ES2341285T3 - Metodo para preparar maleimidas polimericas. - Google Patents

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ES2341285T3 ES06788037T ES06788037T ES2341285T3 ES 2341285 T3 ES2341285 T3 ES 2341285T3 ES 06788037 T ES06788037 T ES 06788037T ES 06788037 T ES06788037 T ES 06788037T ES 2341285 T3 ES2341285 T3 ES 2341285T3
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John Handley
Anthony G. Schaefer
Brian Bray
Ryan Odom
Tony L. Sander
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Abstract

a) combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido; y b) exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación para dar como resultado de esta manera un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, en el que el reactivo de maleimida es de fórmula: en la que: Y 1 es O o S; Y 2 es O o S; (a) es un número entero de 1 a 20; R 1 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; R 2 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; R 3 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y R 4 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico, y en la que el polímero soluble en agua, terminado en maleimida, es de la fórmula: en la que: POLI es un polímero soluble en agua; (b) es cero o uno; X 1 , cuando está presente, es un resto espaciador; R 3 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y R 4 , en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico.

Description

Método para preparar maleimidas poliméricas.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a métodos para preparar polímeros solubles en agua y no peptídicos que llevan grupos funcionales maleimida, particularmente polímeros de poli(etilenglicol) terminados en maleimida, y a composiciones y formulaciones que los contienen. El alcance de protección de la patente se determina mediante las reivindicaciones 1-36 adjuntas.
Antecedentes de la invención
Las maleimidas son derivados versátiles que encuentran un uso extensivo en la síntesis química y en aplicaciones biológicas y farmacológicas. Como aceptores de Michael, las maleimidas reaccionan fácilmente con grupos sulfhidrilo para formar enlaces tioéter estables. Esta reacción se usa extensivamente con proteínas y similares donde los grupos tanto sulfhidrilo como amina están presentes. A un pH aproximadamente neutro, las maleimidas son altamente selectivas, siendo los grupos sulfhidrilo aproximadamente 1.000 veces más reactivos que los grupos amina (Smyth et al., Biochem. J., 91, 589, 1964; Gorin et al. Arch. Biochem. Biophys. 115, 593, 1966; Partis et al., J. Protein Chem, 2, 263-277, 1983). A valores de pH mayores de 8 o por encima, la reacción de las maleimidas con grupos amina empieza a competir significativamente (Brewer and Riehm, Anal. Biochem. 18, 248, 1967).
Aunque se conocen mejor como aceptores de Michael, las maleimidas son útiles también por su reactividad como dienófilos (Baldwin et al., Tetrahedron Lett., 32, 5877, 1991; Philp and Robertson, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1998, 879; Bravo et al., Heterocycles, 53, 81, 2000) y como dipolarófilos (Grigg et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1988, 2693; Konopikova et al., Collect. Czech. Chem. Commun., 57, 1521, 1991; Philp and Booth, Tetrahedron Lett, 39, 6987, 1998).
Los grupos maleimida pueden usarse para facilitar la fijación covalente de proteínas y otras moléculas a polímeros. Por ejemplo, el polímero hidrófilo "poli(etilenglicol)", abreviado como "PEG", a menudo se usa para conjugar moléculas bioactivas y hacerlas solubles en medios acuosos (Harris et al. "Poly(Ethylene Glycol) Chemistry and Biological Applications", ACS Symposium Series, ACS, Washington, DC, 1997). PEG maleimida es un ejemplo de un polímero reactivo adecuado para reaccionar con grupos tiol o amino en una molécula biológicamente activa.
Muchos de los métodos para preparar PEG maleimidas implican conectar un PEG activado a una molécula enlazadora pequeña que comprende un grupo maleimida, muchas de los cuales están disponibles en el mercado. Hay diversos inconvenientes asociados con las varias PEG maleimidas conocidas y con sus métodos de producción. Por ejemplo, la denominada PEG maleimida "sin enlazador", que no tiene un grupo enlazador entre el PEG y el grupo maleimida, a menudo se prepara directamente a partir de una PEG amina usando uno de los dos métodos. Véase la Patente de Estados Unidos Nº 6.602.498. Estos métodos, sin embargo, dan como resultado generalmente un producto relativamente impuro en tanto que una cantidad significativamente pequeña de un derivado que contiene ácido maleámico de anillo abierto está presente en el producto final como se analizará más adelante.
En el primer método descrito la Patente de Estados Unidos Nº 6.602.498, una estructura básica de polímero soluble en agua y no peptídico se hace reaccionar con anhídrido maleico para formar un intermedio de amida del ácido carboxílico de anillo abierto (un intermedio de ácido maleámico). El anillo del intermedio se cierra después en una segunda etapa calentando el intermedio en presencia de anhídrido acético y una sal de ácido acético, tal como acetato sódico o potásico, a una temperatura de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 140ºC durante aproximadamente 0,2 a aproximadamente 5 horas. Este proceso en dos etapas se resume en el Esquema de Reacción I proporcionado a continuación:
Esquema de Reacción I
1
La composición que contiene polímero soluble en agua, terminado en maleimida, bruto, preparada por este método puede contener una cantidad sustancial del intermedio de ácido maleámico de anillo abierto. Una causa principal para la aparición del intermedio de ácido maleámico de anillo abierto puede estar en la etapa de calentamiento, especialmente si se genera cualquier especie ácida o es un contaminante en el anhídrido acético. En estas condiciones, es posible isomerizar el enlace C=C y, de esta manera, hacer que el cierre del anillo sea difícil, si no imposible. Como resultado, es deseable purificar el producto polimérico por algún método, tal como cromatografía de intercambio de iones, capaz de retirar la impureza. Sin embargo, el sistema de anillo de maleimida no tolera una columna cromatográfica que posea sitios básicos o nucleófilos, haciendo de esta manera que la purificación sea más difícil. Un segundo problema con esta ruta sintética radica en el uso de PEG amina.
Análogamente, Sakanoue et al., en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2003/0065134 A1, describen un método relacionado excepto que las PEG maleimidas producidas allí comprenden un grupo propileno en lugar de un grupo etileno entre el oxígeno de PEG final y el nitrógeno de la maleimida. El método descrito en Sakanoue et al., sin embargo, sufre los mismos problemas mencionados anteriormente. Adicionalmente, la referencia muestra que las PEG aminas generalmente se fabrican mediante reducción de un grupo nitrilo usando hidrógeno y un catalizador de níquel que puede conducir a la introducción de procesos adicionales debido a la reacción entre el producto de amina y un intermedio de imina.
En una segunda ruta sintética descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 6.602.498 (la "Ruta de N-alcoxicarbonilmaleimida Acuosa"), una N-alcoxicarbonilmaleimida se hace reaccionar con una amina polimérica para formar un producto polimérico soluble en agua, terminado en maleimida. Ocurre una reacción de abertura de anillo y de cierre de anillo similar a la descrita anteriormente. La reacción se realiza con un lento gradiente de temperatura en aumento en un tampón de bicarbonato sódico acuoso a un pH de aproximadamente 8,5. El grupo maleimida, sin embargo, no es estable en estas condiciones y experimenta hidrólisis a ácido maleámico. Por lo tanto, ocurren dos reacciones paralelas durante la síntesis: formación del anillo de maleimida e hidrólisis del anillo de maleimida.
Un enfoque para abordar el problema sería detener la reacción en un momento en el que se forma una cantidad máxima del producto de polímero soluble en agua, terminado en maleimida. Aunque este enfoque parece firme en teoría, es una tarea casi imposible en la práctica comercial debido a la temperatura de reacción cambiante en la que es difícil conseguir de forma reproducible el gradiente de temperatura para lotes de fabricación consecutivos. Por ejemplo, se encontró que los lotes comerciales consecutivos de ciertos polímeros solubles en agua, terminados en maleimida, tenían una pureza de maleimida del 65 al 80% y un contenido de ácido maleámico de aproximadamente el 20 al 35%. De nuevo, la cromatografía no es una opción viable debido a la sensibilidad del grupo maleimida a los grupos funcionales de la columna de intercambio de iones. Adicionalmente, incluso si fuera posible controlar de forma reproducible el gradiente de temperatura y detener la reacción en el momento apropiado, el enfoque requiere un control de cerca y un equipo adicional (por ejemplo, termopares, mantas calefactoras y similares), añadiendo de esta manera complejidad al enfoque.
Otros enfoques para preparar polímeros solubles en agua, terminados en maleimida, se describen en la Publicación de Patente Internacional WO 05/056636. En un enfoque (marcado como "Esquema de Reacción II" a continuación) un polímero que comprende un grupo saliente ("GS") y una sal de una imida (mostrada como la sal potásica de una amida tricíclica) se hacen reaccionar por sustitución nucleófila para formar un intermedio polimérico, que después va seguido de una reacción de Diels-Alder inversa para proporcionar un polímero funcionalizado con maleimida y furano.
Esquema de Reacción II
2
Aunque la reacción mostrada anteriormente utiliza polímeros funcionalizados relativamente sencillos y reactivos de aducto de Diels-Alder que reaccionan para formar las denominadas maleimidas "sin enlazador" (que significa que el grupo maleimida está unido directamente al polímero), la reacción requiere reactivos que no están disponibles en el mercado.
Independientemente de los enfoques descritos anteriormente, sigue habiendo una necesidad de proporcionar otros enfoques para preparar polímeros solubles en agua, terminados de maleimida, de manera que, por ejemplo, pueda usarse el enfoque más adecuado para cada necesidad. El nuevo enfoque descrito en este documento se cree que proporciona, entre otras cosas, polímeros terminados en maleimida con alto rendimiento y sin cantidades significativas de impurezas poliméricas, particularmente cantidades significativas de impurezas poliméricas que no pueden retirarse fácilmente usando técnicas de purificación convencionales tales como cromatografía de intercambio iónico.
Sumario de la invención
En una o más realizaciones, se proporciona un método para preparar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, comprendiendo el método:
a) combinar el polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, y
a') opcionalmente, aislar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido.
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En una o más realizaciones, se proporciona un método para preparar un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, comprendiendo el método:
a) combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, y
b) exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación en condiciones sustancialmente no acuosas para dar como resultado de esta manera un polímero soluble en agua, terminado en maleimida.
\vskip1.000000\baselineskip
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona una composición que contiene polímero soluble en agua, terminado en maleimida, siendo la composición el resultado del método que comprende:
a) combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico; y
b) exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación en condiciones sustancialmente no acuosas para dar como resultado de esta manera una composición que contiene polímero soluble en agua, terminado en maleimida.
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En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un método para preparar una composición que contiene un conjugado, comprendiendo el método combinar un agente biológicamente activo que contiene tiol con un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, como se proporciona en este documento, para dar como resultado de esta manera una composición que contiene un conjugado.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona una composición que contiene un conjugado, siendo la composición el resultado del método que comprende combinar un agente activo que contiene tiol con una composición que contiene polímero soluble en agua, terminado en maleimida, como se proporciona en este documento.
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un compuesto, teniendo el compuesto, en forma aislada, la siguiente estructura:
3
en la que:
POLI es un polímero soluble en agua;
(b) es cero o uno;
X^{1}, cuando está presente, es un resto espaciador;
Y^{1} es O o S;
Y^{2} es O o S;
(a) es un número entero de 1 a 20;
R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{3}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y
R^{4}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir una o más realizaciones de la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a polímeros, reactivos y similares particulares, puesto que estos pueden variar.
