KR101334541B1 - 중합체 말레이미드를 제조하는 방법 - Google Patents

중합체 말레이미드를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본원에서는 말레이미드를 함유하는 중합체 시약을 제조하는 방법이 제공된다. 또한, 본원에서는 중합체 시약, 및 본 발명의 상세한 설명에 기술된 방법에 의해 수득된 중합체 시약에 의해 제조된 컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

중합체 말레이미드를 제조하는 방법 {METHOD FOR PREPARING POLYMER MALEIMIDES}
본 발명은 말레이미드 작용기를 갖는 수용성 및 비펩티드 중합체, 특히 말레이미드-말단의 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 제조하는 방법, 및 이를 함유하는 조성물 및 제형에 관한 것이다.
말레이미드는 화학적 합성 및 생물학적 및 약리학적 분야에서 광범위한 용도가 밝혀진 다용도 유도체이다. 마이클 수용체로서, 말레이미드는 술프히드릴기와 용이하게 반응하여 안정한 티오에테르 결합을 형성시킨다. 이러한 반응은 술프히드릴기와 아민기가 모두 존재하는 단백질 등에서 널리 사용된다. 약 중성 pH에서, 말레이미드는 매우 선택적인데, 술포히드릴기는 아민기에 비해 약 1,000배 이상 반응적이다[Smyth et al., Biochem. J., 91, 589, 1964; Gorin et al. Arch. Biochem. Biophys. 115, 593, 1966; Partis et al., J. Protein Chem, 2, 263-277, 1983]. 8 또를 이를 초과하는 보다 높은 pH에서, 말레이미드와 아민기의 반응은 상당히 경쟁적으로 개시된다[Brewer and Riehm, Anal. Biochem. 18, 248, 1967].
마이클 수용체로서 가장 널리 공지되었지만, 말레이미드는 또한 친디엔체(Baldwin et al., Tetrahedron Lett., 32, 5877, 1991; Philp and Robertson, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1998, 879; Bravo et al., Heterocycles, 53, 81, 2000)로서, 및 친쌍극자체(Grigg et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1988, 2693; Konopikova et al., Collect. Czech. Chem. Commun., 57, 1521, 1991; Philp and Booth, Tetrahedron Lett., 39, 6987, 1998)으로서 이의 반응성에 대해 유용하다.
말레이미드기는 중합체에 단백질 및 다른 분자들의 공유 결합을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "PEG"로 약칭되는 친수성 중합체 "폴리(에틸렌 글리콜)"은 종종 생활성 분자들을 컨쥬게이트시키고, 수성 매질 중에 이들을 용해시키기 위해 사용된다[Harris et al. "Poly(Ethylene Glycol) Chemistry and Biological Applications", ACS Symposium Series, ACS, Washington, DC, 1997]. PEG-말레이미드는 생물학적 활성 분자 상에서 티올 또는 아미노기와의 반응을 위해 적절한 반응성 중합체의 일 예이다.
PEG 말레이미드를 제조하기 위한 수많은 방법으로는 활성화된 PEG를 말레이미드기를 포함하는 작은 링커 분자에 연결함을 포함하며, 수많은 방법들이 상업적으로 입수가능하다. 몇몇의 공지된 PEG 말레이미드 및 이들을 생산하는 방법과 관련하여 여러 단점이 존재한다. 예를 들어, 소위 "링커부재" PEG 말레이미드는 PEG와 말레이미드기 간에 링커기를 갖지 않는 것으로, 종종 두개의 방법들 중 하나를 사용하여 PEG 아민으로부터 직접 제조된다[미국특허번호 제6,602,498호]. 그러나, 이러한 방법들은 대개 하기에서 논의되는 바와 같이 매우 상당한 양의 열린 고리 말레암산-함유 유도체가 최종 생성물에 존재하는 한 비교적 순수하지 않은 생성물 을 초래한다.
미국특허번호 제6,602,498호에 기술된 제 1 방법에서, 수용성 및 비-펩티드 중합체 골격은 말레산 무수물과 반응하여 열린 고리 아미드 카르복실산 중간체(말레암산 중간체)를 형성시킨다. 이러한 중간체의 고리는 이후 제 2 단계에서, 아세트산 무수물 및 아세트산의 염, 예를 들어 나트륨 또는 칼륨 아세테이트의 존재하, 약 50℃ 내지 약 140℃의 온도에서 약 0.2 내지 약 5 시간 동안 이러한 중간체를 가열시키므로써 닫혀진다. 이러한 2-단계 공정은 하기에 제공된 반응식 I에서 요약된다:
Figure 112008005884142-pct00001
이러한 방법에 의해 제조된 미정제 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물은 실질적인 양의 열린 고리 말레암산 중간체를 함유할 수 있다. 열린 고리 말레암산 중간체의 외형에 대한 주요한 이유는 특히, 임의의 산성 종이 발생되거나 아세트산 무수물 중의 오염물인 경우 가열 단계에서 그래도 잔류할 수 있다. 이러 한 조건하에서, 불가능하지 않는 한, C=C 결합을 분리시킬 수 있으며, 이에 따라 고리 폐쇄를 어렵게 할 수 있다. 결론적으로, 중합체 생성물은 불순물을 제거할 수 있는 이온교환 크로마토그래피와 같은 몇몇 방법에 의해 정제될 수 있다. 그러나, 말레이미드 고리계는 염기성 또는 친핵성 사이트를 갖는 크로마토그래프 컬럼을 허용하지 않으며, 이에 따라 정제를 더욱 어렵게 한다. 이러한 합성 경로가 지닌 제 2 문제점은 PEG 아민의 사용으로부터 방지된다.
유사하게는, 사카노우에 등(Sakanoue et al.)의 미국특허출원공개번호 제2003/0065134 A1호에는 여기에서 생산된 PEG-말레이미드가 최종 PEG 산소와 말레이미드 질소 간에 에틸렌기 보다는 프로필렌기를 포함함을 제외한 관련된 방법을 기재하고 있다. 그러나, 사카노우에 등에 의해 기술된 이러한 방법은 상기에서 언급된 바와 동일한 문제점을 갖는다. 더욱이, 이러한 참고문헌은 PEG 아민이 대개 수소 및 니켈 촉매를 사용하여 니트릴기를 환원시키므로써 제조되며, 이는 아민 생성물과 이민 중간체 간의 반응으로 인해 부가적인 불순물의 도입을 초래할 수 있음을 교시한다.
미국특허번호 제6,602,498호("Aqueous N-alkoxycarbonylmaleimide route")에 기술된 제 2 합성 경로에서, N-알콕시카르보닐말레이미드는 고분자 아민과 반응하여 말레이미드-말단의 수용성 중합체 생성물을 형성한다. 고리-열림 및 고리-폐쇄 반응은 상술된 것과 유사하게 발생한다. 이러한 반응은 약 8.5의 pH의 수성 중탄산나트륨 완충액에서 서서히 증가하는 온도 구배로 수행된다. 그러나, 이러한 말레이미드기는 이러한 조건에서 안정적이지 못하며, 말레암산으로 가수분해된다. 그러므로, 두개의 비슷한 반응들이 합성 동안 발생한다: 말레이미드 고리의 형성 및 말레이미드 고리 가수분해.
이러한 문제점을 처리하기 위한 한가지 방법은 최대 양의 말레이미드-말단의 수용성 중합체 생성물이 형성될 때 반응을 정지시키는 것이다. 이러한 방법이 이론적으로 유효함을 나타내는 한, 반응 온도를 변경시키므로 인해 상업적인 실행에서의 작업을 거의 불가능하게 하며, 여기서 연속적인 제조 배치 동안 온도 구배를 재생산적으로 달성하기 어렵게 할 수 있다. 예를 들어, 특정의 말레이미드-말단의 수용성 중합체의 연속적인 상업적 배치는 65 내지 80%의 말레이미드 순도, 및 약 20 내지 35%의 말레암산 함량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 크로마토그래피는 실행가능한 선택이 아닌데, 이는 이온교환 컬럼의 작용기에 대한 말레이미드기의 민감성 때문이다. 더욱이, 온도 구배를 재생산적으로 제어하고 적절한 시점에 반응을 정지시킬 수 있는 경우, 이러한 방법은 밀폐 모니터링 및 추가 장치(예를 들어, 온도계, 열자켓 등)을 요구하며, 이에 의해 이러한 방법은 복잡하게 된다.
말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하기 위한 다른 방법은 국제특허공개번호 WO 05/056636호에 기술되어 있다. 하나의 방법(하기에서 "반응식 (II)"로서 기재됨)에서, 이탈기("LG") 및 이미드의 염(트리시클릭 아미드의 칼륨염으로서 나타냄)을 포함하는 중합체는 친핵체 치환을 통해 반응되어 중합체 중간체를 형성하고, 이후 역 디엘스-앨더(reverse Diels-Alder) 반응을 수행하여 말레이미드 작용화된 중합체 및 푸란을 제공한다.
Figure 112008005884142-pct00002
상기 기술된 이러한 반응이 소위 "링커부재" 말레이미드(말레이미드기가 중합체에 직접 부착됨을 의미함)를 형성시키기 위해 반응하는 비교적 단순한 작용화된 중합체 및 디엘스-앨더 부가물 시약을 사용하지만, 이러한 반응은 상업적으로 입수가능한 시약을 요구하지 않는다.
상기 기술된 방법들에도 불구하고, 예를 들어 특정 필요를 위해 가장 적합한 방법이 사용될 수 있는 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하기 위한 다른 방법이 아직까지 필요로 한다. 본원에 기술된 신규한 방법은 이 중에서도 상당한 양의 고분자 불순물, 특히 통상적인 정제 기술, 예를 들어 이온교환 크로마토그래피를 사용하여 용이하게 제거될 수 없는 상당한 양의 중합체 불순물이 존재하지 않으면서 고수율의 말레이미드-말단의 중합체를 제공하는 것으로 여겨진다.
발명의 개요
하나 이상의 구체예에서, 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은
a) 실질적으로 비수성 조건하에서 아민-말단의 수용성 중합체를 말레이미드 시약과 조합하여 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 형성시키는 단계; 및
a') 임의적으로 치환된 말레암산-치환된 수용성 중합체를 분리하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 구체예에서, 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은
a) 실질적으로 비수성 조건하에서 아민-말단의 수용성 중합체를 말레이미드 시약과 조합하여 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 형성하는 단계; 및
b) 실질적으로 비수성 조건하에서 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제거 조건에 노출시켜 이에 따라 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은
a) 실질적으로 비수성 조건하에서 아민-말단의 수용성 중합체를 말레이미드 시약과 조합하여 말레암산-말단의 수용성 중합체를 형성시키는 단계; 및
b) 실질적으로 비수성 조건하에서 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제거 조건하에 노출시켜 이에 따라 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로부터 얻어진다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 컨쥬게이트-함유 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 본원에서 제공된 바와 같이 말레이미드-말단의 수용성 중합체와 티올-함유 생물학적 활성제를 조합하여 이에 따라 컨쥬게이트-함유 조성물을 수득함을 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 컨쥬게이트-함유 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은 본원에서 제공된 바와 같이 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물과 티올-함유 활성제를 조합함을 포함하는 방법으로부터 얻어진다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 분리된 형태로 하기 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
Figure 112008005884142-pct00003
(화학식 I)
상기 식에서,
POLY는 수용성 중합체이고;
(b)는 0 또는 1이고;
X1는 존재하는 경우, 스페이서 부분이고;
Y1는 O 또는 S이고;
Y2는 O 또는 S이고;
(a)는 1 내지 20의 정수이고;
R1은 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R2는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R3는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R4는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 하나 이상의 구체예를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 특정 중합체, 시약 등으로 제한되지 않으며 변경될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문장에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 관계를 포함하는 것으로 인식되어야 한다. 따라서, 예를 들어 "중합체(a ploymer)"에 대한 언급은 한개의 중합체 뿐만 아니라 두개 이상의 동일하거나 상이한 중합체를 포함하며, "건조제(a drying agent)"에 대한 언급은 한개의 건조제 뿐만 아니라 두개 이상의 동일하거나 상이한 건조제 등을 언급하는 것이다.
