MX2014003313A

MX2014003313A - Moleculas de union biespecificas para 5t4 y cd3.

Info

Publication number: MX2014003313A
Application number: MX2014003313A
Authority: MX
Inventors: Peter Kufer; Tobias Raum; Roman Kischel; Patrick Hoffman; Doris Rau; Ralf Lutterbuese
Original assignee: Amgen Res Munich Gmbh
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2014-07-09
Also published as: CA2846432A1; WO2013041687A1; EP2758438A1; AU2012311492A1; JP2014533929A

Abstract

La presente invención proporciona una molécula de unión biespecífica que comprende un primero y segundo dominios de unión en donde el primer dominio de unión es capaz de unión al conjunto 4 de epítopo de T4 y el segundo dominio de unión es capaz de unión al complejo receptor de CD3 en linfocitos T. Además, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica para la molécula de unión biespecífica, un vector que comprende a la secuencia de ácido nucleico y una célula hospedera transformada o transfectada con el vector. Además, la invención proporciona un proceso para la producción de una molécula de unión biespecífica de la invención, un uso médico de la molécula de unión biespecífica y un kit que comprende la molécula de unión biespecífica.

Description

MOLECULAS DE UNION BIESPECIFICAS PARA 5T4 Y CD3 CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una molécula de unión biespecífica que comprende un primero y segundo dominios de unión en donde el primer dominio de unión es capaz de unión al conjunto 4 de epítopo de 5T4 y el segundo dominio de unión es capaz de unión al complejo receptor CD3 en linfocitos T. Además, la invención se relaciona con una secuencia de ácido nucleico que codifica para la molécula de unión biespecífica, un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico y una célula hospedera transformada o transfectada con el vector. Además, la invención se relaciona con un proceso para la producción de la molécula de unión biespecífica de la invención, un uso médico de la molécula de unión biespecífica y un kit que comprende la molécula de unión biespecífica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se calcula que 1,529,560 hombres y mujeres serán diagnosticados y 569,490 hombres y mujeres morirán de cáncer en los Estados Unidos en 2010 (Ho lader N, Noone AM, Krapcho M, Neyman N, Aminou R, Waldron W. Altekruse SF, Kosary CL, Ruhl J, Tatalovich Z, Cho H, Marriotto A, Eisner MP, Lewis DR, Chen HS, Feuer EJ, Cronin KA, Edwards BK (eds) . SEER Cáncer Statistics Review, 1975-2008, National Cáncer Ref. 246788 Institute. Bethesda, MD, http://seer.cancer.gov/csr/l975_2008/, basado en el envío de datos de noviembre del 2010 SEER dirigidos al sitio de la red SEER, 2011) . Como lo sugieren estas cantidades, el cáncer es una causa principal de morbilidad y mortalidad en el mundo desarrollado. Para la mayor parte de los cánceres epiteliales, los cuales constituyen la mayoría predominante de casos de cáncer, no existen, con algunas excepciones, tratamiento curativo excepto la extirpación quirúrgica completa en etapas tempranas. El progreso de la enfermedad pese a los repetidos tratamientos convencionales intensivos que incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia genera un estado de mortalidad sustancial anterior. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad médica por modalidades de tratamiento innovadoras que mejoran el resultado para estas poblaciones de pacientes.

El antígeno de superficie celular definido como anticuerpo monoclonal 5T4 es una glucoproteína d 72 kd que se expresa en todos los tipos de trofoblastos en un momento tan temprano como 9 semanas de desarrollo. En tejidos adultos, la expresión de 5T4 se limita a algunos tipos de células epiteliales especializadas pero que no se detectan en hígado adulto, pulmón, bronquios, corazón, testículos, ovario, cerebro o músculo. El antígeno se expresa selectivamente por diversas líneas de células tumorales que incluyen aquellas de origen en el desarrollo. Las características moleculares, la distribución de tejido normal relativamente restringido y la expresión por ciertos tipos de células tumorales vuelven a este antígeno digno de uso como un etiquetador de diagnóstico para condiciones malignas (Hole & Stern, Br J C ncer. (1988) 57 (3) , 239-46) .

Existe una evidencia clara de la relación de 5T4 en cáncer y el progreso del cáncer. Se han demostrado niveles altos de expresión de 5T4 en la superficie de células cancerosas para cáncer de ovario (Wrigley E, McGown AT, Rennison J. et al. 5T4 oncofetal antigen expression in ovarían carcinoma. Int J Gynecol Cáncer. 1995;5:269-274), cáncer de colon (Starzynska T, Marsh PJ, Schofield PF, Roberts SA, Myers KA, Stern PL, Prognostic significance of 5T4 oncofetal antigen expression in colorectal carcinoma. Br J Cáncer. 1994;69:899-902) , cáncer del cuello uterino (Jones H, Robert G, Hole N, McDicken IW, Stern P. Investigation of expression of 5T4 antigen in cervical cáncer. Br J Cáncer. 1990;6:69-100) , cáncer gástrico (Starzynska T. Rahi V, Stern PL. expression of 5T4 antigen in colorectal and gastric carcinoma. Br J Cáncer. 1992;66:867-869 and above) y cáncer pulmonar (Forsberg G, Ohlsson L, Brodin T, et al. Theraphy of human non-small-cell lung carcinoma using amtibody targeting of modified superantigen . Br J Cáncer. 2001;85:129-136) . También se ha demostrado una asociación con el progreso de la enfermedad, específicamente metástasis (Mulder WM, Stern PL, Stukart MJ, et al. Low intercellular adhesión molecule 1 and high 5T4 expression on tumor cells correlate with reduced disease-free survival in colorectal carcinoma patients. Clin Cáncer. 1997,3:1923-1930 and Starzynska T, Wiechowska-Kozlowska A, arlicz Ka, et al. 5T4 oncofetal antigen in gastric carcinoma and its clinical significance . Eur J Gastroenterol Hepatol . 1998;10:479-484. and Naganuma H, Kono K, Mori Y, et al. Oncofetal antigen 5T4 expression as a prognostic factor in patients with gastric cáncer. Anticancer Res. 2002;22:1033-1038) . Puesto que la expresión de 5T4 sobre tejidos normales en contraste con lesiones cancerosas está restringido (Ali A, Langdon J, Stern PL, Partidge M. The pattern of expression of 5T4 oncofoetal antigen on normal, dysplastic and malignant oral mucosa. Oral Oncol . 2001;37:57-64) , se ha sugerido a 5T4 como un antígeno objetivo adecuado para el tratamiento dirigido contra el cáncer (Woods AM, ang W, Shaw DM, et al. Characterization of the murine 5T4 oncofoetal antigen: a target for immunotherapy in cáncer. Biochem J. 2002;366:353-365 and Hole N, Stern PL. Isolation and Characterization of 5T4 , A tumor-associated antigen. Int J Cáncer, 1990;45:179-184) .

Los tratamientos basados en anticuerpo requieren un antígeno objetivo unido firmemente a la superficie de células cancerosas con el fin de que sea activo. Por unión a la superficie objetivo, el anticuerpo puede suministrar, directa o indirectamente, una señal mortal a la célula cancerosa. Como se requiere para un escenario de tratamiento ideal, el antígeno objetivo 5T4 está presente de modo abundante y es accesible sobre células cancerosas específicas y está ausente, está cubierto o es mucho menos abundante en células normales .

Aún así, aunque el antígeno 5T4 se ha identificado como un objetivo de oncología hace más de 20 años, no se ha aprobado inmunoterapia anti-5T4 para tratar cáncer.

En consecuencia, existe una clara necesidad de una sustancia terapéutica eficaz dirigida a este antígeno.

En consecuencia, se proporciona en la presente un medio y métodos para la solución de este problema en forma de una molécula de unión biespecífica con un dominio a células citotóxicas, es decir, linfocitos T citotóxicos y con un segundo dominio de unión a 5T4 en la superficie de células tumorales .

En un aspecto, la presente invención proporciona, en una primera modalidad, una molécula de unión biespecífica que comprende un primero y un segundo dominios de unión, (a) en donde el primer dominio de unión es capaz de unión al conjunto 4 de epítopo de 5T4 ; y (b) en donde el segundo dominio de unión es capaz de unión al complejo receptor de CD3 en linfocitos T; en donde el conjunto 4 de epítopo corresponde al dominio de proteína extracelular de 5T4 formado por residuos aminoácidos 170 a 222 de la secuencia humana, como se muestra en la SEC ID NO: 2.

El antígeno oncofetal 5T4 es una glucoproteína repetida 72 kDa rica en leucina (LRR, por sus siglas en inglés) que pertenece al grupo de proteínas transmembranales tipo 1. Además, el antígeno 5T4 es una proteína altamente N-glucosilada con siete sitios de glucosilación unidos N de consenso putativos en el dominio extracelular (Shaw et al. Biochem. J. 363 (2002) 137-145) .

El antígeno 5T4 extracelular maduro se puede estructurar por sus elementos basados en aminoácidos: una secuencia repetida rica en serina en la parte N-terminal (SRR; 22aa) , seguida por un área no definida de 36 aminoácidos de longitud que contiene cuatro cisteínas, tres secuencias repetidas ricas en leucina (LRR 1-3) adyacentes de 24, 24 y 23 aminoácidos de longitud, respectivamente, un segmento hidrofílico de 45 aa seguido por tres secuencias repetidas más ricas en leucina (LRR 4-5) de 24, 24 y 1 + 23 aminoácidos de longitud, respectivamente, un segundo segmento no definido de 53 aa con cuatro cisteínas más el cual finalmente es seguido por una última secuencia repetida rica en leucina (LRR 7) de 22 + 4 aminoácidos de longitud (véase la figura 1 para una ilustración de la estructura 5T4) .

Puesto que no hay una estructura cristalina disponible para el antígeno 5T4 , en la figura 1 se muestra una estructura hipotética, en base en la comparación estructural con la estructura cristalina de secuencias repetidas ricas en leucina de proteína de lamprea en la cual cada secuencia repetida rica en leucina forma un giro de una hélice de 360 grados de 23 aa de longitud (Kim et al. J. Biol . Chem. 282 (2007) 6726-6732) ; tres LRR en una hilera pueden de esta manera formar un tubo o barril pequeño. También es posible una estructura más compleja por interacción de las cisteínas localizadas en dos segmentos estructuralmente no definidos, lo cual puede provocar doblado de la totalidad de la región extracelular posiblemente que lleva a la parte N-terminal cercana a la membrana celular. Hemos utilizado y secuenciado N-terminal de 5T4 humana para identificar el aminoácido T35 en la proteína inmadura el cual se encuentra en la parte de aminoácido más N-terminal de la proteína madura después de escisión del péptido líder N-terminal. Se ha utilizado una estructura hipotética de 5T4 para diseñar los experimentos ue se muestran en los ejemplos que se presentan en la figura 1.

La lisis redirigida de células objetivo por medio del reclutamiento de linfocitos T por moléculas biespecíficas involucra formación de sinapsis citolítica y suministro de perforina y granzymas . Los linfocitos T acoplados son capaces de lisis de células objetivo en serie y no son afectados por mecanismos de escape inmunitario que interfieren con el procesamiento y presentación del antígeno peptídico, o diferenciación de linfocitos T clónales. Para el MCSP (siglas en inglés para melanoma asociado a proteoglucano de sulfato de condroitina) de antígeno tumoral se ha descrito que, pese a la afinidad de unión similar a MCSP, las moléculas de anticuerpo biespecíficas respectivas difieren en gran medida en su potencia de lisis redirigida de células objetivo CHO transfectadas de manera estable con MCSP humano de longitud completa. Se ha corroborado un efecto de distancia de epítopo indicando que la posición de un epítopo en un antígeno de superficie celular es un factor importante para la potencia de moléculas de anticuerpo biespecíf icas , es decir, la lisis de células objetivo por moléculas de anticuerpo biespecíficas unidas de manera aproximada a la membrana mejora ante la omisión de dominios MCSP más distales (Blümel et al. Cáncer Immunol Immunother. 2010; 59(8), 1197) . Informado de esta manera, una persona experta en el ámbito quien busque crear un potente anticuerpo biespecífico estaría motivado a buscar enlazantes con alta afinidad para epítopos de 5T4 los cuales estén cercanos a la membrana.

Además, el experto esperaría que, para la generación de moléculas de unión biespecíficas para la eliminación de células objetivo por células efectoras (mediante el acoplamiento de las células efectora y objetivo) , la potencia de un compuesto se podría incrementar cuando la afinidad del compuesto a la estructura objetivo se incrementa .

En contraste con la expansión del campo, se ha descubierto sorprendentemente que para moléculas de unión para 5T4 con afinidad alta comparable en el intervalo nM para membrana proximal (conjunto 7 de epítopo) y membrana distal (conjunto 4 de epítopo y 2/4) en un contexto biespecíf ico, los enlazantes para el conjunto de epítopo distal a la membrana muestran una potencia significativa mayor en la lisis de células objetivo que expresan 5T4 en comparación con aquellas que se unen a 5T4 en un epítopo más proximal a la membrana. Esto es especialmente sorprendente puesto que la afinidad del aglutinante por 5T4 no se determinó utilizando sistemas artificiales con expresión de antígeno recombinante (por ejemplo, inmovilización de un chip) sino utilizando células viables Scatchard las cuales expresan de manera natural el antígeno 5T4.

Debe hacerse notar que como se utiliza en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo indique en otro sentido. Así, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o más de tales reactivos diferentes y referencia a "el método" incluye referencia a etapas equivalentes y métodos conocidos por aquellos habitualmente expertos en el ámbito que pueden ser modificadas o sustituidas por los métodos que aquí se describen.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION A menos que se indique en otro sentido, el término, "por lo menos" que precede una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada elemento en la serie. Los expertos en el ámbito reconocerán o serán capaces de determinar sin utilizar nada más que la experimentación habitual, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención que se describen en la presente. Estos equivalentes se pretende que están abarcados por la presente invención .

El término "y/o" siempre que se utilice en la presente, incluye el significado de "y", "o" y "a totalidad o cualquier otra combinación de elementos relacionados con este término" .

El término "alrededor" o "aproximadamente", como se utiliza en la presente, significa dentro de 20%, preferiblemente dentro de 10%, y de manera más preferible dentro de 5% de un valor o intervalo dado.

A través de esta descripción y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiere en otro sentido, la palabra "que comprende" y variaciones tales como "comprendido" y "que está comprendiendo" se entenderá que implica la inclusión de un entero o etapa o grupo de enteros o etapas establecidos pero no la exclusión de cualquier otro entero o etapa o grupos de enteros o etapas . Cuando se utiliza en la presente, el término "que comprende" puede ser sustituido con el término "que contiene" o "que incluye" o algunas veces cuando se utiliza en la presente con el término "que tiene" .

Cuando se utiliza en la presente "que consiste de", excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no específico de un elemento que se reivindica. Cuando se utiliza en la presente "que consiste esencialmente de" no excluye materiales o etapas que no alteren materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación.

En cada ocasión en la presente, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente de" y "consistente en" pueden ser sustituido con cualquiera de los otros dos términos.

El término "dominio de unión" caracteriza en relación con la presente invención un dominio de un polipéptido el cual se une/interactúa específicamente con un epítopo objetivo dado (capaz de unirse a/interactuar con un epítopo objetivo dado) . Un "epítopo" es antigénico y por lo tanto el término epítopo algunas veces se denomina en la presente como "estructura antigénica" o "determinante antigénico". Así, el dominio de unión es un "sitio de interacción con antígeno" . El término "sitio de interacción con antígeno" define, de acuerdo con la presente invención, un motivo de un polipéptido el cual es capaz de interactuar específicamente con un antígeno específico o un grupo de antígenos específicos, por ejemplo el antígeno idéntico en especies diferentes. La unión/ interacción también se entiende que define un "reconocimiento específico". En un ejemplo, el polipéptido el cual se une/interactúa específicamente con un epítopo objetivo dado es un anticuerpo y el dominio es una región VH y/o VL de un anticuerpo.

El término "epítopo" se refiere a un sitio en un antígeno al cual se une específicamente un dominio de unión, tal como un anticuerpo o inmunoglobulina o derivado de un anticuerpo de inmunoglobulina. Los epítopos pueden estar conformados a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Un "epítopo lineal" es un epítopo en donde una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal típicamente incluye por lo menos 3 y, de manera más habitual por lo menos 5, por ejemplo aproximadamente 9 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única.