Debe observarse, que, como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno", "el" y "la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye un solo polímero, así como dos o más polímeros iguales o diferentes, la referencia a "un agente de secado" se refiere a un solo agente de secado, así como a dos o más agentes de secado iguales o diferentes, y similares.
Al describir y reivindicar la presente invención o invenciones, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones proporcionadas a continuación "PEG", "polietilenglicol" y "poli(etilenglicol)" como se usa en este documento, son intercambiables. Típicamente, los PEG para uso de acuerdo con la invención comprenden la siguiente estructura: "-(OCH_{2}CH_{2})_{n}-" donde (n) es de 2 a 4000. Como se usa en este documento, PEG incluye también
"-CH_{2}CH_{2}-O(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-" y "-(OCH_{2}CH_{2})_{n}O-," dependiendo de si los oxígenos terminales se han desplazado o no. A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, debe recordarse que el término "PEG" incluye estructuras que tienen diversos grupos terminales o "de protección terminal". El término "PEG" significa también un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del 50% de subunidades de repetición -OCH_{2}CH_{2}- o -CH_{2}CH_{2}O-. Con respecto a las formas específicas, el PEG puede tener cualquier número de una variedad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías tales como "ramificada", "lineal", "bifurcada", "multifuncional" y similares que se describirán con mayor detalle más adelante.
Los términos "protegido terminalmente" y "con protección terminal" se usan de forma intercambiable en este documento para referirse a un punto final o terminal de un polímero que tiene un resto de protección terminal. Típicamente, aunque no necesariamente, el resto de protección terminal comprende un grupo hidroxi o alcoxi C_{1-20}, más preferiblemente un grupo alcoxi C_{1-10} y aún más preferiblemente un grupo alcoxi C_{1-5}. De esta manera, los ejemplos de restos de protección terminal incluyen alcoxi (por ejemplo, metoxi, epoxi y benciloxi) así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo y similares. Debe recordarse que el resto de protección terminal puede incluir uno o más átomos del monómero terminal en el polímero [por ejemplo, el resto de protección terminal "metoxi" en CH_{3}(OCH_{2}CH_{2})_{n}-]. Además, se prevén formas saturadas, insaturadas, sustituidas y no sustituidas de cada uno de los anteriores. Además, el grupo con protección terminal puede ser también un silano. El grupo con protección terminal puede comprender ventajosamente una etiqueta detectable. Cuando el polímero tiene un grupo de protección terminal que comprende un marcador detectable, la cantidad o localización del polímero y/o el resto (por ejemplo, agente activo) al que se acopla el polímero puede determinarse usando un detector adecuado. Dichos marcadores incluyen, sin limitación, fluorescentes, quimioluminiscentes, restos usados en marcado enzimático, restos colorimétricos (por ejemplo, colorantes), iones metálicos, restos radiactivos y similares. Los detectores adecuados incluyen fotómetros, películas, espectrómetros y similares. El grupo de protección terminal puede comprender también ventajosamente un fosfolípido. Cuando el polímero tiene un grupo de protección terminal que comprende un fosfolípido, se confieren propiedades únicas al polímero y al conjugado resultante. Los fosfolípidos ejemplares, incluyen, sin limitación, aquellos seleccionados entre la clase de fosfolípidos denominada fosfatidilcolinas. Los fosfolípidos específicos incluyen, sin limitación, aquellos seleccionados entre el grupo que consiste en dilauroilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diesteroilfosfatidilcolina, behenoilfosfatidilcolina, araquidoilfosfatidilcolina y lecitina.
"De origen no natural" con respecto a un polímero, como se describe en este documento, se refiere a un polímero que no se encuentra en la naturaleza en su totalidad. Un polímero de origen no natural, sin embargo, puede contener uno o más monómeros o segmentos de monómeros que son de origen natural, siempre y cuando la estructura global del polímero no se encuentre en la naturaleza.
El término "soluble en agua" como en "polímero soluble en agua" es cualquier polímero que es soluble en agua a temperatura ambiente. Típicamente, un polímero soluble en agua transmitirá al menos aproximadamente un 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95% de la luz transmitida por la solución después del filtrado. En una base en peso, un polímero soluble en agua preferiblemente será al menos aproximadamente el 35% (en peso) soluble en agua, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50% (en peso) soluble en agua, aún más preferiblemente aproximadamente el 70% (en peso) soluble en agua, y lo más preferiblemente aproximadamente el 85% (en peso) soluble en agua. Lo más preferido, sin embargo es que el polímero soluble en agua sea aproximadamente un 95% (en peso) soluble en agua o completamente soluble en agua.
El peso molecular en el contexto de un polímero soluble en agua, tal como PEG, puede expresarse como peso molecular promedio en número o peso molecular promedio en peso. A menos que se indique de otra manera, todas las referencias a peso molecular en este documento se refieren al peso molecular promedio en peso. Ambas determinaciones del peso molecular, promedio en número y promedio en peso, pueden medirse usando cromatografía de permeación en gel u otras técnicas de cromatografía líquida. Pueden usarse también otros métodos para medir los valores de peso molecular, tal como el uso de análisis de grupo final o la medición de las propiedades coligativas (por ejemplo, bajada del punto de congelación, elevación del punto de ebullición o presión osmótica) para determinar el peso molecular promedio en número o el uso de técnicas de dispersión de la luz, ultracentrifugación o viscosimetría para determinar el peso molecular promedio en peso. Los polímeros de la invención son típicamente polidispersos (es decir, el peso molecular promedio en número y el peso molecular promedio en peso de los polímeros no es igual), poseyendo valores bajos de poli-dispersidad preferiblemente menores de aproximadamente 1,2, más preferiblemente menores de aproximadamente 1,15, aún más preferiblemente menores de aproximadamente 1,10, aún más preferiblemente menores de aproximadamente 1,05 y lo más preferiblemente menores de aproximadamente 1,03. Como se usa en este documento, en ciertos momentos se hará referencia respecto a un polímero soluble en agua individual que tiene un peso molecular promedio en peso o un peso molecular promedio en número; se entenderá que dichas referencias significan que el polímero soluble en agua individual se obtuvo a partir de una composición de polímeros solubles en agua que tenían el peso molecular indicado.
Los términos "activo" o "activado" cuando se usan junto con un grupo funcional particular, se refieren a un grupo funcional reactivo que reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo sobre otra molécula. Esto está en contraste con aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción poco prácticas para reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte").
Como se usa en este documento, la expresión "grupo funcional" o cualquier sinónimo de la misma pretenden incluir formas protegidas de los mismos así como formas no protegidas.
Los términos "resto espaciador", "unión" o "enlazador" se usan en este documento para hacer referencia a un átomo o un grupo de átomos usado para unir restos de interconexión tales como un extremo de un polímero y un agente activo o un electrófilo o nucleófilo de un agente activo. El resto espaciador puede ser hidrolíticamente estable o puede incluir una unión fisiológicamente hidrolizable o enzimáticamente degradable.
"Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, que varía típicamente de aproximadamente 1 a 15 átomos de longitud. Dichas cadenas de hidrocarburo preferiblemente, aunque no necesariamente, están saturadas y pueden ser de cadena ramificada o lineal, aunque típicamente se prefiere la cadena lineal. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1-metilbutilo, 1-etilpropilo, 3-metilpentilo y similares. Como se usa en este documento "alquilo" incluye cicloalquilo así como alquilo que contiene cicloalquileno.
"Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono y que puede ser de cadena lineal o ramificado. Los ejemplos no limitantes de alquilo inferior incluyen metilo, etilo, n-butilo, y t-butilo.
"Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclico, saturado o insaturado, que incluye compuestos enlazados, condensados o espiro cíclicos, preferiblemente constituidos por 3 a aproximadamente 12 átomos de carbono, más preferiblemente de 3 a aproximadamente 8 átomos de carbono. "Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo que se inserta en una cadena de alquilo enlazando la cadena en dos átomos cualquiera en el sistema de anillo
cíclico.
"Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferiblemente alquilo C_{1-6} (por ejemplo, metoxi, epoxi, propiloxi y similares).
El término "sustituido" como por ejemplo, "alquilo sustituido" se refiere a un resto (por ejemplo, un grupo alquilo) sustituido con uno o más sustituyentes no interferentes tales como, aunque sin limitación: alquilo, cicloalquilo C_{3-8} por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo y similares; halo, por ejemplo, flúor, cloro, bromo y yodo; ciano, alcoxi, fenilo inferior, fenilo sustituido y similares. "Arilo sustituido" es arilo que tiene uno o más sustituyentes no interferentes. Para sustituciones en un anillo de fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para).
"Sustituyentes no interferentes" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, típicamente no son reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula.
"Arilo" significa uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 ó 6 átomos de carbono en el núcleo; arilo incluye anillos de arilo múltiples que pueden estar condensados, como en naftilo o no condensados, como en bifenilo. Los anillos de arilo pueden estar también condensados o no condensados con uno o más hidrocarburos cíclicos, heteroarilarilo o anillos heterocíclicos. Como se usa en este documento "arilo" incluye heteroarilo.
"Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de 1 a 4 heteroátomos, preferiblemente azufre, oxígeno o nitrógeno o una combinación de los mismos. Los anillos de heteroarilo pueden condensarse también con uno o más anillos de hidrocarburo cíclico, heterociclilo, arilo o de heteroarilo.
"Heterociclo" o "heterociclilo" se refiere a uno o más anillos de 5-12 átomos, preferiblemente 5-7 átomos con o sin instauración o carácter aromático y que tiene al menos un átomo del anillo que no es carbono. Los heteroátomos preferidos incluyen azufre, oxígeno y nitrógeno.
"Heteroarilo sustituido" es un heteroarilo que tiene uno o más grupos no interferentes como sustituyentes.
"Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas a partir de sustituyentes no interferentes.
Un "radical orgánico" como se usa en este documento incluirá alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido.
"Electrófilo" y "grupo electrófilo" se refieren a un ión o átomo o grupo de átomos que puede ser iónico, tener un centro electrófilo, es decir, un centro que es aceptor de electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo.
"Nucleófilo" y "grupo nucleófilo" se refieren a un ión o átomo o grupo de átomos que puede ser iónico, tener un centro nucleófilo, es decir, un centro que es aceptor de un centro electrófilo o capaz de reaccionar con un electrófilo.
Un enlace "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" es un enlace que reacciona con agua (es decir, se hidroliza) en condiciones fisiológicas. Se prefieren enlaces que tengan una semi-vida de hidrólisis a pH 8 y 25ºC de menos de aproximadamente 30 minutos. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependerá no solo del tipo general de unión que conecta dos átomos dados sino también de los sustituyentes unidos a estos dos átomos dados. Las uniones débiles o hidrolíticamente inestables apropiadas incluyen, aunque sin limitación, éster de carboxilato, éster de fosfato, anhídridos, acetales, cetales, aciloxialquiléter, imina, ortoéster, péptido y oligonucleótido.
Una "unión enzimáticamente degradable" se refiere a una unión que está sometida a degradación por una o más enzimas.
