BR112016007736B1 - Armação polimérica, e, composição farmacêutica - Google Patents

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Mao YIN
Timothy B. Lowinger
Joshua D. Thomas
Cheri A. Stevenson
Venu R. Gurijala
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Mersana Therapeutics, Inc
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Abstract

ARMAÇÃO POLIMÉRICA, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. Uma armação polimérica útil para conjugar com uma molécula de reconhecimento com base em proteína (PBRM) para formar um Conjugado de droga de polímero PBRM é descrita aqui. A armação inclui um ou mais grupos maleimido terminais. Também é descrito um Conjugado de droga de polímero PBRM preparado a partir da armação. As composições compreendendo os conjugados, métodos para preparação dos mesmos e métodos para tratar vários distúrbios com os conjugados ou composições dos mesmos também são descritas.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de e prioridade sob 35 USC § 119(e) para incluir os Pedidos de Patente U.S. Nos. 61/890.046, depositado em 11 de outubro de 2013; 61/975.455, depositado em 4 de abril de 2014; 61/988.011, depositado em 2 de maio de 2014; e 62/010.972, depositado em 11 de junho de 2014. Os conteúdos de cada um destes pedidos são por meio deste incorporados por referência em suas totalidades.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] Tradicionalmente, os produtos farmacêuticos consistiam primariamente em moléculas que são dispensadas oralmente (como pílulas sólidas e líquidos) ou como injetáveis. Ao longo das últimas três décadas, formulações (isto é, composições que controlam a via e/ou a taxa de distribuição de droga e permitem a distribuição do agente terapêutico no local onde ele é necessário) se tornaram cada vez mais comuns e complexas. No entanto, muitas questões e desafios com relação ao desenvolvimento de novos tratamentos, bem como os mecanismos com os quais administrar os mesmos necessitam ser alcançados. Por exemplo, muitas drogas exibem potências e efeitos terapêuticos limitados ou de outra forma reduzidos porque eles são geralmente ou submetidos à degradação parcial antes de alcançarem o alvo desejado no corpo, ou se acumularem em tecidos diferentes do alvo, ou ambos.
[003] Um objetivo no campo dos sistemas de distribuição de droga, assim, é distribuir medicações intactas para especificamente áreas marcadas no alvo do corpo através de um sistema que possa estabilizar a droga e controlar a transferência in vivo do agente terapêutico utilizando ou mecanismos psicológicos ou químicos, ou ambos.
[004] Conjugados anticorpos-drogas têm sido desenvolvidos como agentes terapêuticos específicos no alvo. Anticorpos contra vários antígenos de superfície da célula de câncer têm sidos conjugados com agentes citotóxicos que inibem vários alvos celulares essenciais como micro túbulos (maitansinoides, auristatinas, taxanos: Patentes U.S. 5.208.020; 5.416.064; 6.333.410; 6.441.163; 6.340.701; 6.372.738; 6.436.931; 6.596.757; e 7.276.497); DNA (caliqueamicina, doxorrubicina, análogos CC-1065; Patentes U.S. 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; 6.534.660; 6.756.397; e 6.630,579). Conjugados de anticorpos com algumas destas drogas citotóxicas estão sendo ativamente investigados nas clínicas para terapia de câncer (Ricart, A. D. e Tolcher, A. W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-255; Krop et al., 2010, J. Clin. Oncol., 28, 2698-2704). No entanto, os conjugados anticorpos-drogas têm exibido algumas limitações. Uma limitação principal é sua incapacidade para distribuir uma concentração suficiente da droga para o sítio do alvo devido ao número limitado de antígenos alvo e a citotoxicidade relativamente moderada das drogas contra câncer como metotrexato, daunorrubicina, maitansinoides, taxanos e vincristina. Uma abordagem para alcançar uma citotoxicidade significante é pela ligação de um grande número de moléculas ou diretamente ou indiretamente ao anticorpo. No entanto, tais anticorpos fortemente modificados frequentemente exibem uma aglutinação prejudicada com o alvo e rápida depuração in vivo na corrente sanguínea. Desse modo, existe uma necessidade para melhorar a capacidade para distribuir uma concentração suficiente de uma droga para o alvo de modo que uma citotoxicidade máxima para a droga seja alcançada.
SUMÁRIO DA INVEN ÇÃO
[005] A presente invenção se refere a um conjugado proteína- polímero-droga que é biodegradável, biocompatível e exibe uma elevada carga de droga assim como forte ligação ao antígeno alvo. A presente invenção também se refere a uma armação polimérica utilizável para conjugar com uma molécula de reconhecimento à base de proteína (PBRM) de modo a obter o conjugado proteína-polímero-droga.
[006] Em um outro aspecto, a invenção adicionalmente a uma armação polimérica da fórmula (Id) útil para conjugar com uma molécula de reconhecimento com base em proteína (PBRM):
Figure img0001
em que: a armação compreende poli(1-hidroximetil-etileno- hidroximetil-formal) (PHF) tendo um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa; cada ocorrência de D independentemente é um agente terapêutico tendo um peso molecular de < 5 kDa e o entre D e o grupo carbonila indica ligação direta ou indireta de D ao grupo carbonila, X é CH2, O ou NH; m é um número inteiro de 1 a cerca de 300, m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 140, m7 é um número inteiro de 1 a cerca de 40, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 18, e a soma de m, m1, m3 e m7 varia de cerca de 15 a cerca de 300.
[007] A armação da fórmula (Id) pode incluir um ou mais dos seguintes traços:
[008] Quando o PHF na Fórmula (Id) tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 20 kDa, m7 é um número inteiro de 1 a cerca de 20, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 10, m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 70 e a soma de m, m1, m3 e m7 varia de cerca de 15 a cerca de 150.
[009] Quando o PHF na Fórmula (Id) tem um peso molecular variando de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa, m7 é um número inteiro de 2 a cerca de 15, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 8, m1 é um número inteiro de 2 a cerca de 50 e a soma de m, m1, m3 e m7 varia de cerca de 20 a cerca de 110.
[0010] Quando o PHF na Fórmula (Id) tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa, m7 é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 10, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 5, m1 é um número inteiro de cerca de 5 a cerca de 35 e a soma de m, m1, m3 e m7 varia de cerca de 40 a cerca de 75.
[0011] Cada ocorrência da porção de maleimido na unidade “m3” da fórmula (Id) é para formar adicionalmente uma ligação covalente com um grupo funcional da PBRM.
[0012] Em uma modalidade, a soma de m1 e m7 é um número inteiro de 2 a cerca de 180.
[0013] A armação da fórmula (Id) pode compreender adicionalmente uma PBRM conjugada aa armação contendo D por intermédio de um ou mais grupos de maleimido da armação contendo D formando um conjugado de proteína-polímero-droga. Por exemplo, a armação da fórmula (Id) compreende adicionalmente uma PBRM conjugada à armação contendo D por intermédio de dois ou mais grupos de maleimido (por exemplo, até cinco) da armação. Por exemplo, a PBRM é conectada a uma ou mais armações poliméricas contendo D da fórmula (Id).
[0014] Em certas modalidades, o conjugado de polímero droga (Id) quando conjugado a uma PBRM é da fórmula (Ie):
Figure img0002
em que: um de Xa e Xb é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido, ou Xa e Xb, juntos com os átomos de carbono aos quais estão ligados formam uma ligação dupla de carbono-carbono; m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 17, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8, em que a soma de m3a e m3b é m3, a soma de m, m1, m7, m3a e m3b varia de cerca de 15 a cerca de 300, e m5 é um número inteiro de 1 a cerca de 10.
[0015] No conjugado de proteína-polímero-droga da fórmula (Id), cada D pode ser a mesma porção ou diferente e cada PBRM pode ser a mesma porção ou diferente.
[0016] Em certas modalidades a razão entre D e PBRM pode ser de cerca de 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1 ou 6:1.
[0017] Em algumas modalidades, a razão entre D e PBRM pode ser de cerca de 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 ou 10:1.
[0018] Em outras modalidades, a razão entre D e PBRM pode ser de cerca de 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 ou 12:1.
[0019] Em certas modalidades a razão entre PHF e PBRM pode ser de cerca de 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, ou 2:1.
[0020] Em algumas modalidades, a razão entre PHF e PBRM pode ser de cerca de 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, ou 2:1.
[0021] Em outras modalidades, a razão entre PHF e PBRM pode ser de cerca de 4:1, 3:1, ou 2:1.
[0022] Em uma modalidade, D é a) um composto de auristatina; (b) um composto de caliqueamicina; (c) um composto de duocarmicina; (d) um inibidor de topoisomerase, (e) um composto de pirrolobenzodiazepina; (f) um composto de vinca; (g) um inibidor da síntese de proteína; (h) um inibidor da RNA polimerase; (i) um composto aglutinante de tubulina; ou um análogo dos mesmos.
[0023] Em certas modalidades, D é a) um composto de auristatina; (b) um composto de caliqueamicina; (c) um composto de duocarmicina; (d) um composto de camptotecina, (e) um composto de pirrolobenzodiazepina; (f) um composto de vinca; ou um análogo dos mesmos.
[0024] Em uma modalidade, o composto de auristatina é auristatina, Dolastatina, monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF), auristatina F hidroxipropil amida (AF HPA), ou auristatina F fenilenodiamina (AFP).
[0025] Em uma modalidade, a duocarmicina ou análogo da mesma são duocarmicina A, duocarmicina B1, duocarmicina B2, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duocarmicina D, duocarmicina SA, CC-1065, adozelesina, bizelesina ou carzelesina.
[0026] Em uma modalidade, o composto de camptotecina é camptotecina, CPT-11 (irinotecano), SN-38, ou topotecano.
[0027] Em uma modalidade, o composto de pirrolobenzodiazepina é um monômero de pirrolobenzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina simétrico ou um dímero de pirrolobenzodiazepina não simétrico.
[0028] Em uma modalidade, D é AF HPA e a razão entre AF HPA e PBRM pode ser de cerca de 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1 ou 6:1.
[0029] Em uma outra modalidade, a razão entre AF HPA e PBRM pode ser de cerca de 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 ou 10:1.
[0030] Adicionalmente em outras modalidades, a razão entre AF HPA e PBRM pode ser de cerca de 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 ou 12:1.
[0031] Em um outro aspecto, a invenção adicionalmente a uma armação polimérica da fórmula (Ia) útil para conjugar com uma molécula de reconhecimento com base em proteína (PBRM):
Figure img0003
em que: a armação compreende poli(1-hidroximetil-etileno- hidroximetil-formal) (PHF) tendo um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa; X é CH2, O ou NH; m é um número inteiro de 1 a cerca de 300, m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 140, m2 é um número inteiro de 1 a cerca de 40, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 18, e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de cerca de 15 a cerca de 300.
[0032] A armação da fórmula (Ia) pode incluir um ou mais dos seguintes traços:
[0033] Quando o PHF na Fórmula (Ia) tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 20 kDa, m2 é um número inteiro de 1 a cerca de 20, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 10, m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 70 e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de cerca de 15 a cerca de 150.
[0034] Quando o PHF na Fórmula (Ia) tem um peso molecular variando de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa, m2 é um número inteiro de 2 a cerca de 15, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 8, m1 é um número inteiro de 2 a cerca de 50 e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de cerca de 20 a cerca de 110.
[0035] Quando o PHF na Fórmula (Ia) tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa, m2 é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 10, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 5, m1 é um número inteiro de cerca de 5 a cerca de 35 e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de cerca de 40 a cerca de 75. Cada ocorrência da porção de maleimido na unidade “m3” da fórmula (Ia) é para formar adicionalmente uma ligação covalente com um grupo funcional da PBRM.
[0036]
[0037] Em uma modalidade, a armação da fórmula (Ia) é da fórmula (A) ou (A1):
Figure img0004
(A1) em que: o PHF tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa; m é um número inteiro de 1 a cerca de 75, m1 é um número inteiro de cerca de 5 a cerca de 35, m2 é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 10, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 5, e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de 40 a cerca de 75.
[0038] Por exemplo, cada ocorrência da porção de maleimido na unidade “m3” da fórmula (A) ou (A1) é para formar adicionalmente uma ligação covalente com um grupo funcional da PBRM.
[0039] A armação da fórmula (Ia) compreende adicionalmente uma PBRM conjugada aa armação por intermédio de um ou mais grupos de maleimidos da armação polimérica. Por exemplo, a armação da fórmula (Ia) compreende adicionalmente uma PBRM conjugada aa armação por intermédio de dois ou mais grupos de maleimido (por exemplo, até cinco) da armação.
[0040] A PBRM tem um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior; 80 kDa ou maior; 100 kDa ou maior; 120 kDa ou maior; 140 kDa ou maior; 160 kDa ou maior; 180 kDa ou maior; ou 200 kDa ou maior, ou de cerca de 40 a 200 kDa, 40 a 180 kDa, 40 a 140 kDa, 60 a 200 kDa, 60 a 180 kDa, 60 a 140 kDa, 80 a 200 kDa, 80 a 180 kDa, 80 a 140 kDa, 100 a 200 kDa, 100 a 180 kDa, ou 100 a 140 kDa).
[0041] A PBRM tem um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior; 80 kDa ou maior; 100 kDa ou maior; 120 kDa ou maior; 140 kDa ou maior; 160 kDa ou maior; 180 kDa ou maior; ou 200 kDa ou maior, ou de cerca de 40 a 200 kDa, 40 a 180 kDa, 40 a 140 kDa, 60 a 200 kDa, 60 a 180 kDa, 60 a 140 kDa, 80 a 200 kDa, 80 a 180 kDa, 80 a 140 kDa, 100 a 200 kDa, 100 a 180 kDa, ou 100 a 140 kDa) e tem um grupo sulfidrila (isto é, -SH ou tiol).
[0042] A PBRM é conjugada ao conjugado polimérico que carrega droga por intermédio do grupo sulfidrila da PBRM conectada ao grupo de maleimido do conjugado polimérico que carrega droga, ver, por exemplo, o átomo de enxofre (-S-) na unidade de “m3b” dentro dos parênteses de qualquer uma das fórmulas aqui desejadas, por exemplo, Fórmula (Ib), (B), (B1) ou (Ie). Em modalidades, o átomo de enxofre é parte da PBRM e é derivado de um grupo sulfidrila (tiol) na PBRM que foi reagida com o grupo maleimido para formar uma ligação (ligação de sulfeto) ao conjugado polimérico que carrega droga.
[0043] Uma PBRM é conectada a um ou mais armações poliméricas que carregam droga da fórmula (Ia).
[0044] A armação compreendendo a PBRM é da fórmula (Ib):
Figure img0005
, em que: um de Xa e Xb é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido, ou Xa e Xb, juntos com os átomos de carbono aos quais estão ligados formam uma ligação dupla de carbono-carbono; m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 17, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8, em que a soma de m3a e m3b é m3 (por exemplo, um número inteiro de 1 a cerca de 18), a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 15 a cerca de 300, e m5 é um número inteiro de 1 a cerca de 10.
[0045] A armação da fórmula (Ib) pode incluir um ou mais dos seguintes traços:
[0046] A PBRM tem um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior; 80 kDa ou maior; 100 kDa ou maior; 120 kDa ou maior; 140 kDa ou maior; 160 kDa ou maior; 180 kDa ou maior; ou 200 kDa ou maior, ou de cerca de 40 a 200 kDa, 40 a 180 kDa, 40 a 140 kDa, 60 a 200 kDa, 60 a 180 kDa, 60 a 140 kDa, 80 a 200 kDa, 80 a 180 kDa, 80 a 140 kDa, 100 a 200 kDa, 100 a 180 kDa, ou 100 a 140 kDa).
[0047] A PBRM tem um grupo sulfidrila (isto é, -SH ou tiol).
[0048] O número total das ligações covalentes (por exemplo, ligação de sulfeto) formadas entre o PHF e a PBRM (ou número total de pontos de ligação) é 10 ou menos.
[0049] Quando o PHF na Fórmula (Ib) tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 20 kDa, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 15 a cerca de 150, m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 70, m2 é um número inteiro de 1 a cerca de 20, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 9, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8 e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 8.
[0050] Quando o PHF na Fórmula (Ib) tem um peso molecular variando de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 20 a cerca de 110, m1 é um número inteiro de 2 a cerca de 50, m2 é um número inteiro de 2 a cerca de 15, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 7, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8 e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 4.
[0051] Quando o PHF na Fórmula (Ib) tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 40 a cerca de 75, m1 é um número inteiro de cerca de 5 a cerca de 35, m2 é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 10, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 4, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 5 e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 4.
[0052] Em certas modalidades, a razão entre auristatina F hidroxilpropil amida (“AF HPA”) e PBRM pode ser de cerca de 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1 ou 6:1.
[0053] Em algumas modalidades, a razão entre AF HPA e PBRM pode ser de cerca de 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1 ou 10:1.
[0054] Em outras modalidades, a razão entre AF HPA e PBRM pode ser de cerca de 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1 ou 12:1.
[0055] Em certas modalidades, a razão entre PHF e PBRM pode ser de cerca de 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, ou 2:1.
[0056] Em algumas modalidades, a razão entre PHF e PBRM pode ser de cerca de 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, ou 2:1.
[0057] Em outras modalidades, a razão entre PHF e PBRM pode ser de cerca de 4:1, 3:1, ou 2:1.
[0058] As porções bloqueadoras de maleimido (por exemplo, Xa ou Xb) são porções que podem ser covalentemente ligadas a um dos dois átomos de carbono da olefina na reação do grupo maleimido com um composto contendo tiol da fórmula (II): R90-(CH2)d-SH (II) em que: R90 é NHR91, OH, COOR93, CH(NHR91)COOR93 ou um grupo fenila substituído; R93 é hidrogênio ou alquila C1-4; R91 é hidrogênio, CH3ou CH3COe d é um número inteiro de 1 a 3.
[0059] Em uma modalidade, o composto bloqueador de maleimido da fórmula (II) pode ser cisteína, N-acetil cisteína, éster metílico de cisteína, N- metil cisteína, 2-mercaptoetanol, ácido 3-mercaptopropanóico, ácido 2- mercaptoacético, mercaptometanol (isto é, HOCH2SH), benzil tiol em que a fenila é substituída com um ou mais substituintes hidrofílicos, ou 3- aminopropano-1-tiol. O um ou mais substituintes hidrofílicos em fenila compreendem OH, SH, metóxi, etóxi, COOH, CHO, COalquila C1-4, NH2, F, ciano, SO3H, PO3H e os seus semelhantes.
[0060] Em um outro aspecto, o grupo bloqueador de maleimido é -S- (CH2)d-R90, em que, R90 é OH, COOH, ou CH(NHR91)COOR93; R93 é hidrogênio ou CH3; R91 é hidrogênio ou CH3CO; e d é 1 ou 2.
[0061] Em uma outra modalidade, o grupo bloqueador de maleimido é -S-CH2-CH(NH2)COOH.
[0062] Em algumas modalidades, o grupo bloqueador de maleimido é solúvel em água.
[0063] A armação da fórmula (Ib) é das fórmulas (B) ou (B1):
Figure img0006
em que: o PHF tem um peso molecular variando de 5 kDa a 10 kDa; m é um número inteiro de 1 a 75, m1 é um número inteiro de cerca de 5 a cerca de 35, m2 é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 10, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 4, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 5, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 40 a cerca de 75, e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 4.
[0064] Em certas modalidades, nas Fórmulas (B) ou (B1), o número total dos pontos de ligação é 10 ou menos.
[0065] A invenção também fornece armações poliméricas da fórmula (Ic):
Figure img0007
em que: a armação compreende PHF tendo um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa; X é CH2, O ou NH; m é um número inteiro de 1 a cerca de 300, m6 é um número inteiro de 2 a cerca de 180, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 18, e a soma de m, m6 e m3 varia de cerca de 15 a cerca de 300.
[0066] A armação da fórmula (Ic) pode incluir um ou mais dos seguintes traços:
[0067] Quando o PHF na Fórmula (Ic) tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 20 kDa, a soma de m, m6 e m3 varia de cerca de 15 a cerca de 150, m6 é um número inteiro de 2 a cerca de 90 e m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 10.
[0068] Quando o PHF na Fórmula (Ic) tem um peso molecular variando de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa, a soma de m, m6 e m3 varia de cerca de 20 a cerca de 110, m6 é um número inteiro de cerca de 4 a cerca de 65 e m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 8.
[0069] Quando o PHF na Fórmula (Ic) tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa, a soma de m, m6 e m3 varia de cerca de 40 a cerca de 75, m6 é um número inteiro de cerca de 8 a cerca de 45 e m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 5.
[0070] Cada ocorrência da porção de maleimido na unidade “m3” da fórmula (Ic) é para formar adicionalmente uma ligação covalente com um grupo funcional da PBRM.
[0071] A armação da fórmula (Ic) é das fórmulas (C) ou (C1):
Figure img0008
Figure img0009
o PHF tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa; m é um número inteiro de 1 a cerca de 75, m6 é um número inteiro de cerca de 8 a cerca de 45, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 5, e a soma de m, m6 e m3 varia de cerca de 40 a cerca de 75.
[0072] Cada ocorrência da porção de maleimido na unidade “m3” das fórmulas (C) ou (C1) é para formar adicionalmente uma ligação covalente com um grupo funcional da PBRM.
[0073] A armação da fórmula (Ic) pode compreender adicionalmente uma ou mais moléculas de droga (“D”) conectadas ao PHF.
[0074] Em uma modalidade, a armação contendo D da fórmula (Ic) é da fórmula (Id).
[0075] Nas Fórmulas aqui divulgadas, tais como Fórmula (Ia), (Ib,) (Ic), (Id), (Ie), (a), (A1), (B), (B1), (C), (C1) ou (E), a desconexão ou intervalo entre as unidades de poliacetal indicam que as unidades podem ser conectadas entre si em qualquer ordem. Além disso, em certas Fórmulas (por exemplo, aquelas na Tabela D) aqui divulgadas, as estruturas em colchetes, isto é, as unidades monoméricas de poliacetal, não são acompanhadas com o número de unidades de repetição (por exemplo, m1, m2, m3, etc.) para o propósito de simplificar a ilustração e não devem ser interpretadas como tendo apenas uma unidade de repetição cada uma.
[0076] Os exemplos da PBRM incluem, mas não são limitados a anticorpos de tamanho natural tais como IgG e IgM, fragmentos de anticorpo tais como Fabs, scFv, scFvFc, camelídeos, Fab2 e os seus semelhantes, proteínas e peptídeos pequenos.
[0077] Em uma modalidade, a PBRM é um anticorpo de tamanho natural ou um anticorpo scFvFc anti-5T4 humanizado. Por exemplo, a PBRM é um ligante (LG) compreendendo uma imunoglobulina ou fragmento funcional da mesma que alveja a proteína oncofetal humana 5T4.
[0078] Em uma outra modalidade, um conjugado de droga terapêutica e alvejador útil nas terapias antineoplásticas é fornecido. O conjugado de droga terapêutica e alvejador compreende (a) um ligante (LG) que compreende uma imunoglobulina ou fragmento funcional da mesma que alveja proteína oncofetal humana 5T4, o ligante (por exemplo, que em algumas modalidades tem um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior) tendo ligado a ele m5 de armações poliméricas de (b), em que m5 é de um a cerca de dez; e (b) uma armação polimérica compreendendo poli(1- hidroximetil-etileno-hidroximetil-formal) (PHF) que tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa, em que a armação polimérica compreende unidades monoméricas aleatoriamente arranjadas m, m1, m2, m3a e m3b, definidas como segue:
Figure img0010
em que m3a está ausente ou 1 a cerca de 17 unidades monoméricas m3a estão presentes na armação polimérica e em cada unidade, Xa e Xb são independentemente selecionados de (a) um é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido, ou (B) Xa e Xb, juntos com os átomos de carbono aos quais estão ligados formam uma ligação dupla de carbono- ca
Figure img0011
rbono; em que a ligação de sulfeto (-S-) forma o ponto de ligação ao LG e em que 1 a cerca de 8 unidades monoméricas de m3b estão presentes na armação polimérica, em que a soma de m3a e m3b é de 1 a 18 e em que o átomo de enxofre é parte do ligante (LG),
Figure img0012
em que 1 a cerca de 300 unidades monoméricas m estão presentes na armação polimérica;
Figure img0013
em que 1 a cerca de 140 unidades monoméricas m1 estão presentes na armação polimérica; e
Figure img0014
(v): m2: em que 1 a cerca de 40 unidades monoméricas m2 estão presentes na armação polimérica; em que em cada uma das unidades monoméricas m, m1, m2, m3a e m3b, X é CH2, O ou NH e a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 15 a cerca de 300 e em que cada ocorrência de D independentemente é um agente terapêutico tendo um peso molecular de < 5 kDa e o entre D e o grupo carbonila indica ligação direta ou indireta de D ao grupo carbonila.
[0079] Em uma modalidade, o conjugado de droga terapêutica e alvejador tem a seguinte estrutura:
Figure img0015
em que: o PHF tem um peso molecular variando de 5 kDa a 10 kDa; m é 1 a 75, m1 é de cerca de 5 a cerca de 35, m2 é de cerca de 3 a cerca de 10, m3a é de 0 a cerca de 4, m3b é de 1 a cerca de 5, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b é de cerca de 40 a cerca de 75 e m5 é de 2 a cerca de 4.
[0080] Em uma modalidade adicional, um conjugado terapêutico de droga anti-5T4 alvejador útil nas terapias antineoplásticas são fornecidos. O conjugado compreende uma armação polimérica compreendendo um poli(1- hidroximetil-etileno-hidroximetil-formal) (PHF) tendo um peso molecular de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa, em que o conjugado é da seguinte estrutura:
Figure img0016
em que m5 é de 1 a 10; m é um número inteiro de 1 a cerca de 300; m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 140; m2 é um número inteiro de 1 a cerca de 40; m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 17; m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8; em que a soma de m3a e m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 18; e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de cerca de 15 a cerca de 300; X é NH; um de Xa ou Xb é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido; e onde cada ocorrência de D independentemente é um agente terapêutico tendo um peso molecular de < 5kDa e o ’ entre D e o grupo carbonila indica ligação direta ou indireta de D ao grupo carbonila; em que o ANTI-5T4 é um ligante anti-5T4 que compreende uma imunoglobulina ou um fragmento funcional da mesma que é seletivo para antígeno 5T4 oncofetal humano. Por exemplo, o peso molecular do anti-5T4 é de pelo menos de cerca de 40 kDa.
[0081] Adicionalmente em uma outra modalidade, um conjugado de droga terapêutica e alvejador útil nas terapias antineoplásticas é fornecido que compreende anti-5T4 e uma armação polimérica de poli(1-hidroximetil- etileno-hidroximetil-formal) (PHF) compreendendo as unidades mostradas abaixo que podem ser aleatoriamente conectadas entre si:
Figure img0017
ANTI-5T4 é uma construção de anticorpo de cadeia única compreendendo a sequência de amino designada como SEQ ID NO: A; o PHF tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa; a razão média da armação polimérica para anticorpo anti-5T4 é de cerca de 2:1 a cerca de 3:1 ou de cerca de 3:1 a cerca de 4:1 e a razão de AF HPA para anticorpo anti-5T4 é de cerca de 12:1 a cerca de 18:1.
[0082] Em algumas modalidades, a armação polimérica da invenção contém unidades monoméricas aleatoriamente arranjadas m, m1, m2, m3a e m3b. Em algumas modalidades, a armação polimérica da invenção contém unidades monoméricas aleatoriamente arranjadas m, m1, m2 e m3b.
[0083] Em algumas modalidades, a armação polimérica da invenção contém unidades monoméricas aleatoriamente arranjadas m, m1, m7, m3a e m3b. Em algumas modalidades, a armação polimérica da invenção contém unidades monoméricas aleatoriamente arranjadas m, m1, m7 e m3b.
[0084] Em um outro aspecto, a invenção fornece composições compreendendo os conjugados, métodos para a sua preparação e métodos de uso dos mesmos no tratamento de vários distúrbios, incluindo, mas não limitados a câncer. O câncer alvo pode ser câncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, de cabeça e pescoço, fígado, testicular, cervical, sarcoma, hemangioma, esofágico, olho, laríngico, boca, mesotelioma, pele, mieloma, oral, retal, garganta, bexiga, mama, útero, ovário, próstata, pulmão, cólon, pâncreas, renal ou gástrico.
[0085] A invenção adicionalmente se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma armação polimérica ou conjugado aqui descrito e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0086] Adicionalmente em outro aspecto, a invenção se refere a um método de diagnóstico de um distúrbio em um indivíduo que se suspeita tenha o distúrbio O método compreende administrar uma quantidade eficaz do conjugado aqui descrito ao indivíduo que se suspeita tenha o distúrbio ou realizar um teste para detectar um antígeno alvo/receptor em uma amostra extraída do indivíduo de modo a determinar se o indivíduo expressa o antígeno alvo ou receptor.
[0087] Salvo de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui tem o mesmo significado como comumente entendido pelo versado na técnica à qual a invenção pertence. No relatório, as formas no singular também incluem o plural, salvo se o contexto claramente indicar o contrário. Apesar de métodos e materiais similares ou equivalentes ao descritos aqui poderem ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais apropriados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionados são incorporados por referência. As referências citadas aqui não são admitidas como sendo técnica anterior à invenção reivindicada. No caso de conflito, o presente relatório, incluindo definições, será o controle. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não se destinam a ser limitativos.
[0088] Uma das vantagens da presente invenção é que os conjugados proteína-polímero-droga ou as armações poliméricas descritas aqui melhoram muito a biodisponibilidade das drogas a serem distribuídos e/ou melhoram a biodisponibilidade da proteína unida ao carreador polimérico. Uma outra vantagem da presente invenção é que a eficácia do conjugado de proteína- polímero-drogas aqui descrito aumenta ou pelo menos permanece substancialmente a mesma com o aumento na carga de droga dos conjugados. Adicionalmente uma outra vantagem da presente invenção é que os conjugados de proteína-polímero por intermédio da conjugação de tiol à porção de cisteína da proteína exibem estabilidade substancialmente melhorada. Outros aspectos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0089] Figura 1 mostra a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com tumores BT474 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo; PBRM (trastuzumab) a 10 mg/kg; conjugados de PBRM-polímero-droga descritos no Exemplo 4 ou Exemplo 13, a 2,5 mg/kg e 5 mg/kg.
[0090] A Figura 2 mostra a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células JIMT-1 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo; PBRM (trastuzumab) a 10 mg/kg; conjugados de PBRM-polímero-droga descritos no Exemplo 4 ou Exemplo 7, a 2,5 mg/kg.
[0091] A Figura 3 mostra a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células HL-60 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo; PBRM (lintuzumab) a 20 mg/kg; ou conjugados de PBRM-polímero-droga descritos no Exemplo 8 a 20 mg/kg.
[0092] A Figura 4 mostra a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células JIMT-1 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo; PBRM (trastuzumab) a 20 mg/kg; Kadcyla® a 20 mg/kg; ou conjugado de PBRM- polímero-droga descrito no Exemplo 14, a 2 mg/kg, 0,67 mg/kg ou 0,3 mg/kg.
[0093] A Figura 5 mostra a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células NCI-N87 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo, ou conjugado de PBRM-polímero-droga descrito no Exemplo 15, a 3 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,3 mg/kg.
[0094] A Figura 6 mostra a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células NCI-N87 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo, conjugados de PBRM-polímero-droga descritos no Exemplo 14, a 0,67 mg/kg ou Exemplo 16, a 3 mg/kg.
[0095] A Figura 7 mostra a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células NCI-N87 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo, conjugado de PBRM-polímero-droga descrito no Exemplo 33 a 0,67 mg/kg; Exemplo 43A a 1 mg/kg ou Exemplo 43C a 0,67 mg/kg ou 3 mg/kg.
[0096] A Figura 8 mostra a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células NCI-N87 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo, conjugado polímero-droga descrito no Exemplo 5A a 0,22 mg/kg; ou conjugados de PBRM-polímero-droga descritos no Exemplo 30B ou Exemplo 30C cada um a 2 mg/kg; Exemplo 40 a 0,67 mg/kg, ou Exemplo 43B a 1 mg/kg; ou Exemplo 38 a 10 mg/kg; ou Exemplo 39 a 10 mg/kg; cada um administrado uma vez por semana durante 3 semanas.
[0097] A Figura 9 mostra a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células JIMT-1 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo; Exemplo 40 a 1 mg/kg e Exemplo 43C a 2 mg/kg.
[0098] A Figura 10 mostra o PK plasmático para a AF HPA conjugada (total), AF HPA não conjugada e AF (indicado como “AF-HPA livre”) e trastuzumab em camundongos inoculados subcutaneamente com tumores BT474 depois da administração de bolo em IV de conjugado de PBRM-polímero-droga descrito no Exemplo 4, a 5 mg/kg, 3 animais/ponto de tempo.
[0099] A Figura 11 ilustra a afinidade e cinéticas de um scADC específico de 5T4 ao domínio extracelular de 5T4 humano, medidas pela ressonância de plásmon de superfície. A afinidade de ligação (KD de < 30 pM) é similar àquela do scFvFc anti-5T4 não conjugado.
[00100] A Figura 12 ilustra a eficácia antitumor de um scADC específico de 5T4, como medida em um modelo de xenoenxerto de tumor A431. O volume do tumor é determinado nos dias especificados. Os valores são expressos como Média ± SEM. A análise estatística realizada pela ANOVA de duas vias seguida pelos testes post de Bonferroni usando Graph Pad Prism (Versão .5).
[00101] A Figura 13 ilustra a eficácia antitumor de um scADC específico de 5T4 em camundongos nus que carregam o xenoenxerto de tumor transfectante que superexpressa MDA-MB-231 5T4. Os valores são expressos como Média ± SEM. A análise estatística realizada pela ANOVA de duas vias seguida pelos testes post de Bonferroni usando Graph Pad Prism (Versão .5).
DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS DA INVENÇÃO
[00102] A presente invenção adicionalmente a novos conjugados proteína-polímero-droga, armações poliméricas para produzir os conjugados, métodos sintéticos para produzir os conjugados ou armações poliméricas, composições farmacêuticas contendo os mesmos e vários usos dos conjugados.
[00103] A presente invenção também adicionalmente a novos conjugados polímero-droga, métodos sintéticos para produzir os conjugados, composições farmacêuticas contendo os mesmos e vários usos dos conjugados.
[00104] A presente invenção adicionalmente a adicionalmente novos derivados de drogas, métodos sintéticos para produzir os derivados, composições farmacêuticas contendo os mesmos e vários usos dos derivados de droga.
Definições/Terminologia
[00105] Certos compostos da presente invenção e definições de grupos funcionais específicos também são descritos em maiores detalhes aqui. Para os propósitos desta invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica dos Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed., capa interna e os grupos funcionais específicos são geralmente definidos como descrito ali. Adicionalmente, os princípios gerais da química orgânica, assim como porções funcionais específicas e reatividade, são descritos em “Organic Chemistry”, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, os conteúdos dos quais são incorporados aqui como referência. Além disso, será apreciado pelos versados na técnica que os métodos sintéticos, como descritos aqui, utilizam uma variedade de grupos protetores.
[00106] O uso dos artigos “um”, “uma” e “a, o” em ambas, na descrição seguinte e reivindicações deve ser interpretado para cobrir tanto o singular como o plural, salvo indicado em contrário aqui ou claramente em contrário pelo contexto. Os termos “compreendendo”, “tendo”, “sendo de” como em “sendo da fórmula química”, “incluindo” e “contendo” devem ser interpretados como termos abrangentes (isto é, significando “incluindo, mas não limitado a”) salvo indicado em contrário. Por exemplo, a armação polimérica de uma certa Fórmula inclui todas as unidades monoméricas mostradas na Fórmula e também pode incluir unidades monoméricas adicionais não mostradas na Fórmula. Adicionalmente quando “compreendendo” ou outro termo abrangente é usado em uma forma de realização, deve ser entendido que a mesma forma de realização pode ser mais minuciosamente reivindicada usando o termo intermediário “consistindo essencialmente em” ou o termo mais próximo “consistindo em”.
[00107] O termo “cerca de”, “aproximadamente”, ou “aproximado”, quando usados em conexão com um valor numérico, significa que uma coleção ou faixa dos valores são incluídas. Por exemplo, “cerca de X” inclui um faixa dos valores que é ± 20 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 2 %, ± 1 %, ± 0,5 %, ± 0,2 %, ou ± 0,1 % de X, onde X é um valor numérico. Em uma modalidade, o termo “cerca de” se refere a uma faixa dos valores que é 5 % mais ou menos do valor especificado. Em uma outra modalidade, o termo “cerca de” se refere a uma faixa dos valores que é 2 % mais ou menos do valor especificado. Em uma outra modalidade, o termo “cerca de” se refere a uma faixa dos valores que é 1 % mais ou menos do valor especificado.
[00108] A citação de faixas de valores é meramente planejada para servir como um método de taquigrafia para se referir individualmente a cada valor separado caindo dentro da faixa, salvo aqui indicado em contrário e cada valor separado é incorporado dentro da especificação como se ele fosse individualmente aqui citado. Uma faixa como aqui usada, a menos que especificado em contrário, inclui os dois limites da faixa. Por exemplo, as expressões “x sendo um número inteiro entre 1 e 6” e “x sendo um número inteiro de 1 a 6” significam ambas “x sendo 1, 2, 3, 4, 5, ou 6”. isto é, os termos “entre X e Y” e “faixa de X a Y”, são inclusivas de X e Y e os números entre eles.
[00109] Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem apropriada salvo aqui indicado em contrário ou de outra forma claramente em contrário pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, “como”) provida aqui, é planejado meramente para ilustrar melhor a invenção e não deve ser interpretado como uma limitação do escopo das reivindicações a menos que explicitamente reivindicado em contrário. Nenhuma linguagem no relatório deve ser interpretada como indicando que qualquer elemento não reivindicado é essencial para o que é reivindicado.
[00110] “Anticorpo” se refere a um anticorpo de tamanho natural ou fragmento funcional de um anticorpo compreendendo uma imunoglobulina. Por um “fragmento funcional” é intencionado que uma porção suficiente da imunoglobulina ou anticorpo seja fornecida que a porção eficazmente se ligue ou complexe com a molécula de superfície celular para sua população de célula alvo, por exemplo, antígeno oncofetal humano.
[00111] Como aqui usado, um antígeno oncofetal humano inclui, por exemplo, proteínas associadas com tumor tais como alfa fetoproteína, antígeno carcinoembriônico, antígeno específico da próstata e proteína antigênica oncofetal (também conhecida como proteína receptora de laminina imatura e que foi associada com, por exemplo, cinomas intestinais e renais).
[00112] Uma imunoglobulina pode ser purificada, recombinantemente gerada, sinteticamente gerada, ou combinações destes, usando técnicas conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica. Embora imunoglobulinas dentro ou derivadas de anticorpos IgG sejam particularmente bem adaptadas para o uso nesta invenção, as imunoglobulinas de qualquer uma das classes podem ser selecionadas, por exemplo, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Adequadamente, a imunoglobulina é da classe IgG incluindo, mas não limitado as subclasses de IgG (IgG1, 2, 3 e 4) ou classe IgM que é capaz de se ligar especificamente a um epítopo específico em um antígeno. Anticorpos podem ser imunoglobulinas intactas derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunorreativas de imunoglobulinas intactas. Os anticorpos podem existir em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos de domínio único camelizados, anticorpos intracelulares (“intracorpos”), anticorpos recombinantes, anticorpos idiotípicos, anticorpos do domínio, anticorpos lineares, anticorpos multiespecificos, fragmentos de anticorpos, como, Fv, Fab, F(ab)2, F(ab)3, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv), tandem/bis-scFv, Fc, pFc’, scFvFc (ou scFv-Fc), dissulfeto de Fv (dsfv), anticorpos biespecíficos (bc-scFv) como anticorpos BiTE; anticorpos de camelídeo, anticorpos recolocados na superfície, anticorpos humanizados, anticorpos completamente humanos, anticorpos de domínio único (sdAb, também conhecidos como NANOCORPO®), anticorpos quiméricos, anticorpos quiméricos compreendendo pelo menos uma região constante humana, anticorpos de dupla afinidade como, proteínas redirecionadas de dupla afinidade (DART®), fragmentos variáveis de cadeia única bivalentes (ou bivalentes) (di-scFvs, bi- scFvs) incluindo, mas não limitado a minicorpos, diacorpos, triacorpos ou tricorpos, tetracorpos e similares e anticorpos multivalentes. “Fragmento de anticorpo” se refere à pelo menos uma porção da região variável da molécula da imunoglobulina que se liga ao seu alvo, isto é, a região de ligação de antígeno. Como usado aqui, o termo “anticorpo” se refere tanto ao anticorpo com comprimento total como fragmentos de anticorpos a menos que especificado em contrário.
[00113] “Molécula de reconhecimento com base em proteína” ou “PBRM” se refere a uma molécula que reconhece e se liga a um marcador ou receptor na superfície da célula como, uma proteína da transmembrana, proteína imobilizada na superfície, ou protoglicano. Exemplos de PBRMs incluem, mas não estão limitados a, anticorpos (por exemplo, Trastuzumab, Cetuximab, Rituximab, Bevacizumab, Epratuzumab, Veltuzumab, Labetuzumab, B7-H4, B7-H3, CA125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, c-Met, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1, NaPi2b, c-Kit, MUC1 e anti-5T4) ou peptídeos (peptídeos marcando no alvo o receptor LHRH, peptídeo EC-1), lipocalinas, como, por exemplo, anticalinas, proteínas como, por exemplo, interferonas, linfocinas, fatores de crescimento, fatores de estimulação da colônia e similares, peptídeos ou mímicos de peptídeo e similares. A molécula de reconhecimento com base em proteína, além de marcar no alvo o conjugado de polímero modificado para uma célula, tecido ou local específico, pode ter também determinados efeitos terapêuticos como atividade antiproliferativa (citostática e/ou citotóxica) contra uma célula alvo ou via. A molécula de reconhecimento com base em proteína compreende ou pode ser engenheirada para compreender pelo menos um grupo quimicamente reativo como -COOH, amina primária, amina secundária-NHR,-SH, ou uma porção de aminoácido quimicamente reativa ou cadeias laterais como, por exemplo, tirosina, histidina, cisteína, ou lisina. Em uma modalidade, uma PBRM pode ser um ligante (LG) ou porção alvejadora que especificamente se ligue ou complexe com uma molécula de superfície celular, tal como um receptor ou antígeno de superfície celular, para uma dada população de célula alvo. Depois da aglutinação ou complexação específicas do ligante com seu receptor, a célula é permissiva para a absorção do ligante ou conjugado ligante -droga, que é depois internalizada na célula. Como aqui usado, um ligante que “especificamente se ligue ou complexe com” ou “alveje” uma molécula de superfície celular preferivelmente se associa com uma molécula de superfície celular por intermédio de forças intermoleculares. Por exemplo, o ligante pode preferivelmente associar com a molécula de superfície celular com um Kd menor do que cerca de 50 nM, menor do que cerca de 5 nM, ou menor do que 500 pM. As técnicas para medir a afinidade de ligação de um ligante a uma molécula de superfície celular são bem conhecidas; por exemplo, a técnica adequada, é denominada ressonância plasmônica de superfície (SPR). Em uma modalidade, o ligante é usado para alvejamento e não tem nenhum efeito terapêutico detectado quando separado da droga que ele libera. Em uma outra modalidade, o ligante funciona tanto como uma porção alvejadora quanto como um agente terapêutico ou imunomodulador (por exemplo, para realçar a atividade da droga ativa ou pró-droga).
[00114] “Biocompatível” como usado aqui se destina a descrever compostos que exercem efeitos destrutivos mínimos ou de resposta ao hospedeiro enquanto em contato com fluidos do corpo ou células ou tecidos vivos. Assim, um grupo biocompatível, como usado aqui, se refere a uma porção alifática, cicloalquila, heteroalifática, heterocicloalquila, arila, ou heteroarila, que cai dentro da definição do termo biocompatível, como definido acima e aqui. O termo “Biocompatibilidade” como usado aqui, é usado também para significar que os compostos exibem interações mínimas com proteínas de reconhecimento, por exemplo, anticorpos ocorrendo naturalmente, proteínas de células, células e outros componentes dos sistemas biológicos, a menos que tais interações sejam especificamente desejadas. Assim, substâncias e grupos funcionais planejados especificamente para causar as interações mínimas acima, por exemplo, drogas e pró-drogas, são considerados como sendo biocompatíveis. Preferivelmente (com exceção dos compostos planejados para serem citotóxicos, como, por exemplo, agentes antineoplásticos), os compostos são “biocompatíveis” se a sua adição a células normais in vitro, em concentrações similares as concentrações in vivo sistêmicas planejadas, resulta em menor do que ou igual a 1 % de morte da célula durante o tempo equivalente ao da meia vida do composto in vivo (por exemplo, o período de tempo exigido para 50 % do composto administrado in vivo ser eliminado/depurado) e sua administração in vivo induz inflamação mínima e medicamente aceitável, reação de corpo estranho, imunotoxicidade, toxicidade química e/ou outros tais efeitos adversos. Na sentença acima, o termo “células normais” se refere a células que não são planejadas para serem destruídas ou de outra forma significantemente afetadas pelo composto sendo testado.
