入どちらによっても遺伝子を導入することができることを意味するものである。
A−HEH293T細胞での形質移入:
HEK293T真核細胞の形質移入を確認し変換された細胞のパーセンテージを測定するために、細胞にLacz遺伝子を含有するプラスミドを導入しX−Gal溶液中でインキュベートした。
a)ウエスタンブロット分析:
形質導入に由来する細胞およびエキソソーム可溶化物を、10%のSDS−PAGEゲル泳動、続いてPVDF膜(ポリフッ化ビニリデンジフロライド、イモビロンP、Millipore)上へのトランスファーにより分析した。次にこれらの膜を、一次抗ウサギCDTM血清、続いてペルオキシダーゼと結合した二次抗ウサギIgG抗体を使用して明らかにした。明らかにした後、これらの抗体を除去し同一の方法でしかしながら抗ウサギCD8α血清を使用してトランスファー膜を明らかにした。
細胞可溶化物では、キメラタンパク質の弱い発現のみ示したことが認められた。一方で、エキソソーム中では特定のキメラタンパク質が時折非常に大きく存在した。
抗CDTM血清での、31kDaへ移動しているバンドは野生型CD8α−CDTMコントロールのエキソソーム可溶化物中に存在し、一方これはネガティブコントロールによって遺伝子導入された細胞由来の可溶化物中には存在しなかった。このバンドは期待されるキメラタンパク質の特徴を示す。
抗CD8α血清で得られた結果のみ相互に同程度であった。抗CDTM血清で得られた結果を前述の結果を確認するためにのみ使用した。CDTMをコードする配列の変異に応じて、これらの結果はキメラタンパク質の発現およびエキソソームへのターゲティングにおける分散を示す。これは、タンパク質のエキソソームへのターゲティングを強固に阻害する変異に関して特に明らかである。当該突然変異体は、突然変異体KM8、KM13、DおよびKS8に関してであった。
キメラタンパク質の存在はまた、蛍光モノクローナル抗CD8抗体を使用して細胞蛍光測定法分析(FACscan)によって調べた。
本実験において、変異型またはマウスCD8αと結合した野生型CDTMの試験ペプチドを発現するためにキメラ遺伝子を構築した。アミノ酸または注目のCDTMのモチーフのこれらの変異はエキソソームへのターゲティングで重要であるアミノ酸およびコンセンサスモチーフを特定することを目的としたものであった。
膜受容体は、処置用分子の開発のための主な対象である。一般的に、薬剤の高処理スクリーニングは、特に培養下で細胞上に発現された複数の膜ドメインを有する受容体で実施される。細胞表面上での受容体の強い発現を得ることが困難であることに加え、この技術はロボットによるオートメーションに困難をもたらす。しかしながら、精製される遺伝子組換え受容体の使用は現在技術上想定できないので、現在これは唯一の解決策である。
HEK293T細胞の様々なpLPCXプラスミドでの形質導入は、キメラCxCR4/CDTMBLV、CxCR4(403)/CDTMBLVおよびCD4(403)/CDTMBLVを発現するために使用されてきた。ウエスタンブロット分析により、細胞可溶化物中のこれらの存在が示されてきた。
我々は、ペプチドの欠失とシステインのアラニンでの置換によって変異させたBLVのTMタンパク質のC末端部の断片がそれと融合した目的のペプチドまたはポリペプチドのエキソソームへの高いターゲティング特性を示すことを発見した。このエキソソームターゲティング特性にかかわるアミノ酸の分析で、このペプチドがESCRTの出芽機構のタンパク質と相互作用することを明らかにした。この機構が、膜貫通タンパク質(例えば、受容体)と相互作用し、さらに細胞質性を維持したままそれらが結合する膜と相互作用する細胞質タンパク質(Hrs、例えばウイルスカプシド)とも相互作用することが知られている。よって、我々は、2つの特性、1つが膜の内表面への結合、そしてもう1つがエキソソームターゲティング、が付加された細胞質性キメラまたは核タンパク質がエキソソームへと振り分けられるかどうか知りたかった。このために、我々は、この仮説(Covalys、NEB)を実証するために核酸代謝にかかわる細胞の内部タンパク質、すなわちSNAPタンパク質を使用した。
我々は、エキソソームへのターゲティングのための機構を有するBLV(ウシ白血病ウイルス)のTMタンパク質由来のペプチドCDTM15の相互作用についての我々の発見した特性と、c−Srcタンパク質のN末端断片の膜内ターゲティング特性を組み合わせたかった。よって、我々は、この機構のタンパク質とCDTMとの相互作用を我々が容易にするであろうと確信した。我々の試作品は、レポータータンパク質、SNAPタンパク質(CovalysおよびNEB)を組み込んだ。このタンパク質は、その他の目的のタンパク質で置き換えることができた。このために、我々はキメラタンパク質SSC(Src−SNAP−CDTMに関する;配列番号123;124)をコードするキメラ遺伝子Src−SNAP−CDTM(配列番号121;122)を作成した。
以下の5オリゴヌクレオチドをMWGによって合成した:
S1(5’GCCACCATGGGCAGCAGCAAGAGCAAGCCCAAGGAC3’)(配列番号108)、
S2(5’P−CCCAGCCAGCGCCGCCGCAAGTCTAGAGGCCCGGGAGGC3’)(配列番号109)、
AS1(5’GCCTCCCGGGCCTCTAGACTTG3’)(配列番号110)、
AS2(5’P−CGGCGGCGCTGGCTGGGGTCCTTGGGCTTGCTCTT3’)(配列番号111)、
AS3(5’P−GCTGCTGCCCATGGTGGC3’)(配列番号112)。
R1Src(GAATTCGCCACCATGGGCAGCAGCAAGAGCAAG)(配列番号113)とSrcNhe1(CATGCTAGCGCTGCCTCCCGGGCCTCTAGACTTTC)(配列番号114)。
NheSNAP(GGAGGCAGCGCTAGCATGGACAAAGACTGCGAAATGA)(配列番号115)、および
SNAPSbfAsc(GCGCGCCGCTTCCTGCAGGACCCAGCCCAGGCTTG)(配列番号116)。
SbfAscDCTM15(CCTGCAGGAAGCGGCGCGCCCCACTTCCCTGAAATC)(配列番号117)、および
DCTM15Not(GCGGCCGCTTCGAACTCGGTGCTGGCAGCAAGA)(配列番号118)。
先の3つのDNA断片をゲル上で精製する。マトリックスとしてのこれらの3つのDNAの混合物の増幅を、使用したPhusion DNA ポリメラーゼの供給業者であるFinnzymeの推薦する条件下で、それを使用して、プライマーR1SrcとDCTM15Not(前記を参照のこと)の存在下でおこなう。得られたDNAを、前述の3つのDNA一緒に融合する。
1)クローニング・ベクターPCR(登録商標)BluntII−TOPO(登録商標)へのPCR産物の連結反応
連結反応を、その端部にトポイソメラーゼI酵素を持っている線状化プラスミドベクターを用いて実行し(図6を参照のこと)、それによりリガーゼの関与なしに統合される挿入を可能にする。加えて、このベクターはその端部のいずれかに平滑末端があるので、挿入物には、連結できるように平滑末端がなければならない。形質転換体を選択するために、プラスミドには、カナマイシンに対する抗生物質抵抗性遺伝子がある。
