CN115443124A - 人工突触 - Google Patents

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CN115443124A
CN115443124A CN202180025775.2A CN202180025775A CN115443124A CN 115443124 A CN115443124 A CN 115443124A CN 202180025775 A CN202180025775 A CN 202180025775A CN 115443124 A CN115443124 A CN 115443124A
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CN
China
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domain
vesicle
engineered
protein
poi
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Application number
CN202180025775.2A
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米奇·彭特科斯特
沃伊切赫·巴托夫斯基
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Daldemor Biomedical Co ltd
Original Assignee
Daldemor Biomedical Co ltd
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Abstract

本文描述了与人工突触的产生和治疗应用有关的组合物和技术。人工突触是工程化细胞外囊泡，包括外泌体，在其表面上掺入了粘性结合剂，以锚定针对生物靶标(诸如受体)的信号传导结构域。这些工程化添加剂可以被组织在哺乳动物细胞中表达的遗传载体构建体中，其中所述粘性结合剂附着于细胞外囊泡诸如外泌体上，从而呈递它们连接的信号传导结构域，所述信号传导结构域被受体细胞迅速吸收。人工突触采用细胞外囊泡的标志性生物物理和生物化学特征，从而允许快速部署和扩大规模。重要的是，这种策略可以允许动力学上有利的信号产生和信号传播。例如，这包括增加激动剂呈现的密度，以支持受体聚类–传统受体靶向策略的繁重障碍。

Description

人工突触
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年2月5日提交的美国临时申请号US 62/970,374的权益，将其内容通过引用完整并入本文。
技术领域
本发明涉及人工突触或细胞外囊泡的产生，其包括被工程化以递送信号传导的细胞外囊泡的特征，用于治疗用途，包括免疫疾病和癌症的治疗。
背景技术
细胞外囊泡(EV)通过将微小RNA、脂质和蛋白质转移到邻近细胞，在细胞间通讯中起关键作用。然而，在本领域中仍然非常需要灵活和动态的平台，其中特定的生物信号可以被可靠地靶向而没有脱靶效应，并且提供稳健的细胞响应以实现治疗效果，诸如调节炎症。然而，在本领域中仍然非常需要灵活和动态的平台，其中特定的生物信号可以被可靠地靶向而没有脱靶效应，并且提供稳健的细胞响应以实现治疗效果，例如调节炎症。
发明内容
本文提供的组合物和方法部分地基于这样的发现，即，细胞外囊泡可用于表达可调节生物信号产生的工程融合多肽。这些工程囊泡，也称为人工突触，采用了细胞外囊泡的标志性生物物理和生物化学特征，但其进一步被工程化为具有囊泡靶向结构域(例如，粘性结合剂)和信号传导结构域，所述结构域任选地通过具有特定功能的接头连接。本文提供的融合多肽被设计和产生为核酸构建体(例如，载体)并在细胞(比如哺乳动物细胞)中表达。具体而言，每个融合多肽的囊泡靶向结构域将所述多肽锚定到细胞外囊泡脂质膜上，从而呈现所述多肽的信号传导结构域。囊泡膜上或囊泡膜内的信号传导结构域可以经由靶多肽(例如，受体细胞的细胞外表面上的受体)与受体细胞接触。重要的是，这种策略可以允许动力学上有利的信号产生和信号传播。例如，这包括增加激动剂呈现的密度，以支持位于靶细胞上的靶受体的受体聚类-传统受体靶向策略的繁重障碍。
通过基因构建体将人工突触工程化，将这种策略应用于改变免疫检查点信号传导，所述基因构建体具有与程序性死亡配体1(PD-L1)信号传导结构域(例如，人程序性死亡配体1(hPD-L1))连接的脂质结合糖基磷脂酰肌醇(GPI)粘性结合剂，其在细胞中表达并能够附着于外泌体。人工突触的分离、纯化和分析揭示了hPD-L1-GPI融合多肽的高密度信号传导结构域。hPD-L1人工突触外泌体进一步显示出比单独的可溶性PD-L1配体增强的激动剂信号传导，支持靶细胞上的受体聚类。当应用于实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)模型时，观察到在EAU症状方面的统计学显著减少。
因而，在一个方面，本文提供了工程化细胞外囊泡或人工囊泡，其包含：至少一种融合多肽，其包含：至少一种感兴趣的蛋白质(POI)结构域；和至少一个囊泡靶向结构域。在任何方面的一些实施方案中，所述工程化细胞外囊泡是外泌体。在任何方面的一些实施方案中，所述融合蛋白还包含至少一个接头。在任何方面的一些实施方案中，所述POI结构域可以基本上结合至靶多肽。
在另一方面，本文提供了一种工程化细胞外囊泡，其包含：至少一种融合多肽，所述融合多肽包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域，
其中所述POI结构域相对于细胞外囊泡的脂质膜位于细胞外位置。
在另一方面，本文提供了一种工程化细胞外囊泡，其包含：
(a)第一融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域，
其中所述至少一个POI结构域相对于细胞外囊泡的脂质膜位于细胞外位置，
(b)第二融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域，
其中所述POI结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的细胞外位置，
并且其中所述至少一个囊泡靶向结构域位于所述细胞外囊泡的脂质膜内。
在另一方面，本文提供了一种细胞外囊泡组合物，其包含：
多个人工突触，
其中每个人工突触包含(i)细胞外囊泡；(ii)一种或多种粘性结合剂；和(iii)一个或多个信号传导结构域。
在另一方面，本文提供了包含多个本文提供的工程化细胞外囊泡的组合物。
在另一方面，本文提供了包含两种或更多种本文提供的工程化细胞外囊泡的组合物。
在另一方面，本文提供了包含三种或更多种本文提供的工程化细胞外囊泡的组合物。
在另一方面，本文提供了一种产生本文提供的工程化细胞外囊泡或组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供表达编码一种或多种粘性结合剂和一个或多个信号传导结构域的载体构建体的细胞群；和
(b)从所述细胞群分离多个人工突触。
在另一方面，本文提供了一种产生本文提供的工程化细胞外囊泡或组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供表达编码一种或多种粘性结合剂和一个或多个信号传导结构域的载体构建体的细胞群；和
(b)从所述细胞群分离多个人工突触；和
(c)从所述细胞群纯化多个人工突触。
在另一方面，本文提供了调节受试者中的炎症的方法，所述方法包括：
给有需要的受试者施用包含多种工程化细胞外囊泡的组合物，
其中所述工程化细胞外囊泡包含至少一种融合多肽，所述至少一种融合多肽包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域。
在另一方面，本文提供了本文提供的组合物或工程化细胞外囊泡用于治疗炎性疾病或疾患的用途。
在另一方面，本文提供了本文提供的组合物或工程化细胞外囊泡用于治疗自身免疫性疾病或疾患的用途。
在另一方面，本文提供了本文提供的组合物或工程化细胞外囊泡用于治疗癌症的用途。
在任何方面的一个实施方案中，所述工程化细胞外囊泡是外泌体。
在任何方面的另一个实施方案中，所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段是融合多肽的N-末端结构域。在任何方面的另一个实施方案中，所述POI结构域选自包括以下各项组成的组：表1.在任何方面的另一个实施方案中，所述POI结构域是PD-L1或其片段。在任何方面的另一个实施方案中，所述POI结构域是PD-L2或其片段。在任何方面的另一个实施方案中，所述POI结构域是FGL1或其片段。在任何方面的另一个实施方案中，所述POI结构域是4-1BBL或其片段。在任何方面的另一个实施方案中，所述POI结构域是CTLA-4或其片段。在任何方面的另一个实施方案中，所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域是HVEM或其片段。
在任何方面的另一个实施方案中，所述囊泡靶向结构域是融合多肽的C-末端结构域。在任何方面的另一个实施方案中，所述囊泡靶向结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的内腔位置。在任何方面的另一个实施方案中，所述囊泡靶向结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的外部位置。在任何方面的另一个实施方案中，所述囊泡靶向结构域选自：表3.在任何方面的另一个实施方案中，所述囊泡靶向结构域选自由下列组成的组：糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚、脂肪酰化位点和异戊二烯化位点。在任何方面的另一个实施方案中，所述囊泡靶向结构域是C1C2。在任何方面的另一个实施方案中，所述囊泡靶向结构域是GPI锚。
在任何方面的另一个实施方案中，所述融合多肽包含至少两个POI结构域和/或至少两个外泌体靶向结构域。
在任何方面的另一个实施方案中，所述POI结构域基本上结合一种或多种靶多肽。在任何方面的另一个实施方案中，所述靶多肽选自由下列组成的组：表2.
在任何方面的另一个实施方案中，所述融合多肽还包含肽接头。在任何方面的另一个实施方案中，所述融合多肽还包含片段可结晶区域(Fc)结构域。在任何方面的另一个实施方案中，所述接头位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的外部位置。在任何方面的另一个实施方案中，所述接头是跨膜接头。在任何方面的另一个实施方案中，所述接头位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的内腔位置。
在任何方面的另一个实施方案中，所述工程化细胞外囊泡不包含内源POI多肽。
在任何方面的另一个实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
在任何方面的另一个实施方案中，所述一种或多种粘性结合剂或所述囊泡靶向结构域选自由下列组成的组：GPI锚、脂肪酰化位点和异戊二烯化位点。
在任何方面的另一个实施方案中，所述信号传导结构域或所述感兴趣的蛋白质包括以下一种或多种：PD-L1、PD-L2、CTLA-4(CD152)、4-1BBL(CD137L)、HVEM(CD270)、FGL1、OX-2(CD200)、半乳凝素-9、PVR(CD155)、连接蛋白-2(CD112)同工型α、连接蛋白-2(CD112)同工型β、连接蛋白-2(CD112)同工型δ、IL-10、TSG-6、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B7-H5(VISTA)、B7-H7(HHLA2)、BTNL1、VSIG8、VSIG3(IGSF11)、VSIG4、TIM-3(HAVCR2)、TIM-4(TIMD4)、CEACAM1、BTN3A1、BTN3A2、BTN2A1、BTNL8、BTN2A2、BTN1A1、TIGIT、CD27L(CD70)、CD30L(CD153)、GITRL、CD40L(CD154)、LIGHT(CD258)、TL1、CD80、CD86、LFA-3(CD58)、SLAM(CD150)、CD40、CD28、CD28H、CD2、LFA-3(CD58)、CD48、CD226、DR3、DcR3、FasL、TIM-1(CD365)、PD-1或其活性片段。
在任何方面的另一个实施方案中，所述分离是通过尺寸排阻色谱法进行的。在任何方面的另一个实施方案中，所述纯化是通过多模式色谱法进行的。在任何方面的另一个实施方案中，所述方法进一步包括进行POI与靶多肽结合的测定法。
在任何方面的另一个实施方案中，所述载体构建体进一步编码启动子。在任何方面的另一个实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子或诱导型启动子。
在任何方面的一个实施方案中，所述方法进一步包括选择患有或疑似患有自身免疫性疾病或炎性疾病或疾患的受试者。在任何方面的另一个实施方案中，所述炎性疾病和/或疾患是急性的。在任何方面的另一个实施方案中，所述炎症相关疾病和/或疾患是慢性的。
在任何方面的另一个实施方案中，施用本文提供的组合物包括注射、局部施用或吸入。
附图说明
图1显示了关于用I型膜蛋白标记外泌体表面的融合多肽的构建体表示。
图2A显示了全长磷脂酰丝氨酸结合的核酸和翻译的蛋白质序列：乳凝集素(MFGE8)C1C2。加下划线的核酸序列突出显示了翻译成C1C2蛋白的序列。粗体和下划线文本突出显示了用于将感兴趣的信号传导结构域(即PD-L1细胞外结构域)锚定到本发明人的人工突触表面上的C1C2结构域。图2B显示了全长CD55(DAF)糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的核酸和翻译的蛋白质序列。粗体和下划线文本突出显示了用于将感兴趣的信号传导结构域(即PD-L1细胞外结构域)锚定到从外泌体工程化的本发明人的人工突触的表面上的GPI锚定结构域。
图3展示了用于基因工程构建体的Fc接头的核酸和翻译的蛋白质序列，以粗体和下划线显示。
图4A展示了人PD-L1(CD274)的核酸和翻译的蛋白质序列。粗体和下划线序列突出显示了从外泌体工程化的本发明人的人工突触中使用的PD-L1细胞外结构域。图4B展示了人PD-L2的核酸和蛋白质序列。粗体和下划线序列突出显示了从外泌体工程化的本发明人的人工突触中使用的PD-L2细胞外结构域。图4C显示了人CTLA-4(CD152)的mRNA和蛋白质序列。粗体和下划线序列突出显示了在本发明人的人工突触中使用的CTLA-4细胞外结构域。
图5A显示了pcDNA5-FRT克隆载体的示例性实施方案，其中编码融合多肽的基因序列插入到多克隆位点中。图5B显示了
Figure BDA0003869254570000081
目的载体pEF5-FRT-V5-DEST的示例性实施方案，其中编码融合多肽的基因序列插入到多克隆位点中。所述载体用于本文所述的融合多肽在哺乳动物细胞中的组成型高水平表达。图5C显示了hCTLA4-Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域的文本用粗体表示，Fc接头加下划线，并且粘性结合剂用斜体表示。图5D显示了hPDL1-GPI-P2A-hHVEM-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1和hHVEM的文本用粗体表示，P2A序列加下划线表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。关于包括的P2A，为一种自切割肽序列，具备这个特征的人工突触将具有加载到表面上的hPDL1-GPI和hHVEM-GPI两者。图5E显示了hPDL1-GPI-P2A-hFGL1-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1和hFGL1的文本用粗体表示，P2A序列加下划线表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。关于包括的P2A，为一种自切割肽序列，具备这个特征的人工突触将具有加载到表面上的hPDL1-GPI和FGL1-GPI两者。图5F显示了hPDL1-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5G显示了hPDL1-Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1的文本用粗体表示，Fc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5H显示了hPDL2-Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL2的文本用粗体表示，Fc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5I显示了hPDL1-C1C2融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂C1C2用斜体表示。图5J显示了hPDL2-C1C2融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL2的文本用粗体表示，并且粘性结合剂C1C2用斜体表示。图5K显示了4F2-h41BBL融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域h41BBL的文本用粗体表示，并且粘性结合剂4F2用斜体表示。图5L显示了hPDL1-4Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1的文本用粗体4Fc，4Fc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5M显示了Myr-NanoLuc萤光素酶融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域Myr-NanoLuc萤光素酶的文本用粗体表示，并且粘性结合剂Myr用斜体表示。图5N显示了Myr-mScarlet融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mScarlet的文本用粗体表示，并且粘性结合剂Myr用斜体表示。图5O显示了hPDL1的分泌同工型(SecPDL1)融合多肽hSecPDL1-GPI的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hSecPDL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5P显示了Tfr2-h41BBL融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域h41BBL的文本用粗体表示，并且粘性结合剂Tfr2用斜体表示。图5Q显示了CD9tm3-h41BBL融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域h41BBL的文本用粗体表示，并且粘性结合剂CD9tm3用斜体表示。图5R显示了Myr/Palm-4F2-h41BBL融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域h41BBL的文本用粗体表示，粘性结合剂Myr/Palm加下划线，并且粘性结合剂4F2用斜体表示。图5S显示了Myr/Palm-连接-h41BBL融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域h41BBL的文本用粗体表示，粘性结合剂Myr/Palm用斜体表示并加下划线，并且粘性结合剂连接(在本实施方案中为GSSG接头)为常规文本(未加下划线也不是斜体)。图5T显示了hPDL1-连接-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1的文本用粗体表示，连接加下划线(在本实施方案中为GSSG接头)，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5U显示了hPDL1的分泌同工型(SecPDL1)融合多肽hSecPDL1-CD9tm2的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hSecPDL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂CD9tm2用斜体表示。图5V显示了hPDL1的分泌同工型(SecPDL1)融合多肽hSecPDL1-CD9tm2-KRAS的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hSecPDL1的文本用粗体表示，粘性结合剂CD9tm2用斜体表示，并且粘性结合剂KRAS用斜体表示并加下划线。图5W显示了hPDL1的分泌同工型(SecPDL1)融合多肽hSecPDL1-CD9tm4的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hSecPDL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂CD9tm4用斜体表示。图5X显示了hPDL1的分泌同工型(SecPDL1)融合多肽hSecPDL1-CD81的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hSecPDL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂CD81用斜体表示。图5Y显示了hCD200-Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hCD200的文本用粗体表示，Fc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示，间隔序列结构域(常规文本，未加下划线且不是斜体)将hCD200序列与Fc结构域分开，间隔序列结构域(常规文本，未加下划线且不是斜体)将Fc序列与GPI分开。图5Z显示了hFGL1-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hFGL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5AA显示了hGal9-Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hGal9的文本用粗体表示，Fc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5BB显示了hCD200-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hCD200的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5CC显示了hGal9-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hGal9的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5DD显示了hHVEM-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hHVEM的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5EE显示了hPDL2-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL2的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5FF显示了hTSG6-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hTSG6的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5GG显示了hHVEM-Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hHVEM的文本用粗体表示，Fc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5HH显示了mCTLA4-Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mCTLA4的文本用粗体表示，Fc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5II显示了mPDL1-C1C2融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂C1C2用斜体表示。图5JJ显示了mPDL1-Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL1的文本用粗体表示，Fc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5KK显示了mPDL1-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5LL显示了mPDL2-C1C2融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL2的文本用粗体表示，并且粘性结合剂C1C2用斜体表示。图5MM显示了mPDL2-Fc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL2的文本用粗体表示，Fc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5NN显示了mPDL1-mFc-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL2的文本用粗体表示，mFc加下划线，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5OO显示了mPDL2-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL2的文本用粗体表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。图5PP显示了mPDL1-GPI-P2A-mHVEM-GPI融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL1和mHVEM的文本用粗体表示，P2A序列加下划线表示，并且粘性结合剂GPI用斜体表示。关于包括的P2A，为一种自切割肽序列，具备这个特征的人工突触将具有加载到表面上的mPDL1-GPI和mHVEM-GPI两者。图5QQ显示了hPDL1-ADAM10融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL1的文本用粗体表示，并且粘性结合剂ADAM10用斜体表示。图5RR显示了hPDL1-4Fc-CD9tm2融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1的文本用粗体4Fc，4Fc加下划线，并且粘性结合剂CD9tm2用斜体表示。图5SS显示了融合多肽hPDL1-4Fc-CD9tm2-KRAS的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1的文本用粗体表示，粘性结合剂4Fc加下划线，粘性结合剂CD9tm2用斜体表示，并且粘性结合剂KRAS用斜体表示且加下划线。图5TT显示了hPDL1-Fc-CD9tm2融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1的文本用粗体表示，Fc加下划线，并且粘性结合剂CD9tm2用斜体表示。图5UU显示了融合多肽hPDL1-Fc-CD9tm2-KRAS的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域hPDL1的文本用粗体表示，粘性结合剂Fc加下划线，粘性结合剂CD9tm2用斜体表示，并且粘性结合剂KRAS用斜体表示且加下划线。图5VV显示了mPDL1-mFc-CD9tm2融合多肽的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域小鼠PDL1(mPDL1)的文本用粗体表示，小鼠mFc(mFc)加下划线，并且粘性结合剂CD9tm2用斜体表示。图5WW显示了融合多肽mPDL1-mFc-CD9tm2-KRAS的核酸和蛋白质序列，其中信号传导结构域mPDL1的文本用粗体表示，粘性结合剂mFc加下划线，粘性结合剂CD9tm2用斜体表示，并且粘性结合剂KRAS用斜体表示且加下划线。其中mPDL1和mFc分别是小鼠PDL1和小鼠Fc。