본 발명(들)을 기술하고 청구함에 있어서, 하기 용어는 하기에 제공된 정의에 따라 사용될 것이다.
본원에서 사용되는 "PEG", "폴리에틸렌 글리콜" 및 "폴리(에틸렌 글리콜)"은 혼용될 수 있다. 통상적으로, 본 발명에 따라서 사용하는 PEG는 하기 구조를 포함한다: "-(OCH2CH2)n-"(여기서, (n)은 2 내지 4000임). 본원에서 사용되는 바와 같이, PEG는 또한 말단 산소가 배치되는지의 여부에 따라 "-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" 및 "-(OCH2CH2)nO-"를 포함한다. 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "PEG"는 다양한 말단기 또는 "말단 캡핑(end capping)" 기를 갖는 구조를 포함하는 것으로 인식될 것이다. 용어 "PEG"는 또한 대부분, 즉 50% 초과의 -OCH2CH2- 또는 -CH2CH2O- 반복 서브유닛을 함유하는 중합체를 의미한다. 특정 형태와 관련하여, PEG는 하기에서 보다 상세히 기술된 바와 같이 임의의 수의 다양한 분자량, 및 "분지형", "선형", "갈라진(forked)", "다작용성"과 같은 구조 또는 기하학을 가질 수 있다.
용어 "말단-캡핑된" 및 "말단적으로 캡핑된"은 말단-캡핑 부분을 갖는 중합체의 말단 또는 종결점을 칭하는 것으로 본원에서 혼용된다. 통상적으로, 필수적이지는 않지만, 말단-캡핑 부분은 히드록시 또는 C1-20 알콕시기, 더욱 바람직하게는 C1-10 알콕시기, 및 더더욱 바람직하게는 C1-5 알콕시를 포함한다. 따라서, 말단-캡핑 부분의 예로는 알콕시(예를 들어, 메톡시, 에톡시 및 벤질옥시), 아릴, 헤테로아릴, 시클로, 헤테로시클로 등을 포함한다. 말단-캡핑 부분이 중합체에서 말단 단량체의 하나 이상의 원자를 포함할 수 있는 것으로 인식되어야 한다[예를 들어, CH3(OCH2CH2)n- 중 말단-캡핑 부분 "메톡시"]. 부가적으로, 상기 각각의 포화되고, 불포화되고, 치환되고, 비치환된 형태가 고려된다. 더욱이, 말단-캡핑기는 또한 실란일 수 있다. 이러한 말단-캡핑기는 또한 유리하게는 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다. 중합체가 검출가능한 라벨을 포함하는 말단-캡핑기를 갖는 경우, 중합체가 커플링되는 중합체 및/또는 부분(예를 들어, 활성제)의 양 또는 위치는 적절한 검출기를 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 라벨은 형광물질, 화학발광물질, 효소 라벨에서 사용되는 부분, 비색 부분(예를 들어, 염료), 금속 이온, 방사활성 부분 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적절한 검출기는 광도계, 필름, 분광계 등을 포함한다. 말단-캡핑기는 또한 유리하게는 인지질을 포함할 수 있다. 이러한 중합체가 인지질을 포함하는 말단-캡핑기를 갖는 경우, 중합체 및 얻어진 컨쥬게이트에 독특한 성질이 부여된다. 대표적인 인지질은 포스파티딜콜린으로 불리우는 인지질의 부류로부터 선택된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 인지질은 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린, 및 레시틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 중합체와 관련하여 "비-천연적으로 발생하는"은 온전히 그대로 천연에서 발견되지 않는 중합체를 의미한다. 그러나, 비-천연적으로 발생하는 중합체는 전체 중합체 구조가 자연에서 발견되지 않는 한, 천연적으로 발생하는 하나 이상의 단량체 또는 단량체의 단편을 함유할 수 있다.
"수용성 중합체"에서와 같이 용어 "수용성"은 실온에서 수중에 가용성인 임의의 중합체이다. 통상적으로, 수용성 중합체는 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의, 필터링 후 동일한 용액으로 투과된 광을 투과시킬 것이다. 중량을 기준으로, 수용성 중합체는 바람직하게는 수중에 약 35% (중량%) 이상의 가용성, 더욱 바람직하게는 수중에 약 50% (중량%) 이상의 가용성, 더더욱 바람직하게는 수중에 약 70% (중량%)의 가용성, 및 더더욱 바람직하게는 수중 약 85% (중량%)의 가용성을 갖을 것이다. 그러나, 수용성 중합체는 수중에 약 95% (중량%)의 가용성이거나 수중에 완전하게 가용성인 것이 가장 바람직하다.
PEG와 같은 수용성 중합체의 문맥에서 분자량은 수평균분자량 또는 중량평균분자량으로 표시될 수 있다. 달리 지시하지 않는 한, 본원에서 분자량에 대한 모든 기준은 중량-평균 분자량으로 언급된다. 두개의 분자량 결정법, 수평균 및 중량평균은 겔투과 크로마토그래피 또는 다른 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 수평균분자량을 측정하기 위한 말단기-분석 또는 속일성(예를 들어, 빙점 내림, 비등점 오름, 또는 삼투압)의 측정의 이용 또는 중량평균분자량을 측정하기 위한 광산란 기술, 초원심분리 또는 점도계의 이용과 같은 분자량 값을 측정하기 위한 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 중합체는 통상적으로 다분상성인데(즉, 중합체의 수평균분자량 및 중량평균분자량이 동일하지 않은데), 바람직하게는 약 1.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 1.15 미만, 더더욱 바람직하게는 약 1.10 미만, 더더욱 바람직하게는 약 1.05 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 낮은 다분산도 수치를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 기준들은 때때로 중량평균분자량 또는 수평균분자량을 갖는 단일의 수용성 중합체에 대해 이루어질 것이며; 이러한 기준들은 단일-수용성 중합체가 기술된 분자량을 갖는 수용성 중합체의 조성물로부터 수득됨을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
특정 작용기와 관련하여 사용되는 경우 용어 "활성" 또는 "활성화된"은 다른 분자 상에 친전자체 또는 친핵체와 용이하게 반응하는 반응성 작용기를 칭한다. 이는 반응시키기 위해 강한 촉매 또는 매우 비실용적인 반응 조건을 요구하는 기(즉, "비-반응성" 또는 "불활성" 기)와는 대비된다.
본원에서 사용되는 용어 "작용기" 또는 이의 임의의 유의어는 이의 보호된 형태 뿐만 아니라 비보호된 형태를 포함함을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "스페이서 부분", "연결" 또는 "링커"는 중합체 및 활성제의 말단부 및 활성제의 친전자체 또는 친핵체와 같은 상호연결 부분을 연결시키기 위해 사용되는 원자 또는 원자의 집합(collection)을 칭하는 것이다. 이러한 스페이서 부분은 가수분해적으로 안정적일 수 있거나 물리적으로 가수분해가능하거나 또는 효소적으로 분해가능한 연결을 포함할 수 있다.
"알킬"은 통상적으로 길이가 약 1개 내지 15개의 원자를 갖는 탄화수소 사슬을 칭하는 것이다. 이러한 탄화수소 사슬은 바람직하게는 포화된 것이지만 필수적인 것은 아니고, 분지되거나 직쇄일 수 있지만, 통상적은 직쇄가 바람직하다. 대표적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸, 등을 포함한다. 본원에서 사용되는 "알킬"은 시클로알킬 뿐만 아니라 시클로알킬렌-함유 알킬을 포함한다.
"저급 알킬"은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬기를 칭하는 것이며, 이는 직쇄이거나 분지된 것일 수 있다. 비제한적인 저급 알킬의 예로는 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸 및 t-부틸을 포함한다.
"시클로알킬"은 바람직하게는 3개 내지 약 12개의 탄소원자, 더욱 바람직하게는 3개 내지 약 8개의 탄소원자로 이루어진 브릿징되거나, 융합되거나, 또는 스피로 시클릭 화합물을 포함하는 포화되거나 불포화된 시클릭 탄화수소 사슬을 칭하는 것이다. "시클로알킬렌"은 시클릭 고리계 중의 임의의 두개의 탄소에서 사슬의 결합에 의해 알킬 사슬로 삽입된 시클로알킬기를 칭하는 것이다.
"알콕시"는 -O-R기를 칭하는 것이며, 여기서 R은 알킬 또는 치환된 알킬, 바람직하게는 C1-6 알킬이다(예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 등).
예를 들어 "치환된 알킬"에서와 같이 용어 "치환된"은 예를 들어 알킬, C3-8 시클로알킬, 예를 들어 시클로프로필, 시클로부틸, 등; 할로, 예를 들어 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도; 시아노; 알콕시; 저급 페닐; 치환된 페닐; 등과 같은 (그러나 이에 제한되지 않은) 하나 이상의 비간섭 치환기(noninterfering substituent)로 치환된 부분(예를 들어, 알킬기)를 칭하는 것이다. "치환된 아릴"은 하나 이상의 비간섭 치환기를 갖는 아릴이다. 페닐 고리 상에 치환을 위하여, 치환기들은 임의의 위치(예를 들어, 오르토, 메타 또는 파라)에 존재할 수 있다.
"비간섭 치환기"는 통상적으로 분자 중에 존재할 때, 분자내에 함유된 다른 작용기와 비반응성인 기이다.
"아릴"은 각각 5개 또는 6개의 코어 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴은 나프틸에서와 같이 융합되거나, 비페닐에서와 같이 비융합될 수 있는 다중 아릴 고리를 포함한다. 아릴 고리는 또한 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로아릴, 또는 헤테로시클릭 고리와 융합되거나 비융합될 수 있다. 본원에서 사용되는 "아릴"은 헤테로아릴을 포함한다.
"헤테로아릴"은 1개 내지 4개의 헤테로원자, 바람직하게는 황, 산소, 또는 질소, 또는 이의 조합을 포함하는 아릴기이다. 헤테로아릴 고리는 또한 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다.
"헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭"은 불포화도 또는 방향족 특징을 지니거나 지니지 않고 탄소가 존재하지 않는 하나 이상의 고리 원자를 갖는 5개 내지 12개의 원자, 바람직하게는 5개 내지 7개의 원자의 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 황, 산소, 및 질소를 포함한다.
"치환된 헤테로아릴"은 치환기로서 하나 이상의 비간섭 기를 갖는 헤테로아릴이다.
"치환된 헤테로사이클"은 비간섭 치환기로부터 형성된 하나 이상의 측쇄를 갖는 헤테로사이클이다.
본원에서 사용되는 "유기 라디칼"은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴을 포함할 것이다.
"친전자체" 및 "친전자체 기"는 이온 또는 원자, 또는 원자의 집합을 칭하는 것이며, 이는 친전자체 중심, 즉 친핵체를 요구하는 전자이거나 친핵체와 반응할 수 있는 중심을 갖는 이온성일 수 있다.
"친핵체" 및 "친핵체 기"는 친핵체 중심, 즉 친전자체 중심을 요구하거나 친전자체와 반응할 수 있는 중심을 갖는 이온성일 수 있는 이온 또는 원자, 또는 원자의 집합을 칭하는 것이다.
"생리학적으로 분할가능한" 또는 "가수분해가능한" 결합은 생리학적 조건하에서 물과 반응하는(즉, 가수분해되는) 결합이다. 바람직하게는 이는 pH 8, 25℃에서, 약 30분 미만의 가수분해 반감기를 갖는 결합이다. 수중에서 가수분해하기 위한 결합의 경향은 두개의 제공된 원자를 연결하는 연결부의 일반적인 유형, 및 이러한 두개의 제공된 원자에 부착된 치환기에 따를 것이다. 적절한 가수분해적으로 불안정하거나 약한 연결부는 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"효소적으로 분해가능한 연결"은 하나 이상의 효소에 의해 분해되는 연결을 의미한다.
