KR100961054B1 - 암을 치료하기 위해 조작한 신규한 초항원을 포함하는 접합체, 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이용 방법에 관한 것이다. 특히, 박테리아성 초항원은 활성도는 유지하면서 감소된 혈청반응성을 갖도록 변형시킨 것이다.
Figure R1020037016268
박테리아성 초항원, 항체 부분, 혈청반응성, 접합체

Description

암을 치료하기 위해 조작한 신규한 초항원을 포함하는 접합체, 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법{A CONJUGATE COMPRISING A NOVEL ENGINEERED SUPERANTIGEN FOR TREATING CANCER, A COMPOSITION COMPRISING THE CONJUGATE AND A METHOD USING THE CONJUGATE}
본 발명은 암을 치료하기 위해 조작한 신규한 초항원을 포함하는 접합체에 관한 것이다. 특히, 혈청반응성(seroreactivity)을 감소시키기 위해 변형시킨 초항원을 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
관련 기술
박테리아성 및 바이러스성 단백질 그룹으로 구성된 초항원(SAg's)류는 다수의 T - 세포 집단을 활성화시키는데 특히 효과적이다. 초항원은 처리되지 않은 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 직접 결합한다. 사실상, 초항원은 MHC 제 2 급 분자 상의 처리되지 않은 외부의 항원 - 결합 홈에 결합하여 통상적인 펩티드 - 결합 부위에서의 대부분의 다형성을 회피하게 된다. 결합 메카니즘은 T - 세포 수용체(TCR)의 초가변 루프(hypervariable loop)와의 결합대신에 Vβ쇄에서 T - 세포 수용체(TCR)에 결합하는 초항원에 따라 달라진다.
포도상구균 엔테로톡신(SEs)은 구조와 기능 두 가지 면에 있어서 초항원의 상동성 그룹이다(Papageorgiou 등의 2000 문헌 참조). 이들은 인체에서 식중독 및 독성 쇽 증후군의 주요 원인인 것으로 공지되어 있다.
신규한 SAg - 기저 종양 치료 연구는 충실성 종양(solid tumor)의 보조 치료에 관해 개발되어 왔다. 종양 - 특이적 모노클로날 항체의 Fab 부분 및 T - 세포 활성 SAg 를 단일 재조합 융합 단백질에 삽입시킴으로써 면역계의 두 주요 목적을 사용하였다. 종양 세포에 결합한 Fab - SAg 단백질은 초항원 항체 - 의존 세포 매개 세포독성(SADCC)에 의해 직접적으로 종양 세포를 사멸시키도록 SAg - 활성 세포독성 T - 세포를 야기할 수 있다. 게다가, 활성화된 T - 세포는 각각의 종양 이질성 및 거대분자 흡착의 문제점을 해결하는 종양파괴성 및 전염증성(proinflammatory) 시토킨류를 생산한다.
초항원 - 기저 종양 치료제는 성공적으로 사용되었지만 처리해야할 문제로서 전신성 면역계의 활성이라는 하나의 임상 문제가 남아있다. 야생형 SEA 를 갖는 융합 단백질은 결장직장암 및 췌장암의 임상 시험에서 조사되었다(Alpaugh 등의 1998 참조). 가능성 있는 결과를 수득하였음에도 불구하고, 제한점이 발견되었다. 첫째로, 생산물의 독성 이 매우 강하다는 점이다. 두번째로, 환자에게서 초항원에 대하여 형성된 항체가 용량 복합체(dosing complex)를 형성한다는 점이다. 게다가, 생산물은 면역원성을 나타낸다. 그러므로 여러번 반복된 치료는 극히 제한된 환자에게서만 가능하였다.
본 발명에 이르기까지, SAg - 기저 치료제는 투여량이 제한되었다. 본 발명은 처음으로 초항원을 변형시켜 초항원의 활성도는 유지한 채 혈청반응성을 감소시켰으므로 본 발명은 신규하고 명백하지 않은 것이다.
발명의 간단한 요약
상기 기술한 내용은, 본 발명의 상세한 설명이 좀더 쉽게 이해될 수 있도록 본 발명의 특징 및 기술적 이점을 다소 광범위한 범위에서 간략히 기술한 것이다. 본 발명의 부가적인 특징 및 이점은 본 발명의 과제 및 청구의 범위를 형성하는 하기에서 상세히 기술될 것이다. 밝혀진 개념 및 특정 실시형태가 본 발명의 동일한 목적을 시행하기 위해 그밖의 다른 구성을 변형시키거나 제조하는데 적합한 기초로서 용이하게 사용될 수 있음을 본 분야의 숙련자들은 이해해야 한다. 또한, 이러한 동등물은 첨부된 청구범위에 기술된 바와 같이 본 발명의 정신 및 범주에서 벗어나지 않음을 본 분야의 숙련자는 인지해야 한다. 도면과 함께 고려될 경우에, 본 발명의 구성 및 조작 방법에 관하여서 본 발명의 또다른 목적 및 이점과 함께 본 발명의 특성이라고 여겨지는 신규한 특징은 하기의 상세한 설명으로부터 자세히 이해될 것이다. 그러나, 각각의 도면들은 본 발명의 정의를 제한하고자 하는 의도가 아니라 단지 도해 및 상세한 설명을 제공하는 것임을 특별히 이해하게 될 것이다.
본 발명은 박테리아성 초항원 및 항체 부분(antibody moiety)을 포함하는 접합체를 제공하며, 상기 초항원은 영역 A 내지 E 를 포함하는 낮은 역가(low titer)의 초항원이고, 영역 A 는 TCR 결합 부위이며 영역 B 내지 E 는 MHC 제 Ⅱ 급 분자와의 결합을 결정하고 ; 상기 초항원을 코드하는 DNA 서열을 치환시켜서 치환된 초항원이 유도된 초항원에 비해 감소된 혈청반응성을 갖게하기 위해 영역 A 에서 15 개의 아미노산 잔기만을 다른 아미노산으로 치환시켰으며 ; 여기에서 항체 부분은 전장(full length)의 항체이거나 그밖의 다른 분자와 결합하는 항체의 활성 단편이며, 이 항체 부분은 암 - 관련 세포 표면 구조에 대해 특이적이다. 초항원의 예로는 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 : 포도상구균 엔테로톡신(SE : staphylococcal enterotoxin), 화농성 연쇄상구균 외독소(SPE : streptococcus pyogenes exotoxin), 황색포도상구균 독성 쇽 - 증후군 독소(TSST - 1 : staphylococcus aureus toxic shock - syndrome toxin), 연쇄상구균 유발성 외독소(SME : streptococcal mitogenic exotoxin) 및 연쇄상구균 초항원(SSA : streptococcal superantigen). 특정 실시형태에서, 포도상구균 엔테로톡신은 포도상구균 엔테로톡신 A(SEA) 또는 포도상구균 엔테로톡신 E(SEE)이다.
특정 실시형태에서, 영역 A 에서 치환하려는 아미노산 잔기 위치는 20, 21, 24, 27, 173 및 204 중에서 선택하였다. 영역 C 에서 15 개의 아미노산 잔기만이 치환되는 것을 생각할 수도 있다. 이러한 치환은 아미노산 잔기 위치 79, 81, 83 및 84 에서 일어날 수 있다. 또한 영역 E 에서도 15 개의 아미노산 잔기만이 치환되며, 이 치환은 아미노산 잔기 위치 227 에서 일어날 것이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 접합체를 제공하며, 상기 초항원은 영역 A 내지 E 를 포함하는 낮은 역가의 초항원이고, 영역 A 는 TCR 결합 부위이며 영역 B 내지 E 는 MHC 제 Ⅱ 급 분자와의 결합을 결정하고, 상기 초항원의 아미노산 서열을 치환시켜서 치환된 초항원이 유도된 초항원에 비해 감소된 혈청반응성을 갖게하기 위해 영역 B 에서 15 개의 아미노산 잔기만을 다른 아미노산으로 치환시켰으며, 상기 항체 부분은 전장의 항체이거나 그밖의 다른 분자와 결합하는 항체의 활성 단편이며, 이 항체 부분은 암 - 관련 세포 표면 구조에 대해 특이적이다. 특히, 영역 B 에서 치환하려는 아 미노산 잔기 위치는 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 및 49 중에서 선택할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시형태는 박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 접합체를 제공하며, 상기 초항원은 영역 A 내지 E 를 포함하는 낮은 역가의 초항원이고, 영역 A 는 TCR 결합 부위이며 영역 B 내지 E 는 MHC 제 Ⅱ 급 분자와의 결합을 결정하고, 상기 초항원의 아미노산 서열을 치환시켜서 치환된 초항원이 유도된 초항원에 비해 감소된 혈청반응성을 갖게하기 위해 영역 C 에서 15 개의 아미노산 잔기만을 다른 아미노산으로 치환시켰으며, 상기 항체 부분은 전장의 항체이거나 그밖의 다른 분자와 결합하는 항체의 활성 단편이며, 이 항체 부분은 암 - 관련 세포 표면 구조에 대해 특이적이다. 특정 실시형태에서 암은 폐암, 유방암, 결장암, 신장암, 췌장암, 난소암, 위암, 경부암 및 전립선암 중에서 선택한 것이다. 영역 C 에서 치환하려는 아미노산 잔기 위치는 74, 75, 78, 79, 81, 83, 및 84 중에서 선택하였다.
초항원의 예는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다 : 포도상구균 엔테로톡신(SE), 화농성 연쇄상구균 외독소(SPE), 황색포도상구균 독성 쇽 - 관련 독소(TSST - 1), 연쇄상구균 유발성 외독소(SME) 및 연쇄상구균 초항원(SSA). 특정 실시형태에서, 포도상구균 엔테로톡신은 포도상구 균 엔테로톡신 A(SEA) 또는 포도상구균 엔테로톡신 E(SEE)이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 접합체는 영역 A 에서 15 개의 아미노산 잔기의 치환만을 더 포함할 것이다. 영역 A 에서 치환은 아미노산 잔기 위치 20, 21, 24, 27, 173 또는 204 에서 일어날 수 있다. 추가적으로, 접합체는 영역 E 에서 15 개의 아미노산 잔기만의 치환을 포함할 수 있다. 좀 더 특별하게, 영역 E 의 치환은 아미노산 잔기 위치 227 에서 일어날 수 있다.
좀더 특정한 실시형태에서, 접합체는 R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S 및 D227S 의 치환을 포함하는 SEE 아미노산 서열 또는 R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S 및 D227A 의 치환을 포함하는 SEE 아미노산 서열을 포함할 것이다. 또한, 접합체는 SEQ ID NO : 2 의 아미노산 서열을 포함할 것이다.
다른 실시형태에서, 접합체는 항체 부분(예를 들어, Fab 단편)을 포함할 수 있으며 이것으로 한정되는 것은 아니다. 특정한 Fab 단편은 C215Fab 또는 5T4Fab 를 포함할 것이다.

접합체는 또한 인터루킨과 같은 시토킨을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 인터루킨은 IL2 또는 천연의 IL2 와 본질적으로 동일한 생물학적 활성도를 갖는 이의 유도체이다.
다른 실시형태는 박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 접합체를 포함하며, 상기 초항원은 영역 A 내지 E 를 포함하는 낮은 역가의 초항원이고, 영역 A 는 TCR 결합 부위이며 영역 B 내지 E 는 MHC 제 Ⅱ 급 분자와의 결합을 결정하고, 상기 초항원의 아미노산 서열을 치환시켜서 치환된 초항원이 유도된 초항원에 비해 감소된 혈청반응성을 갖게하기 위해 영역 D 에서 15 개의 아미노산 잔기만을 다른 아미노산으로 치환시켰으며, 상기 항체 부분은 전장의 항체이거나 그밖의 다른 분자와 결합하는 항체의 활성 단편이며, 이 항체 부분은 암 - 관련 세포 표면 구조에 대해 특이적이다. 영역 D 에서 치환하려는 아미노산 잔기 위치는 187, 188, 189 및 190 중에서 선택하였다.
다른 실시형태에서, 박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 접합체를 제공하며, 상기 초항원은 영역 A 내지 E 를 포함하는 낮은 역가의 초항원이고, 영역 A 는 TCR 결합 부위이며 영역 B 내지 E 는 MHC 제 Ⅱ 급 분자와의 결합을 결정하고, 상기 초항원의 아미노산 서열을 치환시켜서 치환된 초항원이 유도된 초항원에 비해 감소된 혈청반응성을 갖게하 기 위해 영역 E 에서 15 개의 아미노산 잔기만을 다른 아미노산으로 치환시켰으며, 상기 항체 부분은 전장의 항체이거나 그밖의 다른 분자와 결합하는 항체의 활성 단편이며, 이 항체 부분은 암 - 관련 세포 표면 구조에 대해 특이적이다. 특정 실시형태에서, 포도상구균 엔테로톡신은 포도상구균 엔테로톡신 A(SEA) 또는 포도상구균 엔테로톡신 E(SEE)이다. 또한, 영역 E 에서 치환하려는 아미노산 잔기 위치는 217, 220, 222, 223, 225 및 227 중에서 선택하였다.
특정 실시형태에서, 접합체는 또한 영역 A 에서 15 개의 아미노산 잔기만의 치환을 포함한다. 특히, 영역 A 에서의 치환은 아미노산 잔기 위치 20, 21, 24, 27, 173 및 204 에서 일어날 것이다.
다른 특정한 실시형태에서, 접합체는 영역 B 에서 15 개의 아미노산 잔기만의 치환을 더 포함하며 이때의 치환은 아미노산 잔기 위치 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 및 49 에서 일어날 것이다.
접합체는 또한 영역 C 에서 15 개의 아미노산 잔기만의 치환을 포함할 것이다. 특별히, 영역 C 에서의 치환은 아미노산 잔기 위치 74, 75, 78, 79, 81, 83 및 84 에서 일어난다. 또한, 접합체는 영역 D 에서 15 개의 아미노산 잔기만의 치환을 더 포함할 것이며 이 치환은 아미노산 잔기 위치 187, 188, 189 및 190 에서 일어날 것이다.
그밖의 다른 특정 실시형태에서, 박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 치료학적 유효량의 접합체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 초항원은 영역 A 내지 E 를 포함하는 낮은 역가의 초항원이고, 영역 A 는 TCR 결합 부위이며 영역 B 내지 E 는 MHC 제 Ⅱ 급 분자와의 결합을 결정하고, 상기 초항원의 아미노산 서열을 치환시켜서 치환된 초항원이 유도된 초항원에 비해 감소된 혈청반응성을 갖게하기 위해 영역 C 에서 15 개의 아미노산 잔기만을 다른 아미노산으로 치환시켰으며, 상기 항체 부분은 전장의 항체이거나 그밖의 다른 분자와 결합하는 항체의 활성 단편이며, 이 항체 부분은 암 - 관련 세포 표면 구조에 대해 특이적이다. 특히, 영역 C 에서 치환하려는 아미노산 잔기 위치는 74, 75, 78, 79, 81, 83 및 84 중에서 선택하였다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 영역 A 에서 15 개의 아미노산 잔기만의 치환을 포함하는 접합체를 포함할 것이며, 영역 A 에서의 치환은 아미노산 잔기 위치 20, 21, 24, 27, 173 및 204 에서 일어난다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 영역 E 에서 15 개의 아미노산 잔기만의 치환을 포함할 수 있다. 특히, 영역 E 의 치환은 아미노산 잔기 위치 227 에서 일어날 것이다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S 및 D227S 의 부가적인 치환 뿐만 아니라 SEE 아미노산 서열(SEQ ID NO : ID NO : 7)을 포함하는 접합체를 포함할 수 있다.
다른 특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S 및 D227A 의 부가적인 치환 뿐만 아니라 SEE 아미노산 서열(SEQ ID NO : ID NO : 7)을 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 SEQ ID NO : 1 의 아미노산 서열을 갖는 접합체를 포함할 수 있다.
또다른 특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 예를 들어, Fab 단편과 같은 항체 부분을 포함한다. 특히, Fab 단편은 C215Fab 또는 5T4Fab 이다. 약학적 조성물은 인터루킨과 같은 시토킨을 추가로 포함할 수 있다. 인터루킨은 IL2 또는 천연 IL2 와 본질적으로 동일한 생물학적 활성도를 갖는 이의 유도체이다.