图6显示了经由市售的用于外泌体纯化的多模式树脂的hPD-L1-Fc-GPI人工突触纯化。如洗脱1中的高hPD-L1浓度和人工突触数量(2.26E9个突触/ml)所示，大MW人工突触洗脱在第一级分中。原位清洗(CIP)级分显示了来自发明人的人工突触洗脱的结合和消除的蛋白质。
图7显示了使用市售的用于外泌体纯化的树脂经由尺寸排阻色谱法进行的hPDL1-Fc-GPI外泌体纯化。如此处所示，使用市售的用于外泌体纯化的树脂，可以经由尺寸排阻色谱法进一步纯化来自经由多模式树脂洗脱的外泌体的工程化人工突触。使用尺寸排阻色谱法，人工突触洗脱在级分7-9中。图中显示了每个级分的总蛋白(通过qBit确定)和hPD-L1ng/ml(通过ELISA确定)。条形显示了每ml的外泌体数量(即，1E10个外泌体/ml等)。级分7-9含有>99％的纯化人工突触。将级分7-9合并，并且可使用过滤装置例如10K MWCO Amicon离心过滤器进行浓缩。可以通过低蛋白结合过滤器例如0.2μm或0.45μm PES过滤器将最终的纯化产物过滤。
图8显示了hPD-L1在外泌体上的表达、数量，并确定了在尺寸排阻色谱级分7-9中的hPD-L1的浓度。已知工程化hPD-L1的分子量，本发明人可以确定每个外泌体的hPD-L1分子的数量大约在12和40hPD-L1/外泌体之间。这个值在不同的纯化轮和构建体之间是一致的。
图9显示了经由市售的用于外泌体纯化的多模式树脂进行的来自外泌体的工程化hPD-L2-Fc-GPI人工突触的纯化。这个图显示了级分的Abs 280和在指示级分中的hPDL2的量。外泌体洗脱在洗脱1中。原位清洗(CIP)级分显示了来自发明人的人工突触洗脱的结合和消除的蛋白质。
图10显示了使用市售的用于外泌体纯化的尺寸排阻树脂经由如此处所示的尺寸排阻柱进行的hPD-L2-Fc-GPI标记的外泌体的纯化。含有大分子量外泌体的级分(级分7-9)显示出高hPD-L2浓度，表明所述纯化的外泌体含有hPD-L2-Fc-GPI。图中显示了每个级分的总蛋白(通过qBit确定)和hPD-L1 ng/ml(通过ELISA确定)。较低分子量的未结合hPD-L2-Fc-GPI洗脱在后面的级分中。
图11显示了使用市售的用于外泌体纯化的尺寸排阻树脂经由如此处所示的尺寸排阻柱进行的hCTLA4-Fc-GPI外泌体纯化。使用尺寸排阻色谱法，外泌体洗脱在级分7-9中。图中显示了每个级分的总蛋白(通过qBit确定)和hCTLA4 ng/ml(通过ELISA确定)。将级分7-9合并，其含有>99％的纯化外泌体。然后可以使用过滤装置，例如10K MWCO Amicon离心过滤器，将合并的外泌体级分浓缩。可以通过低蛋白结合过滤器例如0.2μm或0.45μm PES过滤器将最终的纯化产物过滤。已知工程化hCTLA-4的分子量，本发明人可以确定每个外泌体的hCTLA-4分子的数量为大约233hCTLA-4/外泌体。
图12A显示了PD-1信号传导生物测定方法。本发明人建立了一种方法，用于验证来自外泌体的工程化PD-L1和PD-L2人工突触可以与表达PD-1配体的细胞结合。为了进行这种验证方法，发明人修改了DiscoverX的PathHunter PD-1信号传导生物测定法。简言之，PathHunter PD-1信号传导生物测定法依赖于良好建立的PathHunter酶片段互补(EFC)技术来询问受体活性。EFC由分裂的β-半乳糖苷酶(β-gal)：酶供体(ED)和酶受体(EA)片段组成，它们独立地没有β-gal活性。然而，当迫使互补时，它们形成活性β-gal酶，所述酶使底物水解而产生化学发光信号。PathHunter PD-1信号传导生物测定包括人类细胞，所述细胞被工程化为稳定表达带ED标签的PD-1受体，而EA融合至细胞内信号传导蛋白SHP1的结合磷酸酪氨酸的SH2结构域。配体或抗体诱导的受体激活导致受体的胞质尾磷酸化。通过添加来自外泌体的工程化配体呈递人工突触，配体接合导致PD-1的磷酸化，从而导致SHP1-EA的募集。这迫使EFC组分互补，以产生活性β-gal酶。这种活性酶使底物水解而产生化学发光，作为受体活性的度量。加入拮抗剂(例如，抗PD-L1的抗体)阻断PD-1信号传导，并将阻止互补，导致信号丢失。图12B显示，当分别与可溶性PD-L1-Fc或PD-L2-Fc配体相比时，发明人在用PD-L1或PD-L2标记的人工突触处理的Jurkat信号传导细胞中获得大约10,000X更高的相对光单位(RLU)增加。这意味着，相比于溶解的PD-L1-Fc或PD-L2配体，花了少10,000X的ug/ml的在人工突触上的PD-L1或PD-L2来实现相同的RLU信号传导。显示了来自外泌体的工程化PD-L1和PD-L2人工突触与可溶性PD-L1和PD-L2信号传导生物测定的剂量响应曲线。
图13A-13C显示了实验性EAU概述，测试剂A-未修饰的外泌体，测试剂B-来自40ug/ml外泌体的工程化mPDL1-Fc-GPI人工突触，测试剂C-来自400ug/ml外泌体的工程化mPDL1-Fc-GPI人工突触，IRBP-光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP)肽，BID-每日两次(每日2次)口服–经口(口服)(图13B)EAU症状在第6天出现。第1次玻璃体内注射和第2次静脉注射在第6天进行。在经由玻璃体内或静脉内递送模式的来自外泌体治疗的大鼠的工程化小鼠PD-L1(mPD-L1)人工突触中，在EAU方面有统计学显著的初始减轻。第2次玻璃体内注射和第3次静脉注射在第12天进行。在1X玻璃体内组和静脉内组中的消退速度似乎更快。(图13C)在整个研究中监测大鼠的体重。第3次玻璃体内注射和第4次静脉注射在第16天进行。在任何测试组的EAU中似乎没有任何显著变化。上述结果提供了用具有PD-L1的人类细胞衍生的人工突触成功治疗自身免疫性疾病(即EAU)的原理证明。
图14显示了展示在外泌体表面上的2种类型的配体(I型和II型膜蛋白)。在I型膜蛋白中，N末端在外泌体膜的腔(内)侧，并且C末端在外泌体的外部。
在II型膜蛋白中，N末端在外部，而C末端在内部。
图15显示了I型膜蛋白构建体的几个实施方案的示意图，所述构建体包括但不限于：PD-L1、PD-L2、FGL1、OX40L。
图16显示了用具有可变膜锚的感兴趣的I型膜蛋白(POI)工程化的细胞外囊泡表面的几个实施方案的示意图。囊泡靶向序列，例如来自4F2(CD98)、ADAM10、CD298、TFR2、CD9的跨膜部分、MARCKS、KRAS和来自CD55的GPI的选择序列。经工程化以包括靶向序列结构域的蛋白质可包括在粘性结合剂和信号传导结构域之间的一个或多个接头(例如，Fc接头或键序列，其中所述键序列可以是二聚化或多聚化序列)。
图17显示了用具有跨膜/外泌体靶向结构域的感兴趣的II型膜蛋白(POI)的细胞外部分工程化的外泌体的表面的示意图。
图18显示了用II型膜蛋白4-1BB的细胞外部分工程化的外泌体的示意图。
图19展示了用II型膜蛋白标记外泌体表面的构建体设计。
图20显示了用于标记具有通过可裂解(例如，P2A)接头可操作连接的多个POI结构域的外泌体表面的构建体设计的示意图。
图21显示了本文提供的纯化和分析过程的流程图。
图22显示了PD-L1标记的外泌体构建体。
图23显示了用PD-L1工程化的外泌体的表面的几个实施方案。PD-L1可以是膜结合的PD-L1同种型或分泌型PD-L1(SecPD-L1)。
图24展示了用于纯化人PD-L1-GPI(无Fc)外泌体的尺寸排阻色谱法。左图：显示了在SEC级分中的蛋白质、RNA和DNA测量值。使用Invitrogen Qubit荧光测定法来测量来自未修饰的浓缩细胞培养基SEC级分或hPD-L1-Exo-标签浓缩细胞培养基SEC级分的生物分子。使用R&D系统PD-L1 ELISA试剂盒测量PD-L1。右图显示了SEC级分的圆点印迹法免疫印迹分析。使用96孔圆点印迹装置将50ul的每个SEC级分固定到PVDF上。右下图：通过可调电阻脉冲传感(TRPS)测量在级分7中的外泌体的大小和浓度。
图25证明GPI将hPD-L1锚定在外泌体上。
图26证明市售的用于外泌体纯化的多模式树脂将外泌体纯化和解聚。
图27显示了具有hPD-L1-Fc-GPI的外泌体修饰。
图28A显示了具有hPD-L1-Fc-GPI的外泌体装饰。级分7含有纯化的hPD-L1-Fc-GPI囊泡。图28B显示了展示在细胞外囊泡表面上的人PD-L1的各种实施方案的尺寸排阻色谱(SEC)纯化结果。
图29显示小鼠PD-L1-Fc-GPI外泌体比mPD-L1-GPI具有更高的效价。
图30A-30C展示了转蛋白表达的比较蛋白质组学，并显示本文提供的工程化细胞外囊泡上的表面标记不影响天然和相关外泌体蛋白的相对表达。图30A显示了hPD-L1-Fc-GPI。图30B显示了hPD-L2-FcGPI。图30C显示了hCTLA4-Fc-GPI。
图31显示了在STR生物反应器中mPD-L1-Fc-GPI的产生。
图32显示了经由SEC的mPD-L1-Fc-GPI纯化(STR)。曲线图显示了mPD-L1 ng/ml与总蛋白ug/ml。
图33显示了mPDL1-Fc-GPI的纯化(STR生物反应器)。
图34显示了4-1BBL标记的外泌体的示意图。上部：显示N-末端胞质结构域、跨膜(TM)结构域和C-末端POI结构域的载体图谱。下部：具有融合蛋白的II型膜展示的工程化EV的实施方案。
图35显示了4-1BBL展示外泌体的实施方案。
图36A-36B显示了4F2-4-1BBL标记的外泌体的蛋白质工程和纯化。图36B证实h4-1BBL展示在工程化外泌体上。
图37显示了外泌体的内部融合蛋白加载。
图38显示了具有mScarlet(RFP)的外泌体的内部加载。
图39A显示了具有NanoLuc荧光素酶的外泌体的内部加载。图39B显示了内部加载有NanoLuc荧光素酶的外泌体的四跨膜蛋白特征。
图40A显示了PD-L1工程化细胞外囊泡诱导靶细胞上的膜聚类和受体激动的机制。具有促进靶细胞上受体聚类的I型膜蛋白信号传导结构域(PD-L1)的细胞外囊泡的拟议机制的示例性模型，其中受体聚类促进靶受体的信号转导效能增加。拮抗抗体能很好地发挥阻断受体的作用。由于抗体通常不能使受体聚类，它们具有弱的激动剂模式。膜表面上的配体是有效的激动剂，然而细胞疗法的成本和冷链物流使得商业化困难且昂贵。用I型膜蛋白工程化的细胞外囊泡能够诱导靶受体的受体聚类，并在靶细胞上引发和传播有效的信号响应。
图40B显示了4-1BBL工程化细胞外囊泡诱导靶细胞上的膜聚类和受体激动的机制。具有促进靶细胞上受体聚类的II型膜蛋白信号传导结构域(4-1BBL)的细胞外囊泡的拟议机制的示例性模型，其中受体聚类促进靶受体的信号转导效能增加。由于可溶配体通常不能使受体聚类，它们常常具有弱的激动剂模式。展示在膜表面上的配体是有效的激动剂，然而细胞疗法的成本和冷链物流使得商业化困难且昂贵。用II型膜蛋白工程化的细胞外囊泡能够诱导靶受体的受体聚类，并在靶细胞上引发和传播有效的信号响应。
具体实施方式
本文提供的组合物和方法部分地基于以下发现：表达工程化融合蛋白(例如，PD-L1)的工程化细胞外囊泡(例如，外泌体)减轻了实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)(一种自身免疫病症)的动物模型中的炎症。本文提供的组合物和方法进一步部分地基于以下发现：与等量的重组配体相比，工程化细胞外囊泡产生增强的信号传导。由于一些细胞受体(例如，PD-1)需要聚类或超聚类来促进信号传导响应，因此有理由将细胞外囊泡工程化为在其表面表达配体，其中所述配体可以与靶细胞上的靶受体结合，并促进所述靶受体的聚类，从而促进所述靶细胞上的信号响应。
在一个方面，本文提供了工程化细胞外囊泡，其包含：至少一种融合多肽，其包含：至少一种感兴趣的蛋白质(POI)结构域；和至少一个囊泡靶向结构域。在任何方面的一些实施方案中，所述工程化细胞外囊泡是外泌体。在任何方面的一些实施方案中，所述融合蛋白还包含至少一个接头。在任何方面的一些实施方案中，所述POI结构域可以基本上结合至靶多肽。在本文提供的任何方面的一些实施方案中，所述工程化细胞外囊泡是人工突触。
通常，通过将细胞群与编码本文提供的融合蛋白的核酸构建体接触并分离多个细胞外囊泡，产生本文提供的细胞外囊泡(例如，外泌体)。然后可以通过本文提供的方法纯化细胞外囊泡，并将其配制为用于治疗用途，包括但不限于治疗受试者中的自身免疫性疾病、癌症或调节炎症。
将本文提供的组合物和方法专门设计为利用细胞外囊泡的膜运输机制，并依赖于细胞外囊泡比如外泌体的标志性生物物理和生物化学特性。将本文提供的囊泡/人工突触专门设计为经由靶多肽来诱导/激动和传播生物信号传导(例如，通过激活受体或酶或激动所述受体或酶)。可替代地，例如，通过阻断内源配体与靶细胞受体结合并阻止受体激活，本文提供的工程化细胞外囊泡可充当细胞诱饵或减少或拮抗生物信号传导。
通过掺入附着于细胞外囊泡比如外泌体的粘性结合剂，进一步与选择的信号传导结构域偶联，本文提供的细胞外囊泡的工程化显著扩展了这些能力。例如，粘性结合剂与外泌体的附着，以及它们连接的信号传导结构域，允许生物信号诱导/激动和传播的受体聚类，否则是不可能的。在这个方面，上述设计通过在靶受体细胞中诱导期望的生物信号传导来实现工程化细胞外囊泡的目的。
下文详细提供了组合物和方法的各个方面和实施方案。
工程化细胞外囊泡(EV)组合物
本文提供的组合物包含至少一个细胞外囊泡(也称为人工突触或缩写为：EV)，其中所述细胞外囊泡包含至少一个融合多肽或多个融合多肽，所述融合多肽包含：至少一个囊泡靶向结构域(例如，粘性结合剂)；和至少一个感兴趣的蛋白质结构域或其片段(也称为信号传导结构域)。
细胞外囊泡(EV)是从各种细胞类型中释放的脂质颗粒，其功能是将“货物”比如核酸和蛋白质转移至其他细胞。EV不能复制，而是充当细胞信使。EV介导的信号可以通过所有不同的生物分子类别(蛋白质、脂质、核酸和糖)传输，这种信息的独特包装既提供了保护，又提供了同时递送多种不同信使的选项，甚至可以递送至远离囊泡起源的部位。参见，例如，
Figure BDA0003869254570000201
M,Siljander PR,Andreu Z等人，Biological properties ofextracellular vesicles and their physiological functions.J ExtracellVesicles.2015；4:27066.其发布于2015年5月14日的doi:10.3402/jev.v4.27066，将其通过引用完整并入本文。此外，越来越多的证据表明，EV可以调节细胞信号传导过程的环境。参见，例如，Yadid等人，Science Translation Medicine(2020)；Cerqueira de Abreu等人，Nature Reviews Cardiology(2020)；Zhang W.等人，Protein J.(2019)；Zha QB等人，Tumor Biology.February 2017；Tan等人，(2016)Recent advances of exosomes inimmune modulation and autoimmune diseases,Autoimmunity,49:6,357-365；KalluriR,LeBleu VS.等人，The biology,function,and biomedical applications ofexosomes.Science.2020Feb 7；367(6478)；将其通过引用完整并入本文。
存在各种类型的细胞外囊泡，这些囊泡根据它们在细胞中的起源部位、大小以及结构和/或功能特性来命名。在本文提供的任何方面的一些实施方案中，细胞外囊泡是本领域普通技术人员已知的外泌体、核外粒体、大囊泡、微粒、凋亡小体、囊泡细胞器、癌小体、外球体(exosphere)、外泌颗粒或细胞衍生的纳米囊泡(CDN)((例如，通过磨碎或剪切细胞产生)、脂质体等。在各种实施方案中，细胞外囊泡包含具有外部磷脂层和内部磷脂层的磷脂双层，其中所述外部磷脂层具有外表面和内表面，其中所述内部磷脂层具有内表面和外表面，并且所述外部磷脂层的内表面面向所述内部磷脂层的内表面，并且所述磷脂双层包围内部空间，其中所述内部磷脂层的外表面面向内部空间，并且其中所述外磷脂层的外表面面向细胞外环境，并且所述内磷脂层的外表面是所述细胞外囊泡的内表面。
在各种实施方案中，细胞外囊泡的尺寸范围为30纳米(nm)至300nm。在各种实施方案中，多个EV的尺寸范围为约30nm至约150nm。在各种实施方案中，多个EV或人工突触包括一个或多个直径为约10nm至约250nm的人工突触，包括约10nm至约15nm、约15nm至约20nm、约20nm至约25nm、约25nm至约30nm、约30nm至约35nm、约35nm至约40nm、约40nm至约50nm、约50nm至约60nm3、约60nm至约70nm、约70nm至约80nm、约80nm至约90nm、约90nm至约95nm、约95nm至约100nm、约100nm至约105nm、约105nm至约110nm、约110nm至约115nm、约115nm至约120nm、约120nm至约125nm、约125nm至约130nm、约130nm至约135nm、约135nm至约140nm、约140nm至约145nm、约145nm至约150nm、约150至约200nm、约200nm至约250nm、约250nm或更大的直径。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，所述EV是外泌体。外泌体是膜结合的EV，其在大多数真核细胞的内体区室中产生。如本文所用的，术语“外泌体”是指直径在约20nm至约400μm之间的一类细胞外囊泡，例如，直径为约30nm-200nm，其通过内体的膜的一部分(例如，早期或晚期内体)向内内陷形成，其中内体在包含质膜的细胞内，并且外泌体在内体膜的另一部分与质膜融合时从细胞中释放。外泌体可以指直径为20nm-400μM，更优选直径为30nm-200nm的一类细胞外囊泡，其起源于质膜的一部分从细胞出芽，其中质膜的出芽部分被释放到细胞外环境中。
本文提供的EV(例如，外泌体或细胞衍生的囊泡)可包含货物，例如，肽、蛋白质、核酸、脂质、代谢物、碳水化合物、生物分子、小分子、大分子、囊泡、细胞器或其片段。外泌体货物可位于外泌体的内部空间。EV货物可以是跨外泌体磷脂双层的一层或两层结合的膜(例如跨膜蛋白)。EV货物可以例如通过共价键或非共价键与外泌体的外部或内部表面接触。本文提供的EV或外泌体的磷脂双层可包含一种或多种跨膜蛋白，其中一种或多种跨膜膜蛋白的一部分位于外泌体的内部空间内。本文提供的EV或外泌体的磷脂双层可包含一种或多种跨膜蛋白，其中一种或多种跨膜膜蛋白的一部分穿过EV磷脂双层。EV的磷脂双层可包含一种或多种跨膜蛋白，其中一种或多种跨膜膜蛋白包含在外泌体外部上的结构域。
在任何方面的一些实施方案中，本文提供的细胞外囊泡或外泌体内源性地表达CD81+、CD82+、CD37+、CD63+、CD9+、CD151+、CD105+或其任何组合。在各种实施方案中，多个人工突触包括表达生物标志物的一个或多个人工突触。在某些实施方案中，所述生物标志物是四跨膜蛋白。在其他实施方案中，所述四跨膜蛋白是选自包括CD63、CD81、CD82、CD53、CD151和CD37的组的一种或多种。在其他实施方案中，人工突触表达一种或多种脂筏相关蛋白(例如，糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白和浮舰蛋白)、胆固醇、鞘脂比如鞘磷脂和/或己糖神经酰胺。
在其他实施方案中，生物蛋白与胞质蛋白的外泌体形成和包装有关，所述胞质蛋白例如，Hsp70、Hsp90、14–3-3ε、PKM2、GW182和AGO2。在某些实施方案中，人工突触表达CD63、HSP70、CD105或其组合。在其他实施方案中，人工突触不表达CD9或CD81，或者两者都不表达。例如，多个人工突触可包括一个或多个CD63+、HSP+、CD105+、CD9-和CD81-的人工突触。
本文提供的EV专门设计为表达经由靶细胞引出生物信号传导的融合多肽。在一些实施方案中，融合多肽被过表达，以引出对靶细胞或靶多肽的生物响应。工程化EV包含至少一个融合多肽，并且可以包含本文提供的多个相同或不同的融合多肽。本文提供的融合多肽包含感兴趣的蛋白质结构域，也称为信号传导结构域。
本文提供的融合多肽可包含一个或多个感兴趣的蛋白质结构域，从而允许所述融合多肽的表达，并且POI结构域的数量不阻碍蛋白质表达或折叠。此外，本文提供的EV可以表达多于一种融合蛋白(例如，由多种不同的核酸构建体编码)。本领域技术人员可以理解，工程化EV可以包括不同的信号传导结构域和/或囊泡靶向结构域的一种或多种组合，或者可以使用多个工程化EV，每个工程化EV包括一个或多个囊泡靶向结构域和一个或多个信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文提供的EV包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或十种或更多种融合蛋白。融合蛋白可以由同一个载体或单独的载体编码。在任何方面的一些实施方案中，工程化细胞外囊泡包含至少两个POI结构域和/或至少两个囊泡靶向结构域。
在一些实施方案中，融合多肽包含在同一多肽或编码所述多肽的核酸构建体上的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个POI结构域。例如，本文提供的融合多肽可表达编码一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个信号传导结构域的融合多肽。在另一个实例中，本文提供的融合多肽可表达编码免疫检查点蛋白或参与免疫突触或细胞突触的蛋白或其任何组合或片段的融合多肽。
在一些实施方案中，所述EV包含在同一EV上的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种融合多肽。例如，EV包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或六种或更多种融合多肽，其中所述融合多肽编码信号传导结构域。在另一个实例中，EV包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种融合多肽，其中所述融合多肽编码一种或多种免疫检查点蛋白或参与免疫突触或细胞突触的蛋白或其任何组合或片段。
在各种实施方案中，所述信号传导结构域是感兴趣的蛋白质或肽或其片段。在各种实施方案中，感兴趣的蛋白质(信号传导结构域)是免疫检查点蛋白。术语“免疫检查点蛋白”或“参与免疫突触或细胞突触的蛋白”可包括但不限于腺苷A2A受体(A2AR)、半乳凝素9、纤维蛋白原样蛋白1(FGL-1)、血小板内皮粘附因子-1(PECAM-1)、肿瘤坏死因子基因6蛋白(TSG-6)、稳定素-1(STAB-1)(也称为Clever-1)、神经毡蛋白1(NRP1)、神经毡蛋白2(NRP2)、神经轴突导向分子-3A(SEMA3A)、神经轴突导向分子-3F(SEMA3F)、排斥性引导分子B(RGMB)(也称为DRG11)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、人类白细胞抗原(HLA)I类、HLA II类、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、T细胞受体(TCR)、含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)、SHP-2、F-Box蛋白38(FBXO38)、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM)相关蛋白(SAP)(也称为SH2D1A)、B7RP1、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)、NADH氧化酶2(NOX2)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员18(TNFRSF18)(也称为激活诱导型TNFR家族受体(AITR)、糖皮质激素诱导的TNFR相关(GITR)蛋白和CD357)、B7-H4(也称为含V-set结构域的T细胞激活物抑制剂(VTCN1))、B7-H5(也称为T细胞激活的V-结构域Ig抑制因子(VISTA)、血小板受体Gi24和应激诱导分泌蛋白1(SISP1)、B7-H6(也称为NCR3LG1)、B7-H7(也称为人内源性逆转录病毒-H(HERV-H)长末端重复相关蛋白2(HHLA2)、阿佩林受体(APLNR)、干扰素γ(IFNγ)受体、程序性细胞死亡-1(PD-1)、蛋白Wnt-5a(WNT5A)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PAK4、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、C型凝集素受体的NKG2家族(例如NKG2A、B、C、D、E、F和H)、NKG2家族的配体、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、CD-2、分化簇4(CD4)、CD8、CD27、CD27配体(CD27L，也称为CD70)、CD28、CD28H(也称为含跨膜和免疫球蛋白结构域2(TMIGD2)和含Ig富脯氨酸受体1(IGPR1))、CD39、CD40、CD44、整合素相关蛋白(CD47)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1，也称为CD66a)、CD73、B7-1(也称为CD80)、B7-2(也称为CD86)、CD94、CD96、免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2)(也称为CD101)、连接蛋白细胞粘附分子2(NECTIN2)(也称为疱疹病毒进入介质B(HVEB))、脊髓灰质炎病毒受体相关2(PRR2、PVRL2和PVRR2)和CD112)、含脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的蛋白(PVIRG)(也称为CD112R)、CD122(也称为IL5RB和P70-75)、OX40(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)和CD134)、OX40配体(OX40L)、4-1BB(也称为CD137)、CD134(也称为4-1BB配体(4-1BBL)和肿瘤坏死因子配体超家族成员9(TNFSF9)和CD137L)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)(也称为CD152)、CD154(也称为CD40L)、脊髓灰质炎病毒受体(PVR)(也称为CD155)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)(例如但不限于CD158家族、CD158a、CD158g、CD158h、KIR2DL1、KIR2DS1、KIRDS3和KIR2DS5)、CD160、信号调节蛋白α(SIRPα)(也称为CD172a)、OX-2(也称为CD200)、CD200R、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)(也称为CD223)、CD226、OX40L(也称为CD252)、疱疹病毒进入介质(HVEM)(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14(TNFRSF14)和CD270、B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)(也称为CD272)、程序性细胞死亡配体2(PD-L2)(也称为B7-DC、PDCD1LG2和CD273)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)(也称为B7-H1和CD274)、B7-H2(也称为诱导型T细胞共刺激配体(ICOSLG)、B7RP1和CD275)、B7-H3(也称为CD276)、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)(也称为CD278)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)(也称为CD279)、白细胞相关Ig样受体-1(LAIR-1)(也称为CD305)、胶原蛋白家族(例如但不限于胶原I、胶原II、胶原IIIα1、胶原IV、胶原XXIIIα1、胶原XXVα1)、唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素7(SIGLEC7)(也称为CD328)、唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素7(SIGLEC9)(也称为CD329)、天然细胞毒性触发受体3(NKp30)(也称为CD337)，或其任何同工型、片段、变体，或其上述蛋白质的配体，或本领域普通技术人员已知的类似物。本发明涵盖所有的变体。
在本文提供的任何方面的一些实施方案中，所述感兴趣的蛋白质结构域(POI结构域)包含多肽或其片段或编码所述多肽或其片段的核酸，其选自由下列组成的组：表1(下文)。表1中还提供了编码本文提供的POI结构域的核酸序列的非限制性实例。
表1-感兴趣的I型蛋白质的氨基酸序列