"가수분해적으로 안정한" 연결 또는 결합은 수중에서 실질적으로 안정한, 즉 생리학적 조건하에서 연장된 시간에 걸쳐 임의의 뚜렷한 범위로 가수분해되지 않는 화학적 결합, 통상적으로 공유 결합을 칭하는 것이다. 가수분해적으로 안정한 연결의 예로는 탄소-탄소 결합(예를 들어 지방족 사슬에서), 에테르, 아미드, 우레탄, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 가수분해적으로 안정한 연결은 생리학적 조건하에서 하루에 약 1 내지 2% 미만의 가수분해율을 나타내는 것이다. 대표적인 화학 결합의 가수분해율은 대부분의 표준 화학 교과서에서 확인될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 부형제"는 조성물 중에 임의적으로 포함될 수 있고 투여후에 환자에게 현저한 독성학적 부작용을 야기하지 않는 부형제를 칭하는 것이다.
본원에서 "치료학적 유효량"은 투여 후 혈류 또는 타겟 조직에 요망되는 수준의 컨쥬게이트(또는 상응하는 비컨쥬게이트된 활성제)를 제공하기 위해 필요로 하는 컨쥬게이트의 양을 의미한다. 정확한 양은 여러 인자들, 예를 들어 특정 활성제, 치료 조성물의 성분 및 물리학적 특성, 의도되는 환자 집단, 전달 모드, 개개 환자의 고려사항, 등에 의존적일 것이며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
"다작용성"은 중합체 함유된 세개 이상의 작용기를 갖는 중합체를 의미하며, 여기서 작용기들은 동일하거나 상이할 수 있다. 다작용성 고분자 시약은 통상적으로 하나 이상의 하기 범위의 작용기의 수를 함유할 것이다: 약 3 내지 100개의 작용기; 3 내지 50개의 작용기; 3 내지 25개의 작용기; 3 내지 15개의 작용기; 3 내지 10개의 작용기. 대표적인 작용기의 수로 중합체 골격내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 작용기를 포함한다.
"임의적" 또는 "임의적으로"는 명세서가 이러한 환경이 발생하는 예 및 발생하지 않는 예를 포함하도록 이후에 기술되는 환경이 발생할 수 있거나 발생하지 않음을 의미한다.
"실질적으로"(다른 경우에 특정 문맥에 대해 상세하게 규정되지 않거나 다른 경우에 문맥이 명확하게 기술되지 않는 한)는 거의 전체적으로 또는 완전하게 예를 들어 하나 이상의 하기 조건을 만족함을 의미한다: 50%, 51% 이상, 75% 이상, 또는 80% 이상, 90% 이상, 및95% 이상의 상태.
구 "실질적으로 비수성 조건"은 10,000 ppm(part per millions) 미만의 물, 바람직하게는 1,000 ppm 미만(0.1% 미만)의 물, 더욱 바람직하게는 100 ppm 미만(0.01% 미만)의 물, 더더욱 바람직하게는 10 ppm 미만(0.001% 미만)의 물을 지닌 조성물 또는 반응 매질(1% 미만)을 의미한다. 바람직하게는, 실질적으로 비수성 조건은 불활성 대기를 포함하지만, 필수적인 것은 아니다.
그밖에 문맥에서 명확하게 기술되지 않는 한, 용어 "약"이 수치 앞에 놓일 때, 수치는 기술된 수치의 ±10%를 의미하는 것으로 이해된다.
치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은
a) 실질적으로 비수성 조건하에서 아민-말단의 수용성 중합체를 말레이미드 시약과 조합하여 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 형성하는 단계; 및
a') 임의적으로, 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 분리시키는 단계를 포함한다.
이러한 조합 단계는 출발 물질로서 아민-말단의 수용성 중합체를 요구한다. 본원에서 사용되는 "아민-말단의 수용성 중합체"는 아민기가 실제적으로 수용성 중합체의 말단에 위치하는지의 여부와 관련없이, 하나 이상의 아민기("-NH2")를 지닌 임의의 수용성 중합체이다. 통상적으로, 필수적이지는 않지만, 아민-말단의 수용성 중합체는 단지 한개의 아민기를 갖지만, 아민-말단의 수용성 중합체는 한개를 초과하는 아민기를 가질 수 있다. 따라서, 아민-말단의 수용성 중합체는 (예를 들어) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 및 10개 중 임의의 하나의 아민 기의 총수를 갖을 수 있다.
대표적인 아민-말단의 수용성 중합체는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112008005884142-pct00004
(화학식 II)
상기 식에서,
POLY는 수용성 중합체이며(바람직하게는 선형 또는 분지된 것이며, 바람직하게는 CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-이며, 여기서 (n)은 POLY가 선형일 때 2 내지 4000임);
(c)는 0 또는 1이며(바람직하게는 0임);
X2는 존재하는 경우, 스페이서 부분이다.
조합 단계는 또한 말레이미드 시약을 요구한다. 이러한 말레이미드 시약은 아민-말단의 수용성 중합체와 조합한 후에 하기 중합체들 중 하나를 형성하는 시약이다: 말레이미드-말단의 수용성 중합체; 또는 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체.
대표적인 말레이미드 시약은 하기 구조를 포함한다:
Figure 112008005884142-pct00005
(화학식 III)
상기 식에서,
Y1은 O 또는 S이고(바람직하게는 O임);
Y2는 O 또는 S이고(바람직하게는 O임);
(a)는 1 내지 20의 정수이고(바람직하게는 1 또는 2임);
R1은 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고(바람직하게는 H임);
R2는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고(바람직하게는 H임);
R3는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고(바람직하게는 H임);
R4는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이다(바람직하게는 H임).
바람직한 말레이미드 시약은 N-알콕시카르보닐말레이미드이고, 특히 여기서 알콕시는 저급 알콕시이다. 바람직한 N-알콕시카르보닐말레이미드, N-메톡시카르보닐말레이미드는 하기와 같다:
Figure 112008005884142-pct00006
(화학식 IV)
조합 단계는 아민-말단의 수용성 중합체를 말레이미드 시약과 접촉시킴을 포함하며, 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 아민-말단의 수용성 중합체를 포함하는 조성물, 및 말레이미드 시약을 포함하는 조성물은 반응 용기에서 조합될 수 있다. 그러나, 조합 단계는 물의 도입을 최소화시키도록 수행된다.
조합 단계 후에, 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법은 임의적으로 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 분리시키는 단계를 포함한다.
치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 분리시키도록 의도되는 경우(이에 따라 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 분리시키는 임의의 단계를 수행하는 경우), 임의의 당해분야에 공지된 기술은 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 분리시키기 위해 사용될 수 있으며, 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않는다. 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 실리카겔 크로마토그래피, HPLC 크로마토그래피, 친화력-기재 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 등), 전기영동, 침전(예를 들어, 재결정화를 포함), 및 추출로 구성된 군으로부터 선택된 분리 기술은 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 분리시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 분리 기술은 당해분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있는 침전법이다(예를 들어 과량의 이소프로필 알코올, 디에틸 에테르, MTBE, 헵탄, THF, 헥산 등을 첨가하여 생성물을 침전시킴). 침전 기술로 건조된 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체가 수득될 것이다. 다른 기술들은 또한 건조된 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 수득하기 위해 사용될 수 있다.
치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체는 임의의 수의 형태로 수득될 수 있다. 바람직한 형태는 하기 구조를 포함하는 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체이다:
Figure 112008005884142-pct00007
(화학식 I)
상기 식에서,
POLY는 수용성 중합체이고;
(b)는 0 또는 1이고;
X1는 존재하는 경우, 스페이서 부분이고;
Y1는 O 또는 S이고;
Y2는 O 또는 S이고;
(a)는 1 내지 20의 정수이고;
R1은 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R2는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R3는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R4는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이다.
치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체가 분리된 형태로 제공되는 것이 바람직하며, 이는 조성물 중에서 모든 중합체 종의 약 70% 이상(더욱 바람직하게는 80% 이상, 및 가장 바람직하게는 90% 이상)이 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체 형태인(아민-말단의 수용성 형태 또는 말레이미드-말단의 수용성 중합체 형태가 아님) 조성물을 의미한다.
임의의 분리된 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 사용하기 전에, 통상적으로 분리된(그리고 통상적으로 건조된) 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 비수성 액상 시스템에 다시 용해시켜 말레암산-말단의 수용성 중합체를 재생시키는 부가적인 단계를 수행한다.
말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하기 위해 사용되는 방법에서의 단계들은 통상적으로 유기 용매에서 수행된다. 임의의 유기 용매가 사용될 수 있고 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않지만, 대표적인 유기 용매로는 할로겐화된 지방족 탄화수소, 알코올, 방향족 탄화수소, 알코올, 할로겐화된 방향족 탄화수소, 아미드(DMF 포함), 니트릴(아세토니트릴 포함), 케톤(아세톤 포함), 아세테이트(에틸 아세테이트 포함), 에테르, 시클릭 에테르 및 이들의 조합물을 구성하는 군으로부터 선택된 용매를 포함한다. 바람직한 유기 용매의 예로는 메틸렌 클로라이드(또는 디클로로메탄), 클로로포름, 옥탄올, 톨루엔, 메틸 t-부틸 에테르, THF(테트라히드로푸란), 에틸 아세테이트, 디에틸카르보네이트, 아세톤, 아세토니트릴, DMF(디메틸 포름아미드), DMSO, 디메틸아세트아미드, N-시클로헥실피롤리디논, 시클로헥산 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법은 그 중에서도 특히 말레이미드-말단의 수용성 중합체(본원에서 기술된 바와 같음)의 형성에서 유용한 중간체를 제공하는데 유용하다. 이러한 방법을 수행하므로써, 아민-말단의 수용성 중합체로부터 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체의 보다 큰 재생산가능한 수율을 제공할 수 있으며, 이에 따라 보다 순수한 말레이미드-말단의 중합체 조성물 및 이로부터 형성된 상응하는 컨쥬게이트 조성물을 수득할 수 있는 더욱 순수한 중간체를 제공할 수 있다. 더욱이, 이러한 방법은 조성물 중에 말레암산-기재 불순물을 보다 덜 갖는 조성물을 제공한다.
말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은
a) 실질적으로 비수성 조건하에서 아민-말단의 수용성 중합체를 말레이미드 시약과 조합하여 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 형성시키는 단계; 및
b) 실질적으로 비수성 조건하에서 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제거 조건에 노출시켜 이에 의해 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 수득하는 단계를 포함한다.
실질적으로 비수성 조건하에서 아민-말단의 수용성 중합체를 말레이미드 시약과 조합하여 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 형성시키는 단계는 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법과 관련하여 상술된 바와 같이 수행될 수 있다.
조합 단계를 수행한 직후에, 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하는 본 방법은 또한 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 분리하고 재용해시키는 임의적 단계를 포함한다. 이들 임의적 단계 각각(임의적 분리 단계 및 임의적 재용해 단계)은 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제조하는 방법과 관련하여 상술된 바와 같이 수행될 수 있다.
말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하는 본 방법의 단계들은 말레암산-말단의 수용성 중합체를, 말레암산-말단의 수용성 중합체를 가열시키는 제거 조건하에 노출시키는 단계를 포함한다. 임의의 당해분야에 공지된 제거 조건이 사용되며, 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않는다. 예를 들어, 안정한 제거 조건은 약 35℃ 이상, 더욱 바람직하게는 약 40℃ 이상의 온도에서 산-말단의 수용성 중합체를 환류시킴을 포함한다.
제거 조건에 노출은 또한 예를 들어 말레암산-말단의 수용성 중합체를 건조제(예를 들어 NaHCO3, Na2CO3, CaCl2, CaSO4, MgSO4, KOH, Na2SO4, K2CO3, KHCO3 및 이들의 조합물을 첨가), 분자체(예를 들어, 알루미늄 실리케이트), 공비 증류 및 이들의 임의의 조합에 노출시키므로써 반응 매질로부터 물을 제거함을 포함할 수 있다.
촉매는 또한 본 방법의 동력학을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 비-친핵체 아민 촉매 또는 염기성 촉매와 같은 촉매의 존재하에 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하는 본 방법을 수행하는 것이 바람직하다. 비-친핵체 아민 촉매와 관련하여, 입체적으로 방해된 비-친핵체 아민 촉매가 바람직하다. 비-친핵체 아민 촉매의 예로는 DMAP(N,N-디메틸-4-아미노피리딘), DBU(1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔), DABCO(1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄), 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, n-메틸 모르폴린으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 입체적으로 방해된 비-친핵체 아민 촉매의 예로는 DMAP(N,N-디메틸-4-아미노피리딘), DBU(1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔), DABCO(1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄), 및 디이소프로필에틸아민을 포함한다. 염기성 촉매의 예로는 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산칼륨 및 중탄산칼륨을 포함한다.