본 발명의 다른 실시형태는 박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 접합체의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하여 포유동물의 면역계를 활성화시킴으로써 포유동물의 암을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 초항원은 영역 A 내지 E 를 포함하는 낮은 역가의 초항원이고, 영역 A 는 TCR 결합 부위이며 영역 B 내지 E 는 MHC 제 Ⅱ 급 분자와의 결합을 결정하고, 상기 초항원의 아미노산 서열을 치환시켜서 치환된 초항원이 유도된 초항원에 비해 감소된 혈청반응성을 갖게하기 위해 영역 C 에서 15 개의 아미노산 잔기만을 다른 아미노산으로 치환시켰으며, 상기 항체 부분은 전장의 항체이거나 그밖의 다른 분자와 결합하는 항체의 활성 단편이며, 이 항체 부분은 암 - 관련 세포 표면 구조에 대해 특이적이다. 암의 예에는 폐암, 유방암, 결장암, 신장암, 췌장암, 난소암, 위암, 경부암 및 전립선암이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 특히, 영역 C 에서 치환하려는 아미노산 잔기 위치는 74, 75, 78, 79, 81, 83, 및 84 중에서 선택한다.
또다른 실시형태에서, 영역 A 는 15 개의 아미노산 잔기만의 치환을 포함할 것이며 영역 A 에서의 치환은 아미노산 잔기 위치 20, 21, 24, 27, 173 및 204 에서 발생한다. 또한, 영역 E 는 15 개의 아미노산 잔기만의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 영역 E 의 치환은 아미노산 잔기 위치 227 에서 일어날 것이다. 접합체는 R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S 및 D227S 의 부가적인 치환 또는 R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S 및 D227A 의 치환 뿐만 아니라 SEE 아미노산 서열(SEQ ID NO : ID NO : 7)을 포함할 것이다. 또한, 접합체는 SEQ ID NO : 1 의 아미노산 서열을 갖는다.
하기 도면은 본 명세서의 부분을 형성하며 본 발명의 특정 양상을 추가로 설명하기 위해 포함된 것이다. 본 발명은 본원에 기재되어 있는 특정 실시형태의 상세한 설명과 함께 하나 또는 그 이상의 도면을 참고로 더 잘 이해하게 될 것이다.
도 1 은 항 - SEA 컬럼에서 용출된 SEA/E - 18 을 펩신으로 소화시켜 확인한 인체 항 - SEA 에 의해 인식되는 펩티드 단편을 나타낸 것이다. 질량분석계(MS)에 연결된 역상 HPLC 를 사용하여 정제 전후에 단편을 확인하였다. 친화성 정제 전후의 동일한 체류시간에서의 소화로 인해 발견된 단편은 양성으로 간주되었다.
도 2 는 SEA/E - 120 에 대한 아미노산 서열 상에 선으로 표시한, 확인된 상이한 7 개의 펩티드를 나타낸다. 밝은 회색으로 표시한 부분의 특징은 잔기가 SEA/E - 18 에 비해 SEA/E120 에서 치환되는 것이다.
도 3 은 SEA/E - 18 의 비교적인 컴퓨터 모델을 구성하기 위해 주형으로 사용하는 SEA, SED 및 SEH 의 구조 서열 배열을 나타낸다. 구조적으로 보존된 영역은 검은색 박스로 표시하였다.
도 4 는 SEA, SEE, SEA/E - 18 및 SEA/E - 120 의 다중 서열 배열을 나타낸다. 배열 상에 선으로 나타낸 부분은 SEA/E - 120 에서 모든 치환이 유지되는 위치 내의 상이한 5 개의 영역 A - E 를 나타낸다.
도 5 는 SEA(1SXT, 회색) 상에 (검은색으로) 겹쳐진 SEA/E - 18 모델을 나타낸다.
도 6 은 확인된 혈청반응성 펩티드에 상응하는 SEA/E - 18 의 영역을 나타낸다.
도 7 은 스트렙타비딘(streptavidin) PVT 비드 상의 바이오틴 접합된 항 - 마우스F(ab)2 의 C215FabSEA, C215FabSEA/E - 18, -65, -97, -109, -110, -113 또는 -120 에 결합하는 125I 인체 항 - SEA 의 특이적인 결합을 측정한 신틸레이션 근접 검정(SPA : Scintillation Proximity Assay)을 나타낸 것이다.
도 8A 및 도 8B 는 세포독성에 특이적인 종양을 조정하는 능력을 나타낸 것이다. 도 8A 는 초항원 항체 의존 세포성 세포독성(SADCC : superantigen antibody dependent cellular cytotoxicity) 검정으로 측정한 세 포독성을 나타낸다. 도 8B 는 초항원 의존 세포성 세포독성(SDCC : superantigen dependent cellular cytotoxicity) 검정으로 측정되는 부작용을 야기시킬 수 있는 전신성 세포독성을 일으키는 MHC 제 Ⅱ 급 발현 세포의 T 세포 사멸을 조정하는 초항원의 효능을 나타낸 것이다. 모든 신규한 키메라는 SDCC 에서 적어도 1log 및 3log 정도의 값을 가지며, C215FabSEA/E - 120 에 비해 효과가 낮아졌다.
도 9 는 SEA/E - 120 모델의 리본 다이아그램을 나타낸다. 잔기 G20, T21, G24 및 K27 의 곁사슬은 진한 회색이고, 잔기 S34, S39, S40, E41, K42, A44, T49, T74, A75, S78, E79, E81, S83 및 S84 의 곁사슬은 회색이며 잔기 T217, S220, T222, S223 및 S225 의 곁사슬은 검은색 및 잔기 S227 의 곁사슬은 밝은 회색으로 나타내었다.
도 10 은 마우스 5T4 항체의 가변 부분 및 마우스 C242 항체의 불변 부분을 갖는 5T4FabSEA/E - 120(SEQ ID NO : 1)의 아미노산 서열을 나타낸다. 위치 1 - 458 은 A 쇄이며 위치 459 - 672 는 B 쇄이다.
다양한 실시형태 및 변형이 본 발명의 범위 및 의도를 벗어나지 않는 범위 내에서 가능함은 본 분야의 숙련자들에게 자명하다.
본원의 명세서에 기재되어 있는 바와 같은 "a" 또는 "an" 은 하나 또는 그 이상을 의미한다. 본원의 청구의 범위에 기재되어 있는 바와 같이, "포함하는" 이란 단어와 연관되어 사용되는 경우 단어 "a" 또는 "an" 은 하나 또는 하나보다 많음을 의미한다. 본원에 사용되는 "다른" 이란 단어는 적어도 둘 또는 그 이상을 의미한다.
본원에 사용되는 "항체" 란 용어는 면역글로불린 분자를 의미하며, 이는 특히 항원에 대한 특정 에피토프에 결합할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 와 같은 모든 면역 결합제에 대해 광범위하게 사용되는 경향이 있다. 항체는 천연원 또는 재조합된 원으로부터 유도된 본래의 면역글로불린일 수 있으며 본래의 면역글로불린의 면역활성 부분일 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 단쇄 항체 및 인체화된 항체 뿐만 아니라 다클론항체, 단클론항체, Fv, Fab 및 F(ab)2 를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow 등의 1988 ; Bird 등의 1988 참조).
본원에 사용되는 "항원" 이란 용어는 면역 반응을 일으키는 분자를 의미한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 특이적인 면역 - 경쟁 세포의 활성 또는 이들 둘 다를 포함할 것이다. 항원은 유기체, 단백질/항원의 아단위, 사멸되거나 불활성화된 전세포 또는 세포 용해물로부터 유도될 수 있다. 따라서, 숙련자들은 실질적으로 모든 단백질을 포함하는 모든 분자가 항원으로 작용할 수 있음을 인지한다. 또한, 항원은 재조합 DNA 에서 유도될 수 있다.
본원에 사용되는 "암" 이란 용어는 증식성 질환 또는 악성 종양(종양)을 의미한다. 예로는 유방암, 전립선암, 난소암, 경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암 및 폐암이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 "접합체" 란 용어는 항체 또는 항체의 단편에 융합되거나 접합되는 초항원의 융합 단백질 또는 초항원의 변이체를 의미한다.
본원에 사용되는 "면역원성의" 또는 "면역원성" 이란 용어는 면역 반응을 유발하는 기질 또는 분자를 의미한다.
본원에 사용되는 "주요 조직적합성 복합체" 또는 "MHC" 란 용어는 조직적합성을 결정하는 가장 중요한 인자 중 항원제시와 관련된 진화적으로 관련된 세포 표면 단백질을 코드하는 다수의 특이적인 유전자 집합을 의미한다. 제 Ⅰ 급 MHC 또는 MHC - Ⅰ 은 주로 CD8 T 림프구에 대한 항원제시에 작용한다. 제 Ⅱ 급 MHC 또는 MHC - Ⅱ 는 주로 CD4 T 림프구에 대한 항원제시에 작용한다.
본원에 사용되는 "혈청반응의", "혈청반응" 또는 "혈청반응성" 이란 용어는 혈청(류)의 결과로서 발생하는 반응 또는 작용을 의미한다. 본 분야의 숙련자들은 환자 또는 동물의 혈청(류)가 다양한 항원이나 분자에 대한 중화 항체 또는 전조 항체(preformed antibodies) 또는 내재성 항체를 포함함을 인지한다. 따라서, 혈청반응성은 혈청 내의 중화 항체 반응에 관한 것이다.
본원에 사용되는 "초항원" 이란 용어는 MHC 제 Ⅱ 급 분자 및 T - 세포 수용체의 Vβ 도메인에 결합하고 특정의 Vβ V 유전자 절편을 발현하는 T - 세포의 활성을 자극하여 T - 세포의 아형을 자극하는 분자류를 의미한다.
본원에 사용되는 "T - 세포 수용체" 란 용어는 세포막에서 CD3 불변 쇄를 갖는 복합체로 발현되는 고도의 가변 α 또는 β 쇄의 이황화물 - 결합 이형이량체로 이루어진 수용체를 의미한다. 이러한 유형의 수용체를 수반하는 T - 세포는 종종 α : β T - 세포라 불린다. 가변의 γ 및 δ 쇄로 이루어진 대체 수용체는 T - 세포의 아형 상에 CD3 를 발현시킨다.
본원에 사용되는 "치료학적으로 유효한" 이란 용어는 질환 또는 증상을 치료하는데 효과적인 약학적 조성물의 양을 의미한다.
본원에 사용되는 "변이체" 또는 "변이체류" 란 용어는 각각 표준 단백질 또는 펩티드와 상이한 단백질 또는 펩티드를 의미한다. 이러한 의미에서 변이체를 본 명세서의 하기에서 더 자세하게 설명하였다. 예를 들어, 변이체의 핵산 서열의 변이는 잠재적일 수 있다(즉, 핵산 서열에 의해 코드되는 아미노산은 치환되지 않는다). 치환이 이러한 유형의 잠재성 변이로 한정되는 경우에 변이체는 표준 펩티드와 같은 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 코드할 것이다. 변이체 핵산 서열의 변이는 표준 핵산 서열에 의해 코드되는 펩티드의 아미노산 서열을 치환시킬 수 있다. 이러한 핵산 서열은 하기에 논의된 바와 같이 표준 서열로 코드되는 펩티드 내의 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단으로 변이시킬 수 있다. 일반적으로, 아미노산 서열의 차이는 한정되므로 표준의 것과 변이체의 서열은 전반적으로 매우 유사하며 많은 영역에서는 동일하다. 변이체 및 표준 펩티드는 하나 또는 그 이상의 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단 및 이의 조합에 의해 아미노산 서열에 있어 다를 수 있다. 변이체는 또한 말단 또는 내부 절단 등으로 표준 서열보다 짧아지도록 함으로써 표준 펩티드 서열과 상이해진 본 발명의 펩티드 단편일 수 있다. 본 발명의 펩티 드의 다른 변이체는 펩티드와 본질적으로 동일한 기능 또는 활성도를 보유하는 펩티드도 포함한다. 또한 변이체는 (ⅰ) 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 비 - 보존된 아미노산 잔기로 치환되고 이렇게 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드로 코드되거나 코드되지 않는 변이체, 또는 (ⅱ) 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 변이체, 또는 (ⅲ) 성숙한 펩티드가 펩티드(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)의 반감기를 증가시키는 화합물과 같은 다른 화합물과 융합된 변이체, 또는 (ⅳ) 부가적인 아미노산이 리더 서열이나 분비 서열 또는 성숙한 펩티드의 정제에 사용하는 서열과 같은 성숙한 펩티드에 융합되는 변이체일 수 있다. 변이체는 핵산, 아미노산, 세포 또는 유기체에 적용할 수 있는 기술을 포함하는 돌연변이유발 기술로 제조되거나 재조합 수단으로 제조할 수 있다. 상기에 정의한 모든 변이체는 본원의 내용 및 본 분야의 범주에 해당함을 본 분야의 숙련자들은 인지한다.
본원에 사용되는 "생물학적 활성도" 란 용어는 예를 들어, 특정 세포를 활성화하거나 특정 수용체에 결합하는 특이적인 분자의 고유 특징을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같은 정의는 양적인 것 보다는 주로 성질적인 것이다.

Ⅰ. 초항원의 변형
본 발명은 초항원의 혈청반응성이 감소됨으로써 면역원성이 낮아지도록 변형시킨 초항원에 관한 것이다. 본 분야의 숙련자들은 혈청반응성이 혈청 내의 중화 항체를 수반하는 분자 또는 항원의 반응을 의미함을 인지한다. 특히 본 발명은 박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 접합체에 관한 것으로, 초항원은 영역 A 내지 E 를 포함하는 낮은 역가의 초항원이며, 영역 A 는 TCR 결합 부위이고 영역 B 내지 E 는 MHC 제 Ⅱ 급 분자와의 결합을 결정하고, 상기 초항원의 아미노산 서열을 치환시켜서 치환된 초항원이 유도된 초항원에 비해 감소된 혈청반응성을 갖게하기 위해 영역 A 내지 E 에서 15 개의 아미노산 잔기만을 다른 아미노산으로 치환시켰으며, 상기 항체 부분은 전장의 항체이거나 암 - 관련 세포 표면 구조에 대해 특이적인 그밖의 다른 분자에 결합하는 항체의 활성 단편이다.
A. 초항원
본 발명에 사용하기 위해 고려되는 박테리아성 초항원은 포도상구균 엔테로톡신(SE), 화농성 연쇄상구균 외독소(SPE), 황색포도상구균 독성 쇽 - 증후군 독소(TSST - 1), 연쇄상구균 유발성 외독소(SME) 및 연쇄상구균 초항원(SSA)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 분야의 숙련자들은 상기에 기재한 초항원의 3 차 구조를 프로테인 데이터 뱅크(PDB, www.rcsb.org)에서 수득할 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 본 분야의 숙련자들은 상기에 기재한 초항원 및 다른 초항원의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 진뱅크(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch. html)에서 수득할 수 있다.
특정 실시형태에서, 초항원은 낮은 역가 초항원이다. 인체 혈청에는 일반적으로 초항원에 대한 높은 역가의 항체가 포함되어 있음이 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 예를 들어, 연쇄상구균 초항원에 대하여, 상대적인 역가는 TSST - 1>SEB>SEC - 1>SEC2>SEA>SED>SEE 이다. 본 분야의 숙련자들은 상대적인 역가가 면역원성 문제 및 혈청반응성이나 중화 항체를 수반하는 문제를 나타냄을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 비경구로 투여된 초항원의 혈청반응성을 피하기 위해 SEA 또는 SEE 와 같은 낮은 역가 초항원의 사용을 고려한 것이다.
또한, 초항원 또는 포도상구균 엔테로톡신의 면역 교차반응성 및 단백질 서열이 두 개의 관련 그룹으로 나누어짐이 공지되어 있다. 첫 번째 그룹은 SEA, SEE, SED 및 SEH 로 구성되어 있다. 두 번째 그룹은 SPEA, SEC, SEB 및 SSA 이다. 따라서, 본 발명은 또한 포도상구균 엔테로톡신에 대한 내재성 항체 또는 높은 역가 항체에 의한 본 발명의 교차반응성을 감소시키거나 제거하기 위해 낮은 역가 초항원을 사용함을 고려한 것이다.
B. 초항원의 변이체
초항원 단백질의 아미노산 서열 변이체는 치환 변이체, 삽입 변이체 또는 결실 변이체일 수 있다. 이러한 변이체는 침전(예를 들어, 황산암모늄), HPLC, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피(면역친화성 크로마토그래피 포함) 또는 다양한 입도분리(various size separation)(침강, 겔 전기영동, 겔 여과)와 같은 공지되어 있는 방법으로 정제할 수 있다.