Un "epítopo conformacional " en contraste con un epítopo lineal, es un epítopo en donde la secuencia primaria de los aminoácidos que comprenden el epítopo no es el único componente que define al epítopo reconocido (por ejemplo, un epítopo en donde la secuencia primaria de aminoácidos no necesariamente es reconocida por el anticuerpo que define al epítopo) . Típicamente, un epítopo conformacional comprende un número aumentado de aminoácidos en relación a un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales , el dominio de unión reconoce una estructura tridimensional del antígeno, preferiblemente un péptido o proteína o un fragmento del mismo (en el contexto de la presente invención, el antígeno es para uno de los dominios de unión a la proteína 5T4) . Por ejemplo, cuando la molécula de proteína se naturaliza para formar una estructura tridimensional, algunos aminoácidos y/o la estructura principal polipeptídica que constituyen el epítopo conformacional quedan yuxtapuestos lo que permite que el anticuerpo reconozca al epítopo. Los métodos para determinar conformación de epítopos incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional y cristalografía de rayos X y etiquetado de giro dirigido a sitio y espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica. Además, el ejemplo que se proporciona describe un método adicional para probar si un dominio de unión dado se une a uno o más conjuntos de epítopo de una proteína dada.

Como se utiliza en la presente, el término "conjunto de epítopo" indica la totalidad de epítopos que se encuentran en un tramo contiguo definido de un antígeno.

En un aspecto, un ligando que une antígeno 5T4 humano (por ejemplo, un scFv) se une a un conjunto de epítopos específicos y pierde de manera significativa la capacidad de unión al antígeno cuando el conjunto de epítopos respectivo en la proteína 5T4 humana se cambia con el conjunto de epítopos respectivos de un antígeno 5T4 que no es de primate (por ejemplo, murino) . Un método para probar esta pérdida de unión debido al intercambio con el conjunto de epítopos respectivos de un antígeno 5T4 no humano (por ejemplo, murino) se describe en los ejemplos anexos 1 a 3.

Los términos "que reconoce específicamente", "dirigido a" y "que reacciona con" significa de acuerdo con esta invención que un dominio de unión es capaz de interactuar específicamente con, y/o unirse a por lo menos dos, preferiblemente por lo menos tres, de manera más preferible por lo menos cuatro aminoácidos de un epítopo. La unión se puede ejemplificar por la especificidad del "principio de cerradura y llave".

Como se utiliza en la presente, los términos "que interactúa específicamente", "que se une específicamente" o "unido específicamente" significa que el dominio de unión presenta una afinidad apreciable por una proteína o antígeno particular y, de manera general, no presente reactividad cruzada significativa con otras proteínas o antígenos. El término "apreciable" o unión preferida incluye la unión con una afinidad de 10"6M (KD) o mayor. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de aproximadamente 10"11 a 10~8M, de manera preferible de aproximadamente 10"11 a 10"9M. Si es necesario, la unión no específica se puede reducir sin que afecte sustancialmente la unión específica al hacer variar las condiciones de unión. Se puede probar fácilmente si los dominios de unión reaccionan específicamente o se unen con el objetivo, por ejemplo, al comparar la reacción de uno de los dominios de unión con una proteína o antígeno objetivo, con la reacción de los dominios de unión con otras proteínas o antígenos.

Se considera que la unión específica va a llevarse a cabo por motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. De esta manera, se obtiene la unión como resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria así como el resultado de modificaciones secundarias de las estructuras. La interacción específica del sitio de interacción con antígeno específico puede resultar también en una unión simple del sitio al antígeno. Además, la interacción específica del sitio de interacción con antígeno con su antígeno con su antígeno específico de manera alternativa puede resultar el inicio de una señal, por ejemplo, debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. En un ejemplo, un dominio de unión es un anticuerpo .

El término "no se une esencialmente" significa que un dominio de unión de la molécula de unión biespecífica de la presente invención no se une a otra proteína, es decir, muestra una reactividad cruzada de menos de 30%, preferiblemente 20%, de manera más preferible 10%, de modo particularmente preferible menos de 9, 8, 7, 6 ó 5% con otra proteína .

Los términos "especificidad de especie cruzada" o "reconocimiento de especie cruzada" y "especificidad entre especies", como se utiliza en la presente, indica la capacidad de un dominio de unión para unirse a la misma molécula objetivo en humanos y en especies diferentes a la humana, preferiblemente en especies de primates. De esta manera, la "especificidad de especie cruzada" o "especificidad entre especies" describe reactividad entre especies para la misma molécula X (por ejemplo, 5T4 o 0?3e) expresada en diferentes especies, pero no con una molécula diferente de X (por ejemplo, 5T4 o CD3e) .

En un aspecto, la especificidad de especies cruzadas de los dominios de unión de la invención se limitan a proteínas humanas y sus análogos correspondientes en primates. Por ejemplo, es evidente que la secuencia de aminoácidos 5T4 humana (SEC ID NO: 2) es muy similar a la secuencia de aminoácidos 5T4 de macaco (SEC ID NO: 4) o de mono rhesus (SEC ID NO: 6) . De esta manera, un dominio de unión contra 5T4 de macaco o de mono rhesus probablemente se una a 5T4 humana.

En consecuencia, en una modalidad, un dominio de unión el cual se une a 5T4 humano, en particular al conjunto 4 de epítopo del dominio de proteína extracelular de 5T4 formado por residuos aminoácidos 170 a 222 de la secuencia humana como se muestra en la SEC ID NO : 1, también se une a 5T4 de macaco, en particular al conjunto 4 de epítopo del dominio de proteína extracelular de 5T4 formado por los residuos aminoácidos 170 a 222 de la secuencia de macaco, como se muestra en la SEC ID NO: 4.

Las proteínas (que incluyen fragmentos de la misma, preferiblemente fragmentos biológicamente activos y péptidos, habitualmente con menos de 30 aminoácidos) comprende uno o más aminoácidos acoplados entre si por medio de un enlace peptídico covalente (que resulta en una cadena de aminoácidos) . El término "polipéptido" , como se utiliza en la presente, describe un grupo de moléculas las cuales consisten de más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar adicionalmente multímeros tales como dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, consisten de más de una molécula polipeptídica . Las moléculas polipeptídicas que conforman los dimeros, trímeros, etc., pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes tales como multímeros en consecuencia se denominan como homo- o heterodímeros , homo- o heterotrímeros , etc. Un ejemplo de un heteromultímero es una molécula de anticuerpo la cual, en su forma como se encuentra en la naturaleza, consiste de dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Los términos "polipéptido" y "proteína" también se refieren a polipéptidos/proteínas modificados de manera natural, en donde la modificación se lleva a cabo, por ejemplo, por modificaciones post-traduccionales como glucosilación, acetilación, fosforilación y similares. Estas modificaciones son bien conocidas en el ámbito.

En una modalidad, un primer dominio de unión de una molécula de unión biespecífica es capaz de unirse al conjunto 2 de epítopo y el conjunto de epítopo de 5T4 , en donde el conjunto 2 de epítopo corresponde al dominio de proteína extracelular de 5T4 conformado por los residuos aminoácidos 78 a 138 de la secuencia humana, como se muestra en la SEC ID NO: 2.

Como se indica en la presente en lo anterior, en un aspecto, el primer dominio de unión de la molécula de unión biespecífica es capaz de unión a 5T4 humano y de tití {Callithrix jacchus) , pinche {Saguinus oedipus) o mono ardilla común (Saimirí sciereus) 5T4 y/o el segundo dominio de unión es capaz de unir al humano y de tití (Callithrix jacchus) , pinche (Saguinus oedipus) o mono ardilla común (Saimirí sciereus) CD3 epsilon. De acuerdo con esta modalidad, uno o ambos dominios de unión de la molécula de unión biespecífica de la invención son específicos de especie cruzada para miembros de la orden de mamíferos de primates.

En otra modalidad, la afinidad del primer dominio de unión por 5T4 humana es _<15 nM (preferiblemente _ 10 nM) .

Las moléculas de unión biespecíficas de la invención se unen a un epítopo o conjunto 4 de epí opo o conjuntos 2 y 4 de epítopo mostrando esta alta afinidad por 5T4 han demostrado actividad citotóxica superior con respecto a moléculas de unión biespecífica que se unen a un epítopo en el conjunto 7 de epítopo con afinidades en el mismo intervalo .

En una modalidad, el primero o el segundo dominios de unión se derivan de un anticuerpo. En otra modalidad, ambos dominios de unión se derivan de un anticuerpo.

La definición del término "anticuerpo" incluye modalidades tales como anticuerpos monoclonales , quiméricos, de cadena sencilla, humanizados y humanos así como fragmentos de anticuerpo como, por ejemplo, fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo o derivados comprenden además fragmentos F(ab' >2, F , scFv o anticuerpos de dominio sencillo tales como anticuerpos de dominio o nanocuerpos, anticuerpos de dominio variable único o de dominio variable único de inmunoglobulina que comprenden simplemente un dominio variable, el cual puede ser VHH, VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de las otras regiones V o dominios; véase, por ejemplo, harlow y Lañe (1988) y (1999), loe. cit.; Kontermann and Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 and Little, Recorabinant Antibodies for Inmmunotherapy, Cambridge University Press 2009. Estos dominios variables únicos de inmunoglobulina abarcan no solo un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo aislado sino también polipéptidos más grandes que comprenden uno o más monómeros de una secuencia polipeptídica de dominio variable único de anticuerpo .

Se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en el ámbito para la producción de estos anticuerpos y/o fragmentos. De esta manera, los derivados (de anticuerpo) se pueden producir por peptidomiméticos . Además, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 4,946,778, Kontermann y Dübel (2010), loe. cit. and Little (2009), loe. cit.), se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos para uno o varios polipéptidos elegidos. Además, se pueden utilizar animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados específicos para polipéptidos y proteínas de fusión de esta invención. Para la preparación de anticuerpos monoclonales se puede utilizar cualquier técnica que proporciona anticuerpos producidos por cultivos de línea celular continua. Los ejemplos de estas técnicas incluyen la técnica de hibridoma (Kóhler and Milstein Nature 256 (1975) , 495-497) , la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor, Inmmunology Today 4 (1983) , 72) y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96) . La resonancia de plasmon de superficie, como se utiliza en el sistema BIAcore se puede utilizar para incrementar la eficiencia de anticuerpos de fago los cuales se unen a un epítopo de un péptido objetivo, tal como CD3 epsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol . Methods 183 (1995), 7-13) . También se considera en el contexto de esta invención ue el término "anticuerpo" comprende construcciones de anticuerpo las cuales se pueden expresar en un hospedador como se describe en la presente más adelante, por ejemplo construcciones de anticuerpo las cuales pueden ser transíectadas y/o transducidas , por ejemplo, por medio de virus o vectores plasmídicos .

Además, el término "anticuerpo" como se utiliza en la invención también se relaciona con derivados o variantes de los anticuerpos descritos en la presente los cuales muestran la misma especificidad que los anticuerpos descritos. Los ejemplos de "variantes de anticuerpo" incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos "madurados por afinidad" (véase, por ejemplo, Hawkins et al., J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) y mutantes de anticuerpo con una o varias funciones efectoras alteradas (véanse, por ejemplo, la patente de E.U.A. 5,648,260, Kontermann and Dübel (2010) , loe. cit. and Little (2009), loe. cit.) .

Los términos "dominio que une antígeno" y "fragmento que une antígeno" y "región que une anticuerpo", cuando se utilizan en la presente se refieren a una parte de la molécula de anticuerpo que comprende aminoácidos responsables por la unión específica entre anticuerpo y antígeno. La parte del antígeno que es reconocida específicamente y unida al anticuerpo se denomina como el "epítopo", como se describe en la presente en lo anterior. Como se menciona en lo anterior, el dominio que une antígeno típicamente puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo; no obstante, no necesita comprender a ambas. Por ejemplo, los fragmentos Fd tienen dos regiones VH y con frecuencia retienen cierta función de unión antígeno del dominio de unión antígeno intacto. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen: (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1 ; (2) un fragmento F(ab' )2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), el cual tiene un dominio VH; (6) una región determinadora de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) aislada, y (7) una cadena Fv sencilla (scFv) . Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH son codificados por genes separados, se pueden unir utilizando métodos recombinantes , por un enlazante sintético que permite que se elaboren como una cadena de proteína única en la cual las regiones VL y VH se parean para formar moléculas monovalentes (conocido como Fv de cadena sencilla (scFv) ; véase, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc . Nati. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en el ámbito y los fragmentos se evalúan para función de la misma manera que los anticuerpos intactos.

El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se produzcan de modo natural y/o modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, isomerizaciones , amidaciones) que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, están dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraste con preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) las cuales típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un dominio único en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en la medida en que pueden ser sintetizados por el cultivo de hibridoma, sin contaminarse por otras inmunoglobulinas . El adjetivo "monoclonal" indica un carácter del anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no se debe considerar que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a ser utilizados de acuerdo con la presente invención se pueden elaborar por el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975) o se pueden elaborar por los métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. número 4,816,567) . Los "anticuerpos monoclonales 11 también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpo de fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . , 222: 581-597 (1991), por ej emplo .

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en las cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o de las cadenas son idénticas u homologas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos en la medida en que presenten la actividad biológica deseada (patente de E.U.A. número 4,816,567; Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) . Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados " que comprenden secuencia que unen antígeno del dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, cercopitecos , monos, etc.), y secuencias de región constante humanas.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab 1 , F(ab' )2 u otras secuencias de anticuerpos que unen antígenos) de secuencias principalmente humanas, las cuales contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el cual los residuos de una región hipervariable (también CDR) del receptor está sustituida por residuos a una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de infraestructura (FR, por sus siglas en inglés) Fv de la inmunoglobulina humana están sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Además, los "anticuerpos humanizados", como se utilizan en la presente también comprende residuos los cuales se encuentran en el anticuerpo receptor y no en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para ajustar aún más y optimizar el funcionamiento del anticuerpo. El anticuerpo humanizado de manera óptima también comprenderá por lo menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) ; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992) .

El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas en el ámbito que incluyen, por ejemplo, las descritas por Kabat et al., (véase Kabat et al. (1991) loe. cit.) . Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo) , por ejemplo en las CDR, y en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones sustituidas con un residuo aminoácido que no es codificado por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo generado in vitro" se refiere a un anticuerpo en donde la totalidad o parte de la región variable (por ejemplo, por lo menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunes (por ejemplo, en una presentación de fago in vitro, chip de proteína o cualquier otro método en el cual las secuencias candidatas pueden ser probadas para determinar su capacidad para unirse a un antígeno) . Este término por lo tanto preferiblemente excluye secuencias generadas por rearreglo genómico en una célula inmunitaria.

Mediante los términos "biespecífico" o "anticuerpo bifuncional" se trata de un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecífieos se pueden producir por una diversidad de métodos que incluye fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab 1. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol . 79:315-321 (1990) . Numerosos métodos conocidos por aquellos expertos en el ámbito están disponibles para obtener anticuerpos o fragmentos de los mismos que unen antígeno. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir utilizando métodos de ADN recombinante (patente de E.U.A. 4,816,567). Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir por generación de hibridomas (véase, por ejemplo, Kohler and Milstein (1975) Nature, 256:495-499) de acuerdo con métodos conocidos. Los hibridomas conformados de esta manera después se someten a cribado utilizando métodos convencionales tales como análisis inmunosorbente unido a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) y análisis de resonancia de plasmón de superficie (BIAC0REMR) , para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno especificado. Cualquier forma de antígeno especificado se puede utilizar como el inmunógeno, por ejemplo, antígeno recombinante , formas que se encuentran de modo natural, cualquier variante o fragmento de la misma así como un péptido antigénico del mismo.

Un método ejemplar para elaborar anticuerpos incluyen el cribado de bibliotecas de expresión de proteínas, por ejemplo, bibliotecas de presentación de fago o de ribosoma . La presentación de fago se describe, por ejemplo en Ladner et al., patente de E.U.A. número 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al., (1991) Nature, 352:624-628.

Además del uso de las bibliotecas de presentación, el antígeno especificado se puede utilizar para inmunizar un animal no humano, por ejemplo un roedor, un ratón, hámster o rata. En una modalidad, el animal no humano incluye por lo menos una parte de un gen para inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible manipular cepas de ratones deficientes en producción de anticuerpos de ratón con fragmentos grandes de los loci de Ig humana. Utilizando la tecnología de hibridoma, los anticuerpos monoclonales específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada se puede producir y seleccionar. Véase, por ejemplo, XENOMOUSEMR, Green et al., (1994) Nature Genetics 7:13-21; documento de E.U.A. 2003/0070185, O 96/34096 y 096/33735.