TOP10ケモコンピテント細菌(10μL)を、TOPO/挿入物連結混合物の全体によって形質転換する。陽性形質転換対照(1ngのPUC19:アンピシリン耐性遺伝子を持つプラスミド)と陰性対照(挿入物を含まないTOPOプラスミド)があった。氷中での30分間のインキュベーション後に、熱ショックを42℃にて30秒間、混合物に適用する。そしてすぐに、氷中にチューブを戻す。次に、250μLのSOC培地(バクトトリプトン2%、バクト酵母抽出物0.5%、NaCl 0.05%、およびグルコース0.2%)を加え、それと慎重に均質化し、そして表現型発現までの時間、水浴中で37℃にて1時間インキュベートする。最終的に、150μLの懸濁液を、50μg/mLのカナマイシンを加えたLB(Luria Broth)/アガーの入ったディッシュ内に播種し、そして37℃にて24時間インキュベートする。ディッシュ内で、カナマイシン耐性遺伝子を取得した、よって目的の遺伝子を含むとは限らないが、クローニング・ベクターを持つコロニーが出現した。クローンを再び広げ、37℃にて24時間インキュベートした2番目のゲロースディッシュ上でカウントし、そして再播種したクローンの10mL(LB+100μMのカナマイシン)の液体培養を振盪しながら37℃にて16時間生じさせた。
細菌培養物を、3500rpm、4℃にて15分間遠心分離する。ペレットを250μLのA1再懸濁バッファー中に溶かす(plasmid DNA Purification Nucleospinキット(Macherey-Nagel))。細菌を、250μLのA2溶解バッファーを用いて周囲温度にて5分間溶解する。次に、300μLのA3中和バッファーを加え、そして拡散ペレットの製造を予防するために、転倒撹拌によって十分に混合することが重要である。チューブを11000rpm、4℃にて10分間遠心分離する。上清を、収集チューブ上に置いたカラムに通す;それを11000rpmにて1分間遠心分離する。500μLのA4洗浄バッファーで洗浄した後に、カラムを11000rpmにて2分間乾燥させる。50μLの溶出バッファーを通し、そして溶出液をエッペンドルフチューブで回収する。得られたDNAを、260nmの分光測光によってアッセイする。
得られたプラスミドDNAが、実際は再結合されているかどうか確かめるために、そのプラスミドを特異的な制限酵素(Biolabs(登録商標))、EcoRIで消化する(EcoRIは挿入部位を囲んでいる)。約200ngのそれぞれのプラスミドを、4単位の酵素によって消化する。1μLのNEB1 10Xバッファーと滅菌水をこれに加え、10μLの終量を得た。消化を37℃にて1時間おこなう。2%のアガロースゲル上で良好なクローンを特定した後に、1.5μgのプラスミドDNAを、シークエンシングのためにEurofins MWG Operonに送る。これが、加えた制限部位が、突然変異と同様に実際に存在しているかどうかチェックすることによって、それぞれの配列の完全性の確認を可能にする。いくつかのクローンを得、それらのプラスミドDNAを分析し、そして配列決定した。2つのプラスミドを保有する:第1のSrc−SNAP−CDTMは、予想されたキメラ遺伝子を表し;第2のD−SNAP−CDTMは、最後のPCR中に生じなければならなかったSrc断片の一部に欠失がある配列に相当する。D−SNAP−CDTMDNAによってコードされたタンパク質もまた、ミルスチル化可能な位置にグリシンを含んでいるが、膜内固定特性を補強する塩基性アミノ酸の一部を消失している。
1)発現ベクターの調製
ベクターpCDNA3.1を、制限酵素EcoR1とNotIによって消化し、次に脱リン酸し、そしてフェノール/クロロホルムで抽出する。
連続したEcoR1−NotI消化:挿入物Src−SNAP−CDTMとD−SNAP−CDTMを含む2μgのpTopo DNAプラスミドを、挿入物を取り囲む2つの制限酵素、すなわちEcoR1とNotIで連続して消化する。65℃にて20分間の酵素の不活性化後に、DNAをエタノールで沈殿させ、そして20μLのTE中に再懸濁する。そして、それを−20℃にて保存した。
挿入物断片を、2%の低融解アガロースゲル上で抽出し、そしてNucleospinキットを使用してカラム精製した(Nucleospin Extract IIR Kit、MACHEREY-NAGEL)。終量は50μLである。
35ngの脱リン酸ベクターを、チューブ内、約3/1(分子対分子)の挿入/ベクター比で挿入物と混ぜる。以下のものを加える:1μLの10Xリガーゼバッファー、滅菌水(qsp 10μL)、および1UのT4 DNAリガーゼ(Biolabs(登録商標))。陰性対照を、同量のTE1Xで挿入物の体積を置き換えることによって作り出した。混合物を、周囲温度にて一晩インキュベートする。
この形質転換は熱ショックに基づく。200μLのDH5α細菌を連結反応生成物に加える;氷中で30分間;42℃にて2分間;氷中で5分間;800μLのLB培地の添加;振盪しながら37℃にて1時間のインキュベーション;LB/アガー/アンピシリン・ディッシュ(50μg/mL)上に100μLを播種、そしてオーブン内、37℃にて16時間インキュベーション。
EcoR1−NotI消化によるMidipreparationsと検定を、トランスフェクションとタンパク質発現ステップのために、良好なクローンを選択し、そしてプラスミドDNAのストックを準備するためにおこなう。
1)細胞培養
HEK 293T真核細胞(ヒト胚腎臓)を、フラスコ内で10%の胎児子ウシ血清(FCS)と20μg/mLの濃度のゲンタマイシンを含むDMEM培地(ダルベッコ変法イーグル培地)中、5%のCO2、37℃にて培養する。
抗生物質を含まないDMEM+4mLの10%FCS中に1ウェルあたり0.5×106個のHEK 293T細胞を、6ウェルプレート内に播種する。5%のCO2中で37℃にて24時間の培養後に、細胞を90%コンフルエントにし、そして500μLの培地中、1μgの目的のプラスミドと2μLのJetPEI(PolyPlus(登録商標))の間に形成された複合体によって形質移入する;DNAはエンドサイトーシスによって取り込まれる。6時間のインキュベーション後に、培地を血清中に含まれるエキソソームを含んでいないFCSによる10%のDMEMによって置き換える(42000rpmにて18時間の超遠心分離によって取り除いた(Ti45ローター、Beckman))。形質移入の48時間後に、上清を取り出して生じたエキソソームを回収し、そして細胞タンパク質を得るために細胞を溶解する。
細胞培地を回収すると、それを1400rpmにて10分間遠心分離して、培地から細胞を取り除く。細胞残屑を排除するために、上清を4℃にて10000rpmで10分間遠心分離する。上清を回収し、20%のショ糖を含むTNEのクッションをチューブの底に注ぎ入れ、そしてTi50ローターにより(Beckman)42000rpm、4℃にて2時間、超遠心分離した。そして、純粋なエキソソームのペレットを100μLのPBS中に溶かす。
細胞を4℃にてPBSで洗浄し、次にRIPAバッファー(TNE 1X、NP40 0.5%、アプロチニン 20μg/mL、ロイペプチン 20μm、無菌のH2O、フェニルメチルスルホニルフルオライド 0.2mM)で溶解する。溶解物を14,000rpm、4℃にて20分間遠心分離し、そして上清を回収する。
サンプル(細胞タンパク質抽出物20μgとエキソソーム溶解物2μg)を10%のポリアクリルアミドゲル上で60mAにて1時間半分離し、次に、メタノール浴で活性化し、水そしてTBST(Tris塩基 20mM pH7.4;NaCl 0.15M;Tween 0.5%)ですすいだPVDF膜(重合ビニリデンジフルオライド、Immobilon-P、Millipore)上に冷凍室内、50mAにて一晩、移し取った。そして、その膜をTBST中、5%の粉ミルクで1時間、飽和させる。次に、それを一次抗体:研究室で準備した抗ウサギCDTM血清、と一緒に4℃にて一晩インキュベートする。次に、TBSTでそれぞれ5分、3回洗浄し、次に二次抗体であるペルオキシダーゼ(Jackson ImmunoResearch)と結合させた抗ウサギIgGと一緒に膜を1時間インキュベートする。それをTBST中で再び洗浄し、次に、ECL(高化学発光、Amersham)の溶液中に浸漬したワットマン紙上に乗せる。Lumi-imager F1カメラ(Roche(登録商標))で像を明らかにする。