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在以上表1中提供的多肽涉及一系列生物过程，包括但不限于抑制免疫系统的适应性臂(例如,PD-L1)；细胞粘附(例如，连接蛋白)、免疫激活(例如，HVEM)，等。所述POI结构域还可用于跟踪、纯化或鉴定来自天然EV的工程化EV(例如，mScarlet和纳米萤光素酶)。可以根据来自表1的任何组合使用基因、转录物、多肽、变体和其片段，从而由本文提供的工程化EV表达。在一些实施方案中，所述POI结构域是人多肽。在一些实施方案中，所述POI结构域是人多肽的同源物(例如，小鼠)。
在任何方面的一些实施方案中，本文提供的工程化细胞或EV包含编码一种或多种外源多肽的外源核酸，所述外源多肽选自由下列组成的组：表1中列出的多肽。
在任何方面的一些实施方案中，所述POI结构域是PD-L1或其片段。在任何方面的一些实施方案中，所述POI结构域是PD-L2或其片段。在任何方面的一些实施方案中，所述POI结构域是FGL1或其片段。在任何方面的一些实施方案中，所述POI结构域是4-1BBL或其片段。在任何方面的一些实施方案中，所述POI结构域是CTLA或其片段。
在任何方面的一些实施方案中，所述POI结构域基本上结合一种或多种靶多肽。在任何方面的一些实施方案中，所述靶多肽是细胞受体。在任何方面的一些实施方案中，所述靶多肽是免疫抑制多肽。在任何方面的一些实施方案中，所述靶多肽是免疫刺激多肽。本文提供的工程化外泌体可被设计成用适当的POI结构域激活、阻断或调节给定的靶多肽，所述POI结构域结合或调节所述靶多肽的功能或表达。
靶多肽的非限制性实例包括在表2(下文)中列出的那些。
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Figure BDA0003869254570001821
本文提供的EV还包含至少一种包含囊泡靶向结构域的融合蛋白。在各种实施方案中，本文提供的囊泡靶向结构域能够例如经由磷脂双层膜的靶向将本文提供的融合多肽结合或锚定至细胞外囊泡。在各种实施方案中，所述囊泡靶向结构域是GPI结构域(即，GPI接头、GPI锚)、脂肪酰化位点或异戊二烯化位点。本领域技术人员可以理解，上述提到的是指肽或蛋白质位点，其中共价脂质附着支持脂质嵌入细胞膜(即，磷脂双层)中。将EV靶向结构域锚定至EV磷脂双层的生化力可包括但不限于静电力、通过与天然驻留的蛋白质(例如，CD81、CD63、CD9、ALIX、TSG101、CD98、CD298、MARCKS、PTGFRN、乳凝集素(MFGe8))的蛋白质-蛋白质相互作用对EV的亲和力、对负或正弯曲的磷脂的缔合或亲和力、对驻留膜相关蛋白的带负电荷或带正电荷的结构域的缔合或亲和力等。
另外的可以使用的膜靶向结构域的非限制性实例及其特性进一步详细描述于例如，Alberts B,Johnson A,Lewis J等人，Molecular Biology of the Cell,4th edition,New York:Garland Science,2002.Membrane Proteins,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26878/；Marilyn D.Resh,Fatty acylation of proteins:new insights intomembrane targeting of myristoylated and palmitoylated proteins.Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Molecular Cell Research.第1451卷，第1期，1999年8月12日，第1-16页，doi.org/10.1016/S0167-4889(99)00075-0；Ann Apolloni等人，H-ras but NotK-ras Traffics to the Plasma Membrane through the Exocytic Pathway,Molecularand Cellular Biology，2000年4月，20(7)2475-2487,DOI:10.1128/MCB.20.7.2475-2487.2000；Rosie Dawaliby等人，Phosphatidylethanolamine Is a Key Regulator ofMembrane Fluidity in Eukaryotic Cells,Membrane Biology，第291卷，第7期，doi.org/10.1074/jbc.M115.706523；R.J.Deschenes,Protein Palmitoylation,Encyclopedia ofBiological Chemistry(第2版),Academic Press,2013年，第645-647页，ISBN9780123786319,https://doi.org/10.1016/B978-0-12-378630-2.00022-0.；CharutaC.Palsuledesai and Mark D.Distefano,Protein Prenylation:Enzymes,Therapeutics,and Biotechnology Applications,ACS Chemical Biology 2015 10(1),51-62,DOI:10.1021/cb500791f；Hung ME,Leonard JN.Stabilization of exosome-targetingpeptides via engineered glycosylation,J Biol Chem,2015Mar 27；290(13):8166-72,doi:10.1074/jbc.M114.621383；Udenwobele Daniel Ikenna等人，Myristoylation:AnImportant Protein Modification in the Immune Response,Frontiers inImmunology，第8卷，2017年，DOI＝10.3389/fimmu.2017.00751；Kinoshita Taroh2020Biosynthesis and biology of mammalian GPI-anchored proteins OpenBiol.10190290,http://doi.org/10.1098/rsob.190290，将这些文献的内容通过引用完整并入本文。
在一些实施方案中，融合多肽包含在同一多肽或编码所述多肽的核酸构建体上的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个或更多个囊泡靶向结构域。例如，本文提供的融合多肽可包含PD-L1和糖基磷脂酰肌醇(GPI)。
在一些实施方案中，所述囊泡靶向结构域是异戊二烯化蛋白。异戊二烯化蛋白是具有至少一个异戊二烯化位点的蛋白质。当15碳或20碳的法尼基或香叶基香叶基类异戊二烯分别通过硫醚键共价结合到蛋白质羧基末端或其附近的半胱氨酸上时，发生异戊二烯化。一般而言，异戊二烯化位点包含氨基酸序列CAAX，其中C代表半胱氨酸，A代表脂肪族氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)，X代表丙氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺。
在一些实施方案中，所述囊泡靶向结构域是脂肪酰化蛋白。脂肪酰化蛋白是已经通过一种或多种脂肪酸的共价连接而在翻译后被修饰的蛋白质，所述脂肪酸通常是经由肉豆蔻酰化含有14个碳(例如肉豆蔻酸)或经由棕榈酰化含有16个碳(例如棕榈酸)的饱和脂肪酸。例如，预定变成肉豆蔻酰化的蛋白质从氨基酸Met-Gly-X-X-X开始，随后在6位是丝氨酸或苏氨酸，在7和/或8位是赖氨酸或精氨酸，其中X可以是任何氨基酸。将甲硫氨酸除去，并将肉豆蔻酸酯经由酰胺键连接到甘氨酸上。本文的棕榈酰化是指脂肪酸(例如棕榈酸)至蛋白质的半胱氨酸(S-棕榈酰化)、丝氨酸和/或苏氨酸(O-棕榈酰化)以及赖氨酸的氨基(N-棕榈酰化)的翻译后共价连接。
棕榈酰化蛋白可以通过硫酯键连接到半胱氨酸的巯基上，或者经由棕榈酸酯连接到N-末端半胱氨酸的氨基上而被酰化。棕榈酰化位点可以存在于蛋白质的N-或C-末端附近。
在一些实施方案中，囊泡靶向结构域是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚。糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚(“GPI锚”)或“GPI粘性结合剂”可互换使用，并且是指将蛋白质稳定地锚定到细胞膜的外小叶(例如磷脂双层的外层)上的手段。GPI锚包括聚糖、磷酸乙醇胺接头、磷脂尾，并且可以被各种聚糖侧链修饰。聚糖核心包含磷酸肌醇、葡糖胺和甘露糖残基，其中所述甘露糖残基可以用例如磷酸乙醇胺或碳水化合物修饰。在GPI连接过程中，磷酸乙醇胺与蛋白质的羧基末端形成酰胺键。在一些实施方案中，囊泡靶向结构域可对EV驻留蛋白具有亲和力，所述驻留蛋白例如CD81、CD63、CD9、ALIX、TSG101、CD98、CD298、MARCKS、PTGFRN、乳凝集素(MFGe8)。
粘性结合剂可包括一个或多个肉豆蔻酰化和/或棕榈酰化(Myr/Palm)位点的序列，其与来自4F2(CD98)的跨膜结构域融合。例如，可以将来自MARCKS蛋白的肉豆蔻酰化序列修饰为编码一个或多个肉豆蔻酰化和棕榈酰化位点，其中经修饰的MARCKS蛋白序列经由共价肽键与来自4F2的跨膜结构域的蛋白质序列融合。与单独的4F2跨膜结构域或单独的Myr/Palm相比，后面有4F2跨膜结构域的Myr/Palm可提高本文提供的融合蛋白的负载。
增强融合多肽结构和细胞外囊泡功能的囊泡靶向结构域的非限制性实例提供在表3(下文)中。
表3-外泌体靶向结构域
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在本文提供的任何方面的一些实施方案中，所述融合多肽还包含肽接头。接头可以是柔性的、刚性的或可切割的。此外，接头可以直接地或经由另一个接头(例如，具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的肽)与本文所述的融合多肽连接。可以根据特定需要配置接头，例如基于以下特征中的至少一个。在任何方面的一些实施方案中，可以将接头配置为具有足够的长度和柔性，使得它可以允许在靶位点的切割。在任何方面的一些实施方案中，可以将接头配置为允许本文提供的融合多肽的多聚化。在任何方面的一些实施方案中，可以将接头配置为促进本文提供的融合蛋白或工程化细胞外囊泡的表达和纯化。
在任何方面的一些实施方案中，可以将接头配置为具有任何长度，其形式为肽、肽模拟物、适体、蛋白质、核酸(例如，DNA或RNA)或其任何组合。例如，在一个实施方案中，接头可以是多肽接头，比如本领域普通技术人员已知的Gly-Ser-Ser-Gly或其变体。在另一个实施方案中，接头可以是自切割肽的蛋白质序列。例如，2A序列，比如P2A、E2A、F2A和T2A通过诱导mRNA上在2A位点的核糖体滑动来编码自切割肽，从而阻止肽键形成。在翻译之后，滑动将导致两个独立的肽。这允许从一个启动子区表达两个不同的蛋白质。如本领域普通技术人员已知，本文所述的蛋白质的任何组合可以与自切割肽一起表达。
在任何方面的一些实施方案中，所述多肽接头是不可切割接头。在任何方面的一些实施方案中，接头可以是任何长度的化学接头。
在任何方面的一些实施方案中，所述接头是Fc接头。编码Fc多肽的示例性核酸序列是：
>KY053479.1合成构建体Fc-脂联素基因，完整cds
Figure BDA0003869254570002121
Fc接头的氨基酸序列是：
>Fc翻译
Figure BDA0003869254570002122
在任何方面的一些实施方案中，所述接头是P2A肽接头。P2A是自切割肽序列，其允许从一个启动子表达两个蛋白质。在一些实施方案中，所述P2A接头由核酸序列：GCTACTAACTTCAGCCTGCT GAAGCAG(SEQ ID NO:221)编码。P2A的氨基酸序列为ATNFSLKQAGDVENPGP(SEQ ID NO:222)。
在任何方面的一些实施方案中，接头提供了多聚化(例如，二聚化)结构域，其中一个融合多肽可以与另一个融合多肽在每个融合多肽的对应的多聚化结构域连接。多个融合多肽的多聚化将针对靶细胞上的一个或多个靶受体提供彼此紧密接近的多个融合多肽，其中所述多个融合肽将增强靶细胞上的受体聚类。靶细胞上的受体聚类将导致信号转导增强。如果没有受体聚类，信号可能更弱或根本不出现。例如，本文提供的Fc结构域序列二聚化，从而产生两个融合多肽，它们经由在其对应的融合多肽上的两个Fc结构域通过共价键连接。Fc结构域的一个优选实施方案来自IgG4，本文中将其标记为4Fc。在其他实施方案中，Fc可以来自IgG1，在本文中将其标记为Fc。在某些实施方案中，可以使用来自其他免疫球蛋白(例如，IgG2、IgG3等)的Fc。
另外可使用的接头的非限制性实例及其特性详细地描述于例如Chen X,Zaro JL,Shen WC.Fusion protein linkers:property,desig n and functionality.Adv DrugDeliv Rev.2013；65(10):1357-1369.doi:10.1016/j.addr.2012.09.039；O'Shea EK,LumbKJ,Kim PS.Pe ptide'Velcro':design of a heterodimeric coiled coil.CurrBiol.199 3 Oct 1；3(10):658-67.doi:10.1016/0960-9822(93)90063-t.PMID:15335856；以及Müller KM,Arndt KM,Alber T.Protein fusions to coiled-coil domains.MethodsEnzymol.2000；328:261-82.doi:10.1016/s0076-6879(00)28402-4.PMID:11075350，将这些文献的内容通过引用完整并入本文。
本文提供的工程化细胞外囊泡组合物可包括POI结构域、接头和/或囊泡靶向结构域的构型变化。这些结构域的特定组合和定位可以增强融合多肽的锚定、功能或治疗效果，例如调节炎症。
因而，在一个方面，本文提供了一种工程化细胞外囊泡，其包含：至少一种融合多肽，所述融合多肽包含：(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和(ii)至少一个囊泡靶向结构域，其中所述POI结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的细胞外位置。
在一些实施方案中，所述POI结构域或其片段是融合多肽的N-末端结构域。在一些实施方案中，所述囊泡靶向结构域或其片段是融合多肽的C-末端结构域。
在另一方面，本文提供了一种工程化细胞外囊泡，其包含：至少一种融合多肽，所述融合多肽包含：(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和(ii)至少一个囊泡靶向结构域，其中所述POI结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的细胞外位置，并且其中所述囊泡靶向结构域是相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述POI结构域或其片段是所述融合多肽的C-末端结构域。在一些实施方案中，所述囊泡靶向结构域或其片段是所述融合多肽的N-末端结构域。在一些实施方案中，所述囊泡靶向结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的内腔位置。
在一些实施方案中，所述接头位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的外部位置。在一些实施方案中，所述接头是跨膜接头。在一些实施方案中，所述接头位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的内腔位置。
本文提供的工程化细胞外囊泡组合物可包含以下一个或多个在表4中的融合多肽序列。
表4-全长构建体
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在任何方面的一些实施方案中，本文提供的融合多肽包含两个或更多个POI结构域。可以使用POI结构域的特定组合来调节炎症免疫响应。可调节炎症信号传导途径的POI的加性和协同组合的非限制性实例提供在表5(下文)中。
表5-用于调节炎症的示例性POI组合和组合靶.
Figure BDA0003869254570002572
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制备细胞外囊泡组合物的方法
在另一方面，本文提供了一种制备本文提供的工程化细胞外囊泡的方法。通常，所述方法包括提供表达载体构建体的细胞群，所述载体构建体编码一种或多种粘性结合剂(囊泡靶向结构域)和一种或多种信号传导结构域(POI结构域)。
本文提供的EV可以从任何生物来源(例如，细胞)分离和纯化。产生本文提供的工程化EV的细胞可以来自任何活的非人来源或生物。通常，所述生物是动物、脊椎动物或哺乳动物。在一些实施方案中，本文所述的细胞来自人。本文所述的细胞可以来自通过本领域已知的方法从生物中分离的任何组织。科学文献为本领域普通技术人员提供了分离、制备和培养用于本文所述组合物和方法所需的细胞的指导。本领域技术人员可以理解的是，EV的细胞来源可以改变细胞蛋白质表达和EV内的天然或内源性货物。本文考虑的是，根据被治疗的疾病或病症，可以充分利用这一点产生治疗效果。
在一些实施方案中，在以改变细胞调节状态的方式分离多个人工突触时，或与之基本上同时，通过暴露于环境条件(例如，缺氧)、小分子添加、外源因子(例如，生长因子、细胞因子)的存在/不存在，细胞群已经被改变。在各种实施方案中，所述细胞是HEK 293细胞、MSC、PER.C、纤维肉瘤HT-1080或HuH7细胞系。
所述方法包括提供细胞群，并在无血清或未浓缩的条件培养基中培养所述细胞。这包括，例如，正如通过在培养中的细胞群调节的分泌到培养基中的人工突触，进一步包括能够连续传代的细胞系。在某些实施方案中，当分离人工突触(工程化EV)时，培养中的细胞生长至10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或90％或更多的汇合。
本文提供的方法进一步包括使本文提供的细胞与编码本文提供的至少一种融合多肽的核酸载体接触。可以通过本领域已知的方法将载体加入到细胞的细胞培养基中，这在下面进一步讨论。
载体是被设计为用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移遗传物质的核酸构建体。如本文所用，载体可以是病毒或非病毒的。术语“载体”包括当与适当的控制元件结合时能够复制并且能够将遗传物质转移到细胞中的任何遗传元件。载体可以包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒体等。在任何方面的一些实施方案中，载体选自由下列组成的组：质粒、粘粒和病毒载体。
“表达”是指参与产生RNA和蛋白质以及在适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用的情况下包括但不限于，例如转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA以及通过从基因转录的mRNA的翻译获得的多肽。
在一些实施方案中，载体能够驱动一个或多个序列在哺乳动物细胞中表达，即，所述载体是哺乳动物表达载体。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,1987.Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等人，1987.EMBO J.6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能典型地由一个或多个调节元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒、猴病毒40、以及本文公开和本领域已知的其他病毒。对于其他适合的原核和真核细胞表达系统，参见，例如，第16章和17章，Sambrook等人，MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。
在一些实施方案中，重组表达载体能够指导外源融合多肽核酸序列优先在特定细胞类型中表达(例如，经由组织特异性调节元件)。
组织特异性和诱导型调节元件是本领域已知的。适合的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人，1987.Genes Dev.1:268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，1988.Adv.hnmunol.43:235-275)，尤其是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore,1989.EMBO J.8:729-733)和免疫球蛋白(Baneiji等人，1983.Cell33:729-740；Queen和Baltimore，1983.Cell 33:741-748)、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等人，1985.Science 230:912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利第4,873,316号和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育调节启动子，例如，鼠同源盒蛋白启动子(Kessel和Gruss，1990.Science 249:374-379)和α-甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman，1989.Genes Dev.3:537-546)。
在一些实施方案中，经由整合载体将本文所述的至少一种核酸序列递送至本文所述的细胞。整合载体将其递送的遗传物质(或其拷贝)永久性地整合到宿主细胞染色体中。非整合载体保持游离型，这意味着其中包含的核酸未曾整合到宿主细胞染色体中。整合载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、杂合腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
在一些实施方案中，经由非整合载体将本文所述的至少一种核酸序列递送至本文所述的细胞。非整合载体包括非整合病毒载体。非整合病毒载体消除了整合型逆转录病毒带来的主要风险之一，因为它们不将其基因组掺入到宿主DNA中。一个实例是爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)oriP/核抗原-1(“EBNA1”)载体，其能够有限地自我复制并且已知在哺乳动物细胞中起作用。含有来自爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒的两个元件，oriP和EBNA1，EBNA1蛋白与病毒复制子区域oriP的结合维持了质粒在哺乳动物细胞中相对长期的游离存在。oriP/EBNA1载体的这一特殊特征使其对于产生无整合宿主细胞而言是理想的。其他非整合型病毒载体包括腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。
另一种非整合型病毒载体是RNA仙台病毒载体，它可以在不进入感染细胞的细胞核的情况下产生蛋白质。F-缺陷型仙台病毒载体在感染细胞的细胞质中保留几代，但在几代(例如，10代)之后被迅速稀释掉并完全消失。这允许选择的一个或多个异源基因在靶细胞中自限性瞬时表达。除了其他用途之外，这个方面可以有助于例如重编程因子的瞬时引入。如上所述，在一些实施方案中，本文所述的核酸序列在细胞中由病毒载体表达。
“病毒载体”包括核酸载体构建体，其包括至少一个病毒来源的元件，并具有被包装到病毒载体颗粒中的能力。病毒载体可含有代替非必需病毒基因的编码本文所述多肽的核酸。为了将核酸经体外或体内转移到细胞中的目的，可以利用载体和/或颗粒。
可以使用任何转染试剂或其他有助于核酸进入细胞的物理手段来递送本文所述的核酸。核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、电穿孔、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体和药剂增强的DNA摄取。脂质转染描述于例如，美国专利第5,049,386号、第4,946,787号；和第4,897,355号)并且脂质转染试剂在市场上有售(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适合于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质包括Felgner的WO 91/17424和WO91/16024中的那些脂质。可以递送至细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
脂质:核酸复合物，包括靶向脂质体比如免疫脂质复合物的制备是本领域技术人员公知的(参见，例如，Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等人，Cancer GeneTher.2:291-297(1995)；Behr等人，Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等人，Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等人，Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等人，Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号和第4,946,787号)。
“增加细胞摄取的药剂”是促进分子(例如，核酸、或肽或多肽、或其他原本不能有效跨脂质膜经过细胞膜的分子)的转运的分子。例如，核酸可以与亲脂性化合物(例如，胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(CPP)(例如，穿透素、TAT、Syn1B等)或多胺(例如，精胺)缀合。例如，增加细胞摄取的药剂的其他实例公开于Winkler(2013).Oligonucleotide conjugatesfor therapeutic applications.Ther.Deliv.4(7)；791-809。可通过上文讨论的或本领域已知的任何方法将编码本文提供的融合多肽的一种或多种核酸序列递送至细胞
在任何方面的一些实施方案中，本文提供的载体包含通过本领域已知方法进行的核酸修饰。在一些实施方案中，可以对细胞进行遗传操作以表达一种或多种载体，各载体编码一个或多个囊泡靶向结构域和/或一个或多个信号传导结构域。在某些实施方案中，细胞群已经过遗传操作。这包括，例如，敲除(KO)或转基因(TG)细胞系，其中已去除内源基因和/或以稳定、持久的方式引入外源基因。在某些实施方案中，这进一步包括经由本领域已知的许多方法，比如引入dsRNA、siRNA、微小RNA等，在细胞群内瞬时敲除一个或多个基因以及相关的编码和非编码转录物。这进一步包括经由本领域已知的许多方法，比如引入载体、质粒、人工质粒、复制型和/或非复制型病毒等，在细胞群内瞬时表达一个或多个基因以及相关的编码和非编码转录物。
在某些实施方案中，已经操作细胞群以敲除编码金属内肽酶的一个或多个内源基因序列的表达。在某些实施方案中，已经操作细胞群以敲除编码金属蛋白酶的一个或多个内源基因序列的表达。在某些实施方案中，已经操作细胞群以敲除编码去整合素和金属蛋白酶(ADAM)的一个或多个内源基因序列的表达。例如，可以操作细胞群以敲除编码ADAM1、ADAM2、ADAM7、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM11、ADAM12、ADAM15、ADAM17、ADAM18、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM22、ADAM23、ADAM28、ADAM29、ADAM30、ADAM33等的一个或多个基因序列的表达。
在某些实施方案中，已经操作细胞群以敲除一个或多个内源基因的表达，所述内源基因编码水解由磷脂酰肌醇聚糖锚定的蛋白质中的肌醇磷酸键的酶，从而阻止经由GPI锚附着于质膜的蛋白质的释放。例如，可以操作细胞群以敲除磷脂酰肌醇-聚糖特异性磷脂酶D(GPLD1)的表达。
在某些实施方案中，细胞群已经过遗传操作。这包括例如外源遗传序列的敲入，其中所述外源遗传序列以稳定、持久的方式表达。在某些实施方案中，已经操作细胞群以敲入重组酶识别序列(例如，FRT)、转基因报告子如抗生素抗性基因、荧光或酶报告基因等或类似物。