Se puede obtener un anticuerpo monoclonal a partir de un animal no humano y después se puede modificar, por ejemplo humanizar, desinmunizar, quimérico y se puede producir utilizando técnicas de ADN recombinante conocidas en el ámbito. Se han descrito una diversidad de enfoques para la elaboración de anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., patente de E.U.A. número 4,816,567; Boss et al., patente de E.U.A. número 4,816,397, Tanaguchi et al., EP 171496; EP 173494, GB 2177096. También se pueden producir anticuerpos humanizados, por ejemplo, utilizando ratones transgénicos que expresan genes para la cadena pesada y ligera humana, pero que son incapaces de expresar los genes para cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de ratón endógenos. Winter describe un método de injertado por CDR ejemplar que puede ser utilizado para preparar los anticuerpos humanizados que aquí se describen (patente de E.U.A. número 5,225,539). La totalidad de las CDR de un anticuerpo humano particular se pueden sustituir con por lo menos una porción de una CDR no humana o con únicamente parte de las CDR pueden ser sustituidas con CDR no humanas. Únicamente es necesario sustituir el número de las CDR requeridas para unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se pueden generar al sustituir secuencias del dominio variable Fv que no están involucrados directamente en la unión de antígeno con secuencias equivalentes de los dominios variables Fv humanos. Los métodos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se proporcionan por Morrison, (1985), Science 229:1202-1207; por Oi et al., (1986), BioTechniques 4:214 y por los documentos de E.U.A. 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205; y 6,407,213. Estos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican para la totalidad o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina desde por lo menos una cadena pesada o ligera. Estos ácidos nucleicos se pueden obtener a partir de un hibridoma produciendo un anticuerpo contra un objetivo predeterminado, como se describe en lo anterior, así como de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica para la molécula de anticuerpo humanizada después se puede clonar en un vector de expresión apropiado.

Un anticuerpo humanizado se puede optimizar por la introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de línea germinal y/o retromutaciones . Estas moléculas de inmunoglobulina alteradas pueden elaborarse por cualquiera de las diversas técnicas conocidas en el ámbito (véase, por ejemplo, Teng et al., Proc. Nati. Acad. Sci . U.S. A., 80:7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol . , 92: 3-16, 1982, y se pueden elaborar de acuerdo con las enseñanzas del documento EP 239 400) .

Un anticuerpo o fragmento del mismo también se puede modificar por reducción específica de epítopos de linfocito T humanos o "desinmunización" por los métodos descritos en O 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo se pueden analizar para péptidos que se unen a CPH clase II. Estos péptidos presentan epítopos de linfocito T potenciales (como se define en WO 98/52976 y WO 00/34317) . Para detección de epítopos de linfocitos T potenciales, se puede aplicar un enfoque de elaboración de modelos por computadora denominados "enhebrado de péptido" y, además de la base de datos de los péptidos de unión CPH clase II humanos pueden ser analizados en búsqueda de motivos presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 halotipos DR de CPH clase II mayores y por lo tanto constituyen epítopos potenciales de linfocitos T. Los epítopos potenciales de linfocitos T pueden ser eliminados al sustituir números pequeños de residuos aminoácidos en los dominios variables o, preferiblemente, por sustitución de un solo aminoácido. Típicamente se realizan sustituciones conservadoras. Con frecuencia, pero no de manera explosiva, se puede utilizar un aminoácido común a una posición en secuencias de anticuerpo de línea germinal humana. Las secuencias de línea germinal humanas se describen, por ejemplo, en Tomlinson, et al., (1992) J. Mol. Biol. 227 :776-798 ; J. Mol. Biol . 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Inmunol. Today Vol . 16 (5) : 237-242; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638. El directorio V BASE proporciona un directorio extenso de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana (compilada por Tomlinson, LA. et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido) . Estas secuencias se pueden utilizar como una fuente de secuencia humana, por ejemplo para regiones de infraestructura y las CDR. Las regiones de infraestructura humanas de consenso también se pueden utilizar, por ejemplo como se describe en la patente de E.U.A. número 6,300,064.

El pareamiento de una VH y una VL juntas forma un sitio único que une antígeno. El dominio CH más proximal a VH se denomina como CH1. Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace disulfuro covalente mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces disulfuro, dependiendo del isotipo de cadena H. Los dominios VH y VL consisten de cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas denominadas regiones de infraestructura (FR1, FR2 , FR3 y FR4) , las cuales forman un andamiaje para las tres regiones de las secuencias hipervariables (regiones determinadoras de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) . Las CDR contienen la mayor parte de los residuos responsables para interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Las CDR se denominan como CDR1, CDR2 y CDR3. En consecuencia, las CDR constitutivas de la cadena pesada se denominan como Hl, H2 y H3 mientras que las CDR constitutivas de la cadena ligera se les denomina como Ll, L2 y L3.

El término "variable" se refiere a las porciones de los dominios de i munoglobulina que presentan variabilidad en su secuencia y que están involucrados en determinar la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, "uno o varios de los dominios variables") . La variabilidad no está distribuida uniformemente a través de los dominios variables y los anticuerpos; se concentra en subdominios de cada una de las regiones variables de cadena pesada y ligera. Estos subdominios se denominan regiones "hipervariables" o "regiones determinadoras de complementariedad" (las CDR) . Las porciones más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se les denomina regiones de "infraestructura" (FRM, por sus siglas en inglés) . Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera que se encuentran de manera natural comprenden cuatro regiones RFM, que en gran medida adoptan una configuración de lámina ß, conectadas por tres regiones hipervariables, las cuales forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por la FR y, con las regiones variables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio que une antígeno (véase Kabat et al., loe. cit.) . Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión de antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras tales como, por ejemplo, citotoxicidad mediada por células, dependiente de anticuerpo y activación de complemento .

También se prefiere para la molécula de unión biespecífica de la invención que el primero y segundo dominio forman una molécula que se selecciona del grupo de (scFv)2 (dominio único mAb)2, scFv dominio único mAb, diacuerpo u oligómeros de los mismos.

Los términos "CDR" y su plural ("los CDR") se refieren a una región determinadora de complementariedad (CDR) de la cual tres constituyen el carácter de unión de una región variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y tres constituyen el carácter de unión de una región variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) . Las CDR contribuyen a Ia actividad funcional de la molécula de anticuerpo y están separadas por secuencias de aminoácidos que comprenden regiones de andamiaje o de infraestructura. Los límites de CDR exactos por definición y las longitudes se someten a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Las CDR por lo tanto se pueden denominar con respecto a Kabat, Chothia, contacto o cualquier otra definición de límite, que incluye el sistema de numeración que se describe en la presente. Pese a los límites diferentes, cada uno de estos sistemas tiene cierto grado de superposición en lo que constituyen lo que se denominan las "regiones hipervariables" dentro de las secuencias variables. Las definiciones de CDR de acuerdo con estos sistemas por lo tanto pueden diferir en cuanto a longitud y áreas límite con respecto a la región de infraestructura adyacente. Véase, por ejemplo, Kabat, Chothia y/o MacCallum et al., (Kabat et al., loe. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol. 1987, 196: 901; y MacCallum et al., J. Mol. Biol. 1996, 262: 732) . No obstante, se prefiere la numeración de acuerdo con los denominados sistemas de Kabat.

El término "aminoácido" o "residuo aminoácido" típicamente se refiere a un aminoácido que tiene su definición reconocida en el ámbito tal como un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R) ; asparagina (Asn o N) ; ácido aspártico (Asp o D) ; cisterna (Cys o C) ; glutamina (Gln o Q) ; ácido glutámico (Glu o E) ; glicina (Gly o G) ; histidina (His o H) ; isoleucina (He o I) ; leucina (Leo o L) ; lisina (Lys o K) ; metionina (Met o M) ; fenilalanina (Phe o F) ; línea pro (Pro o P) ; serina (Ser o S) ; treonina (Thr o T) ; triptofano (Trp o W) ; tirosina (Tyr o Y) ; y valina (Val o V) , aunque se pueden utilizar, según se desee, aminoácidos modificados, sintéticos o raros. Generalmente, los aminoácidos se pueden agrupar por presentar una cadena lateral no polar (por ejemplo Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val) ; una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo Asp, Glu) ; una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, Arg, His, Lys) ; o una cadena lateral polar sin carga (por ejemplo Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr) .

El término "región hipervariable" también conocida como "regiones determinadoras de complementariedad" o " CDR" , cuando se utilizan en la presente, se refieren a los residuos aminoácidos de un anticuerpo los cuales están (habitualmente tres o cuatro regiones cortas de variabilidad de secuencia extrema) dentro del dominio de la región V de una inmunoglobulina la cual forma el sitio que une antígeno y son los determinantes principales de especificidad a antígeno. Existen por lo menos dos métodos para identificar los residuos de CDR: (1) un enfoque basado en variabilidad de secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat et al., loe. cit.); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) . No obstante, en la medida en que dos técnicas de identificación de residuos definen regiones de superposición, pero no regiones idénticas, se pueden combinar para definir una CDR híbrida. No obstante, en general, los residuos de CDR preferiblemente se identifican de acuerdo con lo que se denomina sistema (de numeración) de Kabat .

El término "región de infraestructura" se refiere a las porciones reconocidas en el ámbito de una región variable de anticuerpo que existen entre las CDR más divergentes (es decir, hipervariables) . Tales regiones de infraestructura típicamente se denominan como infraestructuras 1 a 4 (FR1, FR2, FR3 y FR4 ) y proporcionan un andamiaje para la presentación de seis CDR (tres de la cadena pesada y tres de la cadena ligera) en un espacio tridimensional para formar una superficie que une antígeno.

Típicamente, las CDR forman una estructura de bucle que puede ser clasificada como una estructura canónica. El término "estructura canónica" se refiere a la conformación de cadena principal que es adoptada por los bucles de unión a antígeno (las CDR) . A partir de estudios estructurales comparativos se ha encontrado que cinco de los seis bucles que unen antígeno tienen únicamente un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada estructura canónica puede se caracterizada por los ángulos de torsión de la estructura principal polipeptídica . Los bucles correspondientes entre anticuerpos por lo tanto pueden tener estructuras tridimensionales muy similares pese a la alta variabilidad de la secuencia de aminoácidos en la mayor parte de los bucles (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol . , 1987, 196:901; Chothia et al, Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol . 1996, 263: 800, cada una de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad) . Además, existe una relación entre la estructura de bucle adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular se determina por la longitud del bucle y los residuos aminoácidos que se encuentran en posiciones clave dentro del bucle así como dentro de la infraestructura conservada (es decir, fuera del bucle) . La asignación a una clase canónica particular por lo tanto se puede realizar en base en la presencia de estos residuos aminoácidos clave. El término "estructura canónica" también puede incluir consideraciones respecto a la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, como se catalogan por Kabat (Kabat et al, loe. cit.) . El esquema de numeración (sistema) de Kabat es un estándar adoptado ampliamente para numeración de residuos aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo de una manera consistente y es el esquema preferido aplicado en la presente invención como también se menciona en otra parte en este documento. También se pueden utilizar consideraciones estructurales adicionales para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, aquellas diferencias no reflejadas completamente por la numeración de Kabat se pueden describir por el sistema de numeración de Chothia et al., y/o se pueden mostrar por otras técnicas, por ejemplo, cristalografía y elaboración de modelos computacionales bidimensionales o tridimensionales. En consecuencia, una secuencia de anticuerpos dada se puede aplicar en una clase canónica lo que permite, entre otras cosas, identificar las secuencias de chasis apropiadas {por ejemplo, basadas en un deseo de incluir una diversidad de estructuras canónicas en una biblioteca} . La numeración de Kabat de secuencias de aminoácidos de anticuerpo y consideraciones estructurales como se describe por Chothia et al., loe. cit. y sus implicaciones para construir aspectos canónicos de la estructura de anticuerpos se describen en la literatura.

La CDR3 típicamente es la fuente más grande de diversidad molecular dentro del sitio que une anticuerpo. Por ejemplo, H3 puede ser tan corta como dos residuos aminoácidos o mayor de 26 aminoácidos. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en el ámbito. Para una revisión de la estructura de anticuerpos véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds . Harlow et al., 1988. Una persona experta en el ámbito reconocerá que cada estructura de subunidad, por ejemplo una estructura CH, VH, CL, VL, CDR o FR comprende fragmentos activos, por ejemplo, la porción de la subunidad VH, VL o CDR que se une al antígeno, es decir, el fragmento que une antígeno o, por ejemplo, la porción de la subunidad CH que se une y/o que activa, por ejemplo, un receptor Fe y/o complemento. Las CDR típicamente se refieren como las CDR de Kabat, como se describe en Sequences of Proteins of immunological interest, US Department of Health and Human Services (1991) , editores, Kabat et al. Otro estándar para caracterizar el sitio de unión a antígeno es con referencia a los bucles hipervariables, como se describe por Chothia et al. Véase, por ejemplo, Chothia et al. (1987; J. Mol. Biol . 227:799-817; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638) . Otro estándar adicional es la definición de AbM utilizada por el programa de elaboración de modelos de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, de manera general, por ejemplo, Protein Sequences and Structure Analysis of Antibody Variable Domains: in: Antibody Engineering Lab Manual (Ed. : Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg) .

Las modalidades descritas con respecto a las CDR de Kabat de manera alternativa se pueden implementar utilizando relaciones descritas similares con respecto a los bucles hipervariables de Chothia o a los bucles definidos por AbM. ^a secuencia de genes de anticuerpo después de ensamblado y mutación somática varía en gran medida y estos genes variados se calcula que codifican para 1010 moléculas de anticuerpo diferentes ( Immunoglobulin Genes, 2nd ed. , eds . Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995) . En consecuencia, el sistema inmunitario proporciona un repertorio de inmunoglobulinas . El término "repertorio" se refiere a por lo menos una secuencia nucleotídica derivada total o parcialmente de por lo menos una secuencia que codifica para por lo menos una globulina. Una o varias de las secuencia se pueden generar por rearreglo in vivo de los segmentos V, D y J de las cadenas pesadas y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. De manera alternativa, una o varias de las secuencias se pueden generar de una célula en respuesta al tipo de rearreglo que se produzca, por ejemplo, estimulación in vitro. De manera alternativa parte o la totalidad de una o varias de las secuencias se pueden obtener por empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis y otros métodos, véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. 5,565,332. Un repertorio puede incluir únicamente una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, que incluye aquellas en una colección genéticamente diversa.

En una modalidad, el primer dominio de unión de una molécula de unión biespecífica comprende una región VL y una región VH, en donde la región VH comprende una CDR-H3 que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 15, 25, 35, 49, 89, 99, 109, 119, 129, 143. 157 y 167.

En otra modalidad, la molécula de unión biespecífica de la invención comprende una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 y una región VH que comprende CDR-H1. CDR-H2 y CDR-H3 que se selecciona de: (a) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 16, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 17, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 18, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 13, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 14 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 15; (b) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 26, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 17, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 28, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 23, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 24 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 25; (c) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 36, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 37, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 38, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 33, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 34 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 35; (d) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 50, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 51, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 52, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 47, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 48 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 49; (e) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 90, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 91, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 92, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 87, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 88 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 89; (f) CDR-Ll como se muestra en la SEC ID NO: 100, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 101, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 102, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 97, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 98 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 99; (g) CDR-Ll como se muestra en la SEC ID NO: 110, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 111, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 112, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 107, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 108 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 109; (h) CDR-Ll como se muestra en la SEC ID NO: 120, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO : 121, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 122, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 117, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 118 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 119; (i) CDR-Ll como se muestra en la SEC ID NO: 130, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 131, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 132, CDR-Hl como se muestra en la SEC ID NO: 127, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 128 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 129; (j) CDR-Ll como se muestra en la SEC ID NO: 144, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 145, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 146, CDR-Hl como se muestra en la SEC ID NO: 141, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 142 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 143; (k) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 158, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 159, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 160, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 155, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 156 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 157; (1) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 168, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 169, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 170, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 165, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 166 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 167.

En otra modalidad, el primer dominio de unión de la molécula de unión biespecífica comprende una región VL que se selecciona del grupo que consiste de una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 86, SEC ID NO: 96, SEC ID NO: 106, SEC ID NO: 116, SEC ID NO: 126, SEC ID NO: 140, SEC ID NO: 154 Y SEC ID NO: 164.

De manera alternativa, el primer dominio de unión comprende una región VH que se selecciona del grupo que consiste de una región VH como se muestra en la región VH como se muestra en la SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 85, SEC ID NO: 95, SEC ID NO: 105, SEC ID NO: 115, SEC ID NO: 125, SEC ID NO: 139, SEC ID NO: 153 y SEC ID NO: 163.

