CN116139278B - 一种tim-3棕榈酰化修饰及靶向多肽在肿瘤免疫治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种TIM‑3棕榈酰化修饰及靶向多肽在肿瘤免疫治疗中的应用。本发明提供的技术方案明确了TIM‑3棕榈酰化对其细胞膜表达和蛋白稳定性的影响，并研究TIM‑3棕榈酰化介导CTL/NK细胞耗竭的作用机制，提升了TIM‑3棕榈酰化对TIM‑3稳定表达的意义。并设计靶向TIM‑3棕榈酰化位点的阻断多肽，提供靶向干预策略抑制TIM‑3表达，为靶向干预TIM‑3棕榈酰化的抗肿瘤免疫治疗提供了新的方向。

Description

一种TIM-3棕榈酰化修饰及靶向多肽在肿瘤免疫治疗中的 应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，涉及TIM-3棕榈酰化修饰在肿瘤免疫制剂开发领域的应用，具体涉及一种靶向TIM-3的多肽、融合肽及药物组合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子3(T cell immunoglobulin and mucindomain-containing protein 3，TIM-3)是继PD-1、CTLA4后的又一重要的免疫检查点分子。TIM-3在CD8⁺T、NK、Treg和DC等多种免疫细胞上表达，Tim-3通过调节免疫细胞功能参与众多生理和病理过程，是基于免疫点阻断的肿瘤免疫治疗重要靶点。Tim-3表达上调可导致肿瘤浸润CD8⁺T细胞和NK细胞功能耗竭，而Tim-3阻断可以有效抑制多种模型中的肿瘤生长，目前多种Tim-3阻断抗体已进入临床试验。

基于PD-1/PD-L1的免疫检查点治疗可有效恢复免疫细胞功能，在临床中取得了良好疗效并成为肿瘤治疗领域的热点。目前主要以阻断抗体为主，但总体应答率有限。免疫检查点细胞膜表达是其介导免疫抑制和肿瘤免疫治疗的基础，因此深入研究免疫检查点分子的膜表达调控机制，设计新一代免疫检查点分子的靶向干预策略具有极为重要的意义。而近期多项研究揭示了糖基化修饰、泛素化、棕榈酰化等多种翻译后修饰在调控免疫检查点分子膜表达和蛋白降解的关键作用，提出靶向免疫检查点的蛋白翻译后修饰、改善抗肿瘤免疫治疗的新策略。但迄今为止，Tim-3免疫细胞膜表达、蛋白翻译后修饰相关研究非常有限。

发明内容

本发明研究首先证实了TIM-3存在棕榈酰化修饰，明确了TIM-3蛋白胞浆尾部的C296位点是主要的棕榈酰化修饰位点，并且上述蛋白的棕榈化修饰是维持TIM-3细胞膜表面表达的重要因素，对于TIM-3蛋白稳定性具有重要作用。基于上述机制的明确，抑制棕榈酰化程度有利于降低TIM-3的膜表达，实现肿瘤免疫抑制效果。为了验证TIM-3棕榈酰化抑制在医药开发方向的可能性，本发明设计靶向TIM-3棕榈酰化位点的阻断多肽，为靶向干预TIM-3棕榈酰化增强抗肿瘤免疫治疗提供了新的方向。

本发明第一方面，提供了TIM-3棕榈酰化修饰在肿瘤免疫治疗领域的应用。

上述应用方式包括以下方面：

(1)TIM-3棕榈酰化程度作为肿瘤诊断、预后标志物的应用；

(2)TIM-3棕榈酰化抑制剂在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

上述(1)方面的应用中，所述TIM-3棕榈酰化程度作为肿瘤诊断、预后标志物的应用，其具体的方式包括：基于受试者免疫细胞中TIM-3棕榈酰化程度对受试者患病或肿瘤预后情况进行判断，棕榈酰化程度高可能意味着患者免疫功能更耗竭和具有不良的预后情况。