말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하기 위해 사용되는 본 방법의 단계들은 통상적으로 유기 용매에서 수행된다. 임의의 유기 용매가 사용될 수 있고 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않지만, 대표적인 유기 용매로는 할로겐화된 지방족 탄화수소, 알코올, 방향족 탄화수소, 알코올, 할로겐화된 방향족 탄화수소, 아미드(DMF 포함), 니트릴(아세토니트릴 포함), 케톤(아세톤 포함), 아세테이트(에틸 아세테이트 포함), 에테르, 시클릭 에테르 및 이들의 조합물을 구성하는 군으로부터 선택된 용매를 포함한다. 바람직한 유기 용매의 예로는 메틸렌 클로라이드(또는 디클로로메탄), 클로로포름, 옥탄올, 톨루엔, 메틸 t-부틸 에테르, THF, 에틸 아세테이트, 디에틸카르보네이트, 아세톤, 아세토니트릴, DMF, DMSO, 디메틸아세트아미드, N-시클로헥실피롤리디논, 시클로헥산 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
말레이미드-말단의 수용성 중합체는 다양한 구조를 갖을 수 있으며 이로부터 유도되는 치환된 말레암산-말단의 수용성 중합체의 구조를 따를 것이다. 본 방법에 따라 제조된 대표적인 말레이미드-말단의 수용성 중합체는 하기 구조를 가질 것이다:
Figure 112008005884142-pct00008
(화학식 V)
상기 식에서, POLY, X2 및 (c) 각각은 화학식 (II)에서 제공된 바와 같이 규정되며, R3 및 R4 각각은 화학식 (III)에서 제공된 바와 같이 규정된다.
구체적으로 바람직한 말레이미드-말단의 수용성 중합체는 하기 구조를 포함할 것이다:
Figure 112008005884142-pct00009
(화학식 VI)
상기 식에서, (n)은 2 내지 약 4000의 정수이다.
말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은
a) 실질적으로 비수성 조건하에서 아민-말단의 수용성 중합체를 말레이미드 시약과 조합하여 말레암산-말단의 수용성 중합체를 형성하는 단계; 및
b) 실질적으로 비수성 조건하에서 말레암산-말단의 수용성 중합체를 제거 조건하에 노출시켜, 이에 의해 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로부터 얻어진다.
따라서, 본 발명내에 제공된 본 방법에 따라 형성된 말레이미드-말단의 수용성 중합체의 조성물이 포함된다. 본 방법으로부터 얻어진 조성물은 종래 공지된 방법에 비해 보다 큰 순도를 갖는 것으로 여겨진다. 상세하게는, 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물은 비교적 낮은 백분율의 말레암산-말단의 수용성 중합체(예를 들어 통상적으로 4% 미만, 및 종종 2% 미만)을 갖는다. 또한, 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물은 실질적으로 푸란이 존재하지 않으며, 바람직하게는 푸란이 전혀 존재하지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은 조성물 중에서 70% 이상의 고분자 종이 말레이미드-말단의 수용성 중합체인 고분자 종을 포함하고, 추가로 조성물이 열린 고리 에스테르 고분자 종을 포함한다. 열린 고리 에스테르 고분자 종은 하기 구조를 갖는다:
Figure 112008005884142-pct00010
(화학식 Ia)
상기 식에서, POLY, X1, (a), (b), R1, R2, R3, R4, Y1 및 Y2는 화학식 (I)과 관련하여 규정된 바와 같다. 이러한 "열린 고리 에스테르"는 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 제조하기 위한 수계열 N-알콕시카르보닐말레이미드 경로와 관련하여 발견되지 않는다.
컨쥬게이트-함유 조성물을 제조하는 방법
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 컨쥬게이트-함유 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 (반응 용기에서) 티올-함유 생물학적 활성제(예를 들어 시스테인-함유 단백질 또는 폴리펩티드)를 본원에 제공된 바와 같은 말레이미드-말단의 수용성 중합체 조성물과 조합하여 이에 의해 컨쥬게이트-함유 조성물을 수득함을 포함한다. 티올-함유 생물학적 활성제에 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 컨쥬게이트하기 위한 방법이 기술되어 있지만, 대표적인 방법은 증류수에 말레이미드-말단의 수용성 중합체를 용해시켜 10% 시약 용액을 제조하고 이를 티올-함유 생물학적 활성제(티올-함유 생물학적 활성제에 대해 5배 내지 20배의 몰의 중합체로)를 조합하고, 혼합함을 포함한다. 실온에서 약 1시간의 반응 후에, 반응 바이알은 냉각되고 약 12시간 동안 혼합시켜 충분한 반응시간을 확보할 수 있다. 반응의 pH는 약 7에서 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 말레이미드-말단의 수용성 중합체 조성물을 사용하여 컨쥬게이트-함유 조성물을 제조하는 방법은 본 발명내에 포함된다. 이러한 티올-함유 활성제는 단백질간 디술피드 결합에 포함되지 않는 시스테인 잔부를 지닌 임의의 단백질일 수 있다.
컨쥬게이트-함유 조성물
본 발명의 하나 이상의 구체예에서, 컨쥬게이트-함유 조성물이 제공되며, 이러한 조성물은 티올-함유 활성제를 본원에서 제공된 말레이미드-말단의 수용성 중합체-함유 조성물과 조합함을 포함하는 방법으로부터 얻어진다.
따라서, 본 발명에 컨쥬게이트-함유 조성물을 제조하는 제공된 방법에 따라 형성된 컨쥬게이트-함유 조성물이 포함된다. 이러한 방법으로부터 얻어진 조성물은 종래 공지된 방법에 비해 보다 큰 순도를 갖는 것으로 여겨진다. 이를 생성시키는데 사용되는 말레이미드-말단의 수용성 중합체 조성물과 같이 컨쥬게이트-함유 조성물은 비교적 낮은 백분율의 말레암산-말단의 수용성 중합체(예를 들어, 통상적으로 4% 미만, 및 종종 2% 미만)를 갖는다. 또한, 컨쥬게이트-함유 조성물은 실질적으로 푸란을 함유하지 않으며, 바람직하게는 푸란을 완전하게 함유하지 않는다.
수용성 중합체("POLY")
본원에서 사용되는 용어 "수용성 중합체"는 생체적합적이고 비면역원성이며, 상세하게는 생체적합하지 않고 비면역원성적이지 않은 임의의 수용성 중합체 단편을 제외한 수용성 중합체를 포함한다. 생체적합성과 관련하여, 기질을 단독으로 또는 살아있는 조직(예를 들어, 환자에 투여)과 관련한 다른 조직(예를 들어, 활성제)과 함께 사용하는 것과 관련된 이로운 효과가 임상의, 예를 들어 내과의사에 의해 평가되는 바와 같이 임의의 해로운 효과를 능가하는 경우 생체적합한 것으로 간주된다. 비면역원성과 관련하여, 기질은 생체내에서 기질의 의도된 용도가 요망되지 않은 면역 반응(예를 들어, 항체의 형성)을 생산하지 않거나, 면역 반응이 생산되는 경우, 이러한 반응이 임상의에 의해 평가되어 임상적으로 현저하거나 중요하다고 여겨지지 않는 경우 비면역원적인 것으로 간주된다. 특히 본원에 기술된 수용성 중합체 단편 및 컨쥬게이트가 생체적합하고 비면역원성적인 것이 바람직하다.
중합체와 관련하여, 중합체는 임의의 다수의 수용성 및 비-펩티드 중합체, 예를 들어 본 발명에서 사용하기에 적합한 본원에 기술된 수용성 및 비-펩티드 중합체일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는, 이러한 중합체로는 폴리(에틸렌 글리콜)(즉, PEG)가 있다. 용어 PEG는 임의의 다수의 기하학 또는 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하며, 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 선형, 분지형 또는 다중-암(multi-arm) 형태(예를 들어, 갈라진 PEG 또는 폴리올 코어에 부착된 PEG), 펜던트 PEG, 또는 분해가능한 연결부를 지닌 PEG를 포함한다.
중합체에 의해 수반되는 작용기의 수 및 작용기의 위치는 변경될 수 있다. 통상적으로, 중합체는 1개 내지 약 25개의 작용기, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 작용기를 포함할 것이다. 선형 중합체, 예를 들어 PEG 중합체는 통상적으로 중합체 사슬의 말단에 위치한 한개 또는 두개의 작용기를 포함할 것이다. PEG 중합체가 일작용성인 경우(즉 선형 mPEG), 중합체는 단일 작용기를 포함할 것이다. PEG 중합체가 이작용성인 경우, 중합체는 두개의 독립적으로 선택된 작용기를 함유할 수 있으며, 각각은 중합체 사슬의 말단에 위치한다. 이해되는 바와 같이, 다중-암 또는 분지된 중합체는 보다 많은 수의 작용기를 포함할 수 있다.
다중-암 또는 분지된 PEG 분자, 예를 들어 미국특허번호 제5,932,462호에 기술된 PEG 분자는 또한 PEG 중합체로서 사용될 수 있다. 대체로, 다중-암 또는 분지된 중합체는 중심 분기점으로부터 연장하는 두개 이상의 중합체 "암(arms)"을 갖는다. 예를 들어, 대표적인 분지된 PEG 중합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112008005884142-pct00011
상기 식에서, PEG1 및 PEG2는 본원에서 기술된 임의의 형태 또는 기하학의 PEG 중합체이고, 이는 동일하거나 상이하며, L'는 가수분해적으로 안정한 연결부이다. 대표적인 분지된 PEG는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112008005884142-pct00012
상기 식에서, POLYa 및 POLYb는 PEG 골격, 예를 들어 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)이며; R"는 비반응성 부분, 예를 들어, H, 메틸 또는 PEG 골격이며; P 및 Q는 비반응성 연결부이다. 바람직한 구체예에서, 분지된 PEG 중합체는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 이치환된 라이신이다.
분지된 PEG 구조는 하기에 나타낸 바와 같은 제 3의 올리고머 또는 중합체 사슬에 부착될 수 있다.
Figure 112008005884142-pct00013
상기 식에서, PEG3은 제 3의 PEG 올리고머 또는 중합체 사슬이며, 이는 PEG1 및 PEG2와 동일하거나 상이할 수 있다.
PEG 중합체는 대안적으로는 갈라진 PEG를 포함할 수 있다. 대체로, 갈라진 구조를 갖는 중합체는 중합체에서 가수분해적으로 안정한 분기점으로부터 연장하는 공유 연결을 통하여 두개 이상의 작용기에 부착된 중합체 사슬을 갖는 특징을 갖는다. 갈라진 PEG의 예는 PEG-YCHZ2로 표시되며, 여기서 Y는 연결기이며, Z는 생물학적 활성제에 공유 결합하기 위한 활성화된 말단기이다. Z기는 규정된 길이의 원자 사슬에 의해 CH에 연결된다. 미국특허번호 제6,362,254호에서는 본 발명에서 사용할 수 있는 다양한 갈라진 PEG 구조물을 기술하고 있다. 분지된 탄소 원자에 Z 작용기(예를 들어, 히드록실기)를 연결하는 원자의 사슬은 구속 기(tethering group)로서 제공되고, 예를 들어 알킬 사슬, 에테르 연결, 에스테르 연결, 아미드 연결, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
PEG 중합체는 PEG 사슬의 말단에서 보다 PEG 골결의 길이에 따라 공유적으로 결합된 반응성기(예를 들어, 히드록실기)를 갖는 펜던트 PEG 분자를 포함할 수 있다. 펜던트 반응성기는 직접적으로 또는 연결 부분, 예를 들어 알킬렌기를 통해 PEG 골격에 결합될 수 있다.