En otra modalidad, el primer dominio de unión de la molécula de unión biespecífica comprende una región VL y una región VH que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 12 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: : 11; (b) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 22 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: : 21; (c) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 32 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: : 31; (d) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 46 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: : 45; (e) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 86 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 85; (f) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 96 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 95; (g) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 106 una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 105 (h) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 116 una región VH como se mues ra en la SEC ID NO: 115; (i) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 126 una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 125; (j) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 140 una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 139; (k) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 154 una región VH como se muestra <en la SEC ID NO: 153; y (1) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 164 una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 163.

En un ejemplo, el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 94, SEC ID NO: 104, SEC ID NO: 114, SEC ID NO: 124, SEC ID NO: 133, SEC ID NO: 138, SEC ID NO: 147. SEC ID NO: 152 y SEC ID NO: 162.

La molécula de unión biespecífica de la presente invención preferiblemente es una molécula de unión biespecífica "aislada". El término "aislado", cuando se utiliza para describir la molécula de unión biespecífica descrita en la presente, significa una molécula de unión biespecífica que ha sido identificada, separada y/o recuperada de un componente de su ambiente de producción. Preferiblemente, la molécula de unión biespecífica aislada está libre de asociación con todos los demás componentes de su ambiente de producción. Los componentes contaminantes de su ambiente de producción tales como los que resultan de células transfectadas recombinantes , son materiales que habitualmente interfieren con el diagnóstico o usos terapéuticos para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, la molécula de unión biespecífica estará purificada (1) en un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. No obstante, habitualmente un anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Las modificaciones de secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión biespecíf icas descritas en la presente se contemplan. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos de las moléculas de unión biespecíficas se preparan al introducir cambios nucleotídicos apropiados en el ácido nucleico de moléculas de unión biespecí ficas o por síntesis peptídica.

Estas modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de las moléculas de unión biespecíficas . Cualquier combinación de reducción, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final con la condición de que la construcción final presente las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar el proceso post-traduccional de las moléculas de unión biespecíficas , tal como cambio en el número o posición de sitios de glucosilación. Preferiblemente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos pueden estar sustituidos en una CDR mientras que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 19, 20 ó 25 aminoácidos pueden estar sustituidos en las FR. Las sustituciones preferiblemente son sustituciones conservadoras como se describe en la presente. De manera adicional o alternativa, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos se pueden insertar o suprimir en cada una de las CDR (por supuesto, dependiendo de su longitud) mientras que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 19, 20 ó 25 aminoácidos se pueden insertar o suprimir en cada uno de los FR.

Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones de las moléculas de unión biespecíficas que son lugares preferidos para mutagénesis se denominan "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo dentro de la molécula de unión biespecífica son identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y son sustituidos por un aminoácido neutro o cargado negativamente (de manera más preferible, alanina o polialanina) para alterar la interacción de los aminoácidos con el epítopo.

Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones después se refinan al introducir variantes adicionales u otras en, o para los sitios de sustitución. Así, mientras el sitio para introducción de la variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación, por si misma, no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo mutación de exploración de ala o aleatoria en un codón o región objetivo y las variantes de moléculas de unión biespecíficas expresadas se criban para la actividad deseada.

Preferiblemente, la inserciones en la secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminal que varían en longitud de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez residuos a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos sencillos o múltiples. Una variante de inserción de la molécula de unión biespecífica incluye la fusión de la parte N- o C-terminal del anticuerpo a una enzima o una fusión a un polipéptido el cual incrementa la vida media en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes preferiblemente tienen por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez residuos aminoácidos en la molécula de unión biespecífica sustituidos por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen las CDR de la cadena pesada y/o ligera, en particular las regiones hipervariables , pero también se contemplan alteraciones de FR en la cadena pesada y/o ligera.

Por ejemplo, si una secuencia de CDR abarca 6 aminoácidos, se considera que uno, dos o tres de estos aminoácidos están sustituidos. De manera similar, si una secuencia de CDR abarca 15 aminoácidos se considera que uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos aminoácidos están sustituidos .

En general, si los aminoácidos están sustituidos en uno o más o en la totalidad de las CDR de la cadena pesada y/o ligera, se prefiere que la secuencia "sustituida" obtenida de esta manera sea por lo menos 60%, de manera más preferible 65%, incluso de manera más preferible 70%, de manera particularmente preferible 75%, de manera más particularmente preferible 80% idéntica a la secuencia CDR "original". Esto significa que es dependiente de la longitud de la CDR con el grado en el cual es idéntica a la secuencia "sustituida". Por ejemplo, una CDR que tiene 5 aminoácidos preferiblemente es 80% idéntica a su secuencia sustituida con el fin de tener por lo menos un aminoácido sustituido. En consecuencia, las CDR de la molécula de unión biespecífica pueden tener grados de identidad diferentes para sus secuencias sustituidas, por ejemplo, CDRL1 puede tener 80% mientras que CDRL3 puede tener 90%.

Las sustituciones (o reemplazos) preferidos son sustituciones conservadoras. No obstante, cualquier sustitución (incluyendo sustituciones) son conservadoras o uno o más de las sustituciones "ejemplares" enumeradas en la tabla 1 más adelante) se consideran en la medida en que la molécula de unión biespecífica retenga su capacidad para unirse a 5T4 por medio de su primer dominio de unión y a CD3e por medio de su segundo dominio de unión y/o sus CDR tengan una identidad para después las secuencias sustituidas (por lo menos 60%, de manera más preferible 65%, incluso de manera más preferible 70%, de manera particularmente preferible 75%, de manera más particularmente preferible 80% idéntica a la secuencia de CDR "original") .

Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla I bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la tabla 1, o como se describe adicionalmente en lo siguiente con referencia a las clases de aminoácidos, se pueden introducir y los productos se pueden cribar para una característica deseada.

TABLA I - Sustituciones de aminoácido Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la molécula de unión de la presente invención se llevan a cabo al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto o al mantener (a) la estructura de la estructura principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación en lámina o helicoidal, (b) el cargo o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos como se encuentran de manera natural se dividen en grupos en base en las propiedades de cadena lateral común: (1) hidrofóbicas ; norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) neutras hidrofílicas : cys , ser, thr; (3) ácidas: asp, glu; (4) básicas: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro y (6) aromáticos: trp, tyr, phe .

Las sustituciones no conservadoras implicarán cambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo cisteína no involucrado en mantener la conformación adecuada de la molécula de unión biespecífica puede ser sustituido, en general, con serina para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar reticulado aberrante .

Inversamente, uno o varios enlaces cisteína se pueden agregar al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) .

Un tipo particularmente preferido de variantes de sustitución involucran sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . Generalmente, una o varias de las variantes resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo original del cual se han generado. Una manera conveniente de generar estas variantes de sustitución involucra mutación de afinidad utilizando presentación de fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6 a 7 sitios) se mutan para generar toda sustitución de aminoácidos posible en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta manera se presentan de un modo monovalente a partir de partículas de fago filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empacado con cada partícula. Las variantes presentadas en fago después se criban para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en la presente. Con el fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, la mutagénesis por exploración de alanina se puede realizar para identificar residuos de región hipervariable que contribuyan de manera significativa a la unión de antígeno. De manera alternativa o adicional, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el dominio de unión y, por ejemplo, 5T4 humana. Estos residuos de contacto y residuos aledaños son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que se generan estas variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en la presente y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes se pueden seleccionar para desarrollo adicional. 5 Otras modificaciones de la molécula de unión biespecífica se contemplan en la presente. Por ejemplo, la molécula de unión biespecífica se puede unir a uno o una variedad de polímeros no proteináceos , por ejemplo polietilenglicol , polipropilenglicol , polioxialquilenos o 0 copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol.

La molécula de unión biespecífica también puede ser atrapada en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y _5 microcápsulas de poli (metacrilato de metilo, respectivamente) , en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Q Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. , Ed. , (1980) .

Las moléculas de unión biespecíficas descritas en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas . Un "liposoma" es una vesícula pequeña constituida de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo las cuales 5 son útiles para el suministro de un fármaco a un mamífero.

Los componentes de liposoma comúnmente se distribuyen en una conformación de bicapa similar a la distribución lipídica de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en el ámbito tales como los descritos en Epstein et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1995); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); las patentes de E.U.A. números 4,485,045 y 4,544,545; y WO 97/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación mejorada se describen en la patente de E.U.A. número 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles se pueden generar por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab 1 del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol . Chem. 257:286-288 (1982) por medio de una interacción de intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico opcionalmente está contenido dentro del liposoma. Véase Gabizon et al. J. National Cáncer Inst. 81(19) 1484 (1989).

Cuando se utilizan técnicas recombinantes , la molécula de unión biespecífica se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico o es secretada directamente al medio. Si la molécula de unión biespecífica se produce intracelularmente, como una primera etapa, los residuos particulados, ya sea células hospederas o fragmentos lisados deben separarse, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos los cuales son secretados al espacio periplásmico de E. coli.

La composición de molécula de unión biespecífica preparada a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad en donde la cromatografía de afinidad es la técnica de purificación preferida.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de unión biespecífica de la invención.

La molécula de ácido nucleico preferiblemente está comprendida en un vector el cual preferiblemente está comprendida en una célula hospedera. La célula hospedera es, por ejemplo, después de transformación o transfección con la secuencia de ácido nucleico de la invención, capaz de expresar la molécula de unión biespecífica. Para tal propósito la molécula de ácido nucleico está unida operativamente con secuencias de control.

Como se utiliza en la presente, el término "célula hospedera" se pretende que haga referencia a una célula en la cual un ácido nucleico que codifica para la molécula de unión biespecífica de la invención es introducida por medio de transformación, transfección o similar. Debe entenderse que estos términos se refieren no solo a la célula objeto particular sino a la descendencia o descendencia potencial de esta célula. Debido a que algunas modificaciones pueden producirse en generaciones sucesivas debido ya sea a mutación o influencias ambientales, la descendencia, de hecho, puede no ser idéntica a la célula de origen, pero aún así está incluida dentro del alcance del término como se utiliza en la presente .

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "expresión" incluye cualquier etapa involucrada en la producción de una molécula de unión biespecífica de la invención que incluye, pero que no se limita a transcripción, modificación post- transcripcional , traducción, modificación post-traduccional y secreción. El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADM necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operablemente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma . Las células eucarióticas se sabe que utilizan promotores, señales de poliadenilación y mej oradores .

El ácido nucleico está "unido operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o un líder secretor está unido operablemente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador está unido operablemente a una secuencia codificante si altera la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operablemente a una secuencia codificante si está colocado de manera que facilita la traducción. De manera general, "unido operablemente" significa que la secuencia de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguos y en fase de lectura. No obstante, los mejoradores no necesitan estar contiguos. El enlace se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen estos sitios, se utilizan adaptadores o enlazantes oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica habitual.

Las células hospederas adecuadas incluyen células hospederas procariotas y eucariotas que incluyen levaduras, hongos, células de insecto y células de mamífero.

La molécula de unión biespecífica de la invención se puede producir en bacterias. Después de la expresión, la molécula de unión biespecífica de la invención, preferiblemente la molécula de unión biespecífica se aisla de una pasta de células de E. coli en una fracción soluble y se puede purificar, por ejemplo, a través de cromatografía de afinidad y/o exclusión de tamaño. La purificación final se puede llevar a cabo de modo similar al proceso de purificación de anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO. Además de procariotas, los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son adecuados para clonación o expresión de hospedadores para la molécula de unión biespecífica de la invención. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panadero común es la utilizada más comúnmente entre los microorganismos hospedadores eucarióticos inferiores. No obstante, muchos otros géneros, especies y cepas están disponibles comúnmente y son útiles en la presente tales como Schizosaccharomyces pombe,-hospedadores de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K, fragilis (ATCC 12424) , K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickemarii (ATCC 24718), K. waltii (ATCC 56500); K- drosophilarum (ATCC 36906) ; K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402 226) ; Pichia pastoris (EP 183 070) ; Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234) ; Neurospora crassa; Schwanniomyces , tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus hospedadores tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospederas adecuadas para la expresión de la molécula de unión biespecífica glucosilada de la invención, preferiblemente moléculas de unión biespecíficas derivadas de anticuerpo se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células invertebradas incluyen plantas y células de insecto. Numerosas cepas baculovirales y variantes y las células hospederas de insectos premisivas correspondientes de los hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bo byx mori se han identificado. Una diversidad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx morí NPV, y estos virus se pueden utilizar como virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda .

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, frijol de soya, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco también se pueden utilizar como hospedadores. Los vectores de clonación y de expresión útiles en la producción de proteínas en cultivo de células vegetales se conocen por aquellos expertos en el ámbito. Véase, por ejemplo, Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al . (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al . (1995) The Plant J 8:745-750 y Frecker et . al . (1996) Plant Mol Biol 32:979-986.

No obstante, el interés ha sido mayor en células de vertebrado y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento habitual. Los ejemplos de líneas de células hospederas de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster Chino/ -DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4; Mather. Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde Africano (VERO- 76, ATCC CRL 1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon de perro (MDCK, ATCC CCL 34) ; células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de hígado humano (Hep G2,1413 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL5 1); células TRI (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ; células MRC 5; células FS4 ; y línea de hepatoma humano (Hep G2) , Cuando se utilizan técnicas recombinantes , la molécula de unión biespecífica de la invención se puede producir intracelularmente , en el espacio periplásmico o se puede secretar directamente al medio. Si la molécula de unión biespecífica se produce intracelularmente, como una primera etapa, los residuos particulados, ya sea células hospederas o fragmentos lisados son separados, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración . Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos los cuales son secretados al espacio periplásmico de E. coli . Brevemente, una pasta de células se recalienta en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los residuos celulares se pueden separar por centrifugación. Cuando el anticuerpo es secretado al medio, los sobrenadantes de estos sistemas de expresión generalmente se concentran primero utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La molécula de unión biespecífica de la invención preparada a partir de células hospederas se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, en donde la cromatografía de afinidad es la técnica de purificación preferida.

La matriz a la cual se une el ligando de afinidad con mucha frecuencia es agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinil ) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos en comparación con los que se obtienen con agarosa. Cuando la molécula de unión biespecífica de la invención comprende un dominio CH3 , es útil el equipo Bakerbond ABXMresin (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) para purificación. Otras técnicas para purificación de proteínas tales como f accionamiento de una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, CLAP en fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía SEPHAROSETM o una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

En otro aspecto, se proporcionan procesos para producir moléculas de unión biespecíficas de la invención, los procesos comprenden cultivar una célula hospedera definida en la presente bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión biespecífica y recuperar la molécula de unión biespecífica producida del cultivo.

En una modalidad alternativa, se proporcionan composiciones que comprenden una molécula de unión biespecífica de la invención o producida de acuerdo con los procesos de la invención. Preferiblemente, la composición es una composición farmacéutica.

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "composición farmacéutica" se relaciona con una composición para administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica preferida particular de esta invención comprende la molécula de unión biespecífica de la invención. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende formulaciones adecuadas de portadores, estabilizantes y/o excipientes. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal , intraarterial , intratecal y/o intranasal o por inyección directa en tejido. Se considera en particular que la composición se administra a un paciente por medio de infusión o inyección. La administración de las composiciones adecuadas se puede llevar a cabo de diferentes maneras, por ejemplo por administración intravenosa, intraperitoneal , subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica . En particular, la presente invención proporciona una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como un ejemplo no limitante, la administración ininterrumpida, es decir, continua, se puede llevar a cabo por medio de un sistema de bomba pequeña transportado por el paciente para dosificar la entrada de agente terapéutico en el cuerpo del paciente. La composición farmacéutica que comprende la molécula de unión biespecífica de la invención se puede administrar mediante la utilización de sistemas de bomba. Estos sistemas de bomba generalmente se conocen en el ámbito en que comúnmente se basan en intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico que se va a suministrar por infusión. Cuando se intercambia el cartucho en el sistema de bomba, una interrupción temporal del flujo ininterrumpido de otra manera del agente terapéutico en el cuerpo del paciente puede llevarse a cabo. En este caso, la fase de administración antes de sustitución del cartucho y la fase de administración posterior a la sustitución del cartucho aún se considerarán dentro del significado de los medios y métodos farmacéuticos de la invención juntos constituyendo una "administración ininterrumpida" del agente terapéutico.