치환 변이체 또는 대체 변이체(replacement variant)는 일반적으로 단백질 내의 하나 또는 그 이상의 부위에서 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 포함한다. 치환은 보존적일 수 있다. 즉, 하나의 아미노산이 유사한 모양 및 전하를 갖는 아미노산으로 치환된다. 보존적인 치환은 본 분야에 널리 공지되어 있으며 이는 예를 들어, 다음의 치환을 포함한다 : 알라닌을 세린으로 치환 ; 아르기닌을 리신으로 치환 ; 아스파라긴을 글루타민 또는 히스티딘으로 치환 ; 아스파르트산염을 글루탐산염으로 치환 ; 시스테인을 세린으로 치환 ; 글루타민을 아스파라긴으로 치환 ; 글루탐산염을 아스파르트산염으로 치환 ; 글리신을 프롤린으로 치환 ; 히스티딘을 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환 ; 이소루이신을 루이신 또는 발린으로 치환 ; 루이신을 발린 또는 이소루이신으로 치환 ; 리신을 아르기닌으로 치환 ; 메티오닌을 루이신 또는 이소루이신으로 치환 ; 페닐알라닌을 티로신, 루이신 또는 메티오닌으로 치환 ; 세린을 트레오닌으로 치환 ; 트레오닌을 세린으로 치환 ; 트립토판을 티로신으로 치환 ; 티로신을 트립토판 또는 페닐알라닌으로 치환 ; 및 발린을 이소루이신 또는 루이신으로 치환.
하기에 기재한 바와 같이 단백질의 생물학적 유용성 또는 활성도를 상당히 손실시키지 않으면서 유전자의 DNA 서열을 다양하게 치환시킬 수 있음을 본 발명자들은 고려할 수 있다. T - 세포를 유도하는 활성도는 종양 세포의 세포독성을 일으킨다. 또한, 초항원의 세포독성에 관한 효과가 최소가 되도록 MHC 제 Ⅱ 급 분자에 대한 초항원의 친화성을 감소시켰다.
이러한 치환에 있어서, 아미노산의 수치료 지수가 고려될 것이다. 단백질에 관한 생물학적 상호작용 기능을 고려한 아미노산 수치료 지수의 중요성은 본 분야에서 일반적으로 이해된다(Kyte 및 Doolittle, 1982 참조). 아미노산의 상대적인 수치료 특징이 최종 단백질의 2 차 구조에 기여함을 이해함에 따라 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 같은 다른 분자와 단백질 간의 상호작용을 정의할 수 있게 되었다.
각각의 아미노산은 소수성 및 전하 특성을 근거로 수치료 지수를 정할 수 있으며(Kyte 및 Doolittle, 1982 참조), 이 지수는 다음과 같다 : 이소루이신(+4.5) ; 발린(+4.2) ; 루이신(+3.8) ; 페닐알라닌(+2.8) ; 시스테인/시스틴(+2.5) ; 메티오닌(+1.9) ; 알라닌(+1.8) ; 글리신(-0.4) ; 트레오닌(-0.7) ; 세린(-0.8) ; 트립토판(-0.9) ; 티로신(-1.3) ; 프롤린(-1.6) ; 히스티딘(-3.2) ; 글루탐산염(-3.5); 글루타민(-3.5) ; 아스파르트산염(-3.5) ; 아스파라긴(-3.5) ; 리신(-3.9) ; 및 아르기닌(-4.5).
특정 아미노산을 유사한 수치료 지수 또는 수치를 갖는 다른 아미노산으로 치환시켜 유사한 생물학적 활성도를 갖는 단백질, 즉 생물학적으로 기능이 등가인 단백질을 수득할 수 있음이 본 분야에 공지되어 있다. 이러한 치환을 위해서는, ±2 이내의 수치료 지수를 갖는 아미노산 치환이 바람직하고, ±1 이내인 것이 특히 바람직하며 ±0.5 이내의 값을 갖는 것이 더욱 더 바람직하다.
유사 아미노산의 치환은 친수성을 근거로 효과적으로 이루어질 수 있음이 본 분야에 또한 공지되어 있다. 본원에 참고문헌으로 인용되고 있는 미국 특허 제 4,554,101 호에는 인접한 아미노산의 친수성에 의해 조절되는 바와 같이, 단백질의 최대 국소평균 친수성이 단백질의 생물학적 특징과 관련되어 있음이 기재되어 있다. 미국 특허 제 4,554,101 호에 상세하게 기재되어 있는 바와 같이, 다음의 친수성 수치는 아미노산 잔기에 대해 정해진 것이다 : 아르기닌(+3.0) ; 리신(+3.0) ; 아스파르트산염(+3.0 ± 1) ; 글루탐산염(+3.0 ± 1) ; 세린(+0.3) ; 아스파라긴(+0.2) ; 글루타민(+0.2) ; 글리신(0) ; 트레오닌(-0.4) ; 프롤린(-0.5 ± 1) ; 알라닌(-0.5) ; 히스티딘(-0.5) ; 시스테인(-1.0) ; 메티오닌(-1.3) ; 발린(-1.5) ; 루이신(-1.8) ; 이소루이신(-1.8) ; 티로신(-2.3) ; 페닐알라닌(-2.5) ; 및 트립토판(-3.4).
아미노산을 유사한 친수성 수치를 갖는 다른 아미노산으로 치환시켜 생물학적 및 면역적으로 등가인 단백질을 수득할 수 있음을 이해하였다. 이러한 치환에 있어서, 친수성 수치가 ±2 이내인 아미노산 치환이 바람직하며, ±1 이내의 값을 갖는 것이 특히 바람직하고 ±0.5 이내인 것이 더욱 더 바람직하다.
C. 융합 단백질
삽입 변이체의 특정화된 종류는 융합 단백질이다. 이러한 분자는 일반적으로 제 2 의 폴리펩티드의 전체 또는 부분에 대하여 N - 말단이나 C - 말단에 연결되는 천연 분자의 전체 또는 실질적인 부분을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은 특정 종양 세포를 표적으로 하는 항체 단편과 같은 면역 활성 도메인의 부가를 포함한다.
또한, 융합 접합부의 절단 부위 또는 인접 부위에서의 봉입은 정제 후 외래성 폴리펩티드의 제거를 촉진할 것이다. 이외의 유용한 융합은 효소 유래 활성 부위와 같은 기능성 도메인, 글리코실화 도메인, 다른 세포내 표적 신호 또는 트랜스멤브레인 영역과의 연결을 포함한다.
D. 도메인 교환
관련된 일련의 변이체들은 다양한 단백질의 상동 영역을 치환하여 생성할 수 있다. 이는 특정 문헌에 "도메인 교환" 으로 공지되어 있다.
도메인 교환은 관련 폴리펩티드를 제외한 다른 것을 사용하는 키메라 분자의 생성을 포함한다. 다양한 SAg 단백질과 비교하여, 본 분야의 숙련자들은 이러한 분자의 기능적인 특이 영역을 예상할 수 있다. SAg 기능에 대한 영역의 임계성을 결정하려는 노력으로 이러한 분자와 관련된 도메인을 교환하는 것이 가능해졌다. 이러한 분자는 키메라가 천연 분자와 구별될 수 있다는 점에서 부가적인 지수를 가질 수 있으며, 동일한 기능을 부여할 수 있다.
E. 단백질 정제
SAg 또는 이의 변이체는 정제하는 것이 바람직하다. 단백질 정제 기술은 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 동일한 수준에서, 이러한 기술은 펩티드 및 비 - 펩티드 분획에 대한 세포내 환경의 생분획을 포함한다. 단백질과 다른 단백질을 비교하여, 부분적 또는 완벽한 정제(또는 균질성에 관한 정제)를 달성하기 위해 크로마토그래피 기술 및 전기영동 기술을 사용하여 관련 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 순수한 단백질을 제조하는데 특히 적합한 분석적 방법에는 이온 - 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피 ; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ; 등전점분획 전기영동이 있다. 펩티드를 정제하는데 특히 효과적인 방법은 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography) 또는 HPLC 이다.
본 발명의 특정 양상은 코드되는 단백질 또는 펩티드의 정제에 관한 것이고, 특정 실시형태는 코드되는 단백질 또는 펩티드의 실질적인 정제에 관한 것이다. 본원에 사용되는 "정제된 단백질 또는 펩티드" 란 용어는 다른 성분과 분리될 수 있는 조성물을 의미하는 것이며, 단백질 또는 펩티드는 자연적으로 수득할 수 있는 상태에 관련된 정도로 정제된다. 따라서, 정제된 단백질 또는 펩티드는 이들이 자연적으로 발생할 수 있는 환경에서 유리된 단백질 또는 펩티드를 의미한다.
일반적으로, "정제된" 은 다양한 다른 성분을 제거하기 위해 분획화한 단백질 또는 펩티드 조성물을 의미하며, 이러한 조성물은 발현된 생물학적 활성도를 실질적으로 보유하고 있다. "실질적으로 정제된" 이란 용어가 사용되는 경우, 이러한 용어는 조성물 내 단백질이 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 95 % 또는 그 이상으로 구성되어 있는 바와 같이, 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성함을 의미한다.
단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량하기 위한 다양한 방법은 본 발명이 속해 있는 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 활성 분획의 특이적인 활성도를 결정하는 방법 또는 SDS/PAGE 분석으로 분획 내 폴리펩티드의 양을 평가하는 방법을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은 분획의 특이적인 활성도를 측정하고 초기 추출물의 특이적인 활성도와 비교한 다음 순도의 정도를 측정하여 "-접힘 정제수(-fold purification number)" 로 평가한다. 활성도의 정도를 나타내는 실질적인 단위는 물론 정제 후 선택한 검정 기술에 기인할 것이며 발현된 단백질 또는 펩티드는 측정할 수 있는 활성도를 나타낸다.

단백질 정제에 적합한 다양한 기술은 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 황산암모늄, PEG, 항체 등으로 침전시키거나 열변성으로 침전시킨 다음 원심분리 ; 이온 교환, 겔 정제, 역상, 수산화인회석 및 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 단계 ; 등전점 전기영동 ; 겔 전기영동 ; 및 이들의 조합과 다른 기술로 처리하는 단계를 포함한다. 일반적으로 본 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 바뀔 수 있으며 특정 단계를 생략할 수도 있으나 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드를 제조하는 방법으로는 적합하다.
폴리펩티드의 이입은 때때로 특이적으로 SDS/PAGE 의 상이한 조건에 의해 변할 수 있음이 공지되어 있다(Capaldi 등의 1977 참조). 전기영동 조건 하에서, 정제되거나 부분적으로 정제된 발현 산물의 명백한 분자량이 다양할 수 있음을 이해할 것이다.
고성능 액체크로마토그래피(HPLC : High Performance Liquid Chromatography)는 초고속 분리로 피크를 특별하게 분석함을 특징으로 한다. 이는 적당한 유속을 유지시키는 아주 미세한 입자 또는 고압으로 수행할 수 있다. 분리는 몇 분 또는 많아야 한 시간 안에 수행할 수 있다. 또한, 공극부피가 베드부피의 매우 작은 분획이 되도록 입자가 작고 조밀해야 하므로 매우 작은 부피의 시료가 필요하다. 또한, 시료가 거의 희석되지 않을 정도로 밴드가 가늘기 때문에 시료의 농도가 짙을 필요는 없다.
겔 크로마토그래피 또는 분자체 크로마토그래피는 분자 크기에 기인하는 분배 크로마토그래피의 특별한 유형이다. 겔 크로마토그래피를 지지하는 이론은 구멍의 크기에 기인하여 이 구멍을 통과할 수 있는 보다 작은 분자에서 보다 큰 분자를 작은 구멍을 포함하는 불활성 기질의 아주 미세한 입자로 제조된 컬럼으로 분리하는 것이다. 입자를 구성하는 물질이 분자에 흡착하지 않는 한, 유속을 결정하는 유일한 요인은 크기이다. 따라서, 형태가 상대적으로 유지되는 한, 분자는 감소된 크기의 컬럼으로 용출시킬 수 있다. 겔 크로마토그래피는 pH, 이온강도, 온도 등과 같은 그밖의 다른 요인에 의해 분리되는 것이 아니므로 상이한 크기의 분자를 분리하는데 탁월하다. 이는 실질적으로 흡착되는 것이 아니고 전개되는 영역이 보다 좁은 것이며 용출 부피는 단순히 분자량과 관계가 있다.
친화성 크로마토그래피는 분리되는 기질 및 이에 결합할 수 있는 분자 간의 특이적인 친화성에 기인한 크로마토그래피 과정이다. 이는 수용체 - 리간드형 상호작용이다. 컬럼 물질은 불용성 매트릭스 에 대하여 결합 상대 중 하나를 공유적으로 연결시켜 합성한다. 그런 다음 컬럼 물질로 용액에서 기질을 특이적으로 흡착시킬 수 있다. 결합이 일어나지 않도록 조건을 변화시켜 용출시킨다(대체 pH, 이온강도, 온도 등).
F. 변이체의 돌연변이유발
본 발명은 MHC 제 Ⅱ 급 분자에 대한 초항원의 친화성의 변형이 초항원의 독성을 감소시킬 수 있음을 고려한 것이다. 따라서, MHC 제 Ⅱ 급 분자에 대한 감소된 친화성은 혈청반응성을 감소시키거나 중화 항체 또는 내재성 항체나 전조 항체와의 반응을 감소시킨다.
특정 실시형태에서, 돌연변이유발은 MHC 제 Ⅱ 급 분자와의 결합을 결정하는 초항원의 영역을 변형시킨다. 돌연변이유발은 다양한 표준의 돌연변이원성 과정에 의해 수행될 것이다. 돌연변이는 유기체의 양 또는 구조를 변화시키는 과정이다. 돌연변이는 단일 유전자의 뉴클레오티드 변형, 유전자 또는 전 염색체의 차단을 포함할 수 있다. 단일 유전자에서의 변형은 DNA 서열 내의 단일 뉴클레오티드 염기의 제거, 부가 또는 치환을 포함하는 점돌연변이의 결과일 수 있거나 또는 다량의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 포함하는 변형의 결과일 수도 있다.
특정의 유용한 돌연변이유발 기술은 단백질 입체구조에서 대규모의 생물학적 동요(perturbation)의 위험을 최소화하면서, 손실된 곁사슬 상호작용의 효과를 결정할 수 있도록 다량의 잔기를 각각 알라닌 아미노산으로 치환하는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이다(Cunningham 등의 1989 참조).
최근 몇 년 동안, 매우 적은 양의 단백질을 사용하여 리간드 결합에 대한 평형상수를 측정하기 위한 기술이 발달해왔다(미국 특허 제 5,221,605 호 및 제 5,238,808 호 참조). 소량의 물질로 기능적 검정을 수행하는 능력은 항체의 포화 돌연변이유발에 대한 생체외 방법론을 고도로 효과적이도록 발달시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명자들은 단백질 돌연변이체의 높은 처리 생산량에 대하여 짝을 이룬 생체외 전사/번역을 PCR 돌연변이유발과 결합시킴으로써 클로닝 단계를 생략하였다. 여기에서, PCR 산물은 돌연변이 단쇄 항체의 생체외 전사/번역에 대하여 주형으로써 직접적으로 사용될 수 있다. 19 개의 모든 아미노산 치환이 이러한 방법으로 생성되고 분석되도록 하는 높은 효과 때문에, 다량의 관련 잔기에 관한 포화 돌연변이유발을 수행하는 것이 가능해졌으며, 이 방법은 생체외 스캐닝 포화 돌연변이유발로서 기재되어 있다(Burks 등의 1997 참조).

돌연변이유발 포화 스캐닝은 생체 외에서 다음을 포함한 많은 양의 구조 - 기능 정보를 획득할 수 있는 빠른 방법을 제공한다 :
(i) 리간드 결합 특이성을 조절하는 잔기의 식별 ;
(ii) 일정 위치에서 활성을 유지하는 아미노산 및 활성을 없애는
아미노산 식별을 기준으로 리간드 결합의 보다 나은 이해 ;
(iii) 활성 부위 또는 단백질 서브도메인의 종합적인 가소성 평가.
(iv) 결합을 증가시키는 아미노산 치환 식별.
구조 - 유도 부위 - 특이적 돌연변이유발은 단백질 - 리간드 상호 작용을 분석하고 처리하기 위한 우세한 수단을 대표한다 (Wells, 1996, Braisted 등 1996 을 참조). 이 기술은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 교환 서열을 선택된 DNA 내로 이입함으로써 변이체 서열을 제조 및 시험할 수 있다.