Claims (39)
- 適当な真核細胞中で発現されるときに、膜小胞、特にエキソソームに結合して分泌され得るキメラポリペプチドであって、以下のドメイン:
(i)目的のペプチドまたはポリペプチド;
(ii)膜内標的ドメインであって、前記膜内標的ドメインと細胞膜もしくは小胞膜との間の固定のための、および/または相互作用のための、1もしくは2以上の分子を介して、本発明のキメラポリペプチドが前記細胞膜もしくは小胞膜に固定されることを可能とする、前記膜内標的ドメイン;並びに
(iii)真核細胞において前記キメラポリペプチドを膜小胞、特にエキソソーム形成小胞へ、および/または前記膜小胞の形成に関与する1または2以上の細胞区画へ差し向けることができる膜タンパク質の細胞質ドメイン(CD)、或いは、前記CDドメインの変異誘導体であって、基準CDドメインの配列の1または2以上の残基の置換、欠失および/または挿入によって規定され、そして前記CDドメインの前記差し向け能力を保存している前記変異誘導体、ここで前記CDドメインまたはその変異誘導体は、少なくとも1つのモチーフYxxLまたはDxxL、およびモチーフPxxPを含み、ここでxは任意の残基を表わし、そしてY、L、D、およびPはそれぞれチロシン、ロイシン、アスパラギン酸、およびプロリン残基を表わす;
を含んでなるか、またはこれらから成ることを特徴とし;そして、
前記キメラポリペプチド内に存在するドメイン、特にドメイン(i)、(ii)、および(iii)は細胞質ドメインまたは核ドメインであり、かつ、前記キメラポリペプチドは小胞体内への取り込まれるためのシグナルペプチドを欠損していると理解される、前記キメラポリペプチド。 - 前記膜内標的ドメインが、表在性膜タンパク質のものであるか、あるいは、前記膜内標的ドメインの変異誘導体であって、基準膜内標的ドメインの配列の中の1もしくは2以上の残基の置換、欠失、および/または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている前記変異誘導体である、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
- 前記ドメイン(i)〜(iii)が、ポリペプチドのN末端部からC末端部に向かって、以下の:(ii)−(i)−(iii)、または(ii)−(iii)−(i)、または(i)のN末端領域−(ii)もしくは(iii)−(iii)もしくは(ii)−(i)のC末端領域の順で連続して配置されている、請求項1または2に記載のキメラポリペプチド。
- 前記モチーフPXXPが、モチーフPSAP(配列番号88)またはPTAP(配列番号89)である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記CDドメインが、2つまたは3つのモチーフYxxL(xは任意の残基を表す)を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記CDドメインまたはCDドメインの変異誘導体が、以下の:
・YINL、YSHLおよびDYINLから選択されるモチーフYxxLまたはDYxxLの少なくとも1つ;および/または
・PSAPまたはPTAPから選択されるモチーフPxxPの少なくとも1つ、
を含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。 - 前記膜内標的ドメインは、それとの相互作用によって脂質膜に固定されることを可能にする配列、特にコンセンサス、例えば配列FYVE、および/または、脂質、特に脂肪酸、より具体的にはミリスチン酸、パルミチン酸、ゲラニル−ゲラニルまたはファルネシルを介して脂質膜に固定されることを可能にする配列、特にコンセンサス、を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項1〜6のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- ミリスチン酸、パルミチン酸、またはゲラニル−ゲラニルが結合すること、特にミリスチン酸が結合することを可能にするコンセンサス配列が、以下の配列:M−G−X1−X2−X3−S/C(配列中、X1、X2、およびX3は独立して任意の残基を示し、そしてM、SおよびCはそれぞれメチオニン、セリンおよびシステインを示す)を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項7に記載のキメラポリペプチド。
- 配列中:
−X1がC、SおよびLから選択され;および/または
−X2がS、I、V、MおよびLから選択され;および/または
−X3がK、Q、H、F、CおよびSから選択される、
請求項8に記載のキメラポリペプチド。 - 前記膜内標的ドメインが、複数の塩基性アミノ酸残基、特に残基K、RおよびHから選択される複数の残基、より好ましくは残基KおよびRから選択され、そしてより一層好ましくは残基Kを含んでなる、請求項1〜9のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記膜内標的ドメインが:
・Srcファミリーのタンパク質、特にタンパク質Src、Yes、Lyn、Fyn、Lck、Blk、Fgr、HckおよびYrkから選択されるタンパク質に由来するか;または
・Srcファミリーのタンパク質、特にタンパク質Src、Yes、Lyn、Fyn、Lck、Blk、Fgr、HckおよびYrkから選択されるタンパク質の膜内標的ドメインの変異誘導体であって、前記膜内標的ドメインの配列の中の1もしくは2以上の残基の置換、欠失、および/または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている、前記変異誘導体
である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。 - 前記膜内標的ドメインが:
・以下の配列:M−G−x−x−K−S/C−K−x−KおよびM−G−x−x−K−S/C−K−x−K−x−x−x−x−R−R−R(配列中、xは任意の残基を示す)から選択される配列を含んでなるか、またはそれらから成るか;または
・この配列の変異誘導体であって、この配列の中の1もしくは2以上の残基の置換、欠失、および/または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている前記変異誘導体から成るか;または
・以下の配列:M−G−S−S−K−S−K−P−K−D−P−S−Q−R−R−RまたはM−G−S−S−K−S−K−P−K−D−P−S−Q−R−R−R−K−S−R−G−P−G−Gを含んでなるか、またはそれらから成るか;または