[00115] “Biodegradável”: Como usado aqui, polímeros “biodegradáveis” são polímeros que são suscetíveis ao processamento biológico in vivo. Como usado aqui, compostos ou porções “biodegradáveis” são aquelas que, quando capturadas pelas células, podem ser rompidas pelo lisossoma ou outro maquinário químico ou por hidrólise em componentes que as células podem ou reusar ou dispor de sem efeito tóxico significante nas células. O termo “bioclivável” como usado aqui tem o mesmo significado de “biodegradável”. Os fragmentos da degradação preferivelmente induzem pouca ou nenhuma sobrecarga no órgão ou célula ou processos patológicos causados por tal sobrecarga ou outros efeitos adversos in vivo. Exemplos de processos de biodegradação incluem hidrólise enzimática e não enzimática, oxidação e redução. Condições apropriadas para hidrólise não enzimática dos conjugados proteína-polímero-droga biodegradáveis (ou seus componentes, por exemplo, o carreador polimérico biodegradável e os ligantes entre o carreador e o anticorpo ou a molécula da droga) descritas aqui, por exemplo, incluem exposição dos conjugados biodegradáveis a água a uma temperatura e um pH do compartimento intracelular do lisossoma. A biodegradação de alguns conjugados proteína-polímero-droga biodegradáveis (ou seus componentes, por exemplo, o carreador polimérico biodegradável e os ligantes entre o carreador e o anticorpo ou a molécula da droga), pode ser também melhorada extracelularmente, por exemplo, em regiões de baixo pH do corpo do animal, por exemplo, Aa área inflamada, na cercania próxima dos macrófagos ativados ou outras células liberando fatores que facilitam a degradação. Em certas formas de realização preferidas, o tamanho efetivo do carreador de polímero a um pH ~ 7,5 não muda de modo detectável ao longo de 1 a 7 dias e permanece nos 50 % do tamanho original do polímero durante pelo menos várias semanas. A um pH ~ 5, por outro lado, o carreador de polímero preferivelmente se degrada de modo detectável ao longo de 1 a 5 dias e está completamente transformado em fragmentos de baixo peso molecular dentro de uma estrutura de tempo de duas semanas a vários meses. A integridade do polímero em tais testes pode ser medida, por exemplo, por HPLC de exclusão de tamanho. Embora a degradação mais rápida possa ser em alguns casos preferível, em geral pode ser mais desejável que o polímero se degrade nas células com a taxa que não excede a taxa da metabolização ou excreção dos fragmentos de polímero pelas células. Em formas de realização preferidas, os polímeros e subprodutos da biodegradação dos polímeros são biocompatíveis.
[00116] “Biodisponibilidade”: O termo “biodisponibilidade” se refere à disponibilidade sistêmica (isto é, níveis de sangue/plasma) de uma dada quantidade de droga ou composto administrada a um indivíduo. Biodisponibilidade é um termo absoluto que indica medição tanto do tempo (taxa) como quantidade total (extensão) da droga ou composto que alcança a circulação geral a partir de uma forma de dosagem administrada.
[00117] “composto bloqueador de maleimido”: como aqui usado se refere a um composto que pode reagir com maleimido para convertê-lo para succinamida e “porção bloqueadora de maleimido” se refere à porção química ligada à succinamida na conversão. Em certas modalidades, o composto bloqueador de maleimido é um composto tendo um grupo tiol terminal para reagir com o maleimido. Em certas modalidades, o composto bloqueador de maleimido é solúvel em água tal que a reação com maleimido possa ocorrer em uma solução aquosa. Por exemplo, a porção bloqueadora de maleimido resultante é solúvel em água ou hidrofílica. Em uma modalidade, o composto bloqueador de maleimido é cisteína, N-acetil cisteína, éster metílico de cisteína, N-metil cisteína, 2-mercaptoetanol, ácido 3-mercaptopropanóico, ácido 2-mercaptoacético, mercaptometanol (isto é, HOCH2SH), benzil tiol em que a fenila é substituída com um ou mais substituintes hidrofílicos, ou 3- aminopropano-1-tiol.
[00118] “Hidrofílico”: O termo “hidrofílico” à medida que ele se refere aos substituintes, por exemplo, nas unidades monoméricas do polímero ou em uma porção bloqueadora de maleimido para torná-los hidrofílicos ou solúveis em água, não difere essencialmente do significado comum deste termo na técnica e denota porções químicas que contém átomos ionizáveis, polares, ou polarizáveis, ou que diferentemente podem ser solvatados pelas moléculas de água. Assim um grupo hidrofílico, como usado aqui, se refere a uma porção alifática, cicloalquila, heteroalifática, heterocicloalquila, arila ou heteroarila, que cai dentro da definição do termo hidrofílico, como definido acima. Exemplos de porções orgânicas hidrofílicas particulares que são apropriadas incluem, sem limitação, grupos alifáticos ou heteroalifáticos compreendendo uma cadeia de átomos em uma faixa de entre cerca de um a doze átomos de carbono, hidroxila, hidróxi-alquila, amina, carboxila, amida, éster carboxílico, tioéster, aldeído, nitrila, isonitrila, nitroso, hidroxilamina, mercaptoalquila, heterociclo, carbamatos, ácidos carboxílicos e seus sais, ácidos sulfônicos e seus sais, ésteres de ácido sulfônico, ácidos fosfóricos e seus sais, ésteres de fosfato, éteres de poliglicol, poliaminas, policarboxilatos, poliésteres e politioésteres. Em certas formas de realização os substituintes hidrofílicos compreendem um grupo carboxila (COOH), um grupo aldeído (CHO), um grupo cetona (COalquila C1-4), um metilol (CH2OH) ou um glicol (por exemplo, CHOH-CH2OH ou CH-(CH2OH)2), NH2, F, ciano, SO3H, PO3H e os semelhantes.
[00119] O termo “hidrofílico” à medida que ele se refere aos polímeros da invenção geralmente não difere do uso deste termo na técnica e denota polímeros compreendendo grupos funcionais hidrofílicos como definidos acima. Em uma forma de realização preferida, o polímero hidrofílico é um polímero solúvel em água. A hidrofilicidade do polímero pode ser medida diretamente através da determinação da energia de hidratação, ou determinada através da investigação entre duas fases líquidas, ou por cromatografia das fases sólidas com hidrofobicidade conhecida, como, por exemplo, C4 ou C18.
[00120] “Carreador Polimérico”: O termo carreador polimérico, como usado aqui, se refere a um polímero ou polímero modificado, que é apropriado para se unir covalentemente a ou pode ser unido covalentemente a uma ou mais moléculas da droga com um aglutinante designado e/ou uma ou mais PBRMs com um aglutinante designado.
[00121] “Condições fisiológicas”: A expressão “condições fisiológicas”, como usada aqui, se refere à faixa de condições químicas (por exemplo, pH, resistência iônica) e bioquímicas (por exemplo, concentrações de enzima) provavelmente encontradas nos fluidos extracelulares dos tecidos vivos. Para os tecidos mais normais, as faixas de pH fisiológico de cerca de 7,0 a 7,4. Plasma do sangue circulante e líquido intersticial normal representam exemplos típicos de condições fisiológicas normais.
[00122] “Polissacarídeo”, “carboidrato” ou “oligossacarídeo”: Os termos “polissacarídeo”, “carboidrato”, ou “oligossacarídeo” são conhecidos na técnica e referem-se, geralmente, às substâncias tendo a fórmula química (CH2O)n, onde geralmente n>2 e seus derivados. Carboidratos são poli- hidroxialdeídos ou poli-hidroxicetonas, ou mudam para tais substâncias em transformações químicas simples, como hidrólise, oxidação ou redução. Tipicamente, carboidratos estão presentes na forma de acetais cíclicos ou cetais (como, glicose ou frutose). As unidades cíclicas (monossacarídeos) podem ser conectadas a cada outra para formar moléculas com poucas unidades (oligossacarídeos) ou várias unidades de monossacarídeos (polissacarídeos). Frequentemente, carboidratos com números, tipos e posicionamento bem definidos de unidades de monossacarídeos são chamados oligossacarídeos, enquanto carboidratos consistindo em misturas de moléculas de números variáveis e/ou posicionamento de unidades de monossacarídeos são chamados polissacarídeos. Os termos “polissacarídeo”, “carboidrato” e “oligossacarídeo”, são usados aqui de modo interpermutável. Um polissacarídeo pode incluir açúcares naturais (por exemplo, glicose, frutose, galactose, manose, arabinose, ribose e xilose) e/ou derivados de açúcares de ocorrência natural (por exemplo, 2'-fluororibosc, 2'-deoxiribose e hexose).
[00123] “Droga”: Como aqui usado, o termo “droga” se refere a um composto que é biologicamente ativo e fornece um efeito fisiológico desejado a seguir da administração a um indivíduo em necessidade do mesmo (por exemplo, um ingrediente farmacêutico ativo).
[00124] “Pró-droga”: Como aqui usado o termo “pró-droga” se refere a um precursor de uma droga ativa, isto é, um composto que pode ser transformado para uma droga ativa. Tipicamente uma tal pró-droga é submetida ao processamento in vivo, que converte a droga para uma forma fisiologicamente ativa. Em alguns casos, uma pró-droga por si só pode ter um efeito fisiológico desejado. Um efeito fisiológico pode ser, por exemplo, terapêutico, citotóxico, imunomodulador, ou os seus semelhantes.
[00125] “Citotóxico”: Como aqui usado o termo “citotóxico” significa tóxico para as células ou uma população celular selecionada (por exemplo, células cancerosas). O efeito tóxico pode resultar em célula morta e/ou lise. Em certos casos, o efeito tóxico pode ser um efeito destrutivo subletal na célula, por exemplo, diminuir ou deter o crescimento celular. De modo a se obter um efeito citotóxico, a droga ou pró-droga podem ser selecionadas de um grupo consistindo em um agente que danifica o DNA, um agente rompedor de microtubo, ou uma proteína ou polipeptídeo citotóxicos, entre outros.
[00126] “Citostático”: Como aqui usado o termo “citostático” se refere a uma droga ou outro composto que inibe ou interrompe o crescimento e/ou multiplicação celulares.
[00127] “Molécula pequena”: Como usado aqui, o termo “molécula pequena” se refere às moléculas, seja de ocorrência natural ou criadas artificialmente (por exemplo, via síntese química) que tem um peso molecular relativamente baixo. As moléculas pequenas preferidas são biologicamente ativas em que elas produzem um local ou efeito sistêmico em animais, preferivelmente mamíferos, mais preferivelmente humanos. Em determinadas formas de realização preferidas, a molécula pequena é uma droga e a molécula pequena é referida como “molécula de droga” ou “droga” ou “agente terapêutico”. Em determinadas formas de realização, uma molécula de droga tem MW menor do que ou igual a cerca de 5 kDa. Em outras formas de realização, uma molécula de droga tem MW menor do que ou igual a cerca de 1,5 kDa. Em formas de realização, uma molécula de droga é selecionada dentre alcaloides vinca, auristatinas, duocarmicinas, inibidores de quinase, inibidores de MEK, inibidores de KSP, inibidores da PI3 quinase, caliqueamicinas, SN38, camptotecina, inibidor de topoisomerases, camptotecinas não naturais, inibidor da síntese de proteína, inibidor da RNA polimerase, pirrolobenzodiazepinas, maitansinoides, drogas que ligam DNA, drogas de intercalação de DNA e análogos dos mesmos. Preferivelmente, apesar de não necessariamente, a droga é uma que já foi considerada segura e eficaz para usar por uma agência governamental apropriada ou corpo, por exemplo, o FDA. Por exemplo, drogas para uso humano listados pela FDA sob 21 C.F.R. §§ 330,5, 331 através de até 361 e 440 através de até 460; drogas para uso veterinário listados pela FDA sob 21 C.F.R. §§ 500 através de até 589, incorporados aqui por referência, são todos considerados apropriados para uso com os polímeros hidrofílicos presentes.
[00128] Classes de moléculas de droga que podem ser usadas na prática da presente invenção incluem, mas não são limitadas para, substâncias anticâncer, radionuclídeos, vitaminas, substâncias antiAIDS, antibióticos, imunossupressores, substâncias antivirais, inibidores da enzima, neurotoxinas, opióides, hipnóticos, anti-histaminas, lubrificantes, tranquilizantes, anticonvulsivos, relaxantes musculares e substâncias anti-Parkinson, antiespasmódicos e agentes de contração muscular incluindo bloqueadores do canal, mióticos e anticolinérgicos, compostos anti-glaucoma, compostos antiparasitários e/ou antiprotozoáricos, moduladores de interações célula- matriz extracelular incluindo os inibidores do crescimento de células e moléculas antiadesão, agentes vasodilatadores, inibidores de DNA, RNA ou síntese de proteína, anti-hipertensivos, analgésico, antipiréticos, agentes anti- inflamatórios esteroidais e não esteroidais, fatores antiangiogênicos, fatores anti-secretores, anticoagulantes e/ou agentes antitrombóticos, anestésicos locais, oftálmicos, prostaglandinas, antidepressivos, substâncias antipsicóticas, antieméticos, agentes de imagem. Muitas moléculas grandes também são drogas e tais moléculas grandes podem ser usadas nos conjugados e outras construções aqui descritas. Os exemplos de moléculas grandes adequadas incluem, por exemplo, moléculas com base em aminoácido. As moléculas com base em aminoácido podem abranger, por exemplo, peptídeos, polipeptídeos, enzimas, anticorpos, imunoglobulinas, ou fragmentos funcionais dos mesmos, entre outros.
[00129] Uma listagem mais completa, apesar de não exaustiva, de classes e drogas específicos apropriados para uso na presente invenção pode ser encontrada em “Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications” por Axel Kleemann e Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999 e “Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals”, editado por Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, ambos sendo incorporados aqui por referência. Nas formas de realização preferidas, a droga usada nesta invenção é um agente terapêutico que tem atividade antiproliferativa (citostática e/ou citotóxica) contra uma célula alvo ou via. uma droga pode ter um grupo quimicamente reativo como, por exemplo,- COOH, amina primária, amina secundária-NHR,-OH,-SH,-C(O)H,-C(O)R,- C(O)NHR2b, C(S)OH,-S(O)2OR2b,-P(O)2OR2b,-CN,-NC ou-ONO, em que R é uma porção alifática, heteroalifática, carbocíclica ou heterocicloalquila e R2b é um hidrogênio, uma porção alifática, heteroalifática, carbocíclica, ou heterocíclica.
[00130] “Derivado de droga” ou “droga modificada” ou similares, como usado aqui, se refere a um composto que compreende a molécula de droga destinada a ser distribuída pelo conjugado da invenção e um grupo funcional capaz de unir a molécula de droga ao carreador polimérico.
[00131] “Forma ativa” como usada aqui se refere à forma de um composto que exibe eficácia farmacêutica destinada in vivo ou in vitro. Em particular, quando uma molécula de droga destinada a ser distribuída pelo conjugado da invenção é liberada do conjugado, a forma ativa pode ser a própria droga ou seus derivados, que exibem as propriedades terapêuticas destinadas. A liberação da droga a partir do conjugado pode ser obtida por clivagem de uma ligação biodegradável do aglutinante que une a droga ao carreador polimérico. Os derivados de drogas ativas consequentemente podem compreender uma porção do aglutinante.
[00132] “Rótulo de diagnóstico”: Como usado aqui, o termo rótulo de diagnóstico se refere a um átomo, grupo de átomos, porção ou grupo funcional, um nanocristal, ou outro elemento discreto de uma composição de matéria, que podem ser detectados in vivo ou ex vivo usando métodos analíticos conhecidos na técnica. Quando associado com um conjugado da presente invenção, tal rótulo de diagnóstico permite o monitoramento do conjugado in vivo. Alternativamente ou adicionalmente, construtos e composições que incluem rótulos de diagnósticos podem ser usados para monitorar funções biológicas ou estruturas. Exemplos de rótulos de diagnósticos incluem, sem limitação, rótulos que podem ser usados em procedimentos de diagnóstico médico, como, isótopos radioativos (radionuclídeos) para gama cintilografia e tomografia por emissão de pósitrons (PET), agentes de contraste para imagem por ressonância magnética (MRI) (por exemplo, átomos paramagnéticos e nanocristais superparamagnéticos), agentes de contraste para tomografia computadorizada e outros métodos de imagem de raios-X, agentes para métodos de diagnóstico com base em ultrassom (sonografia), agentes para ativação com nêutrons (por exemplo, boro, gadolínio), fluoróforos para vários procedimentos ópticos, e, em geral porções que podem emitir, refletir, absorver, dispersar ou de outra forma afetar campos eletromagnéticos ou ondas (por exemplo, raios gama, raios X, ondas de rádio, micro-ondas, luz), partículas (por exemplo, partículas alfa, elétrons, pósitrons, nêutrons, prótons) ou outras formas de radiação, por exemplo, ultrassom.
[00133] Os seguintes são mais termos gerais usados em todo o presente pedido:
[00134] “Animal”: O termo animal, como usado aqui, se refere a humanos, assim como, animais não humanos, em qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo, por exemplo, mamíferos, aves, répteis, anfíbios, peixes, vermes e células únicas. As culturas de célula e as amostras de tecidos vivos são consideradas como sendo pluralidades de animais. Preferivelmente, o animal não humano é um mamífero (por exemplo, A roedor, um camundongo, um rato, um coelho, um macaco, um cão, um gato, um primata, ou um porco). Um animal pode ser um animal transgênico ou um clone humano. O termo “indivíduo” engloba animais.
[00135] “Quantidade eficiente”: Em geral, com referência a um agente ativo ou dispositivo de distribuição de droga, o termo “quantidade eficiente” se refere à quantidade necessária para eliciar a resposta biológica desejada. Como será apreciada pelo versado nesta técnica, a quantidade eficiente de um agente ou dispositivo pode variar dependendo em tais fatores como o ponto final biológico desejado, o agente a ser distribuído, a composição da matriz de encapsulação, o tecido alvo, etc. Por exemplo, a quantidade eficiente de micropartículas contendo um antígeno a ser distribuído para imunizar um indivíduo é a quantidade que resulta em uma resposta imune suficiente para evitar infecção com um organismo tendo o antígeno administrado.
[00136] “Aminoácido natural” como usado aqui se refere a qualquer um dos L-aminoácidos comuns, de ocorrência natural encontrados nas proteínas de ocorrência natural: glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr), triptofano (Trp), ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), asparagina (Asn), glutamina (Gln), cisteína (Cys) e metionina (Met).
[00137] “Aminoácido não natural” como usado aqui se refere a qualquer aminoácido que não é um aminoácido natural. Isto inclui, por exemplo, aminoácidos que compreendem resíduos de a-, β-, w-, D-, L- aminoacila. Mais geralmente, o aminoácido não natural compreende um resíduo da fórmula geral
Figure img0018
em que a cadeia lateral R é diferente das cadeias laterais de aminoácido ocorrendo na natureza. Os aminoácidos exemplares não naturais incluem, mas não são limitados para, sarcosina (N-metilglicina), citrulina (cit), homocitrulina, β-ureidoalanina, tiocitrulina, hidroxiprolina, alotreonina, ácido pipecólico (homoprolina), ácido a-aminoisobutírico, terc-butilglicina, terc- butilalanina, alo-isoleucina, norleucina, α-metilleucina, cicloexilglicina, β- cicloexilalanina, β-ciclopentilalanina, α-metilprolina, fenilglicina, α- metilfenilalanina e homofenilalanina.
[00138] “Amino acila”: Mais geralmente, o termo amino acila, como usado aqui, engloba aminoácido natural e aminoácidos não naturais.
[00139] “Poliamida”: se refere aos homo ou hetero- polímeros de aminoácidos naturais e aminoácidos não naturais. Os homo-polímeros ilustrativos incluem, mas não são limitados para, poli-lisina, poli-arginina, ácido poli-Y-glutárico e outros. Os hetero- polímeros ilustrativos incluem, mas não são limitados para, polímeros compreendendo fragmentos de peptídeos selecionados dentre peptidases, lisozimas, metaloproteinases e outros.
[00140] “PHF” se refere a poli(1-hidroximetil-etileno-hidroximetil- formal).
[00141] Como usado aqui, os termos “unidade de polímero”, “unidade monomérica”, “monômero”, “unidade de monômero”, “unidade” todos referem-se à uma unidade estrutural repetitiva em um polímero.
[00142] Como aqui usado, “peso molecular” ou “MW” de um polímero ou carreador/suporte poliméricos ou conjugados poliméricos se referem ao peso molecular médio ponderado a menos que de outro modo especificado.
[00143] A presente invenção é destinada a incluir todos os isótopos de átomos ocorrendo nos compostos presentes. Isótopos incluem os átomos tendo o mesmo número atômico, mas números de massa diferentes. A título de exemplo geral e sem limitação, isótopos de hidrogênio incluem trítio e deutério. Isótopos de carbono incluem C-13 e C-14.
[00144] A presente invenção é destinada a incluir todos os isômeros do composto, que se se refere e inclui, isômeros ópticos e isômeros tautoméricos, onde isômeros ópticos incluem enantiômeros e diastereômeros, isômeros quirais e isômeros não quirais e os isômeros ópticos incluem isômeros ópticos isolados, assim como, misturas de isômeros ópticos incluindo misturas racêmica e não racêmicas; onde um isômero pode ser na forma isolada ou em uma mistura com um ou mais outros isômeros.
Carreadores poliméricos
[00145] Em determinadas formas de realização exemplares, os conjugados de invenção encontram uso em aplicações biomédicas, como distribuição de drogas e engenharia de tecidos e o carreador é biocompatível e biodegradável. Em determinadas formas de realização, o carreador é um polímero solúvel, nanopartícula, gel, lipossoma, micela, sutura, implante, etc. Em determinadas formas de realização, o termo “polímero solúvel” engloba polímero biodegradável biocompatível como um polial (por exemplo, poliacetal ou policetal hidrofílico). Em outras determinadas formas de realização, o carreador é um polímero completamente sintético, semi-sintético ou de ocorrência natural. Em outras determinadas formas de realização, o carreador é hidrofílico.
[00146] Em determinadas formas de realização exemplares, os carreadores usados na presente invenção são poliais biodegradáveis biocompatíveis compreendendo pelo menos uma ligação hidrolisável em cada unidade de monômero posicionada dentro da cadeia principal. Isto assegura que o processo de degradação (via hidrólise/clivagem das unidades de monômero) irá resultar em fragmentação do conjugado polímero para os componentes monoméricos (isto é, degradação) e confere aos conjugados do polímero da invenção suas propriedades biodegradáveis. As propriedades (por exemplo, solubilidade, bioadesividade e hidrofilicidade) dos conjugados de polímero biodegradáveis e biocompatíveis podem ser modificadas por subsequente substituição de adicionais grupos hidrofílicos ou hidrofóbico. Exemplos de polímeros biocompatíveis biodegradáveis apropriados para a prática da invenção podem ser encontrados inter alia nas Patentes US 5.811.510; 5.863.990; 5.958.398; 7.838.619 e 7.790.150; e Publicação U.S. No. 2006/0058512; cada um dos documentos acima listado é incorporado aqui por referência em sua totalidade. As diretrizes para a significância, preparação e aplicações deste tipo de polímeros podem ser encontradas nos documentos acima citados. Em determinadas formas de realização, antecipa- se que a presente invenção será particularmente utilizável em combinação com os documentos de patente acima referidos, assim como Patentes US 5.582.172 e 6.822.086, cada um dos documentos de patente acima listados é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[00147] Os conjugados desta invenção são hidrofílicos, hidrolisáveis e compreendem moléculas de drogas (por exemplo, alcaloides vinca ou derivados, inibidores de topoisomerase, tais como, por exemplo, SN38, camptotecina, topotecano, exatecano, compostos de camptotecina não naturais ou derivados; auristatinas, dolastatinas, nemorrubicina e seus derivados, PNU-159682, antraciclina, duocarmicinas, inibidores da quinase (por exemplo, inibidores de PI3 quinase ou inibidores de MEK), inibidores de KSP, caliqueamicinas, pirrolobenzodiazepinas, maitansinoides, elinafida, drogas que ligam DNA, drogas de intercalação de DNA e estereoisômeros, isósteros, análogos e derivados dos mesmos) e anticorpos (por exemplo, Trastuzumab, Cetuximab, Rituximab, Bevacizumab, Epratuzumab, Veltuzumab, Labetuzumab, B7-H4, B7-H3, CA125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, c-Met, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1, NaPi2b, c-Kit, MUC1 e anti-5T4) ou peptídeos (peptídeos alvejadores de marcador do receptor de LHRH, peptídeo EC-1) covalentemente unidos ao carreador de polímero via ligações que contém uma ou mais ligações biodegradáveis. Assim, em determinadas formas de realização exemplares, os carreadores apropriados para a prática da presente invenção são poliais tendo pelo menos átomo de oxigênio acetal/cetal em cada unidade de monômero posicionada dentro da cadeia principal. Como discutido acima, isto assegura que o processo de degradação (via hidrólise/clivagem dos grupos acetal/cetal do polímero) irá resultar em fragmentação do conjugado polial para componentes de baixo peso molecular (isto é, degradação).
[00148] Em determinadas formas de realização, os carreadores de polímero biodegradável biocompatível, usados para a preparação de conjugados de polímero da invenção, são polissacarídeos de ocorrência natural, glicopolissacarídeos e polímeros sintético de poliglicosídeos, poliacetal, poliamida, origem de poliéter e poliéster e produtos de sua oxidação, funcionalização, modificação, reticulação e conjugação.
[00149] Em outras determinadas formas de realização, o carreador é a polímero biodegradável hidrofílico selecionado dentre o grupo consistindo em carboidratos, glicopolissacarídeos, glicolipídeos, glicoconjugados, poliacetais, policetais e derivados dos mesmos.
[00150] Em determinadas exemplares formas de realização, o carreador é um homopolissacarídeo biodegradável biocompatível linear e/ou ramificado de ocorrência natural selecionado dentre o grupo consistindo em celulose, amilose, dextrano, levano, fucoidano, carraginano, inulina, pectina, amilopectina, glicogênio e lixenano.
[00151] Em outras determinadas exemplares formas de realização, o carreador é um heteropolissacarídeo biodegradável biocompatível linear e ramificado de ocorrência natural selecionado dentre o grupo consistindo em agarose, hiluronano, condroitinsulfato, dermatansulfato, queeratansulfato, ácido algínico e heparina.
[00152] Em adicionalmente outras formas de realização exemplares, o carreador polimérico compreende um copolímero de um poliacetal/policetal e um polímero hidrofílico selecionado dentre o grupo consistindo em poliacrilatos, polímeros de polivinila, poliésteres, poliortoésteres, poliamida, polipeptídeos e derivados dos mesmos.
[00153] Em adicionalmente outra forma de realização, o carreador polimérico é dextrina que é produzida pela hidrólise de um amido obtido de vários produtos naturais como, por exemplo, trigo, arroz, milho e tapioca. Dependendo da estrutura do material de partida de amido, cada dextrina compreende uma distribuição singular de α-1,4 ligações e α-1,6 ligações. Porque a taxa de biodegradabilidade de α-1,6 ligações é tipicamente menor do que para as α-1,4 ligações, preferivelmente a porcentagem α-1,6 ligações é menor do que 10 % e mais preferivelmente menor do que 5 %. Em uma forma de realização o peso molecular da dextrina está na faixa de cerca de 1 kDa a cerca de 200 kDa, mais preferivelmente de cerca de 2 kDa a cerca de 20 kDa ou de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa ou de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa.
[00154] Em determinadas formas de realização, o carreador compreende polissacarídeos ativados por oxidação seletiva de dióis cíclicos vicinais de 1,2-, 1,4-, 1,6- e 2,6-piranosídeos e 1,2-, 1,5-, 1,6-furanosídeos, ou por oxidação de polissacarídeos laterais contendo 6-hidróxi e 5,6-diol antes da conjugação com moléculas de drogas ou PBRMs.
[00155] Em adicionalmente outras formas de realização, o carreador polimérico compreende um poliacetal biodegradável biocompatível em que pelo menos um subconjunto das unidades estruturais de repetição de poliacetal tem a seguinte estrutura química:
Figure img0019
em que para cada ocorrência da estrutura n entre colchetes, um de R1 e R2 é hidrogênio e o outro é um grupo biocompatível e inclui um átomo de carbono covalentemente unido a C1; Rx é um átomo de carbono covalentemente unido a C2; n” é um número inteiro; cada ocorrência de R3, R4, R5 e R6 é um grupo biocompatível e é independentemente hidrogênio ou uma porção orgânica; e para cada ocorrência da estrutura n entre colchetes, pelo menos um de R1, R2, R3, R4, R5 e R6 compreende um grupo funcional apropriado a copulação. Em determinadas formas de realização, o grupo funcional é uma porção hidroxila.
[00156] Em uma forma de realização, o carreador polimérico compreende polímeros hidrofílicos biodegradáveis biocompatíveis ativados, compreendendo de 0,1 % a 100 % porções de poliacetal cuja estrutura dorsal é representada pela seguinte estrutura química: (-CH2-CHR7-O-CHR8-O-)o onde: R7 e R8 são independentemente hidrogênio, hidroxila, hidróxi alquila (por exemplo,-CH2OH,-CH(OH)-CH2OH),-CHO,-CH(OH)-CHO ou- carbonila; e o é um número inteiro de 20 a 2000.
[00157] Em adicionalmente outras formas de realização, o carreador polimérico compreende um policetal biodegradável biocompatível em que pelo menos um subconjunto das unidades estruturas de repetição de policetal tem a seguinte estrutura química:
Figure img0020
em que cada ocorrência de R1 e R2 é um grupo biocompatível e Rx, R3, R4, R5, R6 e são como definidos aqui
[00158] Em determinadas formas de realização, as unidades cetal são monômeros de Fórmula (IIa) ou (IIb):
Figure img0021
[00159] Os polímeros de policetal biodegradáveis, biocompatíveis e seus métodos de fabricação foram descritos em Patentes US 5.811.510, 7.790.150 e 7.838.619, aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
[00160] Em uma forma de realização, o carreador polimérico pode ser obtido a partir de dextrano parcialmente oxidado (β1 ^6)-D-glicose) seguido por redução. Nesta forma de realização, o polímero compreende uma mistura aleatória do dextrano não modificado (A), parcialmente unidades acetal de dextrano oxidado (B) e exaustivamente unidades acetal de dextrano (C) das seguintes estruturas:
Figure img0022
[00161] Em outra forma de realização, o carreador polimérico compreende unidades de acetal não modificadas, isto é, segmentos poliacetal. Em algumas formas de realização, os poliacetais podem ser derivados de dextrana exaustivamente oxidado seguido por redução. Estes polímeros foram descritos em referências, ver por exemplo, a Patente US 5.811.510, que é aqui incorporada por referência para sua descrição de poliacetame na coluna 2, linha 65 até coluna 8, linha 55 e sua síntese na coluna 10, linha 45 até coluna 11, linha 14. Em uma forma de realização, o polímero poliacetal não modificado é um polímero poli(hidroximetil-etileno-hidroximetil-formal) (PHF).
[00162] Além dos polímeros poli(hidroximetil-etileno-hidroximetil- formal), a estrutura dorsal do carreador polimérico também pode compreender copolímeros de blocos de poli(hidroximetil-etileno-hidroximetil-formal) e outros monômeros acetal ou não acetal ou polímeros. Por exemplo, polímeros polietileno glicol são utilizáveis como agente de bainha na estrutura dorsal do polímero porque eles podem diminuir as interações entre as cadeias laterais do polímero dos grupos funcionais apensos. Estes grupos também podem ser utilizáveis na limitação das interações como entre fatores de soro e o polímero modificado. Outros monômeros de agentes de bainha para inclusão na estrutura dorsal do polímero incluem, por exemplo, etileno imina, ácido metacrílico, acrilamida, ácido glutâmico e combinações dos mesmos.
[00163] As unidades acetal ou cetal estão presentes no polímero modificado em uma quantidade eficaz para promover a biocompatibilidade. A unidade de acetal ou cetal não modificada pode ser descrita como um “agente de bainha” que proporciona biocompatibilidade e solubilidade para os polímeros modificados. Além disso, conjugação a um polímero poliacetal ou policetal pode modificar a suscetibilidade para metabolismo e degradação das porções unidas ao mesmo e influenciar a biodistribuição, depuração e degradação.
[00164] As unidades acetal não modificadas são monômeros de Fórmula (III):
Figure img0023
[00165] A fração molar, n, de unidades poliacetal não modificadas é a fração molar disponível para promover a biocompatibilidade, solubilidade e aumento da meia-vida, com base no número total de unidades de polímero no polímero modificado. A fração molar n pode ser a fração mínima de unidades de acetal monômero não modificadas necessárias para proporcionar biocompatibilidade, solubilidade, estabilidade, ou uma meia-vida particular, ou pode ser alguma fração maior O grau mais desejável de citotoxicidade é substancialmente nenhum, isto é, o polímero modificado é substancialmente inerte para o indivíduo. No entanto, como é entendido pelos versados na técnica, algum grau de citotoxicidade pode ser tolerado dependendo da severidade da doença ou sintoma sendo tratado, a eficácia do tratamento, o tipo e o grau de resposta imune e considerações similares. .
[00166] Em uma forma de realização, a estrutura dorsal do polímero modificado compreende unidades de Fórmula (IV):
Figure img0024
em que X’ indica o substituinte para o grupo hidroxila da estrutura dorsal do polímero . Como mostrado em Fórmula (IV) e outras fórmulas descritas aqui, cada unidade de poliacetal tem um único grupo hidroxila unido à porção glicerol da unidade e um grupo X’ (ou outro substituinte como um aglutinante compreendendo um terminal de maleimida) unido à porção glicolaldeído da unidade. Isto é para conveniência apenas e deve ser considerado que o polímero tendo unidades de Fórmula (IV) e outras fórmulas descritas aqui pode conter uma distribuição aleatória de unidades tendo um grupo X’ (ou outro substituinte como um aglutinante compreendendo um terminal de maleimida) unido à porção glicolaldeído das unidades e os tendo um único grupo X’ (ou outro substituinte como-LD-D) unido à porção glicerol das unidades assim como unidades tendo dois grupos X’ (ou outros substituintes como um aglutinante compreendendo um terminal de maleimida) com um unido à porção glicolaldeído e o outro unido à porção glicerol das unidades.
[00167] Em uma forma de realização, poliais biodegradáveis biocompatíveis apropriados para a prática da presente invenção têm um peso molecular de entre cerca de 0,5 e cerca de 300 kDa. Por exemplo, o polial biocompatível biodegradável usado para a armação polimérica ou conjugado da invenção é PHF tendo um peso molecular dentre cerca de 2 e cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa, 3 a 15 kDa, ou 5 a 10 kDa).
[00168] Em uma forma de realização, os poliais biodegradáveis biocompatíveis apropriados para a prática da presente invenção são modificados antes da conjugação com uma droga ou uma PBRM. Por exemplo, contêm -C(=O)-X-(CH2)v-C(=O)- com X sendo CH2, O ou NH e v sendo um inteiro de 1 a 6. Tabela A abaixo apresenta alguns exemplos dos poliais modificados apropriados para a conjugação com uma droga ou PBRM ou derivados dos mesmos. Salvo especificado ao contrário, números de referência em Tabelas A até E abaixo correspondem aos números de Exemplos descritos aqui; o termo “ND” significa não determinado; e X é CH2, O ou NH.
Figure img0025
Agentes terapêuticos
[00169] Em determinadas formas de realização, o agente terapêutico é uma molécula pequena tendo um peso molecular preferivelmente < cerca de 5 kDa, mais preferivelmente < cerca de 4 kDa, mais preferivelmente < cerca de 3 kDa, o mais preferivelmente < cerca de 1,5kDa ou < cerca de 1 kDa.
[00170] Em certas modalidades, o agente terapêutico tem uma IC50 de cerca menos do que 1 nM.
[00171] Em uma outra modalidade, o agente terapêutico tem uma IC50 em torno de mais do que 1 nM, por exemplo, o agente terapêutico tem uma IC50 de cerca de 1 a 50 nM.
[00172] Alguns agentes terapêuticos tendo uma IC50 de mais do que cerca de 1 nM (por exemplo, “drogas menos potentes”) são inadequadas para a conjugação com uma PBRM usando técnicas de conjugação reconhecidas na técnica. Sem desejar estar ligado pela teoria, tais agentes terapêuticos têm um potencial que é insuficiente para o uso em conjugados de PBRM-droga alvejados usando técnicas convencionais como cópias suficientes da droga (isto é, mais do que 8) não pode ser conjugada usando técnicas reconhecidas na técnica sem resultar nas propriedades farmacocinéticas e fisioquímicas diminuídas do conjugado. Entretanto, cargas suficientemente altas destas drogas menos potentes podem ser obtidas usando as estratégias de conjugação aqui descritas resultando deste modo em carreadores altos do agente terapêutico enquanto se mantém as propriedades farmacocinéticas e fisioquímicas. Assim, a invenção também adicionalmente a um conjugado de PBRM-polímero-droga que inclui uma PBRM, PHF e pelo menos oito porções de agente terapêutico, em que o agente terapêutico tem uma IC50 de mais do que cerca de 1 nM.
[00173] Em certas modalidades, cerca de 0,3 a cerca de 15 % de monômeros compreende um agente terapêutico, mais preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 12 % e adicionalmente mais preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 10 %.
[00174] Os agentes terapêuticos de molécula pequena usados nesta invenção (por exemplo, agentes antiproliferativos (citotóxicos e citostáticos) capazes de serem ligados a um carreador polimérico) incluem compostos citotóxico (por exemplo, espectro amplo), inibidores da angiogênese, inibidores da progressão do ciclo celular, inibidores dos caminhos de PI3K/m- TOR/AKT, inibidores dos caminhos da sinalização de MAPK, inibidores da quinase, inibidores de chaperonas de proteína, inibidores de HDAC, inibidores de PARP, inibidores do caminho da sinalização de Wnt/Hedgehog e inibidores da RNA polimerase.
[00175] As citotoxinas de amplo espectro incluem, mas não são limitados a, drogas de ligação, intercalação ou alquilação de DNA, agentes de estabilização e desestabilização de microtúbulo, compostos de platina, inibidores da topoisomerase I e inibidores da síntese de proteína.
[00176] As drogas de ligação, intercalação ou alquilação de DNA exemplares incluem, CC-1065 e seus análogos, antraciclinas (doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, nemorrubicina e seus derivados, PNU-159682), os compostos de bisnaftalimida tais como elinafida (LU79553) e seus análogos, agentes de alquilação, tais como caliqueamicinas, dactinomicinas, mitromicinas, pirrolobenzodiazepinas e os seus semelhantes. Os análogos de CC-1065 exemplares incluem duocarmicina SA, duocarmicina A, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duocarmicina B1, duocarmicina B2, duocarmicina D, DU-86, KW-2189, adozelesina, bizelesina, carzelesina, seco-adozelesina e análogos relacionados e formas de pró-droga, os exemplos dos quais são descritos nas Patentes U.S. Nos. 5.475.092, 5.595.499, 5.846.545, 6.534.660, 6.586.618, 6.756.397 e 7.049.316. Doxorrubicina e seus análogos incluem aqueles descritos na Patente U.S. No. 6.630.579. Caliqueamicinas incluem, por exemplo, enedinas, por exemplo, esperamicina e aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos. 5.714.586 e 5.739.116. Duocarmicinas incluem aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos. 5.070.092; 5.101.038; 5.187.186; 6.548.530; 6.660.742; e 7.553.816 B2; e Li et al., Tet Letts., 50: 2932 - 2935 (2009).
[00177] Pirrolobenzodiazepinas (PBD) e seus análogos incluem aqueles descritos em Denny, Exp. Opin. Ther. Patents., 10(4): 459-474 (2000) e Antonow e Thurston, Chem Rev., 2815-2864 (2010).
[00178] Os agentes estabilizantes e desestabilizantes de microtúbulo exemplares incluem compostos de taxano, tais como paclitaxel, docetaxel, tesetaxel e carbazitaxel; maitansinoidas, auristatinas e seus análogos, derivados de alcalóide vinca, epotilonas e criptoficinas.
[00179] Exemplares maitansinoides ou análogos de maitansinóide incluem maitansinol e maitansinol análogos, maitansina ou DM-1 e DM-4 são os descritos em Patentes US 5.208.020; 5.416.064; 6.333.410; 6.441.163; 6.716.821; RE39.151 e 7.276.497. Em determinadas formas de realização, o agente citotóxico é uma maitansinóide, outro grupo de agentes antitubulina (ImmunoGen, Inc.; ver também Chari et al., 1992, Câncer Res. 52:127-131), maitansinoides ou análogos de maitansinóide. Exemplos de maitansinoides apropriados incluem maitansinol e análogos de maitansinol. Apropriados maitansinoides são descritos em patentes U.S. Nos. 4.424.219; 4.256.746; 4.294.757; 4.307.016; 4.313.946; 4.315.929; 4.331.598; 4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.450.254; 4.322.348; 4.371.533; 6.333.410; 5.475.092; 5.585.499; e 5.846.545.
[00180] Exemplares auristatinas incluem auristatina E (também conhecida como um derivado de dolastatina-10), auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), auristatina F, auristatina F fenilenodiamina (AFP), auristatina F HPA e dolastatina. Apropriadas auristatinas também são descritas em Publicação U.S. Nos. 2003/0083263, 2011/0020343 e 2011/0070248; Publicação de pedido PCT Nos. WO 09/117531, WO 2005/081711, WO 04/010957; WO 02/088172 e WO01/24763 e Patentes US 7.498.298; 6.884.869; 6.323.315; 6.239.104; 6.124.431; 6.034.065; 5.780.588; 5.767.237; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; e 4.486.414, cujas descrições são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.
[00181] Exemplares alcaloides vinca incluem vincristina, vinblastina, vindesina e navelbina (vinorrelbina). Apropriados alcaloides Vinca que podem ser usados na presente invenção também são descritos em Publicação U.S. Nos. 2002/0103136 e 2010/0305149 e Patente US 7.303.749 B1, cujas descrições são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.
[00182] Exemplares epotilona compostos incluem epotilona A, B, C, D e F e derivados dos mesmos. Apropriado compostos epotilona e derivados dos mesmos são descritos, por exemplo, em Patentes US 6.956.036; 6.989.450; 6.121.029; 6.117.659; 6.096.757; 6.043.372; 5.969.145; e 5.886.026; e WO 97/19086; WO 98/08849; WO 98/22461; WO 98/25929; WO 98/38192; WO 99/01124; WO 99/02514; WO 99/03848; WO 99/07692; WO 99/27890; e WO 99/28324; cujas descrições são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.
[00183] Exemplares compostos criptoficina são descritos em Patentes US 6.680.311 e 6.747.021.
[00184] Exemplares compostos de placina incluem cisplatina (PLATINOL®), carboplatina (PARAPLATIN®), oxaliplatina (ELOXATINE®), iproplatina, ormaplatina e tetraplatina.
[00185] Adicionalmente outras classes de compostos ou compostos com estes ou outros modos citotóxicos de ação podem ser selecionados, incluindo, por exemplo, mitomicina C, mitomicina A, daunorrubicina, doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, aminopterina, bleomicina, 1-(clorometil)-2,3-diidro-1H-benzo[e]indol-5-ol, pirrolobenzodiazepina (PBD) poliamida e dímeros dos mesmos. Outros agentes citotóxicos adequados incluem, por exemplo, puromicinas, topotecano, rizoxina, equinomicina, combretastatina, netropsina, estramustina, criptofisinas, cemadotina discodermolida, eleuterobina e mitoxantrona.
[00186] Os inibidores exemplares de topoisomerase I incluem camptotecina, camptotecina, derivados, análogos de camptotecina e camptotecina não naturais, como, por exemplo, CPT-11 (irinotecano), SN-38, GI-147211C, topotecano, 9-aminocamptotecina, 7-hidróxi-metil camptotecina, 7-aminometil camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, (20S)- camptotecina, rubitecano, gimatecano, carenitecina, silatecano, lurtotecano, exatecano, diflomotecano, belotecano, lurtotecano e S39625. Outros compostos camptotecina que podem ser usados na presente invenção incluem os descritos em, por exemplo, J. Med. Chem., 29:2358-2363 (1986); J. Med. Chem., 23:554 (1980); J. Med. Chem., 30:1774 (1987).