부위 - 특이적 돌연변이유발은 충분히 많은 비변형 뉴클레오티드 뿐만 아니라 바람직한 돌연변이의 DNA 서열을 코드하는 특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 사용했다. 이러한 방법에 있어서, 프라이머 서열은 횡단 결실 접합점의 양 부위 상에 안정한 듀플렉스를 형성하기 위한 충분한 크기 및 복합성을 갖추고 있다. 약 17 내지 25 개의 뉴클레오티드 길이의 프라이머는 교환된 서열 접합점의 양 부위에 약 5 내지 10 개의 잔기를 갖는것이 바람직하다.
일반적으로, 본 기술은 단일 - 가닥 및 이중 - 가닥 둘 다의 형태로 존재하는 박테리오파아지 벡터를 사용했다. 부위 - 특이적 돌연변이 유발에 유용한 벡터로는 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이러한 파아지 벡터는 상업적으로 이용가능하며 이들의 용도는 일반적으로 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 이중 - 가닥 플라스미드 또한 파아지에서 플라스미드로 흥미 유전자를 운반하는 과정을 배제하는 부위 - 특이적 돌연변이에 일상적으로 사용된다.
일반적으로, 우선 단일 - 가닥 벡터를 수득하거나 또는 이중 - 가닥 벡터의 2 개의 가닥을 용융하는데, 이것의 서열 내에는 요구되는 단백질 또는 유전적 요소를 코드하는 DNA 서열을 포함한다. 합성적으로 제조된, 바람직하게 돌연변이된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 혼성화 조건을 선택한 경우에는 단일 - 가닥 DNA 제제와 어닐링한 후 부적정 정도를 고려한다. 돌연변이 - 함유 가닥의 합성을 완성하기 위해 이 혼성화 산물을 E. coli 중합효소 I(클레노우 단편)과 같은 DNA 를 중합하는 효소로 처리했다. 따라서, 헤테로듀플렉스가 형성되는데, 여기서 첫번째 가닥은 돌연변이 되지 않은 기존의 서열을 코드하며 두번째 가닥은 바람직한 돌연변이를 포함한다. 이 헤테로듀플렉 스 벡터를 E. coli 세포와 같은 적절한 숙주 세포로 운반하는데 사용한 후, 클론을 돌연변이된 서열 배열을 포함하는 재조합 벡터 중에서 선택했다.
모두 19 개의 아미노산 치환을 시험한 곳에서, 포화 돌연변이유발로 인한 일정 단백질 잔기의 기능상 중요성 및 정보량에 대한 포괄적인 정보를 최상으로 수득할 수 있다. 이러한 접근은 다잔기 포화 돌연변이유발 로지스틱(logistic)이 주춤해지는 단점이 있다(Warren 등 1996, Brown 등 1996 ; Zeng 등 1996 ; Burton 및 Barbas 1994 ; Yelton 등 1995 ; Jackson 등 1995 ; Short 등 1995, Wong 등 1996 ; Hilton 등 1996 을 참조). 수백, 심지어 수천의 부위 특이적 돌연변이의 가능성이 연구되어 왔다. 그러나, 돌연변이의 생산 및 빠른 스크리닝이 향상된 기술로 인해 좀 더 간단하게 되었다. 또한 "워크 - 스루우(Walk - through)" 돌연변이유발에 대한 설명은 미국 특허 제 5 798 208 호 및 제 5 830 650 호를 참조하라.
부위 - 특이적 돌연변이유발의 다른 방법들은 미국 특허 제 5 220 007 호, 제 5 284 760 호, 제 5 354 670 호, 제 5 366 878 호, 제 5 389 514 호, 제 5 635 377 호 및 제 5 789 166 호에 나타나 있다.
상기 기술된 돌연변이유발 기술을 사용하여 생산한 생물 기능성 등가물에 더하여, 본 발명자는 또한 본 발명의 초항원 또는 접합체의 중요 부분을 모사하기 위해 구조적으로 유사한 화합물을 제형화할 것이다. 펩티드 유사체로 명명된 이런 화합물은 본 발명의 접합제로서 동일한 방법으로 사용될 것이며, 그러므로 또한 이는 기능성 등가물이다.
단백질의 2차 구조 및 3 차 구조의 요소를 모사한 특정 유사체는 Johnson 등에서 (1993) 기술하고 있다. 펩티드 유사체를 사용하는 가장 근본적인 이유는 단백질의 펩티드 골격이 주로 항체 및/또는 항원과 같이 분자의 상호작용을 촉진하는 방법으로 아미노산 곁사슬을 향하도록 하기 위해 존재한다는 것이다. 그러므로, 펩티드 유사체를 천연 분자와 유사한 분자와 상호작용 하도록 설계하였다.
펩티드 유사체 개념의 일부 성공적인 응용은 단백질 내의 β- 회전 유사체에 중점을 두고 있으며, 이는 고도의 항원성으로 공지되어 있다. 본원에 기술된 것처럼 폴리펩티드 내부의 적당한 β- 회전 구조를 컴퓨터 - 기저 알고리즘으로 예견할 수 있다. 일단 회전의 아미노산 성분이 결정되면, 유사체를 아미노산 곁사슬의 필수 요소의 유사 공간 배향을 달성하도록 구성할 수 있다.
다른 접근들은 거대 단백질의 결합 부위를 모사한 생물학적으로 활성 입체구조를 발생하는 유인 구조 주형으로서의 다이황화물 - 함유 단백질을 소규모로 사용하는데 중점을 두었다. Vita 등을 (1998) 참조하라. 진화적으로 특정 독성에서 보존되는 것으로 보이는 구조 모티프는 작고(30 - 40 개의 아미노산) 안정하며 돌연변이에 대해 매우 관대하다. 이 모티프는 중심 내부에 3 개의 이황화물로 연결된 β- 시트 및 α- 헬릭스로 구성되어 있다.
β Ⅱ 회전을 고리형 L - 펜타펩티드 및 D - 아미노산과 함께 사용하여 성공적으로 모사해왔다(Weisshoff 등을 1999 참조). 또한 Johannesson 등에서는 (1999) 역회전에 의해 특성을 유도하는 두 고리 트리펩티드를 보고하고 있다.
특이적 구조를 발생하는 방법이 본 분야에 밝혀져 있다. 예를 들어, α- 헬릭스 유사체는 미국 특허 제 5 446 128 호 ; 제 5 710 245 호 ; 제 5 840 833 호 ; 및 제 5 859 184 호에 공지되어 있다. 이러한 구조는 펩티드 또는 단백질을 열에 좀 더 안정하게 하며, 또한 단백질 분해에 대한 저항성을 증가시킨다. 6, 7, 11, 12, 13 및 14 개의 부분으로 갈라진 환 구조를 밝혀냈다.
입체구조로 제한된 β- 회전 및 β- 벌즈(bulges)를 발생하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제 5 440 013 호 ; 제 5 618 914 호 ; 및 제 5 670 155 호에 공지되어 있다. β- 회전은 골격의 입체구조에 상응하는 변화 없이 곁 치환기를 변화시킬 수 있으며, 표준 합성 과정으로 적절한 말단을 펩티드 내로 혼합할 수 있다. 다른 종류의 유사체 회전으로는 역 - 회전 및 γ- 회전을 포함한다. 역 - 회전 유사체는 미국 특허 제 5 475 085 호 및 제 5 929 237 호에 나타나 있으며, γ- 회전 유사체는 미국 특허 제 5 672 681 호 및 제 5 674 976 호에 나타나 있다.
G. 초항원 발현
본 발명은 또한 발현 벡터 및 숙주 세포의 용도를 포함한다. 유전적으로 접합체의 핵산 서열을 함유하도록 설계하여 왔던 이러한 발현 벡터는 본 발명의 접합체를 생산하기 위해 숙주 세포 내로 도입되거나 또는 형질전환된다.
본 발명의 핵산 서열의 통합 및 펩티드 발현을 위해 숙주 세포를 유전적으로 설계할 수 있다. 숙주 세포 내로 핵산 서열을 도입하기 위해서 인산 칼슘 트란스펙션, DEAE - 텍스트란 매개 트란스펙션, 트란스벡션(transvection), 현미주사, 양이온성 지질 - 매개 트란스펙션, 일렉트로포레이션, 형질도입, 스크래프 부하(scrape loading), 충격도입, 감염 또 는 다른 방법들을 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 Davis 등의 BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) 및 Sambrook 등의 MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)와 같은 많은 표준 실험 지침서에서 기술하고 있다.
적절한 숙주 세포의 대표적인 예로는 스트렙토코커시, 포도상구균, E. coli, 스트렙토마이세스 및 고초균 세포와 같은 박테리아성 세포 ; 효모 세포 및 아스퍼질루스 세포와 같은 진균 세포 ; 초파리 S2 세포 및 밤나방(spodpotera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포 ; CHO, COS, HeLa, Cl27, 3T3, BHK, 293 및 보우 멜라노마 세포와 같은 동물 세포를 포함한다.
Ⅱ. 암 치료
본 발명에 있어서, 초항원을 표적 세포 및 파괴할 암 세포에 대한 항체 또는 항체의 단편에 접합하였다. 암의 예로는 폐암, 유방암, 대장암, 신장암, 췌장암, 난소암, 위암, 자궁경부암 및 전립선암을 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 양상에 있어서, 종양 세포는 표적화할 수 있는, 즉, 대부분의 다른 세포에는 존재하지 않는 일부 마커를 갖고 있어야 한다. 많은 종양 마커들이 존재하며 이들 중 일부는 본 발명의 환경에서 표적화하기에 적합할 것이다. 본 발명의 특이적 표적으로 항체를 포함한다. 본 발명에서 기대할 수 있는 항체로 Fab 단편을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. Fab 단편의 예로는 C215Fab 또는 5T4Fab 를 포함한다. Fab 에 더하여 다른 보통의 종양 마커로는 암태아성 항원, 전립선 특이적 항원, 뇨로 종양 관련 항원, 태아성 항원, 티로신아제 (p97), gp68, TAG - 72, HMFG, 시알릴 루이스(Sialyl Lewis) 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155 를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은, 면역 자극 분자를 제제로서 사용하거나 또는 예를 들어 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 종양 괴사 인자와 같은 시토킨 ; α- 인터페론, β- 인터페론, γ- 인터페론 ; F42K 및 다른 시토킨 유사체 ; 예를 들어 MIP-1, MIP-1β, MCP-1, RANTES, IL-8 와 같은 케모카인 ; 또는 예를 들어 FLT 3 리간드와 같은 성장 인자와 같은 또 다른 제제와 접합하여 사용하는 것이 좀 더 바람직하다. 자극 분자를 본 발명의 접합체에 접합하거나 또는 본 발명의 접합체와 함께 보조제로서 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용될 것으로 기대되는 특정 시토킨은 IL2 이거나 또는 본질적으로 천연 IL2 와 동일한 생물학적 활성을 갖는 유도체이다. 최초에 T-세포 성장 인자 I 으로 설계된 인터루킨 - 2 (IL-2 : Interleukin-2) 는 매우 능숙한 T-세포 증식 유도자이며 T-림프구의 모든 부집단에 대한 성장 인자이다. IL-2 는 휴지세포에서 세포주기 진행을 유도하는 항원 독립 증식인자이므로 활성화 T- 림프구의 클론을 확대할 수 있다. 새로 분리된 백혈병 세포 또한 IL2 를 분비하며 그것에 반응하기 때문에 IL2 는 ATL 을 악화시킬 수 있는 세포에 대해 자기분비 성장 조절자로서 작용할 것이다. IL2 는 또한 비록 부가적인 인자 예를 들어, IL4 의 존재를 요구할 지라도 활성화 β- 세포의 증식을 촉진시킨다. 생체 외에서, IL-2 는 또한 올리고덴드로글리아 세포의 성장을 자극한다. T-세포 및 B-세포 상의 이것의 효과로 인해 IL2 는 면역 반응의 중추 조절자이다. 이것은 또한 항 - 염증 반응, 조혈 및 종양 감시기구역할도 수행한다. IL-2 는 말초 백혈구에서 IFN-γ 합성을 자극하며 또한 IL-1, TNF-α 및 TNF-β의 분비를 유도한다. LAK 세포의 팽창시의 활성과는 별개로 종양파괴성 시토킨의 분비를 유도하는 것은, (림포카인 활성화 살해 세포) IL2 의 항종양 활성을 일으키는 주요 인자일 것이다.

본 발명은 암 또는 증식성 질환으로 고통받는 환자에게 투여할 수 있을 것으로 기대된다. 환자에게 투여된 양은 치료학적 유효량이거나 또는 암 또는 질환을 치료할 수 있는 양이다. 접합체를 비경구적 경로 또는 소화 경로를 통해 투여할 것이다. 소화 경로의 예로는 경구, 직장, 혀밑샘 및 구강을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 비경구적 경로의 예로는 복강내, 정맥내, 피하, 근육내, 피내, 종양내 및 혈관내를 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
Ⅲ. 약학적 조성물
본 발명의 화합물을 단독으로 투여하거나 또는 치료학적 화합물과 같은 다른 화합물과 결합하여 투여할 수 있다.
주사가능한 용도로 적합한 약학적 형태는 멸균한 수용액 및/또는 분산체 ; 참깨유, 땅콩유 및/또는 수성 프로필렌 글리콜 ; 및/또는 주사가능한 멸균 용액 및/또는 분산체의 일시적인 제조를 위한 멸균분말을 함유하는 제형을 포함한다. 모든 경우의 약학적 형태는 멸균되어야 하며 및/또는 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 이것은 제조 및/또는 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 및/또는 박테리아 및/또는 곰팡이와 같은 미생물의 오염에 대비하여 제조되어야 한다.
유리 염기 및/또는 약리학적으로 수용가능한 염으로서의 활성 화합물 용액을 히드로옥시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조할 수 있다. 분산체 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이의 혼합물 및/또는 유(oil)에서 제조할 수 있다. 보통의 저장 및/또는 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 막기위해 방부제를 포함한다.
본 발명의 접합체를 중성 및/또는 염 형태의 조성물로 제형화 할 수 있다. 약학적으로 수용가능한 염으로 다음을 포함한다 : 산 첨가 염(단백질의 유리 아미노기로 형성됨) 및/또는 예를 들어 염화수소산 및/또는 인산과 같은 무기산 및/또는 아세틱, 옥살릭, 타르타릭, 만델릭, 및/또는 이와 같은 유기산. 또한 유리 카르복실기로 형성된 염을 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 및/또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 및/또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 및/또는 이와 같은 유기 염기로 부터 유도할 수 있다. 유효 성분으로서 사용한 펩티드 치료제에 관해서는, 참고 문헌으로 본 발명에 반영된 각각의 미국 특허 제 4 608 251 호 ; 제 4 601 903 호 ; 제 4 599 231 호 ; 제 4 599 230 호 ; 제 4 596 792 호 및/또는 제 4 578 770 호에 기재된 기술을 사용할 것이다.
담체 또한 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및/또는 액상 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 유사체)를 포함한 용매 및/또는 분사매, 이의 적절한 혼합물 및/또는 식물성유일 수 있다. 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 것으로 코팅하여 사용함으로써, 분산할 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써 및/또는 계면활성제를 사용함으로써 적절히 지속될 수 있다. 미생물의 활동을 다양한 항균제 및/또는 항진균제 예를 들어 파라벤스(parabens), 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 및 또는 유사체로 막을 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장제로 예를 들어 당 및/또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사 가능한 조성물의 흡수는 흡수를 지연하는 조성물 제제 예를 들어 모노스테아르산 알루미늄 및/또는 젤라틴을 사용함으로써 연장될 수 있다.
주사 가능한 멸균 용액은 적절한 용매내 요구량의 활성 화합물을 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 통합함으로써 제조된 다음 요구되는 것처럼 멸균 여과된다. 일반적으로, 염기성 분산매 및/또는 상기 열거된 것 중 다른 필수 성분을 포함하는 멸균 부형제 내로 멸균된 다양한 활성 성분들을 통합함으로써 분산체를 제조했다. 주사 가능한 멸균 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에 있어서, 바람직한 제조 방법으로는 유효 성분 분말에 더하여 부가적으로 이미 멸균 - 여과된 용액 으로부터 바람직한 성분을 수득할 수 있는 진공 - 건조 기술 및/또는 냉각 - 건조 기술이 있다. 직접 주사하기 위해서, 용액은 또한 좀 더 및/또는 고도로 농축하여 제조될 것으로 기대되고, 여기서 용매로서 DMSO 의 사용은 매우 빠른 침입을 야기할 것으로 기대되며, 활성제의 고 농축물을 소구역으로 운반할 것으로 기대된다.