Una unión o enlace "hidrolíticamente estable" se refiere a un enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua, es decir, que no experimenta hidrólisis en condiciones fisiológicas en un grado apreciable durante un periodo de tiempo prologando. Los ejemplos de uniones hidrolíticamente estables incluyen, aunque sin limitación, las siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretano y similares. Generalmente, una unión hidrolíticamente estables es una que presenta una velocidad de hidrólisis menor de aproximadamente el 1-2% por día en condiciones fisiológicas. Las velocidades de hidrólisis de los enlaces químicos representativos pueden encontrarse en la mayoría de libros de texto de química convencionales.
"Excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que puede incluirse opcionalmente en una composición y que no provoca efectos toxicológicos negativos significativos en un paciente tras la administración.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" se usa en este documento para referirse a la cantidad de un conjugado que es necesaria para proporcionar un nivel deseado del conjugado o un agente activo no conjugado correspondiente en el torrente circulatorio o en el tejido diana después de la administración. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo, el agente activo particular, los componentes y las características físicas de la composición terapéutica, la población de pacientes pretendida, el modo de suministro, las consideraciones del paciente individual y similares, y puede determinarlo fácilmente un experto en la materia.
"Multi-funcional" se refiere a un polímero que tiene tres o más grupos funcionales contenidos en su interior, pudiendo ser los grupos funcionales iguales o diferentes. Los reactivos poliméricos multi-funcionales contendrán típicamente un número de grupos funcionales en uno o más de los siguientes intervalos: aproximadamente 3-100 grupos funcionales; de 3-50 grupos funcionales; de 3-25 grupos funcionales; de 3-15 grupos funcionales; de 3 a 10 grupos funcionales. Los números ejemplares de grupos funcionales incluyen 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 grupos funcionales dentro de la estructura básica del polímero.
"Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita posteriormente puede ocurrir o no, de manera que la descripción incluye casos donde la circunstancia ocurre y casos donde no.
"Sustancialmente" (a menos que se defina específicamente para un contexto particular en cualquier parte o el contexto claramente dicte otra cosa) significa casi totalmente o completamente, por ejemplo, satisfaciendo uno o más de los siguientes: mayor del 50%, 51% o mayor, 75% o mayor, 80% o mayor, 90% o mayor y 95% o mayor de la condición.
La expresión "condiciones sustancialmente no acuosas" se refieren a una composición o medio de reacción que tiene menos de 10.000 partes por millón de agua (menor del 1%), más preferiblemente que tiene menos de 1.000 partes por millón de agua (menos del 0,1%), aún más preferiblemente menos de 100 partes por millón de agua (menos del 0,01%), aún más preferiblemente menos de 10 partes por millón de agua (menos de 0,001%). Preferiblemente, aunque no necesariamente, las condiciones sustancialmente no acuosas incluyen una atmósfera inerte.
A menos que el contexto claramente dicte otra cosa, cuando el término "aproximadamente" precede a un valor numérico, el valor numérico se entiende que significa \pm10% del valor numérico indicado.
Método para Preparar Un Polímero Soluble en Agua, Terminado en Ácido Maleámico, Sustituido
En una o más realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para preparar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido. El método comprende:
a) combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido; y
a') opcionalmente, aislar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido.
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La etapa de combinación requiere, como material de partida, un polímero soluble en agua, terminado en amina. Como se usa en este documento un "polímero soluble en agua, terminado en amina" es cualquier polímero soluble en agua que lleva al menos un grupo amina ("-NH_{2}"), independientemente de si el grupo amina está localizado realmente o no en el extremo del polímero soluble en agua. Típicamente, aunque no necesariamente, el polímero soluble en agua, terminado en amina, tendrá sólo un grupo amina, aunque el polímero soluble en agua, terminado en amina, puede tener más de un grupo amina. De esta manera, el polímero soluble en agua, terminado en amina, puede tener (por ejemplo) un número total de grupos amina de uno cualquiera de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve y diez.
Un polímero soluble en agua, terminado en amina, ejemplar comprende la siguiente estructura:
(Fórmula II)POLI-(X^{2})_{c}-NH_{2}
en la que:
POLI es un polímero soluble en agua (preferiblemente lineal o ramificado y preferiblemente es CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2})_{n}-
O-CH_{2}CH_{2}-, en la que (n) es de 2 a 4000 cuando POLI es lineal);
(c) es cero o uno (preferiblemente cero); y
X^{2}, cuando está presente, es un resto espaciador.
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La etapa de combinación requiere también un reactivo de maleimida. El reactivo de maleimida es un reactivo que, tras la combinación con un polímero soluble en agua, terminado en amina, da como resultado la formación de uno de los siguientes: un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, o un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido.
Un reactivo de maleimida ejemplar comprende la siguiente estructura:
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en la que:
Y^{1} es O o S (preferiblemente O);
Y^{2} es O o S (preferiblemente O);
(a) es un número entero de 1 a 20 (preferiblemente uno o dos);
R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico (preferiblemente H);
R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico (preferiblemente H);
R^{3}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico (preferiblemente H); y
R^{4}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico (preferiblemente H).
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Un reactivo de maleimida preferido es una N-alcoxicarbonilmaleimida, particularmente en la que el alcoxi es alcoxi inferior. Una N-alcoxicarbonilmaleimida preferida, N-metoxicarbonilmaleimida se muestran a continuación:
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La etapa de combinación incluye poner el polímero soluble en agua, terminado en amina, en contacto con el reactivo de maleimida y puede conseguirse por cualquier método conocido por los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, una composición que comprende el polímero soluble en agua, terminado en amina, y una composición que comprende el reactivo de maleimida pueden combinarse en un recipiente de reacción. La etapa de combinación, sin embargo, se realizar para minimizar la introducción de agua.
Después de la etapa de combinación, el método para preparar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, incluye opcionalmente la etapa de aislar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido.
Cuando se pretende aislar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, (y de esta manera realizar la etapa opcional de aislar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido) puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica para aislar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido y la invención no está limitada en este aspecto. Por ejemplo, las técnicas de aislamiento seleccionadas entre el grupo que consiste en cromatografía (por ejemplo, cromatografía en gel de sílice, cromatografía HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de iones y similares) electroforesis, precipitación (incluyen, por ejemplo, recristalización) y puede usarse extracción para aislar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido. Una técnica de aislamiento preferida es precipitación, que puede conseguirse usando métodos conocidos en la técnica (tales como añadir un exceso de alcohol isopropílico, éter dietílico, MTBE, heptano, THF, hexano y similares, para provocar que el producto precipite). Las técnicas de precipitación producirán un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, seco. Pueden usarse otras técnicas también que dan como resultado el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, seco.
El polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, puede tomar cualquier número de formas. Una forma preferida es un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, que comprende la siguiente estructura:
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en la que:
POLI es un polímero soluble en agua;
(b) es cero o uno;
X^{1}, cuando está presente, es un resto espaciador;
Y^{1} es O o S;
Y^{2} es O o S;
(a) es un número entero de 1 a 20;
R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
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R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{3}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y
R^{4}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico
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Se prefiere que un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, se proporcione en forma aislada, lo que significa una composición en la que al menos aproximadamente el 70% (más preferiblemente al menos el 80% y lo más preferiblemente al menos el 90%) de todas las especies poliméricas en la composición estén en la forma de polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, (y no en la forma soluble en agua terminada en amina o la forma de polímero soluble en agua, terminada en maleimida).
Antes de usar cualquier polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, aislado lo típico es realizar la etapa adicional de redisolver el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, aislado (y típicamente secado) para regenerar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, en un sistema líquido no acuoso.
Las etapas del método usado para preparar un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, se realizan típicamente en un disolvente orgánico. Aunque puede usarse cualquier disolvente la invención no está limitada en este aspecto, incluyendo los disolventes orgánicos ejemplares aquellos disolventes seleccionados entre el grupo que consiste en hidrocarburos alifáticos halogenados, alcoholes, hidrocarburos aromáticos, alcoholes, hidrocarburos aromáticos halogenados, amidas (incluyendo DMF), nitrilos (incluyendo acetonitrilos), cetonas (incluyendo acetona), acetales (incluyendo acetato de etilo), éteres, éteres cíclicos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de disolventes orgánicos preferidos incluyen aquellos seleccionados entre el grupo que consiste en cloruro de metileno (o diclorometano), cloroformo, octanol, tolueno, metil t-butil éter, THF (tetrahidrofurano), acetato de etilo, carbonato de dietilo, acetona, acetonitrilo, DMF (dimetil formamida), DMSO, dimetilacetamida, N-ciclohexilpirrolidinona, ciclohexano y combinaciones de los mismos.
El método para preparar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, tiene utilidad, entre otras cosas, para proporcionar un intermedio que es útil en la formación de un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, (como se analizará en este documento). Realizando este método, es posible proporcionar mayores rendimientos reproducibles del polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, a partir del polímero soluble en agua, terminado en amina, proporcionando de esta manera un intermedio más puro que puede dar como resultado una composición de polímero terminado en maleimida, más puro y una composición de conjugado correspondiente formado a partir del mismo. Adicionalmente, el método proporciona composiciones que tienen menos impurezas basadas en ácido maleámico en la composición.
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Método Para Preparar un Polímero Soluble en Agua, Terminado en Maleimida
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un método para preparar un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, comprendiendo el método
a) combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido; y
b) exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación en condiciones sustancialmente no acuosas para dar como resultado de esta manera el polímero soluble en agua, terminado en maleimida.
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La etapa de combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, puede realizarse como se ha descrito anteriormente con respecto al método para preparar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido.
Una vez que se ha realizado la etapa de combinación, el método de la presente invención para preparar un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, incluye también las etapas opcionales de aislar y redisolver el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido. Cada una de estas etapas opcionales (la etapa de aislamiento opcional y la etapa de redisolución opcional) pueden realizarse como se ha descrito anteriormente con respecto al método para preparar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido.
Las etapas del método de la presente invención para preparar un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, incluyen la etapa de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación que comprende calentar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico. Puede usarse cualquiera de las condiciones de eliminación conocidas en la técnica y la invención no está limitada en este aspecto. Por ejemplo, las condiciones de eliminación adecuadas comprenden calentar a reflujo el polímero soluble en agua, terminado en ácido, a una temperatura mayor de al menos aproximadamente 35ºC, más preferiblemente al menos aproximadamente 40ºC.
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La exposición a condiciones de eliminación pueden incluir también retirar el agua del medio de reacción, por ejemplo, exponiendo el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a un agente de secado (tal como añadiendo NaHCO_{3}, Na_{2}CO_{3}, CaCl_{2}, CaSO_{4}, MgSO_{4}, KOH, Na_{2}SO_{4}, K_{2}CO_{3}, KHCO_{3} y combinaciones de los mismos), un tamiz molecular (por ejemplo, silicatos de aluminio), destilación azeotrópica y combinaciones de cualquiera de las anteriores.
Pueden usarse también catalizadores para potenciar la cinética del método. En este aspecto, se prefiere realizar el presente método para preparar un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, en presencia de un catalizador tal como un catalizador de amina no nucleófilo o un catalizador básico. Con respecto a catalizadores de amina no nucleófilos, se prefieren catalizadores de amina no nucleófilos con impedimentos estéricos. Los ejemplos de catalizadores de amina no nucleófilos incluyen aquellos seleccionados entre el grupo que consiste en DMAP (N,N-dimetil-4-aminopiridina), DBU (1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno), DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano), diisopropiletilamina, trietilamina, n-metil morfolina. Los ejemplos de catalizadores de amina no nucleófila con impedimentos estéricos incluyen DMAP (N,N-dimetil-4-aminopiridina), DBU (1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno), DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano) y diisopropiletilamina. Los ejemplos de catalizadores básicos incluyen carbonato sódico, bicarbonato sódico, carbonato potásico y bicarbonato potásico.