La administración continua o ininterrumpida de estas moléculas de unión biespecíficas de la invención puede ser intravenosa o subcutánea por medio de un dispositivo de suministro de fluido o sistema de bomba pequeña que incluye un mecanismo de impulsión de fluido para impulsar fluido fuera de un depósito y un mecanismo de accionamiento para accionar el mecanismo de impulsión. Los sistemas de bomba para administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar en la piel de un paciente y suministrar la composición adecuada en el cuerpo del paciente. Los sistemas de bomba se pueden fijar directamente o se pueden unir a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, con lo que se permite el contacto entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba se puede unir a la piel del paciente durante 24 horas hasta varios días. El sistema de bomba puede ser de un tamaño pequeño con un depósito para volúmenes pequeños. Como un ejemplo no limitante, el volumen del depósito para la composición farmacéutica adecuada que se va a administrar puede estar entre 0.1 y 50 mi.

La administración continua puede ser transdérmica por medio de un parche portado en la piel y sustituido a intervalos. Una persona experta en el ámbito tendrá conocimiento de sistemas de parche para suministro de fármaco adecuado para este propósito. Es de hacerse notar que la administración transdérmica es especialmente adecuada para administración ininterrumpida, dado que el cambio del primer parche agotado puede llevarse a cabo ventajosamente de modo simultáneo con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejemplo, sobre la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de retirar el primer parche agotado. No surgen problemas de interrupción de flujo o una falla de la celda de energía.

Las composiciones de la invención pueden comprender además un portador farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados son bien conocidos en el ámbito e incluyen soluciones, por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, liposomas, etc. Las composiciones que comprenden estos portadores se pueden formular por métodos convencionales bien conocidos. Las formulaciones pueden comprender carbohidratos, soluciones amortiguadoras, aminoácidos y/o tensioactivos .

Los carbohidratos pueden ser azúcares no reductores, preferiblemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol. En general, como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" significa cualquiera y la totalidad de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos , agentes isotónicos y de retraso de absorción compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en el ámbito. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas e incluyen: agentes amortiguadores adicionales; conservadores; cosolventes; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; polímeros biodegradables tales como poliésteres; contraiones formadores de sal tal como sodio, alcoholes de azúcar polihídrica; aminoácidos tales como alanina, glicina, asparagina, 2-fenilalanina y treonina; azúcares o alcoholes de azúcar tales como trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o estaquiosa de xilitol, mañosa, sorbosa, xilosa, ribosa, mioinisitosa, galactosa, lactitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, citlitoles (por ejemplo, inositol), polietilenglicol ; agentes reductores que contienen azufre tales como glutation, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, [alfa] -monotioglicerol y tiosulfato de sodio; proteínas de peso molecular bajo tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina u otras inmunoglobulinas ; y polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidina. Estas formulaciones se pueden utilizar para administraciones continuas las cuales pueden ser intravenosas o subcutáneas con y/o sin sistemas de bomba. Los aminoácidos pueden ser aminoácidos cargados, preferiblemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina. Los tensioactivos pueden ser detergentes, preferiblemente con un peso molecular de >1.2 KD y/o un poliéter, preferiblemente con un peso molecular de >3 KD. Los ejemplos no limitantes para los detergentes preferidos son Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 o Tween 85. Los ejemplos no limitantes de poliéteres preferidos son PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 o PEG 5000. Los sistemas amortiguadores utilizados en la presente invención pueden tener un pH preferido de 5-9 y pueden comprender citrato, succinato, fosfato, histidina y acetato.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada la cual puede ser determinada, por ejemplo, por estudios de incremento de dosis por administración de dosis en aumento del polipéptido de la invención que presenta especificidad de especie cruzada descrita en la presente con primates que no son chimpancés, por ejemplo, macacos. Como se establece en lo anterior, el polipéptido de la invención que presenta especificidad de especie cruzada descrito en la presente se puede utilizar ventajosamente en forma idéntica en pruebas preclínicas en primates que no son chimpancés y como un fármaco en humanos. Estas composiciones también se pueden administrar en combinación con otros fármacos proteináceos y no proteináceos. Estos fármacos se pueden administrar simultáneamente con la composición que comprende al polipéptido de la invención como se define en la presente o por separado antes o después de la administración del polipéptido en intervalos sin dosis definidos de manera sincronizada. El régimen de dosificación se determina por el médico que atiende y factores clínicos, tal como se conoce en el ámbito médico, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, área de superficie corporal, edad, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, hora y día de administración, salud general y otros fármacos que se administren de modo concurrente.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen las formas estériles, acuosas o no acuosas, de soluciones, suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol , polietilenglicol , aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos pueden incluir agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones que incluyen solución salina y medio amortiguado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, solución Ringer dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio, solución Ringer lactada o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen fluido y reabastecimiento de nutrientes, reabastecimiento de electrolitos (tal como aquellos basados en Ringer dextrosa) y similares. Los conservadores y otros aditivos también pueden estar presentes tales como, por ejemplo, sustancias antimicrobianas, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Además, la composición de la presente invención puede comprender portadores proteináceos como, por ejemplo, albúmina sérica o inmunoglobulina, preferiblemente de origen humano. Se contempla que la composición de la invención puede comprender, además del polipéptido de la invención que aquí se define, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso destinado de la composición. Estos agentes pueden ser fármacos que actúen sobre el sistema gastrointestinal, fármacos que actúen como citostát icos , fármacos que eviten hiperuricemia, fármacos que inhiban inmunorreacciones (por ejemplo, corticosteroides) , fármacos que modulen la respuesta inflamatoria, fármacos que actúen sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como citocinas conocidas en el ámbito. También se contempla que la molécula de unión biespecífica de la presente invención se aplique en un tratamiento conjunto, es decir, en combinación con otro medicamento contra el cáncer.

La actividad biológica de la composición farmacéutica que aquí se define se puede determinar, por ejemplo, por análisis de citotoxicidad, como se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schlereth et al., (Cáncer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 -12). Los términos "eficacia" o "eficacia in vivo", como se utilizan en la presente, se refiere a la respuesta al tratamiento por la composición farmacéutica de la invención utilizando, por ejemplo, los criterios de respuesta NCI estandarizados. El éxito de la eficacia in vivo del tratamiento utilizando la composición farmacéutica de la invención se refiere como la efectividad de la composición para su propósito destinado, es decir, la capacidad de la composición para provocar su efecto deseado, es decir, reducción de células patológicas, por ejemplo células tumorales. La eficacia in vivo se puede monitorear mediante métodos estándar establecidos para las entidades de enfermedad respectivas que incluyen, pero que no se limitan a cuentas de eritrocitos, diferenciales, clasificación de células activado por fluorescencia, aspiración de médula ósea. Además, diversos parámetros de química clínica específicos de enfermedad y otros métodos estándar establecidos se pueden utilizar. Además, la tomografía ayudada por computadora, rayos X, tomografía por resonancia magnética nuclear (por ejemplo para la determinación de respuesta basado en criterios del National Cáncer Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI , Connors JM, Lister TA, Vose J. Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Cárter W. Hoope R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin 1 s lymphomas . NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol . 1999 Apr : 17 (4)

[1244] ) , exploración de toraografía por emisión de positrones, cuentas de leucocitos, diferenciales, clasificación de células activadas por fluorescencia, aspiración de médula ósea, biopsias/histologías de nodulos linfáticos y diversos parámetros químicos clínicos específicos de linfoma (por ejemplo, lactato deshidrogenasa) y otros métodos estándar establecidos se pueden utilizar.

Otro reto principal en el desarrollo de fármacos tales como la composición farmacéutica de la invención es la modulación predecible de propiedades farmacocinéticas . Para este fin, un perfil farmacocinético del candidato de fármaco, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan la capacidad de un fármaco particular para tratar una condición dada, se pueden establecer. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que alteran la capacidad de un fármaco para tratar cierta entidad de enfermedad incluyen, pero no se limitan a: vida media, volumen de distribución, metabolismo de primer paso hepático y el grado de unión a suero sanguíneo. La eficacia de un agente de fármaco dado puede ser alterada por cada uno de los parámetros mencionados en lo anterior.

El término "vida media" significa el tiempo en donde 50% de un fármaco administrado se elimina a través de procesos biológicos, por ejemplo metabolismo, excreción, etc.

Mediante el término "metabolismo de primer paso hepático" se quiere indicar la susceptibilidad de un fármaco a ser metabolizado ante el primer contacto con el hígado, es decir, durante su primer paso a través del hígado.

El "volumen de distribución" significa el grado de retención de un fármaco a través de diversos compartimientos en el cuerpo como, por ejemplo, espacios intracelulares y extracelulares , tejidos y órganos, etc., y la distribución del fármaco dentro de estos compartimientos.

El "grado de unión a suero sanguíneo" significa la susceptibilidad de un fármaco a interactuar y unirse a proteínas de suero sanguíneo tal como albúmina, lo que genera una reducción o pérdida de la actividad biológica del fármaco .

Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, tiempo de retraso (Tlag) , Tmax, velocidades de absorción, mas inicio y/o Cmax para una cantidad dada de fármaco administrado. El término "biodisponibilidad" significa la cantidad de un fármaco en el compartimiento en sangre.

El término "tiempo de retraso" significa el retraso en tiempo entre la administración del fármaco y su detección y la mensurabilidad en sangre o plasma.

El término "Tmax" es el tiempo después del cual se alcanza la concentración sanguínea máxima del fármaco y "Cmax" es la concentración en sangre obtenida máxima con un 5 fármaco dado. El tiempo para alcanzar una concentración en sangre o tejido del fármaco la cual se requiere para su efecto biológico es alterada por todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de anticuerpos de cadena sencilla biespecíficos que presentan especificidad de especie cruzada, 0 los cuales se pueden determinar en pruebas preclínicas en animales y en primates que no sean chimpancés como se indica en lo anterior, también se establecen, por ejemplo, en la publicación de Schlereth et al. (Cáncer Immunol . Immunother. 20 (2005) , 1 - 12) . 5 El término "toxicidad" como se utiliza en la presente, se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestados en eventos adversos o eventos adversos graves. Estos eventos adversos pueden referirse a una carencia de tolerabilidad del fármaco en general y/o una carencia de o tolerancia local después de su administración. La toxicidad también puede incluir efectos teratogénicos o carcinogénicos causados por el fármaco.

Los términos "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad", como se utilizan en la presente, definen la administración de un fármaco sin inducir eventos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un período de aplicación más prolongado del fármaco. La "seguridad", "seguridad in vivo" o " tolerabilidad" se pueden evaluar, por ejemplo, a intervalos regulares durante el tratamiento y un período de seguimiento. Las mediciones incluyen evaluación clínica, por ejemplo, manifestaciones en órganos, y cribado de anomalías de laboratorio. La evaluación clínica se puede llevar a cabo y las desviaciones a los hallazgos normales registrados/codificados de acuerdo con las normas NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones en órganos pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardiaca, coagulación y similares, como se establece, por ejemplo en Common Terminology Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE) . Los parámetros de laboratorio los cuales se pueden probar incluyen, por ejemplo, hematología, química clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros fluidos corporales tales como suero, plasma, líquido linfoide o líquido cefalorraquídeo, licor y similares. De esta manera la seguridad se puede determinar, por ejemplo, por examen físico, técnicas de generación de imagen (es decir, ultrasonido, rayos X, exploraciones CT, generación de imágenes por resonancia magnética (MRI) , otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma) , signos vitales, al medir los parámetros de laboratorio y registrar eventos adversos. Por ejemplo, los eventos adversos en primates diferentes de chimpancé en los usos y métodos de acuerdo con la invención se pueden examinar por métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

El término "dosis efectiva" o "dosificación efectiva" se define como una cantidad suficiente para obtener o por lo menos obtener parcialmente el efecto deseado. El término "dosis terapéuticamente eficaz" se define como una cantidad suficiente para curar o por lo menos suprimir parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece de la enfermedad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad de la infección y el estado general del sistema inmunitario propio del sujeto. El término "paciente" incluye sujetos humanos u otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico .

El término "dosis efectiva y no tóxica", como se utiliza en la presente, se refiere a una dosis tolerable de una molécula de unión biespecífica de la invención la cual es suficientemente grande para provocar reducción de células patológicas, eliminación de tumor, encogimiento del tumor o estabilización de la enfermedad sin esencialmente efectos tóxicos mayores. Tales dosis efectivas y no tóxicas se pueden determinar, por ejemplo, por estudios de incremento de dosis descritos en el ámbito y deben estar por debajo de la dosis que induce eventos secundarios adversos graves (toxicidad limitante de dosis, DLT) .

Los términos anteriores también se mencionan, por ejemplo, en el documento Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting el 16 de julio de 1997.

La dosificación apropiada o la cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de unión biespecífica de la invención dependerán de la condición que va a ser tratada, la gravedad de la condición, el tratamiento previo y los antecedentes clínicos del paciente y la respuesta al agente terapéutico. La dosis adecuada se puede ajustar de acuerdo con el juicio del médico que atiende de manera que se puede administrar al paciente una vez durante una serie de administraciones. La composición farmacéutica se puede administrar como una sustancia terapéutica única o en combinación con tratamientos adicionales tales como tratamientos contra el cáncer, según se requiera.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para administración parenteral, es decir, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular y/o intrasinovial . La administración parenteral puede ser una inyección en bolo o una infusión continu .

Si la composición farmacéutica ha sido liofilizada, el material liofilizado se reconstituye primero en un líquido apropiado antes de su administración. El material liofilizado puede ser reconstituido, por ejemplo, en agua para inyección bacteriostática (BWFI, por sus siglas en inglés) , solución salina fisiológica, solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) o la misma formulación que la proteína ha tenido antes de la liofilización .

Preferiblemente, la molécula de unión biespecífica de la invención o producida por un proceso de la invención se utiliza en la prevención, tratamiento o disminución de una enfermedad que se selecciona de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico .

Una modalidad alternativa de la invención proporciona un método para el tratamiento o disminución de una enfermedad que se selecciona de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico que comprende la etapa de administrar al paciente en necesidad del mismo la molécula de unión biespecífica de la invención o producida por un proceso de la invención .

Las formulaciones descritas en la presente son útiles como composiciones farmacéuticas en el tratamiento y/o prevención de la condición médica patológica, como se describe en la presente en un paciente en necesidad del mismo. El término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. El tratamiento incluye la aplicación o administración de la formulación al cuerpo, un tejido aislado, una célula de un paciente quien presenta una enfermedad/trastorno, un síntoma de una enfermedad/trastorno o una predisposición hacia una enfermedad/trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, recuperar, alterar, corregir, aminorar, mejorar o alterar la enfermedad, el síntoma o la enfermedad, o la predisposición hacia la enfermedad .

Quienes se encuentran "en necesidad de tratamiento" incluyen a los que ya presentan el trastorno así como aquellos en quienes se puede evitar el trastorno. El término "enfermedad" es cualquier condición que puede beneficiarse del tratamiento con la formulación de proteína descrita en la presente. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero a la enfermedad en cuestión. Los ejemplos no limitantes de enfermedades/trastornos que van a ser tratados en la presente incluyen enfermedades proliferativas , una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico .

En otro aspecto, se proporcionan kits que comprenden una molécula de unión biespecífica de la invención, una molécula de ácido nucleico de la invención o un vector de la invención o una célula hospedera de la invención. El kit puede comprender uno o más frascos que contengan la molécula de unión biespecífica e instrucciones para uso. El kit también puede contener un medio para administrar la molécula de unión biespecífica de la presente invención tal como una jeringa, bomba, infusor o similar.

En otro aspecto adicional, la presente invención se relaciona con el uso de residuos aminoácidos 170 a 222 (conjunto 4 de epítopo) y/o 78 a 138 (conjunto 2 de epítopo) de la secuencia 5T4 humana, como se muestra en la SEC ID NO: 2 para la generación de un anticuerpo, preferiblemente una molécula de unión biespecífica que tiene preferiblemente la capacidad de unirse a 5T4 y CD3 humano, como se describe en la presente .

Además, la presente invención se relaciona con un método para la generación de un anticuerpo, preferiblemente una molécula de unión biespecífica que comprende: (a) inmunizar a un animal con una proteína que comprende los residuos aminoácidos 170 a 222 (conjunto 4 de epítopo) y/o 78 a 138 (conjunto 2 de epítopo) de la secuencia 5T4 humana, como se muestra en la SEC ID NO: 2, (b) obtener el anticuerpo y, opcionalmente (c) convertir el anticuerpo en una molécula de unión biespecífica que tiene preferiblemente la capacidad de unir 5T4 y CD3 humanos como se describe en la presente.

La presente invención contempla además un fragmento de 5T4 que consiste de los residuos aminoácidos 170 a 222 (conjunto 4 de epítopo) o los aminoácidos 78 a 138 (conjunto 2 de epítopo) de la secuencia 5T4 humana, como se muestra en la SEC ID NO: 2.