제형에 따른 용액을 투여 제형과 적합한 방식으로 투여하거나 및/또는 치료학적 유효량으로 투여할 것이다. 제형을 상기 기술된 주사 가능한 용액 형태와 같은 다양한 투여 형태로 쉽게 투여할 수 있으며, 약물 방출 캡슐 및/또는 유사체도 또한 사용할 수 있다.
수용액 상태로 비경구 투여하기 위해서, 예를 들어 용액을 적당하게 완충 처리하였으며, 만약 필요하다면 및/또는 액상 희석액을 우선 충분한 염류 및/또는 글루코오스로 등장처리 하였다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및/또는 복막내로 투여하기에 적합하다. 이런 관계에 있어서, 이용할 수 있는 멸균 수성 배지는 본 명세서의 견지에서 본 분야의 숙련자들에게 공지될 것이다. 예를 들어, 한번 투여량을 1ml 의 등장 Nacl 용액에 용해할 수 있으며, 및/또는 1000 ml 의 대량피하주사액에 첨가 및/또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15 th Edition, Pages 1035 - 1038 및/또는 1570 - 1580 참조). 일부 투여량은 처리된 피실험자의 증상에 따라 필연적으로 변화한다. 경우에 따라, 투여할 능력이 있는 개인이 각각의 피실험자에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다.
활성 접합체 및/또는 활성제를 투여량당 약 0.0001 내지 1.0 mg 및/또는 약 0.001 내지 0.1 mg, 및/또는 약 0.1 내지 1.0 및/또는 심지어 약 10 mg 을 포함하도록 치료학적 혼합물 내에서 제형화할 수 있다. 또한 다양한 투여량으로 투여할 수 있다.
화합물을 정맥내, 관절내 및/또는 근육내 주사와 같은 비경구 투여를 위해 제형화한 것에 더하여, 약학적으로 수용 가능한 다른 형태로는 예를 들어 경구 투여를 위한 정제 및/또는 다른 고체 ; 리포솜 제형 ; 시간 방출 캡슐 ; 및/또는 크렘(cremes)을 포함한 일반적으로 사용되는 다른 형태을 포함한다.
본 발명에서는 비(鼻)용액 및/또는 분무제, 에어로졸 및/또는 흡입제를 사용할 것이다. 일반적으로 비용액은 적제 및/또는 분사시 비(鼻)경로로 투여되도록 설계된 수용액이다. 많은 관점에서 비(鼻)분비와 유사하도록 비용액을 제조하였으며 그러므로, 정상적인 섬모 활동을 유지한다. 따라서, 수성 비용액은 일반적으로 등장이며 및/또는 pH 를 5.5 내지 6.5 로 유지하기 위해 경미하게 완충처리했다. 부가적으로, 요구된다면 안약 제제에 사용되는 것과 유사한 항균성의 방부제 및/또는 적절한 약물 안정제가 제형 내에 포함될 것이다. 다양한 상업적 비(鼻)제제가 공지되어 있고/있거나 예를 들어 항생제 및/또는 항히스타민을 포함하고/하거나 천식 예방에 사용된다.
다른 방식으로 투여하기에 적합한 첨가 제형으로는 질좌약 및/또는 페사리(pessaries)를 포함한다. 또한 직장 페사리 및/또는 좌약을 사용할 것이다. 좌약은 다양한 무게 및/또는 모양을 갖는 고체형의 약제학적 제형이며 일반적으로 직장, 질 및/또는 요도 내로 삽입된다. 삽입 후, 좌약은 강액 내에서 연화되고, 녹고/녹거나 용해된다. 일반적으로, 좌약, 전통적인 결합제 및/또는 담체로는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 및/또는 트리글리세라이드를 포함하며, 이러한 좌약은 0.5 % 내지 10 %, 바람직하게 1 % - 2 % 의 범위 내의 유효 성분을 포함하는 혼합물로부터 형성될 것이다.
경구 제형으로는 일반적으로 사용되는 부형제 예를 들어, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 및/또는 유사체의 약학적 계통을 포함한다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 필(pill), 캡슐, 서방성 제형 및/또는 분말의 형태로 섭취한다. 바람직한 특정 실시형태에 있어서, 경구 투여용 약학적 조성물은 비활성 희석제 및/또는 동화할 수 있는 식용 담체를 포함할 것이며, 경캡슐 및/또는 연껍질 젤라틴 캡술 내로 넣을 수 있으며, 정제로 압축될 수 있으며, 식품 음식물과 직접 통합될 수 있다. 치료용 경구 투여를 위해서, 활성 화합물을 부형제와 통합할 수 있으며 섭취가능한 정제, 버컬정, 윤대(troches), 캡슐, 엘릭시스, 현탁액, 시럽, 카세제(wafers) 및/또는 유사체의 형태로 사용할 것이다. 이러한 조성물 및 제제는 0.1 % 또는 그 이상의 활성 화합물을 포함한다. 물론 조성물 및/또는 제제의 백분율은 다양하며 통상적으로 단위 무게의 약 2 내지 약 75 % 이고/이거나 25 - 60 % 사이가 바람직하다. 치료학적으로 유용한 조성물의 활성 화합물량은 적절한 투여량으로 수득될 수 있는 양이다.
정제, 윤대, 필, 캡슐 및/또는 그 유사체 또한 다음을 포함할 것이다 : 트라가칸드고무, 아카시아속, 옥수수녹말 및/또는 젤라틴과 같은 결합제 ; 인산제2칼슘과 같은 부형제 ; 옥수수녹말, 감자녹말, 알긴산 및/또는 유사체와 같은 붕괴제 ; 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제 ; 및/또는 수크로스, 락토스 및/또는 사카린과 같은 감미제를 첨가 및/또는 페퍼민트, 윈터그린유와 같은 향미료 및/또는 체리향미료. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 형태의 물질에 더하여 액상 담체를 포함할 수 있다. 다른 다양한 물질들은 코팅된 형태로 존재하고/하거나 그렇지 않으면 투여 단위의 물리적 형태를 변형시킬 것이다. 예를 들어, 정제, 필 및/또는 캡슐을 셀락(shellac), 당 및/또는 둘 다로 코팅할 것이다. 엘릭시스 시럽으로는 활성 화합물인 감미제로서 수크로스, 방부제로서 메틸 및/또는 프로필파라벤, 염료 및/또는, 체리향 및/또는 오렌지향과 같은 향미료를 포함할 것이다.
특정 실시형태에 있어서, 지질 제형 및/또는 나노캡슐은 접합체 또는 제제, 및/또는 야생형 및/또는 안티센스 벡터를 포함하는 유전자 요법 벡터를 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용될 것으로 기대된다.
일반적으로, 나노캡슐은 화합물을 안정된 방법 및/또는 재생 방법으로 유도할 수 있다. 세포 내 중합 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해서, 이러한 초미립자(크기가 0.1㎛ 둘레)를 생체 내에서 퇴화될 수 있는 중합체를 사용하여 설계하였다. 이러한 요구에 맞추어 생분해 가능한 시아노아크릴산 폴리알킬 나노입자가 본 발명에 사용될 것으로 기대되며, 및/또는 이러한 입자는 쉽게 만들어질 수 있다.

본 발명의 실시형태에 있어서, 접합체는 지질과 관련되어 있다. 지질 관련 접합체를 리포솜의 수성 내부에서 캡슐화하였으며, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재시켰으며, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 관련된 결합 분자를 통해 리포솜에 부착하였으며, 리포솜 내에서 유도하였으며, 리포솜과 복합체를 형성하도록 하였으며, 지질을 포함한 용액에서 산재시켰으며, 지질과 혼합하였으며, 지질과 결합하였으며, 지질 내 현탁액으로서 포함시켰으며, 미셀을 포함하거나 또는 미셀과 복합체를 형성하거나 또는 다른 방법으로 지질과 관련시켰다. 본 발명의 지질 또는 지질/접합체 관련 조성물을 용액에서 어떤 특정 구조로 제한하지 않는다. 예를 들어, 이들은 미셀처럼 이중층 구조로 존재하거나 또는 붕괴된 구조와 함께 존재한다. 이들은 또한 용액 내에서 간단하게 살포되며, 크기 또는 모양에 있어서 균일하지 않은 집합체 형성이 가능하다.
지질은 자연적으로 발생하는 지방 물질 이거나 또는 합성 지질이다. 예를 들어, 지질은 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지된 장쇄 지방족 탄화수소 및 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드와 같은 이들의 유도체를 포함하는 화합물 뿐만 아니라 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 비말을 포함한다.

인지질을 본 발명에 따른 리포솜을 제조하기 위해 사용할 것이며, 양성 실효전하, 음성 실효전하 또는 중성 실효전하를 운반할 것이다. 리포솜 상에 음성 전하를 부여하기 위해서 인산 디아세틸을 사용할 수 있으며, 리포솜 상에 양성 전하를 부여하기 위해서는 스테아릴아민을 사용할 수 있다. 리포솜을 하나 또는 그 이상의 인지질로 만들 수 있다.
중성 전하를 띤 지질은 전하가 없는 지질, 실질적으로 비전하 지질 또는 양성 전하 및 음성 전하의 수가 동등한 지질 혼합물을 포함할 수 있다. 적절한 인지질로는 포스파티딜 콜린 및 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지된 다른 것들을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 지질을 상업적 원천으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜콜린 디미리스틸(DMPC : dimyristyl phosphatidylcholine)을 시그마 케미칼 코포레이션으로 부터, 인산 디세틸(DCP : dicetyl phosphate)을 케이 앤 케이 라보라토리즈(뉴욕 플레인뷰에 소재함)로 부터 ; 콜레스테롤(Chol : cholesterol)을 칼비오켐베흐링으로 부터 획득 ; 포스파티딜글리세롤 디미리스틸(DMPG) 및 다른 지질을 아반티 폴랄 리피드 인코포레이티드(앨라배마 버밍엄에 소재함)로 부터 획득하였다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올의 지질 원액을 약 -20 ℃ 에서 저장할 수 있다. 클로로포름은 메탄올 보다 좀 더 쉽게 증발되므로 용매로서만 사용하는 것이 바람직하다.
리포솜 결과물의 불안정성 및 누실(leakiness)로 인해 난(egg) 또는 콩의 포스파티딜콜린, 뇌 인지질산, 뇌 또는 식물의 포스파티딜이노시톨, 심장 칼디올핀 및 식물 또는 박테리아성 포스파티딜에탄올아민을 전체 인지질 조성물의 50 % 또는 그 이상을 구성하는 예비 인지질로 사용하는 것은 바람직하지 않다.
인지질은 물에서 분산시킬 경우, 물에 대한 지질의 몰비에 따라 리포솜 보다는 다른 다양한 구조를 형성할 수 있다. 저비율에서 리포솜은 바람직한 구조를 갖는다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및/또는 이가 양이온의 존재에 달려있다. 리포솜은 이온 및/또는 극성 물질에 대해서는 낮은 투과성을 보이나, 상승된 온도에서는 이들의 투과성을 현저하게 바꾸는 상전이를 겪는다. 상전이는 겔 상태로 공지된 빽빽하게 집괴된, 정서 구조를 유체 상태로 공지된 느슨하게 집괴된, 덜 - 정서된 구조로의 변화를 포함한다. 이는 특성 상전이 온도에서 발생하며 및/또는, 이온, 당 및/또는 약물에 대한 투과성을 증가시킨다.
리포솜은 4 개의 다른 메카니즘을 통해 세포와 상호 작용한다 :
· 대식세포 및/또는 호중구와 같은 세망내피계 식세포에 의한 엔
도사이토시스 ;
· 비특이적 약소수성 및/또는 정전기력에 의해서 및/또는 세포 - 표
면 성분과의 특이적 상호작용에 의한 세포 표면에 흡수 ;
· 세포질 내로 리포솜 함유물의 동시 방출에 의한 형질막 내로
지질 이중충 리포솜의 삽입에 의한 형질세포막과의 융합 ; 및/또는
· 리포솜 함량에 관계없이, 리포솜 지질을 세포막 및/또는 세포하막
으로 전달하고/하거나 이와 반대로 세포막 및/또는 세포하막을
리포솜 지질로 전달.
변성 리포솜 제형은 동시에 작동하는 것이 비록 하나가 아니더라도, 메카니즘이 작용하도록 바꿀 수 있다.
생체 외에서, 리포솜 - 매개 올리고뉴클레오티드 방출 및 외래성 DNA 의 발현은 매우 성공적이었다. Wong 등에서는 (1980) 배양된 닭배아, 헤라(HeLa) 및 간암 세포에서 리포솜 - 매개 방출 및 외래성 DNA 의 발현의 가능성을 증명하고 있다. Nicolau 등에서는 (1987) 랫에게 정맥 주사한 후 성공적인 리포솜 - 매개 유전자 전달을 달성했다.

본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 지질은 센다이 바이러스 (HVJ : hemagglutinating virus)와 관련이 있을 것이다. 이는 세포막과의 융합을 손쉽게 하며 리포솜 - 캡슐화 DNA 의 세포 도입을 촉진하는 것으로 밝혀졌 왔다(Kaneda 등을 1989 참조). 다른 실시형태에 있어서, 지질을 비 - 히스톤 핵 염색체 단백질(HMG-1)과 함께 이용하거나 또는 복합체를 형성한다(Kato 등을 1991 참조). 더욱이 실시형태에 있어서, 지질을 HVJ 및 HMG-1 둘 다와 함께 이용하거나 또는 복합체를 형성한다. 이러한 발현에 있어서, 벡터를 생체 외 및 생체 내에서 올리고뉴클레오티드를 전달 및 발현하는데 성공적으로 이용하여 왔으며 이들은 본 발명에 적합하다. 박테리아성 프로모터를 DNA 구조에 사용하는 곳에서 또한 리포솜 내에 적절한 박테리아성 중합효소를 포함하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 리포솜을 다른 방법으로 만들 수 있다. 리포솜 크기는 합성 방법에 따라 다양하다. 수용액에서 현탁된 리포솜은 이중층 지질 분자의 하나 또는 그 이상의 동심층을 갖는 구형 소포 모양이 일반적이다. 각 층은 화학식 XY 로 나타낸 분자의 평형 배열로 이루어져 있는데, 여기서 X 는 친수성 부분이며 Y 는 소수성 부분이다. 수성 현탁액에서, 동심층을 친수성 부분이 수상과 접촉하도록 유지하고 소수성 영역이 자기 회합하기 쉽도록 배열한다. 예 를 들어, 수상이 리포솜 안 및 밖 둘 다에 존재할 경우, 지질 분자는 라멜라로 공지된 배열 XY - YX 의 지질 이중층을 형성할 것이다. 지질 응집체는 하나 이상의 지질 분자의 친수성 및 소수성 부분이 서로 연결 될 경우 형성될 것이다. 이런 응집체의 크기 및 모양은 천연 용매 및 용액 내에 다른 화합물의 존재와 같은 많은 다른 변수에 달려있을 것이다.
본 발명의 범위 내에서, 리포솜을 공지된 실험 기술에 따라 제조할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 리포솜을 예를 들어 유리플라스크, 진주모양플라스크 용기의 용매 내에서 리포솜 지질을 혼합함으로써 제조한다. 용기는 리포솜의 기대 현탁액의 부피 보다 10 배 큰 부피를 갖는다. 회전식 증발기를 사용하여, 약 40 ℃ 의 음성 압력 하에서 용매를 제거한다. 용매를 리포솜의 바람직한 부피에 따라 약 5 분 내지 2 시간 내에 제거하는 것이 일반적이다. 조성물을 진공 상태의 건조기에서 추가로 건조할 수 있다. 건조된 지질은 시간이 지남에 따라 저하되는 경향이 있기 때문에 약 1 주일 후에 폐기하는 것이 일반적이다.
건조된 지질을 모든 지질 필름이 재현탁될 때 까지 진탕함으로써 약 25 - 50 mM 인지질의 멸균되고 발열물질이 없는 물에서 수화시킬 수 있 다. 그 다음 수성 리포솜을 분취량으로 분리시킨 다음 각각을 유리병에 담아 동결 건조하여 진공 하에서 밀봉한다.
선택적으로, 하기의 다른 공지된 실험실 방법에 따라 리포솜을 제조하였다 : 본원에 참고문헌으로 인용된 Bangham 등의 방법(1965) ; 본원에 참고문헌으로 인용된 DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis ed. (1979) pp. 287-341 에 기재된 Gregoriadis 의 방법 ; 및 Szoka 및 Papahadjopoulos(1978)에 의해 기재된 역상 증류법. 상기 언급된 방법들은 수성 물질을 포위하는 각각의 능력 및 각각의 수성 공간 대 지방 비율이 상이하다.