・前記配列M−G−S−S−K−S−K−P−K−D−P−S−Q−R−R−RまたはM−G−S−S−K−S−K−P−K−D−P−S−Q−R−R−R−K−S−R−G−P−G−Gの変異誘導体であって、この配列の中の1もしくは2以上の残基の置換、欠失、および/または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている前記変異誘導体から成る、請求項1〜11のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。 - 2つの連続したドメインを連結する少なくとも1つのリンカーであって、例えば、ペプチドまたはポリペプチドである前記リンカーをさらに含んでなる、請求項1〜12のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記CDドメインまたはその変異誘導体が、配列KCLTSRLLKLLRQを欠損しているおよび/または配列PCPを欠損している、請求項1〜13のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記CDドメインの前記変異誘導体の配列が、連鎖KCLTSRLLKLLRQを欠損している元のCDドメインの配列と、少なくとも60または70%、特に少なくとも80%、90%、95%の類似性または同一性を有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記CDドメインまたはその変異誘導体の配列が、以下の配列:
PxxPxxxxxxxxxxxxYxxL;
PxxPxxxxxxxxxxxDYxxL;
PxxPxxYxxxxxxxxxYxxL;
PxxPxxYxxxxxxxxDYxxL;
PxxPExYxxLxPxxPDYxxL;
PxxPxnYxxL;
PxxPxnDYxxL;
PxxPxnYxnYxxL;
PxxPxnYxnDYxxL;
PxxPExnYxxLxnPxxPDYxxL;
PxxPxxxxPxxPxxxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxL;
PxxPxnPxxPxnYxxLxnPxxPEXnYxxLxnPxxPDYxxL;
PxxPxxxxPxxPxxxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxLxxxx;および
PxxPxnPxxPxnYxxLxnPxxPEXnYxxLxnPxxPDYxxLxxxx、
(配列中、xおよびxnはそれぞれ任意の残基および任意の1または2以上の残基を表わし、そして配列中、モチーフPxxPのうちの少なくとも1つがモチーフPSAPまたはPTAPである)から選択される配列を含んでなるか、またはそれらから成る、請求項1〜15のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。 - 前記ドメイン(iii)が、レトロウイルス、特にウシ白血病ウイルス(BLV)の膜貫通型タンパク質(TM)のCDドメイン、またはこのドメインの変異誘導体である、請求項1〜16のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記CDドメインが、BLVのTMタンパク質のCDドメインであって、配列番号6の配列を有する、請求項1〜17のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記目的のペプチドまたはポリペプチドが、以下の:
・細胞質タンパク質の1もしくは2以上のドメイン、またはこの(これら)ドメインの1もしくは2以上の断片;および/または
・核タンパク質の1もしくは2以上のドメイン、またはこの(これら)ドメインの1もしくは2以上の断片
を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。 - 前記目的のペプチドまたはポリペプチドが、病原体、病原性物質、抗腫瘍抗原、細胞質抗原、リガンド受容体、特に多数の膜ドメインを有する受容体、例えば、7回膜貫通型ドメインを持つ受容体、サイトカイン受容体またはその断片、毒素または毒素部分、特有の活性を有する化合物、例えば酵素、または例えば核酸に結合するポリペプチドに由来し、前記病原体が、例えば、ウイルス、細菌または寄生虫である、請求項1〜19のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 薬剤として使用される、特に細菌、ウイルス寄生虫の感染、あるいは腫瘍またはその他の病状、例えば、機能的または代謝的な欠陥の予防および/または処置のために薬剤として使用される、請求項1〜20のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 追加のキメラポリペプチドと組み合わせて使用されることを特徴とし、ここで前記追加のキメラポリペプチドは、適当な真核細胞中で発現されるときに、膜小胞、特にエキソソームと一緒になって分泌され得、かつ、前記追加のキメラポリペプチドが、以下のドメイン:
・目的のペプチドまたはポリペプチド;
・膜貫通型ドメイン;および
・膜タンパク質の細胞質ドメイン(CD)または前記CDドメインの変異誘導体、ここで前記CDドメインまたはその変異誘導体は、請求項1、4〜6、および14〜18のいずれか1項に記載のものである;
を含んでなるか、またはこれらから成り、ここで前記追加のキメラポリペプチドのCDドメインまたは変異誘導体が、請求項1〜22のいずれか1項に記載のキメラポリペプチドのCDドメインまたはCDドメインの変異誘導体と同一であるか、または異なることを特徴とする、請求項21に記載のキメラポリペプチド。 - 追加のキメラポリペプチドにおいて、以下のドメインが、ポリペプチド内でN末端部からC末端部に向かって以下の順:目的のペプチドまたはポリペプチド−膜ドメイン−細胞質ドメイン(CD)または変異誘導体、で連続して配置されている、請求項21または22に記載のキメラポリペプチド。
- 免疫付与における使用のための、特にインビボで、宿主、特に哺乳動物のヒト、ヒト以外の哺乳動物または鳥類で、目的のペプチドまたはポリペプチドが由来する腫瘍、ウイルス、細菌または寄生虫に対する体液性応答および/または細胞応答を誘発または促進するためのキメラポリペプチドであって、適当であれば、請求項22または23に記載された追加のキメラポリペプチドと組み合わせて使用される、請求項1〜23のいずれか1項に記載のキメラポリペプチド。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載のキメラポリペプチドおよび/またはこのポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物、そして適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドおよび/またはこの追加のキメラポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物を含んでなる膜小胞であって、この(これらの)分解産物は、適当であれば、主要組織適合遺伝子複合体I型またはII型の分子と結合する、前記膜小胞。
- エキソソームであることを特徴とする、請求項25に記載の膜小胞。
- 追加のキメラポリペプチドの、目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいはこの目的のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも1つの断片が、前記膜小胞の外面に、部分的にまたは完全に曝露される、請求項25または26に記載の膜小胞。