[00187] Os inibidores da angiogênese incluem, mas não são limitados a, inibidores de MetAP2, inibidores de VEGF, inibidores de PIGF, inibidores de VGFR, inibidores de PDGFR, inibidores de MetAP2. VGFR e inibidores de PDGFR exemplares incluem sorafenib (Nexavar), sunitinib (Sutent) e vatalanib. Os inibidores exemplares de MetAP2 incluem análogos de fumagilol, significando qualquer composto que inclui a estrutura de núcleo de fumagilina, incluindo fumagilamina, que inibe a capacidade de MetAP-2 para remover metioninas NH2-terminais a partir das proteínas como descrito em Rodeschini et al., J. Org. Chem., 69, 357-373, 2004 e Liu, et al., Science 282, 1324-1327, 1998. Os exemplos não limitativos de “análogos de fumagilol” são descritos em J. Org. Chem., 69, 357, 2004; J.Org. Chem., 70, 6870, 2005; Pedido de patente europeia 0 354 787; J. Med. Chem., 49, 5645, 2006; Bioorg. Med. Chem., 11, 5051, 2003; Bioorg. Med. Chem., 14, 91, 2004; Tet. Lett. 40, 4797, 1999; WO99/61432; Patentes US 6.603.812; 5.789.405; 5.767.293; 6.566.541; e 6.207.704.
[00188] Os inibidores exemplares progressão do ciclo celular incluem inibidores de CDK como, por exemplo, BMS-387032 e PD0332991; inibidores de Rho- quinase como, por exemplo GSK429286; inibidores de ponto de verificação de quinase como, por exemplo, AZD7762; inibidores de quinase aurora como, por exemplo, AZD1152, MLN8054 e MLN8237; inibidores de PLK como, por exemplo, BI 2536, BI6727 (Volasertib), GSK461364, ON-01910 (Estybon); e inibidores de KSP como, por exemplo, SB 743921, SB 715992 (ispinesib), MK-0731, AZD8477, AZ3146 e ARRY- 520.
[00189] Os inibidores exemplares da via de sinalização de PI3K/m- TOR/AKT incluem inibidores de fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K), inibidores de GSK-3, inibidores de ATM, inibidores de DNA-PK e inibidores de PDK-1.
[00190] Os inibidores de PI3 quinase exemplares são descritos na Patente U.S. No. 6,608,053 e incluem BEZ235, BGT226, BKM120, CAL101, CAL263, desmetoxiviridina, GDC-0941, GSK615, IC87114, LY294002, Palomid 529, perifosina, PI-103, PF-04691502, PX-866, SAR245408, SAR245409, SF1126, Wortmanina, XL147 e XL765.
[00191] Os inibidores exemplares de AKT incluem, mas não são limitados a AT7867.
[00192] Os inibidores exemplares da via de sinalização de MAPK incluem inibidores de MEK, Ras, JNK, B-Raf e p38 MAPK.
[00193] Os inibidores exemplares de MEK são descritos em Patente US 7.517.994 e incluem GDC-0973, GSK1120212, MSC1936369B, AS703026, RO5126766 e RO4987655, PD0325901, AZD6244, AZD 8330 e GDC-0973.
[00194] Os inibidores exemplares de B-raf incluem CDC-0879, PLX- 4032 e SB590885.
[00195] Os inibidores exemplares de B p38 MAPK incluem BIRB 796, LY2228820 e SB 202190.
[00196] Os receptores de tirosina quinases (RTK) são receptores da superfície celular que são com frequência associados com as vias de sinalização estimulando a proliferação descontrolada de células de câncer e neoangiogênese. Muitos RTKs, que superexpressam ou tem mutações levando à ativação constitutiva do receptor, foram identificados, incluindo, mas não limitados a e receptores de família de receptores VEGFR, EGFR, FGFR, PDGFR, EphR RET. Os alvos de RTK específicos exemplares incluem ErbB2, FLT-3, c-Kit e c-Met.
[00197] Os inibidores exemplares de receptor ErbB2 (família EGFR) incluem mas não limitados a AEE788 (NVP-AEE 788), BIBW2992, (Afatinib), Lapatinib, Erlotinib (Tarceva) e Gefitinib (Iressa).
[00198] Os inibidores exemplares de alvejamento de RTK como uma via de sinalização (inibidores de quinase marcados com múltiplos alvos) incluem AP24534 (Ponatinib) que alveja receptores de FGFR, FLT-3, VEGFR-PDGFR e Bcr-Abl; ABT-869 (Linifanib) que alveja receptores FLT- 3 e VEGFR-PDGFR; AZD2171 que alveja receptores de VEGFR-PDGFR, Flt-1 e VEGF; CHR-258 (Dovitinib) que alveja os receptores de VEGFR- PDGFR, FGFR, Flt-3 e c-Kit; Sunitinib (Sutent) que alveja VEGFR, PDGFR, KIT, FLT-3 e CSF-IR; Sorafenib (Nexavar) e Vatalanib que alvejam VEGFR, PDGFR assim como serina/treonina quinases intracelulares no caminho de Raf/Mek/Erk.
[00199] Os inibidores exemplares chaperon de proteína incluem inibidores de HSP90. Os inibidores exemplares de HSP90 incluem 17AAG derivados, BIIB021, BIIB028, SNX-5422, NVP-AUY-922 e KW-2478.
[00200] Os inibidores exemplares de HDAC incluem Belinostat (PXD101), CUDC-101, Droxinostat, ITF2357 (Givinostat, Gavinostat), JNJ- 26481585, LAQ824 (NVP-LAQ824, Dacinostat), LBH-589 (Panobinostat), MC1568, MGCD0103 (Mocetinostat), MS-275 (Entinostat), PCI-24781, Piroxamida (NSC 696085), SB939, Trichostatina A e Vorinostat (SAHA).
[00201] Os inibidores exemplares de PARP incluem iniparib (BSI 201), olaparib (AZD-2281), ABT-888 (Veliparib), AG014699, CEP 9722, MK 4827, KU-0059436 (AZD2281), LT-673, 3-aminobenzamida, A-966492 e AZD2461
[00202] Os inibidores exemplares da via de sinalização de Wnt/Hedgehog incluem vismodegib (RG3616/GDC-0449), ciclopamina (11- deoxojervina) (inibidores da via de Hedgehog) e XAV-939 (inibidor da via de Wnt)
[00203] Os inibidores exemplares de RNA polimerase incluem amatoxinas. Exemplares amatoxinas incluem α-amanitinas, β-amanitinas, y- amanitinas, ε-amanitinas, amanulina, ácido amanúlico, amaninamida, amanina e proamanulina.
[00204] Os inibidores da síntese de proteína exemplares incluem compostos de tricoteceno.
[00205] Em uma forma de realização a droga da invenção é um inibidor da topoisomerase (tal como, por exemplo, A composto de camptotecina não natural), alcalóide vinca, inibidor de quinase (por exemplo, inibidor dePI3 quinase (GDC-0941 e PI-103)), inibidor de MEK, inibidor de KSP, inibidor de RNA polimerase, inibidor da síntese de proteína, inibidor de PARP, docetaxel, paclitaxel, doxorubicina, duocarmicina, auristatina, dolastatina, caliqueamicinas, topotecano, SN38, camptotecina, exatecano, nemorubicina e seus derivados, PNU-159682, CC1065, elinafida, trichoteceno, pirrolobenzodiazepinas, maitansinoidas, drogas que ligam DNA ou um composto de platina e seus análogos. Em modalidades específicas, a droga é um derivado de SN-38, camptotecina, topotecano, exatecano, caliqueamicina, exatecano, nemorubicina, PNU-159682, antraciclina, maitansinóide, taxano trichoteceno, CC1065, elinafida, vindesina, vinblastina, PI-103, AZD 8330, dolastatina, auristatina E, auristatina F, um composto de duocarmicina, ispinesib, pirrolobenzodiazepina, ARRY-520 e estereoisômeros, isósteros e seus análogos.
[00206] Em outra forma de realização, a droga usada na invenção é uma combinação de duas ou mais drogas, como, por exemplo, inibidores da PI3 quinase e inibidores de MEK; compostos citotóxicos e compostos de platina de espectro amplo, inibidores de PARP e compostos de platina; compostos citotóxicos de espectro amplo e inibidores de PARP.
[00207] Adicionalmente em uma outra modalidade, a droga usada na invenção é auristatina F-hidroxipropilamida-L-alanina.
[00208] Em uma forma de realização, o alcalóide Vinca é um composto de Fórmula (V):
Figure img0026
em que: R14 é hidrogênio,-C(O)-C1-3 alquila ou -C(O)-cloro substituído C1-3 alquila; R15 é hidrogênio,-CH3 ou -CHO; quando R17 e R18 são tomados independentemente, R18 é hidrogênio e um de R16 ou R17 é etila e o outro é hidroxila; quando R17 e R18 são tomados juntos com o carbono ao qual eles são unidos para formar um anel oxirano, R16 é etila; R19 é hidrogênio, OH, grupo amino, alquil amino ou- [C(R20R21)]a-R22; cada um de R20 e R21 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, arila C6-10 hidroxilado, poli-arila C6-10 hidroxilado, 5 a 13 membros heterociclo, cicloalquila C3-8, hidroxilada cicloalquila C3-8, poli- hidroxilada cicloalquila C3-8 ou uma cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R22 é -OH,-NH2,-COOH,-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)- N(H)(R23),-R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f-N(H)(R23) ou-R82-(C(O)-CH(X2)- NH)d-R77; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8,-COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é uma cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é hidrogênio ou X2 e NR77 foram uma porção heterocíclica contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; e f é um número inteiro de 1 a 12.
[00209] Outros exemplos de alcaloides Vinca são descritos na US 852421 B2 e US 2002/0103136.
[00210] Em uma forma de realização o alcalóide Vinca de Fórmula (V) é um composto de Fórmula (VI):
Figure img0027
em que: R40 é hidrogênio,-OH,-NH2, ou qualquer uma das seguintes estruturas: (
Figure img0028
Figure img0029
em que: a é um número inteiro de 1 a 6; g é um número inteiro de 1 a 6; e c é um número inteiro de 0 a 3.
[00211] Em uma modalidade, na Fórmula (VI), R40 é
Figure img0030
[00212] Em uma outra modalidade,
Figure img0031
[00213] Em uma outra modalidade, o composto da fórmula (VI) é um composto das fórmulas (VIa), (VIb), (VIc) ou (VId):
Figure img0032
Figure img0033
[00214]Em uma outra modalidade, o inibidor de topoisomerase é um composto de camptotecina da fórmula (VII):
Figure img0034
em que: R24 é -H, -Cl, -F, -OH ou alquila; ou R24 e R25, podem ser tomados juntos para formar um anel e 5 ou 6 membros opcionalmente substituído; R25 é -H, -F, -OH, -CH3, -CH=N-O-t-butila, -CH2CH2Si(CH3)3, -Si((CH3)2)-t-butila, -O-C(O)-R29; R29 é -NH2, -R28-alquila C1-6-R22, heterocicloalquila de 5 a 12 membros, R28-heterocicloalquila C5-12-alquila C1-6-R22 ou -R28-alquila C1-6- arila C6-12-alquila C1-6-R22; ou R29 é R47 como aqui definido; R26 é -H, -CH2-N(CH3)2, NH2, ou NO2; R27 é -H, etila, N-metil piperidina, cicloalquila, -CH2OH, -CH2CH2NHCH(CH3)2, ou -N-4-metilcicloexil-amina; R79 é -H ou -C(O)-R28-[C(R20R21)]a-R22; cada um de R20 e R21 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, arila C6-10 hidroxilado, arila C6-10 poliidroxilado, heterociclo de 5 a 10 membros, cicloalquila C3-8, cicloalquila C3-8 hidroxilado, cicloalquila C3-8 poliidroxilado ou cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R22 é -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)- N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f -N(H)(R23), ou -R82-(C(O)- CH(X2)-NH)d-R77; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8, -COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é um hidrogênio ou X2 e NR77 forma um composto cíclico contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; ou R26 e R27 quando tomados juntos com os dois átomos de carbono aos quais eles se ligam e o terceiro átomo de carbono conectando os dois átomos de carbono formam um anel de seis membros opcionalmente substituído; R28 está ausente, NH ou oxigênio; a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; f é um número inteiro de 1 a 12; u é um número inteiro 0 ou 1; w é um número inteiro 0 ou 1; e com a condição de que o composto da fórmula (VII) deve conter pelo menos um de R29 e R79.
[00215] Em uma modalidade o composto de camptotecina da fórmula (VII) é um composto das fórmulas (VIII), (VIIIa), ou (VIIIb), ou Fórmulas (XXV) ou (XXVa):
Figure img0035
Figure img0036
em que R30 é -NH2, -R28-[C(R20R21)]a-R22, -R28-alquila C1-6-R22, heterocicloalquila de 5 a 12 membros, R28-heterocicloalquila C5-12-alquila C1- 6-R22 ou -R28-alquila C1-6-arila C6-12-alquila C1-6-R22; R28 está ausente, NH ou oxigênio; cada um de R20 e R21 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, arila C6-10 hidroxilado, arila C6-10 poliidroxilado, heterociclo de 5 a 10 membros, cicloalquila C3-8, cicloalquila C3-8 hidroxilado, cicloalquila C3-8 poliidroxilado ou cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R22 é -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)- N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f-N(H)(R23) ou -R82-(C(O)-CH(X2)- NH)d-R77; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8, -COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é um hidrogênio ou X2 e NR77 formam um composto cíclico contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; e f é um número inteiro de 1 a 12.
[00216] Em algumas modalidades R30 é qualquer uma das seguintes estruturas:
Figure img0037
a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; e g é um número inteiro de 2 a 6.
[00217] Em uma modalidade, na Fórmula (VII), R30 é:
Figure img0038
[00218] Em uma outra modalidade, o composto da fórmula (VII) é um composto das fórmulas (VIIa), (VIIb), (VIIc), (VIId), (VIIe) ou (VIIf):
Figure img0039
Figure img0040
(VIIf).
[00219] Em uma outra modalidade os inibidores de PI3 de quinase é um composto da fórmula (IX):
Figure img0041
R47 é um grupo amino,-R9-[C(R20R21)]a-R10,-R9- heterocicloalquila C5-12 alquila C1-6-R10, heterocicloalquila de 5 a 12 membros ou -R9-arila C6-10; cada um de R20 e R21 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, arila C6-10 hidroxilado, arila C6-10 poli-hidroxilado, heterociclo de 5 a 13 membros, cicloalquila C3-8, cicloalquila C3-8 hidroxilado, cicloalquila C3-8 poli-hidroxilado ou uma cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R10 é -OH,-NHR83,-N-(R83)R11,-COOH,-R82-C(O)(CH2)c- C(H)(R23)-N(H)(R23),-R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f-N(H)(R23),-R82-(C(O)- CH(X2)-NH)d-R77 ou-R82-C(O)-[C(R20R21)]a-R82-R83; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8,-COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é uma cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é a hidrogênio ou X2 e NR77 formam um composto cíclico contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; R9 está ausente, N-(R83) ou oxigênio; R83 é hidrogênio ou CH3; R11 é:
Figure img0042
cada R12 independentemente é hidrogênio, cloreto,-CH3 ou- OCH3; R13 é hidrogênio ou-C(O)-(CH2)d-(O-CH2-CH2)f-NH2; R82 é -NH ou oxigênio X4 é a cadeia lateral de lisina, arginina, citrulina, alanina ou glicina; X5 é a cadeia lateral de fenilalanina, valina, leucina, isoleucina ou triptofano; cada de X6 e X7 é independentemente a cadeia lateral de glicina, alanina, serina, valina ou prolina; a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; f é um número inteiro de 1 a 12; e cada u independentemente é um número inteiro 0 ou 1. ou R11 é -Yu-Wq-R88, em que:
Figure img0043
em cada uma das quais o grupo NR83 de Y está próximo a R88; R83 é hidrogênio ou CH3; cada W é um aminoácido único; cada R12’ independentemente é halógeno, alquila C1-8 - Oalquila C1-8 nitro ou ciano; R88 é hidrogênio ou -C(O)-(CH2)ff-(NH-C(O))aa-Ej-(CH2)bb-R85 R85 é NH2 ou OH; E é -CH2- ou -CH2CH2O-; u é um número inteiro 0 ou 1; q é um número inteiro de 0 to12; aa é um número inteiro 0 ou 1; bb é um número inteiro 0 ou 2; ff é um número inteiro de 0 a 10; h é um número inteiro de 0 a 4; j é um número inteiro de 0 a 12; e quando E é -CH2-, bb é 0 e j é um número inteiro de 0 a 10; e quando E é -CH2CH2-O-, bb é 2 e j é um número inteiro de 1 a12;
Figure img0044
em que: R83 é hidrogênio ou CH3; R84 é alquila C1-6 ou arila C6-10; cada R12’ independentemente é halógeno, alquila C1-8 - Oalquila C1-8 nitro ou ciano; h é um número inteiro de 0 a 4; e u é um número inteiro 0 ou 1.
[00220] Em algumas modalidades, R11 é:
Figure img0045
cada R12’ independentemente é cloro, -CH3 ou -OCH3; R88 é hidrogênio ou -C(O)-(CH2)ff-(CH2-CH2O)j-CH2-CH2- NH2; R82 é -NH ou oxigênio X4 é a cadeia lateral de lisina, arginina, citrulina, alanina ou glicina; X5 é a cadeia lateral de fenilalanina, valina, leucina, isoleucina ou triptofano; cada um de X6 e X7 é independentemente a cadeia lateral de glicina, alanina, serina, valina ou prolina; ff é um número inteiro de 1 a 3; j é um número inteiro de 1 a 12 h é um número inteiro de 0 a 4; e cada u independentemente é um número inteiro 0 ou 1.
[00221] Em algumas modalidades,
Figure img0046
é citrulina-valina; lisina-fenilalanina; citrulina-fenilalanina; citrulina-leucina; citrulina-valina-glicina-glicina; glicina-fenilalanina-glicina- glicina; valina; prolina; leucina ou isoleucina.
[00222] Em uma outra modalidade, R11 é qualquer uma das seguintes estruturas:
Figure img0047
Figure img0048
[00223] NH2 Em algumas modalidades R47 é qualquer uma das seguintes
Figure img0049
Figure img0050
Figure img0051
em que: a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; e g é um número inteiro de 2 a 6.
[00224] Em uma outra modalidade a auristatina é um composto da fórmula (X):
Figure img0052
em que: cada um de R31 e R32 independentemente é hidrogênio ou alquila C1-8 e no máximo um de R31 e R32 é hidrogênio; R33 é hidrogênio, alquila C1-8, carbociclo C3-8, arila C6-10, alquila C1-8-arila C6-10, X1-(carbociclo C3-8), heterociclo C3-8 ou X1- (heterociclo C3-8); R34 é hidrogênio, alquila C1-8, carbociclo C3-8, arila C6-10, X1- arila C6-10, X1-(carbociclo C3-8), heterociclo C3-8 ou X1-(heterociclo C3-8); R35 é hidrogênio ou metila; ou R34 e R35, juntos com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados forma um anel carbocíclico tendo a Fórmula -(CR55R41)b- em que cada um de R55 e R41 independentemente é hidrogênio ou alquila C1-8 e b é um número inteiro de 3 a 7; R36 é hidrogênio ou alquila C1-8; R37 é hidrogênio, alquila C1-8, carbociclo C3-8, arila C6-10, -X1- arila C6-10, -X1-(carbociclo C3-8), heterociclo C3-8 ou -X1-(heterociclo C3-8); cada R38 independentemente é hidrogênio, OH, alquila C1-8, carbociclo C3-8 ou O-(alquila C1-8);
Figure img0053
R39 é H, alquila C1-8, arila C6-10, -X1-arila C6-10, carbociclo C3-8, heterociclo C3-8, -X1-heterociclo C3-8, -alquileno C1-8-NH2, ou (CH2)2SCH3 cada X1 independentemente é alquileno C1-10 ou cicloalquileno C3-10; R44 é hidrogênio ou alquila C1-8; R45 é X3-R42 ou NH-R19; X3 é O ou S; R19 é hidrogênio, OH, grupo amino, alquilamino ou - [C(R20R21)]a-R22; R42 é um grupo amino, alquila C1-6 amino ou -[C(R20R21)]a-R22; cada um de R20 e R21 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, arila C6-10 hidroxilado, arila C6-10 poliidroxilado, heterociclo de 5 a 10 membros, cicloalquila C3-8, cicloalquila C3-8 hidroxilado, cicloalquila C3-8 poliidroxilado ou cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R22 é -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)- N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f -N(H)(R23) ou -R82-(C(O)- CH(X2)-NH)d-R77; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8, -COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é um hidrogênio ou X2 e NR77 formam um composto cíclico contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; R54 é -C(R56)2--C(R56)2-arila C6-10, -C(R56)2--C(R56)2- heterociclo C3-8 ou -C(R56)2--C(R56)2-carbociclo C3-8; R56 é independentemente selecionado de H, OH, alquila C1-8, carbociclo C3-8, -Oalquila C1-8 -O-C(O)-R29 e -O-R23-O-alquila C1-6-NH2; R29 é um grupo amino, heterocicloalquila de 5 a 12 membros, - R28-alquila C1-6-R22, R28-heterocicloalquila C5-12-alquila C1-6-R22, - [C(R20R21)]a-R22, ou -R28-alquila C1-6-arila C6-12-alquila C1-6-R22; ou R29 é R47 como aqui definido; R28 está ausente, NH ou oxigênio; a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; e f é um número inteiro de 1 a 12.
[00225] Em algumas modalidades, no composto de auristatina da fórmula (X):
Figure img0054
R44 é hidrogênio.
[00226] Em uma outra modalidade a auristatina é um composto da
Figure img0055
em que: R33 até R38 e R44 são como aqui definidos, um de R31 e R32 é hidrogênio ou alquila C1-8 e o outro é:
Figure img0056
em que: R83 é hidrogênio ou CH3; R84 é alquila C1-6 ou arila C6-10; cada R12’ independentemente é halógeno, alquila C1-8 - Oalquila C1-8 nitro ou ciano; h é um número inteiro de 0 a 4; e u é um número inteiro 0 ou 1;
Figure img0057
R39 é H, alquila C1-8, arila C6-10, -X1-arila C6-10, carbociclo C3-8, heterociclo C3-8, -X1-heterociclo C3-8, -alquileno C1-8-NH2, ou (CH2)2SCH3, cada X1 independentemente é alquileno C1-10 ou cicloalquileno C3-10; R45 é X3-R42 ou NH-R19; X3 é O ou S; R19 é hidrogênio, OH, grupo amino, alquilamino ou - [C(R20R21)]a-R22; R42 é H, um grupo amino, alquila C1-6 amino ou -[C(R20R21)]a- R22; cada um de R20 e R21 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, arila C6-10 hidroxilado, arila C6-10 poliidroxilado, heterociclo de 5 a 10 membros, cicloalquila C3-8, cicloalquila C3-8 hidroxilado, cicloalquila C3-8 poliidroxilado ou cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R22 é -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)- N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f -N(H)(R23) ou -R82-(C(O)- CH(X2)-NH)d-R77; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8, -COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é um hidrogênio ou X2 e NR77 formam um composto cíclico contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; R54 é -C(R56)2--C(R56)2-arila C6-10, -C(R56)2--C(R56)2- heterociclo C3-8 ou -C(R56)2--C(R56)2-carbociclo C3-8; R56 é independentemente selecionado de H, OH, alquila C1-8, carbociclo C3-8, -Oalquila C1-8 -O-C(O)-R29 e -O-R23-O-alquila C1-6-NH2; R29 é um grupo amino, heterocicloalquila de 5 a 12 membros, - R28-alquila C1-6-R22, R28-heterocicloalquila C5-12-alquila C1-6-R22, - [C(R20R21)]a-R22, ou -R28-alquila C1-6-arila C6-12-alquila C1-6-R22; ou R29 é R47 como aqui definido; R28 está ausente, NH ou oxigênio; a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; e f é um número inteiro de 1 a 12.
[00227] Em uma modalidade, o composto de auristatina da fórmula (Xa) é um composto da fórmula (XIa) ou Fórmula (XIb):
Figure img0058
Figure img0059
[00228] Em uma modalidade a auristatina da fórmula (X) é um
Figure img0060
composto da fórmula (XI), Fórmula (XII) ou Fórmula (XIII): em que R42 é -CH3 ou qualquer uma das seguintes estruturas:
Figure img0061
Figure img0062
a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; e g é um número inteiro de 2 a 6; em que o composto da fórmula (XII) é:
Figure img0063
em que R40 é hidrogênio, -OH, -NH2, ou estruturas:
Figure img0064
Figure img0065
g é um número inteiro de 2 a 6; e c é um número inteiro de 0 a 3;
Figure img0066
em que R29 é um grupo amino, heterocicloalquila de 5 a 12 membros, -R28-alquila C1-6-R22, R28-heterocicloalquila C5-12-alquila C1-6-R22, - R28-[C(R20R21)]a-R22, ou -R28-alquila C1-6-arila C6-12-alquila C1-6-R22; ou R29 é R47 como aqui definido; cada um de R20 e R21 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, arila C6-10 hidroxilado, arila C6-10 poliidroxilado, heterociclo de 5 a 10 membros, cicloalquila C3-8, cicloalquila C3-8 hidroxilado, cicloalquila C3-8 poliidroxilado ou cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R22 é -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)- N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f -N(H)(R23) ou -R82-(C(O)- CH(X2)-NH)d-R77; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8, -COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é um hidrogênio ou X2 e NR77 formam um composto cíclico contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; R28 está ausente, NH ou oxigênio; a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; e f é um número inteiro de 1 a 12.
[00229] Em uma modalidade, na Fórmula (XII), R40 é
Figure img0067
[00230] Em uma outra modalidade, o composto da fórmula (XII) é um composto da fórmula (XIIb) ou (XIIc):
Figure img0068
(XIIc)
[00231] Em uma modalidade no composto da fórmula (XIII), R29 é - NH2, heterocicloalquila de 5 membros, -R28-alquila C1-6-R22, R28- heterocicloalquila C5-12-alquila C1-6-R22 ou -R28-alquila C1-6-arila C6-12-alquila C1-6-R22;; ou R29 é R47 como aqui definido; R28 está ausente, NH ou oxigênio; R22 é -OH, -NHR23, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)- N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f -N(H)(R23) ou -R82-(C(O)- CH(X2)-NH)d-R77; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8, -COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é um hidrogênio ou X2 e NR77 formam um composto cíclico contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; e f é um número inteiro de 1 a 12.
[00232] Adicionalmente em uma outra modalidade, R29 é qualquer uma das seguintes estruturas:
Figure img0069
Figure img0070
Figure img0071
(21) NH NH2 ; em que: a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; e g é um número inteiro de 2 a 6.
[00233] Em uma modalidade, o inibidor de MEK é um composto da fórmula (XIV):
Figure img0072
em que R43 é H ou -R46-R47; cada um de R20 e R21 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, arila C6-10 hidroxilado, arila C6-10 poliidroxilado, heterociclo de 5 a 10 membros, cicloalquila C3-8, cicloalquila C3-8 hidroxilado, cicloalquila C3-8 poliidroxilado ou cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R22 é -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)- N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f -N(H)(R23) ou -R82-(C(O)- CH(X2)-NH)d-R77; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8, -COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é um hidrogênio ou X2 e NR77 formam um composto cíclico contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; R46é -C(O)-; -C(O)-O-, -C(O)-NH-, ou ausente; R47 é como aqui definido; a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; e f é um número inteiro de 1 a 12.
[00234] Outros exemplos do inibidor de MEK são descritos na US 7.517.994 B2.
[00235] Em algumas modalidades R43 é -C(O)-(CH2)a-NH2, ou -C(O)- C(H)(CH3)-(CH2)c-NH2; em que a é um número inteiro de 1 a 6; e c é um número inteiro de 0 a 3.
[00236] Em uma outra modalidade, o composto de duocarmicina é um composto da fórmula (XV):
Figure img0073
em que: R47 é como aqui definido; R48 é hidrogênio, -COOalquila C1-6, -COOH, -NH2 ou -CH3; R49 é Cl, Br ou -OH; R50 é hidrogênio, -OCH3,
Figure img0074
cada um de R51 e R52 independentemente é hidrogênio ou - OCH3; e o anel AA é um anel de fenila ou pirrolila.
[00237] Outros exemplos dos compostos de duocarmicina são descritos na US 7.553.816.
[00238] Em uma modalidade o composto de duocarmicina da fórmula (XV) é um composto das fórmulas (XVI), (XVII), (XVIII) ou (XIX):
Figure img0075
Figure img0076
em que: R49 é Cl, Br ou -OH; e R47 é como aqui definido.
[00239] Em uma outra modalidade, o composto de duocarmicina é um composto de duocarmicina SA da fórmula (XX): US 5101038; ou (XXI):
Figure img0077
Figure img0078
em que: R42 é alquila C1-6 amino ou -[C(R20R21)]a-R22; cada um de R20 e R21 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, arila C6-10 hidroxilado, arila C6-10 poliidroxilado, heterociclo de 5 a 10 membros, cicloalquila C3-8, cicloalquila C3-8 hidroxilado, cicloalquila C3-8 poliidroxilado ou cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R22 é -OH, -NH2, -COOH, -R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)- N(H)(R23), -R82-C(O)(CH2)d-(O CH2-CH2)f -N(H)(R23), ou -R82-(C(O)- CH(X2)-NH)d-R77; cada R23 independentemente é hidrogênio, alquila C1-6, arila C6-10, cicloalquila C3-8, -COOH, ou -COO-alquila C1-6; X2 é cadeia lateral de um aminoácido natural ou não natural; R77 é um hidrogênio ou X2 e NR77 formam um composto cíclico contendo nitrogênio; R82 é -NH ou oxigênio; a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; d é um número inteiro de 1 a 3; e f é um número inteiro de 1 a 12.
[00240] Em algumas modalidades, R42 é qualquer uma das seguintes estruturas:
Figure img0079
em que: a é um número inteiro de 1 a 6; g é um número inteiro de 2 a 6; e c é um número inteiro de 0 a 3.
[00241] Em uma outra modalidade, o composto inibidor de KSP é um composto da fórmula (XXVI):
Figure img0080
em que R30 é como aqui definido.
[00242] Em algumas modalidades R30 é:
Figure img0081
em que: a é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 0 a 3; e g é um número inteiro de 2 a 6.
[00243] Em uma outra modalidade, o composto de duocarmicina é Duocarmicina A, Duocarmicina B1, Duocarmicina B2, Duocarmicina C1, Duocarmicina C2, Duocarmicina D, CC-1065, Adozelesina, Bizelesin ou Carzelesina
[00244] Em uma outra modalidade o composto inibidor de KSP é um composto das fórmulas (XXVII), (XXVIII) ou (XXIX):
Figure img0082
em que: R11 é como aqui definido.
[00245] Um versado na técnica de agentes terapêuticos irá prontamente entender que cada um dos agentes terapêuticos aqui descrito pode ser modificado de tal modo que o composto resultante irá reter a especificidade e/ou atividade do composto original. O versado também irá entender que muitos destes compostos podem ser usados em vez dos agentes terapêuticos descritos aqui. Assim os agentes terapêuticos da presente invenção incluem análogos e derivados dos compostos descritos aqui.
[00246] Tabela B abaixo fornece mais exemplos de agentes terapêuticos e derivados dos mesmos apropriados para conjugação para formar os conjugados polímero-droga-proteína ou armações de droga- polímero da invenção. Dados espectrais de alguns compostos também são dados (ND na tabela significa “não determinado”). Estes exemplos também podem ser a forma ativa da droga quando ela é liberada dos conjugados in vitro ou in vivo. Tabela B
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Molécula de reconhecimento com base em proteína (PBRMs)
[00247] A molécula de reconhecimento com base em proteína dirige os conjugados droga-carreador de polímero para tecidos, células ou locais específicos em uma célula. A molécula de reconhecimento com base em proteína pode dirigir o polímero modificado em cultura ou em um organismo completo, ou ambos. Em cada caso, a molécula de reconhecimento com base em proteína tem um ligante que está presente sobre a superfície da célula(s) marcada(s) no alvo às quais ele liga como uma especificidade, afinidade e avidez específicas. Em algumas formas de realização, a molécula de reconhecimento com base em proteína alveja o polímero modificado para tecidos diferentes do fígado. Em outras formas de realização a molécula de reconhecimento com base em proteína alveja o polímero modificado a um tecido específico como o fígado, rim, pulmão ou pâncreas. A molécula de reconhecimento com base em proteína pode marcar no alvo o polímero modificado para a célula alvo como uma célula de câncer, como um receptor expressado em uma célula como uma célula de câncer, tecido de matriz ou proteína associada com câncer, como antígeno de tumor. Alternativamente, as células compreendendo a vasculatura do tumor podem ser marcadas no alvo. Molécula de reconhecimento com base em proteína pode dirigir o polímero para tipos específicos de células como marcando no alvo de modo específico hepatócitos no fígado como oposto a células Kupffer. Em outros casos, molécula de reconhecimento com base em proteína pode dirigir o polímero para as células do sistema endotelial ou linfático reticular, ou para células fagocíticas profissionais, como macrófagos ou eosinófilos. (Em tais casos, o próprio polímero pode também ser um sistema de distribuição eficaz, sem a necessidade de uma marcação específica).
[00248] Em adicionalmente outras formas de realização, a molécula de reconhecimento com base em proteína pode marcar no alvo o polímero modificado para um local dentro da célula, como o núcleo, o citoplasma, ou o endossoma, por exemplo. Em formas de realização específicas, a molécula de reconhecimento com base em proteína pode melhorar a ligação celular para receptores, ou transporte citoplásmico para o núcleo e entrada do núcleo ou liberação de endossomas ou outras vesículas intracelulares.
[00249] Em formas de realização específicas as moléculas de reconhecimento com base em proteínas incluem anticorpos, proteínas e peptídeos ou miméticos de peptídeo.
[00250] Em uma modalidade preferida, a molécula de reconhecimento com base em proteína compreende um grupo sulfidrila e a molécula de reconhecimento com base em proteína é conjugada ao conjugado polímero- droga pela formação de uma ligação covalente por intermédio do grupo sulfidrila e um grupo funcional do polímero.
[00251] Os anticorpos exemplares ou anticorpos derivados de Fab, Fab2, scFv ou fragmentos de cadeia pesada de anticorpo de camelo específicos para marcadores de superfície celular, incluem, mas não são limitados a, 5T4, AOC3, ALK,AXL, C242, CA-125, CCL11, CCR 5, CD2, CD3, CD4, CD5, CD15, CA15-3, CD18, CD19, CA19-9, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD30, CD31, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD74, CD79-B, CD80, CD125, CD138, CD141, CD147, CD152, CD 154, CD326, CEA, fator de aglomeração, CTLA-4, CXCR2, EGFR (HER1),ErbB2, ErbB3, EpCAM, EPHA2, EPHB2, EPHB4, FGFR (isto é FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4), FLT3, receptor do ácido fólico, FAP, GD2, GD3, GPNMB, HGF, HER2, HER3, HMI,24, ICAM, ICOS-L, receptor de IGF-1, VEGFR1, EphA2, TRPV1, CFTR, gpNMB, CA9, Cripto, c-KIT, c- MET, ACE, APP, receptor-beta2 adrenérgico, Claudina 3, Mesotelina, MUC1, NaPi2b, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, RON, ROR1, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-B4, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-13, integrinas (incluindo α4, αvβ3, αvβ5, αvβ6, α1β4, α4β1, α4β7, α5β1, α6β4, απbβ3 integrinas), IFN-α, IFN-y, IgE, IgE, receptor de IGF-1, IL-1, IL-12, IL- 23, IL-13, IL-22, IL-4, IL-5, IL-6, receptor de imterferon, ITGB2 (CD18), LFA-1 (CD11a), L-selectina (CD62L), mucina, MUC1, miostatina, NCA-90, NGF, PDGFRα, fosfatidilserina, célula de carcinoma prostático, Pseudomonas aeruginosa, raiva, RANKL, vírus sincicial respiratório, Fator Rhesus, SLAMF7, esfingosina-1-fosfato, TAG-72, receptor de célula T, tenascina C, TGF-1, TGF-β2, TGF-β, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, antígeno de tumor CTAA16,88, VEGF-A, VEGFR2, vimentina e os seus semelhantes.
[00252] Em uma modalidade os anticorpos ou derivados de anticorpo de Fab, Fab2, scFv ou fragmentos de cadeia pesada de anticorpo de camelo específicos para marcadores de superfície celular incluem CA-125, C242, CD3, CD19, CD22, CD25, CD30, CD31, CD33, CD37, CD40, CD44, CD51, CD54, CD56, CD62E, CD62P, CD62L, CD70, CD138, CD141, CD326, CEA, CTLA-4, EGFR (HER1), ErbB2, ErbB3, FAP, receptor do ácido fólico, receptor de IGF-1, GD3, GPNMB, HGF, HER2, VEGF-A, VEGFR2, VEGFR1, EphA2, EpCAM, 5T4, TAG-72, tenascina C, TRPV1, CFTR, gpNMB, CA9, Cripto, ACE, APP, PDGFR α, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, receptor-beta2 adrenérgico, Claudina 3, mucina, MUC1, Mesotelina, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-13 e integrinas (incluindo αvβ3, αvβ5, αvβ6, α1β4, α4β1, α5β1, α6β4 integrinas), tenascina C, TRAIL-R2 e vimentina.
[00253] Os anticorpos exemplares incluem 3F8, abagovomab, abciximab (REOPRO), adalimumab (HUMIRA), adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, ALD518, alemtuzumab (CAMPATH), altumomab, amatuximab, anatumomab, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab (CEA-SCAN), aselizumab, atlizumab (tocilizumab, actemra, roactemra), atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab (Simulect), bavituximab, bectumomab (LYMPHOSCAN), belimumab (BENLYSTA), benralizumab, bertilimumab, besilesomab (SCINITIMUN), bevacizumab (AVASTIN), biciromab (FIBRISCINT), bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, briakinumab, canakinumab (ILARIS), cantuzumab, capromab, catumaxomab (REMOVAB), CC49, cedelizumab, certolizumab, cetuximab (ERBITUX), citatuzumab, cixutumumab, clenoliximab, clivatuzumab, conatumumab, CR6261, dacetuzumab, daclizumab (ZENAPAX), daratumumab, denosumab (PROLIA), detumomab, dorlimomab, dorlixizumab, ecromeximab, eculizumab (SOLIRIS), edobacomab, edrecolomab (PANOREX), efalizumab (RAPTIVA), efungumab (MYCOGRAB), elotuzumab, elsilimomab, enlimomab, epitumomab, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab (REXOMUN), etaracizumab (ABEGRIN), exbivirumab, fanolesomab (NEUTROSPEC), faralimomab, farletuzumab, felvizumab, fezakinumab, figitumumab, fontolizumab (HuZAF), foravirumab, fresolimumab, galiximab, gantenerumab, gavilimomab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, golimumab (SIMPONI), gomiliximab, ibalizumab, ibritumomab, igovomab (INDIMACIS-125), imciromab (MIOSCINT), infliximab (REMICADE), intetumumab, inolimomab, inotuzumab, ipilimumab, iratumumab, keliximab, labetuzumab (CEA-CIDE), lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, lintuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, maslimomab, matuzumab, mepolizumab (BOSATRIA), metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, morolimumab, motavizumab (NUMAX), muromonab-CD3 (ORTHOCLONE OKT3), nacolomab, naptumomab, natalizumab (TYSABRI), nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nimotuzumab (THERACIM), nofetumomab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab (ARZERRA), olaratumab, omalizumab (XOLAIR), ontecizumab, oportuzumab, oregovomab (OVAREX), otelixizumab, pagibaximab, palivizumab (SYNAGIS), panitumumab (VECTIBIX), panobacumab, pascolizumab, pemtumomab (THERAGYN), pertuzumab (OMNITARG), pexelizumab, pintumomab, priliximab, pritumumab, PRO 140, rafivirumab, ramucirumab, ranibizumab (LUCENTIS), raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rilotumumab, rituximab (RITUXAN), robatumumab, rontalizumab, rovelizumab (LEUKARREST), ruplizumab (ANTOVA), satumomab pendetide, sevirumab, sibrotuzumab, sifalimumab, siltuximab, siplizumab, solanezumab, sonepcizumab, sontuzumab, stamulumab, sulesomab (LEUKOSCAN), tacatuzumab (AFP-CIDE), tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab (AUREXIS), telimomab, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, TGN1412, ticilimumab (tremelimumab), tigatuzumab, TNX-650, tocilizumab (atlizumab, ACTEMRA), toralizumab, tositumomab (BEXXAR), trastuzumab (HERCEPTIN), tremelimumab, tucotuzumab, tuvirumab, urtoxazumab, ustekinumab (STELERA), vapaliximab, vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, visilizumab (NUVION), volociximab (HUMASPECT), votumumab, zalutumumab (HuMEX-EGFr), zanolimumab (HuMAX-CD4), ziralimumab e zolimomab.
[00254] Em algumas modalidades os anticorpos são direcionados aos marcadores de superfície celular para 5T4, CA-125, CEA, CD3, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD44, CD51, CTLA-4, EpCAM, HER2, EGFR (HER1), FAP, receptor do ácido fólico, HGF, integrina αvβ3, integrina α5β1, receptor de IGF-1, GD3, GPNMB, mucina, MUC1, fosfatidilserina, células de carcinoma prostático, PDGFR α, TAG-72, tenascina C, TRAIL-R2, VEGF-A e VEGFR2. Nesta modalidade os anticorpos são abagovomab, adecatumumab, alacizumab, altumomab, anatumomab, arcitumomab, bavituximab, bevacizumab (AVASTIN), bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, cantuzumab, catumaxomab, capromab, cetuximab, citatuzumab, clivatuzumab, conatumumab, dacetuzumab, edrecolomab, epratuzumab, ertumaxomab, etaracizumab, farletuzumab, figitumumab, gemtuzumab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, intetumumab, inotuzumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lucatumumab, matuzumab, mitumomab, naptumomab estafenatox, necitumumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, pritumumab, rituximab (RITUXAN), rilotumumab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, taplitumomab, tenatumomab, tenatumomab, ticilimumab (tremelimumab), tigatuzumab, trastuzumab (HERCEPTIN), tositumomab, tremelimumab, tucotuzumab celmoleukin, volociximab e zalutumumab.
[00255] Em modalidades específicas os anticorpos direcionados aos marcadores de superfície celular para HER2 são pertuzumab ou trastuzumab e para EGFR (HER1) o anticorpo é cetuximab ou panitumumab; e para CD20 o anticorpo é rituximab e para VEGF-A é bevacizumab e para CD-22 o anticorpo é epratuzumab ou veltuzumab e para CEA o anticorpo é labetuzumab.
[00256] Exemplares peptídeos ou miméticos de peptídeo incluem peptídeos marcando no alvo integrina (peptídeos RGD), peptídeos marcando no alvo receptor de LHRH, peptídeos marcando no alvo receptor de ErbB2 (HER2), peptídeos marcando no alvo antígeno ligado a membrana específico da próstata (PSMA), lipoproteína marcando no alvo receptor de LRP1, peptídeos derivados de proteína ApoE, peptídeos de proteína ApoA, peptídeos marcando no alvo receptor de somatostatina, peptídeos derivados de clorotoxina e bombesina.
[00257] Em formas de realização específicas os peptídeos ou miméticos de peptídeo são peptídeos marcando no alvo receptor de LHRH e peptídeos marcando no alvo receptor de ErbB2 (HER2)
[00258] Exemplares proteínas compreendem insulina, transferrina, fragmento gama-fibrinogênio, trombospondina, claudina, apolipoproteína E, moléculas Affibody como, por exemplo, ABY-025, proteínas de repetição de Ankyrina, proteínas de repetição de tipo ankyrina e peptídeos sintéticos.
[00259] Em algumas formas de realização da invenção os conjugados proteína-polímero-droga compreendem citotoxinas de largo espectro em combinação com marcadores da superfície celular para HER2 como pertuzumab ou trastuzumab; para EGFR como cetuximab e panitumumab; para CEA como labetuzumab; para CD20 como rituximab; para VEGF-A como bevacizumab; ou para CD-22 como epratuzumab ou veltuzumab.