상기 기재된 바와 같이 제조한 건조된 지방 또는 동결건조된 리포솜을 탈수시키고 저해 펩티드의 용액에 재구성시키며 DPBS 와 같은 적당한 용매에 적절한 농도로 희석시킬 수 있다. 그런 다음 혼합물을 보텍스(vortex) 혼합기로 강하게 흔들어 주었다. 비캡슐화 핵산을 29,000 x g 으로 원심분리하여 제거한 후 리포솜 펠렛을 세척하였다. 세척한 리포솜을 예를 들어, 약 50-200 mM 의 적절한 총 인지질 농도에 재현탁하였다. 캡슐화된 핵산의 양을 표준 방법에 따라 검출하였다. 리포솜 제제 내의 캡슐화된 핵산의 양을 검출한 후, 리포솜을 적절한 농도로 희석할 수 있으며 사용 전까지 4 ℃ 에서 보관할 수 있다.
리포솜을 포함하는 약학적 조성물은 물 또는 식염수와 같은 멸균된 약학적으로 용인가능한 담체 또는 희석액을 포함할 것이다.
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 설명하기 위한 것이다. 본 발명을 잘 실행할 수 있도록 발명자에 의해 발견된 대표 기술을 실시예에 나타내었으며 이 기술은 본 분야의 숙련자들에 의해 인지될 것이며 게다가 본 발명의 실행에 적합하도록 구성되었다고 간주될 수 있다. 그러나, 본 분야의 숙련자들은 본 문헌의 견지에서, 특정 실시형태에서 많은 변화를 일으킬 수 있으며 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 같거나 유사한 결과를 얻을 수 있음이 인지되어야 한다.
실시예 1
생체외 돌연변이유발
폴리머라제 사슬 반응법(PCR) 기저 방법을 사용하여 상이한 초항원 변이체를 제조하였다.
간략하게, PCR 산물은 각 말단에 2 개의 유일한 제한 효소 부위를 포함한다. 서브클로닝 방법에서, pUC19(인비트로겐 라이프 테크놀로지스에서 입수)(구명칭 : 영국 미들섹스에 소재하는 깁코 비알엘 라이프 테크놀로지스)를 사용하였으며 QIAprep 스핀 미니프렙 키트 프로토콜(독일 힐덴에 소재하는 퀴아젠에서 입수)에 따라 제조하였다. 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 점돌연변이를 추가 분석을 용이하게 하기 위해 포함하였다. PCR 반응을 태크(Taq) DNA 폴리머라제 및 15 mM MgCl2 를 함유하는 적당한 PCR 완충용액(스위스 바젤에 소재하는 로슈 모리큘라 바이오케미컬스에서 입수)을 수반하는 퍼킨 엘머 진 Amp PCR 시스템 2400 에서 수행하였다. PCR 산물 및 벡터를 적절한 제한 효소로 밤새 절단하였다. 그런 다음 TAE 완충용액(시그마-알드리치에서 입수)에 용해된 0.5 ㎍/㎖ 의 에티디움브로마이드(독일 스테인헤임에 소재하는 시그마-알드리치에서 입수)를 함유하는 1 % 아가로스 겔(인비트로겐 라이프 테크놀로지스에서 입수)(구명칭 : 깁코 비알엘 라이프 테크놀로지스)에 전기영동하여 정제하였다. 단편을 함유하는 DNA 를 겔로부터 잘라내고 CONSERT™ 라피드 겔 추출 시스템(인비트로겐 라이프 테크놀로지스에서 입수)(구명칭 : 깁코 비알엘 라이프 테크놀로지스)을 사용하여 추출하였다. 벡터 및 삽입물을 실온에서 3-4 시간 동안 결합시켰다(로슈 모리큘라 바이오케미컬스에서 입수한 T4 DNA 리가아제). 결합된 혼합물을 세포에 동봉된 지침에 따라 Escherchia coli 균주 DH5α(인비트로겐 라이프 테크놀로지스에서 입수)(구명칭 : 깁코 비알엘 라이프 테크놀로지스) 내로 형질전환시켰다. 양성 클론을 DNA 서열결정을 통해 확인하였다. 올바른 서열을 37 ℃ 에서 밤새 RsrⅡ/HindⅢ 로 절단한 후 발현 벡터에 결합시켰다(Dohlsten 등의 문헌, 1994). Fab 의 가변 부분을 가축 모델에 적합하도록 C215(화이자 인코포레이티드에서 입수, Forsberg 등의 문헌, 1997 에 단백질 서열이 공개되어 있음)에 대해 변화시켰다. 구성물을 최종적으로 Escherchia coli K12 균주 UL635(xyl-7, ara14, T4R, ㅿompT)(스웨덴 웁살라에 소재하는 웁살라 란트브룩스-유니버시테트에서 입수) 내로 전기천공하였다.
실시예 2
인체 항-SEA 결합 영역의 확인
인체 항-SEA 에 의해 인식되는 영역을 치환 D227A 를 수반하는 SEE/A-A 로 이전에 기재된(Antonsson 등의 문헌, 1997), SEA 또는 SEA 와 SEE 의 키메라 변이체인 SEA/E-18 를 펩신-소화시켜 확인하였다.
각각의 초항원을 37 ℃ 에서 60 분 동안 0.5 % 펩신, 10 mM HCl, 150 mM NaCl(w/w)과 함께 항온하였다. 펩티드 혼합물을 pH 8.0 의 2 M 트리스-HCl 로 중성화시키고 고정화된 인체 항-SEA 를 함유한 1 ㎖ 의 HiTrap 컬럼(스웨덴 웁살라에 소재하는 아메삼 파마시아 바이오텍에서 입수)으로 공급하였다. 세척 완충용액으로 PBS, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, pH 7.3 인 2.7 mM KCl 을 사용하였으며 항체 결합 단편을 pH 3.0 인 0.1 M 아세트산을 사용하여 용출시켰다. 질량분석계(mass spectrometer, MS)에 연결된 HPLC 를 사용하여 정제 전후에 단편을 확인하였다(도 1). 40 ℃ 에서 30 분 동안 0.1 % 트리플루오로아세트산에 용해된 10 내지 60 % 아세토니트릴의 직선밀도구배를 이용하여 C18 컬럼(2×250 mm, 미국 캘리포니아 헤스페리아에 소재하는 VYDAC™ 에서 입수) 상에서 크로마토그래피를 실행하였다. 전기분무 MS(미국 캘리포니아 샌어제이에 소재하는 터모퀘스트에서 입수한 핀니간 LCQ)를 사용하여 질량 결정을 실시하였다. 친화성 정제 전후의 동일한 체류 시간에서의 소화로 인해 발견된 단편은 양성으로 간주되었다(도 2).
실시예 3
분자 모델링
키메라 초항원 SEA/E-18 은 SEA 로부터의 N-말단에 근접한 4 개의 아미노산 잔기 및 C-말단 부분 D227A 의 하나의 치환을 제외하고는 SEE 서 열에 기초를 두고있다(도 3 및 도 4, Antonsson 등의 문헌, 1997).
간략하게, PBD 로부터 입수할 수 있는 SEE 에 대해 높은 서열 동일성을 갖는 초항원의 3 차원 구조는 SEAE-18 의 상동성 모델, 즉, SEA(1ESF, Shard 등의 문헌, 1SXT, Sundstrom 등의 문헌, 1996 A), SED(Sundstrom 등의 문헌, 1996 B) 및 SEH(1ENF, Hakansson 등의 문헌, 2000)를 구성하기 위한 주형으로 사용하였다. SEA 는 80 % 의 서열 동일성을 갖는 SEE 와 가장 유사하다. SEE 에 대해 SED 는 60 % 의 서열 동일성을 가지며 SEH 는 50 % 의 서열 동일성을 갖는다.
모델 구성은 INSIGHTII 소프트웨어(미국 산디에고에 소재하는 MSI 에서 입수)의 HOMOLOGY 모듈을 사용하여 수행하였다. 세 초항원 SEA, SED 및 SEH 의 구조를 정렬하였으며 구조적으로 보존된 영역(SCRs)을 검출하였다(도 3). 이러한 영역을 분자내 일반적인 2 차 구조에 대해 일반적으로 맵핑하였다. SEA/E-18 의 천연 서열을 로딩하였으며 SEA 구조로부터 SCRs 에 대하여 늘어놓았다(도 5). SEA 의 1SXT 좌표축은 1ESF 가 사용된 N-말단의 처음 9 개 잔기를 제외하고 사용되었다. SCRs 사이의 영역은 휘어지기 쉬운 루프 구역에서 가장 많이 나타났으며 SEA 및 SED 로부터 구성되었다. 대부분의 루프는 SED 로부터 구성된 잔기 Gln19, Ile140, Asp141, Lys142, Ser189, Gly191, Asp200, Pro206, Asp207 및 Leu224 를 제외하고는 SEA 로부터 구성되었다. SCRs 내의 몇몇 구역은 SED 와 더 큰 서열 유사성을 나타내므로 구조적 주형으로 SED 를 사용하여 구성하였다(Ile37, Glu49, Asn50, Thr51, Leu52, Ser195 및 Thr218, 도 3).
SEA 가 SEA/E-18 의 대부분 잔기의 구조적 주형으로 사용되므로 곁사슬이 겹쳐지는 문제는 발생하지 않았다. SCRs 전후의 스플라이스 지점은 수복되었다. 우선 치환된 곁사슬이 느슨해진 후 HOMOLOGY 의 표준 프로토콜을 사용해 에너지 최소화 및 분자 동력학 시뮬레이션(molecular dynamics simulation)으로 SCRs 내의 모든 곁사슬을 느슨하게 하였다. 루프 구역은 우선 1000 회의 에너지 최소화 단계를 거친 후 1000 회의 분자 동력학 단계를 거쳐 단번에 느슨해졌다. 이러한 개선된 프로토콜을 우선 루프 곁사슬에 적용하였으며 그런 다음 루프의 모든 원자에 적용하였다. 모든 시뮬레이션에서, 100 kcal/Å2 의 힘 상수를 갖는 CVFF 역장(force field)은 2 fs 의 시간계단(time step)을 사용하여 이용하였다.
INSIGHTII 의 PROSTAT 모듈을 사용하여 최종 모델을 불량 영역에 대해 시험하였다. 불량 영역은 발견되지 않았다. 단백질의 내부는 SEA 와 비교했을 때 큰 차이 없이 잘 충진되어 있었다. 모든 잔기는 라마챈드란 플롯(ramachandran plot)의 허용 영역으로 끝났다. Cα 원자를 비교하였을 때 모델에서의 1SXT 의 중복은 0.4 Å 의 RMSD 로 산출되었다. 두 구조 사이의 주요한 차이는 β9-β10 루프(잔기 His187-Thr193)에 보여진다(도 5).
신규한 초항원 변이체의 신규한 모델은 SEA/E-18 모델을 주형으로 사용하여 구성하였다. 특이 아미노산 잔기는 모델에서 직접적으로 변화되었다. 가장 적절한 곁사슬 입체구조는 입체-장애 조사를 사용한 후 짧은 에너지 최소화를 사용하여 선택하였다.
실시예 4
배양 및 정제
IPTG 유도 Lac UV-5 프로모터 및 카나마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드를 사용하여 E. coli K12 균주 UL635 내에서 C215FabSEA/E 키메라를 융합 단백질로서 발현시켰다.
간략하게, 20 % 글리세롤에 용해된 냉동시킨(-70 ℃) 원액으로부터의 박테리아를 리터 당 2.5 g 의 (NH4)2SO4, 3 g 의 KH2PO4, 2 g 의 K2HPO4, 0.5 g 의 시트르산나트륨, 1 g 의 MgSO4H2O, 0.05 g 의 카나마이신, 12 g 의 글루코스 모노히드레이트 및 1 ㎖ 의 미량원소 용액을 함유하지만 Na2MoO4·2H2O 는 함유하지 않는 진탕 플라스크에서 22-24 시간 동안 25 ℃ 에서 항온하였다. Abs620 이 2 내지 3 이 될 때까지 세포를 항온하고 800 ㎖ 의 시작 부피를 갖는 1 리터 발효조(스웨덴에 소재하는 벨라치 바이오테크닉에서 입수)를 항온하기 위해 배양 배지 10 ㎖ 를 사용하였다. 발효조 배지는 상기와 같이 리터 당 2.5 g 의 (NH4)2SO4, 9 g 의 K2HPO4, 6 g 의 K2HPO4, 0.5 g 의 시트르산나트륨, 1 g 의 MgSO4·7H2O, 0.05g 의 카나마이신, 23.1 g 의 글루코스 모노히드레이트 및 1 ㎖ 의 미량원소 용액을 함유한다. 25 % NH3 의 적정으로 pH 를 7 로 유지하였으며 통기는 1 ℓ/분이고 온도는 25 ℃ 이다. 배치 단계 동안에는 400 rpm 으로부터 2000 rpm 까지 교반을 조절하여 용해된 O2 를 30 % 로 유지하였으며 유가 배양 동안에는 먹이인 글루코스(60 % w/v)를 조절하여 용해된 O2 를 30 % 로 유지하였다. 0.1 mM 의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 620 nm 에서의 흡광도가 45 가 되었을 때 산물 형성이 유도되었다. 발효 후에 세포를 정제하기 전에 -20 ℃ 에서 원심분리하여 제거하였다.
정제 과정은 세 단계로 나눠진다. 우선, 12 ㎖/분의 유속을 갖는 연동식 펌프를 사용하여 pH 7.4 인 0.2 M NaCl 에 용해된 0.19 % 폴리에틸렌이민(w/v)에 의해 배양 상층액으로부터 DNA 를 수득하였다. 7500 × g 으로 30 분간 원심분리한 후 상층액을 수득하였다.
수득한 상층액을 14 ㎖/분의 유속을 갖는 고속 유동 컬럼인 60 ㎖ 의 단백질-G 세파로스 4(아메삼 파마시아 바이오테크에서 입수)에 공급하였다. 컬럼을 PBS 로 세척하고 100 mM 아세트산, pH 3 인 0.025 % 트윈 20 을 사용하여 용출하였다. 용출된 산물을 수득하여 pH 를 1 M NaOH 로 이론 등전점 이하인 1.5 유닛으로 조절하고 여과하였으며(0.2 ㎛) 0.025 % 트윈 20 으로 4 배 희석시켰다. 퇴화된 변이체를 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 제거하였다. 시료의 이온 강도를 2mS/cm 으로 조정하였으며 컬럼은 SP-세파로스-HP 인 하이로드 16/10(아메삼 파마시아 바이오테크에서 입수)을 사용하였다. 0-55 % 의 직선 밀도구배를 나타내는 완충용액 B, 100 mM NaAc, 400 mM NaCl, 0.025 % 트윈 20, pH 5.0 인 완충용액 A, 10 mM NaAc, pH 5 인 0.025 % 트윈 20 을 사용하여 4.0 ㎖/분의 유속으로 50 분간 용출하였다.
실시예 5
혈청반응성
초항원 변이체 및 인체 항-SEA 간의 반응성을 신틸레이션 근접 검정(SPA)으로 측정하였다.
미량역가 플레이트(팩커드 인스트루먼츠에서 입수한 옵티플레이트)에서, 150 ㎍ 비드/웰의 스트렙타비딘 코팅 PVT 비드(아메삼 파마시아 바이오테크에서 입수)를 항-마우스 IgG 의 바이오틴 접합 F(ab)2 단편 및 3 ㎍/㎎ 비드와 실온에서 30 분간 항온하였다. 비드를 C215Fab 접합 초항원과 1:2 로 연속 희석하여 예비항온하였으며 웰에서 가장 높은 최종 농도는 40 nM 이다. 마지막으로, 이것을 1 nM 125I 가 접합되었으며 친화성 정제한 인체 항-SEA 항체와 항온하였으며 □-신틸레이션의 양은 탑-계수기(팩커드 인스트루먼츠에서 입수)로 측정하였다.
초항원 변이체에 대한 인체 항-SEA 반응성 또한 효소-결합 면역흡착 검정인 ELISA(Cavallin 등의 문헌, 2000)로 측정하였다. 결과는 SPA 에서 얻어진 결과와 유사하였다.
실시예 6
생물학적 기능
초항원 항체 의존 세포성 세포독성(SADCC) 및 초항원 의존 세포성 세포독성(SDCC)을 유도하는 능력은 표준 4h 51Cr-방출 검정으로 비교하였다.