PEG의 상술된 형태 이외에, 중합체는 또한 임의의 상술된 중합체를 포함하여 중합체 골격에 하나 이상의 가수분해적으로 안정하거나 분해가능한 연결부과 함께 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG는 가수분해되는 중합체 골격에서 에스테르 연결과 함께 제조될 수 있다. 하기에 기술된 바와 같이, 이러한 가수분해는 저분자량의 단편으로 중합체를 분할시킨다:
Figure 112008005884142-pct00014
중합체 골격내에 분해가능한 연결로서 유용한 다른 가수분해적으로 분해가능한 연결은 카르보네이트 연결; 예를 들어, 아민과 알데히드의 반응으로부터 얻어진 이민 연결(예를 들어, Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(1):582-3 (1997)); 예를 들어 알코올을 포스페이트기와 반응시켜 형성된 포스페이트 에스테르 연결; 히드라지드 및 알데히드의 반응에 의해 통상적으로 형성된 히드라존 연결; 통상적으로 알데히드와 알코올간의 반응에 의해 형성된 아세탈 연결; 예를 들어 산 유도체와 알코올 간의 반응에 의해 형성된 오르토 에스테르 연결; 및 예를 들어 중합체의 말단에서의 포스포르아미디트기, 및 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 연결을 포함한다. 수많은 상술된 분해가능한 연결의 사용은 많은 불안정한 연결과 아민기의 친핵성 반응성으로 인해 덜 바람직하다.
당업자에게 용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG는 상기 모든 형태의 PEG로 표시되거나 이를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
다른 비-펩티드 및 수용성 중합체 사슬을 포함하는 임의의 다양한 다른 중합체는 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 중합체는 선형일 수 있거나, 임의의 상술된 형태(예를 들어, 분지된, 갈라진 형태 등)일 수 있다. 적절한 중합체의 예로는 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시아세트산), 폴리(아크릴산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 예를 들어 미국특허번호 제5,629,384에 기술된 것, 및 이들의 공중합체, 삼중합체, 및 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
수용성 중합체의 분자량이 요망되는 적용, 중합체 구조의 배열, 분기 정도 등에 따라 변경할 수 있지만, 분자량은 하기 값 중 하나 이상을 만족할 것이다: 100 달톤의 초과; 200 달톤의 초과; 400 달톤의 초과; 500 달톤의 초과; 750 달톤의 초과; 900 달톤의 초과; 1,000 달톤의 초과; 1,400 달톤의 초과; 1,500 달톤의 초과; 1,900 달톤의 초과; 2,000 달톤의 초과; 2,200 달톤의 초과; 2,500 달톤의 초과; 3,000 달톤의 초과; 4,000 달톤의 초과; 4,900 달톤의 초과; 5,000 달톤의 초과; 6,000 달톤의 초과; 7,000 달톤의 초과; 7,500 달톤의 초과; 9,000 달톤의 초과; 10,000 달톤의 초과; 11,000 달톤의 초과; 14,000 달톤의 초과; 15,000 달톤의 초과; 16,000 달톤의 초과; 19,000 달톤의 초과; 20,000 달톤의 초과; 21,000 달톤의 초과; 22,000 달톤의 초과; 25,000 달톤의 초과; 30,000 달톤의 초과. 본원에서 유용한 임의의 제공된 수용성 중합체 단편의 분자량의 최대치는 약 300,000 달톤 미만인 것으로 이해될 것이다.
중합체의 분자량은 통상적을 하기 범위 중 적어도 하나에 속할 것이다: 약 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤; 약 200 달톤 내지 약 60,000 달톤; 약 300 달톤 내지 약 40,000 달톤.
수용성 중합체의 대표적인 분자량은 약 100 달톤, 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 350 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 550 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 5,000 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 60,000 달톤, 및 약 75,000 달톤을 포함한다.
중합체의 분지된 양태와 관련하여, 중합체의 전체 분자량에 대한 대표적인 적절한 크기의 범위(두개의 수용성 중합체 부분의 조합된 중량을 필수적으로 기초로 한)는 하기 범위를 포함한다: 약 200 달톤 내지 약 100,000 달톤; 약 1,000 달톤 내지 약 80,000 달톤; 약 2,000 달톤 내지 약 50,000 달톤; 약 4,000 달톤 내지 약 25,000 달톤; 및 약 10,000 달톤 내지 약 40,000 달톤. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 중합체의 분지된 양태의 전체 중량평균 분자량은 하기 수치 중 하나에 상응한다: 400; 1,000; 1,500; 2,000; 3000; 4,000; 10,000; 15,000; 20,000; 30,000; 40,000; 50,000; 60,000; 또는 80,000.
반복 에틸렌 옥사이드 단량체를 포함하는 구조, 예를 들어, "-(CH2CH2O)n-" 또는 "-(OCH2CH2)n"이 제공될 수 있는 PEG와 관련하여, (n)에 대한 바람직한 값은 약 3 내지 약 3,000; 약 10 내지 약 3,000; 약 15 내지 약 3,000; 약 20 내지 약 3,000; 약 25 내지 약 3,000; 약 30 내지 약 3,000; 약 40 내지 약 3,000; 약 50 내지 약 3,000; 약 55 내지 약 3,000; 약 75 내지 약 3,000; 약 100 내지 약 3,000; 및 약 225 내지 약 3,000을 포함한다.
스페이서 부분("X1", "X2" 등)
임의적으로, 스페이서 부분은 말레이미드에, 및/또는 말레이미딜 부분에서 티올-함유 활성제의 잔부에 수용성 중합체를 연결시킬 수 있다. 대표적인 스페이서 부분은 하기를 포함한다: -0-, -S-, -C(O)-, -O-C(O)-, -C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-0-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]0-6-(OCH2CH2)0-2-, -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -O-C(O)-CH2-, -O-C(O)-CH2-CH2-, -0-C(O)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, 2가 시클로알킬기, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, O-C(O)-NH-[CH2]f-(OCH2CH2)n-, 및 임의의 상기 부분들 중 두개 이상의 조합물(여기서, (f)는 0 내지 6이며, (n)은 0 내지 20(바람직하게는 0 내지 10, 예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이며, 더욱 바람직하게는 4임)이다). 또한, 상기 탄소-함유 스페이서 부분 각각은 이에 결합된 분지된 알킬기를 가질 수 있다. 비제한적인 2가 시클로알킬(예를 들어 시클로알킬렌) 기의 예로는 C3-8 시클로알킬, 예를 들어 시클로프로파디일 (예를 들어, 1,1-, 시스-11,2-, 또는 트랜스-1,2-시클로프로필렌), 시클로부타디일, 시클로펜타디일, 시클로헥사디일, 및 시클로헵타디일의 다양한 이성질체를 포함한다. 시클로알킬렌 기는 하나 이상의 알킬기, 바람직하게는 C1-C6 알킬기로 치환될 수 있다.
생물학적 활성 컨쥬게이트
본 발명은 또한 숙신이미드 고리 연결을 통해 반응성 중합체에 공유적으로 결합되는 마이클 첨가를 수행할 수 있는 친핵체 생물학적 활성 분자를 포함하는 안정화된 생물학적 활성 컨쥬게이트를 포함한다. 생물학적 활성제는 바람직하게는 티올 또는 아미노기를 지닌 단백질이다.
적절한 생물학적 활성제는 예를 들어, 수면제 및 진정제, 정신 자극제, 정신 안정제, 호흡기 약물, 경련 방지제, 근육 이완제, 항파킨슨제(도파민 길항제), 마취제, 항염증제, 항불안제(불안 완화제), 식욕 억제제, 편두통약, 근육 수축제, 항감염제(항생제, 항바이러스제, 항균제, 백신), 항관절염제, 항말라리아제, 구토억제제, 항간질제, 기관지 확장제, 사이토카인, 성장 인자, 항암제, 항혈전제, 항고혈압제, 심혈관 약제, 항부정맥제, 항산화제, 항천식제, 호르몬제, 예를 들어 피임약, 교감신경흥분제, 이뇨제, 지질 조절제, 항안드로겐제, 구충제, 응고방지제, 신생물, 항신생물, 저혈당제, 영양제 및 보충제, 성장 보충제, 항장염제, 백신, 항체, 진단제 및 조영제로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 반응성 중합체에 대한 공유 부착에 사용하기에 적합한 활성제의 예는 칼시토닌, 에리트로포이어틴(EPO), 인자 VIII, 인자 IX, 세레다아제, 세레자임, 시클로스포린, 과립구 집락 자극 인자(GCSF), 트롬보포이어틴(TPO), 알파-1 단백질분해효소 억제제, 엘카토닌, 과립구 대식구 집락 자극 인자(GMCSF), 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬(HGH), 성장 호르몬 분비 호르몬(GHRH), 헤파린, 저분자량 헤파린(LMWH), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 수용체, 인터루킨-2, 인터루킨-1 수용체 길항제, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 황체형성 호르몬 분비 호르몬(LHRH), 인자 IX 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린 유사체(예를들어, 미국 특허 제 5,922,675호에 기술된 모노-아실화된 인슐린), 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 소마토스타틴 유사체, 예를들어 옥트레오티드, 바소프레신, 난포 자극 호르몬(FSH), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 인슐린트로핀, 대식구 집락 자극 인자(M-CSF), 신경성장인자(NGF), 조직성장인자, 각질세포 성장인자(KGF), 아교세포 성장인자(GGF), 종양 괴사 인자(TNF), 내피세포 성장인자, 부갑상선 호르몬(PTH), 글루카곤 유사 펩티드 티모신 알파 1, IIb/IIIa 억제제, 알파-1 항트립신, 포스포디에스테라아제(PDE) 화합물, VLA-4 억제제, 비스포스포네이트, 호흡기 세포융합 바이러스 항체, 낭성섬유증 막횡단 조절인자(CFTR) 유전자, 데옥시리보누클레아제(Dnase), 살균/투과 증가 단백질(BPI), 항-CMV 항체, 13-시스 레티노산, 마크로라이드, 예를들어 에리트로마이신, 올리엔도마이신, 트롤렌도마이신, 록시트로마이신, 클라리트로마이신, 다베르신, 아지트로마이신, 플루리트로마이신, 디리트로마이신, 조사마이신, 스피로마이신, 미데카마이신, 류코마이신, 미오카마이신, 로키타마이신, 암다지트로마이신, 및 스위놀리드 A; 플루오로퀴놀론, 예를들어 시프로플록사신, 오플록사신, 레보플록사신, 트로바플록사신, 알라트로플록사신, 목시플록시신, 노르플록사신, 에녹사신, 그레파플록사신, 가티플록사신, 로메플록사신, 스파르플록사신, 테마플록사신, 페플록사신, 아미플록사신, 플레록사신, 토수플록사신, 프룰리플록사신, 이를록사신, 파주플록사신, 클리나플록사신, 및 시타플록사신, 아미노글리코시드, 예를들어 젠타마이신, 네틸마이신, 파라메신, 토브라마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 및 스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코마이신, 람폴라닌, 미데플라닌, 콜리스틴, 답토마이신, 그라미시딘, 콜리스티메테이트, 폴리믹신, 예를들어 폴리믹신 B, 카프레오마이신, 바시트라신, 페넴; 페니실린, 예를들어 페니실리나아제 민감성 작용제 유사 페니실린 G, 페니실린 V, 페니실리나아제 내성 작용제 유사 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린; 그람 네거티브 미생물 작용제 유사 앰피실린, 아목시실린, 및 헤타실린, 실린, 및 갈람피실린; 항슈도모나스 페니실린 유사 카르베니실린, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및 피페라실린; 세팔로스포린 유사 세프포독심, 세프프로질, 세프트부텐, 세프티족심, 세프트리악손, 세팔로틴, 세파피린, 세팔렉신, 세프라드린, 세폭시틴, 세파만돌, 세파졸린, 세팔로리딘, 세파클로르, 세파드록실, 세팔로글리신, 세푸록심, 세포라니드, 세포탁심, 세파트리진, 세파세트릴, 세페핌, 세픽심, 세포니시드, 세포페라존, 세포테탄, 세프메타졸, 세프타지딤, 로라카르베프, 및 목살락탐, 모노박탐 유사 아즈트레오남; 및 카르바페넴, 예를들어 이미페넴, 메로페넴, 펜타미딘 이세티오우에이트, 알부테롤 술페이트, 리도카인, 메타프로테레놀 술페이트, 베클로메타손 디프레피오네이트, 트리암시놀론 아세트아미드, 부데소니드 아세토니드, 플루티카손, 이프라트로퓸 브로마이드, 플루니솔리드, 크로몰린 나트륨, 에르고타미드 타르트레이트, 및 적용가능한 경우 상기 기술된 물질의 유사체, 효능제, 길항제, 억제제 및 약학적으로 허용되는 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 펩티드 및 단백질에 관해서는, 본 발명은 합성, 천연, 당화, 비당화, 페길화 형태, 및 이의 생물학적 활성 단편 및 유사체를 포함한다.