[00260] Em outras formas de realização da invenção os conjugados proteína-droga-polímero ou conjugados proteína-polímero usados na invenção compreendem combinações de duas ou mais moléculas de reconhecimento com base em proteínas, como, por exemplo, combinação de anticorpos biespecíficos dirigidos para o receptor EGF (EGFR) em células de tumor e para CD3 e CD28 em células T; combinação de anticorpos ou derivados de anticorpo a partir de Fab, Fab2, scFv ou fragmentos de cadeia pesada de anticorpo de camelo e peptídeos ou miméticos de peptídeo; combinação de anticorpos ou derivados de anticorpo de Fab, Fab2, scFv ou fragmentos de cadeia pesada de anticorpo de camelo e proteínas; combinação de dois anticorpos biespecíficos como CD3 x CD19 plus anticorpos bi-específicos CD28 x CD22.
[00261] Em outras modalidades da invenção os conjugados de proteína-droga-polímero ou conjugados de proteína-polímero usados na invenção que compreendem moléculas de reconhecimento com base em proteína são antígenos contra anticorpos, tais como, por exemplo, Trastuzumab, Cetuximab, Rituximab, Bevacizumab, Epratuzumab, Veltuzumab, Labetuzumab, B7-H4, B7-H3, CA125, CD33, CXCR2, EGFR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, HER2, NaPi2b, c-Met, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PD-L1, c-Kit, MUC1 e 5T4.
[00262] Em uma modalidade específica da invenção, os conjugados de proteína-droga-polímero ou conjugados de proteína-polímero da invenção compreendem molécula de reconhecimento com base em proteínas que são anticorpos contra 5T4, tais como, por exemplo um anticorpo scFvFc anti-5T4 humanizado.
[00263] Os exemplos de ligantes ou imunoglobulinas alvejadores 5T4 adequados incluem aqueles que são comercialmente disponíveis, ou foram descritos na literatura de patente ou não patente, por exemplo, US 8.044.178, US 8.309.094, US 7.514.546, EP1036091 (comercialmente disponível como TroVax®, Oxford Biomedica), EP2368914A1, WO 2013041687 A1 (Amgen), US 2010/0173382 e P. Sapra, et al., Mol. Cancer Ther. 2013, 12: 38-47. Um anticorpo anti-5T4 é descrito no Pedido Provisório US No. 61/877.439, depositado em 13 de setembro de 2013 e Pedido Provisório US Número 61/835.858, depositado em 17 de junho de 2013. Os conteúdos de cada um dos documentos de patente e publicações científicas são aqui incorporados por referência em suas totalidades.
[00264] Como aqui usado, o termo “porção de ligação do antígeno 5T4” se refere a uma sequência de polipeptídeo capaz de ligar seletivamente a um antígeno 5T4. Nos conjugados exemplares, a porção de ligação do antígeno 5T4 geralmente compreende uma forma scFv-Fc de cadeia única engenheirada a partir de um anticorpo anti-5T4. Um fragmento variável de cadeia única (scFv-Fc) é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de uma imunoglobulina, conectada com um aglutinante peptídico e adicionalmente conectado a uma região Fc compreendendo uma região de dobradiça e regiões CH2 e CH3 de um anticorpo (qualquer uma de tais combinações de porções de anticorpo entre si ou com outras sequências de peptídeo é algumas vezes aqui aludida como uma molécula de “imunofusão”). Dentro de uma tal molécula de scFvFc, a seção de scFv pode ser ligada pelo terminal C ao terminal N da seção Fc por um aglutinante peptídico.
[00265] Pelo menos uma porção da porção de ligação do antígeno 5T4 das moléculas de imunofusão pode originar de uma fonte de murino. Por exemplo, pode-se obter uma molécula de imunofusão pela expressão de um polinuclídeo engenheirado para codificar pelo menos uma região de scFv anti- 5T4 de murino tendo a sequência de polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: A (ver, por exemplo, Pedido Provisório US Número 61/835.858, depositado em 17 de junho de 2013). Adicionalmente, pelo menos uma porção da porção de ligação do antígeno 5T4 pode ser gerada para ser quimérica ou humanizada de acordo com os métodos bem conhecidos. Ver, Borras et al., J. Biol. Chem. 19 de março de 2010; 285(12): 9054-66. Assim, pode-se obter uma molécula de imunofusão tendo uma porção de ligação do antígeno 5T4 com uma porção de scFv humanizada pela expressão de um polinuclídeo engenheirado para codificar pelo menos a sequência de polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: B (ver, por exemplo, Pedido Provisório US Número 61/835.858, depositado em 17 de junho de 2013).
[00266] Em alguns exemplos, a porção de Fv da porção de ligação do antígeno 5T4 pode ser engenheirada pelas técnicas da biologia molecular bem conhecidas para compreender uma ou mais substituições de aminoácido na região VH. A porção de Fc da porção de ligação de antígeno 5T4 preferivelmente compreende uma sequência de polipeptídeo engenheirada a partir das regiões de dobradiça, CH2 e CH3 humanas de um anticorpo anti- 5T4. Por exemplo, é possível engenheirar um polinuclídeo para codificar pelo menos uma porção de Fc tendo a sequência de polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: C (ver, por exemplo, Pedido Provisório US Número 61/835.858, depositado em 17 de junho de 2013).
[00267] Um polinuclídeo que codifica um peptídeo em que as regiões de Fv e Fc de cadeia única são ligadas juntas pode codificar pelo menos uma porção de ligação quimérica do antígeno 5T4 de conjugado tendo a sequência de polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO: D ou pode codificar uma porção de ligação humanizada do antígeno 5T4 tendo a sequência de polipeptídeo de acordo com as SEQ ID NOs: E ou F.
[00268] Um aglutinante de polipeptídeo, tal como um tendo a sequência de polipeptídeo ASTC (SEQ ID NO: Y) ou ASTX (SEQ ID NO: Z) (onde “X” se refere a qualquer aminoácido ou uma ligação de peptídeo direta entre os aminoácidos adjacentes), pode fundir o terminal C da porção de ScFv ao terminal N da porção de Fc da porção de ligação do antígeno 5T4. Assim, é possível engenheirar um polinuclídeo para codificar pelo menos um aglutinante tendo a sequência de polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NOs: Y ou Z. Embora as SEQ ID NOs: Y ou Z possam ser usadas como um aglutinante, uma molécula de imunofusão tendo um peptídeo aglutinante de acordo com a SEQ ID NO: Y beneficia-se da conjugação específica de sítio devido à presença do resíduo de cisteína.
[00269] Preferivelmente, qualquer substituição, inserção ou deleção de aminoácido ou uso de um peptidomimético não reduz substancialmente a afinidade ou especificidade da porção de ligação do antígeno 5T4. Uma molécula de imunofusão tendo uma substituição, inserção ou deleção do aminoácido ou um peptidomimético na porção de ligação do antígeno 5T4 preferivelmente retém mais do que 75 %, preferivelmente mais do que 80 %, preferivelmente mais do que 85 %, preferivelmente mais do que 90 %, ou preferivelmente mais do que 95 % de afinidade ou especificidade para ligar o antígeno 5T4 comparado a um conjugado com porção de ligação do antígeno 5T4 não modificada.
[00270] A proteína de fusão de anticorpo de cadeia única anti-5T4-Fc (“scFv-Fc anti-5T4”) foi preparada nas células CHO DG44, como descrito no Pedido Provisório US Número 61/835.858, depositado em 17 de junho de 2013.
[00271] SEQ ID NO: A: scFv murino específico de 5T4: EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLE WIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAV YYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSIVM TQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTS SRYAGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGG GTKLEIK
[00272] SEQ ID NO: B: scFv humanizado específico de 5T4: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLE WVSRINPNNGVTLYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAW YQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIK
[00273] SEQ ID NO: C: Dobradiça CH2-CH3 humana (Fcgama1): EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: Y: Conjugação específica de sítio-1: ASTC SEQ ID NO: Z: Nenhuma conjugação específica de sítio-1: ASTX SEQ ID NO: D: ScFc-Fc anti-5T4 quimérico: EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSPGKGLE WIGRINPNNGVTLYNQKFKDKATLTVDKSSTTAYMELRSLTSEDSAV YYCARSTMITNYVMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSIVM TQTPTSLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLISYTS SRYAGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDAAVYFCQQDYNSPPTFGG GTKLEIKASTCEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
[00274] SEQ ID NO: E: ScFc-Fc anti-5T4 humanizado (ASTC): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLE WVSRINPNNGVTLYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAW YQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKASTCEPKSSDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[00275] SEQ ID NO: F: ScFc-Fc anti-5T4 humanizado (ASTX): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKASGYSFTGYYMHWVRQAPGKGLE WVSRINPNNGVTLYNQKFKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCARSTMITNYVMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAW YQQKPGKAPKLLIYYTSSRYAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFA TYYCQQDYNSPPTFGGGTKLEIKASTXEPKSSDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[00276] Estes anticorpos podem ser produzidos recombinante, sinteticamente, ou por outro método adequado conhecido na técnica. Tais métodos e construções utilizam as sequências do ácido nucléico que codificam as sequências de polipeptídeo e peptídeo aqui identificadas. Alternativamente, tais métodos e construções para a produção de anticorpo utilizam sequências que são natural ou artificialmente modificadas, por exemplo, variantes naturais ou variantes otimizadas no códon da SEQ ID NOs aqui fornecidas (por exemplo, A). Uma variedade de esquemas de otimização de códon é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, UpGene® e Optimizer®, que são métodos de otimização com base na web. Adicionalmente, várias instituições comerciais realizam a otimização de códon usando esquemas patenteados, por exemplo, SignGen Laboratories, DNA2,0, OpenX, entre outros.
[00277] Estes ligantes alvejadores, os ligantes e a droga ou fragmentos de pró-droga aqui descritos podem ser montados no conjugado de droga terapêutica e alvejador da invenção, por exemplo de acordo com as técnicas e métodos descritos. Os conjugados terapêuticos e alvejadores da invenção e métodos para produzi-los, são descritos abaixo por via de exemplo não limitante.
Conjugados ou armações poliméricas
[00278] Conjugados da invenção compreendem uma ou mais ocorrências de D, onde D é um agente terapêutico, por exemplo, Aa droga, em que a uma ou mais ocorrências de D podem ser iguais ou diferentes.
[00279] Em outras determinadas formas de realização, uma ou mais ocorrências de PBRM são unidas ao carreador polimérico, em que a uma ou mais ocorrências de PBRM podem ser iguais ou diferentes. Em outras determinadas formas de realização, um ou mais carreadores de polímero que contém uma ou mais ocorrências de D são conectados a uma PBRM (por exemplo, um anticorpo).
[00280] Como discutido mais geralmente acima, em determinadas formas de realização, cada carreador polimérico independentemente, tem cerca de 0,1 a cerca de 25 % monômeros compreendendo um D, mais preferivelmente cerca de 0,5 a cerca de 20 %, mais preferivelmente cerca de 1 a cerca de 15 % e adicionalmente mais preferivelmente cerca de 2 a cerca de 10 %. Por exemplo, o carregador polimérico é PHF tendo um peso molecular de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa e tem cerca de 0,3 % a cerca de 15 % de monômeros compreendendo auristatina F, mais preferivelmente cerca de 2 % a 12 %, mais preferivelmente cerca de 5 % a 10 %.
[00281] Em certas modalidades, quando D é droga que tem uma IC50 <10 pM para a atividade antiproliferativa em uma faixa ampla de linhagens celulares, o carregador polimérico é PHF tendo um peso molecular de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa e tem de cerca de 0,1 % a cerca de 25 % de monômeros compreendendo D, mais preferivelmente de cerca de 2 % a 10 %, mais preferivelmente de cerca de 2 % a 5 %.
[00282] Em certas modalidades, o conjugado desta invenção é da fórmula (Id):
Figure img0091
em que: cada ocorrência de D independentemente é um agente terapêutico tendo um peso molecular de < 5 kDa e o entre D e o grupo carbonila indica ligação direta ou indireta de D ao grupo carbonila, m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 140, e m7 é um número inteiro de 1 a cerca de 40, em que a soma de m1 e m7 é m6 (isto é, de 2 a cerca de 180).
[00283] Em uma modalidade, D é a) um composto de auristatina; (b) um composto de caliqueamicina; (c) um composto de duocarmicina; (d) um inibidor de topoisomerase, (e) um composto de pirrolobenzodiazepina; (f) um composto de vinca; (g) um inibidor da síntese de proteína; (h) um inibidor da RNA polimerase; (i) um composto aglutinante de tubulina; ou um análogo dos mesmos.
[00284] Em certas modalidades, D é (a) um composto de auristatina; (b) um composto de caliqueamicina; (c) um composto de duocarmicina; (d) um composto de camptotecina, (e) um composto de pirrolobenzodiazepina; (f) um composto de vinca; ou um análogo dos mesmos.
[00285] Por exemplo, o composto de auristatina é auristatina, dolastatina, monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF), auristatina F, AF HPA, fenilenodiamina (AFP).
[00286] Por exemplo, a duocarmicina ou um análogo dos mesmos é duocarmicina A, duocarmicina B1, duocarmicina B2, duocarmicina C1, duocarmicina C2, duocarmicina D, duocarmicina SA, CC-1065, adozelesina, bizelesina, ou carzelesina.
[00287] Por exemplo, o composto de camptotecina é camptotecina, CPT-11 (irinotecano), SN-38, ou topotecano.
[00288] Por exemplo, o composto de pirrolobenzodiazepina é um monômero de pirrolobenzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina simétrico ou um dímero de pirrolobenzodiazepina não simétrico.
[00289] O conjugado polímero-droga da fórmula (Id) é útil para a conjugação com uma PBRM que tem um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior; 80 kDa ou maior; 100 kDa ou maior; 120 kDa ou maior; 140 kDa ou maior; 160 kDa ou maior; 180 kDa ou maior; ou 200 kDa ou maior, ou de cerca de 40 a 200 kDa, 40 a 180 kDa, 40 a 140 kDa, 60 a 200 kDa, 60 a 180 kDa, 60 a 140 kDa, 80 a 200 kDa, 80 a 180 kDa, 80 a 140 kDa, 100 a 200 kDa, 100 a 180 kDa, ou 100 a 140 kDa).
[00290] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior, 80 kDa ou maior, 100 kDa ou maior, 120 kDa ou maior, 140 kDa ou maior, 160 kDa ou maior ou 180 kDa ou maior), o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa).
[00291] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 40 kDa a 200 kDa, o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa).
[00292] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 40 kDa a 80 kDa, o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa). Por exemplo o PHF tem um peso molecular de cerca de 5 kDa, 10 kDa ou 15 kDa.
[00293] PBRMs nesta faixa de peso molecular incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, fragmentos de anticorpo, tais como, por exemplo, Fabs.
[00294] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 60 kDa a 120 kDa, o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa). Por exemplo o PHF tem um peso molecular de cerca de 5 kDa, 10 kDa ou 15 kDa.
[00295] As PBRMs nesta faixa de peso molecular incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, camelídeos, Fab2, scFvFc e os seus semelhantes.
[00296] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 140 kDa a 180 kDa, o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa). Por exemplo o PHF tem um peso molecular de cerca de 5 kDa, 10 kDa ou 15 kDa.
[00297] As PBRMs nesta faixa de peso molecular incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, anticorpos de tamanho natural, tais como, IgG, IgM.
[00298] Em certas modalidades, o conjugado de polímero droga (Id) quando conjugado a uma PBRM é da fórmula (Ie):
Figure img0092
em que: um de Xa e Xb é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido, ou Xa e Xb, juntos com os átomos de carbono aos quais estão ligados formam uma ligação dupla de carbono-carbono; m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 17, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8, em que a soma de m3a e m3b é m3, a soma de m, m1, m7, m3a e m3b varia de cerca de 15 a cerca de 300, e m5 é um número inteiro de 1 a cerca de 10.
[00299] A PBRM tem um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior; 80 kDa ou maior; 100 kDa ou maior; 120 kDa ou maior; 140 kDa ou maior; 160 kDa ou maior; 180 kDa ou maior; ou 200 kDa ou maior, ou de cerca de 40 a 200 kDa, 40 a 180 kDa, 40 a 140 kDa, 60 a 200 kDa, 60 a 180 kDa, 60 a 140 kDa, 80 a 200 kDa, 80 a 180 kDa, 80 a 140 kDa, 100 a 200 kDa, 100 a 180 kDa, ou 100 a 140 kDa).
[00300] Por exemplo, a PBRM tem um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior; 80 kDa ou maior; 100 kDa ou maior; 120 kDa ou maior; 140 kDa ou maior; 160 kDa ou maior; 180 kDa ou maior; ou 200 kDa ou maior, ou de cerca de 40 a 200 kDa, 40 a 180 kDa, 40 a 140 kDa, 60 a 200 kDa, 60 a 180 kDa, 60 a 140 kDa, 80 a 200 kDa, 80 a 180 kDa, 80 a 140 kDa, 100 a 200 kDa, 100 a 180 kDa, ou 100 a 140 kDa) e tem um grupo sulfidrila (isto é,-SH ou tiol).
[00301] Por exemplo, o número total de ligações de sulfeto formado entre o PHF e a PBRM (ou número total de pontos de ligação) é 10 ou menos.
[00302] Por exemplo, a razão entre m7 e m3b é maior do que 1:1 e menor do que ou igual a 10:1.
[00303] Por exemplo, a razão entre m7 e m3b é de cerca de 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, ou 2:1.
[00304] Por exemplo, a razão entre m7 e m3b está entre 2:1 e 8:1.
[00305] Por exemplo, a razão entre m7 e m3b é de cerca de 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, ou 2:1.
[00306] Por exemplo, a razão entre m7 e m3b está entre 2:1 e 4:1.
[00307] Por exemplo, a razão entre m7 e m3b é de cerca de 4:1, 3:1, ou 2:1.
[00308] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ie) tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 20 kDa, a soma de m, m1, m7, m3a e m3b varia de cerca de 15 a cerca de 150, m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 70, m7 é um número inteiro de 1 a cerca de 20, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 9, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8 e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 8.
[00309] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ie) tem um peso molecular variando de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa, a soma de m, m1, m7, m3a e m3b varia de cerca de 20 a cerca de 110, m1 é um número inteiro de 2 a cerca de 50, m7 é um número inteiro de 2 a cerca de 15, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 7, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8 e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 4.
[00310] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ie) tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa, a soma de m, m1, m7, m3a e m3b varia de cerca de 40 a cerca de 75, m1 é um número inteiro de cerca de 5 a cerca de 35, m7 é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 10, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 4, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 5 e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 4.
[00311] Em certas modalidades, o conjugado proteína-polímero-droga desta invenção é da fórmula (Ib) como aqui descritos:
Figure img0093
em que: um de Xa e Xb é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido, ou Xa e Xb, juntos com os átomos de carbono aos quais estão ligados formam uma ligação dupla de carbono-carbono; m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 17, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8, em que a soma de m3a e m3b é m3, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 15 a cerca de 300, e m5 é um número inteiro de 1 a cerca de 10.
[00312] Por exemplo, a PBRM tem um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior; 80 kDa ou maior; 100 kDa ou maior; 120 kDa ou maior; 140 kDa ou maior; 160 kDa ou maior; 180 kDa ou maior; ou 200 kDa ou maior, ou de cerca de 40 a 200 kDa, 40 a 180 kDa, 40 a 140 kDa, 60 a 200 kDa, 60 a 180 kDa, 60 a 140 kDa, 80 a 200 kDa, 80 a 180 kDa, 80 a 140 kDa, 100 a 200 kDa, 100 a 180 kDa, ou 100 a 140 kDa).
[00313] Por exemplo, o número total de ligações de sulfeto formadas entre o PHF e a PBRM (ou número total de pontos de ligação) é 10 ou menos.
[00314] Por exemplo, a razão entre m2 e m3b é maior do que 1:1 e menor do que ou igual a 10:1.
[00315] Por exemplo, a razão entre m2 e m3b é de cerca de 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, ou 2:1.
[00316] Por exemplo, a razão entre m2 e m3b está entre 2:1 e 8:1.
[00317] Por exemplo, a razão entre m2 e m3b é de cerca de 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, ou 2:1.
[00318] Por exemplo, a razão entre m2 e m3b está entre 2:1 e 4:1.
[00319] Por exemplo, a razão entre m2 e m3b é de cerca de 4:1, 3:1, ou 2:1.
[00320] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ib) tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 20 kDa, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 15 a cerca de 150, m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 70, m2 é um número inteiro de 1 a cerca de 20, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 9, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8 e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 8.
[00321] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ib) tem um peso molecular variando de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 20 a cerca de 110, m1 é um número inteiro de 2 a cerca de 50, m2 é um número inteiro de 2 a cerca de 15, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 7, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8 e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 4.
[00322] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ib) tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 40 a cerca de 75, m1 é um número inteiro de cerca de 5 a cerca de 35, m2 é um número inteiro de cerca de 3 a cerca de 10, m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 4, m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 5 e m5 é um número inteiro de 2 a cerca de 4.
[00323] Por exemplo, as porções bloqueadoras de maleimido são porções que podem ser covalentemente ligadas a um dos dois átomos de carbono da olefina na reação do grupo maleimido com um composto contendo tiol da fórmula (II): R90-(CH2)d-SH (II) em que: R90 é NHR91, OH, COOR93, CH(NHR91)COOR93 ou um grupo fenila substituído; R93 é hidrogênio ou alquila C1-4; R91 é hidrogênio, CH3ou CH3COe d é um número inteiro de 1 a 3.
[00324] Por exemplo, o composto bloqueador de maleimido da fórmula (II) pode ser cisteína, N-acetil cisteína, éster metílico de cisteína, N-metil cisteína, 2-mercaptoetanol, ácido 3-mercaptopropanóico, ácido 2- mercaptoacético, mercaptometanol (isto é, HOCH2SH), benzil tiol em que a fenila é substituída com um ou mais substituintes hidrofílicos, ou 3- aminopropano-1-tiol. O um ou mais substituintes hidrofílicos em fenila compreendem OH, SH, metóxi, etóxi, COOH, CHO, COalquila C1-4, NH2, F, ciano, SO3H, PO3H e os seus semelhantes.
[00325] Por exemplo, o grupo bloqueador de maleimido é -S-(CH2)d- R90, em que, R90 é OH, COOH, ou CH(NHR91)COOR93; R93 é hidrogênio ou CH3; R91 é hidrogênio ou CH3CO; e d é 1 ou 2.
[00326] Por exemplo, o grupo bloqueador de maleimido é -S-CH2- CH(NH2)COOH.
[00327] Por exemplo, quando o PHF tem um peso molecular variando de 2 kDa a 40 kDa, (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa), o número de drogas para PHF (por exemplo, m2) é um número inteiro de 1 a cerca de 40, (por exemplo, de cerca de 1 a 20 ou de cerca de 2 a 15 ou de cerca de 3 a 10). Este suporte pode ser usado, por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior; 80 kDa ou maior; ou 100 kDa ou maior; 120 kDa ou maior; 140 kDa ou maior; 160 kDa ou maior ou 180 kDa ou maior). Nesta modalidade a razão de PBRM para PHF está entre cerca de 1:1 e cerca de 1:10, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:9, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:8, entre cerca de 1:1 e cerca de1:7, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:6, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:5, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:4, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:3, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:2, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:6, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:5, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:4 ou entre cerca de 1:2 e cerca de 1:3.
[00328] Por exemplo, quando o PHF tem um peso molecular variando de 2 kDa a 40 kDa, (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa), o número de drogas para PHF (por exemplo, m2) é um número inteiro de 1 a cerca de 40, (por exemplo, de cerca de 1:20 ou de cerca de 2 a 15 ou de cerca de 3:10). Este suporte pode ser usado, por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 140 kDa a 180 kDa. Nesta modalidade a razão de PBRM para PHF está entre cerca de 1:1 e cerca de 1:10, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:9, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:8, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:7, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:6, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:5, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:4, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:3, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:2, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:6, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:5, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:4 ou entre cerca de 1:2 e cerca de 1:3.
[00329] As PBRMs nesta faixa de peso molecular incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, anticorpos de tamanho natural, tais como, IgG, IgM.
[00330] Por exemplo, quando o PHF tem um peso molecular variando de 2 kDa a 40 kDa, (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa), o número de drogas para PHF (por exemplo, m2) é um número inteiro de 1 a cerca de 40, (por exemplo, de cerca de 1:20 ou de cerca de 2:15 ou de cerca de 3:10). Este suporte pode ser usado, por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 60 kDa a 120 kDa. Nesta modalidade a razão de PBRM para PHF está entre cerca de 1:1 e cerca de 1:10, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:9, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:8, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:7, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:6, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:5, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:4, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:3, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:2, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:6, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:5, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:4 ou entre cerca de 1:2 e cerca de 1:3.
[00331] As PBRMs nesta faixa de peso molecular incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, fragmentos de anticorpo tais como, por exemplo Fab2, scFcFv e camelídeos.
[00332] Por exemplo, quando o PHF tem um peso molecular variando de 2 kDa a 40 kDa, (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa), o número de drogas para PHF (por exemplo, m2) é um número inteiro de 1 a cerca de 40, (por exemplo, de cerca de 1:20 ou de cerca de 2 a 15 ou de cerca de 3:10). Este suporte pode ser usado, por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 40 kDa a 80 kDa. Nesta modalidade a razão de PBRM para PHF está entre cerca de 1:1 e cerca de 1:10, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:9, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:8, entre cerca de 1:1 e cerca de1:7, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:6, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:5, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:4, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:3, entre cerca de 1:1 e cerca de 1:2, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:6, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:5, entre cerca de 1:2 e cerca de 1:4 ou entre cerca de 1:2 e cerca de 1:3.
[00333] As PBRMs nesta faixa de peso molecular incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, fragmentos de anticorpo, tais como, Fabs.
[00334] Em um outro aspecto, a invenção descreve uma armação polimérica útil para conjugar tanto com uma molécula de reconhecimento com base em proteína (PBRM) quanto um agente terapêutico (D). A armação livre de D compreende um carreador polimérico, um ou mais ligantes conectados ao carreador polimérico que são adequados para conectar uma PBRM ao carreador polimérico e um ou mais ligantes adequados para conectar uma droga (D) ao carreador polimérico.
[00335] Em determinadas formas de realização, os conjugados são formados em várias etapas. Estas e etapas incluem (1) modificar um polímero de modo que ele contenha um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional da droga ou seu derivado; (2) reagir o polímero modificado com a droga ou seu derivado de modo que a droga seja ligada ao polímero; (3) modificar o conjugado polímero-droga de modo que o polímero contenha um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional da PBRM ou seu derivado; e (4) reagir o conjugado polímero-droga modificado com a PBRM ou seu derivado para formar o conjugado desta invenção. A etapa (3) pode ser omitida se o polímero modificado produzido por etapa (1) contém um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional da PBRM ou seu derivado.
[00336] Em outra forma de realização os conjugados são formados em várias etapas: (1) modificar um polímero de modo que ele contenha um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional de uma primeira droga ou seu derivado; (2) reagir o modificado polímero com a primeira droga ou seu derivado de modo que a primeira droga seja ligada ao polímero; (3) modificar o conjugado polímero-droga de modo que ele contenha um grupo funcional diferente que pode reagir com um grupo funcional de uma segunda droga ou seu derivado (4) reagir o conjugado polímero-droga modificado com a segunda droga ou seu derivado de modo que a segunda droga é ligada ao conjugado polímero-droga; (5) modificar o conjugado polímero-droga contendo 2 drogas diferentes de modo que o polímero contenha um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional da PBRM ou seu derivado; e (6) reagir o conjugado polímero-droga modificado da etapa (5) com a PBRM ou seu derivado para formar o conjugado desta invenção. As etapas (5) e (6) podem ser repetidas se 2 diferentes PBRM ou seus derivados devem ser conjugados para formar um conjugado polímero-droga compreendendo duas drogas diferentes e duas diferentes PBRMs.
[00337] Em adicionalmente outra forma de realização, os conjugados são formados em várias etapas. Estas etapas incluem (1) modificar um polímero de modo que ele contenha um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional da droga ou seu derivado; (2) adicionalmente modificar o polímero de modo que ele também contenha um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional da PBRM ou seu derivado; (3) reagir o polímero modificado com a droga ou seu derivado de modo que a droga seja ligada ao polímero; e (4) reagir o conjugado polímero-droga modificado com a PBRM ou seu derivado para formar o conjugado desta invenção. A sequência de etapas (1) e (2) ou das etapas (3) e (4) pode ser revertida. Adicionalmente mais ou a etapa (1) ou (2) pode ser omitida se o polímero modificado contém um grupo funcional que pode reagir com ambos um grupo funcional da droga ou seus derivados e um grupo funcional da PBRM ou seu derivado.
[00338] Em outra forma de realização os conjugados são formados em várias etapas: (1) modificar um polímero de modo que ele contenha um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional de uma primeira droga ou seu derivado; (2) adicionalmente modificar um polímero de modo que ele contenha um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional da PBRM ou seu derivado; (3) reagir o polímero modificado com a primeira droga ou seu derivado de modo que a primeira droga seja ligada ao polímero; (4) modificar o conjugado polímero-droga de modo que ele contenha um grupo funcional diferente que pode reagir com um grupo funcional de uma segunda droga ou seu derivado (5) reagir o modificado conjugado polímero- droga com o segunda droga ou seu derivado de modo que a segunda droga seja ligada ao conjugado polímero-droga; (6) reagir o conjugado polímero- droga modificado contendo 2 drogas diferentes de modo que o polímero com a PBRM ou seu derivado forme o conjugado desta invenção. A etapa (6) pode ser repetida se 2 PBRM diferentes ou seu derivados devem ser conjugados para formar um conjugado polímero-droga compreendendo duas drogas diferentes e duas PBRMs diferentes. Etapa (4) pode realizada após a etapa (1) de modo que o polímero modificado contenha dois grupos funcionais diferentes que pode reagir com duas drogas diferentes ou seus derivados. Nesta forma de realização, o polímero modificado contendo dois diferentes grupos funcionais que podem reagir com duas drogas diferentes ou seus derivados pode ser adicionalmente modificado de modo que ele contenha um grupo funcional que pode reagir com um grupo funcional da PBRM ou seu derivado; antes da a reação do polímero modificado com um dos duas drogas diferentes (etapa (3) e etapa (5) ou PBRM (etapa (6).
[00339] Os conjugados biodegradáveis biocompatíveis da invenção podem ser preparados para atender às exigências de biodegradabilidade e hidrofilicidade. Por exemplo, sob condições fisiológicas, um equilíbrio entre biodegradabilidade e estabilidade pode ser alcançado. Por exemplo, sabe-se que as moléculas com pesos moleculares além de um certo limiar (geralmente, acima 40-100 kDa, dependendo do formato físico da molécula) não são excretadas através dos rins, como o são as moléculas pequenas e podem ser depuradas do corpo somente através de absorção pelas células degradação em compartimentos intracelulares, o mais notavelmente os lisossomas. Esta observação exemplificada como os materiais funcionalmente estáveis e adicionalmente biodegradáveis podem ser projetados por modulação de sua estabilidade sob condições fisiológicas gerais (pH = 7,5 ± 0,5) e em pH lisossômico (pH próximo de 5). Por exemplo, a hidrólise de grupos acetal e cetal é conhecida como sendo catalisada por ácidos, assim os poliais serão em geral menos estáveis em ambiente lisossômico do que, por exemplo, em plasma sanguíneo. Pode-se projetar um teste para comparar o perfil de degradação do polímero em, por exemplo, pH = 5 e pH = 7,5 a 37 °C em meio aquoso e, assim, determinar o equilíbrio esperado da estabilidade do polímero em um ambiente fisiológico normal e no compartimento lisossômico “digestivo” após a absorção pelas células. A integridade do polímero em tais testes pode ser medida, por exemplo, por HPLC de exclusão de tamanho. Um versado na técnica pode selecionar outros métodos apropriados para estudar os vários fragmentos dos conjugados degradados desta invenção.
[00340] Em muitos casos, será preferível que a pH = 7,5 o tamanho efetivo do polímero não irá mudar de modo detectável 1 a 7 dias e permanecerá nos 50 % do original durante pelo menos várias semanas. A pH = 5, por outro lado, o polímero deve preferivelmente degradar de modo detectável sobre 1 a 5 dias e ser completamente transformado em fragmentos de baixo peso molecular dentro de um quatro de tempo de duas semanas a vários meses. Apesar de uma degradação mais rápida poder, em alguns casos, ser preferível, em geral, pode ser mais desejável que o polímero degrade em células com uma taxa que não excede a taxa de metabolização ou excreção dos fragmentos do polímero pelas células. Assim, em determinadas formas de realização, os conjugados de presente invenção são esperados como sendo biodegradáveis, in particular mediante absorção pelas células e relativamente “inertes” em relação a sistemas biológicos. Os produtos da degradação do carreador são preferivelmente não carregados e não mudam de modo significante o pH do ambiente. É proposto que a abundância de grupos de álcool pode fornecer uma taxa baixa de reconhecimento do polímero por receptores celulares, particularmente de fagócitos. As estruturas dorsais do polímero da presente invenção geralmente contém alguns, se quaisquer, determinantes antigênicos (característicos, por exemplo, para alguns polissacarídeos e polipeptídeos) e geralmente não compreendem estruturas rígidas capazes de se encaixar em interações do tipo “chave-e-fechadura” in vivo salvo se as últimas forem desejáveis. Assim, os conjugados solúveis, reticulados e sólidos da invenção são previstos como tendo baixas toxicidade e bioadesividade, o que os tornam apropriados para várias aplicações biomédicas.
[00341] Em determinadas formas de realização da presente invenção, os conjugados biodegradáveis biocompatíveis podem formar estruturas lineares ou ramificadas. Por exemplo, os conjugados de polial biodegradáveis biocompatíveis da presente invenção podem ser quirais (opticamente ativos). Opcionalmente os conjugados de polial biodegradáveis biocompatíveis da presente invenção podem ser escalêmicos.
[00342] Em determinadas formas de realização, os conjugados de invenção são solúveis em água. Em determinadas formas de realização, os conjugados de invenção são insolúveis em água. Em determinadas formas de realização, o conjugado da invenção está em forma sólida. Em determinadas formas de realização, os conjugados de invenção são colóides. Em determinadas formas de realização, os conjugados de invenção estão em forma de partícula. Em determinadas formas de realização, os conjugados de invenção estão em forma de gel.
[00343] Esta invenção também apresenta uma armação polimérica utilizável para conjugar com uma PBRM para formar um conjugado polímero-droga-PBRM aqui descrito. A armação compreende um carreador polimérico.
[00344] Esta invenção também retrata uma armação polimérica útil para conjugar com uma PBRM para formar um conjugado de polímero-droga- PBRM aqui descrito. A armação compreende um carreador polimérico da fórmula (Ia) útil para conjugar com uma molécula de reconhecimento com base em proteína (PBRM), por exemplo, PBRM com um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior:
Figure img0094
a armação compreende poli(1-hidroximetil-etileno- hidroximetil-formal) (PHF) tendo um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa; X é CH2, O ou NH; m é um número inteiro de 1 a cerca de 300, m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 140, m2 é um número inteiro de 1 a cerca de 40, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 18, e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de cerca de 15 a cerca de 300.
[00345] Por exemplo, cada ocorrência da porção de maleimido na unidade “m3” da fórmula (Ia) é para formar adicionalmente uma ligação covalente com um grupo funcional da PBRM.
[00346] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 40 kDa ou maior (por exemplo, 60 kDa ou maior, 80 kDa ou maior, 100 kDa ou maior, 120 kDa ou maior, 140 kDa ou maior, 160 kDa ou maior ou 180 kDa ou maior, ou de cerca de 40 a 200 kDa, 40 a 180 kDa, 40 a 140 kDa, 60 a 200 kDa, 60 a 180 kDa, 60 a 140 kDa, 80 a 200 kDa, 80 a 180 kDa, 80 a 140 kDa, 100 a 200 kDa, 100 a 180 kDa, ou 100 a 140 kDa), o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa).
[00347] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 40 kDa a 200 kDa, o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa).
[00348] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 40 kDa a 80 kDa, o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa). Por exemplo o PHF tem um peso molecular de cerca de 5 kDa, 8 kDa, 10 kDa, 13KDa ou 15 kDa.
[00349] PBRMs nesta faixa de peso molecular incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, fragmentos de anticorpo, tais como, por exemplo, Fabs.
[00350] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 60 kDa a 120 kDa, o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 5 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 5 a 30 kDa, cerca de 5 a 20 kDa ou de cerca de 5 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa). Por exemplo o PHF tem um peso molecular de cerca de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa ou 40 kDa.
[00351] PBRMs nesta faixa de peso molecular incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, camelídeos, Fab2, scFcFv e os seus semelhantes.
[00352] Por exemplo, para conjugar uma PBRM tendo um peso molecular de 140 kDa a 180 kDa, o carreador polimérico da armação da invenção é um poliacetal, por exemplo, um PHF tendo um peso molecular (isto é, MW do PHF não modificado) variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (por exemplo, de cerca de 2 a 20 kDa ou de cerca de 3 a 15 kDa ou de cerca de 5 a 10 kDa). Por exemplo o PHF tem um peso molecular de cerca de 5 kDa, 8 kDa, 10 kDa, 13 kDa ou 15 kDa.
[00353] PBRMs nesta faixa de peso molecular incluem, mas não são limitadas a, por exemplo, anticorpos de tamanho natural, tais como, IgG, IgM.
[00354] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ia) tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa (isto é, a soma de m, m1, m2 e m3 variando de cerca de 1 a cerca de 300), m2 é um número inteiro de 1 a cerca de 40, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 18, e/ou m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 140 (por exemplo, m1 sendo de cerca de 1 a 90).
[00355] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ia) tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 20 kDa (isto é, a soma de m, m1, m2 e m3 variando de cerca de 1 a cerca de 150), m2 é um número inteiro de 1 a cerca de 20, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 10, e/ou m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 70 (por exemplo, m1 sendo de cerca de 4 a 45).
[00356] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ia) tem um peso molecular variando de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa (isto é, a soma de m, m1, m2 e m3 variando de cerca de 1 a cerca de 110), m2 é um número inteiro de 2 a cerca de 15, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 8, e/ou m1 é um número inteiro de 2 a cerca de 50 (por exemplo, m1 sendo de cerca de 4 a 30).
[00357] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ia) tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa (isto é, a soma de m, m1, m2 e m3 variando de cerca de 1 a cerca de 75), m2 é um número inteiro de 3 a cerca de 10, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 5, e/ou m1 é um número inteiro de 5 a cerca de 35 (por exemplo, m1 sendo de cerca de 10 a 25).
[00358] Por exemplo, um ou mais carreadores poliméricos que carregam droga são conectados a uma PBRM. Por exemplo, a armação (por exemplo, um conjugado de PBRM-polímero-droga) compreende uma PBRM com um peso molecular de cerca de 40 kDa ou maior e um ou mais carreadores poliméricos que carregam D conectados à PBRM.
[00359] Por exemplo, a armação compreende adicionalmente uma PBRM conectada ao carreador polimérico por intermédio do grupo maleimido.
[00360] A invenção também fornece armações poliméricas da fórmula (Ic) de peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa;
Figure img0095
X é CH2, O ou NH; m é um número inteiro de 1 a cerca de 300, m6 é um número inteiro de 2 a cerca de 180, m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 18, e a soma de m, m6 e m3 varia de cerca de 15 a cerca de 300.
[00361] Por exemplo, cada ocorrência da porção de maleimido na unidade “m3” da fórmula (Ic) é para formar adicionalmente uma ligação covalente com um grupo funcional da PBRM.
[00362] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ic) tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 20 kDa (isto é, a soma de m, m6 e m3 variando de cerca de 15 a cerca de 150), m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 9, e/ou m6 é um número inteiro de 2 a cerca de 90 (por exemplo, m6 sendo de cerca de 6 a 60).
[00363] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ic) tem um peso molecular variando de cerca de 3 kDa a cerca de 15 kDa (isto é, a soma de m, m6 e m3 variando de cerca de 20 a cerca de 110), m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 8, e/ou m6 é um número inteiro de 4 a cerca de 65 (por exemplo, m6 sendo de cerca de 6 a 45).
[00364] Por exemplo, quando o PHF na Fórmula (Ic) tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa, a soma de m, m6 e m3 varia de cerca de 40 a cerca de 75, m6 é um número inteiro de cerca de 8 a cerca de 45 e m3 é um número inteiro de 1 a cerca de 5.
[00365] Em algumas modalidades, a armação polimérica (por exemplo, um polímero de poliacetal tal como PHF) é conjugado com PBRMs utilizando-se a estratégia de bioconjugação com base em cisteína. Ver, por exemplo, a WO2010100430 e US 7.595.292, os conteúdos das quais são por meio deste incorporados por referência em suas totalidades. Em uma modalidade, a armação polimérica (por exemplo, um polímero de poliacetal tal como PHF) conjuga com uma PBRM (por exemplo, um anticorpo) por intermédio de cisteínas na região de dobradiça do anticorpo. Sem desejar estar ligado pela teoria, o conjugado resultante é estabilizado através da formação das estruturas de ligação intercadeia.
[00366] Consequentemente, a invenção também adicionalmente a uma armação polimérica (por exemplo, um polímero de polial) compreendendo pelo menos duas porções conectadas aa armação polimérica, em que cada porção é capaz de conjugação a um grupo tiol de um aminoácido (por exemplo, cisteína) em uma PBRM assim como para formar um conjugado de proteína-polímero. Em uma modalidade, as pelo menos duas porções conectadas aa armação polimérica são grupos maleimido.
[00367] Em modalidades, um ou mais grupos tiol livres de uma PBRM são produzidos pela redução de uma proteína. O um ou mais grupos tiol livres da PBRM depois reagem com as pelo menos duas porções contidas na armação polimérica que são capazes de conjugação a um grupo tiol de um aminoácido de modo a conjugar a PBRM com a armação polimérica. Em uma modalidade, as pelo menos duas porções conectadas aa armação polimérica são grupos maleimido.
[00368] Em modalidades, os grupos tiol livres da PBRM que são usados para a conjugação são derivados de uma ponte de dissulfeto de uma proteína nativa ou uma ponte de dissulfeto de um complexo de proteína consistindo em duas ou mais cadeias de proteína conectadas pela ponte de dissulfeto. Uma ponte de dissulfeto pode ser ponte intracadeia ou intercadeia. Alternativamente, os grupos tiol livres da PBRM são de cisteínas ou dos grupos tiol não emparelhados da proteína nativa que não estão envolvidos na formação de ponte de dissulfeto inter ou intra.
[00369] A ligação de dissulfeto pode ser reduzida, por exemplo, com ditiotreitol, mercaptoetanol, tris-carboxietilfosfina, ácido desidroascórbico, sulfato de cobre, usando métodos convencionais. Uma proteína pode conter uma ou mais pontes de dissulfeto. A redução para dar grupos tiol livres pode ser controlada para reduzir uma ou mais pontes de dissulfeto específicas em uma proteína. Dependendo do grau de redução de dissulfeto e da estequiometria das porções na armação polimérica, é possível conjugar um ou mais armações poliméricas à proteína. Agentes de redução imobilizados podem ser usados se é desejado reduzir menos do que o número total de dissulfetos, assim como pode a redução parcial usando condições de reação diferentes ou a adição de desnaturantes.
[00370] As vantagens de conjugar polímero a uma proteína por intermédio de um tiol incluem, mas não são limitados à eficácia otimizada, dose melhorada para consistência e homogeneidade de dose (visto que o número de moléculas de polímero conjugada por proteína é substancialmente a mesma para cada molécula de proteína), a conjugação específica direcionada a um resíduo ou resíduos específicos em cada proteína e purificação mais fácil. Também, os conjugados de proteína-polímero por intermédio da conjugação de tiol exibem meia vida, tempo de residência médio, e/ou taxa de depuração na circulação substancialmente melhorados quando comparados com a proteína não conjugada.
[00371] Em algumas modalidades, os conjugados de droga-polímero- PBRM, conjugados de droga-polímero, armações poliméricas que carregam droga, ou armações poliméricas que carregam PBRM aqui descritos cada um tipicamente tem um índice de polidispersividade (PDI) de < 1,5, por exemplo, <1,2.
[00372] Os conjugados de PBRM-polímero-droga, armações poliméricas que carregam droga, ou armações poliméricas que carregam PBRM podem ser purificados (isto é, remoção da droga residual não reagida, PBRM, ou materiais de partida poliméricos) pela diafiltração extensiva. Se necessário, a purificação adicional pela cromatografia de exclusão de tamanho pode ser conduzida para remover qualquer um dos conjugados de PBRM- polímero-droga agregados. No geral, os conjugados de PBRM-polímero- droga como tipicamente purificados contêm menos do que 5 % (por exemplo, <2 % p/p) de conjugados de PBRM-polímero-droga agregados como determinado por SEC; menos do que 0,5 % (por exemplo, <0,1 % p/p) de droga livre (não conjugada) como determinado pela RP-HPLC; menos do que 1 % de conjugado polímero-droga como determinado pela SEC e menos do que 2 % (por exemplo, <1 % p/p) de PBRM não conjugada como determinado pela HIC-HPLC.