간략하게, SDCC 에 대해 사용되는 표적은 인체 B-세포 림프종 Raji 세포(ATCC 기탁번호 제 CCL 86 호)이며 SADCC 에 대한 표적은 인체 결장 암종 Colo205 세포(ATCC 기탁번호 제 CCL 222 호)이다. 세포를 51Cr 로 표지하고 V-모양의 미량역가 웰에서 5000 세포/㎖ 의 농도로 희석하였다. 작동 세포인 SEA 반응 인체 T-세포주를 작동 세포 대 표적 세포의 비가 SADCC 에 대하여는 45:1 로, SDCC 에 대하여는 30:1 로 사용하였다. Sag 변이체를 SADCC 에 대해서는 10-9-1016M 및 SDCC 에 대해서는 10-7 -1014M 의 농도로 첨가하였다. 초항원을 수집하여 51Cr 의 방출을 탑계수기(팩커드 인스트루먼츠에서 입수)로 측정하였다. 특이적인 세포독성의 백분율은 100 × [(cpm 실험 방출 - cpm 기본 방출)/(cpm 총 방출 - cpm 기본 방출)]로 계산하였다.
실시예 7
항체 에피토프의 확인
환자에게 있어서, 초항원에 대한 항체가 이미 존재할 때 치료시 투여량의 조절이 요구되는 것과 같이 임상학적 적용을 어렵게 만든 다(Alpaugh 등의 문헌, 1998). 미리 형성된 항체의 영향을 제한하기 위한 다른 접근으로는 T-세포 수용체 결합에 반응하는 초항원의 영역을 변형시키는 것이다(Antonsson 등의 문헌, 1997). 그러나, 본 발명은 초항원의 항체 에피토프를 제거하는 유전 공학을 통해 초항원의 치료학적 잠재성을 더 개선시킬 수 있다.
SEE 는 SEA 에 비해 항체 반응성이 매우 감소함이 발견되었다(Anton sson 등의 문헌, 1997). 불행하게도, 이러한 감소는 또한 종양 반응성 Fab 에 융합되었을 때 종양 사멸 특성이 매우 감소함을 나타내는 것이다(Antonsson 등의 문헌, 1997). 그러므로 SEA 및 SEE 의 키메라 구성물이 연구되었다. SEE 의 TCR-결합 영역의 4 개의 위치에 SEA 로부터의 상응 아미노산을 도입하였을 때, 요구되는 특성을 얻을 수 있었다. 이러한 치환은 SEE 의 Arg20Gly, Asn21Thr, Ser24Gly 및 Arg27Lys(영역 A)이며 결과적으로 키메라 SEA/E-18 이 만들어졌다(도 4, Antonsson 등의 문헌, 1997). 이러한 키메라는 SEE 에서와 같이 항체 반응성이 50 % 보다 크게 감소되며 SEA 에서와 같이 세포독성의 유효 수준이 유지되었다. 부가적으로, SDCC 가 감소되고 이로 인해 치료학적 창(window)이 개선되도록 초항원과 MHC 제 2 급 사이의 친화성을 감 소시키기 위해 SEA/E-18 은 또한 치환 Asp227Ala 를 포함한다(Abrahmsen 등의 문헌, 1995).
SEA/E-18 을 인식하는 인체 항-SEA 의 능력을 추가로 감소시키기 위해, 초항원 내의 항체 결합 에피토프를 검출하였다. SEAwt 또는 SEA/E-18 의 부분적 펩신 소화에 의한 펩티드/단편은 고정화된 항-SEA 항체를 사용하여 획득하였다. 정제 후에, 펩티드 서열을 LC-MS 를 사용하여 확인하였다(도 1). 항체 인식에 포함되는 잠재적인 구역은 아미노산 서열에 위치한다. 특히, 발견된 펩티드의 대부분이 MHC 제 2 급과 상호작용한다고 알려진 영역 주위에 위치하였다(Abrahmsen 등의 문헌, 1995, 도 2 및 도 6). SEA 의 결정구조에 기초한(Schad 등의 문헌, 1995 ; Sundstrom 등의 문헌, 1996 A) SEA 의 3 차 구조(Schad 등의 문헌, 1995 ; Sundstrom 등의 문헌, 1996) 및 SEA/E-18 의 컴퓨터 모델(도 5)은 확인된 펩티드 내의 표면 노출 잔기를 알아내는데 사용하였다. 다음의 잔기가 노출된 것으로 확인된 것이며 항체 결합 에피토프의 잠재적 후보들이다(표 1) : Glu34, Lys35, Glu39, Asn40, Lys41, Glu42, Asp44, Asp45, Glu49, Lys74, Asp75, Asn78, Lys79, Lys81, Lys83, Lys84, Asp173, His187, Ser189, Glu190, Gln204, Lys217, Asn220, Glu222, Asn223, His225 및 Asp227.
이러한 잔기들은 그 후에 항체에 대한 결합을 감소시키기 위해 치환되었다. 추가로 개선된 SAg 변이체를 갖는 새로운 컴퓨터 모델은 나중에 획득한 결과를 확인하고 비교하기 위해 계속 만들어졌다. 특히 곁사슬의 영향이 연구되었으며 단백질의 안정성에 영향을 미치는 변화를 확인하였다.
실시예 8
혈청반응성을 감소시키기 위한 초항원의 변형
확인된 잔기의 항체 결합 수준은 SEA/E-18 에서의 2 내지 6 개의 동시 치환에 의해 처음으로 특성화되었다. 이에 의하여 SAg 변이체인 SEA/E-62(Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala) (영역 E), SEA/E-63 (Ser189Asp, Glu190Ala) (영역 D), SEA/E-64 (Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys) (영역 B), SEA/E-65 (Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Glu, Lys84Glu) (영역 C) 및 SEA/E-74 (Asp44Ala, Asp45Ala, Glu49Thr) (영역 B) 및 SEA/E-75 (Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser) (영역 C)를 수득하였다(표 1, 도 4).
인체 IgG-풀로부터의 항-SEA 항체가 상이한 SAg 변이체를 인식할 수 있는지를 알아보기 위해, 신틸레이션 근접 검정(SPA)을 실시하였다. 변형시킨 변이체는 SEA/E-18 에 비해 낮은 정도로 인식된다(표 1). 결합에서 대부분의 실질적인 감소는 SEA/E-65 에서 만들어진 치환에 의한 것이다. SPA 분석에서, 40 % 보다 큰 감소가 관찰되었다(도 7). 그러나, 많은 치환은 또한 E. coli 의 생산 수준을 감소시키며 게다가, 생물학적 활성도도 가끔 감소시킨다. 치환을 세밀히 조사하여 각 변이체 내의 반응성 잔기를 확인할 수 있었으며 더 나은 특성을 가지도록 이 잔기를 제거하거나 변형시킬 수 있었다. 일반적으로, 생산 수준은 좀더 소수성인 치환보다는 친수성 치환에 의해 증가되었다.
항체 결합의 감소는 SEA/E-63, SEA/E-65 및 변형시킨 SEA/E-74(야생형 Asp45 를 갖는)로 구성되는 SEA/E-91 에서와 같이, 변이체가 조합되었을 때 상승적으로 증가하였다(표 1). SEA/E-18 에 비해 결합이 거의 70 % 감소된 SPA 분석에서 가장 두드러지는 결과를 갖는 변이체는 SEA/E-63, SEA/E-75 및 변형시킨 SEA/E-62(SEA/E-97), SEA/E-64(SEA/E-108), SEA/E-65(SEA/E-84), 및 SEA/E-74(wt Asp45) 의 조합물인 SEA/E-110 이다(도 7, 표 1). 항체 결합의 감소 중 대부분은 SEA/E-75 및 변형시킨 SEA/E-64 (SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) 및 SEA/E-74 (wt Asp45) 의 조합물인 SEA/E-109(Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49Thr, Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser, Lys84Ser)내에서의 변형에 의한 것이다. 이는 이러한 치환을 포함하는 초항원 변이체가 SPA 분석에서 모두 상당한 감소를 나타냈기 때문이다.
그러므로, SEA/E-62, SEA/E-64, SEA/E-65 및 SEA/E-74 에서 치환된 잔기는 SEA/E-18 에 비해 항체 반응성에서 20 내지 40 % 감소되었다(표 1).
Figure 112003047468242-pct00001
실시예 9
생산 수준에 영향을 미치는 치환
상기 언급한 바와 같이, 초항원 표면의 몇몇 치환은 E. coli 의 생산 수준을 감소시킨다. 이러한 치환의 많은 조합은 심지어는 생산을 불가능하게 만든다. 그러므로, 생산량의 감소를 일으키는 것이 분명한 잔기의 선택적인 변형의 연구가 결정되었다. 항체로의 결합을 감소시킴 없이 생산량에 영향을 미치는 치환은 추가로 연구되지 않았다. 대신에 야생형 잔기가 사용되었다.
초항원 변이체의 초기 세트에서, SEA/E-64 의 잔기 Lys35 는 발현 수준에 부정적인 영향을 미치지 않는다. Glu34 및 Glu39 의 세린 치환과 함께 위치 35 의 야생형 잔기를 사용하였을 때(SAg 변이체 SEA/E-108), 생산량이 23 ㎎/ℓ 내지 30 ㎎/ℓ 로 증가하였다. 그러나 항체 반응성의 감소는 그대로 유지되었다. SEA/E-65 의 잔기 Lys79, Lys81, Lys83 및 Lys84 의 글루타민산 치환이 도입되었을 때, 단지 1.5 ㎎/ℓ 의 생산 수준을 나타내었다. 항체 반응성의 효과가 SEA/E-18 에 비해 43 % 감소한다는 사실에 기인하여, 좀 더 나은 치환을 확인하려는 노력이 있었다. 생산량 및 감소된 항체 반응성 둘 다에 있어서 가장 알맞은 조합은 위치 83 및 84 의 세린 잔기 및 위치 79 및 81 의 보존된 글루타민산 잔기를 갖는 SEA/E-84 이었다(표 1). SEA/E-18 에 비해 생산 수준은 10 배 증가하였으며 항체 반응성은 41 % 감소하였다(표 1). 생산 수준은 또한 SEA/E-62 의 치환 Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala 및 Asp227Ala 에서 10 배 이상 감소하여 1.0 ㎎/ℓ 를 나타내었다. 그러나, 세린 잔기를 알라닌 치환으로 치환하면(SEA/E-97), 48 ㎎/ℓ 의 생산량이 얻어졌다(표 1).
흥미롭게는, SEA/E-91 에서와 같이 SEA/E-65 를 SEA/E-63 및 변형시킨 SEA/E-74 와 같은 더 많은 변이체와 조합하였을 때, 낮은 생산 수준이 12 ㎎/ℓ 로 상승되었다(표 1). 반면에 초항원 변이체 SEA/E-110 은 각각 0.5 ㎎/ℓ 및 14 ㎎/ℓ 의 발현 수준을 나타낸다. 그러나 SEA/E-110 의 생산 수준은 치환 Asp174Ala, His87Ala, Ser188Thr, Ser189Asp, Glu190Ala 및 Gln204Thr 을 제거했을 때(SEA/E-120) 30 ㎎/ℓ 로 증가하였다(표 1).
초항원 내에 많은 치환을 유도하는 것은 E. coli 발현에 문제를 일으킬 수 있다. 이러한 것에는 적어도 3 가지 상이한 메카니즘이 있다 ; 감소된 열역학, 파괴된 천연 접힘 경로 또는 새로 도입된 단백질가수분해 부위. 주요 구조적 골격을 손상하지 않을 것 같은 표면의 항원 에피토프를 제거하는 것이 본 연구의 목적이지만, 안정성을 유지 하기 위해 새로운 구조가 야생형 구성보다는 그외의 잔기에 의존하게 될 가능성은 항상 존재한다. 그러므로, 새로운 구조 내의 치환된 잔기의 위치를 예상하거나 확인하기 위해 새로운 컴퓨터 모델이 계속 만들어졌다. 이러한 방법으로 예를 들어 발현 수준에 문제를 발생시키는 초기 초항원 변이체 내의 반응성 잔기를 확인할 수 있으며 야생형 잔기 또는 더 나은 치환을 갖는 개선된 변이체를 완성할 수 있다(표 1).
결론적으로, 생산의 수준을 향상시키기 위해 다음의 잔기 Lys83, Lys84, Asn220, Asn223, His225 및 Asp227 을 알라닌이 아닌 세린으로 치환해야 한다. 부가적으로, 발현 수준의 감소를 피하기 위해서는 잔기 Lys35, Asp173, His187, Ser188, Ser189, Glu190 및 Gln204 를 보존해야 한다.
실시예 10
상이한 Sag 변이체 내의 생물학적 기능의 평가
초항원이 초기에는 종양 치료를 위해 설계된 것이므로(Dohlsten 등의 문헌, 1994), 신규한 초항원 변이체 내에 종양에 대한 직접 세포독성을 감소시키는 치환을 피하는 것이 중요하다. 그러므로 종양에 대한 직접 세포독성을 매개하는 능력을 모든 신규한 초항원 변이체에 대해 SADCC 검정으로 측정하였다(도 3). 게다가, MHC 제 2 급 발현 세포의 T 세포 사멸을 매개하는 초항원의 효능은 SDCC 검정으로 측정되는 부작용을 일으킬 수 있는 전신 세포독성을 나타낸다(도 3). 임상학적 사용을 위해, 치료학적 창을 증가시키도록 SDCC 가 낮아져야 할 것이다.
SAg 변이체의 초기 세트의 대부분은 SEA/E-18 의 종양 특이 세포독성 효능과 같은 수준을 갖는다(표 1). SEA/E-18 에 비해 10 배 감소되는 치환 Lys74Thr, Asp75Ala 및 Asn78Ser 을 갖는 SEA/E-75 및 5 배 감소되는 치환 Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu 및 Glu42Lys 을 갖는 SEA/E-64 는 예외이다(표 1). 흥미롭게는, SEA/E-75 의 감소된 활성은 이 변이체에서만 검출되었으며 예를 들어 SEA/E-109 에서의 추가적인 치환을 갖는 조합에서는 온전한 활성이 검출되었다(표 1). 게다가 SDCC 활성은 SEA/E-18 에 비해 SEA/E-75 에서는 변화하지 않았다. 그러므로 치환 Lys74Thr, Asp75Ala 및 Asn78Ser 은 항체 의존 세포독성에 대해서만 중요한 상호작용을 방해하지 않을 것이다.
본원에 기재된 대부분의 초항원 변이체는 SDCC 가 확실히 감소됨을 보여준다. SEA/E-18 에 비교시 SDCC 활성은 적은 감소는 초기 변이체인 SEA/E-62, SEA/E-63, SEA/E-64, SEA/E-65 및 SEA/E-74 에서 관찰되었다.
모든 초항원 변이체는 치환 잔기 Asp227Ala 또는 Ser 을 포함한다. 이러한 치환은 MHC 제 2 급에 대한 친화성을 100 배 감소시키며 이로 인해 SDCC 활성도 감소시킨다고 알려져 있다(Abrahmsen 등의 문헌, 1995). 그러나, N-말단 치환을 갖는 SAg 변이체 SEA/E-109 가 C-말단 치환을 갖는 SEA/E-113 보다 SEA/E-18 에 비해서 더 많이 감소하는데, 이는 SEA/E-109 내에서 부가적인 잔기가 SDCC 및 MHC 제 2 급에 대한 가장 적합한 결합에 중요하도록 변화되었음을 나타낸다(도 8).
그러므로, 상당한 감소를 일으키는 잔기는 SEA/E-83 에서는 치환 Lys79Ser 및 Lys81Ser 이며 SEA/E-74 에서는 치환 Asp45Ala 이다. 이러한 치환의 대부분은 MHC 제 2 급과 상호작용하는 것으로 알려진(Abrahmsen 등의 문헌, 1995) 잔기 주위에 위치하고 있다.
실시예 11
신규한 초항원 변이체의 설계
최상의 초항원 변이체를 설계하기 위해, 알맞은 모든 치환을 조합하여 우수한 SEA/E-120 을 유도하였다(도 4 및 도 9).