- 活性成分が、請求項25〜27のいずれか1項に記載の1もしくは2以上の膜小胞、ならびに適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドおよび/またはこの追加のキメラポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物を含んでなる、1もしくは2以上の膜小胞、特に1もしくは2以上のエキソソームを含んでなる、治療用組成物。
- (例えば、酵素の追加によって)宿主の標的細胞の処理に使用される、および/または宿主(例えば、腫瘍細胞)中の標的細胞を破壊するために使用される、および/または(例えば、本発明のキメラポリペプチドの、目的のペプチドまたはポリペプチドに結合した核酸を検出することによって)宿主の診断を実施するために使用される、および/または、腫瘍に対する、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫感染に対する予防および/または処置のために使用される、特にインビボで、宿主中で、1または2以上の目的のペプチドまたはポリペプチドが由来する腫瘍、またはウイルス、細菌もしくは寄生虫に対する体液性応答および/または細胞性応答を誘発または促進するために使用される、請求項28に記載の治療用組成物。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載のキメラポリペプチドをコードすることを特徴とする、ならびに適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドをコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
- 以下の:
・請求項30に記載のポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成ることを特徴とする核酸、特にDNA;および
・薬学的に許容され得る支持体、希釈剤またはビヒクル;および
・適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成ることを特徴とする核酸、特にDNA
を含んでなる、治療用組成物。 - 薬剤としての使用のための、特に細菌、ウイルス、寄生虫の感染、または腫瘍の予防および/または処置に使用される、特にインビボで、宿主、特にヒトまたはヒト以外の哺乳動物、あるいは鳥類で、ドメイン(i)が由来する腫瘍、あるいはウイルス、細菌または寄生虫に対する体液性応答および/または細胞性応答を誘発または促進するために使用され、適当であれば、薬学的に許容され得る支持体、希釈剤もしくはビヒクルおよび請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成る核酸、特にDNAを含んでなる免疫原性組成物と組み合わせて使用される、請求項31に記載の治療用組成物。
- 組換え型のエキソソーム産生細胞、特に免疫系の細胞、より具体的にはマスト細胞、リンパ球、特にTおよびBリンパ球、ならびに樹状細胞、特にランゲルハンス細胞から選択される免疫系の細胞であって:
・前記細胞が、請求項30に記載の1もしくは2以上のポリヌクレオチド、および適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドをコードする1もしくは2以上のポリヌクレオチドと再結合されることを特徴とするか;あるいは
・前記細胞が、請求項25〜27のいずれか1項に記載の膜小胞、ならびに適当であれば、請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチドおよび/またはこの追加のキメラポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物を含んでなる1もしくは2以上の膜小胞、特に1もしくは2以上のエキソソームを吸収することを特徴とする、前記細胞。 - 前記目的のペプチドもしくはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドの断片、あるいは請求項22または23に記載の追加のキメラポリペプチド、および/またはこの追加のキメラポリペプチドの1もしくは2以上の分解産物と相互作用することができる特定のパートナーのインビトロでの検出のための、請求項27に記載の1もしくは2以上の膜小胞の使用。
- 目的のペプチドまたはポリペプチドおよび/またはこの目的のペプチドまたはポリペプチドの分解産物を含んでなる、膜小胞、特にエキソソームのインビトロでの産生方法であって、適当であれば、この分解産物は主要組織適合遺伝子複合体の分子に結合され、以下のステップ:
a)請求項30に記載の1もしくは2以上のポリヌクレオチドであって、前記目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを、エキソソーム産生細胞、特に293T細胞、または免疫系の細胞、より具体的にはマスト細胞、リンパ球、特にTおよびBリンパ球、ならびに樹状細胞、特にランゲルハンス細胞から選択される免疫系の細胞へ導入し、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるポリペプチドおよび/またはこのポリペプチドの分解産物を含んでなる、請求項25〜27のいずれか1項に記載の1もしくは2以上の膜小胞とエキソソーム産生細胞とを接触させ;
b)前記エキソソーム産生細胞を培養し;
c)前記エキソソーム産生細胞によって産生される膜小胞、特にエキソソームを回収すること
を含んでなる、前記方法。 - ステップa)とb)の間に中間ステップをさらに含んでなり、この間にエキソソームの分泌を誘発および/または増加するために、あるいは特定の細胞タンパク質、例えば、タンパク質ICAMに関してエキソソーム組成物で特異性を誘発するために、細胞が選択および/または刺激されることを特徴とする、請求項34に記載の方法。
- 膜小胞、特にエキソソームの表面で発現される目的の1もしくは2以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするポリクローナル血清を調製するための方法であって、以下のステップ:
a)請求項25〜27のいずれか1項に記載の膜小胞、請求項28、29または31のいずれか1項に記載の組成物、または請求項30に記載のポリヌクレオチドを、アジュバントと結合させてまたは結合させずに、ヒト以外の動物へ、適当であれば繰り返し投与し;そして
b)1または2以上の目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができる、形成された抗体を回収すること
を含んでなる、前記方法。 - 膜小胞、特にエキソソーム内またはその表面に発現される1もしくは2以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を調製するための方法であって、以下のステップ:
a)請求項25〜27のいずれか1項に記載の膜小胞、請求項28、29または31のいずれか1項に記載の組成物、あるいは請求項30に記載のポリヌクレオチドを、適当であればアジュバントと組み合わせて投与された、および適当であれば繰り返し投与がなされた、(ヒトまたはヒト以外の)宿主、例えばBalb/cマウスから得られる脾臓細胞を、ミエローマ細胞と融合し;
b)抗体の産生が可能な条件下でハイブリドーマを培養および選択し;
c)1または2以上の目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を回収すること