所述(1)方面应用的具体方式还包括将TIM-3棕榈酰化检测试剂应用于制备肿瘤诊断或预后检测产品，如检测芯片或检测试剂盒。

进一步的，所述棕榈酰化检测位点为TIM-3蛋白C296位点，所述棕榈酰化检测试剂包括但不限于基于修饰组学或质量信息进行检测所涉及的相关试剂，所述质量信息检测方法的具体实例如基于质谱方法对目标位点片段质量进行检测。

上述(2)方面的应用中，所述TIM-3棕榈酰化抑制剂包括直接抑制TIM-3棕榈酰化修饰反应、棕榈酰化酶活性的抑制剂，也包括去棕榈酰化酶激动剂，上述抑制剂、激动剂的具体类型为包括但不限于小分子化合物、聚合物、核酸或多肽中的一种。

本发明提供的一种实施方式中，所述小分子化合物如2-BP。

本发明第二方面，提供一种靶向TIM-3的多肽，所述多肽具有如下所示的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(2)与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与靶向TIM-3的多肽仍具有相同或基本相同的功能。

上述(2)方面中，所述一个或多个优选为1-3个，所述添加、缺失或替换以连续或不连续的方式发生在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的N-末端、C-末端或序列中；进一步的，所述衍生序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有90％及以上的相似性；更进一步的，所述相似性至少为91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；所述氨基酸序列的相似性可采用本领域常用方式进行比对，例如Blast方法。所述衍生多肽与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列仍具有相同或基本相同的功能，所述功能主要包括对TIM-3棕榈酰化位点的亲合性或降低TIM-3稳定表达的能力。

另外，所述衍生多肽还包括化学或遗传修饰，例如通过链霉亲和素、生物素、放射性同位素、荧光剂、酶、细胞毒性物质、抗肿瘤剂等对所述靶向TIM-3的多肽进行修饰所形成的衍生多肽。

本发明第三方面，提供一种融合肽，所述融合肽包括第一结构域及第二结构域，其中，第一结构域与为上述第二方面所述TIM-3的多肽，第二结构域为辅助结合效应细胞的片段。

优选的，所述辅助结合效应细胞的片段为穿膜肽，所述穿膜肽为阳离子型穿膜肽，包括但不限于TAT，Penetratin，Polyarginine，P22N，DPV3、DPV6中的一种。进一步的，所述穿膜肽与靶向TIM-3的多肽之间还具有连接子或通过共价键连接；本发明提供的一种具体的实施方式中，所述穿膜肽与靶向TIM-3的多肽的N端通过酰胺键连接，所述融合肽的具体序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明第四方面，提供编码第二方面所述靶向TIM-3的多肽、第三方面所述融合肽的核酸物质。

上述第四方面所述核酸物质包括由于密码子简并性能够翻译得到上述靶向多肽或融合肽的编码核酸，包括DNA形式或RNA形式；其中，DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，可以是单链的或是双链的，可以是编码链或非编码链。分离所述核酸物质的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得。

本发明第五方面，提供包含第四方面所述核酸物质的构建体。

所述构建体的构建方法对于本领域技术人员来说是常规的，例如，通过体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，可以由所述的分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。

本发明第六方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中包括第二方面所述靶向TIM-3的多肽、第三方面所述融合肽、第四方面所述核酸物质或第五方面所述构建体。

所述宿主细胞为任意可使表达载体进行表达的细胞，包括原核细胞(如细菌细胞)、低等真核细胞(如酵母细胞)、高等真核细胞(如哺乳动物细胞)；进一步的，所述宿主细胞为大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、酵母、丝状真菌、植物细胞等。

本发明第七方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中，包括第一方面所述靶向TIM-3的多肽或第三方面所述融合肽。

优选的，所述药物组合物中还包括本领域药学上可接受的载体，所述载体的类型包括但不限于缓冲剂(如乙酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸)、抗氧化剂(如抗坏血酸和甲硫氨酸)、防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵、酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)、杀菌剂(如氯己双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵)、张力调节剂(如海藻糖和氯化钠)、糖类(如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇)、表面活性剂(如聚山梨醇酯)、金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)和/或非离子表面活性剂(如或聚乙二醇)。