Las etapas del método usado para preparar un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, se realizan típicamente en un disolvente orgánico. Aunque puede usarse cualquier disolvente orgánico y la invención no está limitada en este aspecto, los disolventes orgánicos ejemplares incluyen aquellos disolventes seleccionados entre el grupo que consiste en hidrocarburos alifáticos halogenados, alcoholes, hidrocarburos aromáticos, alcoholes, hidrocarburos aromáticos halogenados, amidas (incluyendo DMF), nitrilos (incluyendo acetonitrilos), cetonas (incluyendo acetonas), acetatos (incluyendo acetato de etilo), éteres, éteres cíclicos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de disolventes orgánicos preferidos incluyen aquellos seleccionados entre el grupo que consiste en cloruro de metileno (o diclorometano), cloroformo, octanol, tolueno, metil t-butil éter, THF (tetrahidrofurano), acetato de etilo, carbonato de dietilo, acetona, acetonitrilo, DMF, DMSO, dimetilacetamida, N-ciclohexilpirrolidinona, ciclohexano y combinaciones de los mismos.
El polímero soluble en agua, terminado en maleimida, puede tener diversas estructuras y dependerá de la estructura del polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, del que procede. Un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, ejemplar preparado de acuerdo con el método de la presente invención tendrá la siguiente estructura:
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en la que cada uno de POLI, X^{2} y (c) se definen como se ha indicado en la Fórmula II y cada R^{3} y R^{4} se define como se ha indicado en la Fórmula III.
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Un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, preferido particularmente comprenderá la siguiente estructura:
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en la que (n) es un número entero de 2 a aproximadamente 4000.
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Composición que Contiene un Polímero Soluble en Agua, Terminado en Maleimida
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona una composición que contiene polímero soluble en agua, terminado en maleimida, siendo la composición el resultado del método que comprende:
a) combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico; y
b) exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación en condiciones sustancialmente no acuosas para dar como resultado de esta manera una composición que contiene polímero soluble en agua, terminado en maleimida.
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De esta manera, se incluyen en la invención composiciones de polímeros solubles en agua, terminados en maleimida, formados de acuerdo con el método proporcionado, se cree que las composiciones que resultan del método tienen una mayor pureza que las de los métodos conocidos previamente. Específicamente, las composiciones que contienen un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, poseen porcentajes relativamente bajos de polímeros solubles en agua, terminados en ácido maleámico (por ejemplo, típicamente menor del cuatro por ciento y a menudo menor del dos por ciento). Además, las composiciones que contienen un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, están sustancialmente libres de furano, preferiblemente completamente libres de furano.
En otra realización de la invención, se proporcionan composiciones que contienen un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, comprendiendo dichas composiciones especies poliméricas en las que al menos el 70% de la especie polimérica en la composición son polímeros solubles en agua, terminados en maleimida, y adicionalmente en el que la composición comprende especies poliméricas de éster de anillo abierto. Las especies poliméricas de éster de anillo abierto tienen la estructura
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en la que cada uno de POLI, X^{1}, (a), (b), R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, Y^{1} e Y^{2} es como se ha definido con respecto a la Fórmula I. Este "éster de anillo abierto" no se encuentra en relación con la ruta de N-alcoxicarbonilmaleimida basada en agua para preparar polímeros solubles en agua, terminados en maleimida.
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Método para Preparar una Composición que Contiene un Conjugado
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona un método para preparar una composición que contiene un conjugado, comprendiendo el método combinar (en un recipiente de reacción) un agente biológicamente activo que contiene tiol (tal como una proteína o polipéptido que contiene cisteína) con una composición de polímero soluble en agua, terminado en maleimida, como se proporciona en este documento para dar como resultado de esta manera una composición que contiene un conjugado. Aunque se han descrito enfoques para polímeros solubles en agua, terminados en maleimida, conjugados con agentes biológicamente activos que contienen tiol, un enfoque ejemplar implica disolver el polímero soluble en agua, terminado en maleimida, en agua desionizada para crear una solución de reactivo al 10% y combinarla con un agente biológicamente activo que contiene tiol (a un exceso molar de cinco a veinte veces de polímero respecto al agente biológicamente activo que contiene tiol) y mezclando bien. Después de aproximadamente una hora de reacción a temperatura ambiente el vial de reacción puede enfriarse y mezclarse durante aproximadamente doce horas para asegurar un tiempo de reacción suficiente. El pH de la reacción puede llevarse a aproximadamente 7.
De esta manera, se incluyen dentro de la invención métodos para preparar composiciones que contienen un conjugado usando las composiciones de polímero soluble en agua, terminado en maleimida, de la invención. El agente activo que contiene tiol puede ser cualquier proteína que lleve un resto cisteína que no esté implicada en el enlace disulfuro intraproteína.
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Composiciones que Contienen un Conjugado
En una o más realizaciones de la invención, se proporciona una composición que contiene un conjugado, siendo la composición un resultado del método que comprende combinar un agente activo que contiene tiol con una composición que contiene polímero soluble en agua, terminado en maleimida, como se proporciona en este documento.
De esta manera, se incluyen dentro de la invención composiciones que contienen un conjugado formadas de acuerdo con el método proporcionado para preparar composiciones que contienen un conjugado. Se cree que las composiciones resultantes del método tienen una mayor pureza que los métodos conocidos previamente. Las composiciones que contienen un conjugado, tales como las composiciones de polímero soluble en agua, terminado en maleimida, usadas para crearlas, poseen porcentajes relativamente bajos de polímeros solubles en agua, terminados en ácido maleámico (por ejemplo, típicamente menor del cuatro por ciento y a menudo menor del dos por ciento). Además, las composiciones que contienen un conjugado están sustancialmente libres de furano, preferiblemente completamente libres de furano.
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El Polímero Soluble en Agua, ("POLI")
Como se usa en este documento la expresión "polímero soluble en agua" incluye aquellos polímeros solubles en agua que son biocompatibles y no inmunógenos y excluye específicamente cualquier segmento de polímero soluble en agua que no sea biocompatible y sea no inmunógeno. Con respecto a la biocompatibilidad, una sustancia se considera biocompatible si los efectos beneficiosos asociados con el uso de la sustancia sola o con otra sustancia (por ejemplo, un agente activo) en conexión con tejidos vivos (por ejemplo, administración a un paciente) tiene más importancia que cualquier efecto perjudicial evaluado por un médico de clínica, por ejemplo, un médico. Con respecto a la no inmunogenicidad, una sustancia se considera no inmunógena si el uso pretendido de la sustancia in vivo no produce una respuesta inmune indeseada (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmune, que dicha respuesta no se considere clínicamente significativa o importante según lo evalúe un médico. Se prefiere particularmente que los segmentos de polímeros solubles en agua descritos en este documento así como sus conjugados sean biocompatibles y no inmunógenos.
Cuando se hace referencia al polímero, debe entenderse que el polímero puede ser cualquiera de un número de polímeros solubles en agua y no peptídicos tales como los descritos en ese documento, adecuados para usar en la presente invención: preferiblemente, el polímero es poli(etilenglicol) (es decir, PEG). El término PEG incluye poli(etilenglicol) en cualquiera de un número de geometrías o formas, incluyendo formas lineales, ramificadas o formas multi-brazo (por ejemplo, PEG bifurcado o PEG unido a un núcleo de poliol), PEG colgante o PEG con uniones degradables en su interior, que se describirá más completamente a continuación.
El número de grupos funcionales soportados por el polímero y la posición de los grupos funcionales puede variar. Típicamente, el polímero comprenderá de 1 a aproximadamente 25 grupos funcionales, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 grupos funcionales. Los polímeros lineales tales como polímeros de PEG comprenderán típicamente uno o dos grupos funcionales situados en el extremo de la cadena polimérica. Si el polímero de PEG es monofuncional (es decir, mPEG lineal), el polímero incluirá un solo grupo funcional. Si el polímero de PEG es difuncional, el polímero puede contener dos grupos funcionales seleccionados independientemente, uno en cada extremo de la cadena polimérica. Como se entenderá, los polímeros multi-brazo o ramificados pueden comprender un mayor número de grupos funcionales.
Las moléculas de PEG multi-brazo o ramificado, tales como aquellas descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 5.932.462, pueden usarse también como el polímero de PEG. Hablando en general, un polímero multi-brazo o ramificado posee dos o más "brazos" poliméricos que se extienden desde un punto de ramificación central. Por ejemplo, un polímero de PEG ramificado ejemplar tiene la estructura:
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en la que PEG_{1} y PEG_{2} son polímeros de PEG en cualquiera de las formas o geometrías descritas en este documento y que pueden ser iguales o diferentes y L' es una unión hidrolíticamente estable. Un PEG ramificado ejemplar tiene la estructura:
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en la que poli_{a} y poli_{b} son estructuras básicas de PEG, tales como metoxi poli(etilenglicol); R'' es un resto no reactivo, tal como H, metilo o una estructura básica de PEG y P y Q son uniones no reactivas. En una realización preferida, el polímero de PEG ramificado es lisina disustituida con metoxi y poli(etilenglicol).
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La estructura de PEG ramificado puede unirse a un tercer oligómero o cadena de polímero como se muestra a continuación:
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en la que PEG_{3} es un tercer oligómero o cadena polimérica de PEG, que puede ser igual o diferente de PEG_{1} y PEG_{2}.
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El polímero de PEG puede comprender alternativamente un PEG bifurcado. Hablando en general, un polímero que tiene una estructura bifurcada se caracteriza por tener una cadena polimérica unida a dos o más grupos funcionales mediante uniones covalentes que se extienden desde un punto de ramificación hidrolíticamente estable en el polímero. Un ejemplo de un PEG bifurcado se representa mediante PEG-YCHZ_{2}, donde Y es un grupo de unión y Z es un grupo terminal activado para unión covalente a un agente biológicamente activo. El grupo Z se une a CH mediante una cadena de átomos de longitud definida. La Patente de Estados Unidos Nº 6.362.254 describe diversas estructuras de PEG bifurcadas que pueden usarse en la presente invención. La cadena de átomos que unen los grupos funcionales Z (por ejemplo, grupos hidroxilo) al átomo de carbono de la ramificación sirven como un grupo de unión y pueden comprender, por ejemplo, una cadena de alquilo, una unión éter, una unión éster, una unión amida o combinaciones de las mismas.
El polímero de PEG puede comprender una molécula de PEG colgante que tiene grupos reactivos (por ejemplo, hidroxilo) unidos covalentemente a lo largo de la longitud de la estructura básica de PEG en lugar de al final de la cadena de PEG. Los grupos reactivos colgantes pueden unirse a la estructura básica de PEG directamente o mediante un resto de unión, tal como un grupo alquileno.