を含んでなる、前記方法。 - 目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドの断片と相互作用する分子をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、以下のステップ:
a)請求項27に記載の膜小胞を、前記目的のペプチドまたはポリペプチドと相互作用することができる1もしくは2以上の分子と接触させ;
b)前記目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドの断片と、前記1または2以上の分子との間の任意の相互作用を検出すること
を含んでなる、前記方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR09/04576 | 2009-09-24 | ||
FR0904576A FR2950350B1 (fr) | 2009-09-24 | 2009-09-24 | Nouveaux polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leurs utilisations |
PCT/FR2010/052006 WO2011036416A1 (fr) | 2009-09-24 | 2010-09-23 | Nouveaux polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leurs utilisations |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013505713A true JP2013505713A (ja) | 2013-02-21 |
JP2013505713A5 JP2013505713A5 (ja) | 2013-04-25 |
JP5932647B2 JP5932647B2 (ja) | 2016-06-08 |
Family
ID=42107419
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012530319A Active JP5932647B2 (ja) | 2009-09-24 | 2010-09-23 | エキソソームに結合した目的のポリペプチドの分泌を可能にする新規キメラポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにその使用 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9611481B2 (ja) |
EP (1) | EP2480672B8 (ja) |
JP (1) | JP5932647B2 (ja) |
CA (1) | CA2775151C (ja) |
FR (1) | FR2950350B1 (ja) |
WO (1) | WO2011036416A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019528674A (ja) * | 2016-09-30 | 2019-10-17 | セレックス ライフ サイエンシズ,インコーポレーテッド | タンパク質をロードしたエキソソームを含む組成物、並びにその調製及び送達のための方法 |
US11872193B2 (en) | 2015-05-04 | 2024-01-16 | Ilias Biologics Inc. | Compositions containing protein loaded exosome and methods for preparing and delivering the same |
JP7562682B2 (ja) | 2020-01-27 | 2024-10-07 | マントラ バイオ,インコーポレイテッド | キメラ小胞局在化部分を含む非天然発生の小胞、その産生方法、およびその使用 |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX2015011931A (es) * | 2013-03-15 | 2016-04-07 | Novavax Inc | Expresion mejorada de proteinas de picornavirus. |
US10538570B2 (en) * | 2013-09-30 | 2020-01-21 | Northwestern University | Targeted and modular exosome loading system |
PL228341B1 (pl) * | 2014-04-21 | 2018-03-30 | Bio Ventures Inst Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia | Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu |
WO2016138525A1 (en) * | 2015-02-27 | 2016-09-01 | University Of Washington | Polypeptide assemblies and methods for the production thereof |
SI3672614T1 (sl) | 2018-11-16 | 2022-04-29 | Codiak Biosciences, Inc. | Proizvedeni zunajcelični vezikli in njihova uporaba |
IT201900000651A1 (it) | 2019-01-16 | 2019-04-16 | Pastore Lucio | Tecnologia di trasferimento genico |
SG11202109587TA (en) | 2019-03-21 | 2021-10-28 | Codiak Biosciences Inc | Extracellular vesicle conjugates and uses thereof |
BR112021020668A2 (pt) | 2019-04-17 | 2022-01-11 | Codiak Biosciences Inc | Composições de exossomos e aav |
CN114173807B (zh) * | 2019-09-02 | 2024-03-19 | 庆北大学校产学协力团 | 包含il-2表面表达-细胞外囊泡作为活性成分的用于预防或治疗癌症的组合物 |
WO2021144363A1 (en) | 2020-01-14 | 2021-07-22 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antigenic reactivity of a peptide mimicking the glycan loop of flaviviruses envelope protein |
CN115443124A (zh) | 2020-02-05 | 2022-12-06 | 戴尔戴莫生物医疗有限公司 | 人工突触 |
WO2021184021A1 (en) | 2020-03-13 | 2021-09-16 | Codiak Biosciences, Inc. | Extracellular vesicle-aso constructs targeting pmp22 |