우선, C-말단에서의 알맞은 모든 변형, 즉, 잔기 Gln204Thr 과 함께 Asp173Ala, Ser189Thr, Glu190Ala, Lys217Thr, Asn220Ser, Glu222Thr, Asn223Ser, His225Ser 및 Asp227Ser 을 조합하여 SAg 변이체 SEA/E-113 을 형성하였다. 이러한 변이체는 예상되는 항-SEA 반응성의 감소 및 만족스러운 발현 수준을 나타내지만 생물학적 활성은 다소 감소하였다(표 1, 도 7, 도 8A 및 도 8B). N-말단에서의 알맞은 모든 치환, 즉, 잔기 Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Gul, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49T, Lys74T, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser, 및 Lys84Ser 을 조합하여 SEA/E-109 를 형성하였다. 항-SEA 반응성의 상당한 감소가 높은 수준의 발현 및 개선된 생물학적 프로필을 갖는 이러한 초항원 변이체에서 발견되었다(표 1, 도 7 및 도 8A 및 도 8B). 그러나, SEA/E-110 내에서 두 변이체 SEA/E-113 및 SEA/E-109 의 조합을 만들었을 때, 생산량 및 생물학적 기능 둘 다 극적으로 감소하였다(표 1). 생물학적 효능은 야생형 잔기 Ser189, Glu190 및 Gln204 가 SEA/E-115 에 다시 사용되었을 때 완전히 회복되었지만(표 1) 생산 수준은 여전히 낮은 수준에 머물렀다. 이러한 변이체의 분자 모델링은 잔기 Asp173, His187 및 Ser188 이 접힘의 안정화 및 그로 인한 높은 생산량에 중요한 역할을 할 수 있음을 제안하였다.
상이한 여러 조합은 SEA/E-118, SEA/E-119, SEA/E-120, SEA/E-121 및 SEA/E-122 를 생성하는 이러한 잔기들을 평가하기 위해 만들어졌다(표 1). 모든 세 위치에서 야생형 잔기를 갖는 SEA/E-120 에서 최상의 생산을 얻을 수 있었다. 이전에 만들어진 SEA/E-21, SEA/E-74, SEA/E-97, SEA/E-108 및 SEA/E-109 와 함께, 상기의 초항원 변이체들은 20 ㎎/ℓ 이상의 발현 수준에 이르는 유일한 SAg 변이체이다(표 1). 변이체간에는 생물학적 활성 또는 항체 반응성에 대한 상당한 차이가 발견되지 않았다.
신규한 접합체의 설계
SEA/E-120 을 종양 반응성 항체인 5T4(캔서 리서치 유케이에서 입수, 단백질 서열은 Forsberg 등의 문헌, 1997 에 공개되어 있음)의 Fab 부분에 유전적으로 융합시켰다(Dohlsten 등의 문헌, 1994, 도 10).
5T4 의 항원은 비-소세포(non-small cell) 폐암, 유방암, 신장 세포암, 췌장암, 난소암 및 결장암과 같은 다양한 종양에서 발현된다. 높은 생산량을 이루기 위해 5T4 의 야생형 서열을 치환하였다. 중쇄에서는 His41Pro, Ser44Gly, Ile69Thr 및 Val113Gly 이며 경쇄에서는 Phe10Ser, Thr45Lys, Ile63Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val 및 Leu83Ala 이다.
본 발명 및 그것의 이점이 상세히 기재되어 있지만, 이는 첨부된 청구범위에 의해 규정되는 발명의 정신 및 범주를 벗어남 없이 다양한 변화, 치환 및 변경이 있을 수 있음이 이해되어야 한다. 게다가, 본 출원의 범주는 명세서에 기재된 과정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법 및 단계의 특정 실시형태로 한정하려는 의도가 아니다. 본 분야의 숙련자는 본 발명의 기재내용을 쉽게 인지할 것이므로, 본원에 기재된 해당 실시형태와 실질적으로 동일한 작용을 수행하며 동일한 결과를 나타내는 현재 존재하거나 나중에 개선될 과정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법 또는 단계를 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구범위는 이러한 과정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법 또는 단계를 그것의 범주 내에 포함하려는 의도이다.
본 분야의 숙련자는 본 발명이 본래의 것 뿐만 아니라 목표를 실행하고 언급된 결과 및 이점을 수득하기에 적합함을 쉽게 인식할 것이다. 본원에 기재된 조성물, 방법, 과정 및 기술은 현재 바람직한 대표적 실시형태이고 예시로서 의도된 것이며 범주를 한정할 의도는 아니다. 변화 및 다른 용도는 본 분야의 숙련자들에 의해 발생될 것이며 이는 본 발명의 정신에 포함되고 계류중인 청구범위의 범주에 의해 규정된다.

참고 문헌
본 발명의 상세한 설명 부분에 언급되어 있는 모든 특허 문헌 및 공개 문헌은 본 발명과 관련되어 있는 숙련자의 수준에 적합하며 각각의 공개 문헌이 참고 문헌으로 인용되도록 명확하고 개별적으로 기재된 것과 같이 동일한 범위에서 모든 특허 문헌 및 공개 문헌이 본원에서 참고 문헌으로 인용되었다.
미국 특허 제 4,554,101 호
미국 특허 제 5,221,605 호
미국 특허 제 5,238,808 호
미국 특허 제 5,798,208 호
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미국 특허 제 5,789,166 호
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미국 특허 제 5,710,245 호
미국 특허 제 5,840,833 호
미국 특허 제 5,859,184 호
미국 특허 제 5,440,013 호
미국 특허 제 5,618,914 호
미국 특허 제 5,670,155 호
미국 특허 제 5,475,085 호
미국 특허 제 5,929,237 호
미국 특허 제 5,672,681 호
미국 특허 제 5,674,976 호
미국 특허 제 4,608,251 호
미국 특허 제 4,601,903 호
미국 특허 제 4,599,231 호
미국 특허 제 4,599,230 호
미국 특허 제 4,596,792 호
미국 특허 제 4,578,770 호
Figure 112003047468242-pct00002
Figure 112003047468242-pct00003
SEQUENCE LISTING <110> FORSBERG, GORAN ERLANDSSON, EVA ANTONSSON, PER WALSE, BJORN <120> A NOVEL ENGINEERED SUPERANTIGEN FOR HUMAN THERAPY <130> P02188US0;10104199 <140> TBA <141> 2001-06-20 <160> 7 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 672 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(672) <223> Conjugate protein <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Thr Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Ser Gly Gly 210 215 220 Pro Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys 225 230 235 240 Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Tyr Asn Ser Lys Ala Ile Thr Ser Ser Glu Lys Ser Ala Asp Gln Phe 260 265 270 Leu Thr Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp 275 280 285 Tyr Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Thr Ala Ala Thr Ser Glu 290 295 300 Tyr Glu Gly Ser Ser Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln 305 310 315 320 Cys Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val 325 330 335 Thr Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile 340 345 350 Asn Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr Thr Val Pro Ile Asp Lys Val 355 360 365 Lys Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala 370 375 380 Arg His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe 385 390 395 400 Gly Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly 405 410 415 Ser Thr Val Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Ala Gln Gly Gln Tyr Pro Asp 420 425 430 Thr Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Thr Thr Ile Ser Ser Thr Ser 435 440 445 Leu Ser Ile Ser Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr Ser Ile Val Met Thr Gln 450 455 460 Thr Pro Thr Ser Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 465 470 475 480 Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln 485 490 495 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Ser Ser Arg 500 505 510 Tyr Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp 515 520 525 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr 530 535 540 Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr 545 550 555 560 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe 565 570 575 Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys 580 585 590 Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile 595 600 605 Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln 610 615 620 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr 625 630 635 640 Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His 645 650 655 Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Ser 660 665 670 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> Peptide <222> (1)..(233)<223> Chimeric Protein <400> 2 Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser 1 5 10 15 Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ser Lys Ala Ile Thr Ser Ser Glu Lys Ser Ala Asp Gln Phe Leu 35 40 45 Thr Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp Tyr 50 55 60 Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Thr Ala Ala Thr Ser Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Gly Ser Ser Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr 100 105 110 Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn 115 120 125 Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr Thr Val Pro Ile Asp Lys Val Lys 130 135 140 Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg 145 150 155 160 His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe Gly 165 170 175 Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly Ser 180 185 190 Thr Val Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Ala Gln Gly Gln Tyr Pro Asp Thr 195 200 205 Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Thr Thr Ile Ser Ser Thr Ser Leu 210 215 220 Ser Ile Ser Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr 225 230 <210> 3 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> peptide <222> (1)..(233) <223> Chimeric Protein <400> 3 Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser 1 5 10 15 Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Asn Glu Lys Ala Ile Thr Glu Asn Lys Glu Ser Asp Asp Gln Phe Leu 35 40 45 Glu Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp Tyr 50 55 60 Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr 100 105 110 Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn 115 120 125 Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr Thr Val Pro Ile Asp Lys Val Lys 130 135 140 Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg 145 150 155 160 His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe Gly 165 170 175 Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly Ser 180 185 190 Thr Val Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Ala Gln Gly Gln Tyr Pro Asp Thr 195 200 205 Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Leu 210 215 220 His Ile Ala Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr 225 230 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Staphylococcus sp. <400> 4 Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser 1 5 10 15 Glu Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Asn Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu 35 40 45 Gln His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr 50 55 60 Asn Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr 65 70 75 80 Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr 100 105 110 Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn 115 120 125 Leu Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys 130 135 140 Thr Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg 145 150 155 160 Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp 165 170 175 Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro 180 185 190 Ser Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr 195 200 205 Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met 210 215 220 His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser 225 230 <210> 5 <211> 203 <212> PRT <213> Staphylococcus sp. <400> 5 Ala Leu His Lys Lys Ser Glu Leu Ser Ser Thr Ala Leu Asn Asn Met 1 5 10 15 Lys His Ser Tyr Ala Asp Ala Asn Pro Ile Ile Gly Ala Asn Lys Ser 20 25 30 Thr Gly Asp Gln Phe Leu Glu Asn Thr Leu Leu Tyr Lys Ala Phe Phe 35 40 45 Leu Leu Ile Asn Phe Asn Ser Ala Glu Met Ala Gln His Phe Lys Ser 50 55 60 Lys Asn Val Asp Val Tyr Ala Ile Arg Tyr Ala Ala Ala Cys Arg Thr 65 70 75 80 Ala Cys Thr Tyr Gly Gly Val Thr Pro His Ala Gly Asn Ala Leu Lys 85 90 95 Ala Arg Lys Lys Ile Pro Ile Asn Leu Trp Ile Ile Gly Val Gln Lys 100 105 110 Glu Val Ser Leu Asp Lys Val Gln Thr Asp Lys Lys Asn Val Thr Val 115 120 125 Gln Glu Leu Asp Ala Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Gln Lys Asp Leu Lys 130 135 140 Leu Tyr Asn Ala Ile Gln Arg Gly Lys Leu Glu Phe Asp Ser Ala Ala 145 150 155 160 Ala Ser Lys Val Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Val Ala Gly Asp Phe Pro 165 170 175 Glu Lys Gln Leu Arg Ile Tyr Ser Asp Asn Lys Thr Leu Ser Thr Glu 180 185 190 His Leu His Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Glu Ala 195 200 <210> 6 <211> 217 <212> PRT <213> Staphylococcus sp. <400> 6 Glu Asp Leu His Asp Lys Ser Glu Leu Thr Asp Leu Ala Leu Ala Asn 1 5 10 15 Ala Tyr Gly Gln Tyr Asn His Pro Phe Ile Lys Glu Asn Ile Lys Ser 20 25 30 Asp Glu Ile Ser Gly Glu Lys Asp Leu Ile Phe Arg Asn Gln Gly Asp 35 40 45 Ser Gly Asn Asp Leu Arg Val Lys Phe Ala Thr Ala Asp Leu Ala Gln 50 55 60 Lys Phe Lys Asn Lys Asn Val Asp Ile Tyr Gly Ala Ser Phe Tyr Tyr 65 70 75 80 Lys Cys Glu Lys Ile Ser Glu Asn Ile Ser Glu Cys Leu Tyr Gly Gly 85 90 95 Thr Thr Leu Asn Ser Glu Lys Leu Ala Gln Glu Arg Val Ile Gly Ala 100 105 110 Asn Val Trp Val Asp Gly Ile Gln Lys Glu Thr Glu Leu Ile Arg Thr 115 120 125 Asn Lys Lys Asn Val Thr Leu Gln Glu Leu Asp Ile Lys Ile Arg Lys 130 135 140 Ile Leu Ser Asp Lys Tyr Lys Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Glu Ile Ser 145 150 155 160 Lys Gly Leu Ile Glu Phe Asp Met Lys Thr Pro Arg Asp Tyr Ser Phe 165 170 175 Asp Ile Tyr Asp Leu Lys Gly Glu Asn Asp Tyr Glu Ile Asp Lys Ile 180 185 190 Tyr Glu Asp Asn Lys Thr Leu Lys Ser Asp Asp Ile Ser His Ile Asp 195 200 205 Val Asn Leu Tyr Thr Lys Lys Lys Val 210 215 <210> 7 <211> 233 <212> PRT <213> Staphylococcus sp. <400> 7 Ser Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser 1 5 10 15 Glu Leu Gln Arg Asn Ala Leu Ser Asn Leu Arg Gln Ile Tyr Tyr Tyr 20 25 30 Asn Glu Lys Ala Ile Thr Glu Asn Lys Glu Ser Asp Asp Gln Phe Leu 35 40 45 Glu Asn Thr Leu Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Gly His Pro Trp Tyr 50 55 60 Asn Asp Leu Leu Val Asp Leu Gly Ser Lys Asp Ala Thr Asn Lys Tyr 65 70 75 80 Lys Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr 100 105 110 Leu His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn 115 120 125 Leu Trp Ile Asp Gly Lys Gln Thr Thr Val Pro Ile Asp Lys Val Lys 130 135 140 Thr Ser Lys Lys Glu Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg 145 150 155 160 His Tyr Leu His Gly Lys Phe Gly Leu Tyr Asn Ser Asp Ser Phe Gly 165 170 175 Gly Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Ser Ser Glu Gly Ser 180 185 190 Thr Val Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Ala Gln Gly Gln Tyr Pro Asp Thr 195 200 205 Leu Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Leu 210 215 220 His Ile Asp Leu Tyr Leu Tyr Thr Thr 225 230

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  56. 박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 접합체이되,
    상기 초항원은 다음의 아미노산 치환을 포함하는 SEA/E-65, SEA/E-84, SEA/E-90, SEA/E-91, SEA/E-93, SEA/E-109, SEA/E-110, SEA/E-115, SEA/E-118, SEA/E-119, SEA/E-120, SEA/E-121 및 SEA/E-122 중에서 선택한, SEQ ID NO : 7 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 포도상구균 엔테로톡신 E(Staphylococcal enterotoxin E ; SEE)의 변이체이며, 이러한 초항원은 SEQ ID NO : 7 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 포도상구균 엔테로톡신 E 에 비해 감소된 혈청반응성을 가지고, 아미노산 위치 20 은 글리신이고, 아미노산 위치 21 은 트레오닌이고,
    아미노산 위치 24 는 글리신이고, 아미노산 위치 27 은 리신이며,
    아미노산 위치 227 은 세린 또는 알라닌임(여기에서 아미노산 치환의
    위치는 SEQ ID NO : 7 에 기재되어 있는 아미노산 위치에 상응함) ;
    상기 항체 부분은 SEQ ID NO: 1 에 나타나 있는 아미노산 서열에서 아미노산 위치 1 내지 120 및 아미노산 위치 459 내지 565 의 아미노산 서열을 가지는 5T4Fab 인
    박테리아성 초항원 및 항체 부분을 포함하는 접합체.
  57. 제 56 항에 있어서, 초항원은 SEQ ID NO : 2(SEA/E-120)에 나타나 있는 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 접합체.
  58. 제 56 항에 있어서, 아미노산 위치 227 에서의 치환은 알라닌임을 특징으로 하는 접합체.
  59. 제 56 항에 있어서, 아미노산 위치 227 에서의 치환은 세린임을 특징으로 하는 접합체.
  60. 삭제
  61. 제 56 항에 있어서, SEQ ID NO : 1 에 나타나 있는 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 접합체.
  62. 유효 성분으로서 제 56 항의 접합체의 치료학적 유효량을 포함하는, 폐암, 유방암, 결장암, 신장암, 췌장암, 난소암, 위암, 경부암 및 전립선 암 중에서 선택한 암을 치료하기 위한 조성물.
  63. 제 62 항에 있어서, 암은 폐암임을 특징으로 하는 조성물.
  64. 제 56 항에 있어서, 초항원은 SEA/E-119, SEA/E-120, SEA/E-121 및 SEA/E-122 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 접합체.
KR1020037016268A 2001-06-28 2002-06-19 암을 치료하기 위해 조작한 신규한 초항원을 포함하는 접합체, 이를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법 KR100961054B1 (ko)

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