在一些实施方案中，所述方法包括分离本文提供的工程化细胞外囊泡的步骤。通过一系列特定的离心步骤除去培养基中的颗粒，并过滤培养基。如本文提供的分离细胞外囊泡的一般方法描绘于工作实施例的图21中。分离和纯化细胞外囊泡和外泌体的方法是本领域已知的，并且进一步描述于例如Whitford W,Guterstam P.Exosome manufacturingstatus.Future Med Chem.2019年5月；11(10):1225-1236.doi:10.4155/fmc-2018-0417.PMID:31280675,Patel DB,Santoro M,Born LJ,Fisher JP,Jay SM.Towardsrationally designed biomanufacturing of therapeutic extracellular vesicles:impact of the bioproduction microenvironment.Biotechnol Adv.2018年12月；36(8):2051-2059.doi:10.1016/j.biotechadv.2018.09.001.2018年9月12日电子版.PMID:30218694；PMCID:PMC6250573,Ng KS,Smith JA,McAteer MP,Mead BE,Ware J,JacksonFO,Carter A,Ferreira L,Bure K,Rowley JA,Reeve B,Brindley DA,KarpJM.Bioprocess decision support tool for scalable manufacture of extracellularvesicles.Biotechnol Bioeng.2019年2月；116(2):307-319.doi:10.1002/bit.26809.2018年11月8日电子版.PMID:30063243；PMCID:PMC6322973,Paganini C,Capasso Palmiero U,Pocsfalvi G,Touzet N,Bongiovanni A,Arosio P.ScalableProduction and Isolation of Extracellular Vesicles:Available Sources andLessons from Current Industrial Bioprocesses.Biotechnol J.2019年10月；14(10):e1800528.doi:10.1002/biot.201800528.2019年7月8日电子版.PMID:31140717，将这些文献通过引用完整并入本文。
在一些实施方案中，分离多个工程化EV(人工突触)包括沉淀、离心、过滤、免疫分离、切向流、液相色谱法和/或流分馏。例如，差速超速离心已经成为一种从培养细胞的上清液中分离出分泌的外泌体的技术。这种方法通过利用外泌体相对低的浮力密度，使外泌体与非膜性颗粒分离。尺寸排阻允许它们与生物化学上相似但生物物理上不同的具有高达1000nm的较大直径的微囊泡分离。漂浮速度的差异进一步允许分离不同大小的外泌体。一般而言，外泌体具有30-300nm的直径范围，包括30-150nm的大小。进一步的纯化可能依赖于感兴趣的特定外泌体的特定性质。这包括，例如，使用用感兴趣的蛋白质的免疫吸附来选择具有外质或向外取向的特定囊泡。
在目前的方法(差速离心、不连续密度梯度、免疫亲和、超滤和液相色谱法(例如，快速蛋白液相色谱法(FPLC))中，差速超速离心最常用于外泌体分离。这项技术利用从2000xg增加到10,000xg的离心力，在100,000xg下从外泌体沉淀中分离中等和更大尺寸的颗粒和细胞碎片。单独离心允许从条件培养基大量分离/收集外泌体，尽管它不足以从培养基中除去各种蛋白质聚集体、遗传物质、颗粒和细胞碎片，它们是常见的污染物。增强的外泌体纯化的特异性可以部署顺序离心，与超滤或在蔗糖密度梯度中的平衡密度梯度离心相结合，以提供更高纯度的外泌体制剂(漂浮密度1.1-1.2g/ml)或在制剂中应用离散的糖缓冲物(cushion)。
可以使用超滤来纯化外泌体而不损害其生物活性。已经使用具有不同孔径-比如100kDa截留分子量(MWCO)或300kDa MWCO的膜和用于消除较小的颗粒的凝胶过滤，以避免使用非中性pH或非生理盐浓度。目前可用的切向流过滤(TFF)系统是可扩展的(到>10,000L)，从而允许人们不仅可以纯化，还可以浓缩外泌体部分，并且这种方法比差速离心耗时更少。还可以使用液相色谱法将外泌体纯化成大小均匀的颗粒，并且当制剂保持在生理pH和盐浓度下时保持外泌体的生物活性。
其他化学方法已经利用针对沉淀技术的外泌体的不同溶解性，加入体积排斥聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))，可能结合另外的离心或过滤轮次。例如，可以将沉淀剂
Figure BDA0003869254570002651
加入到条件细胞培养基中，以快速沉淀外泌体群体，尽管经由这种技术制备的沉淀的再悬浮可能是困难的。流场-流分馏(FlFFF)是一种基于洗脱的技术，用于分离和表征大分子(例如，蛋白质)和纳米至微米大小的颗粒(例如，细胞器和细胞)，并已成功应用于从培养基分馏外泌体。
除了这些依赖于一般生物化学和生物物理特征的技术之外，可以将聚焦技术应用于分离的特定的感兴趣的外泌体。这包括依赖于抗体免疫亲和力来识别某些外泌体相关抗原。与磁珠、色谱基质、平板或微流体装置的缀合允许分离感兴趣的特定外泌体群体，这可能与它们从感兴趣的亲本细胞产生或相关细胞调节状态有关。其他亲和捕获方法使用与外泌体表面上的特定糖残基结合的凝集素。
在几个实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括离心细胞和/或受所述细胞调节的培养基。在几个实施方案中，使用超速离心。在几个实施方案中，经由尺寸排阻过滤从细胞群分离多个人工突触。在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用不连续密度梯度、免疫亲和、超滤、切向流和/或液相色谱法。
在某些实施方案中，差速超速离心包括使用1000-2000xg、2000-3000xg、3000-4000xg、4000-5000xg、5000xg-6000xg、6000-7000xg、7000-8000xg、8000-9000xg、9000-10,000xg至10,000xg或更大的离心力，以分离来自源于所述细胞的多个人工突触的更大尺寸的颗粒。
在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用过滤或超滤。在某些实施方案中，使用具有不同孔径的尺寸排阻膜。例如，尺寸排阻膜可以包括使用孔径为0.1-0.5微米(μm)、0.5-1.0μm、1-2.5μm、2.5-5μm、5μm或更多μm的过滤器。在某些实施方案中，所述孔径为约0.2μm。在某些实施方案中，过滤或超滤包括范围为100-500道尔顿(Da)、500-1kDa、1-2kDa、2-5kDa、5-10kDa、10-25kDa、25-50kDa、50-100kDa、100-250kDa、250-500kDa、500kDa或更高kDa的尺寸排阻。在某些实施方案中，尺寸排阻为约2-5kDa。在某些实施方案中，尺寸排阻为约3kDa。在其他实施方案中，过滤或超滤包括尺寸排阻，包括使用能够分离范围为100-500道尔顿(Da)、500-1kDa、1-2kDa、2-5kDa、5-10kDa、10-25kDa、25-50kDa、50-100kDa、100-250kDa、250-500kDa、500kDa或更高kDa的颗粒的中空纤维膜。在某些实施方案中，尺寸排阻为约2-5kDa。在某些实施方案中，尺寸排阻为约3kDa。在其他实施方案中，截留分子量(MWCO)凝胶过滤能够分离范围为100-500道尔顿(Da)、500-1kDa、1-2kDa、2-5kDa、5-10kDa、10-25kDa、25-50kDa、50-100kDa、100-250kDa、250-500kDa、500kDa或更高kDa的颗粒。在某些实施方案中，尺寸排阻为约2-5kDa。在某些实施方案中，尺寸排阻为约3kDa。在各种实施方案中，这样的系统与可变流体流系统结合使用。在某些实施方案中，使用具有不同孔径的尺寸排阻膜，从包含不希望的蛋白质或核酸的溶液纯化细胞外囊泡。
在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用切向流过滤(TFF)系统，用于纯化和/或浓缩外泌体部分。在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用液相色谱法，还可用于将人工突触纯化成大小均匀的颗粒。在各种实施方案中，使用密度梯度，比如在蔗糖密度梯度中离心或在制剂中应用离散的糖缓冲物。
在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用沉淀剂。例如，可以将沉淀剂
Figure BDA0003869254570002671
添加到条件细胞培养基中，以快速和迅速地使人工突触群沉淀。在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用体积排斥聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))。在另一个实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用流场流分馏(FlFFF)，其为一种基于洗脱的技术。
在某些实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用一种或多种捕获剂来分离一种或多种具有特定生物标志物或含有特定生物分子的人工突触。在一个实施方案中，一种或多种捕获剂包括至少一种抗体。例如，使用识别外泌体相关抗原的抗体免疫亲和力来捕获特定的人工突触。在其他实施方案中，至少一种抗体与固定表面比如磁珠、色谱基质、平板或微流体装置缀合，从而允许分离感兴趣的特定外泌体群体。在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用一种或多种不是抗体的捕获剂。这包括，例如，使用呈现抗原特征的“诱饵”分子，其与外泌体表面上相应的感兴趣的分子比如受体或其它偶联分子互补。在一个实施方案中，非抗体捕获剂是能够与外泌体表面上的多糖残基结合的凝集素。
在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用离子交换色谱法。在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用阴离子交换色谱法。在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用阳离子交换色谱法。在某些实施方案中，离子交换色谱法包括具有选自二乙氨基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)、季铵(Q)、羧甲基(CM)、磺丙基(SP)或硫酸甲酯(S)的官能团的色谱树脂。在某些实施方案中，离子交换色谱法包括色谱树脂，其可以具有弱酸、强酸、弱碱或强碱的特性。在某些实施方案中，离子交换色谱法包括选自由下列组成的组的色谱法：DEAE纤维素、DEAE Sephadex、Mono Q、Mini Q、HiTrapCapto、Capto Core 700、HiPrep Q、QAE Sephadex、Q Sepharose、CM纤维素、SP Sepharose、SOURCE S、EAH-Sepharose、磺氧乙基纤维素、CM Sephadex或CM Sepharose。可以通过本领域已知的多种离子交换色谱技术中的任何一种来制备分离多个人工突触。
在其他实施方案中，从细胞群分离多个人工突触包括使用核酸酶(例如，DNA酶或RNA酶)。例如，在存在二价阳离子的情况下，可以将工作浓度的
Figure BDA0003869254570002681
核酸酶加入到细胞外囊泡样品制剂中，所述二价阳离子例如1-2mM Mg2+、2-5mM Mg2+、10-20mM Mg2+、20-50mM Mg2+、50-100mM Mg2+或超过100mM Mg2+。
在分离和纯化本文提供的工程化EV后，可以通过本领域已知的方法进一步评价EV的期望的结构和功能特性。例如，使用基于细胞的生物测定法(例如，那些在商业上可获得的，Promega
Figure BDA0003869254570002682
)、配体-受体结合测定法、囊泡流式细胞测定法、酶联免疫吸附测定、可调电阻脉冲传感(TRPS)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)、表面等离子体共振(SSPR)、核苷酸测序、脂质组学、蛋白质组学、比色测定、荧光测定、发光测定、免疫印迹、放射免疫测定、电子显微镜检查或EV自动分析(例如，
Figure BDA0003869254570002683
)，可以测定本文提供的工程化外泌体对靶细胞的功能活性。另外的表征EV的方法可见于，例如，Zhang Y,Bi J,Huang J,Tang Y,DuS,Li P.Exosome:A Review of Its C lassification,Isolation Techniques,Storage,Diagnostic and Targeted Therapy Applications.Int J Nanomedicine.2020年9月22日；15:6917-6934.doi:10.2147/IJN.S264498.PMID:33061359；PMCID:PMC7519827，Kluszczyńska K,Czernek L,Cypryk W,
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药物组合物
本文提供了包含本文提供的工程化细胞外囊泡(人工突触)的组合物。
在一个方面，本文提供了包含多个本文提供的工程化细胞外囊泡的组合物。在任何方面的一些实施方案中，本文提供的组合物和工程化EV还包含药学上可接受的载体。
对于本文所述的方法和组合物的临床应用，本文提供的工程化EV/人工突触的施用可包括配制成用于肠胃外施用(例如，静脉内施用；粘膜，例如，鼻内；眼部或其他给药方式)的药物组合物或药物制剂。在一些实施方案中，本文所述的工程化EV可以与任何药学上可接受的载体化合物、材料或组合物一起施用，从而在受试者中产生有效治疗。因而，在本文所述方法中使用的药物制剂可以含有与一种或多种药学上可接受的成分相组合的本文所述的工程化EV。短语“药学上可接受的”是指这些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏响应、或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称。如本文所用的短语“药学上可接受的载体”表示药学上可接受的材料、组合物或媒介物，比如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、封装材料、制造助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)，或溶剂封装材料，其涉及维持本文所述的工程化EV的稳定性、溶解性或活性。与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。术语“赋形剂”、“载体”“药学上可接受的载体”或类似术语在本文中可互换使用。
本文提供的工程化EV可被配制为用于以固体、液体或凝胶形式给受试者施用化合物，包括适用于下列的那些：(1)肠胃外给药，例如，通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或混悬液，或持续释放制剂；(2)经皮；(3)跨粘膜；(4)经由支气管肺泡灌洗。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含基于颗粒或聚合物的媒介物。示例性的基于颗粒或聚合物的媒介物包括但不限于纳米颗粒、微粒、聚合物微球或聚合物-药物缀合物。
在任何方面的一个实施方案中，本文所述的组合物还包含脂质媒介物。示例性脂质媒介物包括但不限于脂质体、磷脂、胶束、脂质乳剂和脂质-药物复合物。
制剂可适用于递送至气道，例如，用于治疗呼吸道炎症。这样的制剂可适用于作为气雾剂递送，例如，用于吸入。在一些实施方案中，将本文所述的组合物配制为用于气雾剂给药、雾化器给药、气管灌洗给药或用于肺部递送装置。
如本文所用，术语“肺部递送装置”是指用于将治疗剂量的本发明组合物递送至呼吸系统的装置，包括但不限于雾化器、定量吸入器或干粉吸入器。
雾化器的实例包括但不限于软雾吸入器(例如
Figure BDA0003869254570002711
BoehringerIngelheim)、喷射雾化器(使用压缩气体或空气)、超声波雾化器(使用在高频率的压电晶体振动产生气溶胶)和振动网状雾化器。
如本文所用，术语“喷射雾化器”是指使压缩空气或气体流动穿过本发明组合物以进行雾化的装置。本发明的气溶胶化组合物可以被患者吸入。喷射雾化器可以包括但不限于具有波纹管的喷射雾化器、具有收集袋的喷射雾化器、呼吸增强的喷射雾化器、呼吸驱动的喷射雾化器和定量吸入器。喷射雾化器的实例包括但不限于Circulaire(Westmed INC,Tucson,AZ)、Pari Inhalierboy(PARI,Midlothian,VA)、Pari LC Plus(PARI,Midlothian,VA)、NebuTech(Salter Labs,Arvin,CA)、AeroEclipse(Monoghan/Trudell MedicalInternational,London,Ontario,Canada)和Maxin MA-2(MA-2；Clinova Medical AB,
Figure BDA0003869254570002712
Sweden)。超声波雾化器的实例包括但不限于DeVilbiss-Pulmosonic(Somerset,PA)、Omron-Microair(Omron,Kyoto,Japan)、Omron NE-U17(Omron,Kyoto,Japan)、RhonePoulenc-Rorer-Fisoneb(Sanofi,Paris,France)和Beurer雾化器IH30(Beurer GmbH,Neu-Ulm,Germany)。
如本文所用，术语“网状雾化器”是指迫使液体、凝胶、流体、溶液、酊剂等通过网或孔板中的孔以产生气溶胶。网状雾化器可以包括但不限于主动网状雾化器和被动网状雾化器。主动网状雾化器的实例包括但不限于
Figure BDA0003869254570002721
(Aerogen,Galway,Ireland)和
Figure BDA0003869254570002722
(PARI,Midlothian,VA)。被动网状雾化器的实例包括但不限于I-neb(PhilipsRespironics,Newark,USA)、AKITA(Activaero,Gemunden/Wohra,Germany)和Microair
Figure BDA0003869254570002723
(Omron,Kyoto,Japan)。
为了用作气雾剂，可以将本文所述的组合物制备在溶液或悬浮液中，并且可以与适合的推进剂例如烃推进剂(如丙烷、丁烷或异丁烷)以及常规赋形剂一起包装在加压气雾剂容器中。
本文提供的工程化EV也可以以非加压形式施用，例如在将液体变成细喷雾的雾化器(nebulizer)或雾化器(atomizer)中。优选地，通过这样的雾化，以控制的方式从较大的液体主体产生均匀尺寸的小液滴。为此，可以通过任何适合的手段实现雾化，包括通过使用许多已知的和当今市售的雾化器。例如，可从伊利诺伊州奈尔斯的吸入塑料公司(Inhalation Plastic,Inc.of Niles,Ill)获得的AEROMISTTM气动雾化器。
当活性成分适用于经由雾化器一起或单独施用时，它们可以是雾化的水性悬浮液或溶液的形式，其中有或没有适当的pH或张力调节，其形式为单位剂量或多剂量装置。
此外，任何适合的气体都可以用于在雾化过程中施加压力，迄今为止优选的气体是化学惰性气体。可以有利地使用示例性气体，包括但不限于氮气、氩气或氦气。
在一些实施方案中，本文所述的组合物也可以干粉形式直接施用到气道。因而，工程化EV可以经由吸入器施用。示例性吸入器包括定量吸入器和干粉吸入器。
定量吸入器或“MDI”是耐压罐或容器，其填充有产品，比如溶解在液化推进剂中的药物组合物或悬浮在液化推进剂中的微粉化颗粒。可以使用的推进剂包括含氯氟烃、烃或氢氟烷烃。常用的推进剂是P134a(四氟乙烷)和P227(七氟丙烷)，每一种都可以单独使用或组合使用。它们任选地与一种或多种其他推进剂和/或一种或多种表面活性剂和/或一种或多种其他赋形剂，例如乙醇、润滑剂、抗氧化剂和/或稳定剂组合使用。
如本文所用，术语“干粉吸入器”是指将治疗剂量的没有推进剂的粉末形式的本发明组合物递送至呼吸系统的装置。干粉吸入器(即，TurbuhalerTM(Astra AB))是一种用压缩空气源可操作以产生药物组合物的干粉颗粒的系统，所述药物组合物被压缩成非常小的体积。干粉吸入器的实例包括但不限于
Figure BDA0003869254570002731
(Fisons Pharmaceuticals,Rochester,NY)、
Figure BDA0003869254570002732
(GlaxoSmithKline,NC)、
Figure BDA0003869254570002733
(AstraZeneca,UK)和
Figure BDA0003869254570002734
(GlaxoSmithKline,NC)。
用于吸入疗法的干粉气溶胶通常以主要在<5μm的范围内的平均直径产生。当颗粒的直径超过3μm时，越来越少被巨噬细胞吞噬。然而，还发现增加颗粒尺寸使颗粒(具有标准质量密度)进入气道和腺泡的可能性最小化，这是由于在口咽区或鼻区中的过度沉积所致。
举例来说，适合的粉末组合物包括包含本文所述的工程化EV的粉末制剂。这些可以与乳糖或其他可接受的用于支气管内给药的惰性粉末混合。所述粉末组合物可经由气溶胶分配器施用或封装在易碎胶囊中，所述胶囊可以由患者或临床医师插入到刺穿胶囊并以适于吸入的稳定流将粉末吹出的装置中。所述组合物可包括推进剂、表面活性剂和共溶剂并且可装入常规的气溶胶容器中，所述容器通过适合的计量阀关闭。
用于递送至呼吸道的气溶胶描述于例如Adjei,A.和Garren,J.Pharm.Res.,1:565-569(1990)；Zanen,P.和Lamm,J.-W.J.Int.J.Pharm.,114:111-115(1995)；Gonda,I."Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratorytract,"in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,6:273-313(1990)；Anderson等人，Am.Rev.Respir.Dis.,140:1317-1324(1989))并且也具有全身递送肽和蛋白质的潜力(Patton和Platz,Advanced Drug Delivery Reviews,8:179-196(1992))；Timsina等人，Int.J.Pharm.,101:1-13(1995)；和Tansey,I.P.,SprayTechnol.Market,4:26-29(1994)；French,D.L.,Edwards,D.A.和Niven,R.W.,AerosolSci.,27:769-783(1996)；Visser,J.,Powder Technology 58:1-10(1989))；Rudt,S.和R.H.Muller,J.Controlled Release,22:263-272(1992)；Tabata,Y和Y.Ikada,Biomed.Mater.Res.,22:837-858(1988)；Wall,D.A.,Drug Delivery,2:10 1-201995)；Patton,J.和Platz,R.,Adv.Drug Del.Rev.,8:179-196(1992)；Bryon,P.,Adv.Drug.Del.Rev.,5:107-132(1990)；Patton,J.S.等人，Controlled Release,28:1579-85(1994)；Damms,B.和Bains,W.,Nature Biotechnology(1996)；Niven,R.W.等人，Pharm.Res.,12(9)；1343-1349(1995)；和Kobayashi,S.等人，Pharm.Res.,13(1):80-83(1996)；将各自的内容通过引用完整并入本文。
微乳化技术可以提高一些亲脂(水不溶性)药剂的生物利用度。实例包括Trimetrine(Dordunoo,S.K.等人，Drug Development and Industrial Pharmacy,17(12),1685-1713,1991和REV 5901(Sheen,P.C.等人，J Pharm Sci 80(7),712-714,1991)。除其他外，通过优先将吸收导向至淋巴系统而不是循环系统，从而绕过肝脏，并防止基于细胞的组合物在肝胆循环中破坏，微乳化提供了提高的生物利用度。
可以用两亲性载体配制本文所述的工程化EV。两亲性载体是饱和的和单不饱和的聚乙二醇化脂肪酸甘油酯，例如从完全或部分氢化的各种植物油获得的那些。这样的油可以有利地由三-、二-和单脂肪酸甘油酯和相应脂肪酸的二-和单聚乙二醇酯组成，其中特别优选的脂肪酸组成包括癸酸4-10％、癸酸3-9％、月桂酸40-50％、肉豆蔻酸14-24％、棕榈酸4-14％和硬脂酸5-15％。有用的另一类两亲性载体包括用饱和或单不饱和脂肪酸(SPAN系列)或相应的乙氧基化类似物(TWEEN系列)部分酯化的脱水山梨醇和/或山梨醇。
特别考虑了在商业上可获得的两亲性载体，包括Gelucire系列、Labrafil、Labrasol或Lauroglycol(均由法国Saint Priest的Gattefosse公司制造和销售)、PEG-单油酸酯、PEG-二油酸酯、PEG-单月桂酸酯和二月桂酸酯、卵磷脂、聚山梨醇酯80等(由美国和世界各地的许多公司生产和销售)。
可以用亲水聚合物配制本文提供的工程化EV组合物。亲水聚合物是水溶性的，可以共价连接到形成囊泡的脂质上，并且可以体内耐受而没有毒性作用(即，生物相容的)。适合的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(也称为聚丙交酯)、聚乙醇酸(也称为聚乙交酯)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇。其他适合的亲水聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生的纤维素比如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
在某些实施方案中，本文所述的药物组合物包含生物相容性聚合物，其选自由下列组成的组：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酐、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、多糖、蛋白质、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯及其共混物、混合物或共聚物。
在某些实施方案中，将本文所述的药物组合物配制成脂质体。可以通过本领域已知的各种技术制备脂质体。参见，例如，美国专利第4,235,871号；公布的PCT申请WO 96/14057；New RRC,Liposomes:A practical approach,IRL Press,Oxford(1990)，第33-104页；Lasic DD,Liposomes from physics to applications,Elsevier SciencePublishers BV,Amsterdam,1993。
可以通过用任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂制备如本文所述的工程化EV组合物的治疗制剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980))，其为冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(比如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，比如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，比如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，比如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，比如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，比如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，比如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