WO2021216615A1 (en) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | The General Hospital Corporation | Highly-networked coronavirus immunogen composition |
WO2021237100A1 (en) | 2020-05-21 | 2021-11-25 | Codiak Biosciences, Inc. | Methods of targeting extracellular vesicles to lung |
EP4198042A4 (en) * | 2020-08-11 | 2024-09-25 | Kyungpook Nat Univ Ind Academic Coop Found | PEPTIDE WITH SELECTIVE BINDING TO EXOSOME FROM CANCER CELLS AND USES THEREOF |
EP3973985A1 (en) * | 2020-09-29 | 2022-03-30 | Ciloa | Extracellular vesicles harboring a spike protein, nucleic acids for producing the same, and method of immunizing a subject against sars-cov-2 using the same |
CN113480666B (zh) * | 2021-08-13 | 2024-01-26 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | Ca153融合蛋白及其制备方法和ca153检测质控品或校准品 |
WO2023222890A1 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Ciloa | Reversible loading of proteins in the lumen of extracellular vesicles |
WO2024097893A2 (en) * | 2022-11-02 | 2024-05-10 | Pioneer Biolabs, Llc | Systems and methods for single cell detection of protein secretion |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009115561A1 (fr) * | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Centre National De La Recherche Scientifique | Polynucléotides et polypeptides chimériques permettant la sécrétion d'un polypeptide d'intérêt en association avec des exosomes et leur utilisation pour la production de compositions immunogènes |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003016522A2 (en) * | 2001-08-17 | 2003-02-27 | Anosys, Inc. | Methods and compounds for the targeting of protein to exosomes |
US20050042272A1 (en) | 2002-03-14 | 2005-02-24 | Yafei Hou | Vesiles derived from t cells, production and uses |
JP4939926B2 (ja) * | 2003-02-14 | 2012-05-30 | アノシス・インコーポレーテッド | 抗体を生成し抗体レパートリーをスクリーニングするための方法とコンパウンド |
-
2009
- 2009-09-24 FR FR0904576A patent/FR2950350B1/fr active Active
-
2010
- 2010-09-23 WO PCT/FR2010/052006 patent/WO2011036416A1/fr active Application Filing
- 2010-09-23 JP JP2012530319A patent/JP5932647B2/ja active Active
- 2010-09-23 US US13/497,779 patent/US9611481B2/en active Active
- 2010-09-23 CA CA2775151A patent/CA2775151C/fr active Active
- 2010-09-23 EP EP10769025.7A patent/EP2480672B8/fr active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009115561A1 (fr) * | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Centre National De La Recherche Scientifique | Polynucléotides et polypeptides chimériques permettant la sécrétion d'un polypeptide d'intérêt en association avec des exosomes et leur utilisation pour la production de compositions immunogènes |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN5012017212; NOVAKOVIC S: 'DILEUCINE AND YXXL MOTIFS IN THE CYTOPLASMIC TAIL OF THE BOVINE LEUKEMIA VIRUS以下備考' JOURNAL OF VIROLOGY V78 N15, 20040801, P8301-8311, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY * |
JPN5012017213; DE GASSART A: 'EXOSOMAL SORTING OF THE CYTOPLASMIC DOMAIN OF BOVINE LEUKEMIA VIRUS TM ENV PROTEIN' CELL BIOLOGY INTERNATIONAL V33, 20080101, ACADEMIC PRESS * |
JPN5012017214; REUTHER G W: 'ANALYSIS OF FUNCTION AND REGULATION OF PROTEINS THAT MEDIATE SIGNAL TRANSDUCTION 以下備考' METHODS IN ENZYMOLOGY V327, 2000, P331-350 * |