[00373] As Tabelas C e D abaixo fornecem exemplos dos armações poliméricas que carrega droga e os conjugados de polímero-droga-proteína da invenção respectivamente. Na Tabela D, m5 nas estruturas químicas é definido como na Fórmula (Ib) aqui descrita.
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[00374] Em um exemplo adicional, uma droga terapêutica anti-5T4 e conjugado alvejador são fornecidos. O conjugado compreende (a) um ligante (LG) que é uma imunoglobulina ou fragmento funcional da mesma que alveja a proteína oncofetal humana 5T4, o ligante tendo um peso molecular de mais do que cerca de 40 kD e tendo ligado a ele m5 de armações poliméricas de (b), em que m5 é de um a cerca de dez. e (b) a armação polimérica compreendendo poli(1-hidroximetil-etileno-hidroximetil-formal) (PHF) que tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa, em que a armação polimérica compreende unidades monoméricas aleatoriamente arranjadas m, m1, m2, m3a e m3b, definidas como segue: (i) m3a:
Figure img0109
em que m3a está ausente ou 1 a cerca de 17 unidades monoméricas m3a estão presentes na armação polimérica e em cada unidade, Xa e Xb são independentemente selecionados de (A) um é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido, ou (B) Xa e Xb, juntos com os átomos de carbono aos carbono; (ii) m3b, em que a ligação de sulfeto forma o ponto de ligação
Figure img0110
em que 1 a cerca de 8 unidades monoméricas de m3b estão presentes na armação polimérica, em que a soma de m3a e m3b é de 1 a 18 e em que o átomo de enxofre é parte de LG; (iii)
Figure img0111
em que 1 a cerca de 300 unidades monoméricas m estão presentes na armação polimérica;
Figure img0112
em que 1 a cerca de 140 unidades monoméricas m1 estão presentes na armação polimérica; e
Figure img0113
em que 1 a cerca de 40 unidades monoméricas m2 estão presentes na armação polimérica; em que em cada uma das unidades monoméricas m, m1, m2, m3a e m3b, X é CH2, O ou NH e a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de cerca de 15 a cerca de 300 e em que cada ocorrência de D independentemente é um agente terapêutico tendo um peso molecular de < 5 kDa e o ’ entre D e o grupo carbonila indica ligação direta ou indireta de D ao grupo carbonila. Adequadamente, o ligante anti-5T4 é uma imunoglobulina ou um fragmento funcional do mesmo como aqui definido. Por exemplo, a imunoglobulina ou fragmento funcional do mesmo é selecionado do grupo consistindo em um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, uma imunoadesina, um F(Ab)2, um minicorpo, Fab’, um anticorpo de domínio único, um nanocorpo, um Fv de cadeia única, um tandem/bis-scFv, um F(ab)3, um scFv-Fc (ou scFvFc), um dsFv, um diacorpo, um triacorpo e um tetracorpo.
[00375] Em um exemplo adicional, o conjugado de droga terapêutica e alvejador é caracterizado pela estrutura ilustrada na Fórmula (E):
Figure img0114
em que: o PHF tem um peso molecular variando de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa; m é 1 a 75, m1 é de cerca de 5 a cerca de 35, m2 é de cerca de 3 a cerca de 10, m3a é 0 a cerca de 4, m3b é 1 a cerca de 5, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b é de cerca de 40 a cerca de 75 e m5 é 2 a cerca de 4.
[00376] Em uma outra modalidade, um conjugado terapêutico de droga anti-5T4 alvejador útil nas terapias antineoplásticas é fornecido, que compreende uma armação polimérica compreendendo um PHF tendo um peso molecular de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa, em que o conjugado é da seguinte estrutura:
Figure img0115
em que m5 é de 1 a 10; m é um número inteiro de 1 a cerca de 300; m1 é um número inteiro de 1 a cerca de 140; m2 é um número inteiro de 1 a cerca de 40; m3a é um número inteiro de 0 a cerca de 17; m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 8; em que a soma de m3a e m3b é um número inteiro de 1 a cerca de 18; e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de cerca de 15 a cerca de 300; X é NH; um de Xa ou Xb é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido; e onde cada ocorrência de D independentemente é um agente terapêutico tendo um peso molecular de < 5 kDa e o entre D e o grupo carbonila indica ligação direta ou indireta de D ao grupo carbonila; em que o ANTI-5T4 é um ligante anti-5T4 que compreende uma imunoglobulina ou um fragmento funcional da mesma que é seletivo para antígeno 5T4 oncofetal humano. Por exemplo, o peso molecular do anti-5T4 é de pelo menos de cerca de 40 kDa. Em uma modalidade, D é uma auristatina ou análogo da mesma ligados a uma porção de carbonila de m2 por intermédio de uma porção de hidroxipropilamida-L-alanina. Em uma modalidade, a razão da droga para anti-5T4 é de cerca de 5:1 a cerca de 30:1, ou de cerca de 12:1 a cerca de 18:1. Em uma outra modalidade, a razão média do conjugado PHF droga para anticorpo anti-5T4 é de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00377] Estes conjugados podem ser definidos adicionalmente pelas porcentagens molares ou frações molares das várias unidades que formam o conjugado. Por exemplo, a unidade monomérica compreendendo a porção de dietileno glicol maleimido (EG2-MI) ligada ao ligante tem uma fração molar de cerca de 2 % por mol a cerca de 5 % por mol. Adicionalmente em um outro exemplo, a unidade monomérica que carrega a droga tem uma fração molar de cerca de 5 % por mol a cerca de 10 % por mol. Por exemplo, a razão da droga para anti-5T4 é de cerca de 5:1 a cerca de 30:1, ou de cerca de 12:1 a cerca de 18:1. Em um outro exemplo, a razão média da armação de PHF compreendendo a droga para anticorpo anti-5T4 é de cerca de 2:1 a cerca de 3:1 ou de cerca de 3:1 a cerca de 4:1. Em uma modalidade, o conjugado é anti-5T4-((EG2-MI (3 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %)). Este conjugado pode ser preparado como descrito no Exemplo 10 e mais geralmente, no Esquema 5.
[00378] Adicionalmente em uma outra modalidade, droga terapêutico e conjugado alvejador úteis nas terapias antineoplásticas são fornecidos, que compreendem anti-5T4 e uma armação polimérica de PHF compreendendo as unidades mostradas abaixo que podem ser aleatoriamente conectadas entre si,
Figure img0116
em que: anti-5T4 é uma construção de anticorpo de cadeia única compreendendo a sequência de amino da SEQ ID NO: A; o PHF tem um peso molecular variando de cerca de 2 kDa a cerca de 40 kDa; a razão média de suporte polimérico para anticorpo anti-5T4 é de cerca de 2:1 a cerca de 3:1 ou de cerca de 3:1 a cerca de 4:1; e a razão de AF-HPA para anticorpo anti-5T4 é de cerca de 12:1 a cerca de 18:1.
[00379] Estes conjugados podem ser preparados como aqui descritos e combinados com carreadores adequados nas composições adequadas para a liberação a um indivíduo. Estas composições podem conter misturas destes conjugados droga anti-5T4 alvejador, isto é, uma composição única pode conter droga anti-5T4 alvejador conjugados com drogas diferentes e/ou armações poliméricas diferentes.
Métodos sintéticos
[00380] De acordo com a presente invenção, quaisquer técnicas disponíveis podem ser usadas para fazer os conjugados inventivos ou composições incluindo os mesmos e intermediários e componentes (por exemplo, carreadores e modificadores) utilizáveis para fabricar os mesmos. Por exemplo, métodos semi-sintéticos e completamente sintéticos podem ser usados.
Carreadores
[00381] Métodos para preparar carreadores poliméricos (por exemplo, carreadores poliméricos biocompatíveis, biodegradáveis) adequados para a conjugação aos modificadores são conhecidos na técnica. Por exemplo, orientação sintética pode ser encontrada nas Patentes U.S. Nos. 5.811.510, 5.863.990, 5.958.398, 7.838.619, 7.790.150, 8.685.383, e 8.815.226, os conteúdos de cada uma das quais são por meio deste incorporados por referência em suas totalidades. O técnico habilitado saberá como adaptar estes métodos para fabricar carreadores poliméricos para o uso na prática da invenção.
[00382] Em uma forma de realização, um método para formar os conjugados de polial biodegradáveis, biocompatíveis da presente invenção compreende um processo pelo qual um polissacarídeo apropriado é combinado com uma quantidade eficaz de um agente oxidante específico de glicol para formar um intermediário aldeído. O intermediário aldeído, que é um próprio polial, pode então ser reduzido no correspondente poliol, succinilado e acoplado com um ou mais modificadores apropriados para formar um conjugado de polial biodegradável biocompatível compreendendo ligações contendo succinamida.
[00383] Em outra forma de realização preferida, poliais biodegradáveis biocompatíveis completamente sintéticos para uso na presente invenção podem ser preparados reagindo um iniciador apropriado com um composto precursor apropriado.
[00384] Por exemplo, poliais completamente sintéticos podem ser preparados por condensação de vinil éteres com dióis substituídos protegidos. Outros métodos, como a polimerização de abertura de ciclo, podem ser usados, em que a eficácia do método pode depender do grau de substituição e volume ocupado dos grupos protetores.
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[00385] Um versado na técnica irá notar que os sistemas de solvente, catalisadores e outros fatores podem ser otimizados para obter produtos de peso molecular elevado.
[00386] Em determinadas formas de realização, o carreador é PHF.
[00387] Em modalidades, o carreador polimérico é PHF tendo um índice de polidispersividade (PDI) de menos do que 1,5, por exemplo, <1,2.
Drogas e derivados de drogas
[00388] Em determinadas formas de realização, a droga podem ser modificada antes da conjugação ao carreador polimérico. Esquemas 1 e 2 são métodos ilustrativos para modificar um alcalóide Vinca. Esquema 3 mostra a método para modificar um derivado de camptotecina não natural. Esquema 4 mostra a método para modificar auristatina F. Outros métodos de modificação métodos são descritos em US 2010/0305149, que é aqui incorporada por referência.
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[00389] A reação do éster C23 de um alcalóide Vinca com hidrazina seguida por tratamento com NaNO2 resulta em um éster de azido ativo. A reação do éster de azido com um composto amino como propanolamina ou 1- aminopropan-2-ol resulta em um derivado de alcalóide Vinca com uma hidroxila funcionalizada que pode ser adicionalmente derivada com compostos contendo amino, como, por exemplo, derivados de alanina ou metil alanina, para conjugação com polímeros (ver Esquema 1). Esquema 2
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[00390] Tratamento do derivado de hidroxila do alcalóide Vinca com um éter contendo amino protegido como aminoácido t-butóxi esterificado seguido por hidrólise TFA do éster dá o sal triflato do alcalóide vinca. (Esquema 2) Conjugação do alcalóide vinca para polímeros funcionalizados resulta em conjugados droga-polímero que podem ser adicionalmente conjugados com a PBRM ou seu derivado para resultar em conjugados proteína-polímero-droga.
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[00391] O grupo 10-hidróxi de derivado camptotecina não natural, por exemplo, SN38, é seletivamente protegido reagindo o derivado com cloreto de terc-butildifenilsilila (TBDPSiCl) na presença de trietilamina. O grupo 20- hidróxi pode ser reagido com t-butilcarbonil-alanina para formar o derivado de alanina usando o procedimento descrito em Sapra, P. et al., Clin. Câncer Res., 14: 1888-1896 (2008). Alternativamente, outros aminoácidos podem ser empregados, por exemplo glicina. A amina primária é não mascarada por remoção do grupo de proteção Boc por tratamento com ácido tricloroacético, seguido por remoção do grupo de proteção TBDPS com fluoreto de tetrabutilamônio (ver Esquema 3). O composto SN38 derivado de amino resultante pode ser conjugado com um polímero funcionalizado para formar um conjugado droga-polímero.
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[00392] Tratamento de auristatina F com um éter contendo amino protegido como t-butóxi 2-hidroxipropila amina esterificado seguido por hidrólise HCl do éster dá o derivado 2-hidroxilpropila amino de auristatina F (ver Esquema 4). Conjugação do derivado de auristatina F para polímeros funcionalizados resulta em conjugados droga-polímero que podem ser adicionalmente conjugados com a PBRM ou seu derivado para resultar em conjugados proteína-polímero-droga.
Conjugados ou armações poliméricas
[00393] O Esquema 5 abaixo mostra um Esquema sintético para fabricar as armações de droga poliméricas da invenção. Em uma modalidade, os conjugados são formados em várias etapas: (1) o polímero, PHF é modificado para conter uma porção de COOH (por exemplo, -C(O)-X- (CH2)2-COOH); (2) o polímero é depois modificado adicionalmente de modo que o mesmo contenha uma porção de maleimido (por exemplo, EG2-MI) que pode reagir com um grupo funcional de uma PBRM; (3) o polímero modificado, contendo dois grupos funcionais diferentes, é reagido com um grupo funcional de uma droga ou seu derivado (por exemplo, AF-HPA-Ala) para formar um conjugado polímero-droga; (4) as ligações de dissulfeto de uma PBRM são reduzidas; (5) a PBRM reduzida é depois reagida com o conjugado polímero-droga para formar o conjugado de proteína-polímero- droga; e (6) as porções de maleimido remanescentes são opcionalmente reagidas com um composto bloqueador de maleimido (por exemplo, cisteína).
[00394] Em uma outra modalidade a ordem das etapas (2) e (3) pode ser reversa como representada na via do lado direito no Esquema 5 abaixo. Esquema 5
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[00395] Adicionalmente em uma outra modalidade, as etapas (2) e (3) acima são realizadas simultaneamente como representadas no Esquema 6 abaixo. Esquema 6
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Composições Farmacêuticas
[00396] Também estão incluídas composições farmacêuticas compreendendo um ou mais conjugados proteína-polímero-droga como descritos aqui em um carreador aceitável, como um estabilizador, tampão e similares. Os conjugados podem ser administrados e introduzidos em um indivíduo por um meio padrão, com ou sem estabilizadores, tampões e similares, para formar uma composição farmacêutica. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica e para membranas mucosas incluindo vaginal e distribuição retal), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; administração intratraqueal, intranasal, epidermal e transdermal, oral ou parenteral incluindo injeção intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular ou infusão ou intracraniana, por exemplo, administração intratecal ou intraventricular. Os conjugados podem ser formulados e usados como soluções e/ou suspensões estéreis para administração injetável; pós liofilizados para reconstituição antes da injeção /infusão; composições tópicas; como comprimidos, cápsulas, ou elixires para administração oral; ou supositórios para administração retal e as outras composições conhecidas na técnica.
[00397] Uma composição ou formulação farmacológica se refere a uma composição ou formulação em uma forma apropriada para administração, por exemplo, administração sistêmica, em uma célula ou indivíduo, incluindo, por exemplo, ser humano. As formas apropriadas, em parte, dependem do uso ou da via de entrada, por exemplo, oral, inalada, transdermal, ou por injeção/infusão. Tais formas não devem evitar que a composição ou formulação alcance uma célula alvo (isto é, uma célula para a qual a droga é desejável para a distribuição). Por exemplo, composições farmacológicas injetadas dentro da corrente sanguínea devem ser solúveis. Outros fatores são conhecidos na técnica e incluem considerações como toxicidade e formas que evitem que a composição ou formulação exerça seu efeito.
[00398] Por “administração sistêmica” significa-se absorção ou acumulação sistêmica in vivo do polímero modificado na corrente sanguínea seguido pela distribuição através de todo o corpo. As vias de administração que levam a absorção sistêmica incluem, sem limitação: intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, inalação, oral, intrapulmonar e intramuscular. Cada destas vias de administração expõe os polímeros modificados a um tecido doente acessível. A taxa de entrada de um agente ativo na circulação mostrou ser uma função do peso molecular ou tamanho. O uso de um conjugado desta invenção pode localizar a distribuição de droga em certas células, como células de câncer via a especificidade das PBRMs.
[00399] Uma “formulação farmaceuticamente aceitável” significa uma composição ou formulação que permite a distribuição efetiva dos conjugados no local físico mais apropriado para sua atividade desejada. Em uma forma de realização, a distribuição efetiva ocorre antes da depuração pelo sistema do reticuloendotelial ou a produção da ligação fora do alvo que pode resultar em eficácia reduzida ou toxicidade. Os exemplos não limitativos dos agentes apropriados para a formulação com os conjugados incluem: inibidores da P- glicoproteína (como Pluronic P85), que podem aumentar a entrada dos agentes ativos nos CNS; polímeros degradáveis, como microesferas de poli (DL-lactídeo-coglicolídeo) para distribuição de liberação sustentada após implantação intracerebral; e nanopartículas carregadas, tal como aquelas feitas de acrilato de polibutilciano, que podem distribuir agentes ativos através da barreira sanguínea do cérebro e podem alterar os mecanismos de remoção neuronal.
[00400] Também incluídas aqui estão composições farmacêuticas preparadas para armazenamento ou administração, que incluem uma quantidade farmaceuticamente efetiva dos conjugados desejados em um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Carreadores, diluentes, e/ou excipientes apropriados para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica. Por exemplo, tampões, conservantes, agentes formadores de volume, dispersantes, estabilizadores, corantes, podem ser providos. Além disso, agentes antioxidantes e de colocação em suspensão podem ser usados. Exemplos de carreador, diluentes e/ou excipientes apropriados incluem, mas não estão limitados a: (1) solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, pH cerca de 6,5, que pode conter cerca de 1 mg/ml a 25 mg/ml de albumina do soro humano, (2) solução salina a 0,9 % (NaCl a 0,9 % peso/volume) e (3) dextrose a 5 % (peso/volume).
[00401] O termo “quantidade farmaceuticamente efetiva”, como usado aqui, se refere a uma quantidade de um agente terapêutico para tratar, melhorar, ou evitar uma doença ou condição identificada, ou para exibir um efeito terapêutico detectável ou inibitório. O efeito pode ser detectado por qualquer método de teste conhecido na técnica. A quantidade efetiva precisa para um indivíduo dependerá do peso corporal, tamanho e saúde do indivíduo; da natureza e extensão da condição; e o terapêutico ou combinação de terapêuticos selecionados para a administração. As quantidades farmaceuticamente efetivas para uma dada situação podem ser determinadas por experimentação de rotina, que está dentro das qualificações e julgamento do clínico. Em um aspecto preferido, a doença ou condição pode ser tratada via silenciamento do gene.
[00402] Para qualquer conjugado, a quantidade farmaceuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente ou nos testes de cultura da célula, por exemplo, de células neoplásticas, ou em modelos animais, usualmente ratos, camundongos, coelhos, cães, ou porcos. O modelo animal pode ser usado também para determinar a faixa de concentração apropriada e via de administração. Tal informação pode ser então usada para determinar doses e vias utilizáveis para a administração em humanos. A eficácia terapêutica /profilática e toxicidade podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais para experiência, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50 % da população) e LD50 (a dose letal para 50 % da população). A razão da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e ele pode ser expresso como razão, LD50/ED50. Composições farmacêuticas que exibem grandes índices terapêuticos são preferidas. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada, sensibilidade do paciente e via de administração.
[00403] Por exemplo, uma droga ou seus derivados, conjugados droga- polímero ou conjugados de PBRM-polímero-droga podem ser avaliados quanto a sua capacidade para inibir o crescimento de tumor em várias linhagens celulares usando Cell titer Glo. As curvas de dose resposta podem ser geradas usando Software SoftMax Pro e IC50 os valores pode ser determinados a partir de ajuste de curva de quatro parâmetros. As linhagens de célula utilizadas podem incluir aquelas que são alvos da PBRM e uma linhagem de célula de controle que não é o alvo da PBRM contida nos conjugados de teste.
[00404] Em uma forma de realização, os conjugados são formulados para administração parenteral por injeção incluindo o uso de técnicas de cateterização ou infusão convencionais. As formulações para injeção podem ser apresentadas em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com um conservante adicionado. Os conjugados podem ser administrados parenteralmente em um meio estéril. O conjugado, dependendo do carreador e concentração usada, pode ser ou colocado em suspensão ou dissolvido em um carreador. Vantajosamente, adjuvantes como anestésicos locais, conservante e agentes de volume podem ser dissolvidos no carreador. O termo “parenteral” como usado aqui inclui injeção percutânea, subcutânea, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, ou intratecal ou técnicas de infusão e similares. Além disso, é provida uma formulação farmacêutica compreendendo conjugados e um carreador farmaceuticamente aceitável. Um ou mais dos conjugados podem estar presentes em associação com um ou mais carreadores não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis e/ou diluentes e/ou adjuvantes e se desejado outros ingredientes ativos.
[00405] A preparação injetável estéril pode ser também uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico, parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3- butanodiol. Entre os carreadores e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônico. Além disso, óleos estéreis, unidos são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, um óleo suave aglutinante pode ser empregado incluindo mono ou di-glicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos como ácido oleico encontram uso na preparação dos injetáveis.
[00406] Os conjugados e composições descritas aqui podem ser administrados na forma apropriada, preferivelmente parenteralmente, mais preferivelmente intravenosamente. Para administração parenteral, os conjugados ou composições podem ser soluções, suspensões ou emulsões estéreis aquosas ou não aquosas. Propileno glicol, óleos vegetais e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila, podem ser usados como o solvente ou carreador. As composições podem conter também adjuvantes, emulsificantes ou dispersantes.
[00407] Níveis de dosagem da ordem de entre cerca de 0,001 mg e cerca de 140 mg por quilograma de peso corporal por dia são utilizáveis no tratamento das condições indicadas acima (entre cerca de 0,05 mg e cerca de 7 g por indivíduo por dia). Em algumas formas de realização, a dosagem administrada para um paciente está entre cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Em algumas formas de realização, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 15 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Em algumas formas de realização, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 15 mg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas formas de realização, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 20 mg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas formas de realização, a dosagem administrada está entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg ou de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas formas de realização, a dosagem administrada está entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 15 mg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas formas de realização, a dosagem administrada está entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporal do paciente. A quantidade de conjugado que pode ser combinada com os materiais do carreador para uma forma de dosagem única varia dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. Formas unitárias únicas podem geralmente conter de entre cerca de 0,001 mg e cerca de 100 mg; entre cerca de 0,01 mg e cerca de 75 mg; ou entre cerca de 0,01 mg e cerca de 50 mg; ou entre cerca de 0,01 mg e cerca de 25 mg; de um conjugado.
[00408] Para administração intravenosa, os níveis de dosagem podem compreender as faixas descritas nos parágrafos anteriores ou de cerca de 0,01 a cerca de 200 mg de um conjugado por kg do peso corporal do animal. Em um aspecto, a composição pode incluir de cerca de 1 a cerca de 100 mg de um conjugado por kg do peso corporal do animal. Em outro aspecto, a quantidade administrada estará na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 25 mg/kg do peso corporal de um composto.
[00409] Em algumas formas de realização, os conjugados podem ser administrados como se segue. Os conjugados podem ser dados diariamente durante cerca de 5 dias ou como um bolo i.v., cada dia durante cerca de 5 dias, ou como uma infusão contínua durante cerca de 5 dias.
[00410] Alternativamente, os conjugados podem ser administrados uma vez por semana durante seis semanas ou mais. Como outra alternativa, os conjugados podem ser administrados uma vez a cada duas ou três semanas. As doses do bolo são dadas em cerca de 50 a cerca de 400 ml de salina normal para o qual cerca de 5 a cerca de 10 ml de albumina de soro humano pode ser adicionada. As infusões contínuas são dadas em cerca de 250 a cerca de 500 ml de salina normal, para o qual cerca de 25 a cerca de 50 ml de albumina de soro humano podem ser adicionados, por um período de 24 horas.
[00411] Em algumas formas de realização cerca de uma a cerca de quatro semanas após o tratamento, o paciente pode receber um segundo curso do tratamento. Os protocolos clínicos específicos com relação à via de administração, excipientes, diluentes, dosagens e tempos podem ser determinados pelos versados na técnica como as autorizações da situação clínica.
[00412] Em outras modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser fornecida em um outro programa regular, isto é, base diária, semanal, mensal ou anual ou em um programa irregular com administração variando de dias, semanas, meses, etc. Alternativamente, a quantidade terapeuticamente eficaz a ser administrada pode variar. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz para a primeira dose é mais alta do que a quantidade terapeuticamente eficaz para uma ou mais das doses subsequentes. Em uma outra modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz para a primeira dose é mais baixa do que a quantidade terapeuticamente eficaz para uma ou mais das doses subsequentes. As dosagens equivalentes podem ser administradas em vários períodos de tempo incluindo, mas não limitado a, cerca de cada 2 horas, cerca de cada 6 horas, cerca de cada 8 horas, cerca de cada 12 horas, cerca de cada 24 horas, cerca de cada 36 horas, cerca de cada 48 horas, cerca de cada 72 horas, cerca de cada semana, cerca de cada duas semanas, cerca de cada três semanas, cerca de cada mês e cerca de cada dois meses. O número e frequência de dosagens correspondendo a um curso completo de terapia será determinado de acordo com as recomendações dos corpos reguladores relevantes e julgamento de um profissional de cuidado de saúde. As quantidades terapeuticamente eficazes aqui descritas se referem às quantidades totais administradas para um dado período de tempo; isto é, se mais do que um conjugado diferente aqui descrito é administrado, as quantidades terapeuticamente eficazes correspondem à quantidade total administrada. É entendido que o nível específico da dose para um indivíduo particular depende de uma variedade de fatores incluindo a atividade do conjugado específico, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração e taxa de excreção, combinação com outros agentes ativos e a severidade da doença particular passando por terapia.
[00413] Para a administração em animais não humanos, os conjugados podem ser adicionados também na alimentação ou água de beber do animal. Pode ser conveniente formular a alimentação e água de beber do animal de modo que o animal ingira a quantidade terapeuticamente apropriada dos conjugados junto com a sua dieta. Pode ser conveniente também apresentar os conjugados como uma pré-mistura para adição na alimentação ou água de beber.
[00414] Os conjugados podem ser administrados também em um indivíduo em combinação com outros compostos terapêuticos para aumentar o efeito terapêutico total. O uso de múltiplos compostos para tratar uma indicação pode aumentar os efeitos benéficos enquanto reduzindo a presença de efeitos colaterais. Em algumas formas de realização os conjugados são usados em combinação com agentes quimioterapêuticos, como aqueles descritos na Patente U.S. No. 7.303.749. Em outras formas de realização os agentes quimioterapêuticos, incluem, mas não estão limitados a letrozol, oxaliplatina, docetaxel, 5-FU, lapatiniba, capecitabina, leucovorina, erlotinib, pertuzumab, bevacizumab e gencitabina.
[00415] A presente invenção adicionalmente a também kits farmacêuticos compreendendo um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos conjugados e/ou composições da presente invenção, incluindo, um ou mais agentes quimioterapêuticos. Tais kits podem incluir também, por exemplo, outros compostos e/ou composições, um(s) dispositivo(s) para administrar os compostos e/ou composições e instruções escritas em uma forma prescrita por uma agência governamental regulando a fabricação, uso ou venda dos produtos farmacêuticos ou biológicos. As composições aqui descritas podem ser embaladas como uma dose única ou para administração contínua ou não contínua periódica. Para administração contínua, uma embalagem ou kit pode incluir os conjugados em cada unidade de dosagem (por exemplo, solução ou outra unidade descrita acima ou utilizada na liberação de droga) e opcionalmente instruções para administrar as doses diária, semanal ou mensalmente, para um duração predeterminada de tempo ou como prescrito. Se concentrações variáveis de uma composição, dos componentes da composição, ou as razões relativas dos conjugados ou agentes dentro de uma composição com o tempo é desejada, uma embalagem ou kit podem conter uma sequência de unidades de dosagem que fornecem a variabilidade desejada.
[00416] Várias embalagens ou kits são conhecidos na técnica para dispersar agentes farmacêuticos para o uso oral periódico. Em uma modalidade, a embalagem tem indicadores para cada período. Em uma outra modalidade, a embalagem é uma embalagem tipo blister rotulada, embalagem dispensadora do tipo dial, ou garrafa. Os meios de embalagem de um kit podem ser por si mesmos gerados para a administração, tais como uma seringa, pipeta, gotejador ocular, ou outros tais aparelhos, a partir dos quais a formulação pode ser aplicada a uma área afetada do corpo, injetada em um indivíduo, ou adicionalmente aplicada ao mesmo e misturada com os outros componentes do kit.
Métodos de Uso Métodos de Tratamento
[00417] Em algumas formas de realização preferidas da invenção, os conjugados proteína-polímero-droga da invenção são usados em métodos de tratamento de animais (preferivelmente mamíferos, mais preferivelmente humanos e incluem machos, fêmeas, bebês, crianças e adultos). Em uma forma de realização, os conjugados de presente invenção podem ser usados em um método de tratamento de animais que compreende administrar ao animal um conjugado biocompatível biodegradável da invenção. Por exemplo, os conjugados de acordo com a invenção podem ser administrados na forma de polímeros lineares solúveis, copolímeros, conjugados, colóides, partículas, géis, itens sólidos, fibras, filmes, etc. Os conjugados biocompatíveis biodegradáveis desta invenção podem ser usados como carreadores de drogas e componentes do carreador de drogas, em sistemas de liberação controlada de droga, preparações para procedimentos cirúrgicos de baixa invasão, etc. As formulações farmacêuticas podem ser injetáveis, implantáveis, etc.
[00418] Adicionalmente em outro aspecto, a invenção adicionalmente a um método para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficiente de pelo menos um conjugado da invenção; em que referido conjugado libera um ou mais agentes terapêuticos quando da biodegradação.
[00419] Em outra forma de realização os conjugados podem ser administrados in vitro, in vivo e/ou ex vivo para tratar pacientes e/ou para modular o crescimento das populações das células selecionadas incluindo, por exemplo, câncer. Em algumas formas de realização, os tipos particulares de cânceres que podem ser tratados com os conjugados incluem, mas não estão limitados a: (1) tumores sólidos, incluindo, mas não limitado a fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer dos rins, câncer pancreático, câncer nos ossos, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer esofágico, câncer de estômago, câncer oral, câncer nasal, câncer na garganta, carcinoma de células escamosas, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorífera, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma da célula renal, carcinoma do canal biliar do hepatoma, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, câncer uterino, câncer testicular, carcinoma de pulmão da célula pequena, carcinoma de pulmão da célula não pequena, carcinoma da bexiga, câncer de pulmão, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma, astrocitoma multiforme, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, câncer de pele, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma; (2) cânceres com base nos ossos, incluindo, mas não limitado a leucemia linfoblástica aguda “ALL”, leucemia da célula B linfoblástica aguda, leucemia da célula T linfoblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda “AML”, leucemia promielocítica aguda “APL”, leucemia monoblástica aguda, leucemia eritroleucêmica aguda, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia não linfocítica aguda, leucemia indiferenciada aguda, leucemia mielocítica crônica “CML”, leucemia linfocítica crônica “CLL”, leucemia de células pilosas, mieloma múltiplo, leucemias crônicas e agudas, por exemplo, leucemia mielogênica linfoblástica e mielocítica linfocítica; e (3) linfomas como doença de Hodgkin, Linfoma não de Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença da cadeia pesada e Policitemia vera.
[00420] Em uma outra modalidade os conjugados podem ser administrados in vitro, in vivo e/ou ex vivo para tratar pacientes e/ou para modular o crescimento das populações celulares selecionadas em pacientes tendo câncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, de cabeça e pescoço, hepático, testicular, cervical, sarcoma, hemangioma, esofágico, ocular, laríngeo, bucal, mesotelioma, dérmico, mieloma, oral, retal, garganta, bexiga, mamário, uterino, ovariano, prostático, pulmonar, colônico, pancreático, renal, ou gástrico.
[00421] Em uma outra modalidade, os cânceres são selecionados do grupo consistindo do câncer mamário, câncer gástrico, câncer pulmonar de célula não pequena (NSCLC) e câncer ovariano.
[00422] Em uma outra modalidade, os conjugados podem ser administrados in vitro, in vivo e/ou ex vivo para tratar, prevenir, reduzir o risco de desenvolver e/ou retardar o início de certas patologias, por exemplo, um câncer. Por exemplo, os conjugados da invenção são úteis no tratamento, prevenção, retardo da prevenção de um sintoma ou de outro modo sua melhora de um câncer selecionado do grupo consistindo em câncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer hepático, câncer testicular, câncer cervical, sarcoma, hemangioma, câncer esofágico, câncer ocular, câncer laríngeo, câncer bucal, mesotelioma, câncer dérmico, mieloma, câncer oral, câncer retal, câncer de garganta, câncer da bexiga, câncer mamário, câncer uterino, câncer ovariano, câncer prostático, câncer pulmonar, câncer pulmonar de célula não pequena (NSCLC), câncer colônico, câncer pancreático, câncer renal e câncer gástrico.
[00423] Em outra forma de realização os conjugados podem ser administrados in vitro, in vivo e/ou ex vivo para tratar doenças autoimunes, como lúpus sistêmico, artrite reumatóide, psoríase e esclerose múltipla; rejeições a enxertos, como rejeição a transplante renal, rejeição a transplante de fígado, rejeição a transplante de pulmão, rejeição a transplante cardíaco e rejeição a transplante da medula óssea; enxerto versus doença do hospedeiro; infecções virais, como infecção por CMV, infecção por HIV e AIDS; e infecções por parasitas, como giardíase, amebíase, esquistossomose e similares.
[00424] Em determinadas formas de realização os conjugados podem ser usados também para a fabricação de um medicamento utilizável para o tratamento ou diminuição da severidade de distúrbios, como os, caracterizados pelo crescimento anormal das células (por exemplo, câncer).
[00425] Em determinadas formas de realização, o agente terapêutico é distribuído localmente para uma célula alvo, tecido ou órgão específico.
[00426] Em determinadas formas de realização, na prática do método da invenção, o conjugado compreende adicionalmente ou está associado com uma etiqueta de diagnóstico. Em determinadas formas de realização exemplares, a etiqueta de diagnóstico é selecionada dentre o grupo consistindo em: isótopos radio farmacêuticos ou radioativos para cintigrafia gama e PET, agente de contraste para formação de imagem de ressonância magnética (MRI), agente de contraste para tomografia computadorizada, agente de contraste para método de formação de imagem por raios X, agente para método de diagnóstico por ultrassom, agente para ativação de nêutron, porção que pode refletir, espalhar ou afetar raios X, ultrassom, ondas radiofônicas e micro-ondas e fluoróforos. Em determinadas formas de realização exemplar, o conjugado é monitorado adicionalmente in vivo.
[00427] Exemplos de etiquetas de diagnóstico incluem, mas não estão limitados a, isótopos para diagnóstico radio farmacêutico ou radioativo para cintigrafia gama e PET, agente de contraste para formação de imagem de ressonância magnética (MRI) (por exemplo, átomos paramagnéticos e nano cristais superparamagnéticos), agente de contraste para tomografia computadorizada, agente de contraste método de formação de imagem de raios X, agente para método de diagnóstico por ultrassom, agente para ativação de nêutron e porção que pode refletir, espalhar ou afetar raios X, ultrassom, ondas radiofônicas e micro-ondas e fluoróforos em vários procedimentos ópticos, etc. Radiodrogas para diagnóstico incluem radionuclídeos emitindo y, por exemplo, índio-111, tecnécio-99m e iodo-131, etc. Agentes de contraste para MRI (formação de imagem de ressonância magnética) incluem compostos magnéticos, por exemplo, íons paramagnéticos, ferro, manganês, gadolínio, lantanídeos, porções paramagnéticas orgânicas e superparamagnéticas, compostos ferromagnéticos e antiferromagnéticos, por exemplo, colóides de óxido de ferro, colóides de ferrita, etc. Agentes de contraste para tomografia computadorizada e métodos de formação de imagem com base em raios X incluem compostos absorvedores de raios X, por exemplo, iodo, bário, etc. Agentes de contraste para métodos com base em ultrassom incluem compostos que podem absorver, refletir e espalhar as ondas de ultrassom, por exemplo, emulsões, cristais, bolhas de gás, etc. Adicionalmente outros exemplos incluem substâncias utilizáveis para a ativação de nêutron, como boro e gadolínio. Além disso, as etiquetas que podem ser empregadas podem refletir, refratar, espalhar, ou afetar de outra forma raios X, ultrassom, ondas radiofônicas, micro-ondas e outros raios utilizáveis em procedimentos de diagnóstico. Etiquetas fluorescentes podem ser usadas para formação de imagem por fotos. Em determinadas formas de realização um modificador compreende um íon ou grupo paramagnético.
[00428] Em outro aspecto, a invenção adicionalmente a um método para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo, compreendendo preparar uma solução aquosa de pelo menos um conjugado da invenção e injetar parenteralmente referida formulação no indivíduo.
[00429] Em outro aspecto, a invenção adicionalmente a um método para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo, compreendendo preparar um implante compreendendo pelo menos um conjugado da invenção e implantar referido implante no indivíduo. Em determinadas formas de realização exemplares, o implante é uma matriz de gel biodegradável.
[00430] Em outro aspecto, a invenção adicionalmente a um método para o tratamento de um animal em necessidade do mesmo, compreendendo administrar um conjugado de acordo com os métodos descritos acima.
[00431] Em outro aspecto, a invenção adicionalmente a um método para fazer surgir uma resposta imune em um animal, compreendendo administrar um conjugado como nos métodos descritos acima.
[00432] Em outro aspecto, a invenção adicionalmente a um método de diagnosticar uma doença em um animal, compreendendo as etapas de: administrar um conjugado como nos métodos descritos acima, em que referido conjugado compreende uma molécula detectável; e detectar a molécula detectável.
[00433] Em determinadas formas de realização exemplares, a etapa de detectar a molécula detectável é realizada de modo não invasivo. Em determinadas formas de realização exemplares, a etapa de detectar a molécula detectável é realizada usando equipamento de formação de imagem apropriado.
[00434] Em uma forma de realização, um método para tratar um animal compreende administrar ao animal um conjugado biodegradável biocompatível da invenção como um pacote para um ferimento cirúrgico do qual um tumor ou crescimento tenha sido removido. O pacote do conjugado biodegradável biocompatível substituirá o local do tumor durante a recuperação e se degrada e dissipa à medida que o ferimento cicatriza.
[00435] Em determinadas formas de realização, o conjugado está associado com uma etiqueta de diagnóstico para monitoramento in vivo.
[00436] Os conjugados descritos acima podem ser usados para tratamento (diagnóstico) terapêutico, preventivo e analítico de animais. Os conjugados são planejados, geralmente, para administração parenteral, mas em alguns casos podem ser administrados por outras vias.
[00437] Em uma forma de realização, conjugados solúveis ou coloidais são administrados intravenosamente. Em outra forma de realização, conjugados solúveis ou coloidais são administrados via injeção local (por exemplo, subcutânea, intramuscular). Em outra forma de realização, conjugados sólidos (por exemplo, partículas, implantes, sistemas de distribuição de droga) são administrados via implantação ou injeção.
[00438] Em outra forma de realização, conjugados compreendendo uma etiqueta detectável são administrados para estudar os padrões e dinâmicas da distribuição da etiqueta no corpo do animal.
[00439] Em determinadas formas de realização, qualquer um ou mais dos conjugados descritos aqui podem ser usados na prática de qualquer dos métodos descritos acima. Em determinadas formas de realização exemplares, o conjugado é um conjugado Trastuzumab-PHF-, Rituximab-PHF- ou LHRH- PHF-droga.
[00440] Em toda a descrição, onde as composições são descritas como tendo, incluindo, ou compreendendo componentes específicos, é contemplado que as composições também consistem essencialmente de, ou consistem de, componentes relacionados. Similarmente, onde os métodos ou processos são descritos como tendo, incluindo, ou compreendendo etapas específicas do processo, os processos também consistem essencialmente das, ou consistem das, etapas de processamento recitadas. Além disso, deve ser entendido que a ordem das etapas ou ordem para realizar determinadas ações é imaterial contanto que a invenção permanece operável. Ademais, duas ou mais etapas ou ações podem ser conduzidas simultaneamente.
[00441] Os processos sintéticos da invenção podem tolerar uma ampla variedade de grupos funcionais; desse modo vários materiais de partida substituídos podem ser usados. Os processos adicionalmente aem geralmente o composto final desejado no ou perto do final do processo total, embora possa ser desejável em certas ocasiões adicionalmente converter o composto para um sal farmaceuticamente aceitável, éster ou pró-droga do mesmo.
[00442] Os compostos de droga usados para os conjugados de presente invenção podem ser preparados em uma variedade de formas usando materiais de partida comercialmente disponíveis, compostos conhecidos na literatura, ou a partir de intermediários rapidamente preparados, empregando métodos sintéticos padrão e ou procedimento conhecido pelos versados na técnica, ou que serão aparentes para os versados na técnica levando em consideração os ensinamentos aqui. Métodos sintéticos padrão e procedimentos para a preparação de moléculas orgânicas e transformações e manipulações de grupos funcionais a partir da literatura relevante específica ou a partir de livros didáticos padrão no campo. Embora não limitados a qualquer uma ou várias fontes, testos clássicos como Smith, M. B., March, J., March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms e Estrutura, 5a. edição, John Wiley & Sons: Nova Iorque, 2001; e Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3a. edição, John Wiley & Sons: Nova Iorque, 1999, incorporadas como referência aqui, são utilizáveis e livros didáticos reconhecidos da síntese orgânica conhecido pelos versados na técnica. As descrições seguintes dos métodos sintéticos são projetadas para ilustrar, mas não para limitar, os procedimentos gerais para a preparação dos compostos da presente invenção.
[00443] Os conjugados de presente invenção e os compostos de drogas incluídos aqui podem ser convenientemente preparados por uma variedade de métodos familiar para os versados na técnica. Os conjugados ou compostos desta invenção com cada das fórmulas descritas aqui podem ser preparados de acordo com os procedimentos seguintes a partir de materiais de partida comercialmente disponíveis ou materiais de partida que podem ser preparados usando procedimentos da literatura. Estes procedimentos mostram a preparação dos conjugados representativos desta invenção.
[00444] Os conjugados projetados, selecionados e/ou otimizados pelos métodos descritos acima, uma vez produzidos, podem ser caracterizados usando uma variedade de testes conhecida pelos versados na técnica para determinar se os conjugados têm atividade biológica. Por exemplo, os conjugados podem ser caracterizados por testes convencionais, incluindo, mas não limitado aos testes descritos acima, para determinar se eles têm uma atividade prevista, atividade de ligação e/ou especificidade de ligação.
[00445] Além disso, uma triagem de alta produção pode ser usada para aumentar a velocidade da análise usando tais testes. Como um resultado, pode ser possível rapidamente fazer uma triagem das moléculas do conjugado aqui descrito para atividade, usando técnicas conhecidas na técnica. Metodologias gerais para a triagem de alta produção são descritas, por exemplo, em Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; e Patente US 5.763.263. Os testes de alta produção podem usar uma ou mais técnicas de teste diferentes incluindo, mas não limitado, as descritas acima.
[00446] Todas as publicações e documentos de patente citados aqui são incorporados aqui como referência como se cada publicação ou documento fosse especificamente e individualmente indicado. A citação de publicações e documentos de patente não é planejada como uma admissão que qualquer destes é pertinente a técnica antecedente, nem constitui qualquer admissão como para os conteúdos ou dados dos mesmos. A invenção foi descrita até agora como forma de descrição escrita, os versados na técnica reconhecerão que a invenção pode ser praticada em uma variedade de formas de realização e que a descrição precedente e exemplos abaixo são com propósitos de ilustração e não limitação das reivindicações que seguem.
EXEMPLOS
[00447] Os seguintes exemplos de trabalho são ilustrativos dos ligantes, moléculas de droga e PBRM e métodos para preparar as mesmas. Estes não são intencionados a serem limitantes e será facilmente entendido por uma pessoa habilitada na técnica que outros reagentes ou métodos podem ser utilizados.
[00448] Os conjugados aqui descritos podem ser preparados pelos esquemas geralmente esboçados acima e pelos métodos descritos nos Exemplos abaixo. O termo “conteúdo” como usado em certos exemplos abaixo, a menos que de outro modo especificado, significa a fração molar ou porcentagem molar das unidades estruturais do polímero que são substituídas com a porção pretendida, tais como o aglutinante, a molécula de droga, ou PBRM. Consequentemente, as porcentagens relatadas para as várias unidades poliméricas no polímero-droga ou conjugados de PBRM-polímero-droga como usados nos Exemplos abaixo são porcentagens molares, a menos que de outro modo especificado.