Debe entenderse que las invenciones en la presente no se limitan a metodología, protocolos o reactivos particulares y que estos pueden variar. La presentación y ejemplos que aquí se proporcionan se muestran con el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no tienen la intención de limitar el alcance de la presente invención, el cual se define únicamente por las reivindicaciones .

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en el texto de esta descripción (que incluye todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones científicas, especificaciones de fabricantes, instrucciones, etc.), ya sea en lo anterior o en lo siguiente se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Nada en la presente debe considerarse como admisión de que la invención no está dotada de antefecha de tal descripción en virtud de la invención previa. En la medida en que el material incorporado como referencia contradice o no concuerda con esta descripción, esta descripción prevalecerá sobre cualquier material.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS En las figuras: La figura 1 muestra la estructura hipotética de 5T4. SRR: secuencia repetida rica en serina (café); LRR: secuencia repetida rica en leucina (azul) ; las cisteínas se muestran en círculos amarillos; los sitios de glucosilación potenciales se marcan con asteriscos.

La figura 2 es un modelo de estructura de 5T4 con segmentos resaltados intercambiados en construcciones quiméricas como se diseñan para agrupamiento de epítopo. LLR: secuencia repetida rica en leucina, SRR: secuencia repetida rica en serina. Asteriscos: posición de carbohidratos.

La figura 3 es un agrupamiento de epítopos con construcciones 5T4 quiméricas - alineación de secuencia de 5T4 humana y murina.

Alineación de las secuencia de aminoácidos de 5T4 humana y muri a. Los dominios intracelular y transmembranal se marcan por un rectángulo con líneas discontinuas. Los segmentos de aminoácidos son la secuencia murina homóloga y se sustituye por la secuencia humana en las construcciones quiméricas y también esta marcada con un rectángulo y las posiciones de aminoácidos con referencia a las secuencias humanas se indican.

La figura 4 muestra 5T4 murina y humana así como siete construcciones de 5T4 humana-murina quiméricas que se expresan sobre la superficie de células CHO, como se muestra por citometría de flujo. La expresión de 5T4 humana y las moléculas de 5T4 quiméricas, hu 5T4 El mu, hu 5T4 E2 mu, hu 5T4 E3 mu y hu 5T4 E6 mu sobre CHO se detectaron con anticuerpo monoclonal anti-5T4 humano. La expresión de hu 5T4 E4 mu, hu 5T4 E5 mu y hu 5T4 E7 mu se detecta con un anticuerpo policlonal anti-5T4 humano. La expresión de 5T4 murina se detecta con un anticuerpo policlonal anti 5T4 de ratón. El anticuerpo monoclonal unido se detecta con un anticuerpo anti Fc-gamma específico de ratón conjugado con ficoeritrina . Los anticuerpos policlonales unidos se detectan con un anticuerpo anti borrego etiquetado con PE.

Las figuras 5A-5C son determinaciones de constantes de unión de anticuerpos biespecífieos sobre 5T4 de humano y de macaco y sobre CD3 humano y de macaco utilizando el sistema Biacore. El antígeno se inmoviliza en un chip de densidad baja a intermedia (100 RU) en C 5. Las diluciones de anticuerpos biespecíficos se hacen flotar sobre la superficie del chip y se determina la unión utilizando el programa BiaEval . Las tasas de adición y separación respectivas y la constante de unión resultante (KD) de los anticuerpos biespecífieos respectivos se muestran debajo de cada gráfica. Los números entre paréntesis indican tasa de separación imprecisa y el cálculo KD debido a una tasa de separación bifásica del anticuerpo biespecífico 5T4 respectivo.

La figura 6 es una determinación de las constantes de unión de anticuerpos biespecífieos dirigidos contra el epítopo 4 en células positivas a antígeno 5T4. Las células se incuban con series de dilución por triplicado de anticuerpos biespecíf icos respectivos. La detección se lleva a cabo de una manera estrictamente monovalente utilizando anti-His Fab/Alexa488 como el anticuerpo de detección. Las células positivas a antígenos 5T4 utilizaron: NCI-N87 como línea de células que expresan 5T4 humanas naturalmente (columna izquierda) transfectadas con células CHO que expresan 5T4 recombinante (columna media) y células CHO transfectadas que expresan 5T4 recombinante (columna derecha) . Las gráficas de Hipérbole se muestran con análisis Scatchard incorporado en cada gráfica. Los valores KD respectivos se incluyen en cada diagrama.

La figura 7 es una determinación de las constantes de unión de anticuerpos biespecífieos dirigidos contra el epítopo 7 en células positivas a antígeno 5T4. Las células se incuban con una serie de diluciones por triplicado de los anticuerpos biespecífieos respectivos. La detección se lleva a cabo de una manera estrictamente monovalente utilizando anti-His Fab/Alexa488 como anticuerpo de detección. Se utilizan células positivas antígeno 5T4 : NCI-N87 como la línea de células que expresan 5T4 humanas naturalmente (columna izquierda) , células CHO transfectadas que expresan 5T4 recombinante (columna media) y células CHO transfectadas que expresan 5T4 recombinante (columna derecha) . Las gráficas de Hipérbole se muestran con análisis Scatchard incorporado en cada gráfica. Los valores KD respectivos se incluyen en cada diagrama .

Las figuras 8A-8B son determinaciones de las constantes de unión de anticuerpos biespecífieos dirigidos contra el epítopo E2/4 sobre células positivas a antígeno 5T4. Las células se incuban con series de diluciones por triplicado de los anticuerpos biespecíficos respectivos. La detección se lleva a cabo de una manera estrictamente monovalente utilizando anti-His Fab/Alexa488 como el anticuerpo de detección. Se utilizan células positivas antígeno 5T4 : NCI-N87 como la línea de células que expresan 5T4 humanas naturalmente (columna izquierda) , células CHO transfectadas que expresan 5T4 recombinante (columna media) y células CHO transfectadas que expresan 5T4 recombinante (columna derecha) . Las gráficas de Hipérbole se muestran con análisis Scatchard incorporado en cada gráfica. Los valores KD respectivos se incluyen en cada diagrama.

La figuras 9A-9C muestran la actividad citotóxica de anticuerpos biespecífieos 5T4 medida en un análisis de liberación de "cromo de 18 horas. Células efectoras: linfocitos T CD8 humanos enriquecidos y estimulados. Células objetivo: línea de células tumorales humanas positivas a 5T4 , HCT116. Relación de células efectoras respecto a objetivo (E:T): 10:1. Los intervalos de clasificación basados en la experiencia de anticuerpo biespecífico actual para actividad citotóxica con linfocitos T CD8 humanos enriquecidos estimulados (CE50) < 10 pg/ml (1), [10-100 pg/ml] (2), [100-1000 pg/ml] (3), [1000-5000 pg/ml] (4), >5000 pg/ml (5).

Las figuras 10A-10C muestran la actividad citotóxica de anticuerpos biespecífieos 5T4 medidos en un análisis de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: PBMC humanos no estimulados. Células objetivo: células CHO transfectadas con 5T4 humana, Relación de células efectoras respecto a objetivo (E:T): 10:1. Los intervalos de clasificación basados en la experiencia de anticuerpo biespecífico actual para actividad citotóxica con PBMC humanos no estimulados (CE50) >250 pg/ml (1) , [250-1000 pg/ml] (2), [1000-5000 pg/ml] (3), [5000-20000 pg/ml] (4), _ 2000 pg/ml (5) .

Las figuras 11A-11C muestran la actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos 5T4 medida en un análisis de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras: PBMC humanos no estimulados. Células objetivo: línea de células tumorales humanas positivas a 5T4 , NCI-N87. Relación de células efectoras respecto a objetivo (E:T): 10:1. Los intervalos de clasificación basados en la experiencia de anticuerpo biespecífico actual para actividad citotóxica con PB C humanos no estimulados (CE5Q) > 250 pg/ml (1) , [250-1000 pg/ml] (2), [1000-5000 pg/ml] (3), [5000-20000 pg/ml] (4), >20000 pg/ml (5).

Las figuras 12A-12C muestran la actividad citotóxica de anticuerpos biespecífieos 5T4 medida en un análisis de citotoxicidad basado en FACS de 48 horas. Células efectoras : línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx. Células objetivo: células CHO transfectadas con 5T4 de macaco. Relación de células efectoras respecto a objetivo (E:T): 10:1. Los intervalos de clasificación se basan en la experiencia de anticuerpo biespecífico actual para actividad citotóxica con la línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (CE50) > 250 pg/ml (1), [250-1000 pg/ml] (2), [1000-5000 pg/ml] (3), [5000-20000 pg/ml] (4), >20000 pg/ml (5).

La figura 13 muestra la actividad antitumoral de anticuerpos biespecífieos en un modelo de tumor de etapa avanzada HCT-116 Células de carcinoma de colon humano HCT-116 se inyectan subcutáneamente en el flanco dorsal derecho de ratones NOD/SCID (n = 10 por grupo) . Después de que los tumores han alcanzado un volumen de aproximadamente 180-200 mm3, los linfocitos T humanos se transplantan en la cavidad peritoneal . Se administra un anticuerpo biespecífico 5T4-CD3 (5T4-12 HL x CD3 HL) (0.1, 0.5 y 2.5 mg/kg/d) por inyección en bolo intravenosa en la vena de la cola lateral durante 14 días. Los animales control (grupo 2) y animales sin inyección de linfocitos T (grupo 1) recibieron el vehículo por inyección en bolo intravenosa en la vena de la cola lateral durante 14 días. Se determinó el crecimiento de tumores por mediciones calibradas externas y se calcularon los volúmenes de tumor utilizando una fórmula hemielipsoide convencional: (longitud [rara] x anchura [mm]2)/2.

La figura 14 muestra la actividad antitumoral de anticuerpos biespecífieos en un modelo de tumor de etapa avanzada NCI-N87 Células de carcinoma gástrico humano NCI-N87 se inyectan subcutáneamente en el flanco dorsal derecho de ratones NOD/SCID (n = 10 por grupo) . Después de que los tumores han alcanzado un volumen de aproximadamente 180-200 mm3, los linfocitos T humanos se transplantan en la cavidad peritoneal. Se administra un anticuerpo biespecífico 5T4-CD3 (5T4-12 HL x CD3 HL) (0.1, 0.5 y 2.5 mg/kg/d) por inyección en bolo intravenosa en la vena de la cola lateral durante 21 días. Los animales control (grupo 2) y animales sin inyección de linfocitos T (grupo 1) recibieron la inyección en bolo intravenosa en la vena de la cola lateral durante 21 días. Se determinó el crecimiento de tumores por mediciones calibradas externas y se calcularon los volúmenes de tumor utilizando una fórmula hemielipsoide convencional: (longitud [mm] x anchura [mm] 2) /2.

DESCRIPCCION DETALLADA DE LA INVENCION EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Estos ejemplos no deben considerarse como limitantes del alcance de esta invención. Los ejemplos se incluyen con propósitos de ilustración y la presente invención se limita únicamente por las reivindicaciones.

EJEMPLO 1 GENERACION DE CELULAS CHO QUE EXPRESAN 5T4 TRANSMEMBRANAL QUIMERICO Para la construcción de moléculas de mapeo de epítopo quimérico, la secuencia de aminoácidos de los dominios de epítopo respectivos de 5T4 humana se cambian a la secuencia murina .

Se construyen las siguientes moléculas: hu 5T4 El mu (aminoácidos 34- 77 : murino) hu 5T4 E2 mu (aminoácidos 78- 128 : murino) hu 5T4 E3 mu (aminoácidos 139 -169 : murino) hu 5T4 E4 mu (aminoácidos 170 -222 : murino) hu 5T4 E5 mu (aminoácidos 223 -270 : murino) hu 5T4 E6 mu (aminoácidos 271 -299 : murino) hu 5T4 E7 mu (aminoácidos 300 -360 : murino) Las construcciones de ADN se clonan en vector de expresión de mamífero pEF-DHFR y se transfectan de manera estable en células CHO. La expresión de 5T4 humana y moléculas 5T4 quiméricas, hu 5T4 El mu, hu 5T4 E2 mu, hu 5T4 E3 mu y hu 5T4 E6 mu en CHO se verificó en un análisis FACS utilizando anticuerpo monoclonal anti-5T4 humana (R&D Systems #MAB49751) . La expresión de hu 5T4 E4 mu, hu 5T4 E5 mu y hu 5T4 E7 mu, se detectó con un anticuerpo policlonal anti-5T4 humana (R&D Systems #AF4975) . Se demostró la expresión de mu 5T4 con anticuerpo policlonal anti 5T4 de ratón (R&D Systems #AF5049) . La concentración utilizada de los anticuerpos 5T4 fue de 5 µ9/??1. Se detectaron anticuerpos monoclonales unidos con un anticuerpo anti-específ ico gamma Fe de ratón conjugado a R-ficoeritrina (1:100; Dianova #115-116-071) .

Los anticuerpos policlonales unidos se detectaron con 5 M-g/ml de anticuerpo anti-borrego etiquetado con PE (Santa Cruz Biotechology #sc-3746) . Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS con FCS 2%. Como control negativo se incubaron células con PBS/FCS 2% en vez del primer anticuerpo. Las muestras se midieron por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II (Becton Dickinson) y se analizaron con el programa FlowJo (Versión 7.6) . La expresión en superficie de quimeras 5T4 humanas -murinas , las células CHO transfectada se analizaron y confirmaron en un análisis de citometría de flujo con diferentes anticuerpos anti-5T4 (figura 4) .

EJEMPLO 2 2.1 EXPRESION TRANSITORIA EN CELULAS HEK 293 Se utilizaron clones de plásmidos de expresión con secuencias nucleotídicas verificadas por secuencia para transfección y expresión de proteína en el FreeStyle 293 Expression System (Invtrogen GmbH, Karlsruhe. Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se obtuvieron los sobrenadantes que contienen las proteínas expresadas, las células se eliminaron por centrifugación y los sobrenadantes se almacenaron a -20°C. 2.2 EXPRESION ESTABLE EN CELULAS CHO Los clones de los plásmidos de expresión con secuencias nucleotídicas verificadas por secuencia se transfectaron en células CHO deficientes en DHFR para expresión eucariótica de las construcciones. La expresión de proteína eucariótica en células CHO deficientes en DHFR se realizó como se describe por Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol . 185, 537-566. La amplificación del gen de las construcciones se indujo al incrementar las concentraciones de metotrexato (MTX) a una concentración final de MTX 20 nM. Después de dos pasajes de cultivo estacionario las células se hacen crecer en botellas giratorias con medio de soya líquido HyQ PF CHO libre de nucleósido (con L-glutamina 4.0 mM con Pluronic F - 68 0.1%: Hyclone) durante 7 días antes de la recolección. Las células se separaron por centrifugación y el sobrenadante que contiene la proteína expresada se almacenó a -20°C.

EJEMPLO 3 Agrupamiento de epítopo de fragmentos scFv murinos Células transfectadas con 5T4 humana o murina o con moléculas 5T4 quiméricas se tiñen con extracto periplásmico no diluido crudo que contiene scFv unido a 5T4 de humano/macaco. El scFv unido se detecta con 1 9/t?1 de anticuerpo anti-FLAG (Sigma F1804) y un anticuerpo anti-específico a Fe gamma de ratón etiquetado con R-PE (1:100; Dianova "115-116-071). Todos los anticuerpos se diluyen en PBS con FCS 2%. Como control negativo se incubaron células con PBS/FCS 2% en vez del extracto periplásmico. Las muestras se miden por citometría de flujo en un equipo FASCanto II Instrument (Becton Dickinson) y se analizan por el programa FlowJo (Versión 7.6).

EJEMPLO 4 Procuramiento de formas recombinantes diferentes de RT4 humana y de macaco solubles Las secuencias codificantes de 5T4 humana y de macaco (secuencias de 5T4 humana y de ratón como se publicaron en GenBank, números de acceso NM_006670 [humana] ; NM_011627 (de ratón] ) de las secuencias codificantes de albúmina humana, Fcyl murina y albúmina murina se utilizan para la construcción de secuencias de ADNc artificiales que codifican para proteínas de fusión solubles de 5T4 humana y de macaco, respectivamente y albúmina humana, Fe de IgGl murina y albúmina murina, respectivamente así como proteínas solubles que comprenden únicamente los dominios extracelulares de 5T4. Para generar las construcciones para expresión de las proteínas 5T4 humana y de macaco solubles se obtienen fragmentos de ADNc por mutagénesis por PCR de los ADNc para 5T4 de longitud completa descritos en lo anterior y clonación molecular de acuerdo con procedimientos estándar.