包含如本文所述的工程化EV组合物的疫苗或其他药物组合物可含有药学上可接受的盐，典型地，例如，氯化钠，并且优选为约生理浓度。本文所述的疫苗或其他药物组合物的制剂可以含有药学上可接受的防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂浓度范围为从0.1％到2.0％，典型地表示为v/v。适合的防腐剂包括制药领域已知的防腐剂。苯甲醇、苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯是防腐剂的实例。本文所述的疫苗或其他药物组合物的制剂可以包含浓度为0.005％至0.02％的药学上可接受的表面活性剂。
在被治疗的特定适应症需要时，本文所述的治疗性药物组合物还可含有多于一种的活性化合物，优选地，所述活性化合物具有彼此无不良影响的互补活性。
在一些实施方案中，其中工程化EV被配制为用于疫苗中或与疫苗一起使用，可以将所述疫苗组合物配制为其中工程化EV用作佐剂。在其他实施方案中，可以用工程化EV和另外的佐剂配制所述疫苗组合物，例如，如本领域已知。
如本文在免疫、免疫应答和疫苗接种的上下文中所用，术语“佐剂”是指当与特定抗原联合使用时产生比单独使用抗原更稳健的免疫应答的任何物质。当掺入疫苗制剂中时，佐剂通常起到加速、延长或增强对疫苗抗原的特异性免疫应答质量的作用。佐剂通常促进辅助细胞或因子的积累和/或激活，以增强抗原特异性免疫应答，从而增强疫苗的效力，即，用于诱导针对抗原的保护性免疫的含抗原或编码组合物。
一般而言，佐剂包括产生储库效应的佐剂、免疫刺激佐剂和产生储库效应并刺激免疫系统的佐剂。产生储库效应的佐剂是使抗原在体内缓慢释放，从而延长免疫细胞暴露于抗原的佐剂。这类助剂包括但不限于明矾(例如，氢氧化铝、磷酸铝)；基于乳液的制剂，包括矿物油、非矿物油、油包水或油包水包油乳液、水包油乳液，比如Seppic ISA系列Montanide佐剂(例如，Montanide ISA 720；AirLiquide,Paris,France)；MF-59(一种用司盘85和吐温80稳定的水包角鲨烯乳液；Chiron Corporation,Emeryville,Calif.)；和PROVAXTM(一种含有稳定洗涤剂和胶束形成剂的水包油乳液；IDEC PharmaceuticalsCorporation,San Diego,Calif.)。
免疫刺激佐剂是引起免疫系统细胞的激活的佐剂。例如，它可以引起免疫细胞产生和分泌细胞因子和干扰素。这类佐剂包括但不限于从皂皮树的树皮中纯化的皂苷，比如QS21(一种糖脂，用HPLC分馏洗脱在第21个峰中；Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Worcester,Mass.)；聚[二(羧基合苯氧基)磷腈(PCPP聚合物；Virus Research Institute,USA)；脂多糖的衍生物，比如单磷酰脂质A(MPL；Ribi ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,Mont.)、胞壁酰二肽(MDP；Ribi)和苏氨酰-胞壁酰二肽(t-MDP；ribi)；OM-174(一种与脂质A相关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA,Meyrin,Switzerland)；和利什曼原虫延伸因子(一种纯化的利什曼原虫蛋白；Corixa Corporation,Seattle,Wash.)。这类佐剂还包括CpG DNA。
产生储库效应并刺激免疫系统的佐剂是那些具有两种以上鉴定的功能的化合物。这类佐剂包括但不限于ISCOMS(免疫刺激复合物，其含有混合皂苷、脂质，并形成具有可容纳抗原的孔的病毒大小的颗粒；CSL,Melbourne,Australia)；SB-AS2(SmithKline Beecham佐剂系统#2，其为含有MPL和QS21的水包油乳液：SmithKline Beecham Biologicals[SBB],Rixensart,Belgium)；SB-AS4(含有明矾和MPL的SmithKline Beecham佐剂系统#4；SBB，Belgium)；形成胶束的非离子嵌段共聚物，比如CRL 1005(这些含有疏水性聚氧丙烯的直链，其侧接聚氧乙烯链；Vaxcel,Inc.,Norcross,Ga.)；和Syntex佐剂制剂(SAF，一种含有吐温80和非离子嵌段共聚物的水包油乳液；Syntex Chemicals,Inc.,Boulder,Colo.)。
可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合将本文所述的药物组合物的活性成分包埋在制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这样的技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)中。
在一些实施方案中，可以使用缓释制剂。缓释制剂的适合实例包括含有本文所述的组合物的固体疏水聚合物的半透性基质，其中所述基质呈成形物品的形式，例如，薄膜、或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙基酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，比如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够使分子释放持续100天以上，但某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时期。当被包封时，所述组合物可在体内长时间保留(例如，长达约1小时、1-12小时之间、12-24小时、24小时至2天、2-3天、3-4天、4-5天、5-6天、6-7天、1-2周、3-4周、4周至2个月、2-3个月、3-4个月、4-5个月、5-6个月或6个月以上，或其变体)，作为暴露于在37℃下的湿度的结果而变性或聚集，从而导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。可以根据所涉及的机制针对稳定化设计合理的策略。例如，如果发现凝集机制为通过巯基二硫键转换的分子间S-S-键形成，可通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制含湿量、使用适当的添加剂、和开发特定的聚合物基质组成而实现稳定化。
给药、剂量、功效
本文所述的工程化EV组合物、药物组合物或疫苗组合物可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的特定病症、被治疗的具体受试者、个体受试者的临床状况、病症原因、疫苗组合物的递送部位、给药方法、给药方案、以及执业医师已知的其他因素。
通常，人工突触作为治疗的应用将考虑与其他治疗策略相似的参数，包括浓度、递送时间和在损伤/疾病部位的持续生物利用度。细胞外囊泡可以经由多种途径递送：静脉内、冠状动脉内和心肌内。细胞外囊泡(例如，外泌体)也允许新的递送途径，这些途径在以前对于细胞疗法是不可行的，比如吸入或注射。这些不同的方法如下所述，包括注射、局部施加、肠内给药和肺部递送。
可通过任何适当的途径将本文提供的工程化EV组合物施用至有需要的受试者，从而在受试者中产生有效治疗。如本文所用，术语“施用”和“引入”可互换使用，是指通过一种方法或途径将本文提供的组合物置于受试者体内，所述方法或途径导致这样的组合物至少部分定位在期望部位，例如炎症或肿瘤部位，从而产生期望的效果。可以通过将组合物全身性递送或递送至期望的表面或靶标的任何给药方式将所述组合物施用于受试者，并且可以包括但不限于注射、输注、滴注和吸入给药。在组合物可以被保护而免于在肠道中失活的程度上，还考虑了口服给药形式。“注射”包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、眶后、玻璃体内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、脑内、跗骨内和胸骨内、肿瘤内注射和输注等，正如本领域已知的。
可以通过控制释放的方式将本发明的治疗剂量递送给患者，例如但不限于可植入泵和可植入套管，以提供到静脉或动脉系统的连续通路。
局部施加是指将本发明的组合物以用于局部和/或全身治疗的治疗有效量通过内部和/或外部两者施加或铺展到身体表面上或体内。局部施加可以是表皮施用，其中可以将本发明的组合物直接施加到皮肤或粘膜的局部表面上。局部施加可以包括透皮施加，其中可以使本发明的组合物吸收到体内，以获得全身递送和全身分布。局部施加制剂可包括但不限于乳膏、泡沫、凝胶、洗剂、溶液、软膏、皮肤贴剂、透皮贴剂、粉末、固体、海绵、胶带、蒸气、糊剂、薄膜、脂质体、香膏、香波、喷雾剂或酊剂等或其组合。可以通过阴道(例如阴道栓剂、阴道环、冲洗器、宫内节育器、膀胱内输注等)或尿道等或其组合来递送治疗剂量的本发明组合物。
肠内给药是指本发明的组合物以局部或全身治疗的治疗有效量经由胃肠道给药。肠内给药可以包括但不限于通过口、舌下、食道、胃的(例如胃)、小肠、大肠或直肠递送本发明的组合物。本发明的口服递送可以包括但不限于使用胶囊、软锭剂、丸剂、片剂、溶液、凝胶、混悬剂、乳剂、糖浆、酏剂、酊剂、漱口水、锭剂、口香糖、棒棒糖、乳膏、泡沫、溶液、粉末、固体、蒸气、脂质体、喷雾剂或酊剂渗透控制释放口服递送系统等。胃递送可能涉及使用直接通向胃的管或鼻道，例如经皮内窥镜胃造口管。胃递送可涉及通过腹壁进行的直接注射。直肠递送可以包括但不限于使用栓剂、软膏、灌肠剂、墨菲滴剂等。本发明的治疗剂量可以通过控制释放的方式递送给患者，例如但不限于控释药物递送小丸或丸剂。
吸入(即，肺部递送、肺部给药是指通过呼吸途径向呼吸系统递送，包括但不限于，用于局部或全身治疗的治疗有效量的鼻内给药、口服给药和口服吸入给药(例如气管内滴注和气管内吸入)。可以通过分散，例如通过使用注射器，实现治疗有效量的本发明组合物的肺部递送。可以通过气溶胶给药实现本发明组合物的肺部递送，其中气溶胶给药可以通过重力沉降、惯性碰撞或扩散来沉积本发明的治疗有效量。
可以通过外周或中心静脉导管进行静脉输送技术。作为最简单的递送方式，这项技术避免了侵入性程序的风险。然而，静脉内可能被认为是一种相对低效和较少定位的递送方法，因为高百分比的输注细胞外泌体可能被隔离在诸如肺、肝或脾的器官中。这样的隔离可能导致很少或没有细胞外泌体到达更广泛的循环，或在它们分布后具有非预期全身效应。
在某些实施方案中，给药可以包括递送至与患病和/或功能失调组织的部位相同的组织或器官部位。在某些实施方案中，给药可以包括递送至与患病和/或功能失调组织的部位不同的组织或器官部位。在某些实施方案中，所述递送经由吸入或口服给药来实施。在各种实施方案中，人工突触的给药可以包括多种递送技术的组合。
在一些实施方案中，通过气溶胶给药、雾化器给药或气管灌洗给药来施用本文所述的组合物。
如本文所用的术语“有效量”是指缓解或预防疾病或病症(例如，自身免疫性疾病或癌症)的至少一种或多种症状所需的工程化EV组合物的量，并且涉及提供期望的效果(例如，减轻与疾病相关或由疾病引起的病理或任何症状)的药理学组合物的足够量。因此，术语“治疗有效量”是指当施用于典型受试者时，使用本文公开的方法的本文所述的工程化EV组合物或疫苗组合物足以影响特定的疾病状态的量。如本文所用的有效量还包括足以延缓疾病症状的发展、改变疾病症状的过程(例如，但不限于，减缓疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。因而，不可能规定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定适当的“有效量”。
可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定有效量、毒性和治疗效果，例如，所述程序用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。所述剂量可以取决于所采用的剂型以及利用的给药途径而变化。在毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，并且可以被表示为比率LD50/ED50。表现出大的治疗指数的组合物和方法是优选的。可以根据细胞培养测定法初步估计治疗有效剂量。同样，可在动物模型中配制剂量，以实现包括IC50(即，实现症状的半最大抑制的本文提供的工程化EV或融合多肽的浓度)的循环血浆浓度范围，如在细胞培养中或在适当的动物模型中确定的。通过例如高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、FACS分选、Western印迹、质谱法、可调电阻脉冲传感、
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qRT-PCR、下一代测序(NGS)或通过本领域普通技术人员已知的任何分析技术，可以测量血浆中的治疗性工程化EV的水平。可以通过适合的生物测定来监测任何特定剂量的效果。剂量可以由医师决定，并根据需要进行调整，以适应观察到的治疗效果。
在一些实施方案中，本文所述的工程化EV组合物、药物组合物或疫苗组合物可以与例如一种或多种目前用于预防或治疗感染的另外的治疗剂一起配制。这样的其他药剂的有效量取决于所述制剂中工程化EV的量、病症或治疗的类型、以及以上讨论的其他因素。这些药剂通常以与本文之前所用相同的剂量和给药途径使用，或为迄今采用剂量的约1-99％。
本文所述的药物组合物的剂量范围取决于效力，包括足以产生期望效果的量。剂量不应该太大，以免引起不可接受的不良副作用。通常，剂量将随着患者的年龄、疾患、健康状况和性别而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在发生任何并发症的情况下，也可以由个体医师调整剂量。在一些实施方案中，剂量范围为从0.001mg/kg体重到100mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量范围为从5μg/kg体重到100μg/kg体重。可替代地，可以滴定剂量范围，使血清水平保持在0.1μg/mL至1000μg/mL之间。对于全身给药，受试者可被给予治疗量，例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg或更多。可以通过一次或多次分开给药或通过连续输注来施用这些剂量。对于几天或更长时间的重复给药，根据情况，治疗持续到例如感染被治疗时为止，如通过上述或本领域已知的方法测量的。然而，其他剂量方案可以是有用的。
在各种实施方案中，被施用以实现这些效果的人工突触的数量范围为1x106至1x107、1x107至1x108、1x108至1x109、1x109至1x1010、1x1010至1x1011、1x1011至1x1012、1x1012至1x1013、1x1013至1x1014、1x1014至1x1015、1x1015个或更多个EV/人工突触。在其他实施方案中，人工突触的数量是相对于细胞治疗方法的临床相关剂量中使用的细胞数而言。例如，定义有效剂量范围、给药方案和给药途径，可以通过使用荧光标记的人工突触和测量靶组织保留的研究加以指导，可以是>10X、>50X或>100X背景，正如测量5、10、15、30或30分钟或更长时间作为筛选标准。在某些实施方案中，在30min测量的>100X背景是低剂量和高剂量的基线测量，然后评估其安全性和生物活性(例如，使用MRI终点：疤痕大小、被治疗的靶器官的整体和区域功能)。在各种实施方案中，将单剂量与两个、三个、四个、四个或更多个顺序施加的剂量进行比较。在各种实施方案中，提供重复或顺序施加的剂量，用于治疗急性疾病和/或疾患。在各种实施方案中，提供重复或顺序施加的剂量，用于治疗慢性疾病和/或疾患。在其他实施方案中，多个人工突触的施用是对标准治疗的辅助。
在其他实施方案中，施用组合物包括在单剂量的1×1010个或更多人工突触。在各种实施方案中，外泌体量可以由蛋白质的量来定义，比如包括1-10、10-25、25-50、50-75、75-100或100或更多mg的外泌体蛋白质的剂量。在其他实施方案中，给受试者多次施用单剂量。在其他实施方案中，组合物的施用由下列一种或多种组成：注射、局部给药、肠内、静脉内、动脉内或吸入。
在各种实施方案中，外泌体量可以由蛋白质的量来定义，比如包括1-10、10-25、25-50、50-75、75-100或100或更多mg的外泌体蛋白质的剂量。在各种实施方案中，组合物的施用包括多剂量的人工突触。在各种实施方案中，提供重复或顺序施加的剂量，用于治疗急性疾病和/或疾患。在各种实施方案中，提供重复或顺序施加的剂量，用于治疗慢性疾病和/或疾患。
在其他实施方案中，给受试者施用包含多个人工突触的组合物是对标准治疗的辅助。
只要有医学指征，使用本文所述方法的治疗的持续时间将继续，或直到实现期望的治疗效果(例如，本文所述的那些)时为止。在某些实施方案中，本文所述的疫苗组合物的施用持续1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年、20年，或持续多年，直到受试者的终生。
正如本领域技术人员理解，给定组合物的适当给药方案可以包括单次给药/免疫或多次给药/免疫。可以在多个时间段重复给予后续剂量，例如，约两周或更长时间，贯穿受试者的整个一生，以便例如提供持续的预防效果。在初次免疫之后，后续剂量可以间隔，例如，约两周、约三周、约四周、约一个月、约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月、约七个月、约八个月、约九个月、约十个月、约十一个月或约一年。
在制剂中采用的精确剂量也将取决于给药途径，并且应该根据从业者的判断和每位患者的情况来决定。最终，从业者或医师将决定施用于特定受试者的工程化EV或其组合物的量。
调节炎症和治疗自身免疫性疾病的方法
可以将本文提供的人工突触/工程化EV及其组合物部署在针对几乎任何损伤/疾病的治疗策略中，因为提供了改变生物信号传导的平台。这包括，例如，炎症和免疫信号传导，其在活生物体的几乎所有损伤和疾病中起作用。
因而，本文描述了一种调节炎症的方法，所述方法包括选择患有炎症相关疾病和/或疾患的受试者；以及给所述受试者施用包含多个人工突触(工程化EV)的组合物，其中施用所述组合物调节炎症。
如本文所用，术语“炎症”或“发炎的”是指免疫系统或免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞)的激活或募集。有炎症的组织会变红、变白、肿胀、发热、疼痛、敏感，表现出功能丧失，或有一层膜或粘液。鉴定炎症的方法是本领域公知的。炎症通常发生在损伤、微生物感染、暴露于物质(例如，毒素、化学品或粉尘)或自身免疫功能障碍之后。炎症的发作可以是迅速的(例如，在损伤后立即发作)或缓慢的(例如，随着时间的推移重复暴露于诸如化学品的刺激物)，其中持续时间为数分钟、数小时、数天、数月、数年或个体的一生。
炎症在对免疫系统提醒体内潜在危险和损伤方面起重要作用。炎症对于控制和修复损伤是必需的。例如，急性炎症是对物理创伤、感染和应激的响应。急性炎症有助于防止进一步的损伤，并触发愈合和恢复。不幸的是，炎症可能变得过度和不适当地活跃，持续超过损伤或感染的典型恢复时间。其中健康的炎症有助于身体对损伤作出响应，慢性炎症使损伤永久化并且可能导致对人健康的负面后果。具体而言，自身免疫性疾病是由于宿主的免疫系统攻击自身所致的慢性疾病，通常是由于宿主中异常的生物信号传导所致。通过施加特别是靶向免疫检查点的人工突触，恢复正常的稳态信号传导代表非常有前途的途径。例如，当经由人工突触递送时，表面结合的免疫检查点蛋白或其片段可调节免疫细胞刺激并影响免疫细胞功能的抑制。具有表面结合的免疫检查点蛋白或其片段的人工突触的注射、吸入、摄入或局部施加可用于治疗免疫、自身免疫、炎性和自身炎性疾患。实例包括慢性阻塞性肺病(COPD)(是一种炎性的、进行性的、威胁生命的肺病)、银屑病(一种常见的慢性非传染性炎症性皮肤病)、关节炎(使人虚弱和疼痛的关节退化)以及本领域技术人员公知的其他疾病。
在其他实施方案中，炎症相关疾病和/或疾患是急性的，例如败血症。在其他实施方案中，炎症相关疾病和/或疾患是慢性的，例如慢性阻塞性肺病。在其他实施方案中，所述炎性疾患是自身免疫性疾病，其中所述自身免疫性疾病和/或疾患是下列一种或多种：多发性肌炎、皮肌炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、炎性肠病、克罗恩病、甲状腺功能亢进、自身免疫性肾上腺功能不全、舍格伦综合征、I型糖尿病、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、结节性多动脉炎、复发性多软骨炎、白塞病、反应性关节炎、强直性脊柱炎、格林-巴利综合征或视神经病变。在其他实施方案中，疾病和/或疾患是慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎、葡萄膜视网膜炎、银屑病和湿疹。在其他实施方案中，疾病和/或疾患是易激性肠病、多发性硬化或狼疮。
在其他实施方案中，炎症相关疾病和/或疾患是眼部疾病。如本文所用，术语“眼部疾病”、“眼病症”和“眼病”可互换使用，是指影响一只或两只眼睛或眼睛的一般区域、眼睑或眼睛周围或附近区域的健康和/或视力的疾病或病症。眼病可以包括但不限于黄斑变性(例如，年龄相关性黄斑变性)、白内障、糖尿病视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、眼飞蚊症、电光性眼炎、青光眼、弱视、斜视、视网膜炎(例如，CMV视网膜炎)、色盲、圆锥角膜、视网膜脱离、眼睑抽搐、高眼压、睑缘炎、葡萄膜炎、Bietti晶体营养不良、眼睑痉挛、角膜和角膜疾病、干眼、组织胞浆菌病、黄斑裂孔、黄斑皱褶、结膜炎、老视、视网膜母细胞瘤、视网膜色素变性、视网膜病、斯塔加特病(Stargardt disease)、厄舍综合征(Usher syndrome)、葡萄膜Coloma和玻璃体脱离等。
本文描述了一种治疗方法，所述方法包括选择需要治疗的受试者，给个体施用包含多个人工突触的组合物，其中施用所述组合物治疗所述受试者。在某些实施方案中，受试者需要治疗涉及组织损伤或功能障碍的疾病和/或疾患。
本文描述了治疗受试者的自身免疫性疾病、炎症、炎性疾病或疾患或癌症的方法，所述方法包括：给受试者施用本文提供给受试者的工程化EV或其组合物。
测量的或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物，例如，临床或生物标志物的升高或降低的水平，以及与疾病或病症的症状或标志物的临床接受等级相关的参数。然而，应当理解的是，将由主治医师在合理的医学判断范围内决定本文公开的组合物和制剂的总用量。需要的确切量将根据治疗的疾病类型等因素而变化。
可用于评估自身免疫性疾病、炎性疾患或炎症参数的临床试验的非限制性实例包括血液测试、皮肤活检、MRI、眼部检查、眼压测试等。在必要或需要的情况下，可以使用损伤或疾病的动物模型来测量本文所述的特定组合物的有效性。例如，可以使用如工作实施例中展示的EAU动物模型。
在各种实施方案中，施用多个人工突触改变了在受损或功能障碍组织中的基因表达，提高了受损组织的活力和/或增强了个体中的新组织的再生或产生。在各种实施方案中，施用多个人工突触改变了受损或功能障碍组织中的基因表达，提高了受损组织的活力和/或增强了个体中的新组织的再生或产生。
在各种实施方案中，由于急性事件，受损或功能障碍的组织需要修复、再生或改善功能。急性事件包括但不限于创伤，比如撕裂伤、挤压伤或撞击伤、休克、失血或缺氧、感染、化学或热暴露、中毒或毒液暴露、药物过度使用或过度暴露等。其他损伤来源还包括但不限于损伤、年龄相关性黄斑变性、癌症和感染。在几个实施方案中，用于制备本文提供的工程化EV的再生细胞来自需要修复或再生的同一个组织类型。在几个其他实施方案中，再生细胞来自需要修复或再生的组织以外的组织类型。在一些实施方案中，本文提供的工程化EV来源于被治疗的受试者。在一些实施方案中，工程化EV来源于供体受试者。
在其他实施方案中，由于慢性疾病的损害，受损或功能障碍的组织需要修复、再生或改善功能。
一些选择的定义
将所有在本文中引用的参考文献通过引用完整并入本文，如同完全列出一样。除非另外定义，本文中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Allen等人，Remington:The Science and Practice of Pharmacy第22版，Pharmaceutical Press(2012年9月15日)；Hornyak等人，Introduction toNanoscience and Nanotechnology,CRC Press(2008)；Singleton和Sainsbury,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版，修订版，J.Wiley&Sons(NewYork,NY 2006)；Smith,March’s Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanismsand Structure第7版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2013)；Singleton,Dictionary of DNAand Genome Technology第3版,Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第4版，Cold Spring HarborLaboratory Press(Cold Spring Harbor，NY 2012)，为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指南。关于抗体和融合多肽的制备和结构的参考文献，参见例如，Greenfield,Antibodies A Laboratory Manual第2版，Cold Spring Harbor Press(ColdSpring Harbor NY,2013)；
Figure BDA0003869254570002891
和Milstein，Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion,Eur.J.Immunol.1976年7月，6(7):511-9；Queen和Selick,Humanized immunoglobulins、美国专利第5,585,089号(1996年12月)；以及Riechmann等人，Reshaping human antibodies for therapy,Nature1988Mar 24,332(6162):323-7。还参见，Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))，Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)，Bird等人，Science 242,423-426(1988)，Brinkman等人，mAbs第9卷，第2期，182-212(2017),Chothia&Lesk,J.Mol.Biol,196:901-917(1987)，Chothia等人，Nature 342:877-883(1989)),Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123)；Kontermann和Dubel编辑，Antibody Engineering,Springer-Verlag,N.Y.(2001)，第790页，(ISBN 3-540-41354-5，Zapata等人，(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984)，美国专利第4,816,567号、第5,693,780号，将这些文献通过引用完整并入本文。
本领域技术人员将认识到可以用于本发明实践中的与本文所述那些类似或等同的许多方法和材料。事实上，本发明决不限于所描述的方法和材料。出于本发明的目的，下列术语定义如下。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”和“囊泡”可互换使用，并且是指颗粒，其中所述颗粒包含围绕内部空间的磷脂双层和外表面，并且可以来源于或不是来源于细胞。细胞外囊泡的大小可以在20nm至3μm之间，但可以小于20nm或大于3μm。细胞外囊泡的实例包括但不限于外泌体(例如小外泌体和大外泌体)、核外粒体、大囊泡、微粒、凋亡小体、囊泡细胞器、癌小体(例如大癌小体)、外球体(exosphere)、外泌颗粒、细胞衍生的纳米囊泡(CDN)(例如，通过磨碎或剪切细胞产生)、脂质体或本领域普通技术人员已知的类似物。可以通过已知或未知的生物合成途径天然地产生细胞外囊泡。可以通过使用机械方法比如细胞磨碎或细胞剪切来促进细胞外囊泡的产生，其中细胞被磨碎或剪切，引起部分或部份细胞膜形成囊泡。例如，可以通过使用机械方法比如细胞磨碎或细胞剪切来形成CDN，其中细胞被磨碎或剪切，引起部分或部份细胞膜形成囊泡。另外的可用于形成细胞衍生的纳米囊泡的机械方法的非限制性实例进一步详细地描述于例如，Goh,W.J.,Zou,S.,Ong,W.Y.等人BioinspiredCell-Derived Nanovesicles versus Exosomes as Drug Delivery Systems:a Cost-Effective Alternative.Sci Rep 7,14322(2017).https://doi.org/10.1038/s41598-017-14725-x，将这些文献的内容通过引用完整并入本文。