优选的，所述药物组合物，所述靶向TIM-3的多肽或融合肽应当是活性剂量的，所述剂量可依据治疗的对象和特定给药方式通过常规手段进行确定。例如，以药物组合物的总质量计，所述靶向TIM-3的多肽或融合肽含量范围可以是大约0.01～99％、0.1～70％、1～30％、0.01～0.05％、0.05～0.1％、0.1～0.3％、0.3～0.5％、0.5～1％、1～3％、3～5％、5～10％、10～20％、20～30％、30～50％、50～70％、或70～99％。

本发明第八方面，提供第一方面所述靶向TIM-3的多肽、第三方面所述融合肽或第七方面所述药物组合物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。

优选的，所述肿瘤免疫治疗药物包括用于诊断、预防、改善或治疗与TIM-3高表达相关肿瘤疾病；进一步的，所述肿瘤可以是包括但不限于肺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、经典霍奇金淋巴瘤、血液恶性肿瘤、头颈癌、鼻咽癌中的一种。

优选的，所述治疗药物中，所述靶向TIM-3的多肽、融合肽或药物组合物应当是有效剂量的。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为灵长类动物TIM-3C端存在特定11aa与其稳定性密切相关并存着棕榈酰化修饰位点；

A：不同物种TIM-3蛋白胞浆尾部结构域序列分析；

B：野生型(TIM-3-WT)和11aa敲除突变体(TIM-3Δ11aa)进行蛋白稳定性比较分析；

C：TIM-3棕榈酰化修饰位点数据库预测分析；

D：脂酰生物素交换(ABE)试验原理示意图；

E：脂酰生物素交换(ABE)试验TIM-3棕榈酰化修饰位点分析；

图2为TIM-3棕榈酰化修饰在膜定位和维持蛋白稳定性方面的作用；

A：2-BP处理不同免疫细胞TIM-3膜表达水平分析；

B：2-BP、ML348剂量处理NK92 TIM-3蛋白水平变化分析；

C：2-BP处理TIM-3蛋白半衰期变化分析；

D和E：野生型(D)与C296A(E)TIM-3细胞内定位差异分析；

图3为TIM-3棕榈酰化通过影响其泛素化从而导致TIM-3通过内质网相关降解途径(ERAD途径)降解；

A：棕榈酰化修饰影响TIM-3降解途径分析；

B：TIM-3存在泛素化修饰检测；

C：2-BP处理增加TIM-3的泛素化水平；

D：C296突变增加TIM-3的泛素化修饰水平；

E和F:Co-IP互作分析筛选出TIM-3的ERAD相关E3泛素连接酶；

G：过表达HRD1对TIM-3-K48连接的多泛素化水平修饰的促进作用；

图4为TIM-3棕榈酰化阻断多肽抑制TIM-3膜表达的相关验证；

A：阻断TIM-3棕榈酰化的野生型多肽和突变型(C296A)多肽与穿膜肽融合方式示意图；

B：融合肽处理对CD8⁺T细胞的TIM-3表达水平的影响；

C：融合肽处理对NK92细胞体外杀伤肿瘤细胞能力的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例

1、灵长类动物TIM-3C端存在特定11aa与其稳定性密切相关并存着棕榈酰化修饰位点

对不同物种TIM-3蛋白序列进行比对分析发现灵长类TIM-3胞浆尾部进化多出11aa(A),提示灵长类TIM-3可能存在特殊的调控机制。将人TIM-3野生型(TIM-3-WT)和11aa敲除突变体(TIM-3Δ11aa)进行蛋白稳定性比较，发现11aa敲除突变体蛋白稳定性显著下降(B)。利用CSS-palm 4.0棕榈酰化预测工具发现人TIM-3蛋白C296位点是潜在的棕榈酰化修饰位点(C)。脂酰生物素交换试验(D)进行棕榈酰化修饰检测，首次明确了人TIM-3蛋白存在棕榈酰化修饰，且第296位Cys是主要棕榈酰化修饰位点(E)。