Para las fusiones con albúmina humana, los fragmentos de ADNc modificados se diseñan de manera que contengan primero un sitio Kozac para expresión eucariótica de las construcciones seguido por la secuencia codificante de las proteínas 5T4 humana y de macaco, respectivamente, que comprende los aminoácidos 1 a 355 que corresponden al péptido señal y dominio extracelular de 5T4 humana y de macaco, respectivamente, seguida en marco por la secuencia codificante de un enlazante artificial Serl-Gly4-Serl-seguido en marco por la secuencia codificante de albúmina sérica humana, seguida en marco por la secuencia codificante de la etiqueta Flag, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de detención.

Para las fusiones con IgGl murina, los fragmentos de ADNc modificados se diseñan de manera que contengan primero un sitio Kozac para expresión eucariótica de las construcciones seguido por la secuencia codificante de las proteínas 5T4 humana y de macaco, respectivamente, que comprende los aminoácidos 1 a 355 que corresponden al péptido señal y dominio extracelular de 5T4 humana y de macaco, respectivamente, seguida en marco por la secuencia codificante de un enlazante artificial Serl-Gly4 -Serl- , seguido en marco por la secuencia codificante de una bisagra y la porción gamma Fe de IgGl murina, seguida en marco por la secuencia codificante de una etiqueta hexahistidina y un codón de detención.

Para las fusiones con albúmina murina, los fragmentos de ADNc modificados se diseñan de manera que contengan primero un sitio Kozac para expresión eucariótica de las construcciones seguido por la secuencia codificante de las proteínas 5T4 humana y de macaco, que respectivamente, comprenden los aminoácidos 1 a 355 que corresponden al péptido señal y dominio extracelular de 5T4 humana y de macaco, respectivamente, seguida en marco por la secuencia codificante de un enlazante artificial Serl -Gly4 -Serl - , seguido en marco por la secuencia codificante de albúmina sérica murina, seguida en marco por la secuencia codificante de la etiqueta Flag, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta de histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de detención.

Para las construcciones de dominio extracelular solubles, los fragmentos de ADNc modificados se diseñan de manera que contengan primero un sitio Kozac para expresión eucariótica de las construcciones seguido por la secuencia codificante de las proteínas 5T4 humana y de macaco, que comprenden respectivamente los aminoácidos 1 a 355 que corresponden al péptido señal y el dominio extracelular de 5T4 humana y de macaco, respectivamente, seguida en marco por la secuencia codificante de un enlazante artificial Serl-Gly4-Serl, seguido en marco por la secuencia codificante de una etiqueta Flag, seguida en marco por la secuencia codificante de la etiqueta histidina modificada (SGHHGGHHGGHH) y un codón de detención.

Los fragmentos de ADNc también se diseñan para introducir sitios de restricción al inicio y al final de los fragmentos. Los sitios de restricción introducidos, EcoRI en el extremo 5' y Salí en el extremo 3' se utilizan en los siguientes procedimientos de clonación. Los fragmentos de ADN se clonan por medio de EcoRI y sal en un plásmido designado como pEF-DHFR (pEF-DHFR se describe en Raum et al. Cáncer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) . Los procedimientos mencionados antes se llevan a cabo todos de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)) .

EJEMPLO 5 Determinación basada en Biacore de afinidad de anticuerpo biespecífico para 5T4 y CD3 de humano y de macaco Se llevaron a cabo experimentos de análisis Biacore utilizando proteínas de fusión 5T4 recombinantes con albúmina sérica humana (ALB, por sus siglas en inglés) para determinar unión a objetivo 5T4. Para mediciones de afinidad CD3 , las proteínas de fusión recombinantes que tienen 27 aminoácidos en la parte N terminal de CD3 epsilon (CD3e) se fusionaron a la porción Fe de anticuerpo humano son las que se utilizaron. Esta proteína recombinante existe en una versión CD3el-27 humana y en una versión CD3e de macaco, ambas presentando el epítopo del aglutinante CD3 en los anticuerpos biespecífieos .

De manera detallada, los chips sensores CM5 (GE Healthcare) se inmovilizan con aproximadamente 100 a 150 RU del antígeno recombinante respectivo utilizando amortiguador acetato pH 4.5 de acuerdo con el manual del fabricante. Las muestras de anticuerpo biespecíficas se cargan en cinco concentraciones: 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM y 3.13 nM diluido en amortiguador de corrimiento HBS-EP (GE Healthcare) . El caudal es de 30 a 35 µ?/min durante 3 min, después se aplica el amortiguador de corrimiento HBS-EP durante 8 min nuevamente a un caudal de 30 a 35 µ?/ml. La regeneración del chip se realiza utilizando glicina 10 mM, NaCl 0.5 M, pH 2.45. Los conjuntos de datos se analizan utilizando el programa BiaEval (figuras 5A-5C) . En general se realizan dos experimentos independientes.

EJEMPLO 6 Unión biespecífica de reactividad cruzada interespecies Para citometría de flujo se incubaron 200,000 células de las líneas de células respectivas durante 30 min en hielo con 50 µ? de moléculas biespecíficas purificadas a una concentración de 5 g/ml. Las células se lavan dos veces en PBS con FCS 2% y la unión de las construcciones se detecta con un anticuerpo PentaHis murino (Qiagen; diluido 1:20 en 50 µ? de PBS con FCS 2%) . Después del lavado, los anticuerpos PentaHis unidos se detectan con un anticuerpo específico para Fe gamma (Dianova) conjugado con ficoeritrina , diluido 1:100 en PBS con FCS 2%.

EJEMPLO 7 Determinación basada en Scatchard de afinidad de anticuerpo biespecí fico para 5T4 humana y de macaco Para el análisis Scatchard, se realizaron experimentos de unión de saturación utilizando un sistema de detección monovalente desarrollado en Micromet (anti-His Fab/Alexa 488) para determinar con precisión la unión monovalente de los anticuerpos biespecífieos a la línea de células respectiva.

Una cantidad de 2 x 104 células de la línea de células respectivas (línea de células de cáncer humano que expresa 5T4 de manera nativa NCI-N87, línea de células CHO que expresa 5T4 humana de manera recombinante , línea de células CHO que expresa 5T4 de macaco de modo recombinante) se incuban cada una con 50 µ? de una serie de dilución triplete (ocho diluciones a 1:2) del anticuerpo biespecífico 5T4 respectivo comenzando a 100 nM seguido por incubación durante 16 h a 4°C bajo agitación y una etapa de lavado residual. Después las células se incuban durante 30 min adicionales con 30 µ? de solución anti-His Fab/Alexa 488 (Micromet; 30 µg/ml) . Después de una etapa de lavado, las células se resuspenden en 150 µ? de amortiguador FACS que contiene formaldehído 3.5% se incuban durante 15 min adicionales, se centrifugan, se resuspenden en amortiguador FACS y se analizan utilizando una máquina FACS Cantoll y el programa FACS Diva. Se generan datos a partir de dos conjuntos de experimentos independientes. Los valores se grafican como curvas de unión de Hipérbole. El análisis Scatchard respectivo se calcula para extrapolar la unión máxima (Bmax) . Las concentraciones de anticuerpos biespecífieos y la unión semimáxima se determinó reflejando las KD respectivas. Los valores de mediciones por triplicado se grafican como curvas hiperbólicas. La unión máxima se determina utilizando la evaluación Scatchard y las KD respectivas se calculan. Los valores mostrados en la tabla 2 se derivan de dos experimentos independientes por anticuerpo biespecífico 5T4. Un experimento representativo por anticuerpo biespecífico 5T4 se muestra desde la figura 6 a las figuras 8A- 8B .

TABLA 2 : Afinidades (KD) de anticuerpos biespecíficos 5T4 a partir de análisis Scatchard basado en células (dos experimentos independientes de cada uno) Las altas afinidades de los 15 anticuerpos biespecíficos 5T4 medidos por Biacore sobre antígeno 5T4 humano y de macaco soluble recombinante se pueden confirmar por análisis Scatchard sobre células CHO transíectadas con 5T4 humanas de macaco. De manera más importante, las afinidades de 5T4 nativa expresadas sobre la superficie de la línea de células tumorales humanas NCI-N87 recuerda cercanamente a las medidas en células CHO que expresan 5T4 recombinante en su superficie. Todos los anticuerpos biespecíf icos 5T4 del conjunto de epítopo E2/4 y todos los anticuerpos biespecíf icos 5T4 del conjunto de epítipo E7 se unen a 5T4 humana nativa en células NCI-N87 con afinidad sub-nM, mientras que cuatro de los cuatro anticuerpos biespecíficos 5T4 del conjunto de epítopo E4 se unen a 5T4 humana nativa con afinidad de 1 dígito nM.

EJEMPLO 8 Actividad citotóxica 8.1 Análisis de liberación de cromo con linfocitos T humanos estimulados Los linfocitos T estimulados enriquecidos con linfocitos T CD8+ se obtienen como se describe más adelante.

Una caja de petri (145 nm de diámetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) se recubre con un anticuerpo específico anti-CD3 disponible comercialmente (0KT3, Orthoclone) en una concentración final de 1 µg/ml durante 1 hora a 37°C. La proteína no unida se retira por una etapa de lavado con PBS . Se agregan 3-5 x 107 PBMC humanos a la caja de petri recubierta previamente en 120 mi de RPMI 1640 con glutamina estabilizada/FCS 10%/IL-2 20 U/ml (ProleukinMR, Chiron) y se estimula durante 2 días. En el tercer día se recolectan las células y se lavan una vez con RP I 1640. Se agrega IL-2 a una concentración final de 20 U/ml y las células se cultivan nuevamente durante un día en el mismo medio de cultivo de células como en lo anterior.

Los linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) CD8+ se enriquecen por reducción de linfocitos T CD4+ y células NK CD56+ utilizando Dynal-Beads de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Las células objetivo CHO transfectadas con 5T4 de macaco o humano se lavan dos veces con PBS y se etiquetan con 11.1 MBq 51Cr en un volumen final de 100 µ? de RMPI con FCS 50% durante 60 minutos a 37°C. Subsecuentemente, las células objetivo marcadas se lavan tres veces con 5 mi de RPMI y después se utilizan en el análisis de citotoxicidad . El análisis se realiza en una placa de 96 pozos en un volumen total de 200 µ? suplementado con RPMI (como en lo anterior) con una relación E:T de 10:1. Se utiliza una concentración de inicio de 0.01 - 1 µg/ml de anticuerpo biespecífico purificado y diluciones triples de las mismas. El tiempo de incubación para el análisis es de 18 horas. Se determinó la citotoxicidad como valores relativos de cromo liberado en el sobrenadante en relación a la diferencia de lisis máxima (adición de Triton-X) y lisis espontánea (sin células efectoras) . Todas las medidas se llevaron a cabo por cuadriplicado. La medición de la actividad de cromo en los sobrenadantes se realizó en un contador gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Colonia, Alemania) . El análisis de los resultados se llevó a cabo con Prism 5 for Windows (versión 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA) . Se calcularon los valores CE50 mediante el programa de análisis a partir de las curvas dosis-respuesta sigmoideas que se utilizaron para comparación de actividad citotóxica . 8.2 Análisis de citotoxicidad basado en FACS con PBMC humano no estimulado Aislamiento de células efectoras Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) humanas por centrifugación en un gradiente de densidad Ficoll a partir de preparaciones de linfocitos enriquecidas (capas linfocíticas) , un producto secundario de bancos de sangre que recolectan sangre para transfusiones. Las capas linfocíticas se suministran por un banco de sangre local y los PBMC se preparan en el mismo día de la recolección de sangre. Después de centrifugación por gradiente de densidad Ficoll y lavados extensos con PBS de Dulbecco (Gibco) , los eritrocitos restantes se retiran de PBMC por incubación con amortiguador de lisis para eritrocitos (NH4C1 155 mM, KHC03 10 mM, EDTA 100 µ?) . Las plaquetas se extraen por medio del sobrenadante bajo centrifugación de PBMC a 100 x g. Los linfocitos remanentes principalmente abarcan linfocitos B y T, células NK y monocitos. Los PBMC se mantienen en cultivo a 37°C/C02 5% en medio RPMI (Gibco) con FCS 10% (Gibco) .

Reducción de células CD4+ Y CD56+ Para la reducción de células CD14+, se utilizan microesferas CD14 humanas (Milteny Biotec, MACS, #130-050-201) , para reducción de células NK microesferas CD56 humanas (MACS, #130-050-401) . Se cuenta PBMC y se centrifugan durante 10 min a temperatura ambiente con 300 x g. El sobrenadante se desecha y el sedimento celular se resuspende en amortiguador de aislamiento MACS [80 µ?/107 células; PBS (Invitrogen, #20012-043) , FBS 0.5% (v/v) (Gibco, #10270-106) , EDTA 2 mM (Sigma-Aldrich, #E-6511)] . Las microesferas CD14 y microesferas CD56 (20 µ1/107 células) se agregan y se incuban durante 15 min a 4-8°C. Las células se lavan con amortiguador de aislamiento MACS (1 - 2 mi/ (107 células) . Después de centrifugación (véase antes) se desecha el sobrenadante y las células se resuspenden en amortiguador de aislamiento MACS (500 µ?/108 células) . Las células negativas CD14/CD56 después se aislan utilizando columnas LS (Miltenyl Biotec, #130-042-401) . Las células PBMC sin CD14+/CD56+ se cultivan en medio completo de RPMI, es decir, RPMI 1640 (Biochrom AG, #FG1215) suplementado con FBS 10% (Biochrom AG, #S0115) , lx de aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, #K0293) , amortiguador Hepes 10 mM (Biochrom AG, #L1613), piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG, #L0473) y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG, #A2213) a 37°C en un incubador, hasta que se necesite.

Etiquetado de las células objetivo Para el análisis de lisis de células en análisis de citometría de flujo, se utilizó el tinte de membrana fluorescente DiOCi8 (DiO) (Molecular Probes, #V22886) para marcar células CHO transfectadas con 5T4 humana o de macaco o células NCI-N87 humanas que expresan 5T4 como células objetivo y distinguirlas de células efectoras. Brevemente, las células se cosechan, se lavan una vez en PBS y se ajustan a 10s células/ml en PBS que contiene FBS 2% (v/v) y el colorante de membrana DiO (5 µ?/106 células) . Después de incubación durante 3 min a 37°C, las células se lavan dos veces en medio RPMI completo y el número de células se ajusta a 1.25 x 105 células/ml. Se determina la vitalidad de las células utilizando solución de eosina G isotónica 0.5% (Roth, #45380) .

Análisis basado en citometría de flujo Este análisis se diseña para cuantificar la lisis de células CHO transfectadas con 5T4 de macaco o humana en presencia de diluciones seriadas de anticuerpos biespecífieos 5T4.

Se mezclan volúmenes iguales de células dirigidas marcadas con DiO y células efectoras (es decir, PBMC sin células CD14+) , lo que resulta en una relación de células E:T de 10:1. 160 µ? de esta suspensión se transfiere a cada pozo de una placa de 96 pozos. Se agregan 40 µ? de diluciones seriadas de anticuerpos biespecífieos 5T4 y un control negativo biespecífico (un anticuerpo biespecífico basado en CD3 que reconoce un antígeno objetivo irrelevante) o medio completo RPMI como un control negativo adicional. La reacción citotóxica mediada por anticuerpo biespecífico se lleva a cabo durante 48 horas en un incubador humidificado con C02 7%. Después las células se transfieren a una placa de 96 pozos nuevas y se monitorea la pérdida de integridad de membrana celular objetivo al agregar yoduro de propidio (PI) a una concentración final de 1 g/ml . El PI es un colorante impermeable a membrana que normalmente es excluido de las células viables mientras que las células muertas lo captan y se vuelven identificables por emisión fluorescente. Las muestras se miden por citometría de flujo en un instrumento FACSCanto II y se analizan por el programa FACSDiva (ambos de Becton Dickinson) .

Las células objetivo se identifican como células DiO positivas. Las células objetivo PI negativas se clasifican como células objetivo vivas. Se calcula el porcentaje de citotoxicidad de acuerdo con la siguiente fórmula : . .. , r„, " célula objetivo muertas Citotoxicidad [%\ = . "células objetivo n = número de eventos Utilizando el programa GraphPad Prims 5 (Graph Pad Software, San Diego) , se gráfica el porcentaje de citotoxicidad contra las concentraciones correspondientes de anticuerpo biespecíf ico . Se analizan las curvas dosis-respuesta con los cuatro modelos de regresión logísticos paramétricos para evaluación de curvas dosis-respuestas sigmoideas con pendiente de colina fija y se calculan los valores CE50.

Análisis de citotoxicidad basados en FACS con la línea de linfocitos T de macaco.