细胞外囊泡包含货物，其中术语“货物”是指肽、蛋白质、核酸、脂质、代谢物、碳水化合物、生物分子、小分子、大分子、囊泡、细胞器或其片段。在一些实施方案中，货物可以指本领域已知的现有药物或治疗剂。细胞外囊泡货物可以位于细胞外囊泡的内部空间内。细胞外囊泡货物可以是结合的膜并且跨细胞外囊泡磷脂双层的一层或两层(例如跨膜蛋白)。细胞外囊泡货物可以例如通过共价键或非共价键与细胞外囊泡的外表面或内表面接触。细胞外囊泡的磷脂双层可包含一种或多种跨膜蛋白，其中所述一种或多种跨膜膜蛋白的一部分位于所述细胞外囊泡的内部空间内。细胞外囊泡的磷脂双层可包含一种或多种跨膜蛋白，其中所述一种或多种跨膜膜蛋白包含在所述细胞外囊泡的外部上的结构域。细胞外囊泡的磷脂双层可包含一种或多种跨膜蛋白，其中所述一种或多种跨膜膜蛋白包含在所述细胞外囊泡的内部上的结构域。货物可以指细胞外囊泡的内腔侧(例如，在内部空间中)的蛋白质，其中所述蛋白质编码可以与细胞外囊泡的内部磷脂层接触的囊泡靶向结构域。货物可以指细胞外囊泡的内腔侧(例如，在内部空间中)的蛋白质，其中所述蛋白质编码可以与细胞外囊泡的内部磷脂层接触的囊泡靶向结构域，并且其中所述蛋白质可以被呈递到细胞外囊泡的内部空间中。
如本文所用，术语“粘性结合剂”、“囊泡靶向结构域”和“锚定蛋白”可互换使用，并且是指共价或非共价连接到至少一种脂质上的蛋白质，其中一种或多种脂质嵌入膜(例如细胞膜)内，并且所述脂质用于将蛋白质锚定到膜上。术语“粘性结合剂”、“囊泡靶向结构域”和“锚定蛋白”也可以表示编码一个或多个跨膜结构域的蛋白质序列，其中所述一个或多个跨膜结构域至少部分跨越磷脂双层，例如细胞外囊泡的磷脂双层。跨膜结构域可以是I型或II型膜蛋白。可以使用本领域技术人员已知的方法在结构上鉴定跨膜结构域，所述方法比如鉴定疏水和亲水结构域的序列分析程序(例如TMHMM Server,v.2.0-DTU,ErikL.L.Sonnhammer,Gunnar von Heijne和Anders Krogh:A hidden Markov model forpredicting transmembrane helices in protein sequences.In Proc.of SixthInt.Conf.on Intelligent Systems for Molecular Biology，第175-182页，EdJ.Glasgow,T.Littlejohn,F.Major,R.Lathrop,D.Sankoff和C.Sensen Menlo Park,CA:AAAI Press,1998，将其通过引用完整并入本文。
囊泡靶向结构域可以包括但不限于一个或多个异戊二烯化位点、脂肪酰化位点和/或糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接的蛋白质。囊泡靶向结构域的一个优选实施方案是来自CD55的GPI序列。囊泡靶向结构域的另一个优选实施方案是来自CD59的GPI序列。囊泡靶向结构域的另一个实施方案是来自MFGE8的C1C2结构域。囊泡靶向结构域的序列的其他实施方案包括CD9的跨膜区(例如分别为CD9、CD9tm2或CD9tm3的跨膜区2或3)、K-Ras(例如K-Ras4A和K-Ras4B)、来自含去整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白10(ADAM10，也称为CDw156或CD156c)或其他ADAM蛋白的跨膜结构域。囊泡靶向结构域可以包括来自4F2的一个或多个序列(例如由溶质载体家族3成员2(SLC3A2)基因编码的4F2，其构成CD98的重亚基)。囊泡靶向结构域可包括一个或多个肉豆蔻酰化位点的序列。例如，来自肉豆蔻酰化的富含丙氨酸的C-激酶底物(MARCKS)蛋白的肉豆蔻酰化位点的蛋白质序列。囊泡靶向结构域可包括一个或多个棕榈酰化位点的序列。例如，来自MARCKS蛋白的肉豆蔻酰化序列可以被修饰为编码棕榈酰化位点。本发明包括本领域普通技术人员已知的所有变体、同工型或片段等。
囊泡靶向结构域可包括来自智人转铁蛋白受体2(TFR2)、转录物变体1(转铁蛋白受体蛋白2同工型1)或其版本的跨膜序列。在优选实施方案中，囊泡靶向结构域可以是来自CD298的跨膜结构域。
如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，以指示通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键相互连接的一系列氨基酸残基。虽然“蛋白质”通常用于指代相对较大的多肽，而“肽”通常用于指小的多肽，但是这些术语在本领域中的用法是重叠和变化的。除非另有说明，如本文所用的术语“肽”是指肽、多肽、蛋白质和蛋白质片段。当提及基因产物及其片段时，术语“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用。因而，示例性肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直向同源物、旁系同源物、片段和前述物质的其他等效物、变体、片段和类似物。
如本文所用，术语“接头”指用于经由肽键连接两个多肽结构域的合成蛋白质氨基酸序列。
如本文所用的，术语“融合蛋白”是指包含与外源蛋白或蛋白质片段(例如锚定蛋白)连接的感兴趣的蛋白质(例如检查点蛋白)的单一嵌合蛋白，其中所述融合蛋白的组分通过肽键直接地或通过肽接头彼此连接。融合蛋白的锚定蛋白可以增强融合蛋白在囊泡的膜上和/或膜中例如外泌体膜的磷脂双层的内部和/或外部小叶的掺入。融合蛋白可以具有免疫检查点蛋白或涉及免疫突触的蛋白的氨基酸序列的至少一部分。融合蛋白可以具有A2AR、VTCN1、半乳凝素9、FGL-1、PECAM-1、TSG-6、STAB-1、NRP1、NRP2、SEMA3A、SEMA3F、RGMB、TIM-3、TIGIT、HLA I类、HLA II类、VISTA、HMGB1、磷脂酰丝氨酸、T细胞受体(TCR)、SHP-1、SHP-2、FBXO38、SH2D1A、B7RP1、IDO、NOX2、TNFRSF18、B7-H4、B7-H5、SISP1、B7-H6、B7-H7、APLNR、IFNγ、PD-1、WNT5A、IL-6、IL-10、C型凝集素受体的NKG2家族、NKG2家族的配体、杀伤细胞免疫球蛋白样受体、CD2、CD4、CD8、CD27、CD27配体(CD70)、CD28、CD28H、CD39、CD40、CD44、CD47、CD63、CD66a、CD80、B7-2、CD86、CD73、CD94、CD96、CD101、CD112、CD112R、CD122、CD134、CD137(4-1BB)、CD137配体(4-1BBL)、CD152、CD154、CD155、CD158、CD158a、CD158g、CD158h、KIR2DL1、KIR2DS1、KIRDS3、KIR2DS5、CD160、CD172a、CD200、CD200R、CD223、CD226、CD252、CD270、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD278、CD279(PD-1)、CD279配体(PD-L1/PDL-2)、CD328、CD329和/或CD337的氨基酸序列的至少一部分。融合蛋白可以具有多肽接头序列(例如，Fc结构域和/或GSSG接头)，随后是编码锚定蛋白序列(例如，异戊二烯化位点、脂肪酰化位点或GPI序列)的氨基酸序列或其任何同工型、片段、变体或上述蛋白质的配体或本领域普通技术人员已知的类似物。本发明涵盖所有的变体。
如本文所用，术语“免疫突触”和“细胞突触”可互换使用，并且是指细胞间相互作用，其中所述相互作用导致一个或多个细胞的激活、抑制和/或粘附。免疫突触或细胞突触由蛋白质介导，所述蛋白质可以是细胞质的、膜结合的、膜相关的和/或分泌的。免疫或细胞突触可由一种或多种“免疫检查点蛋白”介导，免疫检查点蛋白在本文中是指涉及维持免疫稳态或在调节免疫激活或抑制中起作用的任何蛋白质。免疫检查点蛋白可以是细胞质的、膜结合的、膜相关的和/或分泌的。
如本文所用，术语“片段”或“活性片段”指本文提供的核酸或多肽的一部分，其保留了由本文提供的工程化EV表达的能力。在一些实施方案中，活性片段保留激活靶多肽的能力，从而增加所述靶多肽的活性(例如，抑制免疫应答)。
如本文所用，术语“特异性地结合”和/或“特异性地识别”或“基本上结合”是指相比于结合分子对非靶分子的亲和力的结合分子对靶分子的亲和力。特异性结合靶分子(例如，本文提供的靶多肽)的结合分子(例如，POI结构域)基本上不识别或结合非靶分子。例如，抗体“特异性地结合”和/或“特异性地识别”另一种分子，意味着这种相互作用依赖于分子结构(例如，抗原表位)的结合特异性的存在。如本文所用，“非特异性结合”和“背景结合”是指不依赖于特定结构(例如，特定抗原表位)的存在的相互作用。测量多肽与靶结合的方法是本领域已知的(例如，差示扫描量热法、等温滴定量热法、光谱学、结晶学、表面等离子体共振、共免疫沉淀、下拉测定法、交联、酵母双杂交系统、串联亲和纯化-质谱、蛋白质微阵列、生物层干涉测量法、远Western印迹、计算预测、分析超速离心、光散射、荧光光谱学、共振能量转移、ELISA或ELISPOT测定法，或本领域已知的任何其他测定法)。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“改善”是指治疗性处理，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症相关的疾患的进展或严重性。术语“治疗”包括减轻或缓解与感染或癌症相关的疾患、疾病或病症的至少一种副作用或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少，那么治疗通常是“有效的”。可替代地，如果疾病的进展减少或停止，那么治疗是“有效的”。即，“治疗”不只是包括症状或标志物的改善，而且包括在没有治疗的情况下预期的症状的进展或恶化的停止或至少减缓。有益或期望的临床结果包括但不限于：一种或多种症状的减轻、疾病程度的降低、疾病状态的稳定化(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、以及缓解(不管是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。术语“治疗”疾病还包括提供疾病的症状或副作用的减轻(包括姑息治疗)。
如本文所用，“治疗(preventing)”或“治疗(prevention)”是指任何方法学，其中疾病状态不会由于该方法学(例如，施用如本文所述的组合物或构建体)的作用而发生。在一个方面，可以理解的是，预防也可以意味着疾病没有发展到在未治疗对照中发生的程度。因此，疾病的预防包括相对于未治疗受试者(例如，未用本文所述的方法或组合物治疗的受试者)降低受试者发生所述疾病的可能性。
如本文所用，术语“自身免疫性病症”和“自身免疫性疾病”可互换使用，并且是指以免疫系统功能异常为特征的任何疾病，可以包括但不限于失弛缓症、艾迪生病、成人斯蒂尔病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性自主神经障碍、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴索性和神经元性神经病(AMAN)、巴洛病(Balo disease)、白塞病、良性粘膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、卡斯特曼病(Castleman disease)、乳糜泻、恰加斯病(Chagas disease)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome，CSS)、嗜酸性肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性类天疱疮、科根综合征(Cogan’ssyndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德雷斯勒综合征(Dressler’s syndrome)、子宫内膜异位症、嗜酸性粒细胞性食管炎(EoE)、嗜酸性粒细胞性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症、伊文思综合征(Evans syndrome)、纤维肌痛、纤维化性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性贫血、亨诺氏-许兰紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)、妊娠疱疹或妊娠类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低γ-球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、1型糖尿病、青少年肌炎(JM)、川崎病(Kawasaki disease)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、木样结膜炎、混线状IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病(Lyme disease chronic)、梅尼埃病(Meniere’s disease)、显微镜下多血管炎(MPA)、混合结缔组织病(MCTD)、莫伦溃疡(Mooren’s ulcer)、穆哈-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼部瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病(PR)、PANDA、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕里-罗姆伯格综合(Party Romberg syndrome)、睫状体平坦部炎(Parsplanitis)(周边葡萄膜炎)、帕森-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、天疱疮、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎(perivenous encephalomyelitis)、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I、II和III型多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、不宁腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(Stiff person syndrome，SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克综合征(Susac’s syndrome)、交感性眼炎(SO)、高安动脉炎(takayasu’s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Hunt syndrome，THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、沃格特小柳原田病(Vogt-Koyanagi-Harada disease)。自身免疫性疾患或自身免疫性疾病可由但不限于先天素因、感染(例如，细菌或病毒)、药物、疫苗接种、环境触发因素(例如，毒素或化学物质比如粉尘、二氧化硅、油、苯、三氯乙烯或全氯乙烯等)、应激、癌症、血液或组织或器官移植或不明病因引起。自身免疫性病症可导致但不限于身体组织的破坏、器官或组织的异常生长、器官或组织功能的变化(例如，血管、结缔组织、内分泌腺功能、关节、肌肉、血细胞、皮肤等的变化)。
如本文所用，术语“癌症”是指细胞的过度增殖，其表现出正常细胞控制的丧失，导致不受调控的生长、缺乏分化、局部组织侵袭和转移。本文所述的方法和组合物可用于治疗实体瘤(例如，癌症)或非实体瘤，比如白血病、血细胞癌等。实体瘤可见于骨骼、肌肉、大脑或器官中，可以是肉瘤或癌。在本文所述的方法和组合物可以克服肿瘤治疗的障碍，包括但不限于治疗或抑制转移的障碍的情况下，预期本文所述的技术的方面可用于治疗所有类型的实体和非实体肿瘤癌症，包括本说明书中未列出的癌症。本文所述的组合物和方法非限制性地包括治疗癌症的方法、抑制转移的方法和诱导抗肿瘤免疫应答的方法。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”、“宿主”和“患者”可互换使用，并且可以指接受或登记接受治疗量的本发明组合物用于医疗护理或治疗的任何动物、哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物和两栖动物，例如，人、猴、狗、猫、马、猪、牛、公牛、驴、兔、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、豚鼠、骆马、鸡、鹅、鸭、火鸡等。
如本文所用，术语“注射”是指允许本领域技术人员通过穿透将任何治疗剂施用于目标部位的任何过程或方法。注射的实例是，但不限于，皮下、表皮下、囊下、蛛网膜下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心室内、囊内、眶内、眼内、胸内、腹膜内、玻璃体内、眶后、鼻内、脑内、胸腺内、脊柱内、胸骨内、关节内、海绵体内、心内、骨内、鞘内、经气管、硬膜外等，如本领域已知的。可以通过控制释放的方式将本发明的治疗剂量递送给患者，例如但不限于可植入泵和可植入套管，以提供到静脉或动脉系统的连续通路。
如本文所用，术语“局部施加”是指将本发明的组合物以用于局部和/或全身治疗的治疗有效量通过内部和/或外部两者施加或铺展到身体表面上或体内。局部施加可以是表皮施用，其中可以将本发明的组合物直接施加到皮肤或粘膜的局部表面上。局部施加可以包括透皮施加，其中可以使本发明的组合物吸收到体内，以获得全身递送和全身分布。例如，可以将透皮贴剂敷贴到身体上，以递送治疗剂量的本文呈现的本发明组合物。局部施加制剂可包括但不限于乳膏、泡沫、凝胶、洗剂、溶液、软膏、皮肤贴剂、透皮贴剂、粉末、固体、海绵、胶带、蒸气、糊剂、薄膜、脂质体、香膏、香波、喷雾剂或酊剂。可以通过阴道(例如阴道栓剂、阴道环、冲洗器、宫内节育器、膀胱内输注等)或尿道来递送治疗剂量的本发明组合物。
“肠内给药”是指本发明的组合物以局部或全身治疗的治疗有效量经由胃肠道给药。肠内给药可以包括但不限于通过口、舌下、食道、胃的(例如胃)、小肠、大肠或直肠递送本发明的组合物。本发明的口服递送可以包括但不限于使用胶囊、软锭剂、丸剂、片剂、溶液、凝胶、混悬剂、乳剂、糖浆、酏剂、酊剂、漱口水、锭剂、口香糖、棒棒糖、渗透控制释放口服递送系统等。胃递送可能涉及使用直接通向胃的管或鼻道，例如经皮内窥镜胃造口管。胃递送可涉及通过腹壁进行的直接注射。直肠递送可以包括但不限于使用栓剂、软膏、灌肠剂、墨菲滴剂等。本发明的治疗剂量可以通过控制释放的方式递送给患者，例如但不限于控释药物递送小丸或丸剂。
如本文所用，术语“肺系统”或“呼吸系统”可互换使用，并且是指但不限于呼吸区、传导气道、鼻腔、鼻窦、鼻咽、口咽、喉、气管、支气管、细支气管、呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊、呼吸上皮(例如，肺泡上皮细胞)、内皮细胞等。
如本文所用，术语“肺部递送”和“肺部给药”可互换使用，并且是指通过呼吸途径将本发明的组合物递送至呼吸系统，包括但不限于用于局部或全身治疗的治疗有效量的鼻内给药、口服给药和口服吸入给药(例如，气管内滴注和气管内吸入)。可以通过分散，例如通过使用注射器，实现治疗有效量的本发明组合物的肺部递送。可以通过气溶胶给药实现本发明组合物的肺部递送，其中气溶胶给药可以通过重力沉降、惯性碰撞或扩散来沉积本发明的治疗有效量。
肺部递送治疗有效量的本发明组合物可以沉积在呼吸系统的任何粘液层上，例如但不限于包覆传导气道、较小气道和/或肺泡腔的壁的粘液层。
如本文所用,“适当的对照”是指未处理的、原本完全相同的细胞或群体(例如，与非对照细胞相比，未被施用本文所述的组合物或仅被施用本文所提供的药剂子集的受试者)。
如本文所用,“参考水平”可以指对正常的原本未受影响的细胞群或组织(例如，从健康受试者获得的生物样品，或在先前时间点从受试者获得的生物样品，或尚未与本文所述病原体接触的生物样品)测量的一种或多种参数或标志物。为了测量或监测治疗效果，在治疗前或治疗早期确定的水平也可以为给定的参数或值提供参考水平。
如本文所用，术语“调节”是指包括增加或降低给定参数的作用，如本文定义的那些术语。
本文中使用术语“增加(increased)”、“增加(increase)”、“增加(increases)”、或“增强”或“激活”通常表示特性、水平或其他参数以统计学显著的量提高；为避免任何疑问，术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强”或“激活”是指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％，或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的增加，或10％-100％之间的任何增加、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加、至少约20倍增加、至少约50倍增加、至少约100倍增加、至少约1000倍增加或更多。例如，增加活性可以指激活受体或信号传导途径(例如，抗体产生或炎症)。
术语“减少”、“降低(reduced)”、“降低(reduction)”或“抑制”在本文中均用于表示特性、水平或其他参数以统计学显著的量减少或降低。在任何方面的一些实施方案中，“降低(reduce)”、“降低(reduction)”或“减少”或“抑制”通常表示与参考水平(例如，在不存在给定治疗的情况下)相比减少至少10％，并且可以包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，“降低”或“抑制”不包括与参考水平相比的完全抑制或降低。“完全抑制”是与参考水平相比的100％抑制。对于没有给定病症的个体来说，降低可以优选降至正常范围内可接受的水平。
如本文所用的术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”用于指组合物、方法及其对应的组分，它们对于所述方法或组合物来说是必需的，但可以包括无论是否必需的未指定要素。
如本文所用的术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需的那些要素。所述术语容许存在实质上不影响该实施方案的基本和新颖或功能特征的要素。
术语“由……组成”是指本文所述的组合物、方法及其对应的组分，其不包括在实施方案的描述中未列举的任何要素。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确地指示。因而，例如，提到“所述方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，和/或本领域技术人员在阅读本公开时将理解的方法和/或步骤，等。类似地，除非上下文另外清楚指出，词语“或/或者”意图包括“和/及/以及”。虽然可以在本公开的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述的那些的方法和材料，但在下文中描述了适合的方法和材料。缩写“例如”来源于拉丁语例如(exempli gratia)，并且本文用于表示非限制性实例。因而，缩写“例如(e.g.)”与术语例如“例如(for example)”是同义词。
缩写“等等”来源于拉丁语等等(et cetera)，并且本文用于表示非限制性列表。因而，缩写“等等(etc..)”与术语“和其他类似的东西”或“等等(and so forth)”是同义词。
除了在操作实施例中，或在另外指出的情况下，本文使用的表示成分的数量或反应条件的所有数字应该被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。当术语“约”与百分比一起使用时，可以表示±1％。
术语“统计学显著的”或“显著地”指统计显著性，通常表示高于或低于参考值的两个标准差(2SD)的差异。以下各节的文本中提供了另外的定义。
应当理解的是，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂等，因为它们可以变化。本文使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的，而不旨在限制仅由权利要求书限定的本发明的范围。
如本文和权利要求中使用的，除非上下文另外明确地指示，单数形式包括复数指代，反之亦然。术语“或”是包含性的，除非被例如“任一”修饰。除了在操作实施例中，或在另外指出的情况下，本文使用的表示成分的数量或反应条件的所有数字应该被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。
除非另外解释的，本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常的理解相同的含义。
应该理解的是，前面的描述和下列实施例仅仅是说明性的，而不应理解为对本发明范围的限制。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的实施方案进行各种改变和修改，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。此外，将所有确定的专利、专利申请和出版物通过引用明确并入本文，目的是描述和公开例如在这样的出版物中描述的可能与本发明结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是因为它们的公开在本申请的申请日之前。在这方面不应被解释为承认发明人无权凭借在先发明或由于任何其他原因而先于这样的公开。所有关于日期的声明或关于这些文件的内容的表述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
将所有确定的专利和其他出版物通过引用明确并入本文，目的是描述和公开例如在这样的出版物中描述的可以与本发明结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是因为它们的公开在本申请的申请日之前。在这方面不应被解释为承认发明人无权凭借在先发明或由于任何其他原因而先于这样的公开。所有关于日期的声明或关于这些文件的内容的表述基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
可以根据以下编号的段落中的任何一个定义本文所述的技术的一些实施方案：
1.一种工程化细胞外囊泡，其包含：
至少一种融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域，
其中所述POI结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的细胞外位置。
2.根据段落1所述的工程化细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡是外泌体。
3.根据段落1或段落2所述的工程化细胞外囊泡，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段是所述融合多肽的N-末端结构域。
4.根据段落1-3中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述囊泡靶向结构域是所述融合多肽的C-末端结构域。
5.根据段落1-4中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述融合多肽包含至少两个POI结构域和/或至少两个外泌体靶向结构域。
6.根据段落1-5中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述融合多肽还包含肽接头。
7.根据段落1-6中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述融合多肽还包含片段可结晶区域(Fc)结构域。
8.根据段落1-7中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述囊泡靶向结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的内腔位置。
9.根据段落1-7中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述囊泡靶向结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的外部位置。
10.根据段落1-9中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域选自由下列组成的组：表1.