ABREVIAÇÕES
[00449] As seguintes abreviações são usadas nos Esquemas de reação e exemplos sintéticos, que seguem. esta lista não é intencionada ser uma lista toda inclusiva de abreviações usadas nos pedidos como abreviações de padrão adicional, que são facilmente entendidas por aqueles de habilidade na técnica de síntese orgânica, também podem ser usadas nos Esquema sintéticos e exemplos. ACN Acetonitrila AF-HPA Auristatina F-hidroxipropilamida Ala Alanina BA β-Alanina BOC terc-Butiloxicarbonila DCC N,N’-Dicicloexilcarbodiimida DCM Diclorometano DIEA N,N-Diisopropiletilamina DMA Dimetilacetamida DMAP N,N-Dimetilpiridin-4-amina DMF Dimetilformamida DMSO Sulfóxido de dimetila EDAC Cloridreto de N1-((etilimino)metileno)-N3,N3- dimetilpropano-1,3-diamina EDC.HCl Cloridreto de 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida GA Ácido glutárico HIC-HPLC Cromatografia líquida de alta pressão de interação hidrofóbica HOAt 1-Hidróxi-7-azabenzotriazol HOBt Hidrato de 1-Hidroxibenzotriazol HPLC Cromatografia líquida de alta pressão HPSEC Cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho HPV Hidroxipropilvindesina 2HPV 2-Hidroxipropilvindesina MWCO Corte de peso molecular NHS 1-Hidroxipirrolidino-2,5-diona (isto é, N-hidróxi- succinamida) NMP N-metil-2-pirrolidona PBS Solução salina tamponada com fosfato, NaCl a 0,9 % EG Etileno glicol EG2 Dietileno glicol MI Maleimida ou maleimido HPA-Ala Hidroxipropilamida-L-alanina PHF poli(1-hidroximetil-etileno hidroxilmetilformal), ou FLEXIMER® RP-HPLC Cromatografia líquida de alto desempenho com fase reversa SEC Cromatografia de exclusão de tamanho TBSCl Cloreto do éter terc-Butildimetilsilílico TCEP Tris[2-carboxietil] fosfina TEA Trietilamina TEAA Acetato de trietilamônio TFA Ácido trifluoroacético WCX Cromatografia de troca catiônica fraca Informação Geral
[00450] China. O éster de maleimido-EG2-NHS foi adquirido da Biomatrik,
[00451] Boc-diaminoetano HCl foi adquirido da Chem-Impex International Inc., Wood Dale, IL.
[00452] Kadcyla® (ado-trastuzumab entansina) para injeção fabricada pela Genentech foi adquirido.
[00453] A purificação pela HPLC foi realizada em uma coluna de semi-preparação Phenomenex Gemini 5 μm 110 Â, 250 x 10 mm, 5 microns.
[00454] A SEC foi realizada em uma coluna de TSK gel G5000 da Tosoh Biosciences (7,8 mm x 30 cm, 10 μm) ou coluna Superose 12 (GE Healthcare).
[00455] A WCX foi realizada em coluna ProPac WCX-10 (94 mm x 250 mm) (ThermoFisher).
[00456] Sempre que possível o conteúdo de droga dos conjugados foi determinado espectrofotometricamente de outro modo a LC/MS ou 1H-RMN foram realizados para a determinação quantitativa do conteúdo de droga.
[00457] O conteúdo de proteína dos conjugados de proteína-polímero- droga foi determinado espectrofotometricamente a 280 nm ou pelo ELISA.
[00458] Os pesos moleculares dos conjugados poliméricos (relatados como os pesos moleculares médios ponderados aparentes ou pesos moleculares de pico) foram determinados por SEC com padrões de peso molecular de polissacarídeo ou proteína. Mais especificamente, para o polímero ou conjugados polímero-droga, padrões de peso molecular de polissacarídeo foram usados e para os conjugados de proteína-droga- polímero, padrões de proteína são usados. A menos que especificamente indicado o peso molecular do carreador polimérico relatado é o peso molecular médio ponderado de PHF; e o peso molecular do conjugado polímero-droga e dos conjugados de proteína-polímero-droga é o peso molecular de pico. Os conjugados de PBRM-polímero-droga têm um peso molecular de pico de cerca de 160 kDa a cerca de 260 kDa. O polímero e conjugados poliméricos sintetizados/medidos tipicamente têm uma polidispersividade < 1,5.
[00459] Os conjugados de PBRM-polímero-droga foram separados dos conjugados de droga-polímero não reagidos residuais pela diafiltração extensiva. Se necessário, a purificação adicional pela cromatografia de exclusão de tamanho e /ou cromatografia de WCX foi conduzida para remover qualquer um dos conjugados de PBRM-polímero-droga agregados. No geral, os conjugados de PBRM-polímero-droga tipicamente contidas < 5 % (p/p, por exemplo, <2 % p/p) agregaram fração como determinado por SEC; <0,5 % (p/p, por exemplo, <0,1 % p/p) de droga livre (não conjugada) como determinado por RP-HPLC ou LC-MS/MS; <1 % (p/p) de conjugado polímero-droga livre como determinado por SEC e/ou RP-HPLC e <2 % (p/p, por exemplo, <1 % p/p) de PBRM não conjugada como determinado por HIC-HPLC e/ou WCX HPLC. Os anticorpos reduzidos ou parcialmente reduzidos foram preparados usando procedimentos descritos na literatura, ver, por exemplo, Francisco et al., Blood 102 (4): 1458-1465 (2003). A concentração de droga total (conjugada e não conjugada) foi determinada pela LC-MS/MS.
[00460] Para estudar as propriedades farmacocinéticas, isto é, curso de tempo de absorção, distribuição, metabolismo e excreção de conjugado de PBRM-polímero-droga, ensaios foram desenvolvidos para medir a concentração do conjugado de PBRM-PHF-AF-HPA (isto é AF-HPA conjugado) e concentração da AF-HPA liberada, não conjugada e AF (droga livre), por exemplo, nas amostras de plasma, tumor e tecido. Para determinar a concentração da droga livre na amostra, a amostra acidificada foi tratada com acetonitrila. A droga livre foi extraída do sobrenadante e analisada pela LC-MS/MS. Para determinar a concentração de AF-HPA conjugada, o homogenado de plasma, tumor ou tecido acidificado foi submetido à hidrólise básica seguida pela acidificação e precipitação de proteína com acetonitrila. O sobrenadante de acetonitrila contendo a AF-HPA e AF liberadas foi analisado pela LC-MS/MS. As curvas padrão para a droga livre e AF-HPA conjugada no plasma e homogenados de tumor e tecido foram lineares nas faixas de concentração de 0,3 a 3.000 ng/ml e 10 a 20.000 ng/ml, respectivamente. A concentração de trastuzumab total foi determinada por ELISA.
[00461] Em todos os experimentos in vitro ou in vivo aqui descritos, a menos que de outro modo especificado, as doses usadas foram todas com base na PBRM (por exemplo, anticorpo) dos conjugados de PBRM-polímero- droga.
[00462] A RP-HPLC, SDS-PAGE ou eletroforese capilar foram usadas para caracterizar a especificidade e distribuição dos sítios de bioconjugação de cisteína nos conjugados de PBRM-polímero-droga. Os resultados deram a distribuição posicional dos conjugados de droga-polímero nas cadeias pesada (H) e leve (L) da PBRM e mostraram que a conjugação à PBRM ocorreu predominantemente nas regiões de dobradiça da cisteína intercadeia da cadeia pesada. Os resultados similares foram obtidos com mapas peptídicos de PBRM pela LC-MS.
PROCEDIMENTOS GERAIS Procedimento Geral A. Conjugação de polímero com aglutinante ou droga
[00463] No geral, a conjugação do polímero (PHF-BA ou PHF-GA) com um aglutinante contendo amina, tal como, por exemplo, EG2-maleimido ou uma droga aglutinantea contendo amina, tal como, por exemplo, AF-HPA- Ala, HPV-Ala, é conduzida em um aquoso ou mistura de solvente orgânico/aquoso de 10 a 90 % na presença de um agente de ativação, tal como, por exemplo EDC.HCl. Os solventes orgânicos típicos, incluem, mas não são limitados a, solventes miscíveis em água, tais como, por exemplo, DMSO, DMF, DMA, NMP e ACN. Para acelerar a ligação, um co-ativador, tal como, por exemplo, NHS, é adicionado. O polímero é primeiro misturado com o composto contendo amino seguido pela adição do co-ativador (NHS) e depois a adição do ativador (EDC.HCl). A reação é conduzida de 0 a 10 oC, pH 4,5 a 7,5 por 1 hora a 24 horas na temperatura ambiente. O produto conjugado polimérico resultante é purificado pela diafiltração ou pela SEC. O produto é concentrado de 2 a 50 mg/ml, o pH é ajustado de 4,5 a 6,5 para garantir a estabilidade da droga-polímero aglutinante e o conjugado é armazenado congelado de -20 a -80 oC até uso futuro.
[00464] A conjugação do polímero com o aglutinante ou droga contendo amina pode ser conduzida sequencialmente, em qualquer ordem, ou simultaneamente.
Procedimento Geral B. Redução seletiva parcial de proteína (PBRM)
[00465] A redução seletiva parcial dos grupos de dissulfeto inter- cadeia ou dissulfeto não emparelhado na PBRM relevante antes da conjugação com o conjugado polímero-droga é obtida usando-se um agente redutor, tal como, por exemplo, TCEP, DTT ou β-mercaptoetanol. Quando a redução é realizada com um excesso do agente redutor, o agente redutor é removido antes da conjugação pela SEC. O grau de conversão dos grupos de dissulfeto da PBRM nas sulfidrilas do grupo reativo depende da estequiometria de PBRM, agente redutor, pH, temperatura e/ou duração da reação. Quando alguns mas não todos dos grupos dissulfeto na PBRM são reduzidos, a PBRM reduzida é uma PBRM parcialmente reduzida. Procedimento Geral C. Conjugação de PBRM parcialmente reduzido com conjugado de polímero droga
[00466] A conjugação da PBRM parcialmente reduzida ao conjugado polímero-droga é conduzida sob condições neutras ou levemente básicas (pH 6,5 a 8,5) nas concentrações de PBRM de 1 a 10 mg/ml e concentrações de conjugado polímero-droga de 0,5 a 10 mg/ml. O conjugado polímero-droga é tipicamente usado em excesso 1 a 5,0 vezes em relação à estequiometria do conjugado de proteína-polímero-droga desejado. Quando a PBRM é conjugada ao grupo maleimido do conjugado polímero-droga, a conjugação é opcionalmente terminada pela adição de um composto bloqueador de maleimido solúvel em água, tal como, por exemplo, N-acetil cisteína, éster metílico de cisteína, N-metil cisteína, 2-mercaptoetanol, ácido 3- mercaptopropanóico, ácido 2-mercaptoacético, mercaptometanol (isto é, HOCH2SH), benzil tiol e os seus semelhantes.
[00467] O conjugado de PBRM-polímero-droga resultante é tipicamente purificado pela diafiltração para remover qualquer conjugado polímero-droga não conjugado, droga não conjugada e impurezas de molécula pequena. Alternativa ou adicionalmente, procedimentos de separação cromatográfica apropriados tais como, por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de íon tal como, por exemplo, cromatografia WCX; cromatografia de fase reversa, cromatografia de hidroxil apatita, cromatografia de afinidade ou combinações destes podem ser usados para purificar o conjugado de PBRM- polímero-droga. O conjugado de PBRM-polímero-droga purificado resultante é tipicamente formulado em um tampão no pH 5,0 a 6,5. Exemplo 1. Síntese de EG2-maleimido: (O-[N-(3-maleimidopropionil) aminoetil]-O’-[3-(N-(2-aminoetil)amino)-3-oxopropil]etileno glicol)
Figure img0126
[00468] A uma suspensão gelada do éster de maleimido-EG2-NHS (O- [N-(3-maleimidopropionil)aminoetil]-O’-[3-(N-succinimidilóxi)-3- oxopropil]etileno glicol, 1,2 g, 2,82 mmol) e cloridreto de Boc-diaminoetano (560 mg, 2,82 mmol) em ACN (15 ml) foi adicionado TEA (0,571 g, 5,64 mmol) às gotas sob agitação. A mistura resultante foi levada até a temperatura ambiente e a agitação continuada durante a noite na temperatura ambiente. Cloridreto de BOC-diaminoetano adicional foi adicionado (110 mg) para dirigir a reação até a conclusão. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo e o resíduo purificado na RP-HPLC (0 a 100 % de ACN em água) para dar Boc-diaminoetano-EG2-maleimido como um sólido incolor (1,18 g, 89 % de rendimento). ESI MS: calculado C21H35N4O8 [M + H+] 471,3; encontrado 471,2.
[00469] O Boc-diaminoetano-EG2-maleimido (1,18 g, 2,508 mmol) foi dissolvido em uma solução de TFA a 30 % em DCM (20 ml) a 0 oC, a solução resultante foi agitada por 2 horas na temperatura ambiente. A mistura da reação bruta foi concentrada sob vácuo e depois purificada na RP-HPLC (de 0 a 10 % de ACN em água contendo 0,1 % de TFA) para produzir o composto do título (EG2-maleimido) como um óleo incolor (1,04 g, 86 %). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6+D2O): δ 6,95 (s, 2 H), 3,66-3,54 (m, 10 H), 3,34 (t, 2 H, J = 5,6 Hz), 3,27 (t, 2 H, J = 6,7 Hz), 3,18-3,10 (m, 2 H), 2,84 (t, 2 H, J = 6,2 Hz), 2,33 (q, 4 H, J = 6,7 Hz); ESI MS: calculado para C16H27N4O6 [M + H+] 371,2; encontrado 371,2. Exemplo 2. Síntese de PHF-BA 10K (30 %)-EG2-MI (3 %)
Figure img0127
[00470] A uma solução de PHF-BA 10K (30 %) (588 mg, 3,46 mmol preparada em uma maneira similar àquela como descrita na US 13/493.899, agora a Patente US 8.685.383, Exemplo 1) em água (10 ml) foi adicionada uma solução de EG2-maleimido (102 mg, 0,211 mmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 1) em água (5 ml) seguida pela adição de N-hidróxi-succinamida (NHS, 25 mg, 0,211 mmol). A mistura resultante foi esfriada de 5 a 10 °C e o pH foi ajustado até 5,8 (de 5,3) usando a solução NaOH 0,1 N. Depois EDC.HCl (94 mg, 0,486 mmol) em água (2 ml) foi adicionado à mistura de reação em 40 minutos. A mistura de reação foi levada até a temperatura ambiente e a agitação continuada na temperatura ambiente por 18 horas. O produto resultante foi purificado pela diafiltração em membrana MWCO 3K e liofilizado para dar o composto do título como um produto sólido branco amarelado (0,460 g, 71 % de rendimento). 1H-RMN (400 MHz, D2O): 6,9 ppm (singleto amplo, MI), 5,0-4,7 ppm (m, 1H, O-CH-O-, polímero de acetal-próton), 4,3-3,6 ppm (m, O-CH2- cadeia principal polimérica e prótons aglutinantes), 3,4-3,3 ppm (m, CH2-NH-, beta- alanina e prótons aglutinantes), 2,7-2,4 ppm (m, CH2-COOH-, beta-alanina e prótons aglutinantes). A carga de aglutinante EG2-MI (isto é, o conteúdo de unidades poliméricas contendo o aglutinante EG2-MI) determinada pela 1H- RMN foi de 3 % por mol das unidades estruturais poliméricas. Exemplo 3. Síntese de PHF-BA 10K (30 %)-EG2-MI (3 %)-AF-HPA-Ala (8 %)
Figure img0128
[00471] Uma solução homogênea de PHF-BA 10K (30 %) EG2-MI (3 %) (144 mg, 11,08 μmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 2) em água (4,2 g) foi esfriada de 5 a 10 °C. O pH da solução foi ajustado até 5,8 usando HCl 1 N, seguido pela adição de Auristatina F-hidroxipropilamida-L-Alanina.2TFA (AF-HPA-Ala.2TFA) (85 mg, 77,52 μmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita na US 13/493.899, agora a Patente US 8.685.383, Exemplo 50) dissolvida em NMP (1,4 ml) e NHS (16 mg em 0,5 ml de água). A mistura foi agitada vigorosamente de 5 a 10 °C e o pH da solução foi ajustado até 5,8 com NaOH 0,1 N. À mistura resultante foi adicionada uma solução aquosa recém preparada de EDC.HCl (30 mg em 0,5 ml de água). Depois de 45 minutos EDC.HCl adicional (30 mg em 0,5 ml de água) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada por 18 a 24 horas enquanto se manteve o pH a 5,8. A análise de RP-HPLC da mistura de reação indicou >95 % de consumo do material de partida do composto de auristatina. O produto foi purificado pela diafiltração em membrana MWCO 3K, seguido pela purificação pela HPLC e liofilização para dar o composto do título (143 mg, 78 % de rendimento). 1H-RMN (400 MHz, D2O): 7,15 ppm (singleto amplo, prótons aromáticos de AF-HPA), 6,9 ppm (singleto amplo, MI), 5,0-4,8 ppm (m, 1H, O-CH-O- polímero de acetal-próton), 4,4-3,6 ppm (m, O-CH2-cadeia principal polimérica e droga/ prótons aglutinantes), 3,4-2,8 ppm (m, CH2-NH-, beta- alanina e droga/prótons aglutinantes), 2,2-1,8 ppm (m, CH2-COOH-, beta- alanina e droga/prótons aglutinantes) e 1,6-0,9 ppm (m, droga/prótons aglutinantes).
[00472] A carga de droga do produto conjugado (isto é, conteúdo de unidades poliméricas contendo a droga) determinada pela 1H-RMN foi de 8 % por mol das unidades estruturais poliméricas (ou em média de cerca de 6 moléculas de AF-HPA por cadeia polimérica). O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 17 kDa. Exemplo 4. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %))
Figure img0129
[00473] A uma solução de trastuzumab (6,19 ml, 100 mg, 0,676 μmol) no tampão de TEAA foi adicionada uma solução de TCEP (0,6 ml, 2,36 μmol, 0,678 mg) sob agitação. A mistura foi incubada por 1 hora a 37 °C, depois esfriada até ~ 0 °C. O trastuzumab parcialmente reduzido foi depois adicionado a uma solução vigorosamente agitada de PHF-BA 10K (30 %)- EG2-MI (3 %)-AF-HPA-Ala (8 %) (76 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 3) no tampão de TEAA, pH 7,4 (26,5 ml) a 0 oC. A agitação foi continuada por 30 min a 0 oC. A reação foi extinta com uma solução aquosa de cloridreto de cisteína (65 mg, 371 μmol, 1,9 ml). Depois de agitar por 1 hora na temperatura ambiente no pH 7,0, a mistura de reação foi acidificada até o pH 5,0. O produto bruto foi purificado pela cromatografia seguido pela purificação com SEC para dar o composto do título (61 mg, 61 % de rendimento).
[00474] A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 12:1 a cerca de 17:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 180 kDa, PDI 1,15. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 3:1 ou de cerca de 3:1 a cerca de 4:1.
[00475] O conjugado de PBRM-polímero-droga, trastuzumab-((PEG2- MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %)) (2,5 μg, preparado em uma maneira similar àquela como descrita acima) foi submetido a SDS- PAGE isto é, à eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida) sob condições não redutoras e redutoras e visualizado com Odyssey IRDye® Blue Protein Stain Buffer. Sob condições não redutoras o conjugado foi aquecido a 70 °C por 10 minutos, ou não aquecido antes da análise de SDS- PAGE.
[00476] Os géis de SGS-PAGE mostraram que o conjugado foi estável e não dissociou sob condições não redutoras, tal como 70 oC por 10 minutos. Sob condições reduzidas o conjugado dissociou nos fragmentos de cadeia pesada e leve.
[00477] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga no conjugado de droga-polímero. Exemplo 5. Síntese de PHF-BA 10K (30 %)-AF-HPA-Ala (9 %)
Figure img0130
[00478] A uma solução homogênea de PHF-BA 10K (30 %) (700 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita na US 13/493.899, agora a Patente US 8.685.383, Exemplo 1) em água (20 ml) foi adicionada auristatina F-hidroxipropilamida-L-alanina.2TFA (AF-HPA-Ala.2TFA) (460 mg, 417 μmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita na US 13/493.899, agora a Patente US 8.685.383, Exemplo 50) dissolvida em NMP (6,7 g). A mistura resultante foi agitada vigorosamente enquanto esfriava até 5 a 10 °C. O pH da solução foi ajustado até 5,8, seguido pela adição de NHS (129 mg em 1 ml de água). À mistura resultante foi adicionada uma solução aquosa recém preparada de EDC.HCl (223 mg em 1 ml de água). Depois de 30 minutos EDC.HCl adicional (220 mg em 1 ml de água) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada por 18 horas enquanto se manteve o pH a 5,8. A análise de RP-HPLC do indicou consumo > 95 % do material de partida do composto de auristatina. O produto foi purificado pela HPLC e liofilização para dar o composto do título (859 mg, 83 % de rendimento). 1H-RMN (400 MHz, D2O): 7,7 - 7,2 ppm (singleto amplo, prótons aromáticos de AF-HPA), 5,0-4,8 ppm (m, 1H, O-CH-O-polímero de acetal-próton, parcialmente oculto sob sinal da água), 4,4-3,6 ppm (m, O-CH2- cadeia principal polimérica e droga/ prótons aglutinantes), 3,5-2,8 ppm (m, CH2-NH- , beta-alanina e droga/prótons aglutinantes), 2,2-1,6 ppm (m, CH2-COOH-, beta-alanina e droga/prótons aglutinantes) e 1,6-0,8 ppm (m, droga/prótons aglutinantes).
[00479] A carga de droga do produto conjugado determinada pela 1H- RMN foi de 8,7 % por mol das unidades estruturais poliméricas (ou em média de cerca de 6 moléculas de AF-HPA por cadeia polimérica). Conjugado A: PHF-BA 10K (30 %)-AF-HPA-Ala (9,5 %) foi preparado a partir de PHF-BA 10K (30 %) (100 mg) usando o procedimento descrito acima. Exemplo 6. Síntese de PHF-BA 10K (30 %)-EG2-MI (2 %)-AF-HPA-Ala (9 %)
Figure img0131
[00480] A uma solução de PHF-BA 10K (30 %)-AF-HPA-Ala (9 %) (500 mg, 35 μmol. preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 5) em água (13,7 ml) foi adicionada uma solução de EG2- maleimido (83 mg, 0,139 mmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 1) seguida pela N-hidróxi-succinamida (NHS, 40 mg, 0,348 mmol). A mistura resultante foi esfriada de 5 a 10 °C e o pH foi ajustado até 5,8 (a partir de 4,6) usando a solução NaOH 0,1 N. Depois EDC.HCl (174 mg, 0,91 mmol) em água (2 ml) foi adicionado à mistura de reação em 40 minutos em duas porções iguais. A análise de RP-HPLC da mistura de reação indicou consumo de >95 % do EG2-maleimido. A mistura de reação foi levada até a temperatura ambiente e a agitação continuada na temperatura ambiente por 18 horas. O produto resultante foi purificado pela diafiltração em membrana MWCO 3K e liofilizado para dar o composto do título como um produto sólido branco amarelado (0,57 g, 100 % de rendimento). 1H-RMN (400 MHz, D2O): 7,4 - 7,2 ppm (singleto amplo, prótons aromáticos de AF-HPA), 6,9 ppm (singleto amplo, MI), 5,0-4,8 ppm (m, 1H, O-CH-O- polímero de acetal-próton, parcialmente oculto sob o pico de água), 4,4-3,6 ppm (m, O-CH2- cadeia principal polimérica e droga/ prótons aglutinantes), 3,5-2,8 ppm (m, CH2-NH-, beta-alanina e droga/prótons aglutinantes), 2,2-1,6 ppm (m, CH2-COOH-, beta-alanina e droga/prótons aglutinantes) e 1,6-0,8 ppm (m, droga/prótons aglutinantes).
[00481] A carga do aglutinante EG2-MI determinada pela 1H-RMN foi de ~2 % em mol das unidades estruturais poliméricas. O peso molecular do composto do título foi de cerca de 20 kDa. Em média houve 6 moléculas de AF-HPA por cadeia polimérica. Exemplo 7. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (9 %))
Figure img0132
[00482] A uma solução de trastuzumab (6,4 ml, 100 mg, 0,68 μmol) no tampão de TEAA foi adicionada uma solução de TCEP (0,993 mg, 3,4 μmol) sob agitação. A mistura foi incubada por 1,5 hora na temperatura ambiente. O trastuzumab parcialmente reduzido foi depois adicionado a uma solução vigorosamente agitada de PHF-BA 10K (30 %)-EG2-MI (2 %)-AF-HPA-Ala (9 %) (86 mg, 4,7 μmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 6) no tampão de TEAA, pH 7,4 (26,5 ml) a 0 oC. A agitação foi continuada por 45 minutos na temperatura ambiente. A reação foi extinta com uma solução aquosa de cisteína no tampão de TEAA, pH 6,8 (65 mg, 371 μmol, 1,9 ml). Depois de agitar por 1 hora na temperatura ambiente no pH 7,0, a mistura de reação foi acidificada até o pH 5,8. O produto bruto foi purificado pela purificação de SDC para dar o composto do título (35 mg, 35 % de rendimento).
[00483] A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 16:1 a cerca de 21:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 210 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 3:1 ou de cerca de 3:1 a cerca de 4:1.
[00484] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 8. Síntese de Lintuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (9 %))
Figure img0133
[00485] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (30 %)-EG2-MI (2 %)-AF-HPA-Ala (9 %) (preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 3 ou Exemplo 6), lintuzumab e TCEP:lintuzumab 3,5:1 foram usados.
[00486] A razão AF-HPA para lintuzumab foi de cerca de 10:1 a cerca de 15:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 184 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para lintuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 3:1 ou de cerca de 3:1 a cerca de 4:1.
[00487] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 9. Síntese de Rituximab-((EG2-MI (3 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)- (AF-HPA-Ala (8 %))
Figure img0134
[00488] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (30 %)-EG2-MI (3 %)-AF-HPA-Ala (8 %) (preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 3 ou Exemplo 6), rituximab e TCEP:rituximab 3,5:1 foram usados.
[00489] A razão de AF-HPA para rituximab foi de cerca de 13:1 a cerca de 18:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 163 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para rituximab foi de cerca de 2:1 a cerca de 3:1 ou de cerca de 3:1 a cerca de 4:1.
[00490] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 10. Síntese de Anti-5T4-((EG2-MI (3 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)- (AF-HPA-Ala (8 %))
Figure img0135
[00491] O composto do título (“conjugado scFvFc anti-5T4 polímero droga”, ou “scADC anti-5T4”) foi preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (30 %)-EG2-MI (3 %)-AF- HPA-Ala (8 %) (preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 3 ou Exemplo 6) e anticorpo de scFvFc anti-5T4 e TCEP:anticorpo de scFvFc anti-5T4 3:1 foram usados. O anticorpo de scFvFc anti-5T4 (proteína de fusão de anticorpo de cadeia única anti-5T4-Fc) foi preparado recombinantemente em células CHO DG44, como descrito no Pedido Provisório US Número 61/835.858, depositado em 17 de junho de 2013, aqui incorporado por referência.
[00492] A razão de AF-HPA para anticorpo anti-5T4 foi de cerca de 12:1 a cerca de 18:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 200 kDa. A razão média de conjugado PHF-droga para anticorpo anti-5T4 foi de cerca de 2:1 a cerca de 3:1 ou de cerca de 3:1 a cerca de 4:1.
[00493] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 11. Síntese de PHF 10K-GA (29 %)-EG2-MI (1 %)
Figure img0136
[00494] A uma solução de PHF 10K-GA (29 %) (1,7 g, 10,1 mmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita na US 13/493.899, agora a Patente US 8.685.383, Exemplo 2) em água (35 ml) foi adicionada uma solução de EG2-maleimido (204 mg, 0,42 mmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 1) em DMA (3 ml) seguida pela adição de N-hidróxi-succinamida (NHS, 70,3 mg, 0,611 mmol). A mistura resultante foi esfriada de 5 a 10 °C. Depois EDC.HCl (269 mg, 1,402 mmol) em água (2 ml) foi adicionado à mistura de reação em duas porções iguais em 40 minutos. A mistura de reação foi levada até a temperatura ambiente e a agitação continuada na temperatura ambiente por 18 horas. O produto resultante foi purificado pela diafiltração em membrana MWCO 3K e liofilizado para dar o composto do título como um produto sólido branco amarelado (1,7 g, 91 % de rendimento). 1H-RMN (400 MHz, D2O): 6,9 ppm (singleto amplo, MI), 5,0-4,7 ppm (m, 1H, O-CH-O-, polímero de acetal-próton, parcialmente oculto sob o pico de água), 4,4-3,6 ppm (m, O-CH2- cadeia principal polimérica e prótons aglutinantes), 3,3-2,6 ppm (m, prótons aglutinantes), 2,5 ppm (m, CH2-CO-, prótons glutáricos), 2,3 ppm (singleto amplo, CH2-COO-, prótons glutáricos), 1,9 ppm (singleto amplo, -CH2-CH2- CH2-CO-, prótons glutáricos).
[00495] A carga do aglutinante EG2-MI determinada pela 1H-RMN foi de 1 % por mol das unidades estruturais poliméricas. Exemplo 12. Síntese de PHF 10K-GA (29 %)-EG2-MI (1 %)-AF-HPA-Ala (6 %)
Figure img0137
[00496] Uma solução homogênea de PHF-BA 10K (29 %)-EG2-MI (1 %) (214 mg, 15 μmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 11) em água (5,4 g) foi adicionado AF-HPA-Ala,2TFA) (98 mg, 90 μmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita na US 13/493.899, agora a Patente US 8.685.383, Exemplo 50) dissolvida em NMP (1,85 ml) e NHS (25 mg em 0,5 ml de água). A mistura foi agitada vigorosamente de 5 a 10 °C. À mistura resultante foi adicionada uma solução aquosa recém preparada de EDC.HCl (40 mg em 0,8 ml de água). Depois de 30 minutos EDC.HCl adicional (44 mg em 0,8 ml de água) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada por 18 a 24 horas enquanto se manteve o pH a 5,8. A análise de RP-HPLC do material de partida indicou > 95 % de consumo do composto de auristatina. O produto foi purificado pela diafiltração em membrana MWCO 3K e concentrado a 10 ml para dar o composto do título (177 mg, 63 % de rendimento). 1H-RMN (400 MHz, D2O): 7,4 - 7,2 ppm (singleto amplo, prótons aromáticos de AF-HPA), 6,9 ppm (singleto amplo, MI), 5,0-4,8 ppm (m, 1H, O-CH-O-, polímero de acetal-próton), 4,4-3,6 ppm (m, O-CH2- cadeia principal polimérica e prótons aglutinantes), 3,4-2,9 ppm (m, prótons aglutinantes de droga), 2,5 ppm (tripleto amplo, CO- CH?-, prótons glutáricos), 24-2,2 ppm (m, CH2-COO-, prótons glutáricos e droga/prótons aglutinantes), 2,0 - 1,8 ppm (m, -CH2-CH2- CH2-CO-, prótons glutáricos), 1,5- 0,8 (m, droga/prótons aglutinantes).
[00497] A carga de droga do produto conjugado determinado por 1H- RMN foi de 5,9 % por mol das unidades estruturais poliméricas (ou em média de cerca de 4,5 moléculas de AF-HPA por cadeia polimérica). O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 17 kDa. Exemplo 13. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (1 %))-(PHF 10 kDa-GA (29 %)-(AF-HPA-Ala (6 %))
Figure img0138
[00498] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF 10K-GA (29 %)-EG2-MI (1 %)-AF-HPA-Ala (6 %) (78 mg, preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 12) e trastuzumab (25 mg) e TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados. A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 18:1 a cerca de 23:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 200 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 4:1 a cerca de 5:1.
[00499] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 14. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %))
Figure img0139
[00500] O composto descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %)-EG2-MI (2 %)-AF-HPA-Ala (9 %) (11 mg, preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 3 ou Exemplo 6, trastuzumab (620 mg) e TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados.
[00501] A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 10:1 a cerca de 15:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 183 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00502] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 15. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %))
Figure img0140
[00503] O composto descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %)-EG2-MI (2 %)-AF-HPA-Ala (9 %) (243 mg, preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 3 ou Exemplo 6), trastuzumab (435 mg) e TCEP:trastuzumab 3:1 foram usados.
[00504] A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 11:1 a cerca de 16:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 197 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00505] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 16. Síntese de Rituximab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %))
Figure img0141
[00506] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %)-EG2-MI (2 %)-AF-HPA-Ala (9 %) (170 mg, preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 3 ou Exemplo 6) 300 mg de rituximab e TCEP:rituximab 3:1 foram usados.
[00507] A razão de AF-HPA para rituximab foi de cerca de 13:1 a cerca de 18:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 180 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para rituximab foi de cerca de 3:1 a cerca de 4:1.
[00508] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 17. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %))
Figure img0142
[00509]O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %)-EG2-MI (2 %)-AF-HPA-Ala (9 %) (8,4 mg, preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 3 ou Exemplo 6, trastuzumab (15 mg) e (TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados. A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 5:1 a cerca de 10:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 183 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00510] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 18. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (28
Figure img0143
[00511] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7.
[00512] Conjugado A - A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 19:1 a cerca de 24:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 201 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00513] Conjugado B - A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 20:1 a cerca de 25:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 224 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00514] Conjugado C - A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 23:1 a cerca de 28:1. O peso molecular do conjugado do título foi de 259 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00515] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 19 Síntese de PHF-BA 10K (30 %) EG2-MI (2,7 %)-(HPV-Ala (14 %)
Figure img0144
[00516] Uma solução homogênea de PHF-BA 10K (30 %) EG2-MI (2,7 %) (25,00 mg, 2,80 μmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 2) em água (0,612 ml e NMP (0,14 ml) foi resfriada a 0 °C. 1-Hidroxipirrolidino-2,5-diona (8,06 mg, 0,07 mmol) em NMP (0,14 ml) foi adicionado seguido pela HPV-Alanina (15,56 mg, 0,018 mmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita na Patente U.S. No. 8.524.214, Exemplo 1) em água (0,250 ml). A mistura foi agitada vigorosamente até que todos os materiais fossem dissolvidos depois uma solução aquosa recém preparada de EDC.HCl (6,71 mg em 0,125 ml de água) foi adicionada. Depois de 45 minutos EDC.HCl adicional (6,71 mg em 0,125 ml de água) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada por 18 horas enquanto se manteve o pH a 5,8. A análise de RP-HPLC da mistura de reação indicou que a reação foi incompleta. A mistura foi esfriada até 0 °C e EDC.HCl (12 mg em 0,250 ml) foi adicionado. O pH da solução foi ajustado até 5,9 com NaOH 0,1 N e a mistura agitada por um adicional de 2 horas tempo no qual a análise de RP-HPLC da mistura de reação indicou o consumo completo do material de partida O produto foi purificado pela cromatografia de coluna (Sephadex G25 Gel) seguido pela purificação pela HPLC e liofilização para dar o composto do título (10,18 mg, 24 % de rendimento).
[00517] Conjugado A: PHF-BA 10K (30 %) EG2-MI (2,7 %)-(HPV- Ala (14 %) foi preparada em uma maneira similar àquela como descrita acima. A carga de droga do produto conjugado (isto é, o conteúdo de unidades poliméricas contendo a droga) determinada pela 1H-RMN foi de 14 % por mol das unidades estruturais poliméricas (isto é em média 2,4 moléculas de HPV-Ala por cadeia polimérica).
[00518] Conjugado B: PHF-BA 10K (30 %) EG2-MI (2,7 %)-(HPV- Ala (7,7 %) foi preparado usando o procedimento descrito acima. A carga de droga do produto conjugado (isto é, conteúdo de unidades poliméricas contendo a droga) determinada pela 1H-RMN foi de 28,3 % por mol das unidades estruturais poliméricas (isto é em média 4,6 moléculas de HPV-Ala por cadeia polimérica).
[00519] Conjugado C: PHF-BA 10K (30 %) EG2-MI (3,5 %)-(HPV- Ala (4,3 %) foi preparado usando o procedimento descrito acima. A carga de droga do produto conjugado (isto é, conteúdo de unidades poliméricas contendo a droga) determinado pela HPLC foi de 4,3 % por mol das unidades estruturais poliméricas (isto é em média 2,6 moléculas de HPV-Ala por cadeia polimérica). Exemplo 20 Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(HPV-Ala (14 %))
Figure img0145
[00520] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (30 %) EG2-MI (2,7 %)-(HPV-Ala (14 %) (1,5 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 19), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 4:1 foram usados.
[00521] Conjugado A: Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa- BA (30 %)-(HPV-Ala (14 %)). A razão de HPV-Ala para trastuzumab foi de cerca de 13:1 a cerca de 18:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 168 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00522] Conjugado B: Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa- BA (30 %)-(HPV-Ala (7,7 %)) foi preparado usando o procedimento acima exceto PHF-BA 10K (30 %) EG2-MI (2,7 %)-(HPV-Ala (7,7 %) (5,7 mg, Exemplo 19, conjugado B), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 4:1 foram usados. A razão de HPV-Ala para trastuzumab foi de cerca de 10:1 a cerca de 14:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 180 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00523] Conjugado C: Trastuzumab-((EG2-MI (3,5 %)-(PHF 10 kDa- BA (30 %)-(HPV-Ala (4,3 %)) foi preparada em uma maneira similar àquela como descrita neste exemplo exceto PHF-BA 10K (30 %) EG2-MI (2,7 %)- (HPV-Ala (4,3 %) (4,2 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 19 conjugado C), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 4:1 foram usados. A razão de HPV-Ala para trastuzumab foi de cerca de 8,5:1 a cerca de 12:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 181 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00524] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 21 Síntese de PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(Ispinesib- PABA-Val-Cit (3,5 %)
Figure img0146
[00525] A uma solução de PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %) (60,8 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 2) em 5 ml de NMP foi adicionado Ispinesib-PABA-Val-Cit-NH2 (sal de TFA, 10,0 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita na Patente U.S. No. 8.815.226, Exemplo 84) em NMP (0,5 ml). A esta mistura foi adicionado HATU (5,5 mg) em NMP (0,5 ml) seguido por DIEA (4,4 mg). A mistura de reação foi agitada de 5 a 10 min na temperatura ambiente. A mistura bruta foi purificada pela ultrafiltração para dar o composto do título (Rendimento: 64 %, com base em Ispinesib).
[00526] A carga de droga do produto conjugado (isto é, conteúdo de unidades poliméricas contendo a droga) determinada por UV foi de 3,5 % por mol das unidades estruturais poliméricas (ou em média de cerca de 2,5 moléculas de ispinesib-PABA-Val-Cit por cadeia polimérica). Exemplo 22. Síntese de Trastuzumab- ((EG2-MI (28 %)-(PHF 10 kDa-BA (2,7 %)-(Ispinesib-PABA-Val-Cit-(3,5 %))
Figure img0147
[00527] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(Ispinesib-PABA-Val-Cit (3,5 %) (5,6 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 21), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados. A razão de ispinesib para trastuzumab foi de cerca de 7,5:1 a cerca de 10:1. A razão média de conjugado de PHF- droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00528] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 23. Síntese de Rituximab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(Ispinesib-PABA-Val-Cit-(3,5 %))
Figure img0148
[00529] O composto descrito no Exemplo 22, exceto rituximab e TCEP:rituximab 3,5:1 foram usados. A razão de ispinesib para rituximab foi de cerca de 6,5:1 a cerca de 10:1. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00530] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 24. Síntese de THP-2-metil-Ispinesib
Figure img0149
[00531] Composto 1: A uma solução de 4-(hidróxi-metil)-2,6- dimetoxifenol (2,77 g) em 25 ml de DMA foi adicionado<autotext key="12898A30" name="[Reactants]" index="3" field="Reactants" type="field" length="50"/> imidazol (1,13 g). A mistura foi esfriada até 0 oC sob argônio e depois TBSCl (2,49 g) foi adicionado. A mistura de reação foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada protegida da luz por 3 dias sob argônio. A mistura de reação foi diluída com DCM (300 ml) e lavada com NH4Cl sat (100 ml) depois salmoura (100 ml). A fase orgânica foi secada em Na2SO4 e concentrada para dar o produto bruto que foi purificado pela cromatografia cintilante em gel de sílica (Hex/EtOAc, 0 % de B a 30 % de B) para dar um óleo incolor (2,24 g, 50 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,17 (s, 1H), 6,54 (s, 2 H), 4,59 (s, 2 H), 3,72 (s, 6 H), 0,89 (s, 9 H), 0,05 (s, 6 H).
[00532] Composto 2: A uma solução gelada do composto 1 (0,508 g), TEA (0,603 g) e DMAP (0,021 g) em 5 ml de THF seco foi adicionada uma solução de cloroformiato de 4-nitrofenila (0,68 g) em ~3 ml de THF. O banho de gelo foi removido e a agitação foi continuada na temperatura ambiente. A reação foi extinta com NH4Cl (20 ml) e depois extraída com acetato de etila (60 ml). Os orgânicos foram lavados com salmoura (20 ml), secos em Na2SO4 depois concentrados para dar o produto bruto que foi purificado pela cromatografia cintilante em gel de sílica (Hex:Acetato de Etila, 0 % de B a 20 % de B) para produzir o composto 2 como um sólido incolor (0,724 g, 92 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,32-8,28 (m, 2 H), 7,51-7,48 (m, 2 H), 7,12 (s, 1 H), 6,64 (s, 1 H), 4,75 (d, 2 H, J = 12,9 Hz), 3,93 (d, 3 H, J = 13,5 Hz), 3,88 (s, 3 H), 1,0-0,94 (m, 9 H), 0,15 (s, 3 H), 0,12 (s, 3 H).
[00533] Composto 3: A uma solução do composto 2 (0,5 g) em 5 ml de THF seco foi adicionado HOBt (0,291 g) e a mistura resultante foi agitada por ~ 5 min. A esta mistura foi adicionado 2-aminopropanol (0,324 g) e TEA (0,546 g). A mistura resultante foi agitada ~1 h a 0 oC ponto no qual a TLC indicou que a reação foi completa. A mistura foi diluída com DCM (60 ml) e lavada com NH4Cl sat (20 ml) seguido por salmoura (20 ml). Os orgânicos foram secados (Na2SO4) e concentrados para dar um óleo amarelo. O produto bruto foi purificado pela cromatografia cintilante em gel de sílica (Hex:Acetato de Etila, 0 % de B a 80 % de B) para produzir o composto 3 como um sólido amarelo (0,356 g, 83 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,50 (t, 1 H J = 5,8 Hz), 6,64 (s, 2 H), 4,68 (s, 2 H), 4,64 (d, 1 H, J = 4,8 Hz), 3,71 (s, 6 H), 3,70-3,61 (m, 1 H), 3,04-2,96 (m, 1 H), 2,96-2,86 (m, 1 H), 1,05 (d, 3 H, J = 6,1 Hz), 0,10 (s, 6 H); ESI MS: teórico C19H33NO6Si (M + H) 400,2, encontrado 400,2.
[00534] Composto 4: A uma solução gelada do composto 3 (0,358 g) <autotext key="12B4CD8F" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="78"/>e DMAP (0,219 g) em 5 ml de DCM seco foi adicionada uma solução de DCC (0,369 g) em ~5 ml de DCM sob argônio. O banho de gelo foi removido e a mistura foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada, diluída com DCM (~60 ml) e lavada com NH4Cl sat (2 x 20 ml) seguido pela salmoura (~20 ml). A fase orgânica foi secada em Na2SO4 e concentrada para dar o produto bruto que foi purificado pela cromatografia cintilante em gel de sílica para produzir o composto 4 como um óleo incolor (0,422 g, 75 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,65 (s, 1 H), 7,39 (s, 1 H), 6,64 (s, 2 H), 4,93-4,84 (m, 1 H), 4,68 (s, 2 H), 3,71 (s, 6 H), 3,68-3,62 (m, 1 H), 3,62-3,47 (m, 4 H) 3,16 (t, 2 H, J = 5,9 Hz), 2,88 (s, 4 H), 2,01-1,93 (m, 2 H), 1,91-1,77 (m, 3 H), 1,75-1,66 (m, 1 H), 1,57-1,47 (m, 1 H), 1,39 (s, 9 H), 1,35-1,29 (m, 1 H), 1,28-1,22 (m, 1 H), 1,15-1,10 (m,3 H), 0,92 (s, 9 H); ESI MS: teórico C30H50N2O10Si (M + H) 627,3, encontrado 527,2 (M - Boc + H).