La línea de linfocitos T de macaco 4119LnPx (Knappe et al. Blood 95:3256-61 (2000) , proporcionada amablemente por el profesor Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuernberg) se utilizó como fuente de células efectoras. El etiquetado de células objetivo de células CHO transfectadas con 5T4 de macaco y el análisis basado en citometría de flujo de la actividad citotóxica se realizó como se describe en lo anterior.

EJEMPLO 9 Actividad citotoxica Se analizó la potencia de anticuerpos biespecíficos 5T4 similares humanos en linfocitos T efectores redirigidos contra células objetivo que expresan 5T4 en cinco análisis de citotoxicidad in vitro adicionales: 1. La potencia de anticuerpos biespecíficos 5T4 en linfocitos T efectores humanos estimulados redirigidos contra la línea de célula de tumor humano 5T4 positivas HCT116 se mide en un análisis de liberación de 51-cromo. 2. La potencia de anticuerpos biespecíficos 5T4 en la redirección de linfocitos T en células CHO transíectadas con 5T4 humano contra PBMC humano no estimulado se mide en un análisis de citotoxicidad basado en FACS . 3. La potencia de anticuerpos biespecíficos 5T4 en la redirección de linfocitos T en PBMC humano no estimulado contra la línea de células de tumor humano positiva a 5T4 , N87, se mide en un análisis de citotoxicidad basado en FACS . 4. La conformación de que los anticuerpos biespecíficos 5T4 de reacción cruzada son capaces de redirigir linfocitos T de macaco contra células CHO transíectadas con 5T4 de macaco, se realiza un análisis de citotoxicidad basado en FACS con una línea de linfocitos T de macaco como linfocitos T efectores. 5. La separación de potencia entre formas monomérica y dimérica de anticuerpos biespecífieos 5T4 se determinó en un análisis de liberación de 51-cromo utilizando células CHO transíectadas con 5T4 humana como células objetivo y linfocitos T humanos estimulados como células efectoras . 9.1 Linfocitos T humanos estimulados contra la línea de células tumorales humanas 5T4 positivas, HCT116. La actividad citotóxica de anticuerpos biespecífieos 5T4 se analizó en un análisis de citotoxicidad de liberación de 51-cromo (51Cr) utilizando la línea de células tumorales humanas positivas a 5T4 HCT116 (ATCC NoCCL-247) como fuente de células objetivo y los linfocitos T CD8 humanos enriquecidos y estimulados como células efectoras (figuras 9A-9C) .

De acuerdo con los resultados de los análisis de liberación de 51cromo con linfocitos T CD8 humanos enriquecidos y estimulados como células efectoras y células CHO transfectadas con 5T4 humana como objetivos, la mayor parte de los anticuerpos biespecífieos 5T4 citotóxicos con valore CE50 tan bajos como 1 dígito pg/ml se encontraron dentro del conjunto de epítopo E2/4 cuando los linfocitos T CD8 humanos enriquecidos y estimulados se utilizaron como células efectoras y la línea de célula tumoral humana 5T4 positiva HCT116 sirvió como objetivo. La fuerte actividad de los anticuerpos biespecífieos 5T4 por el conjunto de epítopo E4 también se puede observar dentro de los valores CE50 en el análisis de HCT116 de dos dígitos de pg/ml. Los anticuerpos biespecíf icos 5T4 del conjunto de epítopo E7, no obstante, mostraron una citotoxicidad pobre contra células HCT116 con valores de CE50 de dos dígitos de ng/ml, aunque sus valores CE50 para actividad citotóxica contra células CHO transfectadas con 5T4 humanas aún está dentro del intervalo aceptable de tres dígitos de pg/ml. 9.2 PBMC humanos estimulados contra células objetivo transfectadas con 5T4 humano La actividad citotóxica de anticuerpos biespecíficos para 5T4 también se analizó en un análisis de citotoxicidad basado en FACS utilizando células CHO transfectadas con 5T4 humana como células objetivo y PBMC humanos no estimulados como células efectoras (figuras 10A-10C) .

Los resultados de los análisis de citotoxicidad basados en FACS con PBMC humanos no estimulados como células efectoras y células CHO transfectadas con 5T4 humana como objetivos confirmaron la relación epítopo-actividad ya observada en los análisis de liberación de 51cromo. Dentro del conjunto de epítopo E2/4 seis de los ocho anticuerpos biespecíf icos 5T4 demostraron ser muy potentes con valores de CE50 de 1 dígito, en pg/ml, y dos de los ocho aún presentaban valores CE50 con 2 dígitos, en pg/ml. La totalidad de los cuatro conjuntos E4 biespecífieos se encuentran en el intervalo de CE50 de dos dígitos, en pg/ml mientras que los anticuerpos biespecífieos 5T4 del conjunto E7 requieren concentraciones de 3 dígitos, en pg/ml (es decir, CE50) para inducir lisis semimáxima de células CHO transfectadas con 5T4 humana por PBMC humanos no estimulados. 9.3 PBMC humanos no estimulados contra la línea de células tumorales humanas NCI-N87 positiva a 5T4 La actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos 5T4 se analizó adicionalmente en un análisis de citotoxicidad basado en FACS utilizando la línea de células tumorales humanas positivas a 5T4 NCI-N87 como fuente de células objetivo y PBMC humanos no estimulados como células efectoras (figuras 11A-11C) .

Los resultados de los análisis de citotoxicidad basados en FACS con PBMC humanos no estimulados como células efectoras y la línea de células tumorales humanas positivas a 5T4 , NCI-N87 como objetivo, confirmaron nuevamente la actividad citotóxica superior de los anticuerpos biespecífieos 5T4 mapeados en el conjunto E2/4. En este análisis, los cuatro anticuerpos biespecífieos 5T4 del conjunto de epítopo E4 demostraron ser casi tan activos como sus contrapartes E2/4. No obstante, el conjunto E7 de anticuerpos biespecífieos requiere concentraciones de 1 dígito, en ng/ml (es decir, CE50) para inducir lisis semimáxíma de células tumorales NCI-N87 humanas, lo cual concuerda con la pobre actividad citotóxica contra las otras líneas de células tumorales humanas positivas a 5T4 (HCT116) , como se probaron en los análisis de liberación de 51cromo con linfocitos T efectores CD8 humanos enriquecidos y estimulados . 9.4 Linfocitos T de macaco contra células objetivo que expresan 5T4 de macaco.

Finalmente, se analizó la actividad citotóxica de anticuerpos biespecífieos 5T4 en un análisis de citotoxicidad basado en FACS utilizando células CHO transfectadas con 5T4 de macaco como células objetivo, y una línea de linfocitos T de macaco como fuentes de células efectoras (figura 12) .

Los resultados de los análisis de citotoxicidad basados en FACS en el sistema de macaco recuerdan estrechamente el hallazgo en el sistema humano. En consecuencia, los linfocitos T de macaco de la línea de células 4119LnPx se indujeron para destruir eficientemente células CHO transfectadas con 5T4 de macaco mediante anticuerpos biespecífieos 5T4 del conjunto E2/4 con un valor de CE50 de 1 dígito, en pg/ml, por anticuerpos biespecífieos 5T4 del conjunto E4 con un valor CE50 de 2 dígitos, en pg/ml) y los anticuerpos biespecíficos 5T4 en el conjunto E7 con valores CE50 de 3 ó 4 dígitos, en Pg/ml.

EJEMPLO 10 Eficacia terapéutica de anticuerpos biespecí fieos en modelos de xenoinjeto de tumor humano Las líneas de células cancerosas humanas HCT-116 y NCI-N87 se inyectaron subcutáneamente en el flanco dorsal derecho de ratones NOD . CB17-Prkdcscid/J .

Después de que los tumores alcanzaron un volumen de 180-200 mm3, se distribuyó aleatoriamente a los ratones en grupos de tratamiento. Se transplantaron linfocitos T humanos expandidos in vi tro dentro de los ratones por inyección en la cavidad peritoneal de animales de grupos. Los ratones del grupo 1 (n = 5) no recibieron células efectoras y se utilizaron como un control sin transplante para comparación con el grupo 2, para monitorear el impacto de linfocitos T solos sobre el crecimiento del tumor.

El tratamiento comenzó cuando la media del volumen de tumor alcanzó -240 (HCT-116) y 200 mm3 (NCI-N87) respectivamente. La media de tamaño de tumor de cada grupo de tratamiento en el día del inicio del tratamiento no fue estadísticamente diferente de cualquier otro grupo (análisis de varianza) . Se trató a los ratones con 0.1, 0.5 y 2.5 mg/kg/día de 5T4-12-CD3 por inyección intravenosa en bolo a los 14 días (HCT-116) y 21 días (NCI-N87), respectivamente.

Se midieron los tumores por calibrador durante el estudio y se evalúa el progreso por comparación entre los grupos de volúmenes de tumor.

TABLA 3 - Volumen de tumor relativo en un modelo de tumor de etapa avanzada HCT-116 El volumen de tumor en el día x se expresa como volumen de tumor relativo (RTV, por sus siglas en inglés) y se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula RTV TVx/TV15, en donde TVx es el volumen del tumor en el día x y TV15 es el volumen de tumor antes del inicio del tratamiento en el día 15.

TABLA 4 - Inhibición de crecimiento de tumor mediada por anticuerpo biespecífico en un modelo de tumor de etapa avanzada HCT-116 El T/C% se determina al calcular TV como T/C% = 100 x (mediana de TV del grupo tratado) / (mediana de TV del grupo control) .

TABLA 5 - Volumen de tumor relativo en un modelo de tumor de etapa avanzada NCI -N87 volumen de tumor en el día x se expresa como volumen de tumor relativo RTV, por sus siglas en inglés) y se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: RTV = TVx/TV22, en donde TVx es el volumen del tumor en el día x y TV15 es el volumen del tumor antes del inicio del tratamiento en el día 22.

TABLA 6 - Inhibición de crecimiento de tumor mediado por anticuerpo biespecífico en un modelo de tumor de etapa avanzada de NCI-N87 El T/C% se determina al calcular TV como T/C% = 100 x (mediana de TV del grupo tratado) / (mediana de TV del grupo control) . 5 10 5 10 5 10 5 15 5 5 5 10 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una molécula de unión biespecífica caracterizada porque comprende un primero y un segundo dominio de unión, (a) en donde el primer dominio de unión es capaz de unión al conjunto 4 de epítopo de 5T4 ; y (b) en donde el segundo dominio entre unión es capaz de unión al complejo de receptor de CD3 en linfocitos T; en donde el conjunto 4 de epítopo corresponde al dominio de proteína extracelular de 5T4 conformado por residuos aminoácidos 170 a 222 de la secuencia humana, como se muestra en la SEC ID NO: 2.

2. La molécula de unión biespecífica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer dominio de unión es capaz de unión al conjunto 2 de epítopo y el conjunto 4 de epítopo de 5T4 y en donde el conjunto 2 de epítopo corresponde al dominio de proteína extracelular de 5T4 conformado por los residuos aminoácidos 78 a 138 de la secuencia humana, como se muestra en la SEC ID NO: 2.

3. La molécula de unión biespecífica de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque el primer dominio de unión es capaz de unión a 5T4 humano y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus y/o el segundo dominio de unión es capaz de unión a CD3 epsilón humano y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus.

4. La molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la afinidad del primer dominio de unión por 5T4 humano es _<15 nM (preferiblemente <10 nM) .

5. La molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el primero y segundo dominios de unión se derivan de un anticuerpo.

6. La molécula de unión biespecífica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque se selecciona del grupo de (scFv)2, (dominio simple de mAb)2, scFv-dominio simple mAb, diacuerpo u oligómeros de los mismos .

7. La molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el primer dominio de unión comprende una región VL que comprende CDR-Ll, CDR-L2 y CDR-L3 y una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que se selecciona de: (a) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 16, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 17, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 18, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 13, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 14 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 15; (b) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 26, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 17, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 28, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 23, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 24 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 25; (c) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 36, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 37, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 38, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 33, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 34 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 35; (d) CDR-Ll como se muestra en la SEC ID NO: 50, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 51, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 52, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 47, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 48 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 49; (e) CDR-Ll como se muestra en la SEC ID NO: 90, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 91, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 92, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 87, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 88 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 89; (f) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 100, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 101, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 102, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 97, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 98 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 99; (g) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 110, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 111, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 112, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 107, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 108 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 109; (h) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 120, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 121, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 122, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 117, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 118 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 119; (i) CDR-Ll como se muestra en la SEC ID NO: 130, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 131, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 132, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 127, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 128 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 129; (j) CDR-Ll como se muestra en la SEC ID NO: 144, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 145, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 146, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 141, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 142 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 143; (k) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 158, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 159, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 160, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 155, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 156 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 157; (1) CDR-L1 como se muestra en la SEC ID NO: 168, CDR-L2 como se muestra en la SEC ID NO: 169, CDR-L3 como se muestra en la SEC ID NO: 170, CDR-H1 como se muestra en la SEC ID NO: 165, CDR-H2 como se muestra en la SEC ID NO: 166 y CDR-H3 como se muestra en la SEC ID NO: 167.

8. La molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el primer dominio de unión comprende una región VL que se selecciona del grupo que consiste de una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 86, SEC ID NO: 96, SEC ID NO: 106, SEC ID NO: 116, SEC ID NO: 126, SEC ID NO: 140, SEC ID NO: 154 Y SEC ID NO: 164.

9. La molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el primer dominio de unión comprende una región VH que se selecciona del grupo que consiste de una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 85, SEC ID NO: 95, SEC ID NO: 105, SEC ID NO: 115, SEC ID NO: 125, SEC ID NO: 139, SEC ID NO: 153 y SEC ID NO: 163.

10. La molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la primera unión comprende una región VL y una región VH que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 12 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 11; (b) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 22 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 21; (c ) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 32 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 31; (d) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 46 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 45; (e) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 86 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 85; ( f ) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 96 y una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 95; (g) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 106 una :región VH como se muestra en la SEC ID NO: 105 (h) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 116 una :región VH como se muestra en la SEC ID NO: 115; ( i ) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 126 una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 125; (j) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 140 una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 139; (k) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 154 una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 153; y (1) una región VL como se muestra en la SEC ID NO: 164 una región VH como se muestra en la SEC ID NO: 163.

11. La molécula de unión biespecífica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 20, SEC ID NO : 30, SEC ID NO: 39, SEC ID NO: 44, SEC ID NO: 84, SEC ID NO: 94, SEC ID NO: 104, SEC ID NO: 114, SEC ID NO: 124, SEC ID NO: 133, SEC ID NO: 138, SEC ID NO: 147. SEC ID NO: 152 y SEC ID NO: 162.

12. Una secuencia de ácido nucleico caracterizada porque codifica para una molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un vector, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12.

14. Una célula hospedera transformada o transfectada con la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, o un vector de conformidad con la reivindicación 13.

15. Un proceso para la producción de una molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque comprende cultivar una célula hospedera definida de conformidad con la reivindicación 14, bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y recuperar la molécula de unión biespecífica producida del cultivo.

16. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o producida de conformidad con el proceso de la reivindicación 15.

17. La molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o producida con el proceso de conformidad con la reivindicación 15, para usarse en la prevención, tratamiento o disminución de una enfermedad que se selecciona de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico .

18. Un método para el tratamiento o disminución de una enfermedad que se selecciona de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico, caracterizado porque comprende la etapa de administrar a un sujeto en necesidad del mismo la molécula de unión biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o producida con el proceso de conformidad con la reivindicación 15.

19. Un kit caracterizado porque comprende una molécula biespecífica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12, un vector de conformidad con cualquiera de la reivindicación 13 o una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14.

20. Uso de los residuos aminoácidos 170 a 222 (conjunto 4 de epítopo) y/o 78 a 138 (conjunto 2 de epítopo) de la secuencia 5T4 humana de conformidad con la SEC ID NO : 2 para la generación de un anticuerpo.

21. Un método para la generación de un anticuerpo, preferiblemente una molécula de unión biespecífica, caracterizado porque comprende: (a) inmunizar a un animal con una proteína que comprende los residuos aminoácidos 170 a 222 (conjunto 4 de epítopo) y/o 78 a 138 (conjunto 2 de epítopo) de la secuencia 5T4 humana, como se muestra en la SEC ID NO: 2, (b) obtener el anticuerpo y, (c) opcionalmente convertir el anticuerpo en una molécula de unión biespecífica que tiene preferiblemente la capacidad de unir 5T4 humana y CD3 como se describe en la presente .

22. Un fragmento de 5T4 humana caracterizado porque consiste de los residuos aminoácidos 170 a 222 (conjunto 4 de epítopo) o los aminoácidos 78 a 138 (conjunto 2 de epítopo) de la secuencia 5T4 humana, como se muestra en la SEC ID NO: 2 .