11.根据段落1-10中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是PD-L1或其片段。
12.根据段落1-11中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是PD-L2或其片段。
13.根据段落1-12中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是FGL1或其片段。
14.根据段落1-13中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是4-1BBL或其片段。
15.根据段落1-14中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是CTLA-4或其片段。
16.根据段落1-15中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域基本上结合一种或多种靶多肽。
17.根据段落16所述的工程化细胞外囊泡，其中所述靶多肽选自由下列组成的组：表2.
18.根据段落1-17中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述囊泡靶向结构域选自由下列组成的组：表3.
19.根据段落1-18中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述接头位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的外部位置。
20.根据段落1-18中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述接头是跨膜接头。
21.根据段落1-18中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述接头位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的内腔位置。
22.根据段落1-21中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡不包含内源POI多肽。
23.一种组合物，其包含根据段落1-22中任一项所述的多种工程化细胞外囊泡。
24.根据段落23所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
25.一种工程化细胞外囊泡，其包含：
(a)第一融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域，
其中所述至少一个POI结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的细胞外位置，
(b)第二融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域，
其中所述POI结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的细胞外位置，
并且其中所述至少一个囊泡靶向结构域位于所述细胞外囊泡的脂质膜内。
26.一种组合物，其包含选自段落1-25中任一项所述的两种或更多种工程化细胞外囊泡。
27.一种细胞外囊泡组合物，其包含：
多个人工突触，
其中每个人工突触包含(i)细胞外囊泡；(ii)一种或多种粘性结合剂；和(iii)一个或多个信号传导结构域。
根据段落27所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含外泌体。
28.根据段落27所述的组合物，其中所述一种或多种粘性结合剂选自由下列组成的组：GPI锚、脂肪酰化位点和异戊二烯化位点。
30.根据段落27所述的组合物，其中所述信号传导结构域包含下列一种或多种：PD-L1、PD-L2、CTLA-4(CD152)、4-1BBL(CD137L)、HVEM(CD270)、FGL1、OX-2(CD200)、半乳凝素-9、PVR(CD155)、连接蛋白-2(CD112)同工型α、连接蛋白-2(CD112)同工型β、连接蛋白-2(CD112)同工型δ、IL-10、TSG-6、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B7-H5(VISTA)、B7-H7(HHLA2)、BTNL1、VSIG8、VSIG3(IGSF11)、VSIG4、TIM-3(HAVCR2)、TIM-4(TIMD4)、CEACAM1、BTN3A1、BTN3A2、BTN2A1、BTNL8、BTN2A2、BTN1A1、TIGIT、CD27L(CD70)、CD30L(CD153)、GITRL、CD40L(CD154)、LIGHT(CD258)、TL1、CD80、CD86、LFA-3(CD58)、SLAM(CD150)、CD40、CD28、CD28H、CD2、LFA-3(CD58)、CD48、CD226、DR3、DcR3、FasL、TIM-1(CD365)、PD-1或其活性片段。
29.一种产生根据段落1-30中任一项所述的工程化细胞外囊泡或组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供表达编码一种或多种粘性结合剂和一个或多个信号传导结构域的载体构建体的细胞群；和
(b)从所述细胞群分离多个人工突触。
30.一种产生根据段落1-30中任一项所述的工程化细胞外囊泡或组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供表达编码一种或多种粘性结合剂和一个或多个信号传导结构域的载体构建体的细胞群；和
(b)从所述细胞群分离多个人工突触；和
(c)从所述细胞群纯化多个人工突触。
33.根据段落31或段落32所述的方法，所述分离是经由尺寸排阻色谱法来实施的。
34.根据段落32所述的方法，其中所述纯化是经由多模式色谱法来实施的。
35.根据段落31-34中任一项所述的方法，进一步包括进行POI与靶多肽结合的测定。
36.根据段落35所述的方法，其中所述载体构建体进一步编码启动子。
37.根据段落36所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子或诱导型启动子。
38.一种调节受试者中的炎症的方法，所述方法包括：
给有需要的受试者施用包含多种工程化细胞外囊泡的组合物，
其中所述工程化细胞外囊泡包含至少一种融合多肽，所述至少一种融合多肽包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域。
39.根据段落38所述的方法，其中所述细胞外囊泡包含外泌体。
40.根据段落38-39中任一项所述的方法，进一步包括选择患有或疑似患有自身免疫性疾病或炎性疾病或疾患的受试者。
41.根据段落38-40中任一项所述的方法，其中所述囊泡靶向结构域选自由下列组成的组：糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚、脂肪酰化位点和异戊二烯化位点。
42.根据段落38-41中任一项所述的方法，其中所述囊泡靶向结构域是GPI锚。
43.根据段落38-41中任一项所述的方法，其中囊泡靶向结构域是C1C2。
44.根据段落38-43中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域包含下列一种或多种：PD-L1、PD-L2、CTLA-4(CD152)、4-1BBL(CD137L)、HVEM(CD270)、FGL1、OX-2(CD200)、半乳凝素-9、PVR(CD155)、连接蛋白-2(CD112)同工型α、连接蛋白-2(CD112)同工型β、连接蛋白-2(CD112)同工型δ、IL-10、TSG-6、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B7-H5(VISTA)、B7-H7(HHLA2)、BTNL1、VSIG8、VSIG3(IGSF11)、VSIG4、TIM-3(HAVCR2)、TIM-4(TIMD4)、CEACAM1、BTN3A1、BTN3A2、BTN2A1、BTNL8、BTN2A2、BTN1A1、TIGIT、CD27L(CD70)、CD30L(CD153)、GITRL、CD40L(CD154)、LIGHT(CD258)、TL1、CD80、CD86、LFA-3(CD58)、SLAM(CD150)、CD40、CD28、CD28H、CD2、LFA-3(CD58)、CD48、CD226、DR3、DcR3、FasL、TIM-1(CD365)、PD-1或其活性片段。
45.根据段落38-44中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域是PD-L1或其片段。
46.根据段落38-44中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域是PD-L2或其片段。
47.根据段落38-44中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域是CTLA-4或其片段。
48.根据段落38-44中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域是HVEM或其片段。
49.根据段落40所述的方法，其中所述炎性疾病和/或疾患是急性的。
50.根据段落40所述的方法，其中所述炎症相关疾病和/或疾患是慢性的。
51.根据段落38所述的方法，其中施用组合物包括注射、局部给药或吸入。
52.一种包含多种工程化细胞外囊泡的组合物的用途，所述工程化细胞外囊泡各自包含：
至少一种融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域
其用于治疗炎性疾病或疾患。
53.一种包含多种工程化细胞外囊泡的组合物的用途，所述工程化细胞外囊泡各自包含：
至少一种融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域
其用于治疗自身免疫性疾病或疾患。
54.一种包含多种工程化细胞外囊泡的组合物的用途，所述工程化细胞外囊泡各自包含：
至少一种融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域
其用于治疗癌症。
实施例
提供以下实施例作为说明而非限制。
实施例1
人工突触的设计
如所述，人工突触被工程化为诱导和传播生物信号传导，包括例如拮抗剂和激动剂信号传导。人工突触被设计为包括细胞外囊泡的标志性生物物理和生物化学特征，进一步包括囊泡靶向结构域和信号传导结构域。能够附着于细胞外囊泡比如外泌体的囊泡靶向结构域、信号传导结构域，任选地包括接头(例如，Fc接头)，可以组织在遗传载体构建体中。设计显示在图1中。
粘性结合剂是细胞外囊泡靶向序列。感兴趣的初步细胞外囊泡靶向序列来自但不限于4F2(CD98)、ADAM10、CD298、TFR2、CD9的跨膜结构域、MARCKS、KRAS等或如本领域普通技术人员所理解的类似物。本发明人发现了当用GPI结构域对蛋白质进行工程化时的高效率。任选地，可以添加接头区域，诸如在囊泡靶向结构域和信号传导结构域之间的Fc接头。
多种信号传导结构域是感兴趣的，其中概念验证实例包括PD-L1、PD-L2和CTLA-4(CD152)。图2-5中显示了包括这三个信号传导结构域的人工突触。
这些元件中的每一个描述于以下非限制性实施例中。
实施例2
遗传构建体
将包括这些可变元件(例如，粘性结合剂GPI或C1C2，或包括PD-L1、PD-L2和CTLA-4(CD152)的信号传导结构域)的构建体的实例经工程化至图2-5显示的载体中。
实施例3
通过市售的用于外泌体纯化的多模式树脂纯化带有hPD-L1标签的人工突触
在哺乳动物细胞中表达hPD-L1-Fc-GPI后，使用市售的用于外泌体纯化的尺寸排阻树脂进一步纯化人工突触。如洗脱1中的高hPD-L1浓度和外泌体数量(2.26E9个人工突触/ml)所示，大MW人工突触洗脱在第一级分中。原位清洗(CIP)级分显示了来自发明人的外泌体洗脱的结合和消除的蛋白质。结果显示在图6中。
实施例4
hPDL1-Fc-GPI外泌体纯化–尺寸排阻色谱柱
在从市售的用于外泌体纯化的尺寸排阻树脂洗脱之后，可以经由如此处所示的尺寸排阻柱进一步纯化来自诸如hPDL1-Fc-GPI的外泌体的工程化人工突触。使用尺寸排阻色谱法(SEC)，人工突触洗脱在级分7-9中。图中显示了每个级分的总蛋白(通过qBit确定)和hPD-L1ng/ml(通过ELISA确定)。条形显示了每ml的外泌体数量(即1E10个人工突触/ml等)。级分7-9含有>99％的纯化人工突触。将级分7-9合并，并且可使用过滤装置例如10K MWCOAmicon离心过滤器进行浓缩。通过低蛋白结合0.2μm或0.45μm过滤器，例如PES过滤器过滤最终的纯化产物。结果显示在图7中。
实施例5
在人工突触上的hPD-L1表达
确定在SEC级分7-9中的外泌体数量和hPD-L1浓度。已知工程化hPD-L1的分子量，本发明人可以确定每个外泌体的hPD-L1分子的数量大约在12至40个PD-L1/外泌体之间。这个值在不同的纯化轮和构建体之间是一致的。结果显示在图8中。
实施例6
经由市售的用于外泌体纯化的多模式树脂色谱法进行的hPD-L2-Fc-GPI人工突触的纯化
这个图显示了多模式树脂色谱级分的Abs 280和在指示级分中的hPDL2的量。人工突触洗脱在洗脱1中。
原位清洗(CIP)级分显示了来自发明人的外泌体洗脱的结合和消除的蛋白质。结果显示在图9中。
实施例7
经由尺寸排阻色谱法进行的PD-L2纯化
在从市售的用于外泌体纯化的尺寸排阻树脂洗脱之后，经由如所示的尺寸排阻色谱法进一步纯化来自诸如hPDL2-GPI的人工突触的工程化人工突触。结果显示在图10中。
实施例8
经由尺寸排阻色谱法进行的hCTLA4-Fc-GPI外泌体纯化
使用市售的用于外泌体纯化的尺寸排阻色谱法，人工突触洗脱在级分7-9中。图中显示了每个级分的总蛋白(通过qBit确定)和hPD-L1ng/ml(通过ELISA确定)。将级分7-9合并，并且其含有>99％的纯化外人工突触。然后，可以使用过滤装置，例如10K MWCO Amicon，浓缩从人工突触级分工程化的合并人工突触。通过低蛋白结合过滤器例如0.2μm或0.45umPES过滤器将最终的纯化产物过滤。结果显示在图11中。
实施例9
来自DiscoverX的PD-L1和PD-L2体外测定法
为了进行这种验证方法，发明人修改了DiscoverX的PathHunter PD-1信号传导生物测定法。简言之，PathHunter PD-1信号传导生物测定法依赖于良好建立的PathHunter酶片段互补(EFC)技术来询问受体活性。EFC由分裂的β-半乳糖苷酶(β-gal)酶：酶供体(ED)和酶受体(EA)片段组成，它们独立地没有β-gal活性。然而，当迫使互补时，它们形成活性β-gal酶，所述酶使底物水解而产生化学发光信号。PathHunter PD-1信号传导生物测定包括人类细胞，所述细胞被工程话为稳定表达带ED标签的PD-1受体，而EA融合至细胞内信号传导蛋白SHP1的结合磷酸酪氨酸的SH2结构域。配体或抗体诱导的受体激活导致受体的胞质尾磷酸化。与EA融合的SH2结构域结合磷酸化受体，迫使ED和EA互补，导致活性β-gal酶的形成，所述酶水解底物产生化学发光信号。将全长PD-1受体用小的β-gal片段(ED以红色表示)融合至它的C-末端进行了工程化，并且将SHP1的SH2结构域用互补的β-gal片段(EA)进行了工程化。这些构建体在Jurkat细胞(由DiscoverX生产)中稳定表达，而PD-L1和PD-L2在由Diadem Biotherapeutics生产的人工突触上稳定表达。将人工突触工程化为具有表面表达的人PD-L1或PD-L2。简言之，将编码人PD-L1或PD-L2的细胞外结构域的基因序列经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)接头与外泌体连接，其中Fc结构域位于接头和PD-L1或PD-L2之间(PD-L1-Fc-GPI和PD-L2-Fc-GPI)。本发明人的PD-L1和PD-L2人工突触的另外变异包括克隆C1C2接头(来自MFGE8)，其代替GPI接头，并且具有或没有Fc结构域。本发明人还克隆了PD-L1和PD-L2细胞外结构域的鼠版本，代替人PD-L1和PD-L2的所有变异。通过添加配体呈递人工突触，配体接合导致PD-1的磷酸化，从而导致SHP1-EA的募集。
当分别与可溶性PD-L1-Fc或PD-L2-Fc配体相比时，发明人在用PD-L1或PD-L2标记的人工突触处理的Jurkat信号传导细胞中获得大约高1000X的相对光单位(RLU)增加。这意味着，相比于溶解的PD-L1-Fc或PD-L2配体，花了少1000X的ug/ml的在人工突触上的PD-L1或PD-L2来实现相同的RLU信号传导。结果显示在图12中。
实施例10
PD-L1体内测定-Lewis大鼠中的实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)生物测定
实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)是器官特异性T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，它用作具有明显自身免疫性质的几种人类眼部炎症的模型。在mPDL1人工突触治疗的大鼠中，经由玻璃体内或静脉内递送模式在EAU方面有统计学显著的初始减轻。第2次玻璃体内注射和第3次静脉内注射在第12天进行。在1X玻璃体内组和静脉内组中的消退速度似乎更快。(C)上述结果的简化视图。(D)在整个研究中监测大鼠的重量。第3次玻璃体内注射和第4次静脉内注射在第16天进行。在任何测试组的EAU中似乎没有任何显著变化。上述结果提供了用注射到大鼠中的具有小鼠PDL1的人类细胞衍生的人工突触成功地免疫所述大鼠的原理证明。结果显示在图13中。
实施例11
工程化外泌体多价展示
本发明人已经开发了在外泌体上或内的以下3种类型的蛋白质展示：
·I型膜蛋白，其中N末端在外泌体膜的腔(内)侧，并且C末端在外泌体的外部。
·II型膜蛋白，其中N末端在外部，而C末端在内部。
·通过将蛋白质附着到外泌体膜内部的肉豆蔻酰化/棕榈酰化位点与外泌体连接的内腔内装载的蛋白质。
图14-21展示了工程化细胞外囊泡的各种实施方案。
展示在外泌体表面的另外的实施方案或配体(I型和II型膜蛋白)和内腔展示可包括下列物质：
·I型：PD-L1、PD-L2、FGL1、OX40L
·II型：4-1BBL、GITRL、CD27L、CD30L
·内腔：
Figure BDA0003869254570003151
萤光素酶；绿色荧光蛋白(GFP)(例如，eGFP，等)；红色荧光蛋白(RFP)(例如，mScarlet、mCherry、mRuby、tdTomato等)；青荧光蛋白(CFP)；黄色荧光蛋白(YFP)；治疗性蛋白质；和CRISPR/CAS-9
图20显示了示例性多种蛋白质展示构建体。诸如P2A、E2A、F2A和T2A的序列诱导核糖体滑动，其阻止肽键形成，这意味着带有2A序列的单个mRNA转录物在翻译之后会产生两个独立的肽。这允许从一个启动子区表达两个不同的蛋白质，因而将两个蛋白质装载到外泌体上。可以将本文提供的感兴趣的蛋白质结构域的任何组合进行工程化。此外，具有在独立的启动子控制下的多个转基因插入物的细胞系。任一种方法都可以用来标记I型、II型和腔展示蛋白。
实施例12a
设计和工程化的人融合多肽构建体
本发明人已经设计、工程化改造和纯化了以下用于治疗用途的人融合多肽构建体(图5A-图5WW)：
·pEF5-FRT-hPDL1-C1C2(图5I)
·pEF5-FRT-hPDL2-C1C2(图5J)
·pEF5-FRT-hPDL1-GPI-P2A-hFGL1-GPI(图5E)
·pEF5-FRT-hCTLA4-Fc-GPI(图5C)
·pEF5-FRT-hPDL2-Fc-GPI(图5H)
·pEF5-FRT-hPD-L1-GPI-P2A-hHVEM-GPI(图5D)
·pEF5-FRT-hPDL1-GPI(图5F)
·pcDNA5-FRT-hSecPDL1-GPI(图5O)
·pcDNA5-FRT-hPDL1-GPI(图5F)
·pcDNA5-FRT-hPDL1-连接-GPI(图5T)
·pcDNA5-FRT-4F2-h41BBL(图5K)
·pcDNA5-FRT-Tfr2-h41BBL(图5P)
·pEF5-FRT-hPDL1-Fc-GPI(图5G)
·pcDNA5-FRT-CD9tm3-h41BBL(图5Q)
·pcDNA5-FRT-hPDL1-Fc-GPI(图5G)
·pcDNA5-FRT-hPDL1-4Fc-CD9tm2(图5RR)
·pcDNA5-FRT-hPDL1-Fc-CD9tm2KRAS(图5UU)
·pcDNA5-FRT-hPDL1-4Fc-CD9tm2KRAS(图5SS)
·pcDNA5-FRT-hPDL1-4Fc-GPI(图5L)
·pcDNA5-FRT-hPDL1-ADAM10(图5QQ)
·pcDNA5-FRT-MyrPalm-4F2-h41BBL(图5R)
·pcDNA5-FRT-MyrPalm-h41BBL(图5S)
·pcDNA5-FRT-hPDL1-Fc-CD9tm2(图5TT)
·pcDNA5-FRT-hSecPDL1-CD9tm4(图5W)
·pcDNA5-FRT-hSecPDL1-CD9tm2KRas(图5V)
·pcDNA5-FRT-hSecPDL1-CD9tm2(图5U)
·pcDNA5-FRT-hSecPDL1-CD81(图5X)
·pEF5-FRT-hCD200-Fc-GPI(图5Y)
·pEF5-FRT-hCD200-GPI(图5BB)
·pEF5-FRT-hTSG6-GPI(图5FF)
·pEF5-FRT-hPDL2-GPI(图5EE)
·pEF5-FRT-hFGL-1-GPI(图5Z)
·pEF5-FRT-hHVEM-GPI(图5DD)
·pEF5-FRT-hGal9-GPI(图5CC)
·pEF5-FRT-hHVEM-Fc-GPI(图5GG)；和
·pEF5-FRT-hGal9-Fc-GPI(图5AA)
实施例12b
设计和工程化的融合多肽构建体
本发明人已经设计、工程化和纯化了以下用于治疗用途的小鼠融合多肽构建体(图5A-图5WW)：
·pcDNA5-FRT-mPDL1-mFc-CD9tm2KRAS(图5WW)
·pcDNA5-FRT-mPDL1-mFc-CD9tm2(图5VV)
·pcDNA5-FRT-mPDL1-mFc-GPI(图5NN)
·pcDNA5-FRT-mPDL1-GPI(图5KK)
·pEF5-FRT-mPDL2-GPI(图5OO)
·pEF5-FRT-mPDL1-GPI-P2A-mHVEM-GPI(图5PP)
·pEF5-FRT-mPDL1-GPI(图5KK)
·pEF5-FRT-mPDL2-Fc-GPI(图5MM)
·pEF5-FRT-mPDL1-Fc-GPI(图5JJ)
·pEF5-FRT-mCTLA4-Fc-GPI(图5HH)
·pEF5-FRT-mPDL1-C1C2(图5II)；和
·pEF5-FRT-mPDL2-C1C2(图5LL)。
实施例12c
设计和工程化的内腔装载的融合多肽构建体
本发明人已经设计、工程化和纯化了以下融合多肽构建体，用于融合多肽的内腔装载：
·pcDNA5-FRT-Myr-NanoLuc(图5M)
·pcDNA5-FRT-Myr-mScarlet(图5N)
实施例13
用I型膜融合多肽标记的外泌体的纯化
本发明人已经纯化了工程化的EV，包括hPD-L1-GPI；hPDL1-Fc-GPI；hPDL2-Fc-GPI；hCTLA4-Fc-GPI；mPDL1-GPI；和mPD-L1-Fc-GPI。工程化EV的纯化和分析处理过程显示在图21提供的流程图中。