본 발명은 또한 약학적 부형제와 조합된, 본원에 제공되는 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 제조물을 포함한다. 일반적으로, 컨쥬게이트 자체는 고체 형태 (예를들어, 침전물)일 것이고, 이는 고체 또는 액체 형태일 수 있는 적절한 약학적 부형제와 조합될 수 있다.
예시적 부형제는 탄수화물, 무기염, 항균제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 염기 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되나, 이에 제한되지는 않는다.
탄수화물, 예를들어 당, 유도된 당, 예를들어 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당, 및/또는 당 중합체가 부형제로 존재할 수 있다. 특정 탄수화물 부형제는 예를들어 단당류, 예를들어 프룩토오스, 말토오스, 갈락토오스, 글루코오스, D-만노오스, 소르보오스 등; 이당류, 예를들어 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 셀로비오스 등; 다당류, 예를들어 라피노오스, 멜레지토오스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예를들어 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨(글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등을 포함한다.
부형제는 또한 무기염 또는 완충제, 예를들어 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 제 1 인산나트륨, 제 2 인산나트륨 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
제조물은 또한 미생물 성장을 예방하거나 방지하기 위한 항균제를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항균제의 비제한적인 예는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 질산 페닐수은, 티메르솔 및 이들의 조합물을 포함한다.
항산화제가 또한 제조물에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 방지함으로써 제조물의 컨쥬게이트 또는 기타 성분의 악화를 방지하는데 사용된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항산화제는 예를들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시아니솔, 부틸화된 히드록시톨루엔, 하이포아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 나트륨 비술파이트, 나트륨 포름알데히드 술폭실레이트, 나트륨 메타비술파이트 및 이들의 조합물을 포함한다.
계면활성제가 부형제로 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 폴리소르베이트, 예를들어 "트윈 20" 및 "트윈 80", 및 플루로닉(pluronic), 예를들어 F68 및 F88(둘 모두는 바스프사 (BASF, Mount Olive, New Jersey)에서 시판됨); 소르비탄 에스테르; 지질, 예를들어 인지질, 예를들어 레시틴 및 기타 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민(바람직하게는 리포솜 형태가 아님), 지방산 및 지방산 에스테르; 스테로이드, 예를들어 콜레스테롤; 및 킬레이트제, 예를들어 EDTA, 아연 및 기타 적절한 양이온을 포함한다.
산 또는 염기가 제조물 내에 부형제로 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 비제한적인 예는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다. 적절한 염기의 예는 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산 암모늄, 아세트산 칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산 나트륨, 포름산 나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸마르산 나트륨 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 염기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
약학적 제조물은 모든 유형의 제형 및 특히 주사에 적합한 제형, 예를들어 재구성될 수 있는 분말 뿐만 아니라 현탁액 및 용액을 포함한다. 조성물 내의 컨쥬게이트 (즉, 본원에 기술된 활성제와 중합체 사이에 형성된 컨쥬게이트)의 양은 다수의 요인에 따라 다양할 것이나, 최적으로는 상기 조성물이 단위 투여 용기 (예를들어, 바이얼) 내에 저장되는 경우에 치료적으로 유효한 용량일 것이다. 또한, 약학적 제조물은 주사기에 저장될 수 있다. 치료적 유효량은 어떠한 양이 임상적으로 요망되는 종점을 발생시키는지 결정하기 위해 컨쥬게이트의 양을 증가시켜 반복 투여함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
조성물 내의 임의의 개별적 부형제의 양은 부형제의 활성 및 특히 조성물의 필요에 따라 다양할 것이다. 통상적으로, 임의의 개별적 부형제의 최적량은 통상적 실험을 통해, 예를들어 다양한 양의 부형제 (적은 양으로부터 많은 양으로의 범위)를 함유하는 조성물을 제조하고, 조성물의 안정성 및 기타 파라미터를 시험하고, 최적 효과가 유의한 부작용이 없이 달성되는 범위를 결정함으로써 결정된다.
그러나, 일반적으로 부형제는 조성물 내에 약 1 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 5 내지 98 중량%, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 95 중량%의 부형제의 양으로 존재할 것이고, 30 중량% 미만의 농도가 가장 바람직하다.
기타 부형제와 함께 상술한 약학적 부형제는 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), and Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000]에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 제조물은 통상적으로, 그러나 필수적이지는 않게 주사를 통해 투여되고, 따라서 이는 일반적으로 투여 직전에 액체 용액 또는 현탁액이다. 약학적 제조물은 또한 기타 형태, 예를들어 시럽, 크림, 연고, 정제, 분말 등의 형태를 취할 수 있다. 기타 투여 방법, 예를들어 폐, 직장, 경피, 경점막, 경구, 수막강내, 피하, 동맥내 투여 등이 포함된다.
상기 기술된 바와 같이, 컨쥬게이트는 정맥내 주사, 덜 바람직하게는 근내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형의 유형은 즉시주사가능한(ready-for-injection) 용액, 사용전에 용매와 조합되는 건조 분말, 즉시주가사능한 현탁액, 사용 전에 비히클과 조합되는 건조 불용성 조성물, 및 주사 전에 희석되는 에멀젼 및 액체 농축물 등을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 컨쥬게이트를 컨쥬게이트를 이용한 치료에 민감한 질환에 걸린 환자에 투여하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 일반적으로 주사를 통해 치료적 유효량의 컨쥬게이트 (바람직하게는, 약학적 제조물의 일부로 제공된 컨쥬게이트)를 투여하는 것을 포함한다. 상기 투여 방법은 특정 컨쥬게이트의 투여에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 임의의 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 어떠한 질환이 특정 컨쥬게이트에 의해 효과적으로 치료되는지 인지한다. 투여되는 실제량은 환자의 연령, 체중 및 일반적인 상태 뿐만 아니라 치료되는 질환의 중증도, 건강 관리 직업인의 판단, 및 투여되는 컨쥬게이트에 따라 다양할 것이다. 치료적 유효량은 당업자에게 공지되어 있고/거나 타당한 참고자료 및 문헌에 기술되어 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 약 0.001 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일, 더욱 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 범위일 것이다.
임의의 제공된 컨쥬게이트 (즉, 바람직하게는 약학적 제조물의 일부로서 제공된 컨쥬게이트)의 단위 투여량은 임상의의 판단, 환자의 요청 등에 따라 다양한 투여 스케줄로 투여될 수 있다. 특정 투여 스케줄은 당업자에게 공지되어 있거나 통상적 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 투여 스케줄은 1일에 5회, 1일에 4회, 1일에 3회, 1일에 2회, 1일에 1회, 1주일에 3회, 1주일에 2회, 1주일에 1회, 1개월에 2회, 1개월에 1회, 및 이의 임의의 조합 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일단 임상적 종점이 달성되면, 조성물의 투여가 중단된다.
본 발명이 바람직한 특정 구체예로 기술되었으나, 상술된 기재 뿐만 아니라 하기 기재되는 실시예는 단지 예시를 위한 것으로 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 기타 양태, 장점 및 변형은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 비록 특정 용어가 본원에서 사용되지만, 이들은 단지 설명 및 기술적인 것으로, 제한하고자 함이 아니다.
본 발명의 실시는 달리 기술되지 않는 한 유기 합성, 생화학, 단백질 정제 등의 통상적인 기술을 이용하며, 이는 당업자의 이해 범위 내에 해당된다. 이러한 기술은 예를들어 문헌[J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992), 상기]에 충분히 설명되어 있다.
하기 실시예에서, 사용된 수 (예를들어, 양, 온도 등)는 정확하게 하도록 하였으나, 다소의 실험적 오차 및 편차를 고려해야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 온도는 ℃이고, 압력은 해발고도에서의 대기압이거나 이의 근처이다. 하기 실시예 각각은 본원에 기술된 하나 이상의 구체예를 수행하기 위해 당업자에게 도움이 되는 것으로 간주된다. 모든 1H NMR 데이터는 브루커사(Bruker)에서 제조된 300 또는 400 MHz NMR 분광계에 의해 생성된다. 실시예 5 내지 12에서, 상용 등급의 mPEG(20k Da)-아민은 하기 특성을 지니도록 사용되었다: 아민의 치환 %, 94.6 내지 100%; 히드록시 mPEG 불순물 %, 0 내지 4.2%; 이합체 (두개의 기능화된 PEG 종이 서로 반응하여 형성된 종) %, 0.6 내지 2.1%; 삼합체 (세개의 기능화된 PEG 종이 서로 반응하여 형성된 종) %, 0 내지 0.3%.
실시예 1
치환된 말레암산 말단의 수용성 중합체의 제조
Figure 112008005884142-pct00015
무수 디클로로메탄 (350 ml) 중의 mPEG (20k Da)-아민 (Nektar Therapeutics, 50.0 g, 0.0025 mol)의 용액에 N-메톡시카르보닐말레이미드 (0.80 g, 0.0051 mol)를 첨가하고, 용액을 아르곤 분위기 하에서 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (1.0 ml)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 실온에서 밤새 교반시켰다. 다음, 반응 혼합물을 증류시켜 ~200 ml의 디클로로메탄을 제거하여 농축시키고, 생성물을 에틸 에테르로 침전시켰다. 건조후 수율: 46.3 g. NMR (d6-DMSO): 3.24 ppm (s, PEG-OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 골격), 3.86 ppm (s, CH3O-NH-), 6.20 ppm (m, - CH=CH-), 8.46 ppm (-NH).
실시예 2
mPEG(20k Da)말레이미드의 제조
Figure 112008005884142-pct00016
무수 아세토니트릴 (100 ml) 중의 실시예 1에서 제조된 치환된 말레암산 말단의 수용성 중합체 (10.0 g)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (10 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에서 실온에서 44시간 동안 교반시켰다. 다음, 혼합물을 증류시켜 ~80 ml의 아세토니트릴을 제거하여 농축시키고, 생성물을 에틸 에테르로 침전시켜, 8.5 g의 mPEG(20K Da)말레이미드를 생성시켰다. NMR (d6-DMSO): 3.24 ppm (s, PEG-OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 골격), 7.01 ppm (s, -CH=CH-, 말레이미드); 치환 93.5%.
실시예 3
치환된 말레암산 말단의 수용성 중합체를 제조하기 위한 프로토콜
Figure 112008005884142-pct00017
상기 식 (화학식 Ⅱ)에서,
POLY는 수용성 중합체(바람직하게는, 선형 또는 분지형, 바람직하게는 CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-이고, 여기서 POLY가 선형인 경우 (n)은 2 내지 4000임)이고;
(c)는 0 또는 1 (바람직하게는 0)이고;
X2는 존재시 스페이서 부분이고,
상기 식 (화학식 Ⅲ)에서,
Y1은 O 또는 S이고;
Y2는 O 또는 S이고;
(a)는 1 내지 20의 정수이고;
R1은 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R2는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R3는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R4는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
상기 식 (화학식 Ⅰ)에서,
POLY는 수용성 중합체이고;
(b)는 0 또는 1이고;
X1은 존재시 스페이서 부분이고;
Y1은 O 또는 S이고;
Y2는 O 또는 S이고;
(a)는 1 내지 20의 정수이고;
R1은 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R2는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R3는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R4는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이다.
아민 말단의 수용성 중합체 (화학식 Ⅱ)를 디클로로메탄 (20% wt/v 용액)에 용해시키고, 모든 디클로로메탄이 제거될때까지 40℃에서 감압하에서 증류시켰다. 이는 물과의 등비등 혼합물을 형성하고, 잔류하는 중합체로부터 물을 효과적으로 제거한다. 이를 1회 반복하였다. 요망시 감압하에 두어 고체로 완전히 건조시킨다 (필수적이지는 않음).