Además de las formas descritas anteriormente de PEG, el polímero puede prepararse también con una o más uniones hidrolíticamente estables o degradables en la estructura básica del polímero, incluyendo cualquiera de los polímeros descritos anteriormente. Por ejemplo, PEG puede prepararse con uniones éster en la estructura básica del polímero que están sometidas a hidrólisis. Como se muestra a continuación, esta hidrólisis da como resultado la escisión del polímero en fragmentos de peso molecular inferior:
-PEG-CO_{2}-PEG- + H_{2}O \rightarrow -PEG-CO_{2}H + HO-PEG-
Otras uniones hidrolíticamente degradables, útiles como una unión degradable dentro de una estructura básica de polímero, incluyen uniones carbonato; uniones imina resultantes, por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehído (véase por ejemplo, Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(1): 582-3 (1997).; uniones éster de fosfato formadas, por ejemplo, haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; uniones hidrazona que se forman típicamente por reacción de una hidrazida y un aldehído; uniones acetal que se forman típicamente por reacción entre un aldehído y un alcohol; uniones ortoéster que se forman, por ejemplo, por reacción entre derivados de ácido y un alcohol y uniones oligonucleótido formadas por ejemplo, mediante un grupo fosforamidita, al final de un polímero, y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucleótido. El uso de muchas de las uniones degradables descritas anteriormente es menos preferido debido a la reactividad nucleófila de muchas de las uniones inestables con grupos amina.
Los expertos en la materia entienden que el término poli(etileno) o PEG representa o incluye todas las formas anteriores de PEG.
Cualquiera de una variedad de otros polímeros que comprenden otras cadenas poliméricas no peptídicas y solubles en agua pueden usarse también en la presente invención. El polímero puede ser lineal, o puede estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente (por ejemplo, ramificado, bifurcado y similares). Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen, aunque sin limitación, otros poli(alquilenglicoles), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(alcoxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacáridos), poli(ácido \alpha-hidroxiacético), poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolinas, poli(N-acriloilmorfolina) tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.629.384 y copolímeros y mezclas de los mismos.
Aunque el peso molecular del polímero soluble en agua puede variar dependiendo de la aplicación deseada, la configuración de la estructura del polímero, el grado de ramificación y similares, el peso molecular satisfará uno o más de los siguientes valores: mayor de 100 Dalton; mayor de 200 Dalton; mayor de 400 Dalton; mayor de 500 Dalton, mayor de 750 Dalton; mayor de 900 Dalton; mayor de 1.000 Dalton; mayor de 1.400 Dalton; mayor de 1.500 Dalton. mayor de 1.900 Dalton; mayor de 2.000 Dalton; mayor de 2.200 Dalton; mayor de 2.500 Dalton; mayor de 3.000 Dalton; mayor de 4.000 Dalton; mayor de 4.900 Dalton; mayor de 5.000 Dalton; mayor de 6.000 Dalton; mayor de 7.000 Dalton; mayor de 7.500 Dalton. mayor de 9.000 Dalton; mayor de 10.000 Dalton; mayor de 11.000 Dalton; mayor de 14.000 Dalton. mayor de 15.000 Dalton; mayor de 16.000 Dalton; mayor de 19.000 Dalton; mayor de 20.000 Dalton; mayor de 21.000 Dalton; mayor de 22.000 Dalton. mayor de 25.000. Dalton; y mayor de 30.000 Dalton. Se entiende que el límite máximo para el peso molecular para cualquier segmento de polímero soluble en agua dado útil en este documento es menor de aproximadamente 300.000 Dalton.
El peso molecular del polímero típicamente estará dentro de al menos uno de los siguientes intervalos: de aproximadamente 100 Dalton a aproximadamente 100.000 Dalton; de aproximadamente 200 Dalton a aproximadamente 60.000 Dalton; de aproximadamente 300 Dalton a aproximadamente 40.000 Dalton.
Los pesos moleculares ejemplares para el polímero soluble en agua incluyen aproximadamente 100 Dalton, aproximadamente 200 Dalton, aproximadamente 300 Dalton, aproximadamente 350 Dalton, aproximadamente 400 Dalton, aproximadamente 500 Dalton, aproximadamente 550 Dalton, aproximadamente 600 Dalton, aproximadamente 700 Dalton, aproximadamente 750 Dalton, aproximadamente 800 Dalton, aproximadamente 900 Dalton, aproximadamente 1.000 Dalton, aproximadamente 2.000 Dalton, aproximadamente 2.200 Dalton, aproximadamente 2.500 Dalton, aproximadamente 3.000 Dalton, aproximadamente 4.000 Dalton, aproximadamente 4.400 Dalton, aproximadamente 5.000 Dalton, aproximadamente 6.000 Dalton, aproximadamente 7.000 Dalton, aproximadamente 7.500 Dalton, aproximadamente 8.000 Dalton, aproximadamente 9.000 Dalton, aproximadamente 10.000 Dalton, aproximadamente 11.000 Dalton, aproximadamente 12.000 Dalton, aproximadamente 13.000 Dalton, aproximadamente 14.000 Dalton, aproximadamente 15.000 Dalton, aproximadamente 20.000 Dalton, aproximadamente 22.500 Dalton, aproximadamente 25.000 Dalton, aproximadamente 30.000 Dalton, aproximadamente 35.000 Dalton, aproximadamente 40.000 Dalton, aproximadamente 50.000 Dalton, aproximadamente 60.000 Dalton., y aproximadamente 75.000 Dalton.
Con respecto a las versiones ramificadas del polímero, los intervalos ejemplares de tamaño son adecuados para el peso molecular total del polímero (basado básicamente en los pesos combinados de las dos partes de polímero solubles en agua) incluyen los siguientes: de aproximadamente 200 Dalton a aproximadamente 100.000 Dalton; de aproximadamente 1.000 Dalton a aproximadamente 80.000 Dalton; de aproximadamente 2.000 Dalton a aproximadamente 50.000 Dalton; de aproximadamente 4.000 Dalton a aproximadamente 25.000 Dalton; y de aproximadamente 10.000 Dalton a aproximadamente 40.000 Dalton. Más particularmente, el peso molecular promedio en peso de una versión ramificada del polímero de la invención corresponde a uno de los siguientes: 400; 1.000; 1.500; 2.000; 3000; 4.000; 10.000; 15.000; 20.000; 30.000; 40.000; 50.000; 60.000; u 80.000.
Con respecto a PEG, donde puede proporcionarse una estructura comprende un monómero de óxido de etileno repetido, tal como "-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-" o "-(OCH_{2}CH_{2})_{n}", los valores preferidos para (n) incluyen: de aproximadamente 3 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 10 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 15 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 20 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 25 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 30 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 40 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 50 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 55 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 75 a aproximadamente 3.000; de aproximadamente 100 a aproximadamente 3.000; y de aproximadamente 225 a aproximadamente 3.000.
El Resto Espaciador ("X^{1}", "X^{2}" y similares).
Opcionalmente, un resto espaciador puede unir el polímero soluble en agua a la maleimida y/o el resto maleimida al resto de un agente activo que contiene tiol. Los restos espaciadores ejemplares incluyen los siguientes: -O-, -S-, -C(O)-, -O-C(O)-, -C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -O-CH_{2}-, -CH_{2}-O-, -O-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-O-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-O-, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-, -O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}^{-}, -CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-O-, -C(O)-NH-CH_{2}-, -C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-,
-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-, -C (O)-O-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-O-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-O-CH_{2}-, -C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-, -NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -C(O)-NH-CH_{2}-, -C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-, -NH-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-NH-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-NH-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-, -C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C (O)-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-NH-[CH_{2}]_{O . 6}-(OCH_{2}CH_{2})_{O . 2}-,
-C(O)-NH-(CH_{2})_{1 . 6}-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH_{2})_{1 . 6}NH-C(O)-, -O-C(O)-CH_{2}-, -O-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, -O-C(O)-
CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-
CH_{2}-, grupo cicloalquilo bivalente, -CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-C(O)-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-, O-C(O)-NH-[CH_{2}]_{f}-
(OCH_{2}CH_{2})_{n}, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, donde (f) es de 0 a 6, (n) es de 0 a 20 (preferiblemente de 0 a 10, por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 y más preferiblemente 4). Además, cada uno de los restos espaciadores que contienen carbono anteriores puede tener un grupo alquilo ramificado unido al mismo. Los ejemplos no limitantes de grupos cicloalquilo bivalente (por ejemplo, cicloalquileno) incluyen cicloalquilo C_{3-8}, tal como diversos isómeros de ciclopropadiílo (por ejemplo, 1,1-, cis-11,2- o trans-1,2-ciclopropileno), ciclobutadiílo, ciclopentadiílo, ciclohexadiílo y cicloheptadiílo. El grupo cicloalquileno puede estar sustituido con uno o más grupos alquilo, preferiblemente grupos alquilo C_{1-6}.
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Conjugados Biológicamente Activos
La presente invención incluye también conjugados biológicamente activos y estabilizados que comprende una molécula biológicamente activa nucleófila capaz de adición de Michael unida covalentemente al polímero reactivo a través de una unión de anillo de succinimida. El agente biológicamente activo es preferiblemente una proteína que lleva un grupo tiol o amino.
Los agentes biológicamente activos adecuados pueden seleccionarse por ejemplo, entre hipnóticos y sedantes, activadores psíquicos, tranquilizantes, fármacos respiratorios, anticonvulsivos, relajantes musculares, agentes anti-parkinson (antagonistas de dopamina), analgésicos, anti-inflamatorios, fármacos antiansiedad (ansiolíticos), supresores del apetito, agentes antimigraña, contractores musculares, anti-infecciosos (antibióticos, antivirales, antifúngicos, vacunas), antriartríticos, antimalaria, antieméticos, antiepilépticos, broncodilatadores, citocinas, factores de crecimiento, agentes anticancerosos, agentes antitrombóticos, antihipertensores, fármacos cardiovasculares, antiarrítmicos, antioxidantes, agentes antiasma, agentes hormonales incluyendo anticonceptivos, simpaticomiméticos, diuréticos, agentes reguladores de lípidos, agentes antiandrogénicos, antiparasitarios, anticoagulantes, neoplásicos, antineoplásicos, hipoglucémicos, agentes y complementos nutricionales, complementos de crecimiento, agentes antienteritis, vacunas, anticuerpos, agentes de diagnóstico y agentes de contraste.