进行尺寸排阻色谱法纯化hPD-L1-GPI(无Fc)外泌体(图24)。SEC级分中的蛋白质、RNA和DNA测量。使用Invitrogen Qubit荧光测定法来测量来自未修饰的浓缩细胞培养基SEC级分或hPD-L1-Exo-标签浓缩细胞培养基SEC级分的生物分子。使用R&D系统PD-L1ELISA试剂盒测量PD-L1。SEC级分的圆点印迹免疫印迹分析。使用96孔圆点印迹装置将50ul的每个SEC级分固定到PVDF上。通过可调电阻脉冲传感(TRPS)测量在级分7中的外泌体的大小和浓度。已经证实GPI将hPD-L1融合蛋白锚定在外泌体上(图25)。
此外，还使用在商业上可获得的多模式外泌体纯化树脂来纯化和分离PD-L1-GPI外泌体和PD-L1-Fc-GPI外泌体。通过圆点印迹进一步分析级分7(图28A-28B)。具体而言，图28B显示了展示在细胞外囊泡表面上的人PD-L1的各种实施方案的SEC纯化结果。一个实施方案是hPD-L1-4Fc-GPI(CMV)构建体，如在顶部圆点印迹中所见(用兔单克隆抗PD-L1抗体染色)。另一个实施方案是hPD-L1-4Fc-GPI(EF1a)，如在顶部圆点印迹中所见(用兔单克隆抗PD-L1抗体染色)。
如洗脱1中的高hPD-L1浓度和外泌体数量(2.26E9个外泌体/ml)所示，大MW外泌体洗脱在第一级分中。原位清洗(CIP)级分显示了来自我们的外泌体外泌体洗脱的结合和消除的蛋白质。确定在SEC级分7-9中的外泌体数量和hPD-L1浓度。已知工程化hPD-L1的分子量，我们可以确定每个外泌体的hPD-L1分子的数量为大约12个PD-L1/外泌体。这个值在不同的纯化轮和构建体之间是一致的(图8)。
纯化人hPD-L2和hCTLA-4-Fc-GPI SEC级分。另外，对小鼠PD-L1-FcGPI外泌体进行了纯化(图29)。表达小鼠Fc-PD-L1的外泌体比不含Fc接头的外泌体具有更高的效价。
实施例14
工程化EV的比较蛋白质组学分析
Fc-GPI使得能够高密度展示，并且比内源性PTGFRN或CD81具有更高的丰度。因此，进行工程化外泌体(hPD-L1-Fc-GPI；hPD-L2-Fc-GPI；和hCTLA-Fc-GPI)上的转蛋白表达和表面标记的比较蛋白质组学，以确定对工程化外泌体中的内源性蛋白表达的影响。证实了融合多肽表达不影响天然和相关外泌体蛋白的相对表达。然而，转蛋白可能会挤出丰富的蛋白质，如CD81(数据未显示)。
实施例15
使用搅拌罐一次性生物反应器(STR)中的微载体进行mPD-L1-Fc-GPI外泌体的放大生产和纯化
利用1E7个HEK 293细胞来生产mPDL1-Fc-GPI外泌体。将细胞在
Figure BDA0003869254570003201
微载体上传代，一直到第4代，此时使细胞在2.5L搅拌罐一次性生物反应器中扩增。将第4代细胞再培养5天，并在第5天收获培养基并用于外泌体纯化。总体目标和过程提供如下
目标：利用SoloHill的无异种微载体技术来扩大用于工程化EV的细胞规模，并评价在无异种培养基条件下生产治疗性外泌体的微载体搅拌罐生物反应器技术。
第1代：
解冻具有细胞的小瓶(1.00E+07)并以1.00E+04个细胞/cm2的种子密度接种Corning T-150&CellSTACK2组织培养物处理的烧瓶。
在第3天从两个烧瓶进行100％培养基更换。
在接种和种子旋转器微载体培养后第4天收获Corning T-150&CellSTACK2烧瓶。
第2代：
使用SoloHill的无异种原型微载体以10cm2/mL微载体密度在2×200mL旋转瓶中扩增细胞。
以1.00E+04个细胞/cm2的种子密度接种微载体培养物，并且将T-25作为浅容器对照烧瓶。
在第3天，从旋转器和T-25烧瓶进行80％批次体积的培养基更换。
在接种和种子旋转器微载体培养后第4天收获微载体和T-25烧瓶两者。
第3代：
使用SoloHill的无异种原型微载体以10cm2/mL微载体密度在3x300mL旋转瓶中扩增细胞。
以1.00E+04个细胞/cm2的种子密度接种微载体培养物，并且将T-25作为浅容器对照烧瓶。
在第3天，从旋转器和T-25烧瓶进行80％批量体积的培养基更换。
在接种后第4天收获微载体和T-25烧瓶两者。
用于外泌体生产的种子微载体-搅拌罐生物反应器。
第4代：
以10cm2/mL表面积与培养基的比率在2.5L微载体-搅拌罐中扩增细胞。
以1.00E+04个细胞/cm2的种子密度接种培养物，并且将T-25作为浅容器对照烧瓶。
在第2天进行80％批量体积培养基更换。
在第3天，用2x细胞培养体积的含Ca和Mg的DPBS冲洗所有培养物。
将外泌体生产培养基(DMEM-1％Glutamax)以10cm2/mL表面积与培养基体积比添加至所有培养物。
在第5天，从所有培养物收集收获用过的培养基，使用0.45μm Nalgene快速流动系统过滤并在-20℃冷冻。
程序：
培养基组成
DMEM 1x(Corning参考号10-013-CV)
1％Glutamax(Thermo参考号35050061)
3％人血小板裂解物(来自Cook Reagentec PG-NH-500的Stemulate)
用于平面培养的细胞收获方案
使微载体沉降并除去最大体积的用过的培养基，而不除去微载体。
用DPBS以0.1mL/cm2体积与表面积比将微载体培养物洗涤2次。
以0.012mL/cm2加入37℃的加热的TrypLE 5x，并在室温下将烧瓶孵育约15分钟。
以0.024mL/cm2加入完全培养基以使TrypLE 5x活性猝灭。
使用NC200细胞计数仪进行活细胞计数。
用于微载体培养的细胞核计数方案
从生物反应器或旋转瓶中获得4-5mL的微载体培养物
使微载体沉降并除去最大体积的用过的培养基，而不除去微载体。
将1.5mL Nucleocounter试剂A添加至巨载体样品管，并高速涡旋1分钟。
将1.5mL Nucleocounter试剂B添加至巨载体样品管，并高速涡旋1分钟。
使用NC200细胞核计数仪进行细胞核计数。
从STR生物反应器收集培养基
停止所有控制，并使微载体沉降在生物反应器容器中。
使用蠕动泵以200mL/分的流速经过网袋泵出培养基，进入收集瓶中。
在BSC内将培养基倒入0.45μm Nalgene快速流动过滤系统，并去除游离漂浮细胞。
在零下20℃冰箱中冷冻培养基瓶。
从旋转瓶收集培养基
在BSC内将微载体培养物基倒入0.45μm Nalgene快速流动过滤系统，并去除游离漂浮细胞以及微载体。
在零下20℃冰箱中冷冻培养基瓶。
细胞培养设定点
Figure BDA0003869254570003241
图31显示了来自搅拌罐一次性(STR)生物反应器中2.6L培养物的mPDL1-Fc-GPI产量、生长参数和分析物浓度。第2天：更换80％批量体积培养基(葡萄糖第1次增加，并且乳酸盐减少)第3天：用2倍细胞培养体积的含Ca和Mg的DPBS冲洗培养物。(葡萄糖第2次增加，并且乳酸盐减少)。将外泌体生产培养基(DMEM-1％Glutamax)以10cm2/mL表面积与培养基体积比添加至培养物。
使用上述纯化方法纯化mPDL1(图32-33)。
实施例16
PD-L1-Fc-GPI和PDL2-Fc-GPI外泌体增加PD-1信号传导
使用图12A中的修改的DiscoverX测定法测试纯化的外泌体。当分别与单独的可溶性PD-L1-Fc或PD-L2-Fc配体相比时，用PD-L1或PD-L2标记的外泌体处理的Jurkat信号传导细胞获得大约1000X的相对光单位(RLU)增加。因此，在所述工程化外泌体上它比溶解的配体PD-L1-Fc或PD-L2花了少1000Xμg/ml的PD-L1或PD-L2激活PD-1，实现相同的RLU信号传导。图12B显示了对于PD-L1和PD-L2外泌体对比可溶性PD-L1和PD-L2信号传导生物测定的剂量响应曲线。图12B显示了包含Fc接头和GPI粘性结合剂的PD-L1和PD-L2外泌体相对于具有Fc结构域接头的可溶性配体的剂量响应曲线。这些结果表明，与单独的可溶性配体相比，与EV上的Fc和GPI结构域融合的PD-L1和PD-L2多肽对PD-1信号传导具有更强的作用。
实施例17
体内测定–mPD-L1外泌体
在Lewis大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)模型中的治疗效果
用视网膜抗原光受体间类视黄醇结合蛋白(IRBP)肽攻击Lewis大鼠。这个模型可用于研究前房和后房依赖性EAU。在第1天免疫大鼠，通常在第6天出现EAU。确定大鼠中的临床评分。EAU给药方案显示在13A中。EAU给药测试品如下表所示。
EAU给药测试品
Figure BDA0003869254570003251
*IVT-玻璃体内，IV–静脉内
研究设计概述如下：
Figure BDA0003869254570003261
如下确定临床评分：
大鼠中的EAU临床评分
评分 临床标准
0 无疾病；眼睛是半透明的，并反射光(红色反射)
0.5(微量) 虹膜中血管扩张
1 虹膜中血管充血；异常瞳孔收缩
2 前房混浊；红色反射减弱
3 中度不透明前房，但瞳孔仍可见；暗红色反射
4 不透明前房，并且瞳孔模糊；红色反射缺失；眼球突出
每个更高的等级包括前一个等级的标准。
已经发现，与未治疗的动物相比，在经由玻璃体内和静脉内递送模式的mPDL1外泌体治疗的大鼠中，在EAU方面有统计学显著的初始减轻(图13A)。免疫后大鼠重量没有变化(图13C)。
实施例18
II型膜蛋白标记的外泌体的纯化
本发明人通过本文提供的方法设计、工程化和纯化了pcDNA5-FRT-4F2-4-1BBL外泌体(图34)。4-1BBL标记的外泌体的几个实施方案显示在图35中。证实了4F2-4-1BBL的细胞表达(数据未显示)。图92A-92B显示了4F2-4-1BBL外泌体的纯化。
实施例19
内腔标记的外泌体的纯化(内部装载)
除了在EV表面上的I型和II型展示融合蛋白外，外泌体还可以装载有定位在所述外泌体的磷脂双层的内腔的融合蛋白(图37)。当本文所用的Myr/Palm序列在与mScarlet融合时，所述融合蛋白进入细胞外囊泡的内腔内部。在激发波长470nm和发射波长665-720nm处的荧光在SEC级分7、8和9中达到峰值。SEC级分7、8和9含有外泌体，如通过圆点印迹证明。使用ExoView系统进一步分析级分8的外泌体定量(图38)。未修饰的外泌体未显示荧光。外泌体显示接近80％的Myr/Palm-mScarlet装载。其余20％超出了检测限。因而，使用特定的Myr/Palm序列实现了几乎100％的内部装载。
还用掺入编码所述融合多肽的载体中的Myr/Palm序列纯化表达NanoLuc荧光素酶的外泌体。使用Qubit荧光计测量总蛋白，并且使用Promega Nano-Glo底物和平板发光计测量发光(图39A)。进行外泌体的四跨膜蛋白表征，并确定NanoLuc萤光素酶外泌体被内部装载和纯化在级分8中(39B)。

Claims (54)

1.一种工程化细胞外囊泡，其包含：
至少一种融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域，
其中所述POI结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的细胞外位置。
2.如权利要求1所述的工程化细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡是外泌体。
3.如权利要求1或权利要求2所述的工程化细胞外囊泡，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段是所述融合多肽的N-末端结构域。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述囊泡靶向结构域是所述融合多肽的C-末端结构域。
5.如权利要求1-4中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述融合多肽包含至少两个POI结构域和/或至少两个外泌体靶向结构域。
6.如权利要求1-5中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述融合多肽还包含肽接头。
7.如权利要求1-6中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述融合多肽还包含片段可结晶区域(Fc)结构域。
8.如权利要求1-7中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述囊泡靶向结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的内腔位置。
9.如权利要求1-7中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述囊泡靶向结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的外部位置。
10.如权利要求1-9中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域选自由下列组成的组：表1。
11.如权利要求1-10中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是PD-L1或其片段。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是PD-L2或其片段。
13.如权利要求1-12中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是FGL1或其片段。
14.如权利要求1-13中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是4-1BBL或其片段。
15.如权利要求1-14中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域是CTLA-4或其片段。
16.如权利要求1-15中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述POI结构域基本上结合至一种或多种靶多肽。
17.如权利要求16所述的工程化细胞外囊泡，其中所述靶多肽选自由下列组成的组：表2。
18.如权利要求1-17中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述囊泡靶向结构域选自由下列组成的组：表3。
19.如权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述接头位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的外部位置。
20.如权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述接头是跨膜接头。
21.如权利要求1-18中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述接头位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的内腔位置。
22.如权利要求1-21中任一项所述的工程化细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡不包含内源POI多肽。
23.一种组合物，其包含多种如权利要求1-22中任一项所述的工程化细胞外囊泡。
24.如权利要求23所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。
25.一种工程化细胞外囊泡，其包含：
(a)第一融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域，
其中所述至少一个POI结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的细胞外位置，
(b)第二融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域，
其中所述POI结构域位于相对于所述细胞外囊泡的脂质膜的细胞外位置，
并且其中所述至少一个囊泡靶向结构域位于所述细胞外囊泡的脂质膜内。
26.一种组合物，其包含选自权利要求1-25中任一项的两种或多种工程化细胞外囊泡。
27.一种细胞外囊泡组合物，其包含：
多个人工突触，
其中每个人工突触包含(i)细胞外囊泡；(ii)一种或多种粘性结合剂；和(iii)一个或多个信号传导结构域。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述细胞外囊泡包含外泌体。
29.如权利要求27所述的组合物，其中所述一种或多种粘性结合剂选自由下列组成的组：GPI锚、脂肪酰化位点和异戊二烯化位点。
30.如权利要求27所述的组合物，其中所述信号传导结构域包含下列一种或多种：PD-L1、PD-L2、CTLA-4(CD152)、4-1BBL(CD137L)、HVEM(CD270)、FGL1、OX-2(CD200)、半乳凝素-9、PVR(CD155)、连接蛋白-2(CD112)同工型α、连接蛋白-2(CD112)同工型β、连接蛋白-2(CD112)同工型δ、IL-10、TSG-6、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B7-H5(VISTA)、B7-H7(HHLA2)、BTNL1、VSIG8、VSIG3(IGSF11)、VSIG4、TIM-3(HAVCR2)、TIM-4(TIMD4)、CEACAM1、BTN3A1、BTN3A2、BTN2A1、BTNL8、BTN2A2、BTN1A1、TIGIT、CD27L(CD70)、CD30L(CD153)、GITRL、CD40L(CD154)、LIGHT(CD258)、TL1、CD80、CD86、LFA-3(CD58)、SLAM(CD150)、CD40、CD28、CD28H、CD2、LFA-3(CD58)、CD48、CD226、DR3、DcR3、FasL、TIM-1(CD365)、PD-1或其活性片段。
31.一种产生如权利要求1-30中任一项所述的工程化细胞外囊泡或组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供表达编码一种或多种粘性结合剂和一个或多个信号传导结构域的载体构建体的细胞群；和
(b)从所述细胞群分离多个人工突触。
32.一种产生如权利要求1-30中任一项所述的工程化细胞外囊泡或组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供表达编码一种或多种粘性结合剂和一个或多个信号传导结构域的载体构建体的细胞群；和
(b)从所述细胞群分离多个人工突触；和
(c)从所述细胞群纯化多个人工突触。
33.如权利要求31或权利要求32所述的方法，所述分离是经由尺寸排阻色谱进行的。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述纯化是经由多模式色谱法进行的。
35.如权利要求31-34中任一项所述的方法，其还包括进行POI与靶多肽结合的测定。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述载体构建体还编码启动子。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子或诱导型启动子。
38.一种调节受试者中的炎症的方法，所述方法包括：
给有需要的受试者施用包含多种工程化细胞外囊泡的组合物，
其中所述工程化细胞外囊泡包含至少一种融合多肽，所述至少一种融合多肽包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述细胞外囊泡包含外泌体。
40.如权利要求38-39中任一项所述的方法，其还包括选择患有或疑似患有自身免疫性疾病或炎性疾病或疾患的受试者。
41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述囊泡靶向结构域选自由下列组成的组：糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚、脂肪酰化位点和异戊二烯化位点。
42.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述囊泡靶向结构域是GPI锚。
43.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述囊泡靶向结构域是C1C2。
44.如权利要求38-43中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域包含下列一种或多种：PD-L1、PD-L2、CTLA-4(CD152)、4-1BBL(CD137L)、HVEM(CD270)、FGL1、OX-2(CD200)、半乳凝素-9、PVR(CD155)、连接蛋白-2(CD112)同工型α、连接蛋白-2(CD112)同工型β、连接蛋白-2(CD112)同工型δ、IL-10、TSG-6、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B7-H5(VISTA)、B7-H7(HHLA2)、BTNL1、VSIG8、VSIG3(IGSF11)、VSIG4、TIM-3(HAVCR2)、TIM-4(TIMD4)、CEACAM1、BTN3A1、BTN3A2、BTN2A1、BTNL8、BTN2A2、BTN1A1、TIGIT、CD27L(CD70)、CD30L(CD153)、GITRL、CD40L(CD154)、LIGHT(CD258)、TL1、CD80、CD86、LFA-3(CD58)、SLAM(CD150)、CD40、CD28、CD28H、CD2、LFA-3(CD58)、CD48、CD226、DR3、DcR3、FasL、TIM-1(CD365)、PD-1或其活性片段。
45.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域是PD-L1或其片段。
46.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域是PD-L2或其片段。
47.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域是CTLA-4或其片段。
48.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质(POI)结构域是HVEM或其片段。
49.如权利要求40所述的方法，其中所述炎性疾病和/或疾患是急性的。
50.如权利要求40所述的方法，其中所述炎症相关疾病和/或疾患是慢性的。
51.如权利要求38所述的方法，其中施用组合物包括注射、局部施用或吸入。
52.包含多种工程化细胞外囊泡的组合物的用途，所述工程化细胞外囊泡各自包含：
至少一种融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域
其用于治疗炎性疾病或疾患。
53.包含多种工程化细胞外囊泡的组合物的用途，所述工程化细胞外囊泡各自包含：
至少一种融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域
其用于治疗自身免疫性疾病或疾患。
54.包含多种工程化细胞外囊泡的组合物的用途，所述工程化细胞外囊泡各自包含：
至少一种融合多肽，其包含：
(i)至少一个感兴趣的蛋白质(POI)结构域或其片段；和
(ii)至少一个囊泡靶向结构域
其用于治疗癌症。
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