2、TIM-3棕榈酰化修饰是其膜定位和维持蛋白稳定性所必须

棕榈酰化酶抑制剂2-BP作用于多种免疫细胞，包括CD8⁺T细胞、NK92细胞、THP1细胞，流式细胞数检测发现细胞膜表面的TIM-3表达水平显著降低(A)。Western Blot检测发现棕榈酰化抑制剂2-BP处理降低NK92细胞内总TIM-3表达水平，去棕榈酰化酶的抑制剂ML348处理增加NK92内TIM-3的表达水平，且均呈现剂量依赖性(B)，说明棕榈酰化修饰对TIM3蛋白表达至关重要。蛋白半衰期检测发现，2-BP处理导致TIM-3的蛋白半衰期明显缩短(C)。进一步免疫荧光发现TIM-3棕榈酰化位点突变(C296A)，导致其内质网扣留增加(D)。膜浆器分离试验也发现C296A突变后，TIM-3的细胞膜表达明显降低，在细胞器中表达比例显著增加(E)(E图中C指胞浆组分，M指细胞膜组分，O指内质网等膜性细胞器)。这些结果表明棕榈酰化修饰不仅影响TIM-3的蛋白稳定性，同时影响TIM-3的内质网-细胞膜转运。

3、TIM-3棕榈酰化通过影响其泛素化从而导致TIM-3通过ERAD途径降解

为探究棕榈酰化调控TIM-3蛋白降解的机制，首先用蛋白酶体途径抑制剂MG132、溶酶体途径抑制剂CQ和内质网相关蛋白降解ERAD途径抑制剂Eer-I分别处理，发现Eer-I和MG132可阻断2-BP诱导的TIM-3蛋白降解(附图3A)，提示TIM-3棕榈酰化降低后通过ERAD途径发生泛素化降解(A)。进一步探究发现TIM-3确实存在泛素化修饰(B)，2-BP处理或者C296A位点突变后TIM-3多聚泛素化水平显著升高(C和D)。通过ERAD相关的E3泛素连接酶与TIM-3的Co-IP互作分析明确HRD1为TIM-3的E3泛素连接酶(E和F)，过表达HRD1能明显增加TIM-3蛋白的K48连接的多泛素化水平(G)。

4、TIM-3棕榈酰化阻断多肽抑制TIM-3的膜表达

基于TIM-3棕榈酰化修饰在TIM-3膜表达及稳定中的重要作用，进一步设计了靶向TIM-3棕榈酰化位点的穿模多肽，竞争性抑制TIM-3的棕榈酰化修饰。将TIM-3野生型多肽和突变型(C296A)多肽分别与穿膜肽(CPPtat：YGRKKRRQRRR)融合：野生型穿膜多肽CPP-TIM-3-WT:YGRKKRRQRRRQPSQPLGCRFAMP；突变型穿膜多肽CPP-TIM-3-C296A：YGRKKRRQRRRQPSQPLGARFAMP(A)。CPP-TIM-3-WT多肽处理可显著降低CD8⁺T细胞膜TIM-3表达水平(B)。进一步体外杀伤实验发现，CPP-TIM-3-WT多肽与NK92细胞共孵育后，可有效增强NK92杀伤靶细胞K562的能力并呈剂量依赖性(C)，说明靶向TIM3棕榈酰化的穿膜多肽可降低TIM-3细胞膜表达并增强CTL和NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，具有良好的抗肿瘤潜在应用价值。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.TIM-3棕榈酰化抑制剂在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，其特征在于，

所述TIM-3棕榈酰化抑制剂为一种融合肽，所述融合肽的具体序列如SEQ ID NO:2所示。

2.编码融合肽的核酸分子，其特征在于，所述融合肽的具体序列如SEQ ID NO:2所示。