비활성 가스하에서 무수 디클로로메탄 (20% wt/v 용액) 중에 상기 중합체를 다시 용해시켰다. 1.5 당량의 말레이미드 시약 (화학식 Ⅲ)을 첨가하였다. 용해된 후, 0.5 당량의 디이소프로필에틸아민을 적가하였다. 1시간 이상 동안 비활성 분위기하에서 실온에서 교반시켰다 (밤새가 적합하나, 닫힌-고리 말레이미드가 형성될 수 있음).
진한 오일과 유사한 용액 (분자량에 따라 수용성 중합체 g당 약 0.5-1.5 mL의 용액)이 생성될때까지 25-30℃에서 감압하에서 용매를 증류시켰다. 교반과 함께 용액 (수용성 중합체 g당 약 25 mL)에 이소프로필 알코올을 천천히 첨가하였다. 30분 이상 동안 실온에서 교반하였다. 액체를 여과시켰다. 이에 이소프로필 알코올을 다시 충분히 첨가하여 수용성 중합체의 슬러리를 만든 후, 액체를 다시 한번 여과시켰다. 모든 이소프로필 알코올이 제거될때까지 진공하에서 고체를 건조시켰다.
실시예 4
말레이미드 말단의 수용성 중합체를 제조하기 위한 프로토콜
Figure 112008005884142-pct00018
상기 식 (화학식 Ⅰ)에서,
POLY는 수용성 중합체이고;
(b)는 0 또는 1이고;
X1은 존재시 스페이서 부분이고;
Y1은 O 또는 S이고;
Y2는 O 또는 S이고;
(a)는 1 내지 20의 정수이고;
R1은 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R2는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R3는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R4는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
상기 식 (화학식 Ⅴ)에서, POLY, X2 및 (c) 각각은 화학식 Ⅱ에서 정의된 바와 같고, R3 및 R4 각각은 화학식 Ⅲ에서 정의된 바와 같다.
실시예 3으로부터의 치환된 말레암산 말단의 수용성 중합체를 무수 디클로로메탄에 용해시켜, 10% wt/v 용액을 제조하였다. 무수 황산나트륨 (PEG g당 0.5g)을 첨가하였다. 무수 탄산나트륨 (수용성 중합체 g당 0.5 g)을 첨가하였다. 비활성 분위기 (약 40℃) 하에서 가열하여 환류시켰다. 5시간 동안 교반하여 환류시켰다. 열을 제거하고, 35℃ 미만으로 냉각되도록 두었다. 고체를 여과시켰다. 진한 오일과 같은 용액이 생성될때까지 25-40℃에서 감압하에서 용매를 증류시켰다. 실시예 3에서와 같이 이소프로필 알코올을 이용하여 침전시켰다.
실시예 5
말레이미드 말단의 수용성 중합체의 비수성 제조
등비등화된 mPEG(20k Da)-아민, 0.01 wt % 부틸화된 히드록시톨루엔 (BHT), 및 디클로로메탄을 40℃에서 조합시켰다. 회전 증발기를 이용하여 보다 휘발성인 성분의 증발을 수행하였다. 함수량을 시험하였고, 이는 56 ppm (100 ppm 미만이 요망됨)인 것으로 나타났다. 이 혼합물에 각각의 제분된 탄산나트륨 및 과립 황산나트륨 g당 0.5 g을 첨가하였다. 제분된 탄산나트륨 및 과립 황산나트륨을 첨가한 후, 혼합물을 교반하고, 5℃로 냉각시켜, 저온의 PEG 용액을 형성시켰다.
별개로, 3당량 (0.56 g)의 N-메톡시카르보닐말레이미드를 디클로로메탄에 용 해시켜, 3% (w/v) 용액을 제조하였다. 생성된 혼합물을 30초 동안 볼텍스시켰다. 볼텍스된 혼합물은 흐린 외관을 지녔다. 볼텍스된 혼합물을 저온의 PEG에 첨가하고, 5℃ 또는 약 5℃에서 21시간 동안 교반시켰다.
교반후, 혼합물을 약 40℃까지 점진적으로 가열하고, 45분 이상 동안 환류시켰다. 이후, 샘플을 회수하여 H NMR에 의해 반응 완료를 결정하였다.
8.5시간 동안 환류시킨 후, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 셀라이트 베드(bed)를 통해 여과시킨 후, 회전 증발기를 이용하여 디클로로메탄 용매를 제거하고, 30℃의 수조에 두어 오일을 생성시켰다. 이소프로필 알코올(IPA)을 이용하여 침전시켜 생성물을 회수하였다 (30분 동안 교반).
본 실시예와 관련된 분석은 표 1 및 2에 제공되고, 이는 실시예 13에서 논의된다.
실시예 6
말레이미드 말단의 수용성 중합체의 비수성 제조
하기의 예외/주해와 함께 실시예 5의 과정을 반복하였다. 제분된 탄산나트륨 및 과립 황산나트륨을 첨가한 후, 혼합물을 10시간 동안 5℃로 냉각시켰다. 7시간 동안 환류를 수행하였다 (이는 6시간 째에서 6%의 선구물질을 나타냄).
본 실시예와 관련된 분석은 표 1 및 2에 제공되고, 이는 실시예 13에서 논의된다.
실시예 7
말레이미드 말단의 수용성 중합체의 비수성 제조
하기의 예외/주해와 함께 실시예 5의 과정을 반복하였다. 제분된 탄산나트륨 및 과립 황산나트륨을 첨가한 후, 혼합물을 교반하고, 9.5시간 동안 5.7℃로 냉각시켰다. 약간 가열한 후, 환류시키고, 혼합물을 45분 동안 실온에서 교반시키고, 환류시켰다. 6.5시간 동안 환류를 수행하였다 (이는 5시간째에서 6%의 선구물질을 나타냄).
본 실시예와 관련된 분석은 표 1 및 2에 제공되고, 이는 실시예 13에서 논의된다.
실시예 8
말레이미드 말단의 수용성 중합체의 비수성 제조
하기의 예외/주해와 함께 실시예 5의 과정을 반복하였다. 전체 15시간 동안 교반하면서 제분된 탄산나트륨 및 과립 황산나트륨을 첨가한 후, 혼합물을 교반시키고, 처음엔 5.75℃로 냉각시키고, 2시간에 걸쳐 점진적으로 5℃로 냉각시켰다. 약간 가열한 후, 환류시키고, 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반시키고, 환류시켰다. 8시간 동안 환류를 수행하였다 (이는 6시간 째에서 12%의 선구물질을 나타냄).
본 실시예와 관련된 분석은 표 1 및 2에 제공되고, 이는 실시예 13에서 논의된다.
실시예 9 (비교 실시예)
"수성 N-알콕시카르보닐말레이미드 경로"
7.6 % (w/v) 중탄산나트륨 용액 중의 mPEG 아민 (20k Da)의 17.5 % 용액 (w/v)을 6℃로 냉각시켰다. 아세토니트릴 중의 N-메톡시카르보닐말레이미드 (3 당 량, 5.3 %)의 10 % 용액 (w/v)을 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반시켰다. 충분한 증류수를 상기 용액에 첨가하여 부피를 2배로 만들었다. 용액을 먼저 냉각시킨 후, 45분에 걸쳐 13℃로 가온되도록 하였다.
용액의 pH를 인산을 이용하여 3.0으로 조정한 후, 충분한 염화나트륨을 첨가하여 15 % 염화나트륨 (w/v)의 염 용액을 생성시켰다. 염 용액을 15분 동안 교반시킨 후, 동일한 부피의 디클로로메탄으로 추출하여 디클로로메탄 용액을 생성시켰다.
디클로로메탄 용액을 황산나트륨 (3.5g/100 mL)을 이용하여 건조시키고, 증발시켜, 오일을 생성시켰다. 이소프로필 알코올 (17.5mL/g)을 이용하여 침전시키고, 여과시키고, 건조시켜, 백색 고체를 생성시켰다.
본 실시예와 관련된 분석은 표 1 및 2에 제공되고, 이는 실시예 13에서 논의된다.
실시예 10 (비교 실시예)
"수성 N-알콕시카르보닐말레이미드 경로"
7.6% (w/v) 중탄산나트륨 용액 중의 mPEG 아민 (20k Da)의 17.5 % 용액 (w/v)을 3.8 내지 5.9℃로 냉각시켰다. 냉각기 문제로 인해 밤새 실온으로의 온도에서의 일탈이 발생하였다. 아세토니트릴 중의 N-메톡시카르보닐말레이미드 (3 당량, 4.4 %)의 10 % 용액 (w/v)을 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반시켰다. 충분한 증류수를 상기 용액에 첨가하여 부피를 두배로 만들었다. 용액을 먼저 냉각시킨 후, 45분에 걸쳐 13℃로 가온되도록 하였다.
인산을 이용하여 용액의 pH를 3.0으로 조정한 후, 충분한 염화나트륨을 첨가하여 15 % 염화나트륨 (w/v)의 염 용액을 생성시켰다. 염 용액을 15분 동안 교반시킨 후, 동일한 부피의 디클로로메탄으로 추출하여 디클로로메탄 용액을 생성시켰다.
황산나트륨 (3.5g/100 mL)을 이용하여 디클로로메탄 용액을 건조시키고, 증발시켜 오일을 생성시켰다. 이소프로필 알코올 (17.5mL/g)을 이용하여 침전시키고, 여과시키고, 건조시켜 백색 고체를 생성시켰다.
본 실시예와 관련된 분석은 표 1 및 2에 제공되고, 이는 실시예 13에서 논의된다.
실시예 11 (비교 실시예)
"수성 N-알콕시카르보닐말레이미드 경로"
7.6 % (w/v) 중탄산나트륨 용액 중의 mPEG 아민 (20k Da)의 17.5 % 용액 (w/v)을 4℃로 냉각시켰다. 아세토니트릴 중의 N-메톡시카르보닐말레이미드 (3 당량, 5.4 %)의 10% 용액 (w/v)을 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반시켰다. 충분한 증류수를 첨가하여 용액의 부피를 두배로 만들었다. 용액을 우선 냉각시킨 후, 45분에 걸쳐 8 내지 9℃로 가온되도록 하였다.
인산을 이용하여 용액의 pH를 3.0으로 조정한 후, 충분한 염화나트륨을 첨가하여 15 % 염화나트륨 (w/v)의 염 용액을 생성시켰다. 염 용액을 15분 동안 교반시킨 후, 동일한 부피의 디클로로메탄을 이용하여 추출하여 디클로로메탄 용액을 생성시켰다.
황산나트륨 (3.5g/100 mL)을 이용하여 디클로로메탄 용액을 건조시키고, 증발시켜 오일을 생성시켰다. 이소프로필 알코올 (17.5mL/g)을 이용하여 침전시키고, 여과시키고, 건조시켜, 백색 고체를 생성시켰다.
본 실시예와 관련된 분석은 표 1 및 2에 제공되고, 이는 실시예 13에서 논의된다.
실시예 12 (비교 실시예)
"수성 N-알콕시카르보닐말레이미드 경로"
7.6% (w/v) 중탄산나트륨 용액 중의 mPEG 아민 (20k Da)의 17.5% 용액 (w/v)을 6℃로 냉각시켰다. 아세토니트릴 중의 N-메톡시카르보닐말레이미드 (3 당량, 5.3%)의 10% 용액 (w/v)을 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반시켰다. 충분한 증류수를 상기 용액에 첨가하여 용액의 부피를 두배로 만들었다. 용액을 우선 냉각시킨 후, 45분에 걸쳐 13℃로 가온되도록 하였다.
인산을 이용하여 용액의 pH를 3.0으로 조정한 후, 충분한 염화나트륨을 첨가하여 15% 염화나트륨 (w/v)의 염 용액을 생성시켰다. 염 용액을 15분 동안 교반시킨 후, 동일한 부피의 디클로로메탄을 이용하여 추출하여 디클로로메탄 용액을 생성시켰다.
황산나트륨 (3.5g/100 mL)을 이용하여 디클로로메탄 용액을 건조시키고, 증발시켜 오일을 생성시켰다. 이소프로필 알코올 (17.5mL/g)을 이용하여 침전시키고, 여과시키고, 건조시켜 백색 고체를 생성시켰다.