Los ejemplos de agentes activos adecuados para su uso en la fijación covalente al polímero reactivo de la invención incluyen, aunque sin limitación, calcitonina, eritropoyetina (EPO), Factor VIII, Factor IX, ceredasa, cerecima, ciclosporina, factor estimulante de la colonia de granulocitos (GCSF), trombopoyetina (TPO), inhibidor de alfa-1 proteinasa, elactonina, factor estimulante de la colonia de macrófagos y granulocitos (GMCSF), hormona del crecimiento, hormona del crecimiento humana (HGH), hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH), heparina, heparina de bajo peso molecular (LMWH), interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, receptor de interleucina-1, interleucina-2, antagonista del receptor de interleucina, interleucina-3, interleucina-4, interleucina-6, hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), factor IX de insulina, pro-insulina, análogos de insulina (por ejemplo, insulina mono-acilada como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.922.675), amilina, péptido C, somatostatina, análogos de somatostatina incluyendo octreotida, vasopresina, hormona estimuladora del fulículo (FSH), factor de crecimiento similar a insulina (IGF), insulinotropina, factor estimulante de la colonia de macrófagos (M-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factores de crecimiento tisular, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento glial (GGF), factor de necrosis tumoral (TNF), factores de crecimiento endotelial, hormona paratiroidea (PTH), péptido similar a glucagón, timosina alfa 1, inhibidor IIb/IIIa, antitripsina alfa-1, compuestos de fosfodiesterasa (PDE), inhibidores de VLA-4, bisfosfonatos, anticuerpo del virus sincitial respiratorio, gen regulador transmembrana de fibrosis quística (CFTR), desoxirribonucleasa (ADNasa), proteína de aumento de la permeabilidad/bactericida (BPI), anticuerpo anti-CMV, ácido 13-cis retinoico, macrólidos tales como eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiromicina, midecamicina, leucomicina, miocamicina, roquitamicina, andazitromicina y swinolida A; fluoroquinolonas tales como ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina, alatrofloxacina, moxifloxicina, norfloxacina, enoxacina, grepafloxacina, gatifloxacina, lomefloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina, tosufloxacina, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina, clinafloxacina, y sitafloxacina, aminoglucósidos tales como gentanicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amicacina, kanamicina, neomicina y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato, polimixinas tales como polimixina B, capreomicina, bacitracina, penems; penicilinas incluyendo agentes sensibles a penicilinasa como penicilina G, penicilina V, agente resistentes a peniclinasa como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina; microorganismos gram negativos, agentes activos como ampicilina, amoxicilina y hetacilina, cilina y galampicilina; penicilinas antiseudomonas como carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina; cefalosporinas como cefpodoxima, cefprozil, ceftbuten, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefradrina, cefoxitina, cefamandol, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxilo, cefaloglicina, cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetrila, cefepima, cefixima, cefonicid, cefoperazona, cefotetan, cefmetazol, ceftazidima, loracarbef y moxalactama, monobactamas como aztreonam; y carbapenems tales como imipenem, meropenem, isetiouato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocaína, sulfato de metaproterenol, dipropionato de beclometasona, triamcinolona acetamida, budesonida acetonida, fluticasona, bromuro de ipratropio, flunisolida, cromolina sódica, tartrato de ergotamina y cuando sea aplicable, análogos, agonistas, antagonistas, inhibidores y formas de sal farmacéuticamente aceptables de los anteriores. En referencia a péptidos y proteínas, la invención pretende incluir formas sintéticas, nativas, glucosiladas, no glucosiladas, pegiladas y análogos biológicamente activos
de las mismas.
La presente invención incluye también preparaciones farmacéuticas que comprenden un conjugado como se proporciona en este documento, en combinación con un excipiente farmacéutico. Generalmente, el propio conjugado estará en forma sólida (por ejemplo, un precipitado) que puede combinarse con un excipiente farmacéutico adecuado que puede estar en forma sólida o líquida.
Los excipientes ejemplares incluyen, sin limitación, aquellos seleccionados entre el grupo que consiste en carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, tampones, ácidos, bases y combinaciones de los mismos.
Un carbohidrato tal como un azúcar, un azúcar derivatizado, tal como alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar pueden estar presentes como excipiente. Los excipientes de carbohidrato específicos incluyen, por ejemplo: monosacáridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares, polisacáridos tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol y similares.
El excipiente puede incluir también una sal inorgánica o tampón tal como ácido cítrico, cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, nitrato potásico, fosfato sódico monobásico, fosfato sódico dibásico y combinaciones de los mismos.
La preparación puede incluir también un agente antimicrobiano para evitar o impedir el crecimiento microbiano. Los ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invención incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de acetil piridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol y combinaciones de los mismos.
Un antioxidante puede estar presente en la preparación también. Los antioxidantes se usan para evitar la oxidación, evitando de esta manera el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Los antioxidantes adecuados para usar en la presente invención incluyen por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hidroxifosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito sódico, sulfoxilato de formaldehído sódico, metabisulfito sódico y combinaciones de los mismos.
Un tensioactivo puede estar presente como un excipiente. Los tensioactivos ejemplares incluyen: polisorbatos, tales como "Tween 20" y "Tween 80" y pluronics tales como F68 y F88 (ambos de los cuales están disponibles en BASF, Mount Olive, New Jersey); ésteres de sorbitano, lípidos tales como fosfolípidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferiblemente no en forma liposomal), ácidos grasos y ésteres grasos, esteroides tales como colesterol; y agentes quelantes tales como EDTA, cinc y otros cationes adecuados.
Pueden estar presentes ácidos o bases como un excipiente en la preparación. Los ejemplos no limitantes de ácidos que pueden usarse incluyen aquellos ácidos seleccionados entre el grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen, sin limitación, bases seleccionadas entre el grupo que consiste en hidróxido sódico, acetato sódico, hidróxido de amonio, hidróxido potásico o acetato de amonio, acetato potásico, fosfato sódico, fosfato potásico, citrato sódico, formiato sódico, sulfato sódico, sulfato potásico, fumarato potásico y combinaciones de
los mismos.
Las preparaciones farmacéuticas incluyen todos los tipos de formulaciones y, en particular, aquellas que son adecuadas para inyección, por ejemplo, polvos que pueden reconstituirse, así como suspensiones y soluciones. La cantidad de conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el polímero descrito en este documento) en la composición variará dependiendo de numerosos factores, aunque óptimamente será una dosis terapéuticamente eficaz cuando la composición se almacena en un recipiente de dosis unitaria (por ejemplo, un vial). Además, la preparación farmacéutica puede alojarse en una jeringuilla. Una dosis terapéuticamente puede determinarse experimentalmente por administración repetida de cantidades en aumento de conjugado para determinar que cantidad produce un punto final clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y de las necesidades particulares de la composición. Típicamente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual se determina por experimentación rutinaria, es decir, preparando composiciones que contienen cantidades variables del excipiente (que varían de baja a alta), examinando la estabilidad y otros parámetros de la composición y después determinando el intervalo en el que se alcanza el rendimiento óptimo sin efectos negativos significativos.
Generalmente, sin embargo, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 99% en peso, preferiblemente aproximadamente el 5%-98% en peso, más preferiblemente aproximadamente el 15-95% en peso del excipiente, siendo las más preferidas las concentraciones menores del 30% en peso.
Estos excipientes farmacéuticos anteriores junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19ª ed., Williams & Williams, (1995), "Physician's Desk Reference", 52ª ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3ª Edición, American Pharmaceutical Association, Washington, D. C., 2000.
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención típicamente, aunque no necesariamente, se administran por inyección y, de esta manera, generalmente son soluciones o suspensiones líquidas antes de la administración. La preparación farmacéutica pueden tomar también otras formas tales como jarabes, cremas, pomadas, comprimidos, polvos y similares. Se incluyen también otros modos de administración tales como pulmonar, rectal, transdérmica, transmucosa, oral, intratecal, subcutánea, intraarterial y similares.
Como se ha descrito previamente, los conjugados pueden administrarse por vía parenteral, por inyección intravenosa o, menos preferiblemente, por inyección intramuscular o subcutánea. Los tipos de formulación adecuados para administración parenteral incluyen soluciones listas para inyectar, polvos secos para combinación con un disolvente antes de su uso, suspensiones listas para inyectar, composiciones insolubles secas para combinación con un vehículo antes de su uso y emulsiones y concentrados líquidos para dilución antes de la administración, entre otros.
La invención proporciona también un método para administrar un conjugado como se proporciona en este documento a un paciente que padece una afección que es sensible al tratamiento con un conjugado. El método comprende administrar, generalmente por inyección, una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado (proporcionado preferiblemente como parte de una preparación farmacéutica). El método de administración puede usarse para tratar cualquier afección que pueda remediarse o evitarse por la administración del conjugado particular. Aquellos expertos en la materia apreciarán qué afecciones puede tratar eficazmente un conjugado específico. La dosis real a administrar variará dependiendo de la edad, peso y estado general del paciente así como de la gravedad de la afección a tratar, el juicio del profesional sanitario y el conjugado administrado. Las cantidades terapéuticamente eficaces las conocen los expertos en la materia y/o se describen en los libros de texto y la bibliografía de referencia. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz variará de aproximadamente 0,001 mg a 100 mg, preferiblemente en dosis de 0,01 mg/día a 75 mg/día y más preferiblemente en dosis de 0,10 mg/día a 50 mg/día.
La dosificación unitaria de cualquier conjugado dado (de nuevo proporcionado preferiblemente como parte de una preparación farmacéutica) puede administrarse en diversos esquemas de dosificación dependiendo del juicio del médico, las necesidades del paciente y similares. El esquema de dosificación específico lo conocerá el experto habitual en la materia o puede determinarse experimentalmente usando métodos rutinarios. Los esquemas de dosificación ejemplares incluyen, sin limitación, administración cinco veces al día, cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes y cualquier combinación de las mismas. Una vez que se ha conseguido el punto final clínico, la dosificación de la composición se detiene.
Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con realizaciones específicas preferidas de la misma, la descripción anterior así como los ejemplos que siguen pretenden ilustrar y no limitar el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invención resultarán evidentes para aquellos expertos en la materia a la que pertenece la invención. Aunque se emplean términos específicos en este documento, se usan en un sentido genérico y descriptivo únicamente y no con propósitos de limitación.
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Parte experimental
La práctica de la invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de síntesis orgánica, bioquímica, purificación de proteínas y similares, que están dentro de las especialidades de la técnica. Dichas técnicas se explican totalmente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4ª Ed. (Nueva York: Wiley-Interscience, 1992), supra.
En los siguientes ejemplos, se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), aunque podría encontrarse algún error y desviación experimental. A menos que se indique de otra manera, la temperatura está en grados C y la presión está cerca de la presión atmosférica al nivel del mar. Cada uno de los siguiente ejemplos se considera que es instructivo para un experto habitual en la materia para realizar una o más de las realizaciones descritas en este documento. Todos los datos de ^{1}H RMN se generaron mediante un espectrómetro de RMN a 300 ó 400 MHz fabricado por Bruker. En los Ejemplos 5 a 12, se usó mPEG (20 kDa)-amina de calidad comercial que tenía la siguiente caracterización: porcentaje de sustitución de amina, del 94,6 al 100%; porcentaje de impureza hidroxi mPEG, del 0 al 4,2%; porcentaje de dímeros (especies formadas a partir de la reacción de dos especies de PEG funcionalizadas entre sí), del 0,6 al 2,1%; porcentaje de trímeros (especies formadas a partir de la reacción de tres especies de PEG funcionalizadas entre sí), del 0 al 0,3%.
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Ejemplo 1 Preparación de un Polímero Soluble en Agua, Terminado en Ácido Maleámico, Sustituido
13
A una solución de mPEG (20 kDa)-amina (NektarTherapeutics, 50,0 g, 0,0025 mol) en diclorometano anhidro (350 ml), se le añadió N-metoxicarbonilmaleimida (0,80 g, 0,0051 mol) y la solución se agitó durante una hora a temperatura ambiente en atmósfera de argón. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (1,0 ml) y la mezcla se agitó durante una noche a temperatura ambiente en atmósfera de argón. A continuación, la mezcla de reacción se concentró retirando por destilación 200 ml de diclorometano y el producto se precipitó con éter etílico. El rendimiento después del secado fue de 46,3 g. RMN (d_{6}-DMSO): 3,24 ppm (s, PEG-OCH_{3}), 3,51 ppm (s, estructura básica de PEG), 3,86 ppm (s, CH_{3}O-NH-), 6,20 ppm (m, -CH=CH-), 8,46 ppm (-NH).
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Ejemplo 2 Preparación de mPEG (20 kDa) Maleimida
14
A la solución del polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, preparada en el Ejemplo 1 (10,0 g) en acetonitrilo anhidro (100 ml) se le añadió N,N-diisopropiletilamina (10 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante cuarenta y cuatro horas a temperatura ambiente en atmósfera de argón. A continuación, la mezcla se concentró retirando por destilación 80 ml de acetonitrilo y el producto se precipitó con éter etílico dando 8,5 g de mPEG (20 kDa)-maleimida. RMN (d_{6}-DMSO): 3,24 ppm (s, PEG-OCH_{3}), 3,51 ppm (s, estructura básica de PEG), 7,01 ppm (s, -CH=CH-, maleimida); sustitución del 93,5%.
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Ejemplo 3 Un Protocolo Para Preparar un Polímero Soluble en Agua, Terminado el Ácido Maleámico, Sustituido
15
en la que (con respecto a la Formula II):
POLI es un polímero soluble en agua (preferiblemente lineal o ramificado y preferiblemente es CH_{3}O-(CH_{2}
CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-, en la que (n) es de 2 a 4000, cuando POLI es lineal;
(c) es cero o uno (preferiblemente cero); y
X^{2}, cuando está presente, es un resto espaciador,
en la que (con respecto a la Fórmula III):
Y^{1} es O o S;
Y^{2} es O o S;
(a) es un número entero de 1 a 20;
R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{3}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y
R^{4}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
en la que (con respecto a la Fórmula I):
POLI es un polímero soluble en agua;
(b) es cero o uno;
X^{1}, cuando está presente, es un resto espaciador;
Y^{1} es O o S;
Y^{2} es O o S;
(a) es un número entero de 1 a 20;
R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{3}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y
R^{4}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico.
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Se disuelve el polímero soluble en agua, terminado en amina, (Fórmula II) en diclorometano (solución al 20% p/v) y se destila a presión reducida a 40ºC hasta que se retira todo el diclorometano. Este formará una mezcla azeotrópica con agua y retirará eficazmente el agua del polímero restante. Se repite esta etapa una vez más. Se pone al vacío para secar completamente hasta un sólido si se desea (no necesario).
Se redisuelve el polímero en diclorometano anhidro (solución al 20% p/v) en una atmósfera de gas inerte. Se añaden 1,5 equivalentes de un reactivo de maleimida (Fórmula III). Una vez disuelto, se añaden 0,5 equivalentes de diisopropiletilamina gota a gota. Se deja agitar a temperatura ambiente en atmósfera inerte durante al menos una hora (durante una noche estaría bien, aunque puede formar maleimida de anillo cerrado).
Se retira por destilación el disolvente a presión reducida a 25-30ºC hasta que se obtiene una solución de tipo aceite espeso (aproximadamente 0,5-1,5 ml de solución por gramo de polímero soluble en agua, dependiendo del peso molecular). Se añade alcohol isopropílico lentamente a la solución en agitación (aproximadamente 25 ml/g del polímero soluble en agua). Se deja agitar a temperatura ambiente durante al menos treinta minutos. El líquido se retira por filtración. Se vuelve a añadir suficiente alcohol isopropílico para hacer a la suspensión de polímero soluble en agua y después se retira por filtración el líquido una vez más. Se secan los sólidos al vacío hasta que se retira todo el alcohol isopropílico.
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Ejemplo 4 Un Protocolo Para Preparar un Polímero Soluble en Agua, Terminado en Maleimida
16
en la que (con respecto a la Fórmula I):
POLI es un polímero soluble en agua;
(b) es cero o uno;
X^{1}, cuando está presente, es un resto espaciador;
Y^{1} es O o S;
Y^{2} es O o S;
(a) es un número entero de 1 a 20;
R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{3}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y
R^{4}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
en la que (con respecto a la Fórmula V) cada POLI, X^{2} y (c) es como se proporciona en la Fórmula II y cada de uno R^{3} y R^{4} se definen como se proporciona en la Fórmula III.
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Se disuelve el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido, del Ejemplo 3 en diclorometano anhidro para preparar una solución al 10% p/v. Se añade sulfato sódico anhidro (0,5 g/g de PEG). Se añade carbonato sódico anhidro (0,5 g/g de polímero soluble en agua). Se calienta a reflujo en atmósfera de gas inerte (aproximadamente 40ºC). Se agita a reflujo durante cinco horas. Se retira el calor y se deja enfriar a menos de 35ºC. Los sólidos se retiran por filtración. Se retira por destilación el disolvente a presión reducida a 25-40ºC hasta que se obtiene una solución de tipo aceite espeso. Se hace precipitar con alcohol isopropílico como en el Ejemplo 3.
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Ejemplo 5 Preparación no Acuosa de Polímero Soluble en Agua, Terminado en Maleimida
Se combinaron a 40ºC mPEG (20 kDa)-amina en forma de azeótropo, hidroxitolueno butilado (BHT) al 0,01% en peso y diclorometano. La evaporación de los componentes más volátiles se realizó usando un rotavapor. El contenido de agua se ensayó y se encontró que era de 56 ppm (se desea por debajo de 100 ppm). A esta mezcla se le añadieron 0,5 g/g de cada uno de carbonato sódico molido y sulfato sódico granular. Después de la adición del carbonato sódico molido y el sulfato sódico granular, la mezcla se agitó y se enfrió a 5ºC para formar una solución de PEG
enfriada.
Por separado, se disolvieron 3 eq. (0,56 g) de N-metoxicarbonilmaleimida en diclorometano para preparar una solución al 3% (p/v). La mezcla resultante se agitó con formación de vórtice durante 30 segundos. La mezcla agitada con formación de vórtice tenía una apariencia turbia. La mezcla agitada con formación de vórtice se añadió a la solución de PEG fría y se agitó durante 21 horas a aproximadamente 5ºC.
Después de la agitación, la mezcla se calentó gradualmente a aproximadamente 40ºC y se calentó a reflujo durante aproximadamente 45 minutos. Posteriormente, las muestras se extrajeron para determinar si se había completado la reacción por H RMN.
Después de 8,5 horas a reflujo, la mezcla se enfrío a temperatura ambiente, se filtró a través de un lecho de celite y le siguió la retirada del disolvente de diclorometano usando un rotavapor y un baño a 30ºC, produciendo de esta manera un aceite. El producto se recuperó por precipitación con alcohol isopropílico (IPA) (agitación durante 30
minutos).
Los análisis asociados con este ejemplo se proporcionan en las Tablas 1 y 2 y se analizan en el Ejemplo 13.
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Ejemplo 6 Preparación no Acuosa de un Polímero Soluble en Agua, Terminado en Maleimida
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 5, con las siguientes excepciones/indicaciones. Después de la adición del carbonato sódico molido y el sulfato sódico granular, la mezcla se enfrió a 5ºC durante 10 horas. El reflujo se realizó durante 7 horas (mostrando un 6% de precursor en la 6ª hora).
Los análisis asociados con este ejemplo se proporcionan en las Tablas 1 y 2 y se analizan en el Ejemplo 13.
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Ejemplo 7 Preparación no Acuosa de un Polímero Soluble en Agua, Terminado en Maleimida
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 5 con las siguientes excepciones/indicaciones. Después de la adición del carbonato sódico molido y el sulfato sódico granular, la mezcla se agitó y se enfrió a 5,7ºC durante 9,5 horas. En lugar de calentar y después calentar a reflujo, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos antes de calentarla a reflujo. El calentamiento a reflujo se realizó durante 6,5 horas (que mostró un 6% de precursor en la 5ª hora).
Los análisis asociados con este ejemplo se proporcionan en las Tablas 1 y 2 y se analizan en el Ejemplo 13.
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Ejemplo 8 Preparación no Acuosa de un Polímero Soluble en Agua, Terminado en Maleimida
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 5 con las siguientes excepciones/indicaciones. Después de la adición del carbonato sódico molido y el sulfato sódico granular, la mezcla se agitó y se enfrió a 5,75ºC inicialmente y se enfrió gradualmente durante 2 horas a 5ºC con agitación durante 15 horas en total. En lugar del calentamiento y después calentamiento a reflujo, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora antes de calentarla a reflujo. El calentamiento a reflujo se realizó durante 8 horas (que mostró un 13% de precursor en la 6ª hora).
Los análisis asociados con este ejemplo se proporcionan en las Tablas 1 y 2 y se analizan en el Ejemplo 13.
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Ejemplo 9
(Ejemplo Comparativo)
Ruta Acuosa de N-Alcoxicarbonilmaleimida
Una solución al 17,5% (p/v) de mPEG amina (20 kDa) en solución de bicarbonato sódico al 7,6% (p/v) se enfrió a 6ºC. Se le añadió una solución al 10% (p/v) de N-metoxicarbonilmaleimida (3 eq., 5,3%) en acetonitrilo y la mezcla se agitó durante 15 minutos. Se añadió suficiente agua destilada a la solución para doblar el volumen. La solución, en primer lugar, se enfrió y después se permitió que se calentara a 13ºC durante 45 minutos.
El pH de la solución se ajustó a 3,0 con ácido fosfórico y después se añadió suficiente cloruro sódico para proporcionar una solución de sal de cloruro sódico al 15% (p/v). La solución de sal se agitó durante 15 minutos y después se extrajo con un volumen equivalente de diclorometano proporcionando de esta manera una solución.
La solución de diclorometano se secó con sulfato sódico (3,5 g/100 ml) y se evaporó hasta dar como resultado un aceite. La precipitación con alcohol isopropílico (17,5 ml/g), la filtración y el secado dieron un sólido blanco.
Los análisis asociados con este ejemplo se proporcionan en las Tablas 1 y 2 y se analizan en el Ejemplo 13.
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Ejemplo 10
(Ejemplo Comparativo)
Ruta Acuosa de N-Alcoxicarbonilmaleimida
Una solución al 17,5% (p/v) de mPEG amina (20 kDa) en solución de bicarbonato sódico al 7,6% (p/v) se enfrió a de 3,8 a 5,9ºC. Ocurrió una disminución de temperatura hasta temperatura ambiente durante una noche debido a problemas en el refrigerador. Una solución al 10% (p/v) de N-metoxicarbonilmaleimida (3 eq. 4,4%) en acetonitrilo se añadió a la mezcla y se agitó durante 15 minutos. Se añadió suficiente agua destilada a la solución para doblar el volumen. La solución, en primer lugar, se enfrió y después se permitió que se calentara a 13ºC durante 45 minutos.
El pH de la solución se ajustó a 3,0 con ácido fosfórico y después se añadió suficiente cloruro sódico para proporcionar una solución de sal de cloruro sódico al 15% (p/v). La solución de sal se agitó durante 15 minutos y después se extrajo con un volumen equivalente de diclorometano proporcionando de esta manera una solución de diclorometano.
La solución de diclorometano se secó con sulfato sódico (3,5 g/100 ml) y se evaporó para dar como resultado un aceite. La precipitación con alcohol isopropílico (17,5 ml/g), la filtración y el secado dieron un sólido blanco.
Los análisis asociados con este ejemplo se proporcionan en las Tablas 1 y 2 y se analizan en el Ejemplo 13.
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Ejemplo 11
(Ejemplo Comparativo)
Ruta Acuosa de N-Alcoxicarbonilmaleimida
Una solución al 17,5% (p/v) de mPEG amina (20 kDa) en solución de bicarbonato sódico al 7,6% (p/v) se enfrió a 4ºC. Una solución al 10% (p/v) de N-metoxicarbonilmaleimida (3 eq, 5,4%) en acetonitrilo se añadió a la mezcla y se agitó durante 15 minutos. Se añadió suficiente agua destilada a la solución para doblar el volumen. La solución, en primer lugar, se enfrió y después se permitió que se calentara a de 8ºC a 9ºC durante 45 minutos.
El pH de la solución se ajustó a 3,0 con ácido fosfórico y después se añadió suficiente cloruro sódico para proporcionar una disolución de sal de cloruro sódico al 15% (p/v). La solución de sal se agitó durante 15 minutos y después se extrajo con un volumen equivalente de diclorometano, proporcionando de esta manera una solución de diclorometano.
La solución de diclorometano se secó con sulfato sódico (3,5 g/100 ml) y se evaporó para dar como resultado un aceite. La precipitación con alcohol isopropílico (17,5 ml/g), la filtración y el secado dieron un sólido blanco.
Los análisis asociados con este ejemplo se proporcionan en las Tablas 1 y 2 y se analizan en el Ejemplo 13.
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Ejemplo 12
(Ejemplo Comparativo)
Ruta Acuosa de N-Alcoxicarbonilmaleimida
Una solución al 17,5% (p/v) de mPEG amina (20 kDa) en solución de bicarbonato sódico al 7,6% (p/v) se enfrió a 6ºC. Una solución al 10% (p/v) de N-metoxicarbonilmaleimida (3 eq. 5,3%) en acetonitrilo se añadió y la mezcla se agitó durante 15 minutos. Se añadió suficiente agua destilada a la solución para doblar el volumen. La solución, en primer lugar, se enfrió y después se permitió que se calentara a 13ºC durante 45 minutos.
El pH de la solución se ajustó a 3,0 con ácido fosfórico y después se añadió suficiente cloruro sódico para proporcionar una solución de sal de cloruro sódico al 15% (p/v). La solución de sal se agitó durante 15 minutos y después se extrajo con un volumen equivalente de diclorometano proporcionando de esta manera una solución de diclorometano.
La solución de diclorometano se secó con sulfato sódico (3,5 g/100 ml) y se evaporó para dar como resultado un aceite. La precipitación con alcohol isopropílico (17,5 ml/g), la filtración y el secado dieron un sólido blanco.
Los análisis asociados con este ejemplo se proporcionan en las Tablas 1 y 2 y se analizan en el Ejemplo 13.
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Ejemplo 13
Los productos obtenidos de los Ejemplos 5 a 12 se analizaron usando HPLC, GFC y ^{1}H RMN. La Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC) se realizó usando un sistema de HPLC Agilent 1100 (Agilent), usando una columna de GFC Shodex Protein KW-803 con una fase móvil de HEPES 10 mM, caudal de 1,0 ml/minuto y temperatura de 25ºC usando un detector RI (producto derivatizado con una especie tiol funcionalizada con ácido carboxílico y la sustitución se determina por comparación de los espectros derivatizado y no derivatizado). La GFC se realizó usando una columna de GFC Shodex Protein KW-803 con una fase móvil de 1x solución salina tamponada con fosfato, caudal de 1,0 ml/minuto y temperatura de 25ºC con uso de un detector RI. Los resultados se proporcionan en las Tablas 1 y 2. Con respecto a la Tabla 1, "% de especie dimaleimidilo" se refiere a un polímero de aproximadamente el mismo peso molecular que el producto de maleimida deseado, pero con dos extremos de maleimidilo y, con respecto a la Tabla 2, "% dímero de MAL" se refiere a una especie formada a partir de la reacción de dos especies de PEG funcionalizadas entre sí, "% trímero de MAL" se refiere a una especie formada a partir de la reacción de tres especies de PEG funcionalizadas entre sí y "% de PM mayor que trímero" se refiere a especies formadas a partir de la reacción de cuatro o más especies de PEG funcionalizadas entre sí.
TABLA 1
17
TABLA 2
19
A partir de la Tabla 1, queda claro que el método general empleado en el los Ejemplos 5 a 8 da como resultado composiciones que tenían una sustitución de maleimida mayor que la composición generada de acuerdo con el enfoque basado en agua seguido en los Ejemplos Comparativos 9 a 12. A menudo, el método general empleado en los Ejemplos 5 a 8 proporcionó una sustitución de maleimida mayor del 86%. También, la Tabla 1 demuestra que el método general empleado en los Ejemplos 5 a 8 daba como resultado composiciones que tenían un porcentaje de polímeros que llevaban un ácido maleámico ("mPEG-ácido maleámico") menor del 4 por ciento e incluso menor del 2 por ciento, que es mejor que lo que podría conseguirse con el enfoque de base acuosa seguido en los Ejemplos Comparativos 9 a 12.
A partir de la Tabla 2, se deduce que con excepción de las especies de mayor peso molecular analizadas por cromatografía de filtración en gel (% de dímeros de maleimida, % de trímeros de maleimida y otras especies de alto peso molecular) los parámetros tales como los porcentajes de precursor M-MAL 20 k e impureza de éster de anillo abierto son bastante consistentes entre los ejemplos ensayados.
Finalmente, queda claro a partir de las Tablas 1 y 2 que el método general empleado en los Ejemplo 5 a 8 proporcionaba rendimientos consistentes y buenos al compararlo con el método general empleado en los Ejemplos Comparativos.

Claims (36)

1. Un método sintético que comprende:
a) combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, sustituido; y
b) exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación para dar como resultado de esta manera un polímero soluble en agua, terminado en maleimida, en el que el reactivo de maleimida es de fórmula:
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20
en la que:
Y^{1} es O o S;
Y^{2} es O o S;
(a) es un número entero de 1 a 20;
R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{3}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y
R^{4}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico,
y en la que el polímero soluble en agua, terminado en maleimida, es de la fórmula:
21
en la que:
POLI es un polímero soluble en agua;
(b) es cero o uno;
X^{1}, cuando está presente, es un resto espaciador;
R^{3}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y
R^{4}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico.
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2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente aislar el polímero soluble en agua, terminando en ácido maleámico, sustituido, antes de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación.
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3. El método de la reivindicación 2, en el que el aislamiento del polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, se realiza por precipitación para preparar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, secado.
4. El método de la reivindicación 3, en el que la precipitación se efectúa añadiendo un exceso de un agente seleccionado entre el grupo que consiste en alcohol isopropílico, éter dietílico, MTBE, heptano, THF, hexano y mezclas de los mismos.
5. El método de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente la etapa de disolver el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, secado, para regenerar el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico.
6. El método de la reivindicación 1, realizado en un disolvente orgánico.
7. El método de la reivindicación 6, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre el grupo que consiste en hidrocarburos alifáticos halogenados, alcoholes, hidrocarburos aromáticos, alcoholes, hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos aromáticos halogenados, amidas, nitrilos, cetonas, acetatos, éteres, éteres cíclicos y combinaciones de los mismos.
8. El método de la reivindicación 6, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre el grupo que consiste en diclorometano, cloroformo, acetonitrilo, tolueno, metil t-butil éter, tetrahidrofurano, octanol, acetato de etilo, carbonato de dietilo, acetona, ciclohexano y combinaciones de los mismos.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el disolvente orgánico es diclorometano o acetonitrilo.
10. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de combinar un polímero soluble en agua, terminado en amina, con un reactivo de maleimida en condiciones sustancialmente no acuosas para formar un polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, se realiza en presencia de un catalizador básico.
11. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación en el disolvente orgánico se realiza en presencia de una base.
12. El método de la reivindicación 11, en el que la base se selecciona entre el grupo que consiste en bicarbonato sódico, bicarbonato potásico, carbonato sódico o carbonato potásico.
13. El método de la reivindicación 11, en el que la etapa de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación se realiza a una temperatura de 10 a 60ºC.
14. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación se realiza en presencia de un catalizador de amina no nucleófila.
15. El método de la reivindicación 14, en el que el catalizador de amina no nucleófila se selecciona del grupo que consiste en diisopropiletilamina, trietilamina, n-metil morfolina, piridina, N,N-dimetil-4-aminopiridina), 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno y 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano.
16. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de exponer el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, a condiciones de eliminación se realiza en presencia de un agente de secado.
17. El método de la reivindicación 16, en el que el agente de secado se selecciona entre el grupo que consiste en NaHCO_{3}, Na_{2}CO_{3}, CaCl_{2}, CaSO_{4}, MgSO_{4}, KOH, Na_{2}SO_{4}, K_{2}CO_{3}, KHCO_{3}, tamices moleculares y combinaciones de los mismos.
18. El método de la reivindicación 2, en el que el polímero soluble en agua, terminado en amina, es un polímero soluble en agua que lleva un grupo amina terminal, en el que el polímero soluble en agua se selecciona entre el grupo que consiste en poli(alquilenglicol), poli(alcohol olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacárido), poli(ácido \alpha-hidroxiacético), poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina) y copolímeros o terpolímeros de los mismos.
19. El método de la reivindicación 18, en el que el polímero soluble en agua es un poli(etilenglicol).
20. El método de la reivindicación 19, en el que el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000 Dalton.
\newpage
21. El método de la reivindicación 1, en el que el polímero soluble en agua, terminado en ácido maleámico, es de la fórmula:
22
en la que:
POLI es un polímero soluble en agua;
(b) es cero o uno;
X^{1}, cuando está presente, es un resto espaciador;
Y^{1} es O o S;
Y^{2} es O o S;
(a) es un número entero de 1 a 20;
R^{1}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{2}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico;
R^{3}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico; y
R^{4}, en cada caso, es independientemente H o un radical orgánico.
\vskip1.000000\baselineskip
22. El método de la reivindicación 21, en el que POLI es un polímero soluble en agua, lineal.
23. El método de la reivindicación 21, en el que POLI es CH_{3}O-(CH_{2}-CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2} y (a) es uno y, adicionalmente, en el que (n) es de 2 a 4000.
24. El método de la reivindicación 21, en el que POLI está ramificado.
25. El método de la reivindicación 1, en el que POLI es un polímero soluble en agua, lineal.
26. El método de la reivindicación 1, en el que POLI es CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH_{2}CH_{2}-, en la que (n) es de 2 a 4000.
27. El método de la reivindicación 1, en el que POLI está ramificado.
28. El método de la reivindicación 1, en el que condiciones sustancialmente no acuosas representan un medio de reacción que tiene menos de 1000 partes por millón de agua.
29. El método de la reivindicación 28, en el que las condiciones sustancialmente no acuosas representan un medio de reacción que tiene menos de 100 partes por millón de agua.
30. El método de la reivindicación 29, en el que las condiciones sustancialmente no acuosas representan un medio de reacción que tiene menos de 60 partes por millón de agua.
31. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 70 por ciento de la especie de polímero soluble en agua en la composición son polímeros solubles en agua terminados en maleimida.
32. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 80 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son polímeros solubles en agua terminados en maleimida.
33. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 90 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son polímeros solubles en agua terminados en maleimida.
34. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 93 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son polímeros solubles en agua terminados en maleimida.
35. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 86 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son mPEG-maleimidas.
36. El método de la reivindicación 1, en el que se forma una composición en la que más del 93 por ciento de las especies poliméricas solubles en agua en la composición son mPEG-maleimidas.
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