[00535] Composto 5: Uma solução do composto 4 (0,400 g) e SnCl2 diidratado (0,144 g) em um EtOH/água (7,25 ml, 9:1) foi agitada na temperatura ambiente ~3 h sob argônio. Na conclusão da reação (TLC) a mistura de reação foi diluída com 60 ml de EtOAc e depois lavada com NH4Cl sat (20 ml) e salmoura (20 ml). A fase orgânica foi secada em Na2SO4 e concentrada para dar o produto bruto que foi purificado pela cromatografia cintilante em gel de sílica (Hex:Acetato de Etila, 0 % de B a 100 % de B) para produzir o composto 5 como um óleo incolor (0,220 g, 67 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 6,61 (s, 2 H), 5,82 (brs, 1 H), 5,16 (brs, 1 H), 4,87 (m, 1 H), 4,64 (s, 2 H), 3,90-3,75 (m, 8 H), 3,75-3,62 (m, 2 H), 3,62-3,51 (m, 1 H), 3,41-3,18 (m, 1 H), 2,31-2,13 (m, 2 H), 1,93-1,81 (m, 2 H), 1,44 (s, 9 H), 1,29 (d, 3 H, J = 6,6 Hz); ESI MS: teórico C24H36N2O10 (M + H) 513,2, encontrado 413,2 (M - Boc + H).
[00536] Composto 6: A uma solução do composto 5 (0,220 g) em 2 ml de THF seco foi adicionado TEA (0,152 g). A mistura foi esfriada até 0 oC e cloroformiato de p-nitrofenila (0,087 g) foi adicionado como um sólido. A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente e agitada ~ 4 horas. Cloroformiato adicional (~0,05 g em ~1 ml de THF) foi adicionado e a mistura foi agitada durante a noite. A mistura de reação foi diluída com 30 ml de EtOAc e depois lavada com NH4Cl sat (10 ml) seguido pela salmoura (10 ml). A fase orgânica foi secada em Na2SO4 e concentrada para produzir o produto bruto como um óleo. O produto bruto foi purificado cromatografia cintilante em gel de sílica (Hexano: EtOAc 0 % de B a 90 % de B) para produzir o composto 6 como um sólido incolor (0,257 g, 88 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,28 (d, 2 H, J = 9,3 Hz), 7,39 (d, 2 H, J = 9,8 Hz), 6,67 (s, 2 H), 5,90 (brs, 1 H), 5,23 (s, 2 H), 5,21-5,13 (m, 1 H), 4,87 (brs, 1 H), 3,89-3,76 (m, 8 H), 3,75-3,64 (m, 2 H), 3,63-3,53 (m, 1 H), 2,30-2,19 (m, 1 H)1,95-1,83 (m, 2 H), 1,44 (s, 9 H), 1,29 (d, 3 H, J = 6,7 Hz); ESI MS: teórico C31H39N3O14(M + H) 678,2, encontrado 578,2 (M - Boc + H).
[00537] Composto 7: A uma solução do composto 6 (53,5 mg) em 0,5 ml de DMA seco foi adicionado Ispinesib (37,1 mg), DIEA (9,27 mg) e HOAt (2,93 mg) em sucessão. A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante a noite sob nitrogênio. A mistura da reação bruta foi purificada pela RP-HPLC preparativa (Hex:Acetato de Etila 50 % de B-90 % de B EM 25 min, 0,1 % de TFA em ambas as fases móveis) para produzir o composto 7 como um sólido incolor (64 mg, 84 % de rendimento). ESI MS: teórico C55H67ClN6O13(M + H) 1055,5, encontrado 1055,4.
[00538] Composto 8: A uma solução gelada do composto 7 (64 mg) em 2 ml de DCM seco foi adicionado 1 ml em TFA sob nitrogênio. O banho de gelo foi removido e a mistura foi agitada 1 h na temperatura ambiente ponto no qual a LC/MS indicou que a reação foi completa. O solvente foi removido por intermédio da evaporação rotativa e o resíduo foi liofilizado para produzir o composto 8 como um sólido incolor (64 mg, 99 %). ESI MS: teórico C50H59ClN6O11 (M + H) 955,4, encontrado 955,3. Exemplo 25 síntese de PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(THP-2- metil-Ispinesib) (2,4 %)
Figure img0150
[00539] O composto do título foi preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 21 usando PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %) (58,9 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 2) e THP-2-metil-Ispinesib (10,0 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 24; 46 % de rendimento (com base em Ispinesib).
[00540] A carga de droga do produto conjugado (isto é, conteúdo de unidades poliméricas contendo a droga) determinado por UV foi de 2,4 % por mol das unidades estruturais poliméricas (ou em média de cerca de 1,7 moléculas de THP-2-metil-Ispinesib por cadeia polimérica). Exemplo 26. Síntese de Trastuzumab- ((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(THP-2-metil-Ispinesib) (2,4 %))
Figure img0151
[00541] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(THP-2-metil-Ispinesib) (2,4 % mg, preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 25), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados. A razão de ispinesib para trastuzumab foi de cerca de 5:1 a cerca de 8:1. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 3:1 a cerca de 4:1.
[00542] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 27. Síntese de Rituximab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(THP-2-metil-Ispinesib) (2,4 %))
Figure img0152
[00543]O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 26 exceto rituximab e TCEP:rituximab 3,5:1 foram usados. A razão média de ispinesib para rituximab foi de cerca de 4,5:1 a cerca de 7:1. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00544] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 28. Síntese de valina-aciloxiisopropilóxi-MMAE
Figure img0153
[00545] Composto 1: ácido (S)-2-(benziloxicarbonilamino)-3- metilbutanóico (4,76 g, 18,93 mmol)<autotext key="125B2ED3" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="73"/>, 4-(metiltio)fenilcarbonato de 1-cloro-2-metilpropila (2,6 g, 9,46 mmol)<autotext key="125B2ED4" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="73"/> e monoóxido de monoprata(I) monoprata(III) (2,193 g, 9,46 mmol)<autotext key="125B2ED5" name="[Reactants]" index="3" field="Reactants" type="field" length="60"/> foram aquecidos a 90° C por 1 h. A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente, o resíduo triturado com o éter etílico e os sólidos foram lavados com éter. Os orgânicos foram lavados com água (4X), NaHCO3 aquoso, secados em Na2SO4 e concentrados até um óleo de cor palha. O óleo bruto em DCM foi purificado pela cromatografia cintilante em gel de sílica (Hexano:EtOAc 0 % de B a 20 % de B), seguido pela HPLC de fase reversa C18 usando um gradiente de acetonitrila/água de 20 a 95 % de acetonitrila tamponada com 0,1 % de TFA para dar um óleo incolor (2,78 g, 60 % de rendimento). O composto foi caracterizado pela 1H, 13C RMN e espec. de massa, M/z = 490,3.
[00546] Composto 2: A uma solução gelada do composto 1, (2,5 g, 5,11 mmol)<autotext key="1269B5A7" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="121"/> em DCM (20 ml)<autotext key="1269B5A8" name="[Solvents]" index="1" field="Solvents" type="field" length="11"/> foi adicionada às gotas uma solução do ácido peracético em ácido acético (12,14 g, 51,1 mmol)<autotext key="1269B5A9" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="50"/> e agitada por 2 horas depois do que a adição foi completa. A reação foi monitorada pela LC/MS. Depois de 2 horas, à mistura de reação foram adicionados 25 ml de água e agitados frio por 30 min, os orgânicos diluídos com 100 ml de DCM, lavados com água gelada (5x), NaHCO3 aquoso, secados em Na2SO4 e concentrados. O produto bruto foi purificado pela cromatografia cintilante em gel de sílica (Hexano:EtOAc 0 % de B a 50 % de B).
[00547] Composto 3: MMAE, (300 mg, 0,418 mmol)<autotext key="126B4A49" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="254"/>, composto 2, (436 mg, 0,836 mmol)<autotext key="126B4A4A" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="127"/>, 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-ol hidratado (129 mg, 0,836 mmol)<autotext key="126B4A4B" name="[Reactants]" index="3" field="Reactants" type="field" length="66"/> e THF (25 ml)<autotext key="126B4A4C" name="[Solvents]" index="1" field="Solvents" type="field" length="11"/> foram combinados e agitados em um banho gelado. À mistura resultante foi adicionada trietilamina (0,291 ml, 2,089 mmol)<autotext key="126B4A4D" name="[Reactants]" index="4" field="Reactants" type="field" length="36"/> e agitados frio por 15 min depois a 40 °C até que a reação fosse completa como indicado pela LC/MS. Depois de 4 horas a mistura de reação foi diluída com Acetato de Etila, lavada com NaHCO3 aquoso, ácido cítrico aquoso a 5 %, secada em Na2SO4, concentrada e purificada pela cromatografia de fase reversa para dar o composto 3 como um sólido amorfo branco como o sal de TFA. LC/MS, M/z = 1067,6.
[00548] Composto 4: Ao composto 3 (150 mg, 0,141 mmol)<autotext key="1271E178" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="315"/> em THF (10 ml)<autotext key="1271E179" name="[Solvents]" index="1" field="Solvents" type="field" length="11"/> e EtOH (10,00 ml)<autotext key="1271E17A" name="[Solvents]" index="2" field="Solvents" type="field" length="15"/> foi borbulhado argônio. A esta mistura foi adicionado paládio a 10 % em carbono (29,9 mg, 0,028 mmol)<autotext key="1271E17B" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="41"/> seguido pela ligação de um balão de hidrogênio (0,283 mg, 0,141 mmol)<autotext key="1271E17D" name="[Reactants]" index="3" field="Reactants" type="field" length="31"/> e a reação monitorada pela LC/MS. Quando completa a mistura de reação foi purificada pela cromatografia de fase reversa usando um gradiente de acetonitrila em água tamponada com 0,1 % de TFA como fase móvel para dar o composto do título como um sólido amorfo branco como o sal de TFA (56 % de rendimento). M/z = 933,6 Exemplo 29 Síntese de PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(valina- aciloxiisopropilóxi-MMAE) (3 %)
Figure img0154
[00549] A uma solução de PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %) (20 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 2) em 1 ml de NMP foi adicionado valina-aciloxiisopropilóxi-MMAE (9,98 mg, preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 28). A esta mistura foi adicionado HOAt (5,41 mg), EDC.HCl (7,62 mg) e DIEA (3,1 mg) A mistura de reação foi agitada durante a noite na temperatura ambiente e depois adicionada lentamente a uma solução aquosa agitada de NaCl (1 %, ~50 ml). A mistura bruta foi purificada pela diafiltração para dar o composto do título (21 % de rendimento com base em MMAE).
[00550] A carga de droga do produto conjugado (isto é, o conteúdo das unidades poliméricas contendo a droga) determinada pela LC/MS foi de 3,1 % por mol das unidades estruturais poliméricas (ou em média de cerca de 2,2 moléculas de MMAE-val-isopropil-aciloxiisopropilóxi por cadeia polimérica). O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 8,3 kDa. Exemplo 30. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(valina-aciloxiisopropilóxi-MMAE) (3 %))
Figure img0155
[00551] Conjugado A: Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa- BA (28 %)-(valina-aciloxiisopropilóxi-MMAE) (3 %)) foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(valina-aciloxiisopropilóxi-MMAE (3 %) (5,6 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 29) e TCEP TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados. A razão média de MMAE para trastuzumab foi de cerca de 11:1 a cerca de 15:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 171 kDa.
[00552] Conjugado B, Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa- BA (28 %)-(valina-aciloxiisopropilóxi-MMAE) (9 %)) foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(valina-aciloxiisopropilóxi-MMAE) (9 %) (31,7 mg, preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 30), trastuzumab (57 mg, TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados. A razão média de MMAE para trastuzumab foi de cerca de 12:1 a cerca de 16,5:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 224 kDa.
[00553] Conjugado C: Rituximab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(valina-aciloxiisopropilóxi-MMAE) (9 %)) foi preparado substituindo-se rituximab reduzido no procedimento descrito acima para Conjugado A. A razão de MMAE para rituxiumab foi de cerca de 9,5:1 a cerca de 13:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 202 kDa.
[00554] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 31. Síntese de trifluoroacetato de t-butilglicina AF-HPA
Figure img0156
[00555] À solução gelada do ácido de (R)-2-(terc- butoxicarbonilamino)-3,3-dimetilbutanóico (67,6 mg, 0,292 mmol)<autotext key="12991EA0" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="80"/> em DCM (5 ml)<autotext key="12991EA1" name="[Solvents]" index="1" field="Solvents" type="field" length="10"/> foi adicionado DCC (0,046 ml, 0,292 mmol)<autotext key="12991EA2" name="[Reactants]" index="3" field="Reactants" type="field" length="26"/> e a mistura de reação fria agitada por 15 a 20 min. Separadamente AF-HPA (134 mg, 0,146 mmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita na Patente US No. 8.685.383, Exemplo 18)<autotext key="12991EA3" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="305"/> e DMAP (53,6 mg, 0,438 mmol)<autotext key="12991EA4" name="[Reactants]" index="4" field="Reactants" type="field" length="26"/> em DCM (5 ml)<autotext key="12991EA5" name="[Solvents]" index="1" field="Solvents" type="field" length="10"/> foram esfriados, as duas misturas de reação foram combinadas e agitadas frias por 20 a 30 min depois na temperatura ambiente. A mistura de reação foi monitorada pela LC/MS. Depois de quatro horas a LC/MS indicou que a reação não foi completa. Uma segunda alíquota de aminoácido ativado e éster de DCC ativado (1 eq de cada em DCM) foi adicionado e a reação mista deixada agitar durante a noite na temperatura ambiente seguido pela purificação pela HPLC usando um gradiente de 25 a 90 % acetonitrila/água com a fase móvel tamponada com 0,1 % de TFA. AF-HPA-Boc-t-Butil Glicina foi obtida como um sólido amorfo branco como o sal de TFA (85 % de rendimento). M/z = 1016,6.
[00556] A uma solução gelada de AF-HPA-Boc-t-Butil Glicina, (140 mg, 0,124 mmol)<autotext key="129FE870" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="316"/> em DCM (5 ml)<autotext key="129FE871" name="[Solvents]" index="1" field="Solvents" type="field" length="10"/> foi adicionado TFA (0,477 ml, 6,19 mmol)<autotext key="129FE872" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="25"/> e a mistura de reação fria agitada por 1 hora depois na temperatura ambiente até a conclusão como indicado pela LC/MS. A mistura foi concentrada e o resíduo resultante purificado pela purificação pela HPLC usando um gradiente de acetonitrila/água de 10 a 90 % de acetonitrila tamponada com 0,1 % de TFA usada como fase móvel. O composto do título foi obtido como um sólido amorfo branco como o sal de TFA. M/z = 917,6 Exemplo 32 Síntese de PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(t- butilglicina AF-HPA) (7,5 %)
Figure img0157
[00557] A uma solução gelada de PHF-BA 10K(28 %)-PEG2-MI(2,7 %) (137 mg, 10,84 μmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 2)<autotext key="12F6EE1C" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="59" /> em água (5,5 ml)<autotext key="12F6EE1D" name="[Solvents]" index="2" field="Solvents" type="field" length="14" /> e NMP (1,375 ml)<autotext key="12F6EE1E" name="[Solvents]" index="1" field="Solvents" type="field" length="14" /> foi adicionado AF-HPA-t-butilglicina, (67 mg, 0,065 mmol, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 31)<autotext key="12F6EE1F" name="[Reactants]" index="4" field="Reactants" type="field" length="294" /> e a mistura resultante agitada fria por 15 min seguida pela adição de 1-hidroxipirrolidino-2,5-diona (15,59 mg, 0,135 mmol)<autotext key="12F6EE20" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="53" />. À mistura de reação foi adicionado EDAC (51,9 mg, 0,271 mmol)<autotext key="12F6EE21" name="[Reactants]" index="3" field="Reactants" type="field" length="96" />. Depois de 30 min uma segunda adição da mesma quantidade do reagente foi adicionada. Depois de 4 horas o pH foi ajustado até 5,6 com NaHCO3 0,1 N e uma alíquota adicional de EDAC (50 mg) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada durante a noite. O produto foi purificado pela filtração em gel e a HPLC de fase reversa.
[00558] A carga de droga do produto conjugado (isto é, conteúdo de unidades poliméricas contendo a droga) determinada pela 1H-RMN foi de 7,5 % por mol das unidades estruturais poliméricas (ou em média de cerca de 5,7 moléculas de t-butilglicina AF-HPA por cadeia polimérica). Exemplo 33. Síntese de Trastuzumab- ((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(t-butilglicina AF-HPA) (7,5 %))
Figure img0158
[00559] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(t-butilglicina AF-HPA) (7,5 %) (45,7 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 32), trastuzumab TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados. A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 4:1 a cerca de 6:1. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 215 kDa.
[00560] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 34. Síntese de Rituximab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(t-butilglicina-AF-HPA) (7,5 %))
Figure img0159
[00561] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 33 exceto rituximab e TCEP:rituximab 3,5:1 foram usados. A razão média de AF-HPA para rituximab foi de cerca de 2,5:1 a cerca de 3,5:1. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 202 kDa.
[00562] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 35. Síntese de trifluoroacetato de val-AF-HPA
Figure img0160
[00563] AF-HPA-Boc-valina foi preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 31 exceto ácido ((R)-2-(terc- butoxicarbonilamino)-3-metilbutanóico (63,5 mg, 0,292 mmol foi usado. A AF-HPA-Boc-valina foi obtida como um sólido amorfo branco como o sal de TFA (85 % de rendimento). M/z = 1002,6.
[00564] O composto do título foi preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 31 exceto AF-HPA-Boc-valina (128 mg, 0,115 mmol)<autotext key="12BF80C1" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="321"/> foi usada para dar 106 mg, 91 % de rendimento. M/z = 903,3 Exemplo 36. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(val-AF-HPA) (7,2 %))
Figure img0161
[00565] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(val AF-HPA) (7,2 %) (52,3 mg, preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 32), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados. A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 14,5:1 a cerca de 20:1. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 235 kDa.
[00566] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 37. Síntese de PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(Val-Cit- PABA-Arry 520) (2,9 %)
Figure img0162
[00567] A uma solução de PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(252 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 2) em 23 ml de NMP foi adicionado Arry 520-PABA-Val-Cit-NH2 (37,6 mg, preparado usando o procedimento descrito na Patente U.S. No. 8.815.226, Exemplo 84) em NMP (1 ml). A esta mistura foi adicionado HATU (22,8 mg) em NMP (1 ml) seguido pela DIEA (20,7 mg). A mistura de reação foi agitada 30 min na temperatura ambiente. A mistura bruta foi purificada pela diafiltração para dar o composto do título (47 % de rendimento com base em Arry 520).
[00568] A carga de droga do produto conjugado (isto é, conteúdo de unidades poliméricas contendo a droga) determinado por UV foi de 2,9 % por mol das unidades estruturais poliméricas (ou em média de cerca de 2,1 moléculas de Arry 520-PABA-Val-Cit per cadeia polimérica). O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 9,0 kDa. Exemplo 38. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(Val-Cit-PABA-Arry 520 (2,9 %))
Figure img0163
[00569] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,7 %)-(Val-Cit-PABA-Arry 520) (2,9 %) (55,6 mg, preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 38), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 2,5:1 foram usados. A razão de Arry 520 para trastuzumab foi de cerca de 4:1 a cerca de 6:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 245 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00570] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 39. Síntese de Rituximab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(Val-Cit-PABA-Arry 520 (2,9 %))
Figure img0164
[00571] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 38, exceto rituximab e TCEP:rituximab 2,5:1 foram usados. A razão média de Arry 520 para rituximab foi de cerca de 4:1 a cerca de 6:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 231 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00572] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 40. Síntese de sc-FvFc-Trastuzumab-((EG2-MI (2,8 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (8 %))
Figure img0165
[00573] O composto do título (“conjugado de scFvFc-trastuzumab polímero droga”, ou “trastuzumab scADC”) foi preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %)-EG2-MI (2,8 %)-AF-HPA-Ala (8 %) (2,2 mg preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 3 ou Exemplo 6) e anticorpo scFvFc trastuzumab e TCEP: anticorpo scFvFc trastuzumab 3:1 foram usados. A sequência do anticorpo scFvFc trastuzumab (proteína de fusão do anticorpo de cadeia única trastuzumab-Fc) é como publicada em Olafsen et al (Cancer Res. 65(13): 5907-16, 2005) com três modificações nas regiões constantes: a dobradiça tem uma mutação (C^S) para eliminar a cisteína desemparelhada que usualmente se liga com a constante de cadeia leve (Yang e Rader, Cloning, Expression and Purification of Monoclonal Antibody in scFv-Fc Format. Antibody Methods and Protocols. Ed. Proetzel e Ebersback, 2012). As duas outras modificações também são na sequência de IgG1. Olafsen et al 2005, criaram o Mutante Duplo Trastuzumab-scFv-Fc (H310A, H435Q) de modo a encurtar a meia-vida do fragmento de anticorpo para melhorar propósitos de formação de imagem. As modificações foram revertidas de volta para a sequência de IgG1 canônica.
[00574] A razão de AF-HPA para anticorpo scFvFc trastuzumab foi de cerca de 14:1 a cerca de 19:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 182 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para anticorpo scFvFc trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00575] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 41. Topotecan-alanina
Figure img0166
[00576] Topotecano (0,500 g, 1,19 mmol)<autotext key="0AF23D59" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="31" />, BOC-ala-OH (0,449 g, 2,37 mmol)<autotext key="0AF4BEFE" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="32" /> e N,N-dimetilpiridin-4-amina (0,145 g, 1,19 mmol)<autotext key="13D983B8" name="[Reactants]" index="4" field="Reactants" type="field" length="49" /> foram dissolvidos em CH2Cl2 anidro (5,93 ml)<autotext key="0AF23D5A" name="[Solvents]" index="1" field="Solvents" type="field" length="16" />. N,N’-metanodiilidenodiciclo- hexanamina (DCC) (0,580 g, 2,81 mmol)<autotext key="0AF23D5B" name="[Reactants]" index="3" field="Reactants" type="field" length="65" /> em CH2Cl2 anidro (1 ml) foi adicionada e a mistura agitada na temperatura ambiente por 18 horas. DCC adicional (300 mg, 1,45 mmol) foi adicionado e a mistura agitada por 48 horas. Os sólidos foram removidos via filtração e a solução lavada com HCl 0,1 N (2 x 5 ml), água (5 ml) e salmoura (5 ml), depois secada em MgSO4, seguido pela RP-HPLC eluindo com 0,1 % de TFA/CH3CN:0,1 % de TFA/água (coluna combiflash, C18, 100 G; 5 min 0 % de B, elevando para 100 % de B em 20 min) para dar Topotecan-BOC-alanina como um sólido (186,6 mg, 0,315 mmol, 26,5 % de rendimento).
[00577] Topotecano-BOC-alanina (186,6 mg, 0,315 mmol)<autotext key="13D983B8" name="[Reactants]" index="1" field="Reactants" type="field" length="57" /> foi dissolvido em CH2Cl2 anidro (1,5 ml)<autotext key="0AF23D5A" name="[Solvents]" index="1" field="Solvents" type="field" length="16" />. Ácido 2,2,2-trifluoroacético (1,205 ml, 15,74 mmol)<autotext key="0AF23D5B" name="[Reactants]" index="2" field="Reactants" type="field" length="48" /> foi adicionado e a mistura agitada na temperatura ambiente por 1 hora seguido pela RP-HPLC (C18, HPLC eluindo com 0,1 % de TFA:AcN / 0,1 % de TFA;Água) para dar o composto do título como um sólido laranja/amarelo (93,0 mg, 0,189 mmol, 60,0 % de rendimento)<autotext key="13F53BAF" name="[Products]" index="1" field="Products" type="field" length="65" />. Exemplo 42. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2,4 %)-(PHF 10 kDa-BA (22,3 %)-(topotecano alanina) (6,5 %))
Figure img0167
[00578] Conjugado A: Trastuzumab-((EG2-MI (2,4 %)-(PHF 10 kDa- BA (22,3 %)-(topotecano alanina) (6,5 %)) foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (22,3 %) EG2-MI (2,4 %)-(topotecano alanina) (6,5 %) (19,3 mg, tendo em média cerca de 4,2 moléculas de topotecano por cadeia polimérica, preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 3 ou Exemplo 6), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 3:1 foram usados. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 256 kDa. A razão média de topotecano para trastuzumab foi de cerca de 19:1 a cerca de 26:1. A razão média de conjugado de PHF- droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 5:1.
[00579] Conjugado B: Rituximab-((EG2-MI (2,4 %)-(PHF 10 kDa-BA (22,3 %)-(topotecano alanina) (13 %)) foi preparado substituindo-se rituximab reduzido no procedimento descrito acima. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 212 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para rituxiumab foi de cerca de 16:1 a cerca de 22:1.
[00580] O trastuzumab-((EG2-MI)-(PHF 10 kDa-BA)-(topotecano valina) é preparado usando o procedimento descrito acima exceto PHF-BA 10K EG2-MI-(topotecano valina), preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 41 é usado.
[00581] Outros conjugados de PBRM-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina como descritos acima. Também conjugados de PBRM-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e carga de droga. Exemplo 43. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI (2,8 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (7,3 %))
Figure img0168
[00582] O composto do título foi preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 4 ou Exemplo 7 exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,8 %)-(HPV-Ala (7,2 %) (8,36 mg, preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 3 ou Exemplo 6), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 2,5:1 foram usados.
[00583] Conjugado A: Trastuzumab-((EG2-MI (2,8 %)-(PHF 10 kDa- BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (7,3 %)). A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 6:1 a cerca de 9:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 183 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00584] Conjugado B: Trastuzumab-((EG2-MI (2,5 %)-(PHF 10 kDa- BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (8,4 %)) foi preparada em uma maneira similar àquela como descrita neste exemplo acima exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2- MI (2,5 %)-(HPV-Ala (8,4 %) (preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 3 ou Exemplo 6), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 3,5:1 foram usados. A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 12:1 a cerca de 17:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 218 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00585] Conjugado C: Trastuzumab-((EG2-MI (2,5 %)-(PHF 10 kDa- BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (8,4 %)) foi preparada em uma maneira similar àquela como descrita neste exemplo exceto PHF-BA 10K (28 %) EG2-MI (2,8 %)-(HPV-Ala (8,4 %) (preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 3 ou Exemplo 6), trastuzumab e TCEP:trastuzumab 2,75:1 foram usados. A razão de AF-HPA para trastuzumab foi de cerca de 12:1 a cerca de 16:1. O peso molecular do conjugado do título foi de cerca de 247 kDa. A razão média de conjugado de PHF-droga para trastuzumab foi de cerca de 2:1 a cerca de 4:1.
[00586] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 44. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI)-(PHF 10 kDa-BA)-(SN38 alanina)
Figure img0169
[00587] O composto do título é preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 42 exceto PHF-BA 10K EG2-MI-(SN38 alanina), preparado usando o procedimento descrito no Exemplos 42 e 41 é usado.
[00588] Trastuzumab-((EG2-MI)-(PHF 10 kDa-BA)-(SN-38 valina) é preparado usando o procedimento descrito acima exceto PHF-BA 10K EG2- MI-(SN-38 valina), preparado usando o procedimento descrito no Exemplos 41 e 42 é usado.
[00589] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero. Exemplo 45. Síntese de Trastuzumab-((EG2-MI)-(PHF 10 kDa-BA)- (camptotecina-alanina)
Figure img0170
[00590] O composto do título pode ser preparado usando o procedimento descrito no Exemplo 42 exceto PHF-BA 10K EG2-MI- (camptotecina alanina), preparado usando o procedimento descrito nos Exemplos 42 e 41 é usado.
[00591] Trastuzumab-((EG2-MI)-(PHF 10 kDa-BA)-(camptotecina valina) é preparado usando o procedimento descrito acima exceto PHF-BA 10K EG2-MI-(camptotecina valina), preparado usando o procedimento descrito nos Exemplos 41 e 42 é usado.
[00592] Outros conjugados de PBRM-polímero-droga são sintetizados com os métodos similares ao procedimento descrito acima, envolvendo outros derivados de PBRM, tais como, por exemplo, formas parcialmente reduzidas de cetuximab, rituximab, bevacizumab, nimotuzumab, gemtuzumab, alemtuzumab, lintuzumab, anticorpos anti-5T4 ou anti-Mesotelina. Também conjugados de PBRM-polímero-droga com razões variáveis de droga para PBRM são obtidos variando-se o número de grupos sulfidrila da PBRM e a carga de droga do conjugado de droga-polímero.
Exemplo 46. Ensaio de viabilidade celular para os conjugados de PBRM- polímero-droga
[00593] Os conjugados de PBRM-polímero-droga foram avaliados quanto às suas propriedades antiproliferação em linhagens de célula de tumor in vitro usando Cell Titer-Glo (Promega Corp). As células foram plaqueadas em placa de 96 poços de parede preta e deixadas aderir durante a noite a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5 % de CO2. SKBR3, BT474, células NCI- N87 (células que expressam HER2), células MCF7 (células de nível de expressão baixo de HER2) e células JIMT1 (células de nível de expressão médio de HER2) foram plaqueadas em uma densidade de 5.000 células por poço. No dia seguinte o meio foi substituído com 50 μl de meio fresco e 50 μl de 2x estoques de conjugado de PBRM-polímero-droga, conjugado de polímero droga ou droga foram adicionados aos poços apropriados, misturados e incubados por 72 h. O reagente Cell Titer-Glo foi adicionado aos poços na temperatura ambiente e o sinal luminescente foi medido depois de 10 min usando uma leitora de placa SpectraMax M5 (Molecular Devices). As curvas de dose resposta foram geradas usando Software SoftMax Pro. Os valores de IC50 foram determinados a partir de ajuste de curva de quatro parâmetros.
[00594] As células HL-60 que expressam CD33 foram passadas em uma densidade de 5.000 células por reservatórios e tratadas com conjugado de PBRM-polímero-droga no mesmo dia. Depois de 72 h de incubação, as células foram analisadas usando o mesmo procedimento descrito acima.
[00595] As células de expressão OVCAR-3, TF-1α e HCT-15 foram plaqueadas e analisadas usando o mesmo procedimento descrito acima.
[00596] As linhagens de célula A431 que expressam 5T4 (A431, uma linhagem de célula de carcinoma epidermóide disponível da American Type Culture Collection (ATCC), Manassas Virginia US, sob o número de acesso ATCC®CRL-1555); PC3 (uma linhagem de célula prostática humana, ATCC® CRL-1435), MDAMB231-5T4 OE e células de expressão da linhagem de célula de controle negativo alvo LLC1 (células de carcinoma de célula pulmonar, negativas quanto à expressão de 5T4) foram plaqueadas e analisadas usando o mesmo procedimento descrito acima. “MDAMB231-5T4 OE” significa células MDA-MB-231 recombinantes que super expressam 5T4 (geradas pela transfecção estável; divulgadas no Pedido Provisório US Número 61/835.858, depositado em 17 de junho de 2013, que é aqui incorporado por referência).
[00597] As Tabelas I a III são resultados ilustrativos para as propriedades de antiproliferação do conjugado de PBRM-polímero-droga nas células que expressam HER2 (Tabelas I), células que expressam CD33 (Tabela II) ou células que expressam 5T4 (Tabela III).
[00598] A Tabela IV são resultados ilustrativos para as propriedades antiproliferação da droga, AF-HPA em linhagens de célula OVCAR-3 e TF- 1α.
[00599] A Tabela I lista os resultados para o conjugado de PBRM- polímero-droga Trastuzumab-((EG2-MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)- (AF-HPA-Ala (8 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a 17:1), Exemplo 4; Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF- HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 16:1 a cerca de 21:1), Exemplo 7; Trastuzumab-((EG2-MI (1 %))-(PHF 10 kDa-GA (29 %)-(AF- HPA-Ala (6 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 18:1 a cerca de 23:1), Exemplo 13; Trastuzumab-((EG2-MI (2 %))-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF- HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 10:1 a cerca de 15:1), Exemplo 14; Trastuzumab-((EG2-MI (2 %))-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF- HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 11:1 a cerca de 16:1), Exemplo 15; e Rituximab-((EG2-MI (2 %))-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF- HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 13:1 a cerca de 18:1), Exemplo 16; Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF- HPA-Ala (9 %), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 5:1 a cerca de 10:1), Exemplo 17; Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF- HPA-Ala (9 %), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 19:1 a cerca de 24:1), Exemplo 18A; (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 20:1 a cerca de 25:1), Exemplo 18B; (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 23:1 a cerca de 28:1), Exemplo 18C; Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)- (HPV-Ala (14 %)), Exemplo 20A; Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(HPV-Ala (7,7 %)), Exemplo 20B; Trastuzumab-((EG2-MI (3,5 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(HPV-Ala (4,3 %)), Exemplo 20C; sc- FvFc-Trastuzumab-((EG2-MI (2,8 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA- Ala (8 %)), Exemplo 40; Trastuzumab-((EG2-MI (2,8 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (7,3 %) AF-HPA:trastuzumab de cerca de 6:1 a cerca de 9:1), Exemplo 43A; Trastuzumab-((EG2-MI (2,5 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (8,4 %), AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a cerca de 16:1), Exemplo 43C; livre de droga (AF-HPA); e Kadcyla®. Tabela I
Figure img0171
Figure img0172
[00600] Os resultados na Tabela I mostram que, para as linhagens de célula que expressam HER2 SKBR3, BT474, N87 e JIMT1, os conjugados de PBRM-polímero-droga (Exemplo 4, Exemplo 7, Exemplos 13 a 15, Exemplo 17, Exemplos 18A a 18C, Exemplo 20A, Exemplo 43A e Exemplo 43C) exibiram atividade antiproliferativa mais alta quando comparados à linhagem de célula MCF7 que expressa HER2 baixo e quando comparados ao conjugado de PBRM-polímero-droga de controle (Exemplo 16) ou Kadcyla®.
[00601] A Tabela II lista os resultados para Lintuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA: lintuzumab cerca de 10:1 a cerca de 15:1), Exemplo 8; e Rituximab-((EG2-MI (3 %)- (PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %)) (AF-HPA: rituximab cerca de 13:1 a cerca de 18:1), Exemplo 9; e droga livre (AF-HPA). Tabela II
Figure img0173
[00602] Os resultados na Tabela II mostram que, para a linhagem de célula HL-60 que expressa CD33 o conjugado de PBRM-polímero-droga (Exemplos 8) exibiu atividade antiproliferativa mais alta comparado ao conjugado de PBRM-polímero-droga de controle (Exemplo 9).
[00603] A Tabela III lista os resultados para o conjugado de PBRM- polímero-droga Anti-5T4-((EG2-MI (3 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF- HPA-Ala (8 %)), (AF-HPA:anti-5T4 cerca de 12:1 a cerca de 18:1), Exemplo 10; e Rituximab-((EG2-MI (3 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %))), (AF-HPA:rituximab cerca de 13:1 a cerca de 18:1), Exemplo 9; e droga livre (AF-HPA). Tabela III
Figure img0174
* Resultados de dois experimentos diferentes.
[00604] Os resultados na Tabela III mostram que, para as linhagens de célula A431, PC3 e MDAMB231OE que expressam 5T4 o conjugado de PBRM-polímero-droga (Exemplo 10) exibiu atividade antiproliferativa mais alta em relação ao conjugado de PBRM-droga de controle (Exemplo 9) e às células alvo que não de expressão LLC1.
[00605] A Tabela IV lista os resultados para a droga livre (AF-HPA). Tabela IV
Figure img0175
Exemplo 47. Estudos de aglutinação de ligante pela Ressonância plasmônica de superfície (SPR) BIAcore
[00606] A aglutinação cinética do conjugado de PBRM-polímero- droga a um receptor imobilizado é determinada pela SPR BIAcore. As constantes de ligação para a PBRM no conjugado de PBRM-polímero-droga e PBRM sozinha podem ser determinados usando procedimentos BIAcore padrão.
[00607] Usando a química da ligação de amina padrão, hErbB2 é imobilizado em três canais de fluxo para a superfície de chip sensor da ressonância plasmônica de superfície em três densidades similares. Trastuzumab facilmente ligou ao hErbB2 imobilizado demonstrando deste modo que ambos os parceiros de ligação foram ativos. Os parâmetros de ligação ka (associação ou constante da taxa de afinidade) e KD (constante de dissociação) são medidas a 25 oC para o conjugado de PBRM-polímero-droga e PBRM usando um biossensor óptico ProteOn XPR36 da BioRad equipado com um chip sensor GLC e equilibrado com tampão de condução.
[00608] Os resultados mostram que a PBRM no conjugado de PBRM- polímero-droga é reconhecida pelo receptor de PBRM e que a ligação da PBRM no conjugado de PBRM-polímero-droga não é significantemente afetado em relação à PBRM não conjugada.
Exemplo 48. Ensaio de Ligação de FACS
[00609] A ligação de superfície celular do conjugado de PBRM- polímero-droga Trastuzumab-((EG2-MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)- (AF-HPA-Ala (8 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a 17:1), Exemplo 4, foi avaliada usando o citômetro de fluxo de bancada digital MACSQuant® Analyzer 10 em linhagens de célula cancerosa humana diferentes. 100.000 células foram incubadas em soro de cabra a 6 % em gelo. O conjugado de PBRM-polímero-droga ou PBRM não conjugada foram adicionados às células e incubados em gelo por três horas, depois as células foram lavadas com PBS gelado e incubadas com os anticorpos secundários fluorescentemente rotulados em gelo por uma hora. Na conclusão, as células foram lavadas com PBS, fixadas com 1 % de paraformaldeído e analisadas pelo citômetro de fluxo. A ligação à superfície da célula do conjugado de PBRM-polímero-droga foi determinada por titulação e comparada com aquela da PBRM não conjugada.
[00610] A Tabela V dá a constante de ligação (Kd) de conjugado de PBRM-polímero-droga Trastuzumab-((EG2-MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a 17:1), Exemplo 4 e trastuzumab sozinho às células JIMT-1. Tabela V
Figure img0176
[00611] Os resultados mostram que a ligação à superfície da célula da PBRM no conjugado de PBRM-polímero-droga foi comparável com aquele da PBRM não conjugada.
[00612] A ligação à superfície da célula da PBRM em outros conjugados de PBRM-polímero-droga às outras células cancerosas humanas pode ser determinada e deve ser comparável àquela da PBRM não conjugada. Exemplo 49. Estudos de Aglutinação de ligante pela Ressonância Plasmônica de Superfície BIAcore (SPR)
[00613] A ligação cinética do conjugado de PBRM-polímero-droga a um receptor imobilizado foi determinada por BIAcore SPR. As constantes de ligação para a PBRM nos conjugados de PBRM-polímero-droga tais como Trastuzumab-((EG2-MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a 17:1), Exemplo 4; Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 16:1 a cerca de 21:1), Exemplo 7, Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 5:1 a 10:1), Exemplo 17; e Trastuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 19:1 a 24:1), Exemplo 18A; (AF- HPA:trastuzumab de cerca de 20:1 a 25:1), Exemplo 18B; (AF- HPA:trastuzumab de cerca de 23:1 a 28:1), Exemplo 18C; PBRM in PBRM- droga conjugado (isto é, Kadcyla®) e PBRM (isto é, trastuzumab) sozinha foram determinadas usando procedimentos BIAcore padrão.
[00614] Usando a química da ligação de amina padrão, a hErbB2 foi imobilizada em três canais de fluxo à superfície de chip sensor da ressonância plasmônica de superfície em três densidades similares. Trastuzumab facilmente se ligou à hErbB2 imobilizada demonstrando deste modo que ambos os parceiros foram ativos. A Tabela VI fornece os parâmetros de ligação ka (constante de associação ou da taxa de afinidade), kd (constante da taxa de dissociação) e KD (constante de dissociação) medida a 25 oC para os conjugados do Exemplo 4 e Exemplo 7 e trastuzumab usando um biossensor óptico ProteOn XPR36 da BioRad equipado com um chip sensor GLC e equilibrado com tampão de condução. Tabela VI
Figure img0177
[00615] Os resultados mostram que a PBRM no conjugado de PBRM- polímero-droga foi reconhecida pelo receptor de PBRM.
Exemplo 50. Estudos de eficácia in vivo, farmacocinética e biodistribuição
[00616] A fim de avaliar a eficácia e farmacocinética do conjugado proteína-droga, modelos de xenoenxertos subcutâneos e ortotópicos de camundongo e rato são usados.
[00617] Os artigos de teste, junto com os controles apropriados são administrados intravenosamente (IV) via injeção cauda-veia ou intraperitonealmente. Para verificar os níveis de circulação do artigo do teste a amostra de sangue é coletada em tempos designados via punção cardíaca terminal. As amostras foram mantidas em temperatura ambiente durante 30 min. para coagular, então centrifugadas durante 10 min. a 1.000x g a 4 °C e imediatamente congeladas a-80 °C. As concentrações totais de PBRM nas amostras de soro foram medidas usando ELISA. A concentração de droga circulando (conjugado e livre) é determinada pela métodos de LC/MS /MS.
[00618] Para verificar a eficácia dos conjugados de PBRM-polímero- droga o tamanho do tumor é medido usando calibradores digitais. O volume o tumor é calculado e usado para determinar o atraso no crescimento de tumor.
[00619] Para determinação da biodistribuição da droga, tumor e órgãos principais como, por exemplo, fígado, rim, baço, pulmão, coração, músculos e cérebro são coletados, imediatamente congelados em nitrogênio líquido, armazenados a-80 °C. Os níveis de PBRM e/ou droga são determinados em tecidos homogeneizados por métodos padrão, como, por exemplo, os métodos ELISA ou LC/MS /MS respectivamente.
Exemplo 51. Distribuição em Tecido de Camundongo Depois da Administração de Conjugados de PBRM-Polímero-Droga
[00620] Camundongos SCID CB-17 fêmeas foram inoculados subcutaneamente com tumores BT474 (n = 4 para cada grupo). Veículo ou conjugados de PBRM-polímero-droga:Trastuzumab-((EG2-MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a cerca de 17:1), Exemplo 4, a 5 mg/kg; e Trastuzumab-((EG2-MI (1 %))-(PHF 10 kDa-GA (29 %)-(AF-HPA-Ala (6 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 18:1 a cerca de 23:1), Exemplo 13, a 5 mg/kg foram dosados IV como uma dose única no dia 1.
[00621] Em 48 horas após a administração, os camundongos foram sacrificados e o sangue foi coletado pela cardíaca terminal. Os órgãos: rim esquerdo, fígado, pulmão, músculo esqueletal, baço e o tumor foram colhidos, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C até a análise para AF-HPA e AF conjugadas, livres.
[00622] As Tabelas VII, VIII e VIIIA dão a concentração da droga conjugada (AF-HPA conjugada, isto é, PBRM-PHF-AF-HPA); droga não conjugada (livre) (isto é, AF-HPA e AF); AF-HPA livre e AF livre em tecidos diferentes. As concentrações são relatadas como ng de equivalente de AF- HPA (e/ou AF) /g de tecido como valor médio ± desvio padrão. Tabela VII
Figure img0178
Figure img0179
Tabela VIII Concentrações totais de AF-HPA e AF não conjugadas
Figure img0180
Concentrações de AF-HPA não conjugada e AF não conjugada
Figure img0181
[00623] Os resultados mostram que no tecido a AF-HPA não conjugada liberada é metabolizada adicionalmente para AF ao passo que no plasma a AF-HPA não conjugada não é convertida para AF.
Exemplo 52. Resposta de Crescimento de tumor à Administração de Conjugados de PBRM-Polímero-Droga
[00624] Camundongos SCID CB-17 fêmea foram inoculados subcutaneamente com tumores BT474 (n = 10 para cada grupo) ou células JIMT-1 (n = 10 para cada grupo) ou células NCI-N87 (n = 10 para cada grupo). Os camundongos NCr nu/nu fêmeas foram inoculados subcutaneamente com células HL-60 (n = 10 para cada grupo). os compostos de teste ou veículo foram dosados IV como uma dose única no dia 1. O tamanho de tumor foi medido nos tempos indicados nas Figuras 1 a 9 usando calibres digitais. O volume do tumor foi calculado e foi usado para determinar o retardo no crescimento de tumor. Os camundongos foram sacrificados quando os tumores atingiram um tamanho de 1000 mm3. Os volumes de tumor são relatados como a média ± SEM para cada grupo.
[00625] A Figura 1 fornece os resultados para a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com tumores BT474 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo; PBRM (trastuzumab) a 10 mg/kg; conjugados de PBRM-polímero- droga Trastuzumab-((EG2-MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA- Ala (8 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a cerca de 17:1), Exemplo 4, a 2,5 mg/kg e 5 mg/kg; ou Trastuzumab-((EG2-MI (1 %))-(PHF 10 kDa- GA (29 %)-(AF-HPA-Ala (6 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 18:1 a cerca de 23:1), Exemplo 13, a 2,5 mg/kg e 5 mg/kg. Os resultados mostram a redução do volume do tumor para os exemplos 4 e 13 com 100 % de regressões a 5 mg/kg de dose e 100 % e 80 % de sobrevivência livre de tumor respectivamente. O veículo e trastuzumab sozinho, mostraram um aumento do volume do tumor. A conjugação de uma PBRM específica para HER2 (trastuzumab) a um conjugado de droga-polímero foi necessária para a redução do volume do tumor visto que a PBRM sozinha não mostrou a redução no volume do tumor).
[00626] A Figura 2 fornece os resultados para a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células JIMT-1 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV do veículo; PBRM (trastuzumab) a 10 mg/kg; conjugados de PBRM-polímero-droga Trastuzumab-((EG2-MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a cerca de 17:1), Exemplo 4, a 2,5 mg/kg; ou Trastuzumab- ((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF- HPA:trastuzumab de cerca de 16:1 a cerca de 21:1), Exemplo 7, a 2,5 mg/kg. Os resultados mostram a redução do volume do tumor tanto para o Exemplo 4 quanto o 7. Especificamente, no grupo testado administrado com o conjugado descrito no Exemplo 4, houve 100 % de regressões a 2,5 doses consistindo em nove regressões completas (um animal morreu devido à morte não relacionada com o tratamento) e três sobreviventes livres de tumor. No grupo testado administrado com o conjugado descrito no Exemplo 7, houve 100 % de regressões, consistindo em regressões completas, todos permaneceram livres de tumor (dois animais morreram livres de tumor no final do estudo devido à morte não relacionada com o tratamento). O veículo e trastuzumab sozinho, mostraram um aumento do volume do tumor. A conjugação de uma PBRM específica para HER2 (trastuzumab) a um conjugado de droga polímero foi necessária para a redução do volume do tumor visto que a PBRM sozinha não mostrou redução no volume do tumor).
[00627] Camundongos NCr nu/nu fêmeas foram inoculados subcutaneamente com células HL-60 (n = 10 para cada grupo). Os compostos de teste ou veículo foram dosados IV como uma dose única no dia 1. O tamanho do tumor foi medido nos tempos indicados na Figura 3 usando calibres digitais. O volume do tumor foi calculado e foi usado para determinar o retardo no crescimento de tumor. Os camundongos foram sacrificados quando os tumores atingiram um tamanho de 2000 mm3. Os volumes do tumor são relatados como a média ± SEM para cada grupo.
[00628] A Figura 3 fornece os resultados para a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células HL-60 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo; PBRM (lintuzumab) a 20 mg/kg; ou conjugados de PBRM-polímero- droga Lintuzumab-((EG2-MI (2 %)-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:lintuzumab cerca de 10:1 a cerca de 15:1), Exemplo 8, 20 mg/kg. Os resultados mostram a redução do volume do tumor para o Exemplo 8 com 100 % de regressões e 70 % de sobrevivência livre de tumor no dia 44. O veículo e lintuzumab sozinho, mostraram um aumento do volume do tumor. A conjugação de uma PBRM específica para CD33 (lintuzumab) a um conjugado de droga polímero foi necessário para a redução do volume do tumor visto que a PBRM sozinha não mostrou a redução no volume do tumor.
[00629] A Figura 4 fornece os resultados para a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células JIMT-1 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo; PBRM (trastuzumab) a 20 mg/kg; Kadcyla® (um conjugado de PBRM-droga) a 20 mg/kg; ou conjugado de PBRM-polímero-droga Trastuzumab-((EG2-MI (2 %))-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 10:1 a cerca de 15:1), Exemplo 14, a 2 mg/kg, 0,67 mg/kg ou 0,3 mg/kg. Os resultados mostram a redução do volume do tumor para o Exemplo 14 com 100 % de regressões a 2,0 doses e 100 % de sobrevivência livre de tumor. O veículo, Kadcyla® e trastuzumab sozinhos, mostraram um aumento do volume do tumor. A conjugação de uma PBRM específica para HER2 (trastuzumab) a um conjugado de droga polímero foi necessária para a redução do volume do tumor visto que a PBRM sozinha não mostrou redução no volume do tumor.
[00630] A Figura 5 fornece os resultados para a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células NCI-N87 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo, ou conjugado de PBRM-polímero-droga Trastuzumab-((EG2-MI (2 %))-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF- HPA:trastuzumab de cerca de 11:1 a cerca de 16:1), Exemplo 15, a 3 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,3 mg/kg. Os resultados mostram uma dose resposta para conjugado de PBRM-polímero-droga (Exemplo 15) com a dose mais alta de 3 mg/kg mostrando regressão completa do volume do tumor com 100 respostas completas. Na dose intermediária de 1 mg/kg houve 7 regressões parciais e 1 completa dos 10 animais.
[00631] A Figura 6 fornece os resultados para a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células NCI-N87 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo, conjugados de PBRM-polímero-droga Trastuzumab-((EG2-MI (2 %))-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 11:1 a cerca de 16:1), Exemplo 14, a 0,67 mg/kg ou Rituximab- ((EG2-MI (2 %))-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (9 %)), (AF- HPA:trastuzumab de cerca de 13,7 a cerca de 18,7), Exemplo 16, a 3 mg/kg. Os resultados mostram uma resposta de retardo no crescimento de tumor para o conjugado de PBRM-polímero-droga (Exemplo 14). O veículo ou conjugado de Rituximab-droga polímero (Exemplo 16) na dose de 3 mg/kg não tem nenhum efeito sobre o crescimento de tumor.
[00632] A Figura 7 fornece os resultados para a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células NCI-N87 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo, conjugados de PBRM-polímero-droga Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(t-butilglicina AF-HPA) (7,5 %)), (AF- HPA:trastuzumab de cerca de 4:1 a cerca de 6:1) Exemplo 33, a 0,67 mg/kg; Trastuzumab-((EG2-MI (2,8 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (7,3 %)) (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 6:1 a cerca de 9:1), Exemplo 43A a 1 mg/kg; ou Trastuzumab-((EG2-MI (2,5 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF- HPA-Ala (8,4 %)), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a cerca de 16:1), Exemplo 43C a 0,67 mg/kg ou 3 mg/kg. Os resultados mostram uma resposta de retardo no crescimento de tumor para o conjugado de PBRM-polímero- droga Exemplo 43C na dose de 0,67 mg/kg e a dose de 3 mg/kg mostrou 90 % de sobrevivência livre de tumor no dia 115.
[00633] A Figura 8 fornece os resultados para a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células NCI-N87 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo, conjugado polímero-droga PHF-BA 10K (30 %)-AF-HPA-Ala (9,5 %), Exemplo 5A a 0,22 mg/kg; ou conjugados de PBRM-polímero-droga Trastuzumab-((EG2-MI (2,7 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(valina- aciloxiisopropilóxi-MMAE) (9 %)), (MMAE:trastuzumab de cerca de 12:1 a cerca de 16,5:1) Exemplo 30B, a 2 mg/kg; Rituximab-((EG2-MI (2,7 %)- (PHF 10 kDa-BA (28 %)-(valina-aciloxiisopropilóxi-MMAE) (9 %)) (MMAE:rituximab cerca de 9,5:1 a cerca de 13:1), Exemplo 30C a 2 mg/kg; sc-FvFc-Trastuzumab-((EG2-MI (2,8 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF- HPA-Ala (8,1 %)), (AF-HPA: scFvFc trastuzumab anticorpo cerca de 14:1 a cerca de 19:1), Exemplo 40 a 0,67 mg/kg; ou Trastuzumab-((EG2-MI (2,5 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (8,4 %), (AF-HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a cerca de 17:1), Exemplo 43B a 1 mg/kg; ou semanalmente dosado durante 3 semanas com Trastuzumab-((EG2-MI (2,65 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(Val-Cit-PABA-Arry 520 (2,9 %)), (Arry 520:trastuzumab de cerca de 4:1 a cerca de 6:1), Exemplo 38 a 10 mg/kg; ou semanalmente dosado durante 3 semanas com Rituximab- ((EG2-MI (2,65 %)-(PHF 10 kDa- BA (28 %)-(Val-Cit-PABA-Arry 520 (2,9 %)), (Arry 520:trastuzumab de cerca de 4:1 a cerca de 6:1), Exemplo 39 a 10 mg/kg; Os resultados mostram uma resposta de retardo do crescimento de tumor para o conjugado de PBRM- polímero-droga (Exemplo 40 e Exemplo 43B).
[00634] A Figura 9 fornece os resultados para a resposta de tumor em camundongos inoculados subcutaneamente com células JIMT-1 (n = 10 para cada grupo) depois da administração IV como uma dose única no dia 1 do veículo, ou sc-FvFc-Trastuzumab-((EG2-MI (2,8 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (8,1 %)), (AF-HPA: anticorpo scFvFc trastuzumab de cerca de 14:1 a cerca de 19:1), Exemplo 40 a 1 mg/kg; ou Trastuzumab-((EG2-MI (2,5 %)-(PHF 10 kDa-BA (28 %)-(AF-HPA-Ala (8,4 %)), (AF- HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a cerca de 16:1), Exemplo 43C a 2 mg/kg. Exemplo 53. PK de Plasma de Camundongo depois da Administração de Conjugados de PBRM-Polímero-Droga
[00635] Camundongos fêmea CD-1 foram deixados aclimatizar por pelo menos 4 dias antes da dosagem inicial. Todos os camundongos foram providos com ração regular e água ad libitum e não foram jejuados antes da administração de composto. Os compostos de teste ou veículo foram dosados IV como uma dose única no dia 1.
[00636] Os camundongos foram injetados intravenosamente com veículo (n = 3) ou com conjugado de PBRM-polímero-droga, Trastuzumab- ((EG2-MI (3 %))-(PHF 10 kDa-BA (30 %)-(AF-HPA-Ala (8 %))), (AF- HPA:trastuzumab de cerca de 12:1 a cerca de 17:1), Exemplo 4, a 5 mg/kg, n = 3 para cada grupo). O plasma foi coletado a 5 min, 1 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, dia 7 e dia 14 após a dosagem. O peso corporal foi medido antes da dosagem no dia 1 e nos dias 1, 7 e 14. Todos os animais foram observados por todo o período de catorze dias quanto à mortalidade ou morbidez.
[00637] As concentrações de AF-HPA conjugada e droga não conjugada (livre) (tal como AF-HPA e AF) foram determinadas pela análise de LC/MS. A concentração de trastuzumab total foi determinada por ELISA.
[00638] Os resultados na Figura 10 mostraram que o trastuzumab teve uma concentração plasmática de ~100 μg/ml e uma meia-vida de ~12 dias ao passo que a AF-HPA e AF não conjugadas tiveram uma concentração plasmática total de < 1 ng/ml. O conjugado de PBRM-polímero-droga teve uma meia-vida de >5 dias com uma AUC0 para inf de ~300 μg.dia/ml.
Exemplo 54. PK Plasmático de Camundongo depois da Administração de Conjugados de PBRM-Polímero-Droga
[00639] Camundongos CD-1 fêmeas foram deixadas aclimatizar por pelo menos 4 dias antes da dosagem inicial. Todos os camundongos foram providos com ração regular e água ad libitum e não foram jejuados antes da administração do composto. Os compostos de teste ou veículo foram dosados IV como uma dose única no dia 1.
[00640] Os camundongos foram injetados intravenosamente com veículo (n = 3) ou com conjugados de PBRM-polímero-droga, como descrito nos Exemplos 4, 7, 18A, 18B e 18C. O plasma foi coletado a 5 min, 1 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, dia 7 e dia 14 após a dosagem. O peso corporal foi medido antes da dosagem no dia 1 e nos dias 1, 7 e 14. Todos os animais foram observados por todo o período de catorze dias quanto à mortalidade ou morbidez.
[00641] A AF-HPA total (as concentrações de AF-HPA conjugada e droga não conjugada (livre) (tal como AF-HPA e AF) foram determinadas pela análise de LC-MS/MS. Tabela IX Plasma PK
Figure img0182
[00642] Os resultados na Tabela IX mostraram que os conjugados de PBRM-polímero-droga tiveram uma meia-vida de ~120 - 154 horas (~ 5 a 6,4 dias) com uma AUC0 a 336 de ~19 a 25 μg*h/ml e foram independentes da razão de AF-HPA para trastuzumab dos conjugados de PBRM-polímero- droga.
Exemplo 55: Tolerabilidade do conjugado de PBRM-polímero-droga (estudo MTD)
[00643] A tolerabilidade do conjugado de PBRM-polímero-droga foi estimada em camundongos CD-1 fêmeas. O conjugado de PBRM-polímero- droga, Exemplo 4, foi administrado como uma única dose IV em uma dose de 20 mg/kg, 40 mg/kg, 60 mg/kg (n = 6 para cada grupo). O grupo de controle de veículo recebeu solução salina fisiológica. Os animais foram monitorados quanto aos sinais clínicos em um período de vinte e um dias. Os pesos corporais individuais de todos os animais do estudo foram registrados no dia zero (linha de base), a cada dia durante os primeiros cinco dias e aproximadamente a cada segundo dia daí em diante. Os resultados estão resumidos na Tabela X. Tabela X
Figure img0183
[00644] A dose de 20 mg/kg foi bem tolerada, nenhuma perda de peso corporal foi observada em nenhum dos camundongos neste grupo. Na dose de 40 mg/kg a perda de peso corporal máxima de ~20 % foi observada no dia 7. Um animal neste grupo foi encontrado morto no dia 7 e teve ~12 % de perda de peso corporal no dia anterior. No final do estudo (Dia 21) todos os animais que sobreviveram (5 dos 6) neste grupo de estudo ganharam peso em relação ao grupo de controle. A dose de 60 mg/kg claramente excedeu a dose máxima tolerada visto que todos os animais neste grupo tiveram perda de peso corporal significante no dia 7 e foram moribundos e foram sacrificados no dia 9.
[00645] Os resultados mostram que a dose tolerada máxima para o camundongo foi entre 20 e 40 mg/kg. Exemplo 56: Tolerabilidade da Auristatina F-hidroxipropilamida (estudo MTD)
[00646] A tolerabilidade da Auristatina F-hidroxipropilamida (AF- HPA) foi estimada em camundongos CD-1 fêmeas. A AF-HPA, (preparada em uma maneira similar àquela como descrita na US 13/493.899, agora a Patente US 8.685.383, Exemplo 48), foi administrada como uma dose IV única em uma dose de 1,6 mg/kg, 3,2 mg/kg, 4,7 mg/kg (n = 6 para cada grupo). O grupo de controle de veículo recebeu solução salina fisiológica. Os animais foram monitorados quanto aos sinais clínicos em um período de vinte e um dias. Os pesos corporais individuais de todos os animais de estudo foram registrados no dia zero (linha de base), a cada dia durante os primeiros cinco dias e aproximadamente a cada segundo dia daí em diante. Os resultados estão resumidos na Tabela XI. Tabela XI
Figure img0184
[00647] A dose de 1,6 mg/kg foi aceitavelmente tolerada, com 11,6 % de perda de peso corporal observada no dia 7. Os animais se recuperaram completamente no Dia 21 com 5,5 % de aumento no peso corporal em relação à sua linha de base do grupo. Na dose de 3,2 mg/kg, 1 animal morreu no dia 7, 3 animais foram moribundos e sacrificados no dia 7. No final do estudo (Dia 21) 2 dos 6 animais sobreviveram. A dose de 4,7 mg/kg claramente excedeu a dose tolerada máxima visto que todos os animais neste grupo morreram, ou foram moribundos e sacrificados.
Exemplo 57. Estimativa da afinidade e cinéticas de ligação do conjugado scFvFc anti-5T4 polímero droga ao 5T4 humano (domínio extracelular) pela ressonância plasmônica de superfície
[00648] A afinidade e parâmetros cinéticos quanto à ligação do conjugado scFvFc anti-5T4 polímero droga preparado em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 10 ao antígeno 5T4 foram medidas pela ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore T200 da GE Healthcare. O antígeno 5T4-ECD-Fc (domínio extracelular 5T4 humano fundido ao domínio Fc do subtipo IgG1 humano) foi covalentemente imobilizado em um chip sensor BIAcore CM5 pelo método de ligação de amina usando reagentes fornecidos como um kit (GE Healthcare). No estudo de ligação, o conjugado scFvFc anti-5T4 polímero droga ou proteínas de controle foram diluídas em série a uma série de concentrações em tampão de condução BIAcore HBS-EP+ (Solução Salina Tamponada com HEPES suplementada com EDTA e P20) e fluxada no antígeno imobilizado durante um período de tempo fixo para permitir a ligação, seguido pelo fluxo de tampão de condução apenas para dissociar o antígeno e finalmente, regeneração da superfície usando uma solução de pH baixo (10 mM de Glicina-HCl, pH 2). Todos os reagentes de BIAcore foram adquiridos da GE Healthcare. As curvas de dados resultantes são aludidas como sensorgramas e constituem os dados de ligação brutos. Os dados foram ajustados a um modelo de ligação de Langmuir 1:1 usando o software BIAevaluation (GE Healthcare) e a afinidade/parâmetros cinéticos tais como taxa de associação, taxa de dissociação e afinidade foram estimadas. As estimativas da afinidade são a média de medições múltiplas.
[00649] Como ilustrado na Figura 11, o conjugado de scFvFc anti-5T4 polímero droga (Exemplo 10) ligou ao domínio extracelular de 5T4 humano com alta afinidade (KD de < 30 pM). Este valor é similar a aquele determinado para o scFvFc anti-5T4 não conjugado. Exemplo 58. Ligação do conjugado de scFvFc anti-5T4 polímero droga ao antígeno 5T4 de superfície celular
[00650] A ligação de superfície celular do conjugado de scFvFc anti- 5T4 polímero droga (scADC anti-5T4) (Exemplo 10) foi avaliada usando um citômetro de fluxo FACS Calibre (Beckton Dickinson) em várias linhagens de célula cancerosa humana. A ligação à superfície da célula do conjugado de scFvFc anti-5T4 polímero droga foi determinada por titulação e comparada à ligação à superfície da célula medida para anticorpo de scFvFc anti-5T4 não conjugado.
[00651] MDA-MB-231 recombinante que superexpressa 5T4 (MDA- MB-231-5T4 OE), MDA-MB-231 (negativo para 5T4; disponível da American Type Culture Collection, Manassas Virginia US, sob o número de acesso HTB-26) e células A431 (que expressam 5T4 naturalmente) (A431, disponível da American Type Culture Collection, Manassas Virginia US, sob o número de acesso CRL-1555) foram usados para a titulação de conjugado de scFvFc anti-5T4 polímero droga e scFvFc anti-5T4 não conjugado. As células em crescimento exponencial foram descoladas do frasco de cultura usando 0,5 mM de tampão de PBS/EDTA. As células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas com scFvFc anti-5T4, scADC anti-5T4, ou proteína de fusão que não liga scFvFc (0,01 a 10 μg/ml) em 1 % de BSA-PBS por 1 hora na temperatura ambiente. As células foram lavadas três vezes com PBS e incubadas com anticorpo FITC específico anti-Fc por 45 min a 4 oC. Depois da incubação do anticorpo FITC específico anti-Fc, as células foram lavadas três vezes com PBS e analisadas usando a citometria (FACS Calibre, Becton Dickinson). As intensidades de fluorescência média (MFI) foram determinadas para as amostras.
[00652] A ligação de superfície celular dependente de dose específica para o conjugado de scFvFc anti-5T4 polímero droga (Exemplo 10) foi comparável com aquela de scFvFc anti-5T4 não conjugado nas célula MDA- MB-231 que super expressam tanto A431 quanto 5T4. A ligação de uma proteína de fusão de scFvFc não relacionada foi de 200 vezes menos a 5 μg/ml. Além disso, as células MDA-MB-231, que são negativas para a expressão de 5T4, não mostram nenhuma ligação de superfície celular a scFvFc anti-5T4 ou a scFvFc anti-5T4 conjugado ADC. Exemplo 59. Eficácia in vivo do conjugado de scFvFc anti-5T4 polímero droga
[00653] Materiais: Seringas BD de 1 ml (Calibre 271/2), meio de Cultura Estéril, Solução Salina Tamponada com Fosfato Estéril, Matrigel - BD Biosciences (catálogo No. 354248), Tampões de algodão estéreis, tubos Eppendrof estéreis (1,5 ml, 2 ml), Pipetas, Papel filtro, Álcool a 70 %/Álcool Isopropílico, Calibre Vernier (Mitutoyo). Todos os outros itens essenciais usados foram de grau analítico.
[00654] Animais: Camundongos nus fêmeas atímicos (Hsd: Athymic Nude-Foxn1nu) de 5 a 6 semanas de idade, pesando de 20 a 22 g foram obtidos da Harlan, Países Baixos. Os animais foram cuidados de acordo com Regulations of Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals (CPCSEA), Government of India and Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). A ‘Forma B’ para realizar experimentação com animal foi revisada e aprovada pelo Institutional Animal Ethics Committee.
[00655] Alojamento e Alimentação: Os animais foram mantidos em um ambiente controlado com temperatura de 22 ± 3 °C, 50 ± 20 % de umidade, um ciclo de luz/escuro de 12 horas cada e 15 a 20 mudanças de ar fresco por hora. Os animais foram alojados aos grupos e sabugo de milho autoclavado foi usado como um material de cama. Os animais foram alimentados, ad libitum, com Dieta de Roedor de Laboratório Irradiada certificada durante o período de estudo.
[00656] Preparação de Animais & Identificação de Animal: Os animais foram mantidos sob aclimatização na sala experimental por um período de pelo menos 5 dias. Os animais foram individualmente numerados e os cartões de gaiola indicando o experimento, número do estudo, data de implantação de tumor, data da randomização, tipo de tumor, cepa do camundongo, gênero e número de camundongo individual foram demonstrados nas gaiolas correspondentes. Depois da randomização, identidade do grupo, composto de teste, dosagem, programa e via de administração foram adicionados.
[00657] Preparação das células de tumor: Todos os procedimentos foram realizados em capela de fluxo laminar seguindo técnicas estéreis. As células cancerosas (a) A431 (Epidermóide), (b) MDA-MB-231 recombinante (mamário) que super expressa 5T4 (MDA-MB-231 5T4++) (5T4 OE) e (c) H1975 (carcinoma pulmonar de célula não pequena) com 70 a 80 % confluente e viabilidade de >90 % foram escolhidas para o estudo. 5 X 106 células foram recolocadas em suspensão em 200 μl de PBS ou meio livre de soro contendo 50 % de matrigel mantido em gelo.
[00658] Injeção subcutânea das células: Camundongos nus (Hsd: Athymic Nude-Foxn1nu) alojados em Gaiolas Ventiladas Individuais (IVCs) foram usados. As linhagens de célula cancerosa foram propagadas nos animais injetando-se subcutaneamente nos flancos ou dorso dos animais. A área implantada foi monitorada quanto ao crescimento de tumor. Uma vez os tumores foram palpáveis e do volume requerido (TV ~ 150 mm3), os animais foram randomizados com base no volume do tumor e a dosagem foi iniciada. O volume do tumor foi determinado pela medição bidimensional com um calibre no dia da randomização (Dia 0) e depois uma vez a cada três dias (isto é nos mesmos dias nos quais os camundongos foram pesados). Usando um calibre vernier o comprimento (L) e a largura (W) do tumor foram medidos. O volume do tumor (TV) foi calculado usando a seguinte Fórmula: Volume do tumor (mm3) = L X W2 / 2, onde, L = Comprimento (mm); W = Largura (mm).
[00659] O conjugado de scFvFc anti-5T4 polímero droga (Exemplo 10) foi dissolvido em 1x PBS estéril que resultou em soluções claras em todas as concentrações preparadas e foi administrado intravenosamente via veia da cauda. O item de teste foi recém preparado nos dias de administração e o volume de dose foi mantido a 5 ml/kg de peso corporal. Para cada grupo separado nova seringa e agulhas foram usadas.
[00660] Peso corporal: Observações ao lado da gaiola, o peso corporal foi medido uma vez a cada três dias durante o período de estudo. A mudança % nos pesos corporais de camundongos individuais foi calculado.
[00661] Atividade Antitumor: A atividade antitumor foi avaliada como a inibição máxima do volume do tumor versus o grupo de controle de veículo. A avaliação dos dados foi realizada usando software estatístico Graph pad Versão, 5.
[00662] Valor de Teste/Controle em % (% T/C): A inibição de tumor em um dia particular (T/C em %) foi calculado a partir da razão dos valores de TV médios do grupo de teste versus controle multiplicado por 100 %, como segue: T/C (Dia X) = (TV média do grupo de teste no dia X - TV média do grupo de teste no dia 0) / (TV média do grupo de controle no dia X - TV média do grupo de controle no dia 0) x 100 %.
[00663] O valor %T/C mínimo (ou ótimo) registrado para um grupo de teste particular durante um experimento representa a atividade antitumor máxima para o respectivo tratamento. TV= Volume do tumor (mm3)
[00664] Inibição do crescimento de tumor (TGI): TGI foi calculada usando a seguinte Fórmula: TGI = (1 - T/C) x 100 Onde, T = (TV média do grupo de teste no dia X - TV média do grupo de teste no dia 0) e C = (TV média do grupo de controle no dia X - TV média do grupo de controle no dia 0)
[00665] Sinais clínicos: Morbidez & Mortalidade: Os animais foram observados individualmente quanto aos sinais clínicos gerais visíveis uma vez a cada três dias durante o período de estudo. Todos os animais foram checados quanto à morbidez e mortalidade.
[00666] Análise estatística: Para a avaliação da significância estatística da inibição de tumor, ANOVA de duas vias seguido pelo pós teste de Bonferroni foram realizados usando GraphPad Prism v5. Os valores p < 0,05 indicam diferenças estatisticamente significantes entre os grupos.
Resultados: Atividade antitumor de xenoenxerto subcutâneo A431:
[00667] Nos experimentos de xenoenxerto com a linhagem de célula A431 [“Characterization of the A431 tumor xenograft as an in vivo model for testing epidermal growth factor-receptor antagonists”, S. Robinson et al., Int. J. Oncol. 1992, 1(3): 293-8], scADC anti-5T4 preparada em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 10 foi administrada IV aos camundongos que carregam tumor nas seguintes doses: 10 mg/kg, dose única; 1 mg/kg, Q4D x 4; 3 mg/kg, Q4D x 4; e 6 mg/kg, Q4D x 4. “Q4D x 4” significa a dosagem uma vez a cada 4 dias, para um total de 4 doses. Um grupo separado de camundongos que carregam tumor foi administrado com scFvFc anti-5T4 não conjugado (10 mg/kg IV, Q4D x 4). Neste estudo, a terapia scADC anti-5T4 demonstrou atividade antitumor forte contra xenoenxertos de carcinoma A431 quando administrada como uma dose única ou doses repetidas nos níveis de dose mencionados acima (Figura 12). O tratamento com scADC anti-5T4 em uma dose única (10 mg/kg IV) resultou em um valor T/C ótimo de -4 % no dia 24. A % de inibição do crescimento de tumor (TGI) para o grupo da dose única de 10 mg/kg IV foi descoberto ser de 104 % (Dia 24, p<0,001). O valor T/C ótimo nos grupos de dose repetidos (1 mg/kg, 3 mg/kg e 6 mg/kg IV, Q4D x 4) foi descoberto ser de -2 %, -4 % & - 3 % no dia 24, respectivamente. Além disso, a % de inibição do crescimento de tumor (TGI) para grupos de dose repetida (1 mg/kg, 3 mg/kg e 6 mg/kg IV, Q4D x 4) foi descoberto ser de 102 % (Dia 24, p<0,001), 104 % (Dia 24, p<0,001) e 103 % (Dia 24, p<0,001), respectivamente. Não houve nenhuma diferença significante entre os grupos de tratamento com scADC anti-5T4 de dose única e dose repetida. A administração de scFvFc anti-5T4 não conjugado na dose de 10 mg/kg IV, Q4D x 4 não causou nenhuma % de redução significante no volume do tumor de xenoenxertos A431. O valor %T/C de no dia 24 foi descoberto ser de 87 %. A diferença nos tamanhos de tumor entre o grupo tratado com veículo e o grupo tratado com scFvFc anti- 5T4 não foi estatisticamente significante e a % de inibição do crescimento de tumor (TGI) nesta dose foi descoberta ser de 13 % (Dia 24). No regime após o tratamento, os animais nos grupos de teste de scADC anti-5T4 foram observados até o dia 90, tempo no qual o estudo foi terminado. No grupo de dose repetida de scADC anti-5T4 tratado a 6 mpk, i.v, Q4D x 4 houve perda de peso corporal relacionada com o tratamento e mortalidade (7/10 animais) no Dia 24; os animais sobreviventes neste grupo de dose foram observados até o dia 90. A regressão completa do crescimento de tumor foi observada em todos os grupos tratados com scADC anti-5T4 e não houve nenhum sinal de retomada de crescimento de tumor até o final do período de estudo (incluindo 3/10 no grupo de dose de 6 mpk, i.v., Q4D x 4).
Atividade de tumor no xenoenxerto subcutâneo de MDA-MB-231 5T4++:
[00668] Em um experimento com os xenoenxertos de MDA-MB-231- 5T4 OE, scADC anti-5T4 preparados em uma maneira similar àquela como descrita no Exemplo 10 foi administrada aos camundongos que carregam tumor nas seguintes doses: 10 mg/kg IV, dose única; 1 mg/kg IV, Q4D x 4; 3 mg/kg IV, Q4D x 4; e 6 mg/kg IV, Q4D x 4. Um grupo separado foi administrado com scFvFc anti-5T4 não conjugado (10 mg/kg IV, Q4D x 4). Neste estudo, a terapia com scADC anti-5T4 demonstrou atividade antitumor forte contra xenoenxertos MDA-MB-231-5T4 OE quando administrada como uma dose única ou doses repetidas nos níveis de dose mencionados acima (Figura 13). O tratamento com scADC anti-5T4 na dose única (10 mg/kg IV) resultou em um valor T/C ótimo de -25 % no dia 18. A % de inibição do crescimento de tumor (TGI) para o grupo de dose única de 10 mg/kg IV foi descoberto ser de 125 % (Dia 18, p<0,001). O valor T/C ótimo nos grupos de dose repetida (1 mg/kg, 3 mg/kg e 6 mg/kg IV, Q4D x 4) foi descoberto ser de -26 %, -32 % & -38 % no dia 18 respectivamente. Além disso, a % de inibição do crescimento de tumor (TGI) para os grupos de dose repetida (1 mg/kg, 3 mg/kg e 6 mg/kg IV, Q4D x 4) foi descoberto ser de 126 % (Dia 18, p<0,001), 132 % (Dia 18, p<0,001) e 138 % (Dia 18, p<0,001) respectivamente. Não houve nenhuma diferença significante entre os grupos de tratamento com scADC anti-5T4 na dose única e na dose repetida. A terapia com scFvFc anti-5T4 não conjugado na dose de 10 mg/kg IV, Q4D x 4 mostrou atividade antitumor moderada contra xenoenxertos MDA-MB-231 5T4 OE. O valor %T/C no dia 18 foi descoberto ser de 45 % e a inibição do crescimento de tumor (TGI) nesta dose foi de 55 % (Dia 18, p<0,001). Além disso, o volume médio do tumor no dia 66 para o grupo de controle de veículo foi descoberto ser de 1763 mm3. Em grupos de dose repetida de scADC anti- 5T4 (1 mpk, 3 mpk, i.v; Q4D x 4) e grupo de dose única (10 mpk, i.v), houve a regressão completa do crescimento de tumor do Dia 45 até o Dia 90, tempo no qual o estudo foi terminado. Não houve nenhum sinal de retomada de crescimento de tumor nos grupos tratados com scADC anti-5T4 mencionados acima até o final do período de estudo. Entretanto, no grupo de dose repetida de scADC anti-5T4 tratado a 6 mpk, i.v, Q4D x 4 houve perda de peso corporal severa relacionada com o tratamento e mortalidade (10/10) no Dia 21. O volume médio do tumor para o grupo tratado com anticorpo de scFvFc anti-5T4 não conjugado no dia 72 foi descoberto ser de 1502 mm3. O valor %T/C do dia 66 para este grupo tratado com anticorpo foi descoberto ser de 60 % e a inibição do crescimento de tumor (TGI) nesta dose foi de 40 % (Dia 66, p<0,001).
Atividade antitumor do xenoenxerto subcutâneo H1975:
[00669] Nos experimentos de xenoenxerto conduzidos em uma maneira similar com a linhagem de célula de carcinoma pulmonar H1975, scADC anti-5T4 preparado em uma maneira similar como descrita no Exemplo 10 foi administrado IV aos camundongos que carregam tumor (n = 5 camundongos por grupo, volume do tumor inicial ~150 mm3) nas seguintes doses: 0,3 mg/kg, Q4D x 4; 1 mg/kg, Q4D x 4; e 3 mg/kg, Q4D x 4. Um grupo separado foi administrado com anticorpo de scFvFc anti-5T4 não conjugado a 3 mg/kg IV, Q4D x 4. O tratamento com scADC anti-5T4 (0,3 & 1 mg/kg, i.v; Q4D x 4) resultou na remissão parcial (no dia 39) de xenoenxertos de tumor H1975 quando administrado como dose repetida nos níveis de dose mencionados acima. O tratamento com scADC anti-5T4 a 3 mg/kg, i.v; Q4D x 4, resultou na remissão completa (no dia 39) de xenoenxertos de tumor H1975. O tratamento com scADC anti-5T4 a 0,3, 1 & 3 mpk, i.v; Q4D x 4 resultou em um valor T/C ótimo de -0,7 %, -4 % & -5 % no dia 39 respectivamente e a % de inibição do crescimento de tumor (TGI) foi descoberto ser de 101 %, 104 % & Remissão Completa (CR) (Dia 39, p<0,001). O tratamento com anticorpo não conjugado de scFvFc anti-5T4 resultou em atividade antitumor insuficiente com um valor de %T/C de 88 % no dia 39 com a %TGI sendo de 12 %. No regime após o tratamento, os animais nos grupos de teste foram observados até o Dia 81, tempo no qual o estudo foi terminado. No dia 60, a terapia com scADC anti-5T4 (0,3 mg/kg, i.v; Q4D x 4) demonstrou a remissão completa (3/5) em camundongos nus que carregam xenoenxerto H1975, enquanto que a retomada do crescimento de tumor foi observada em 2 animais a partir do Dia 39 em diante até o Dia 60, tempo no qual os animais neste grupo foram sacrificados. Entretanto, no dia 81, a terapia com scADC anti-5T4 (1 & 3 mg/kg, i.v; Q4D x 4) resultou na remissão completa (5/5; Dia 81) em camundongos nus que carregam xenoenxertos H1975.
Atividade antitumor de xenoenxerto subcutâneo NCI-N87:
[00670] Em uma maneira similar aos estudos de xenoenxerto de tumor descritos acima, experimentos de xenoenxerto foram conduzidos com a linhagem de célula NCI-N87 (carcinoma gástrico). ScADC anti-5T4 preparado em uma maneira similar como descrita no Exemplo 10 foi administrado IV aos camundongos SCID que carregam tumor (n = 10 camundongos por grupo, o volume inicial do tumor ~135 mm3) nas seguintes doses: 3 mg/kg, dose única; e 3 mg/kg, Q4D x 3. Um grupo separado foi administrado com anticorpo de scFvFc anti-5T4 não conjugado a 3 mg/kg IV, Q4D x 3. Uma morte não relacionada com o tratamento foi avaliada no grupo de dose única de 3 mg/kg de scADC anti-5T4 e os dados para este animal foram excluídos da análise. No dia 19, os grupos de tratamento scADC anti- 5T4 mostraram a inibição do crescimento de tumor de 92 e 87 % a 3 mg/kg, dose única; e 3 mg/kg, Q4D x 3, respectivamente. ambos os grupos de tratamento com scADC anti-5T4 tiveram 100 % de regressão completa, que foram duráveis até o final do estudo no dia 75. O tratamento com anticorpo de scFvFc anti-5T4 não conjugado resultou na atividade antitumor insuficiente com um valor de inibição do crescimento de tumor de 14 % no dia 19; todos os animais neste grupo de tratamento atingiram um ponto final de volume de tumor de 800 mm3 no Dia 56.
[00671] Todas as publicações, incluindo, por exemplo, a literatura que não de patente, pedidos de patente e patentes, citadas neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência para todos os propósitos. A invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se desviar do espírito ou características essenciais da mesma. As formas de realização precedentes devem ser consideradas assim em todas as referências ilustrativas em vez de limitar a invenção descrita aqui. O escopo da invenção é indicado assim pelas reivindicações anexas em vez de pela descrição precedente e todas as mudanças que estejam dentro do significado e faixa de equivalência das reivindicações são planejadas como sendo aqui englobadas.

Claims (15)

1. Armação polimérica da Fórmula (Id) útil para conjugar com uma molécula de reconhecimento com base em proteína (PBRM):
Figure img0185
caracterizada pelo fato de que: a armação compreende poli(1-hidroximetil-etileno- hidroximetil-formal) (PHF) tendo um peso molecular que varia de 2 kDa a 40 kDa, e em que a desconexão entre as unidades monoméricas indica que as unidades são arranjadas aleatoriamente; cada ocorrência de D é independentemente um agente terapêutico tendo um peso molecular de < 5kDa e o ’ entre D e o grupo carbonila indica fixação direta ou indireta de D ao grupo carbonila, X é CH2, O ou NH; m é um número inteiro de 1 a 300, m1 é um número inteiro de 1 a 140, m7 é um número inteiro de 1 a 40, m3 é um número inteiro de 1 a 18, e a soma de m, m1, m3 e m7 varia de 15 a 300.
2. Armação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o PHF tem um peso molecular variando de 2 kDa a 20 kDa, m7 é um número inteiro de 1 a 20, m3 é um número inteiro de 1 a 10, m1 é um número inteiro de 1 a 70 e a soma de m, m1, m3 e m7 varia de 15 a 150; preferencialmente o PHF tem um peso molecular variando de 3 kDa a 15 kDa, m7 é um número inteiro de 2 a 15, m3 é um número inteiro de 1 a 8, m1 é um número inteiro de 2 a 50 e a soma de m, m1, m3 e m7 varia de 20 a 110; e mais preferencialmente, o PHF tem um peso molecular variando de 5 kDa a 10 kDa, m7 é um número inteiro de 3 a 10, m3 é um número inteiro de 1 a 5, m1 é um número inteiro de 5 a 35 e a soma de m, m1, m3 e m7 varia de 40 a 75.
3. Armação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 2, caracterizada pelo fato de que cada ocorrência de D é independentemente selecionada de um composto de auristatina, um inibidor de topoisomerase, um composto de caliqueamicina, um composto vinca, um composto de tubulisina, um composto de duocarmicina, um composto de pirrolobenzodiazepina, um inibidor de cinase, um inibidor de KSP, um maitansinoide, um fármaco de ligação ao DNA, droga de alquilação ou intercalação, um inibidor de polimerase de RNA, um inibidor de síntese de proteína e seus análogos.
4. Armação de acordo com a reivindicação 1, tendo a Fórmula (Ia)
Figure img0186
(Ia), caracterizada pelo fato de que: m2 é um número inteiro de 1 a 40, a soma de m, m1, m2 e m3 varia de 15 a 300.
5. Armação de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o PHF tem um peso molecular variando de 2 kDa a 20 kDa, m2 é um número inteiro de 1 a 20, m3 é um número inteiro de 1 a 10, m1 é um número inteiro de 1 a 70 e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de 15 a 150; preferencialmente o PHF tem um peso molecular que varia de 3 kDa a 15 kDa, m2 é um número inteiro de 2 a 15, m3 é um número inteiro de 1 a 8, m1 é um número inteiro de 2 a 50 e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de 20 a 110; e mais preferencialmente, o PHF tem um peso molecular que varia de 5 kDa a 10 kDa, m2 é um número inteiro de 3 a 10, m3 é um número inteiro de 1 a 5, m1 é um número inteiro de 5 a 35 e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de 40 a 75.
6. Armação de acordo com a reivindicação 4, tendo a Fórmula (A):
Figure img0187
(A), caracterizada pelo fato de que: o PHF tem um peso molecular que varia de 5 kDa a 10 kDa; m é um número inteiro de 1 a 75, m1 é um número inteiro de 5 a 35, m2 é um número inteiro de 3 a 10, m3 é um número inteiro de 1 a 5, e a soma de m, m1, m2 e m3 varia de 40 a 75.
7. Armação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um conjugado de PBRM ao PHF por intermédio do grupo maleimido.
8. Armação de acordo com a reivindicação 7, quando conjugada à PBRM sendo da Fórmula (Ie):
Figure img0188
caracterizada pelo fato de que: um de Xa e Xb é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido ou Xa e Xb, junto com os átomos de carbono ao qual estes são fixados formam uma ligação de carbono-carbono; m3a é um número inteiro de 0 a 17, m3b é um número inteiro de 1 a 8, em que a soma de m3a e m3b é m3, a soma de m, m1, m7, m3a e m3b varia de 15 a 300, e m5 é um número inteiro de 1 a 10.
9. Armação de acordo com a reivindicação 7, quando conjugada à PBRM sendo da Fórmula (Ib):
Figure img0189
caracterizada pelo fato de que: um de Xa e Xb é H e o outro é uma porção bloqueadora de maleimido, ou Xa e Xb, junto com os átomos de carbono ao qual estes são fixados formam uma ligação de carbono-carbono; m3a é um número inteiro de 0 a 17, m3b é um número inteiro de 1 a 8, em que a soma de m3a e m3b é m3, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de 15 a 300, e m5 é um número inteiro de 1 a 10.
10. Armação de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o PHF tem um peso molecular que varia de 2 kDa a 20 kDa, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de 15 a 150, m1 é um número inteiro de 1 a 70, m2 é um número inteiro de 1 a 20, m3a é um número inteiro de 0 a 9, m3b é um número inteiro de 1 a 8 e m5 é um número inteiro de 2 a 8; preferencialmente o PHF tem um peso molecular que varia de 3 kDa a 15 kDa, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de 20 a 110, m1 é um número inteiro de 2 a 50, m2 é um número inteiro de 2 a 15, m3a é um número inteiro de 0 a 7, m3b é um número inteiro de 1 a 8 e m5 é um número inteiro de 2 a 4; e mais preferencialmente, o PHF tem um peso molecular que varia de 5 kDa a 10 kDa, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de 40 a 75, m1 é um número inteiro de 5 a 35, m2 é um número inteiro de 3 a 10, m3a é um número inteiro de 0 a 4, m3b é um número inteiro de 1 a 5 e m5 é um número inteiro de 2 a 4.
11. Armação de acordo com a reivindicação 9, tendo a Fórmula (B):
Figure img0190
(B), caracterizada pelo fato de que: o PHF tem um peso molecular que varia de 5 kDa a 10 kDa; m é um número inteiro de 1 a 75, m1 é um número inteiro de 5 a 35, m2 é um número inteiro de 3 a 10, m3a é um número inteiro de 0 a 4, m3b é um número inteiro de 1 a 5, a soma de m, m1, m2, m3a e m3b varia de 40 a 75, e m5 é um número inteiro de 2 a 4; e opcionalmente a PBRM tem um peso molecular maior do que 40 kDa.
12. Armação polimérica da Fórmula (Ic):
Figure img0191
(Ic), caracterizada pelo fato de que: a armação compreende PHF tendo um peso molecular que varia de 2 kDa a 40 kDa, e em que a desconexão entre as unidades monoméricas indica que as unidades são arranjadas aleatoriamente; X é CH2, O ou NH; m é um número inteiro de 1 a 300, m6 é um número inteiro de 2 a 180, m3 é um número inteiro de 1 a 18, e a soma de m, m6 e m3 varia de 15 a 300.
13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma armação como definida em qualquer uma das reivindicações 7-11 e um carregador farmaceuticamente aceitável.
14. Armação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é para uso em uma terapia.
15. Armação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7-11 ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que são para uso no tratamento de câncer, preferivelmente o dito câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer anal, astrocitoma, leucemia, linfoma, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, câncer testicular, câncer cervical, sarcoma, hemangioma, câncer esofágico, câncer ocular, câncer laringeal, câncer de boca, mesotelioma, câncer de pele, mieloma, câncer oral, câncer retal, câncer de garganta, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer uterino, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer renal e câncer gástrico.
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