본 실시예와 관련된 분석은 표 1 및 2에 제공되고, 이는 실시예 13에서 논의 된다.
실시예 13
실시예 5 내지 12에서 수득된 생성물을 HPLC, GFC 및 1H NMR을 이용하여 분석하였다. RI 검출기의 사용과 함께, 10 mM HEPES의 이동상, 1.0 mL/분의 유속 및 25℃의 온도를 지니는 쇼덱스 (Shodex) 단백질 KW-803 GFC 컬럼을 사용하는 애질런트 1100 HPLC 시스템 (Agilent)을 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 수행하였다 (생성물은 카르복실산 기능화된 티올 종을 이용하여 유도되고, 치환은 유도된 스펙트럼 및 유도되지 않은 스펙트럼의 비교에 의해 결정됨). RI 검출기의 사용과 함께, 1x 인산염 완충 염수의 이동상, 1.0 mL/분의 유속 및 25℃의 온도를 지니는 쇼덱스 단백질 KW-803 GFC 컬럼을 이용하여 GFC를 수행하였다. 결과는 표 1 및 2에 제공된다. 표 1과 관련하여, "디말레이미딜 종의 %"는 요망되는 말레이미드 생성물과 대략 분자량이 동일하지만 두개의 말레이미딜 말단을 지니는 중합체를 의미하고, 표 2와 관련하여, "MAL의 이합체 %"는 두개의 기능화된 PEG 종의 서로에 대한 반응으로부터 생성된 종을 의미하고, MAL의 삼합체 %는 세개의 기능화된 PEG 종의 서로에 대한 반응으로부터 형성된 종을 의미하고, 삼합체보다 높은 MW %"는 네개 이상의 기능화된 PEG 종의 서로에 대한 반응으로부터 형성된 종을 의미한다.
표 1
실시예 5 내지 12로부터의 생성물의 HPLC 분석
실시예 #으로부터의 생성물 HPLC
말레이미드의 치환% mPEG-말레암산의 % 공지되지 않은 물질 + mPEG-말레암산의 % 미반응종의 % 디말레이미딜종의 %
실시예 5 89 ≤1.9 6.8* 4 3.7
실시예 6 86 ≤1.1 6.6* 7.5 2.6
실시예 7 89 ≤1.9 4.6* 6 2.5
실시예 8 88 ≤1.4 3.1* 6.3 2.5
실시예 9
(비교 실시예)		 83 7.9 9.7* 5.9 3.8
실시예 10***
(비교 실시예)		 0 65 - - -
실시예 11
(비교 실시예)		 86 4.5 4.5* 7.7 1.8
실시예 12
(비교 실시예)		 80 13.6 14.2* 4 2
* mPEG-말레암산 피크를 포함하나, 미반응종은 포함하지 않음.
***온도 일탈이 발생한 실시예.
표 2
실시예 5 내지 12로부터의 생성물의 GFC 및 1H NMR 분석 및 실시예 5 내지 8로부터의 생성물의 수율 및 배치(batch) 크기
실시예 #으로부터의 생성물 GFC(젤 여과 크로마토그래피) 1H NMR 질량 수율(%) 배치 크기(g)
MAL의 이합체의 % MAL의 삼합체의 % 삼합체보다 높은 MW의 % 치환된 말레암산종의 % 열린-고리 에스테르 불순물의 %
실시예 5 3.2 1.3 1.1 0 0 85 ~25
실시예 6 4.5 1.2 0 2 2.3 88 ~25
실시예 7 2.8 0.4 0.3 ≤1.5** ≤2.0** 79 ~25
실시예 8 2.3 0.4 0 0 0 85 ~25
실시예 9
(비교 실시예)		 1.6 0 0 0 0 93.5 ~1122
실시예 10***
(비교 실시예)		 - - - - - 66.4 ~797
실시예 11
(비교 실시예)		 0.9 0 0.6 5.8 0 90.7 ~463
실시예 12
(비교 실시예)		 0.7 0 0 0 0 87 ~1045
** 정량화될 수 없었으며, 제공된 값은 예상값임.
*** 온도 일탈이 발생한 실시예.
표 1로부터, 실시예 5 내지 8에서 사용된 일반적인 방법이 비교 실시예 9 내지 12에 따른 수성-기재 방법에 따라 생성된 조성물보다 많은 말레이미드 치환을 지니는 조성물을 생성시킨다는 것이 명백하다. 종종, 실시예 5 내지 8에서 사용된 일반적인 방법은 86 퍼센트를 초과하는 말레이미드 치환을 발생시킨다. 또한, 표 1은 실시예 5 내지 8에서 사용된 일반적인 방법이 비교 실시예 9 내지 12에 따른 수성-기재 방법으로 달성될 수 있는 것보다 나은, 4 퍼센트 미만, 2 퍼센트 미만까지의 말레암산 ("mPEG-말레암산")을 지니는 중합체의 백분율을 지니는 조성물을 생성시키는 것을 입증한다.
표 2로부터, 가스 여과 크로마토그래피를 통해 분석된 보다 높은 분자량의 종 (말레이미드의 이합체 %, 말레이미드의 삼합체 % 및 기타 고분자량종)을 제외하고는, M-MAL 20k 선구물질 및 열린 고리 에스테르 불순물의 백분율과 같은 파라미터가 시험된 실시예에서 대체로 일치하는 것으로 나타났다.
최종적으로, 표 1 및 2로부터, 실시예 5 내지 8에서 사용된 일반적인 방법이 비교 실시예에서 사용된 일반적인 방법과 비교시 일치되고 우수한 수율을 발생시키는 것이 명백하다.

Claims (42)

  1. a) 10,000 ppm 미만의 물의 실질적 비수성 조건하에서 하기의 구조를 지니는 아민 말단의 수용성 중합체와
    Figure 112013041164835-pct00019
    [상기 식에서,
    POLY는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시아세트산), 폴리(아크릴산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 및 이들의 공중합체 또는 삼중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 수용성 중합체이고;
    (c)는 0 또는 1이며;
    X2는 존재하는 경우, 스페이서 부분이다.]
    하기의 구조를 지니는 말레이미드 시약을 조합시켜,
    Figure 112013041164835-pct00020
    [상기 식에서,
    Y1은 O 또는 S이고;
    Y2는 O 또는 S이고;
    (a)는 1 내지 20의 정수이고;
    R1은 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이고;
    R2는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이고;
    R3는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이고;
    R4는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이다.]
    하기의 구조를 갖는 치환된 말레암산(maleamic acid) 말단의 수용성 중합체를 형성시키는 단계;
    Figure 112013041164835-pct00021
    [상기 식에서,
    POLY는 수용성 중합체이고;
    (b)는 0 또는 1이고;
    X1는 존재하는 경우, 스페이서 부분이고;
    Y1는 O 또는 S이고;
    Y2는 O 또는 S이고;
    (a)는 1 내지 20의 정수이고;
    R1은 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이고;
    R2는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이고;
    R3는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이고;
    R4는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이다.]
    b) 말레암산 말단의 수용성 중합체를 제거 조건에 노출시킴으로써 하기의 구조를 지니는 말레이미드 말단의 수용성 중합체를 생성시키는 단계를 포함하는, 말레이미드 말단의 수용성 중합체를 포함하는 조성물을 제공하는 합성 방법.
    Figure 112013041164835-pct00022
    [상기 식에서,
    POLY는 수용성 중합체이고;
    (c)는 0 또는 1이고;
    X2는 존재하는 경우, 스페이서 부분이고;
    R3는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이고;
    R4는 각각의 예에서 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이다.]
  2. 제 1항에 있어서, 말레암산 말단의 수용성 중합체를 제거 조건에 노출시키기 전에 치환된 말레암산 말단의 수용성 중합체를 분리시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 말레암산 말단의 수용성 중합체를 분리시키는 것이 건조 말레암산 말단의 수용성 중합체를 제조하기 위한 침전에 의해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 침전이 과량의 이소프로필 알코올, 디에틸 에테르, MTBE, 헵탄, THF, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 시약을 첨가함으로써 달성됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 건조 말레암산 말단의 수용성 중합체를 용해시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 유기 용매에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 유기 용매가 할로겐화된 지방족 탄화수소, 알코올, 방향족 탄화수소, 할로겐화된 지방족 탄화수소, 알코올, 방향족 탄화수소, 할로겐화된 방향족 탄화수소, 아미드, 니트릴, 케톤, 아세테이트, 에테르, 시클릭 에테르 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 유기 용매가 디클로로메탄, 클로로포름, 아세토니트릴, 톨루엔, 메틸 t-부틸 에테르, 테트라히드로푸란, 옥탄올, 에틸 아세테이트, 디에틸카르보네이트, 아세톤, 시클로헥산 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 유기 용매가 디클로로메탄 또는 아세토니트릴임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 실질적 비수성 조건하에서 아민 말단의 수용성 중합체와 말레이미드 시약을 조합시켜 말레암산 말단의 수용성 중합체를 형성시키는 단계가 염기성 촉매의 존재하에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 6항에 있어서, 말레암산 말단의 수용성 중합체를 제거 조건에 노출시키는 단계가 염기의 존재하에서 유기 용매에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 염기가 중탄산나트륨, 중탄산칼륨, 탄산나트륨 또는 탄산칼륨으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 말레암산 말단의 수용성 중합체를 제거 조건에 노출시키는 단계가 10 내지 60℃의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 말레암산 말단의 수용성 중합체를 제거 조건에 노출시키는 단계가 비친핵성 아민 촉매의 존재하에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 비친핵성 아민 촉매가 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, n-메틸 모르폴린, 피리딘, N,N-디메틸-4-아미노피리딘, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔, 및 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 말레암산 말단의 수용성 중합체를 제거 조건에 노출시키는 단계가 상기 단계를 건조제의 존재하에서 수행하는 것을 포함하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 건조제가 NaHCO3, Na2CO3, CaCl2, CaSO4, MgSO4, KOH, Na2SO4, K2CO3, KHCO3, 분자체 (molecular sieve) 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 삭제
  19. 제 1항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜)임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 약 100 내지 약 100,000 달톤의 분자량을 지님을 특징으로 하는 방법.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제 1항에 있어서, POLY가 선형 수용성 중합체임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, POLY가 CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2이고, (a)가 1이고, 추가로 (n)이 2 내지 4000임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1항에 있어서, POLY가 분지된 것임을 특징으로 하는 방법.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 제 1항에 있어서, 실질적 비수성 조건이 1000 ppm (parts per million) 미만의 물을 지니는 반응 매질임을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 실질적 비수성 조건이 100 ppm 미만의 물을 지니는 반응 매질임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 실질적 비수성 조건이 60 ppm 미만의 물을 지니는 반응 매질임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1항에 있어서, 조성물이, 조성물 내의 수용성 중합체 종의 70 퍼센트 이상이 말레이미드 말단의 수용성 중합체가 되도록 형성됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1항에 있어서, 조성물이, 조성물 내의 수용성 중합체 종의 80 퍼센트 이 상이 말레이미드 말단의 수용성 중합체가 되도록 형성됨을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1항에 있어서, 조성물이, 조성물 내의 수용성 중합체 종의 90 퍼센트 이상이 말레이미드 말단의 수용성 중합체가 되도록 형성됨을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 1항에 있어서, 조성물이, 조성물 내의 수용성 중합체 종의 93 퍼센트 이상이 말레이미드 말단의 수용성 중합체가 되도록 형성됨을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 1항에 있어서, 조성물이, 조성물 내의 수용성 중합체 종의 86 퍼센트 이상이 mPEG-말레이미드가 되도록 형성됨을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 1항에 있어서, 조성물이, 조성물 내의 수용성 중합체 종의 93 퍼센트 이상이 mPEG-말레이미드가 되도록 형성됨을 특징으로 하는 방법.
  39. 삭제
  40. 컨쥬게이션 조건하에서, 제 1 항의 방법에 의해 제조된 말레이미드 말단의 수용성 중합체를 포함하는 조성물과 티올을 함유하는 생물학적 활성제를 조합시키는 것을 포함하여, 컨쥬게이트를 제조하는 방법.
  41. 삭제
  42. 삭제
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