JPN5012017215; SILVERMAN LAUREN: 'LYSINE RESIDUES FORM AN INTEGRAL COMPONENT OF A NOVEL NH2-TERMINAL MEMBRANE 以下備考' JOURNAL OF CELL BIOLOGY V119 N2, 1992, P415-425 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11872193B2 (en) | 2015-05-04 | 2024-01-16 | Ilias Biologics Inc. | Compositions containing protein loaded exosome and methods for preparing and delivering the same |
JP2019528674A (ja) * | 2016-09-30 | 2019-10-17 | セレックス ライフ サイエンシズ,インコーポレーテッド | タンパク質をロードしたエキソソームを含む組成物、並びにその調製及び送達のための方法 |
JP7562682B2 (ja) | 2020-01-27 | 2024-10-07 | マントラ バイオ,インコーポレイテッド | キメラ小胞局在化部分を含む非天然発生の小胞、その産生方法、およびその使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2775151A1 (fr) | 2011-03-31 |
EP2480672B8 (fr) | 2017-03-22 |
EP2480672B1 (fr) | 2016-12-28 |
US9611481B2 (en) | 2017-04-04 |
FR2950350A1 (fr) | 2011-03-25 |
CA2775151C (fr) | 2019-01-22 |
US20120321653A1 (en) | 2012-12-20 |
WO2011036416A1 (fr) | 2011-03-31 |
EP2480672A1 (fr) | 2012-08-01 |
FR2950350B1 (fr) | 2013-12-13 |
JP5932647B2 (ja) | 2016-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5932647B2 (ja) | エキソソームに結合した目的のポリペプチドの分泌を可能にする新規キメラポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにその使用 | |
JP5727361B2 (ja) | エキソソームに結合して目的のポリペプチドの分泌を可能にするキメラポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びに免疫原性組成物の産生におけるこれらの使用 | |
CN101321781A (zh) | 一种核苷酸疫苗 | |
KR20160055164A (ko) | 면역원성 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (ΜERS-CoV) 조성물 및 방법 | |
CN112930192A (zh) | 尼帕病毒免疫原及其用途 | |
JP2010540674A (ja) | Hiv特異抗体に基づくhiv予防ワクチン | |
CA3171092A1 (en) | Selectable marker proteins, expression vectors, for the production of virus-like particles for therapeutic and prophylactic applications | |
CN112552413B (zh) | 新型冠状病毒重组蛋白亚单位疫苗 | |
US20240252617A1 (en) | Coronavirus spike protein designs, compositions and methods for their use | |
US20240294580A1 (en) | Compositions and methods of ribonucleic acid respiratory syncytial virus (rsv) vaccines | |
CN114213548A (zh) | 同时诱导抗多种病毒的免疫应答的方法 | |
JP2023523423A (ja) | SARS-CoV-2に対するワクチン及びその調製物 | |
CN111148528A (zh) | 流感疫苗 | |
CN117279659A (zh) | 人偏肺病毒疫苗 | |
CN113801206A (zh) | 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法 | |
US20240092840A1 (en) | Vaccine formulation comprising recombinant overlapping peptides and native proteins | |
US20240307524A1 (en) | Coronavirus vaccines | |
JP4549666B2 (ja) | 抗体の製造方法 | |
WO2024073005A2 (en) | Exosome display compositions | |
KR20230112691A (ko) | 바이러스 감염을 치료하기 위한 방법 및 조성물 | |
WO2022165085A1 (en) | Kits and methods for nucleic acid delivery | |
WO2021097254A1 (en) | Hiv immunogens, vaccines, and methods related thereto | |
JP2024537847A (ja) | COVID19 mRNAワクチン | |
TW202217000A (zh) | Sars—cov—2 mrna結構域疫苗 | |
Barbuto | Induction of Innate and Adaptive Immunity In Vivo by Selective Antibody Targeting of Poly dA: dT and Antigen to Dendritic Cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130308 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130917 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150106 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150220 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150703 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160229 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160329 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160428 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5932647 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |