KR20200082345A - 암배항원을 표적화하는 재조합 면역독소 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

암배항원을 표적화하는 재조합 면역독소 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암배항원을 표적화하는 재조합 면역독소 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 염기서열과 슈도모나스 외독소 A (PEA)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 슈도모나스 외독소 A가 결합된 재조합 면역독소의 생산방법, 암배항원을 과발현하는 암세포를 사멸시키기 위한 재조합 면역독소 및 상기 재조합 면역독소를 포함하는 암배항원을 과발현하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

암배항원을 표적화하는 재조합 면역독소 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Recombinant immunotoxin targeting carcinoembryonic antigen and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same}
본 발명은 암배항원을 표적화하는 재조합 면역독소 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 염기서열과 슈도모나스 외독소 A (PEA)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 발현 벡터를 이용한 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 슈도모나스 외독소 A가 결합된 재조합 면역독소의 생산방법, 암배항원을 과발현하는 암세포를 사멸시키기 위한 재조합 면역독소 및 상기 재조합 면역독소를 포함하는 암배항원을 과발현하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
CEACAM5 (carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5) 또는 CD66e로도 알려진 CEA는 건강한 성인에서 매우 낮은 수준으로 발현되지만, 위암, 췌장암, 폐암, 유방암, 특히 직장암을 포함하는 일부 암에서 높게 발현되어 항암제를 위한 좋은 표적이 될 수 있다. CEA는 매우 특이적이고 민감한 바이오마커이다. 알투모맙 (Altumomab), 아르시투모맙 (Arcitumomab), 세구투주맙 (Cergutuzumab) 및 라베투주맙 (Labetuzumab)을 포함하는 몇몇 항체가 대장암과 유방암의 진단 및 치료를 위해 조사되어 왔다. 항체의 독성을 증가시키기 위해, CEA-Cide 및 라베투주맙 고비테칸 (IMMU-30)과 같은 항체-약물 접합체 또는 시비사타맙 (Cibisatamab)과 같은 이중특이적 항체도 연구되어 왔다.
슈도모나스 외독소 A (Pseudomonas exotoxin A; PEA)는 녹농균 (P. aeruginosa)에 의해 생성된 박테리아 독소로, AB 독소 구조-기능 특성을 갖는 613 개의 아미노산으로 구성된다. A 도메인은 촉매 도메인 (Ib 및 III, aa 365-613)에 해당하고, B 도메인은 전좌 도메인 (II, aa 253-364)에 해당한다. B 도메인은 A 도메인을 세포의 세포질로 전달하고 결합 도메인은 세포 표면 수용체에 결합하는 독소 (Ia, aa 1-252)에 포함된다. PEA는 그 세포 표면 수용체에 결합하여 수용체 매개 엔도사이토시스 (endocytosis)를 통해 세포로 진입한다. 엔도좀에서, 전좌 도메인은 퓨린 프로테아제에 의해 절단되고 A 도메인은 세포질세망막 (endoplasmic reticulum membrane)을 통해 전좌되어 숙주 세포질로 전달된다. 이후 EF2 (elongation factor 2)의 촉매성 ADP 리보실화가 일어나고, 세포사멸성 세포 죽음을 일으킨다. PEA의 효능은 가능한 신규 항암 치료제로서의 가능성을 시사한다. 그러나, 천연 독소는 특이성의 결핍 및 임상적 사용을 방해하는 혈관 누출 증후군의 촉진과 같은 문제를 가진다.
PEA가 항체에 융합되면, 높은 특이성과 효능을 나타내는 재조합 면역독소(RIT)가된다. 이전의 연구에서 PEA의 절단된 38 KDa 부분이 독소로 사용될 수 있다는 것이 입증된바 있다. 슈도모나스 외독소 A의 38-kDa 절단형(PE38)을 사용하는 RIT는 임상 시험에서 주목할만한 성공을 거두었지만, 불충분한 고형 종양 침투, 높은 면역원성, 및 비특이적인 독성을 포함하는 한계들을 갖는다(문헌[Kreitman RJ et al., Clin Cancer Res., 15(16):5274-9 (2009)]; 문헌[Hassan R et al., Clin Cancer Res., 13(17):5144-9 (2007)]; 문헌[Wayne AS et al., Clin Cancer Res., 16(6):1894-903 (2010)]; 문헌[Kreitman RJ et al., J Clin Oncol., 27(18):2983-90(2009)]; 문헌[Sampson JH et al., Neuro Oncol., 10(3):320-9 (2008)]; 문헌[Powell DJ Jr et al., J lmmunol., 179(7):4919-28 (2007)]; 문헌[Kreitman RJ, J Clin Oncol., 23(27):6719-29 (2005)]; 문헌[Pal LH et al., Nat Med., 2(3):350-3 (1996)]).
이에 본 발명자들은 대부분의 도메인 II (aa 253-364)가 제거되지만 퓨린 프로세싱 부위 (furin processing site) 및 도메인 Ib 일부 (aa 365-404)가 유지된 26 kDa 단편의 절단된 PEA에서 B 세포 면역원성을 감소시키기 위해 8개의 잔기를 치환(D406A, R432G, R467A, R490A, R513A, E548A, K590A, Q592A)한 PE26를 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편과 결합하여 제조된 신규한 재조합 면역독소 (recombinant immunotoxin, RIT)를 개발하였다. 본 발명의 조작된 면역독소는 비특이적 독성 및 면역원성이 낮았고 리소좀 프로테아제에 의한 분해에 저항성을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 RIT는 더욱 효과적인 암세포 활성 억제제일 뿐만 아니라, 마우스에서 약 8배 낮은 독성을 나타내고 래트에서 모세혈관 누출 증후군을 유발할 가능성을 감소시킨다.
본 발명은 암배항원 (CEA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 염기서열과 슈도모나스 외독소 A (PEA)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는데 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 슈도모나스 외독소 A가 결합된 재조합 면역독소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 슈도모나스 외독소 A를 포함하는, 암배항원을 과발현하는 암세포를 사멸시키기 위한 재조합 면역독소를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 면역독소를 포함하는, 암배항원을 과발현하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음의 염기서열이 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 제공한다:
암배항원 (CEA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 염기서열;
퓨린 (furin) 절단 부위를 코딩하는 염기서열;
링커를 코딩하는 염기서열; 및
슈도모나스 외독소 A (PEA)를 코딩하는 염기서열.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 미니바디, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), scFv, dsFv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 scFv일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 퓨린 절단 부위는 RHRQPR/GWEQL (서열번호 4)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 링커는 GGSG (서열번호 서열번호 5) 또는 GGGS (서열번호 6)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 슈도모나스 외독소 A는 B 세포 및 T 세포가 결여된 26 kDa의 절단된 형태일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 슈도모나스 외독소 A는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 슈도모나스 외독소 A가 결합된 재조합 면역독소의 생산방법을 제공한다:
전술한 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계;
형질전환된 숙주세포를 배양한 후, 단일 콜로니를 암피실린이 포함된 배지에서 종자배양하는 단계;
상기 종자 배양물을 성장시킨 후 암피실린과 테트라사이클린이 첨가된 배지에 옮겨 배양하는 단계;
IPTG를 첨가하여 과발현을 유도하는 단계; 및
2 내지 20 시간 동안 15 내지 40 ℃를 유지하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 숙주세포는 E. Coli BL21(DE3) 또는 Shuffle일 수 있다.
본 발명은 또한, 다음을 포함하는 암배항원을 과발현하는 암세포를 사멸시키기 위한 재조합 면역독소를 제공한다:
암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편; 및
슈도모나스 외독소 A.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 미니바디, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), scFv, dsFv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 슈도모나스 외독소 A는 B 세포 및 T 세포가 결여된 26 kDa의 절단된 형태일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 재조합 면역독소는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 암배항원을 과발현하는 암세포는 위암, 췌장암, 폐암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 재조합 면역독소를 포함하는 암배항원을 과발현하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암은 위암, 췌장암, 폐암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.
본 발명에 따른 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 슈도모나스 외독소 A가 결합된 재조합 면역독소의 생산방법은 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그를 사용함으로써 발현된 산물의 용해도를 높이고 이의 적절한 폴딩을 촉진한다. 또한, 숙주세포의 종류 및 발현 조건을 최적화함으로써 발현 수준과 용해도가 우수한 재조합 면역독소의 생산방법을 제공한다. 본 발명에 따른 재조합 면역독소는 CEA-발현 암세포에서 강한 활성을 나타내지만, 비-CEA-발현 세포에서는 활성을 나타내지 않으므로, CEA를 과발현하는 암을 치료하기 위한 항암제로서 유용하다.
도 1은 CEA(scFv)-PE26의 구성을 나타낸 것으로, (A)는 CEA(scFv)-PE26의 아미노산 서열이고, (B)는 게이트웨이 클로닝 시스템을 이용한 His6-MBP-CEA(scFv)-PE26의 벡터맵이다. 벡터의 원핵생물 발현은 IPTG-유도성 T7 프로모터에 의해 유도된다. 암피실린은 세포를 선별하기 위해 사용되었다.
도 2는 상이한 E. coli 균주에서 CEA(scFV)-PE26 융합 단백질의 발현 및 용해도 분석을 나타낸 것이다. 재조합 융합 단백질의 발현은 0.5 mM IPTG에 의해 유도되었다. 재조합 발현은 37℃ (A) 또는 18℃ (B)의 유도 온도에서 테스트되었다. 화살표는 His6-MBP 태그와 융합된 이동한 CEA(scFv)-PE26 산물을 나타낸다 (M: 분자량 마커; C: 음성 대조군으로 IPTG 유도 전 총 세포 단백질; I: IPTG 유도 후 총 세포 단백질; P: 세포 초음파 분해 후 펠릿 분획; S: 세포 초음파 분해 후 수용성 상층액).
도 3은 CEA-PE26의 정제에 관한 것으로, (A)는 재조합 면역독소에 대한 정제 단계의 플로우 차트를 나타낸 것이고, (B)는 첫 번째 컬럼 단계를 나타낸 것이며 (M: 분자량 마커; 레인 1: IPTG 유도 후 총 세포 단백질; 레인 2: 총 세포 단백질이 Ni 컬럼에 결합될 때 유동; 레인 3: 30 mM 이미다졸로 세척; 레인 4-9: 500 mM 이미다졸로 융합 단백질 용출; 레인 10: 1 M 이미다졸로 세척), (C)는 두 번째 컬럼 단계를 나타낸 것이다 (M: 분자량 마커; 레인 11: 레인 4-9로부터의 단백질의 풀링(pooling) 및 TEV 프로테아제 처리; 레인 12: 유동으로 CEA(scFv)-PE26이 용출됨; 레인 13: 1 M 이미다졸로 TEV-비절단 단백질 및 His6-MBP 태그 용출.
도 4는 CEA(scFv)-PE26의 SEC-HPLC 분석을 나타낸 것으로, (A)는 CEA(scFv)-PE26을 단백질-팩(pak) 300SW SEC 7.5 × 300mm 컬럼을 이용한 HPLC로 분석하여 순도를 평가한 것이고, 여기서 x축은 체류 시간 (분)을 나타내고, y축은 280 nm에서의 흡광도를 보여준다 (arbitrary units, AU). 첫 번째 피크는 5.33 분에 나타났고, CEA(scFv)-PE26에 대한 주요 피크인 두 번째 피크는 9.831 분에 나타났다. (B)는 (A)로부터의 분획을 SDS-PAGE를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것으로, 첫 번째 및 두 번째 피크 분획은 동일한 부피로 농축되고 동일한 양으로 로딩되었다. 두 번재 피크 분획에만 존재하는 51 kDa 단백질은 CEA(scFv)-PE26이다.
도 5는 트립신 분해 샘플에 의해 수행되는 LC-MS/MS에 의해 분석된 CEA(scFv)-PE26의 확인 결과를 나타낸 것으로, 단백질 확인에 대한 커버리지 (coverage) 백분율은 총 단백질 서열에서 확인된 펩티드로 표현된다. 단백질은 트립신으로 분해되었고 커버리지는 81.46%였다.
도 6은 상이한 암세포 종류에서 CEA의 발현을 나타낸 것으로, (A)는 MKN45, SNU-C4, HCT-116 및 HepG2 세포를 로딩 컨트롤로 사용된 β-액틴과 함께 CEA 항체 (CEACAM5)를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 분석한 결과이고, CEA는 MKN45 세포주에서만 검출되었다. (B)는 MKN45 세포에서 더 높은 CEA 발현을 실시간 PCR로 확인한 것이다.
도 7은 MTT 어세이 결과를 나타낸 것으로, (A)는 CEA(scFv)-PE26 처리 후, 표시된 세포의 형태학적 변화를 나타낸 것이고, (B)는 정제된 CEA(scFv)-PE26의 효과를 나타낸 것이다 (■ : HCT-116, ▲ : SNU-C4, ● : MKN-45). 0.1 μg/mL 농도의 재조합 농도에서, MKN45 세포의 생존율은 약 20 %로 감소하였고, 다른 종류의 세포에서는 효과가 없었다.
도 8은 MKN45 세포에서 CEA(scFv)-PE26에 대한 IC50 어세이 결과를 나타낸 것으로, MKN45 세포에서 CEA(scFv)-PE26의 IC50 은 1.22 ± 0.56 ng/mL (n=3)이고, Hill 계수는 0.52 ± 0.07로 계산되었다.
도 9는 암세포에 결합하는 CEA(scFv)-GFP의 유세포 분석 결과를 나타낸 것으로, 검정색 선은 비처리된 세포를 나타내고 붉은색 선은 CEA(scFv)-GFP 처리된 세포를 나타낸다. CEA(scFv)-GFP로 1 시간 배양 후, 그래프의 이동은 MKN45 세포에서만 나타났다.
상술한 바와 같이, 슈도모나스 외독소 A의 38-kDa 절단형(PE38)을 사용하는 RIT는 임상 시험에서 주목할만한 성공을 거두었지만, 불충분한 고형 종양 침투, 높은 면역원성, 및 비특이적인 독성을 포함하는 한계들을 갖는다.
이에 본 발명자들은 대부분의 도메인 II (aa 253-364)가 제거되지만 퓨린 프로세싱 부위 (furin processing site) 및 도메인 Ib 일부 (aa 365-404)가 유지된 26 kDa 단편의 절단된 PEA에서 B 세포 면역원성을 감소시키기 위해 6개의 잔기를 치환한 PE26를 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편과 결합하여 제조된 신규한 재조합 면역독소 (recombinant immunotoxin, RIT)를 개발하였다. 본 발명의 조작된 면역독소는 비특이적 독성 및 면역원성이 낮았고 리소좀 프로테아제에 의한 분해에 저항성을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 RIT는 더욱 효과적인 암세포 활성 억제제일 뿐만 아니라, 마우스에서 약 8배 낮은 독성을 나타내고 래트에서 모세혈관 누출 증후군을 유발할 가능성을 감소시킨다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명은 암배항원 (CEA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 염기서열; 퓨린 (furin) 절단 부위를 코딩하는 염기서열; 링커를 코딩하는 염기서열; 및 슈도모나스 외독소 A (PEA)를 코딩하는 염기서열;이 작동가능하게 연결된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 분자에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 모노클로날, 단일쇄 또는 사람화된 항체의 전부 또는 일부일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "항체"는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 모든 면역학적 결합 제제를 광범위하게 지칭한다. 일반적으로, IgG 및/또는 IgM이 바람직한데, 이는 이들이 생리학적 환경 하에서 가장 통상적인 항체이고, 실험실 환경에서 가장 용이하게 만들어질 수 있기 때문이다.
모노클로날 항체(mAbs)는 특정의 이점, 예를 들면, 재현성 및 대규모 생산이 가능한 것으로 인식되고 있으므로, 이들을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하며, 상기 모노클로날 항체는 사람, 쥐, 원숭이, 랫트, 햄스터, 토끼 및 닭 유래일 수 있다.
용어 "항체의 단편"은 항원 결합 영역을 지니고 있는 모든 항체-유사 분자를 지칭하는데 사용되며, 이에는 항체 단편, 예를 들면, 미니바디, 디아바이, 트리아바디, Fab, Fab', F(ab')2, 단일 도메인 항체(DABs), Fv, scFv(단일 쇄 Fv) 등이 포함된다. 각종 항체-기반 작제물 및 단편을 제조 및 사용하는 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 항체를 제조하고 특성화하기 위한 수단이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; 이는 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다].
본 발명의 일실시예에서는, 라베투주맙(Labetuzumab)으로부터 유래된 scFv를 사용하였으며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
본 발명의 핵산 분자에 있어서, 상기 퓨린 절단 부위는 퓨린에 의해 절단 가능한 임의의 폴리펩타이드 부위일 수 있다. 퓨린은 "서브스틸리신/켁신-유사 프로단백질 전환효소라 지칭되는 진화상 보존된 이염기- 및 일염기-특이적 CA2+-의존성 세린 프로테아제 계열"의 효소이다. "짝을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소" 또는 "PACE"로서 또한 공지된 퓨린은 상기 계열의 7 개의 포유동물 구성원 중 하나이며, 다수의 내생적인 인간 단백질의 프로세싱에 관여한다.
본 발명에 있어서, 퓨린 절단 부위는 RHRQPR/G를 포함하는 아미노산 서열이며, 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 퓨린 절단 부위로 RHRQPR/GWEQL (서열번호 4)을 사용하였다,
본 발명의 핵산 분자에 있어서, 상기 링커는 퓨린 절단 부위 다음에 삽입되어 슈도모나스 외독소 A와 연결된다 (도 1A). 상기 링커는 글리신 또는 세린 잔기로 이루어지며, 1 내지 9개의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, GGSG (서열번호 5) 또는 GGGS (서열번호 6)의 아미노산 서열로 이루어진 링커를 사용할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 GGSG (서열번호 5)의 아미노산 서열로 이루어진 링커를 사용하였다.
본 발명의 핵산 분자에 있어서, 상기 슈도모나스 외독소 A는 B 세포 및 T 세포가 결여된 26 kDa의 절단된 형태(PE26)일 수 있다. PE26은 대부분의 도메인 II (aa 253-364)가 제거되지만 퓨린 프로세싱 부위 (furin processing site) 및 도메인 Ib 일부 (aa 365-404)가 유지되며, B 세포 면역원성을 감소시키기 위해 6개의 잔기가 치환된다. 그 결과 조작된 면역독소는 비특이적 독성 및 면역원성이 낮았고 리소좀성 프로테아제에 의한 분해에 저항성을 나타냈다. 따라서, 이 RIT는 더욱 효과적인 암세포 활성 억제제일 뿐만 아니라, 마우스에서 약 8배 낮은 독성을 나타내고 래트에서 모세혈관 누출 증후군을 유발할 가능성을 감소시킨다. 본 발명의 일실시예에서는 슈도모나스 외독소 A로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 PE26을 사용하였다.
본 발명의 핵산 분자는 CEA-PE26 뉴클레오티드의 N-말단에 TEVrs (tobacco etch virus recognition site)인 ENLYFQ/G (서열번호 7)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
본래 및 변형된 폴리펩타이드는 벡터 내에 포함된 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. 용어 "벡터"는 이를 복제시킬 수 있는 세포 내로의 도입을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 운반체 핵산 분자를 지칭하는데 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있는데, 이는 핵산 서열이 벡터가 도입되는 세포에 대해 외래라는 것을의미하거나, 또는 상기 서열이 본래 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 특정 위치를 제외하고는 해당 세포 내의 서열과는 상동성이라는 것을 의미한다.
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 생성물의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 몇몇 경우에는, 이때 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 해독된다. 기타 경우, 이들 서열은, 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임을 생성시키는데 있어서는 해독되지 않는다. 발현 벡터는 특정한 숙주 유기체 내의 작동적으로 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능하게는 해독에 필요한 핵산 서열을 지 칭하는 각종 "제어 서열"을 함유할 수 있다. 전사와 해독을 좌우하는 제어 서열 이외에도, 벡터 및 발현 벡터는 기타 기능도 제공해주는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
본 발명에서 용어 "숙주 세포"는 상기 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지할 수 있는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어 E. coli, 또는 진핵생물 세포, 예를 들어 효모, 곤충, 양서류 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 형질전환된 숙주세포를 배양한 후, 단일 콜로니를 암피실린이 포함된 배지에서 종자배양하는 단계; 상기 종자 배양물을 성장시킨 후 암피실린과 테트라사이클린이 첨가된 배지에 옮겨 배양하는 단계; IPTG를 첨가하여 과발현을 유도하는 단계; 및 2 내지 20 시간 동안 15 내지 40 ℃를 유지하는 단계;를 포함하는, 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 슈도모나스 외독소 A가 결합된 재조합 면역독소의 생산방법에 관한 것이다.
목적하는 단백질을 재조합에 의해 조작된 세포, 예를 들어 세균, 식물, 효모, 곤충 및 포유동물 세포에서 발현시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 E. coli, 다른 세균 숙주, 효모 및 다양한 고등 진핵생물 세포, 예를 들어 COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주를 포함하여 단백질 발현에 이용될 수 있는 다수의 발현 시스템들을 인지하고 있다. 본 발명의 핵산 분자의 발현은 전형적으로 상기 핵산 분자의 DNA 또는 cDNA를 프로모터에 작동적으로 결합시킨 다음 발현 카세트에 통합시킴으로써 성취될 수 있다. 상기 카세트는 원핵생물 또는 진핵생물에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 발현 카세트는 단백질을 암호화하는 DNA의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다. 클로닝된 유전자의 높은 수준의 발현을 획득하기 위해서, 최소한 전사를 지시하는 강한 프로모터, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위, 및 전사/번역 종결자를 함유하는 발현 카세트를 제작하는 것이 바람직하다. E. coli의 경우, 상기는 프로모터, 예를 들어 T7, trp, lac, 또는 람다 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 바람직하게는 전사 종결 신호를 포함한다. 진핵생물 세포의 경우, 상기 조절 서열은 프로모터 및 바람직하게는 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 인헨서, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있으며, 연접 공여체 및 수용체 서열을 포함할 수도 있다. 본 발명의 카세트를 널리-공지된 방법, 예를 들어 에스케리키아 콜라이의 경우 염화 칼슘 형질전환 또는 일렉트로포레이션, 및 포유동물 세포의 경우 칼슘 포스페이트 처리, 일렉트로포레이션 또는 리포펙션에 의해 상기 선택된 숙주 세포 내로 이동시킬 수 있다. 상기 카세트에 의해 형질전환된 세포를 상기 카세트 중에 함유된 유전자, 예를 들어 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해 부여된 항생제 내성에 의해 선택할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "cDNA"는 주형으로서 전령 RNA(mRNA)를 사용하여 제조된 DNA를 지칭한다. 게놈성 DNA, 또는 게놈성의 프로세싱되지 않거나 부분적으로 프로세싱된 RNA 주형으로부터 중합화된 DNA와는 달리, cDNA를 사용하는 경우의 이점은 이러한 cDNA가 상응하는 단백질의 암호화 서열을 주로 함유하고 있다는 것이다. 완전 또는 부분 게놈 서열이 바람직한 경우, 예를 들면, 최적의 발현을 위해 비-암호화 영역이 요구되거나 또는 인트론과 같은 비-암호화 영역을 안티센스 전략에서 표적화시켜야 하는 경우에 있을 수 있다.
본 발명의 생산방법에 있어서, 상기 숙주세포는 E. coli인 것이 바람직하고, 예를 들어, 보다 바람직하게는 E. Coli BL21(DE3) 또는 Shuffle일 수 있고, E. Coli BL21(DE3)인 것이 가장 바람직하다.
E. coli는 RIT 생산을 위한 가장 보편적인 숙주 시스템으로, 이들 분자는 생체활성을 위한 글리코실화와 같은 번역 후 변형을 필요로 하지 않는다. 따라서, 이러한 단백질의 고수율은 비용면에서 매우 효과적이지만, E. coli에서 재조합 생산물의 효율적인 생산은 종종 봉입체로 알려진 불용성 단백질 형태를 야기할 수 있다. 봉입체 단백질은 생물학적 활성이 결여되어 있고 이의 기능을 회복하기 위해 가용화 및 리폴딩(refolding)이 요구된다. 이러한 문제 중 일부를 해결하기 위해, 본 발명자들은 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그를 사용함으로써 융합 단백질 접근법을 채택하였고, E. coli에서 융합 생산물의 발현 조건과 용해도를 최적화하였다 (표 2). MBP-CEA(scFv)-PE26 융합 단백질을 정제한 후, MBP 태그가 발현된 산물의 용해도를 높이고 이의 적절한 폴딩을 촉진한다는 것을 확인하였다.
당업자는 본 발명의 핵산 분자에 대해 그의 생물 활성의 감소 없이 변형을 수행할 수 있음을 알 것이다. 상기 표적화 분자의 클로닝, 발현 또는 융합 단백질 내로의 통합을 촉진하기 위한 일부의 변형을 수행할 수도 있다. 상기와 같은 변형은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 종결 코돈, 개시를 제공하기 위해 아미노 말단에 첨가된 메티오닌, 부위, 편의상 배치된 제한 부위를 생성시키기 위해 어느 한 말단 상에 놓인 추가의 아미노산, 또는 정제 단계를 돕기 위한 추가의 아미노산(예를 들어 폴리 His)을 포함한다.
본 발명의 생산방법에서 사용되는 배지는 E. coli를 성장시킬 수 있는 배지라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 LB 배지를 사용할 수 있다.
본 발명의 생산방법에 있어서, 상기 종자 배양물을 성장시킨 후 배지에는 암피실린과 테트라사이클린이 첨가될 수 있다.
OD600이 일정 수준, 예를 들어 0.6 내지 0.8에 도달하면, IPTG를 배양 배치에 첨가하여 과발현을 유도한다. 이후 온도 조건은 3 내지 20 시간 동안 15 내지 40 ℃를 유지할 수 있다. 바람직하게는 3 내지 6 시간 동안 35 내지 39 ℃, 또는 14 내지 22시간 동안 16 내지 20 ℃를 유지할 수 있고, 가장 바람직하게는 16 내지 20 시간 동안 16 내지 20 ℃를 유지할 수 있다.
본 발명의 생산방법으로 생산된 RIT는 추가의 정제 과정을 거쳐 수득될 수 있다. 예를 들어 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피 등을 포함한 당해 분야의 표준 과정에 따라 정제될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
추가로, 본 발명의 생산방법은 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그를 사용함으로써 MBP 태그가 발현된 산물의 용해도를 높이고 이의 적절한 폴딩을 촉진한다.
본 발명은 또한, 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편; 및
슈도모나스 외독소 A;를 포함하는, 암배항원을 과발현하는 암세포를 사멸시키기 위한 재조합 면역독소에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 면역독소에 있어서, 상기 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편 및 슈도모나스 외독소 A에 대한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 기재를 생략한다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 재조합 면역독소는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 면역독소에 있어서, 상기 암배항원을 과발현하는 암세포는 위암, 췌장암, 폐암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있고, 바람직하게는 위암일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 재조합 면역독소를 포함하는, 암배항원을 과발현하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 암은 위암, 췌장암, 폐암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 비제한적으로 암, 예를 들어 암배항원을 과발현하는 암을 포함한 상태의 치료를 위해 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 약학 조성물 또는 약제를 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 표준 기법에 의해 제형화할 수 있다. 적합한 약학 담체는 본 발명 및 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005)]에 개시된다. 본 발명의 약학 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 흡입을 통해, 국소, 코, 경구, 비경구 또는 직장에 의해 투여하기 위해서 제형화할 수 있다. 따라서, 상기 약학 조성물의 투여를 피내, 피하, 정맥 내, 근육 내, 비내, 흡입에 의해, 대뇌 내, 기관 내, 동맥 내, 복강 내, 방광 내, 흉막 내, 관상동맥 내, 피하 또는 종양 내 주사에 의해, 주사기 또는 다른 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 경피 투여가 또한, 흡입 또는 에어로졸 투여와 같이 고려된다. 정제 및 캡슐을 경구, 직장 또는 질내 투여할 수 있다.
상기 투여용 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 재조합 면역독소를 포함할 수 있다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충된 염수 등을 사용할 수 있다. 이들 용액은 살균성이며 바람직하지 못한 물질은 존재하지 않는다. 이들 조성물을 통상적인, 널리 공지된 살균 기법에 의해 살균시킬 수 있다. 상기 약학 조성물은 생리학적 조건에 근접하기 위해 요구되는 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 pH 조절 및 완충제, 독성 조절제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 나트륨 락테이트 등을 함유할 수도 있다. 이들 제형 중 재조합 면역독소의 농도는 광범위하게 다양할 수 있으며, 선택된 특정한 투여 모드 및 환자의 필요에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등을 근거로 선택될 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 정맥 내 투여 또는 체강 내 투여를 포함하여 비경구 투여에 적합하다.
본 발명의 약학 조성물은 일시 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화할 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여형, 예를 들어 앰풀 또는 수회-용량 용기 중에, 첨가된 보존제와 함께 존재할 수 있다. 주사 가능한 조성물은 바람직하게는 수성 등장성 용액 또는 현탁액이며, 좌약은 바람직하게 지방 유화액 또는 현탁액으로부터 제조한다. 상기 조성물은 살균될 수 있고, 보조제, 예를 들어 보존제, 안정제, 습윤 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 활성 성분은 사용 전에, 적합한 비히클, 예를 들어 멸균성의 발열원이 없는 물에 의해 조성되는 분말 형태로 존재할 수 있다. 또한, 상기 활성 성분은 또한 다른 치료학적으로 중요한 물질을 함유할 수도 있다. 상기 조성물들을 통상적인 각각의 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조하며, 이들은 약 0.1 내지 75%, 바람직하게는 약 1 내지 50%의 활성 성분을 함유한다.
본 발명의 약학 조성물의 조절된 방출 비경구 제형을 임플란트, 유성 주사액으로서 또는 미립자 시스템으로서 제조할 수 있다. 미립자 시스템은 미소구, 미세입자, 미세캡슐, 나노캡슐, 나노구, 및 나노입자를 포함한다. 미세캡슐은 중심 코어로서 상기 치료 단백질을 함유한다. 미소구에서, 상기 치료제는 상기 입자 전체를 통해 분산된다. 약 1 ㎛ 미만의 입자, 미소구 및 미세캡슐을 일반적으로 각각 나노입자, 나노구 및 나노캡슐이라 칭한다. 모세관은 오직 나노입자만이 정맥 내로 투여되도록 대략 5 ㎛의 직경을 갖는다. 미세입자는 전형적으로 직경이 대략 100 ㎛이며 피하 또는 근육 내로 투여된다.
본 발명의 약학 조성물의 이온-조절된 방출을 위해 중합체를 사용할 수 있다. 조절된 약물 전달에 사용하기 위한 다양한 분해성 및 비분해성 중합체성 기질이 당해 분야에 공지되어 있다(문헌[Langer R., Accounts Chem. Res., 26:537-542 (1993)]). 예를 들어, 블록 공중합체, 폴락사머 407은 저온에서 점성이지만 여전히 이동성인 액체로서 존재하나 체온에서는 반고형 젤을 형성한다. 상기 공중합체는 재조합 인터류킨-2 및 유레아제의 제형화 및 지속된 전달에 유효한 비히클인 것으로 나타났다. 한편, 하이드록시아파타이트가 단백질의 조절된 방출을 위한 미세담체로서 사용될 수 있다. 다르게는, 리포솜이 지질-캡슐화된 약물의 약물 표적화뿐만 아니라 조절된 방출을 위해 사용될 수 있다.
경피 적용에 적합한 제형은 유효량의 본 발명의 약학 조성물을 담체와 함께 포함한다. 바람직한 담체는 숙주의 피부를 통한 통과를 지원하는 흡수 가능한 약물학적으로 허용 가능한 용매를 포함한다. 예를 들어 경피 장치는 배면 부재를 포함하는 붕대, 임의로 담체와 함께 상기 조성물을 함유하는 저장용기, 임의로 연장된 기간에 걸쳐 조절된 속도 및 소정의 속도로 숙주의 피부에 상기 조성물을 전달하기 위한 속도 조절 차단층, 및 상기 장치를 상기 피부에 고정시키기 위한 수단의 형태로 존재한다. 기질 경피 제형이 또한 사용될 수 있다.
국소 적용에, 예를 들어 피부 및 눈에 대한 국소 적용에 적합한 제형은 바람직하게는 당해 분야에 널리 공지된 수용액, 연고, 크림 또는 젤이다. 상기와 같은 제형은 용해제, 안정제, 탄력성 향상제, 완충제 및 보존제를 함유할 수 있다.
경구 투여의 경우, 약학 조성물 또는 약제는 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께, 예를 들어 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 활성 성분, 즉 본 발명의 조성물을 (a) 희석제 또는 충전제, 예를 들어 락토오스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스(예를 들어 에틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스), 글리신, 펙틴, 폴리아크릴레이트 및/또는 칼슘 수소 포스페이트, 칼슘 설페이트, (b) 윤활제, 예를 들어 실리카, 탤컴, 스테아르산, 그의 마그네슘 또는 칼슘 염, 금속성 스테아레이트, 콜로이드성 이산화 규소, 수소화된 식물성 오일, 옥수수 전분, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 및/또는 폴리에틸렌글리콜과 함께; 정제의 경우 또한 (c) 결합제, 예를 들어 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 및/또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스; 경우에 따라 (d) 붕해제, 예를 들어 전분(예를 들어 감자 전분 또는 나트륨 전분), 글리콜레이트, 아가, 알긴산 또는 그의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물; (e) 습윤제, 예를 들어 나트륨 라우릴 설페이트, 및/또는 (f) 흡수제, 착색제, 풍미제 및 감미제와 함께 포함하는 정제 및 젤라틴 캡슐이 바람직하다.
정제는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 필름 코팅되거나 또는 장용 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 예를 들어 용액, 시럽, 또는 현탁액의 형태를 취하거나, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클에 의해 조성되는 건조한 생성물로서 존재할 수 있다. 상기와 같은 액체 제제는 약학적으로 허용 가능함 첨가제, 예를 들 어 현탁제, 예를 들어 솔비톨 시럽, 셀룰로스 유도체, 또는 수소화된 식용 지방; 유화제, 예를 들어 레시틴 또는 아카시아; 비-수성 비히클, 예를 들어 아몬드 오일, 유성 에스터, 에틸 알콜, 또는 분류된 식물성 오일; 및 보존제, 예를 들어 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산과 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 상기 제제는 또한 적합한 경우, 완충염, 풍미제, 착색제 및/또는 감미제를 함유할 수 있다. 경우에 따라, 경구 투여용 제제를 상기 활성 조성물의 조절된 방출을 제공하도록 적합하게 제형화할 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 약학 조성물을 편의상, 적합한 추진제, 예를 들어 다이클로로다이플루오로메탄, 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로에탄, 1,1,1,2-테트라플루오르에탄, 이산화탄소, 또는 다른 적합한 가스를 사용하여, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 모양의 형태로 전달할 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 상기 투여 단위를, 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 정할 수 있다. 상기 약학 조성물은 적합한 분말 베이스, 예를 들어 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 예를 들어 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지로 제형화할 수 있다.
상기 조성물을 또한, 예를 들어 통상적인 좌약 베이스, 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 함유하는 직장 조성물, 예를 들어 좌약 또는 정체 관장약으로 제형화할 수 있다.
다르게는, 상기 조성물을 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 상기와 같은 장시간-작용 제형을 이식(예를 들어 피하 또는 근육 내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 조성물을 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어 허용 가능한 오일 중의 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 약간 용해성인 유도체로서, 예를 들어 약간 용해성인 염으로서 제형화할 수 있다.
상기 조성물은, 경우에 따라, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 함유할 수 있는 팩 또는 분배장치 중에 존재할 수 있다. 상기 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들어 발포팩을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투여 설명서를 동반할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 암과 같은 질병 또는 악성 질환을 예방, 치료 또는 억제하기 위한 치료학적 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물은 환자에게서 유효한 치료 또는 진단 반응을 이끌어내기에 충분한 양으로 투여한다. 유효한 치료 또는 진단 반응은 상기 병 또는 악성 상태의 증상 또는 합병증을 적어도 부분적으로 저지하거나 늦추는 반응이다. 이를 수행하기에 적합한 양을 "치료 유효 용량"으로서 정의한다.
상기 약학 조성물의 투여량은 온혈 동물(포유동물)의 종, 체중, 연령, 개별적인 조건, 치료하려는 영역의 표면적 및 투여 형태에 따라 다르다. 상기 용량의 크기는 또한 특정 환자에게서 특정 화합물의 투여에 동반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다. 약 50 내지 70 ㎏의 포유동물에게 투여하기 위한 단위 투여량은 약 5 내지 500 ㎎의 활성 성분을 함유할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 목적하는 효과를 성취하기에 충분한 투여량이다.
최적의 투여 스케줄을 상기 약학 조성물의 측정, 환자의 신체 중의 누적으로부터 계산할 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 ㎏당 1 ng 내지 1,000 ㎎이며 하루에, 일주일에, 한달에 또는 1년에 1 회 이상 제공될 수 있다. 당업자들은 최적 투여량, 투여 방법 및 반복 비율을 쉽게 결정할 수 있다. 당업자는 당해 기술분야에 공지되고 본 발명에 개시된 확립된 프로토콜에 따라 약학 조성물의 투여를 위한 최적 투여를 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 최적 투여량, 독성 및 치료 효능은 개별적인 조성물의 상대적인 효능에 따라 변할 수 있으며 예를 들어 LD50(집단의 50%에 치사적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)을 측정함으로써 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 과정에 의해 측정될 수 있다. 독성과 치료 효과간의 용량비는 치료 지수이며, 이를 비, LD50/ED50로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 조성물을 사용할 수 있지만, 상기와 같은 조성물을 병든 조직의 부위에 표적화하여 정상 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하고 이에 의해 부작용을 감소시키는 전달 시스템을 설계하도록 주의해야 한다.
예를 들어 동물 연구(예를 들어 설치류 및 원숭이)로부터 획득된 데이터를 사용하여 인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화할 수 있다. 본 발명 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없이 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 상기 투여량은 상기 범위 내에서 사용되는 투여형 및 투여 경로에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 임의의 조성물의 경우, 상기 치료 유효 용량을 초기에 세포 배양 분석으로부터 추정할 수 있다. 1 회 용량을 세포 배양물에서 측정 시 IC50(증상의 최대-절반 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환하는 혈장 농도 범위를 성취하기 위해서 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 상기와 같은 정보를 사용하여 인간에 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 중 수준을 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정할 수 있다. 일반적으로, 재조합 독소를 포함하는 약학 조성물의 용량 당량은 전형적인 환자의 경우 약 1 ng/㎏ 내지 100 ㎎/㎏이다.
정맥 내 투여를 위한 본 발명의 약학 조성물은 하루에 환자당 약 0.1 내지 10 ㎎일 수 있다. 하루에 환자당 0.1 내지 약 100 ㎎의 투여량을 사용할 수도 있다. 투여 가능한 조성물의 제조를 위한 실제적인 방법은 당업자들에게 공지되거나 자명하며 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins (2005)]에 보다 상세히 개시된다.
본 발명의 약학 조성물의 예시적인 용량은 환자의 kg당 또는 샘플 중량당 조성물의 mg 또는 μg 양(예를 들어 약 1 μg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 100 μg/kg 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 1 μg/kg 내지 약 50 μg/kg)을 포함한다. 또한, 약학 조성물의 적합한 용량은 성취하고자 하는 목적하는 효과에 관하여 상기 조성물의 효능에 따라 변하는 것으로 간주된다. 이들 조성물 중 하나 이상을 포유동물에게 투여해야 하는 경우, 의사, 수의학자 또는 연구자들은 예를 들어 처음에는 비교적 낮은 용량을 처방하고 후속으로 적합한 반응이 획득될 때까지 상기 용량을 증가시킬 수 있다. 또한, 임의의 특정 포유동물 환자에 대한 특정한 용량 수준은 사용되는 특정 조성물의 활성, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 및 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 임의의 약물 조합, 및 조절하고자 하는 발현 또는 활성의 정도를 포함한 다양한 인자들에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 1일 용량을 하루에 한 번 또는 하위 용량으로 분할하여 투여하고 수회 용량, 예를 들어 하루에 2 회, 3 회 또는 4 회 투여할 수 있다. 그러나, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물은 상이한 양 및 상이한 시간으로 투여할 수 있다. 당업자는 또한 비제한적으로 질병 또는 악성 상태의 중증도, 선행 치료, 환자의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함한 몇몇 인자가 환자를 유효하게 치료하기 위해 요구되는 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수도 있음을 알 것이다. 더욱이, 치료학적 유효량의 약학 조성물에 의한 환자의 치료는 단일 치료를 포함하거나 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
성공적인 치료에 이어서, 치료된 질병 또는 악성 상태의 재발을 방지하기 위해서 상기 환자가 유지 요법을 받게하는 것이 바람직할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 치료학적 치료를 위해서 투여할 수 있다. 치료학적 적용 시, 조성물을 질병 또는 악성 상태, 예를 들어 암을 앓고 있는 환자에게 상기 질병 및 그의 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 저지시키기에 충분한 양으로 투여한다. 이를 수행하기에 적합한 양을 "치료학적 유효량"으로서 정의한다. 상기 용도에 유효한 양은 상기 질병의 중증도 및 상기 환자의 건강의 일반적인 상태에 따라 변할 것이다. 상기 약학 조성물의 유효량은 의사 또는 다른 자격을 갖춘 관찰자에 의해 언급되는 바와 같이 증상(들)의 주관적인 경감 또는 객관적으로 확인 가능한 개선을 제공하는 것이다.
일반적으로, 본 발명의 재조합 면역독소를 포함하는 약학 조성물의 유효량은 먼저 낮은 용량 또는 소량의 조성물을 투여하고, 이어서 상기 투여되는 용량 또는 투여량을 증분에 의해 증가시키고, 필요한 경우 최소의 부작용으로 또는 독성 부작용 없이 치료하고자 하는 환자에게서 목적하는 효과가 관찰될 때까지 제 2 또는 제 3 약물을 가함으로써 측정된다.
상기 약학 조성물의 단일 또는 수회 투여를 환자에 의해 요구되고 허용되는 바와 같은 투여량 및 빈도에 따라 투여한다. 어떤 경우에든, 상기 조성물은 상기 환자를 유효하게 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 단백질을 제공해야 한다.
바람직하게는, 상기 투여량을 1 회 투여하나, 치료학적 결과가 성취될 때까지 또는 부작용이 상기 요법의 중단을 정당화할 때까지 주기적으로 적용할 수도 있다. 일반적으로, 상기 용량은 환자에게 허용가능하지 않은 독성을 생성시키지 않으면서 질병의 증상 또는 징후를 치료 또는 개선시키기에 충분하다. 목적하는 치료 효과를 성취하기 위해서, 조성물을 상기 치료학적으로 유효한 1 일 용량으로 수일간 투여할 수 있다. 따라서, 환자에게서 본 발명에 개시된 질병 또는 악성 질환을 치료하기 위한 조성물의 치료학적으로 유효한 투여는 3 일 내지 2 주 이상 범위의 기간 동안 계속되는 주기적인(예를 들어 매일) 투여를 필요로 할 수도 있다. 전형적으로, 조성물을 3 일 이상의 연속일 동안, 종종 5 일 이상의 연속일 동안 , 보다 종종 10 일 이상 및 때때로 20, 30, 40 일 이상의 연속일 동안 투여할 것이다. 연속적인 1 일 용량이 치료 유효 용량을 성취하기에 바람직한 경로이지만, 상기 투여가 상기 환자에게서 상기 조성물의 치료 유효 농도를 유지시키기에 충분히 빈번히 반복되는 한, 상기 화합물 또는 조성물을 매일 투여하지 않은 경우에조차 치료학적으로 유리한 효과가 성취될 수 있다. 예를 들어, 조성물을 2 일 마다, 3 일 마다 투여하거나, 또는 더 높은 용량 범위가 사용되고 환자에 의해 허용되는 경우, 1 주일에 1 회 투여할 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.
[준비예]
물질
DTT (Dithiothreitol)와 IPTG (1-thio-β-d-galactopyranoside)는 Anaspec (Fremont, CA)에서 구입하였고, 쿠마씨 블릴리언트 블루 R-250과 Tris-HCl은 Amresco (Solon, OH)로부터 공급받았다. 이미다졸은 대정화금㈜ (시흥, 대한민국)에서 입수하였고 암피실린은 Duchefa Biochemie (Haarlem, Netherlands)에서 구입하였다. NaCl과 글리세롤은 삼전화학 (평택, 대한민국)에서 입수하였고, HisTrapTMFF은 GE 헬스케어 (Piscataway, NJ)로부터 구입하였다. E.coli BL21 (DE3), SHuffle 및 Origami 2 세포는 Novagen (Madison, WI)으로부터 입수하였다. 게이트 클로닝을 위해, 인테그라아제, 람다 인테그라아제 및 제거효소 (excisionase)는 ㈜엘피스바이오텍 (대전, 대한민국)으로부터 입수하였고, 투석막은 Viskase (Darien, IL)로부터 구입하였다. Amicon Ultra는 Merck Millipore (Darmstadt, Germany)로부터 공급받았고, Triton X-114와 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. SNU-C4, MKN-45, HepG2 및 HCT-116 세포주는 한국세포주은행 (서울, 대한민국)으로부터 입수하였다. RPMI-1640, FBS(fetal bovine serum) 및 다른 조직배양 시약들은 Gibco/Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)로부터 구입하였다. ECL (enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블로팅 검출 시약은 Amersham (Buckinghamshire, UK)으로부터 구입하였고, CEACAM5 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)로부터 입수하였다.
CEA ( scFv )-PE26의 발현 및 정제
1-1. 발현 플라스미드의 구성
CEA(scFV)-PE26 발현 벡터는 BP 및 LR 재조합 반응 기반 게이트웨이 클로닝 시스템을 이용하여 제조하였다. BP 반응은 attB와 attP 부위 사이의 재조합 반응이다. 관심 유전자를 attB 태그된 프라이머 쌍으로 증폭시켰다. 공여 벡터는 attP 부위를 포함한다. attB 부위를 포함하는 PCR 산물은 attP 부위를 포함하는 공여 벡터와 결합하여 진입 클론 (entry clone)을 형성하게 된다. 이 통합 반응은 반응의 기초를 형성한다. 그 결과 형성된 진입 클론은 attL 부위 측면에 관심있는 유전자를 포함한다. LR 반은응 attL과 attR 부위 사이의 재조합 반응이다. 이 반응은 발현 클론을 생성한다. BP 반응으로부터 생성된 진입 클론은 attL 부위를 포함한다. 목표 벡터 (destination vector)는 attR 부위를 포함하도록 설계된다. LR 반응은 관심있는 서열을 동시 반응에서 하나 이상의 목표 벡터로 이동시켜 기술을 대량신속처리할 수 있도록 만든다. 진입 클론은 적절한 게이트웨이 벡터 및 게이트웨이 클로나아제 (clonase) 효소와 함께 혼합된다. 이들 사이의 재조합은 2 개의 분자를 생성한다. 하나의 분자는 관심있는 DNA 분절을 포함하고, 다른 하나의 분자는 부산물이다.
요약하면, CEA(scFv)-PE26의 480 개의 아미노산을 코딩하는 코돈의 최적화된 서열이 합성되었다 (GenScript, Piscataway, NJ). 이 서열의 CEA(scFv) 부위는 퓨린 프로세싱 부위인 RHRQPR/G에 연결시켰다. 퓨린 절단 부위 다음, GGSG 링커를 PE26 서열에 연결시켰다 (도 1A). TEVrs (tobacco etch virus recognition site)인 ENLYFQ/G를 CEA-PE26 뉴클레오티드의 N-말단에 위치시켰다. 전체 DNA 서열을 BP 반응을 통해 pDONOR207 벡터에 서브클로닝하여 진입 클론 pENTR-CEA-PE26을 수득하였다. BP 반응 후, 발현 벡터는 pENTR-CEA-PE26과 목표 벡터 pDEST-HMGWA 사이의 LR 반응에 의해 생성되었다. 최종 벡터의 정확도 (fidelity)는 시퀀싱 (마크로젠, 대전, 대한민국)으로 확인되었다. PE26과 CEA(scFv)-GFP 벡터는 또한 게이트웨이 클로닝에 의해 생성되었고, 이후 세포 독성 어세이 및 FACscan 분석에서 음성 대조군으로 사용되었다.
1-2. 융합 단백질의 발현
발현 플라스미드는 상이한 E. coli 세포 유형, 즉 BL21 (DE3), SHuffle 및 Origami 2로 형질전환시켰다. 각 배양물은 LB 브로스에서 37 ℃, 200 rpm으로 24 시간 동안 배양하였다. 하루 후, 단일 콜로니를 집어 50 ㎍/mL 암피실린이 포함된 LB 배지 4 mL에 종자 배양하였다. 이 소량의 배양물을 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장시킨 다음 암피실린과 테트라사이클린이 1:100의 비율로 첨가된 LB 배지 2L로 옮겼다. 이 배양물을 37 ℃에서 200 rpm으로 진탕배양하였다. 재조합 생성물의 과발현을 유도하기 위해, OD600이 0.62에 도달하면 0.5 mM IPTG를 배양 배치에 첨가하였다. 이후 온도 조건은 4 시간 동안 37 ℃, 18 시간 동안 18 ℃를 유지하였다. 박테리아 세포를 수확한 다음, 10 % 트리신 겔을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다.
1-3. E. coli 로부터 CEA -PE26 정제
E. coli를 4 ℃에서 20 분 동안 3000 rpm으로 원심분리하여 2 L 배양물로부터 수확하였다. 상층액을 제거한 후 펠릿을 -80 ℃에서 보관하였다. 세포 용해를 위해, 수집된 펠릿을 얼음에서 녹이고 150 mL의 고정된 금속이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 결합 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤 [v/v], pH 8.0)에 재현탁시킨 다음 용해물 (lysate)이 완전히 균질화될 때 까지 초음파 세포 분쇄기 JY99-IIDN (Ningbo Scientz Biotechnology, Guangdong, China)을 사용하여 분해하였다. 그런 다음 현탁액을 4 ℃에서 10 분 동안 15000 rpm으로 원심분리하고 정제를 위해 20 mL HisTrap FF 컬럼 (GE healthcare, Piscataway, NJ)을 이용하여 상층액을 수집하였다. 5 컬럼 부피 (CV)의 IMAC 결합 버퍼로 평형화시킨 후, 컬럼에 원료 그대로의 샘플(crude sample)을 공급하였다. 비특이적인 단백질을 30 mM 이미다졸을 포함하는 5 CV의 IMAC 세척 버퍼로 제거하였다. 5 CV의 IMAC 용출 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤 [v/v], 500 mM 이미다졸, pH 8.0)를 포함하는 컬럼으로부터 MBP-CEA(scFv)-PE26 융합 단백질을 완전히 융출하였다. NaCl과 이미다졸이 TEV 프로테아제에 미치는 부정적인 영향을 차단하기 위해, 용출 버퍼를 NaCl이 없는 IMAC 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 5% 글리세롤 [v/v], pH 8.0)로 투석막 (Viskase, Darien, IL)을 이용하여 변경하였다. 용출된 융합 단백질을 실온에서 18 시간 동안 1:5 (w/w)의 비율의 TEV 프로테아제로 분해시켰다. 2 번째 IMAC 정제의 경우, 분해된 용액을 300 mM NaCl에 첨가하고 5 CV의 IMAC 결합 버퍼로 미리 평형화된 5 mL HisTrap FF 컬럼에 로딩하였다. 예상대로, 표적 CEA(scFv)-PE26 단백질 생산물은 Ni 수지에 결합하지 않았고 유동액을 통해 수집되었다. 이 조제 물질은 Amicon Ultra-0.5 원심 여과기 (Millipore ,Massachusetts)를 사용하여 연속적으로 농축되었다. 최종적으로 정제된 CEA(scFv)-PE26는 PBS 버퍼에 대해 4 ℃에서 투석하고, 내독소 제거 후 사용 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
1-4. E. coli 로부터 PE26 및 CEA ( scFv )- GFP 정제
세포독성 어세이에 사용하기 위해 음성 대조군 재조합 생산물로, CEA(scFv)가 없는 PE26을 제조하고 정제하였다. 박테리아 세포를 1 L 배양물로부터 수확하고 필수적으로 CEA(scFv)-PE26에 대해 기재한 바와 같이 정제하였다. CEA(scFv)-GFP 또한 세포독성 어세이 및 FACscan 분석에 사용하기 위해 제조되었다. 간단하게, MBP-CEA(scFv)-GFP는 1 L E. coli 배양물로부터 제조되었다. 4 ℃에서 20 분 동안 3000 rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠릿을 -80 ℃에서 보관하였다. 그 다음, 펠릿화된 세포를 100 mL IMAC 결합 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 5% 글리세롤 [v/v], pH 8.0)에 재현탁시키고 앞서 기재한 바와 같이 초음파를 처리하여 분해하였다. 결과적으로 형성된 현탁액을 4 ℃에서 10 분 동안 15000 rpm으로 원심분리하고, 정제를 위해 5 mL HisTrap FF 컬럼 상에 수집하였다. 5 CV의 IMAC 결합 버퍼로 평형화시킨 후, 컬럼에 원료 그대로의 샘플(crude sample)을 공급하고, 비특이적인 단백질을 100 mM 이미다졸을 포함하는 추가 5 CV의 IMAC 세척 버퍼로 제거하였다. MBP-CEA(scFv)-PE26 융합 단백질을 5 CV의 IMAC 용출 버퍼 (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 5% 글리세롤 [v/v], 500 mM 이미다졸, pH 8.0)로 완전히 용출시켰다. 용출된 단백질을 수집하고 1:5 비율의 TEV 프로테아제로 분해한 뒤 18 시간 동안 실온에서 배양하였다. 조제 물질을 10 kDa 컷오프 멤브레인을 이용하여 20 mM Tris, 250 mM NaCl, 5% 글리세롤 (v/v), pH 8.0에 대해 투석하였다. 투석된 샘플을 다시 5 mL Ni 컬럼 상에 다시 로딩하였다. 50 mM 이미다졸 (10 CV)을 포함하는 세척 버퍼를 컬럼에 통과시키고 생성물을 100 mM 이미다졸을 포함하는 동일한 세척 버퍼로 용출시켰다. 그 다음, 표적 단백질 조제물을 MBP Trap HP 컬럼 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)에 적용하였다. 5 CV의 IMAC 결합 버퍼 (20 mM Tris, 250 mM NaCl, 5% 글리세롤 [v/v], pH 8.0)로 평형화시킨 후, 단백질을 컬럼 상에 로딩하고 표적 단백질을 유동액에서 용출하였다. 정제된 CEA(scFv)-GFP를 약 1 mg/ml로 농축하고 5 % 글리세롤이 첨가된 PBS 버퍼에 대해 투석하였다. 내독소를 Triton X-114로 제거한 후, 단백질을 -20 ℃에서 보관하였다.
CEA ( scFv )-PE26의 전기영동, 단백질 발현의 정량화 및 용해도
2-1. CEA ( scFv )-PE26 발현 및 용해도
단백질을 10% 트리신 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하기 전에, 5 × 샘플 버퍼 (312.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 50% 글리세롤, 5% SDS, 0.05% 브로모페놀 블루, 100 mM DTT)와 혼합하였다. 단백질 밴드를 쿠마씨 브릴리언트 블루 R-250으로 염색하였다. 단백질의 발현 수준, 용해도 및 순도를 ImageJ 이미지 분석기 (http://imagej.nih.gov.ij)로 평가하고 앞서 기재한 바와 같이 정량화하였다.
재조합 CEA(scFv)-PE26 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터를 게이트웨이 클로닝 시스템 (도 1B)을 이용하여 구성하였다. 단백질 생산물은 이의 N-말단에 His6-MBP 태그, 태그와 표적 유전자 사이에 TEV 절단 부위를 포함한다. 표적 유전자의 발현은 E. coli BL21 (DE3)에서 0.5 mM 농도의 IPTG 첨가로 유도되는 T7 프로모터에 의해 조절되었고, 모든 융합 단백질에 대해 약 38-40%였다 (도 2). BL21(DE3), SHuffle and Origami 2)의 3 종의 상이한 박테리아 균주 중, BL21(DE3)은 18 ℃에서 재조합 산물의 가장 높은 발현 및 가장 좋은 용해도를 나타냈다 (표 1). 이러한 결과는 낮은 온도가 E. coli의 세포질에서 재조합 단백질의 용해도를 개선시킨다는 것을 보여준다.
상이한 온도에서 상이한 E. coli 균주의 CEA(scFv)-PE26 발현 및 용해도
균주 발현 수준 ( % ) 용해도 ( % )
37 o C 18 o C 37 o C 18 o C
BL21(DE3) 38.3 39.9 39.5 47.5
SHuffle 33.5 36.9 27.9 42.3
Origami 2 17.9 18.7 40.5 44.1
2-2. HPLC에 의한 CEA ( scFv )-PE26 순도 측정
CEA(scFv)-PE26는 2개의 IMAC 단계로 정제되었다 (도 3A). His6-MBP 태그를 포함하는 CEA(scFv)-PE26 생산물은 Ni 컬럼에 결합할 수 있고 이어서 500 mM 이미다졸을 사용하여 용출될 수 있다 (도 3B). TEA 프로테아제는 25 ℃에서 18 시간 동안 90% 이상의 효율로 태그를 절단하는데 사용될 수 있다. 결과적으로 형성된 태그가 없는 CEA(scFv)-PE26을 절단된 태그 및 일부 불순물을 제거하기 위해 다시 Ni 컬럼으로 2차 IMAC를 이용하여 정제하였다 (도 3C). 태그는 NiSO4 수지에 의해 트랩되기 때문에 태그되지 않은 CEA(scFv)-PE26은 유동에서 용출되었다.
재조합 단백질의 순도를 측정하기 위해 재조합 단백질을 크기 배제 크로마토그래피-고성능 액체 크로마토그래피 (SEC-HPLC)를 이용하여 평가하였다. 결합 용액은 최종 생산물이 PBS 버퍼에서 보관되었기 때문에 PBS를 사용하여 준비하였다. 평형화를 위해, pH 7.4에서 10 CV 이상의 PBS 버퍼를 단백질-팩(pak) 300SW SEC 7.5 Х 300 mm 컬럼에 적용하였다. 그 다음 단백질 자체를 25분 동안 1 mL/분의 유속으로 컬럽에 적용하였다. 용출 피크는 280 nm에서 측정되었다. 이 실험은 실온에서 수행되었다.
3.6%의 정제 수율로, 2 L 배양물로부터 12.6 mg의 CEA(scFv)-PE26을 수득하였다 (표 2).
CEA(scFv)-PE26의 원핵생물 정제
정제 단계 CEA ( scFv )- PE26 ( 2 L 배양물로부터)
총 단백질 (mg) 순도
(%)		 CEA(scFv)-PE26
(mg)		 수율
(%)
세포 중량 5000 (펠릿) - - -
상층액 1080 58.6 339.7 100
1st 크로마토그래피 45 81.6 19.7 5.8
최종 산물 12.6 97.03 12.2 3.6
*수율은 BL21(DE3) E. coli 균주의 2L 배양물로부터 수득되었다.
CEA(scFv)-PE26의 순도는 HPLC로 평가하였을 때 약 97%였다 (도 4). GPC 컬럼 단계가 없더라도 최종 산물의 순도는 거의 97%였다.
내독소 제거 및 내독소 어세이
정제된 단백질을 4 ℃에서 30 분 동안, 그리고 실온에서 10 분 동안 Triton X-114 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 단백질 부피의 1%로 처리하였다. 그 다음, 샘플을 Triton 세정제를 제거하기 위해 10 분 동안 13000 rpm으로 원심분리하고 Toxin Sensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, NJ)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 내독소 수준을 측정하였다. 간단하게, 정제된 CEA(scFv)-PE26을 내독소가 없는 LAL 물을 사용하여 1 ㎍/mL의 농도로 희석하고, 이 중 100 μL의 앨리쿼트 (aliquot)를 내독소가 없는 바이알에 내독소 기준에 따라 1, 0.1, 0.05, 0.025 및 0.01 EU/mL으로 첨가하였다. 재구성된 LAL 시약은 부드럽게 혼합하면서 각 바이알 (100 μL)에 첨가하고, 6 분 동안 히팅 블록에서 37 ℃로 배양하였다. 색-안정화제 #1의 500 μL 앨리쿼트를 정지 용액으로 첨가하고 완전히 혼합하였다. 이어서 색-안정화제 #2 및 #3 500 μL를 순차적으로 첨가하고 혼합하였다. 각각의 최종 혼합물의 150 μL 앨리쿼트를 96 웰 플레이트로 옮기고 545 nm 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다. 샘플에 존재하는 내독소의 단위를 표준 용액으로부터 수득된 표준 곡선을 이용하여 계산하였다.
정제된 CEA(scFv)-PE26 조제 물질에서 내독소 수준은 0.251 EU/μg이었고, 이는 상업적 조제 물질을 위한 허용가능한 범위 내(<1 EU/μg)이다.
LC-MS/MS 분석을 통한 CEA(scFv)-PE26의 확인
CEA(scFv)-PE26의 정제를 확인하기 위해, LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 간단하게, CEA(scFv)-PE26 샘플을 SDS-PAGE에 넣고 재조합 생성물을 겔로부터 절제하였다. CEA(scFv)-PE26 겔 조각을 50% 아세토니트릴에 용해한 100 mM 중탄산암모늄 (ABC)을 사용하여 탈색시켰다. 이어서, 겔 단편을 100 mM의 ABC에서 세척하고 100% ACN을 첨가하여 실온에서 겔을 탈수시켰다. 건조된 겔을 50 mM ABC에 용해된 50 mM DTT에서 1 시간 동안 50 ℃로 배양하고, 50 mM ABC에서 다시 세척한 다음 50 mM ABC에 용해된 55 mM 아이오도아세트아미드 (IAA)에 첨가하여 빛이 없는 조건에서 실온으로 1 시간 동안 다시 배양하였다. 배양 후, 겔 단편을 100% ACN에서 추가로 세척하고 얼음에서 1 시간 동안 2 mM CaCl2로 20 μL 부피에서 0.1 μg/μL의 트립신으로 분해하였다. 이 반응 후, 50 mM ABC를 첨가하고 단편을 37 ℃에서 16 시간 동안 두었다. 상층액과 겔 단편을 부드러운 볼텍싱을 통해 다시 0.1 % 트리플루오로 아세트산 (TFA)이 첨가된 40 % ACN으로 세척하고 새로운 상층액을 이전의 것과 결합시켰다. 그 다음, 이 상층액을 고속 진공에서 건조시켰다. LC-MS/MS는 Q Exactive plus biopharm 분광기 (Thermo)에 연결된 Ultimate 3000 액체 크로마토그래피 시스템 (Thermo, Waltham. MA)을 이용하여 수행되었다.
CEA(scFv)-PE26 단백질을 확인하기 위해, 트립신 분해 샘플을 사용하여 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. CEA(scFv)-PE26은 이러한 접근법을 이용하여 81.46 % 서열 커버리지로 확인되었다 (도 5).
상이한 세포주에서의 CEA 발현 수준 확인
5-1. 웨스턴 블랏 분석
MKN45, SNU-C4, HepG2 및 HCT-116 세포주에서 CEA 발현 수준을 조사하기 위해, 각 경우의 세포를 pro-prep을 이용하여 용해시켰다. 구체적으로, 웨스턴 블랏팅을 위해, 세포주 또는 종양세포를 프로테아제 억제제 칵테일 (BP-477; Boston BioProducts, Worcester, MA)을 포함하는 proprep (인트론 바이오, 성남, 대한민국)을 사용하여 4 ℃에서 30 분 동안 용해하고, 13000 rpm에서 원심분리로 제거하였다. 단백질 앨리쿼트 50 ㎍을 각 웰에 로딩하고, 10 % SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동으로 분리한 후, PVDF (polyvinylidene difluoride) 멤브레인으로 이동시켰다. 멤브레인의 차단은 스킴 밀크 (Bioworld, Philadelphia, PA)를 사용하여 30 분 동안 수행하였고, 블랏은 CEA (A0116; DAKO, Glostrup, Denmark) 및 β-액틴 (A5441; Sigma, St. Louis, MO)에 대한 항체와 함께 배양하였다. 블랏은 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (34080; Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 전개되었다.
CEA에 대한 CEACAM5 항체를 사용하였고, 이는 180-200 kDa 크기를 갖는다. 이 밴드는 MKN45 세포에서만 관찰되었다 (도 6A).
5-2. RNA 준비 및 실시간 정량 PCR
MKN45, SNU-C4 및 HepG2 세포에 Trizol (Gibco BRL)을 처리하여 RNA를 추출하였다. 이어서 RNA 샘플을 iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 역전사시켰다. 결과적으로 형성된 cDNA를 CEA 패밀리 유전자인 CEACAM5에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories)와 함께 iCycler iQ 시스템을 이용하여 수행하였고, 전사 수준을 비교 Ct 방법을 이용하여 정량화하고 S18 하우스킵핑 유전자로 정규화시켰다. 다음의 프라이머 서열을 사용하였다.
유전자 염기서열 서열번호
CEACAM5 정방향 5′-AAGAAATGACGCAAGAGCCTATGAC-3′ 9
역방향 5′-CCCGAAAGGTAAGACGAGTCTGAC-3′ 10
S18 정방향 5'-TTTGCGAGTACTCAACACCAACA-3' 11
역방향 5'-CCTCTTGGTGAGGTCAATGTCTG-3' 12
Step-One 실시간 PCR 시스템 증폭 조건을 다음과 같이 사용하였다 (Applied Biosystems, Foster City, CA): 95 ℃, 10분; 95 ℃, 15초, 40 사이클; 60 ℃, 1분. 용융 곡선 분석은 PCR 산물 형광의 특이성을 평가하기 위해 수행하였다. 각 전사량은 계측기에 대한 프로토콜에 설명된 바와 같이 계산하였다.
S18 리보솜 단백질로 정규화된 Ct 값을 이용한 실시간 PCR로 이 결과를 확인하였다. 그 결과 도 6B에 나타난 바와 같이, MKN45 세포주에서 현저하게 높은 수준의 CEA 발현이 확인되었다 .
세포독성 어세이
4 개의 세포주를 사용하여 CEA 발현 및 비발현 세포에 대한 CEA(scFv)-PE26의 효과를 테스트하였다.
구체적으로, MKN 45, SNU-C4 및 HCT116 세포를 5 % CO2/95% 공기 대기를 갖는 5% 가습 배양기의 37 ℃, 10% 소태아 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 및 100 U/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 96 웰 플레이트에 3 × 103 세포/웰의 밀도로 파종하였다. 그 다음, CEA(scFv)-PE26을 0.1, 1 또는 10 μg/mL으로 세포 배지에 첨가하였다. PBS를 대조군으로 사용하였고 이를 이중으로 처리하였다. 세포를 5% CO2/95% 공기 대기를 갖는 5% 가습 배양기에서 37 ℃로 72 시간 동안 배양하였다. 세포 생존율을 560 nm에서 흡광도를 측정함으로써 평가하였다. IC50의 계산은 MKN 45 세포에 대해서만 수행하였다. 간단하게, 세포를 3,000 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고 다양한 농도 (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ng/mL)의 CEA(scFv)-PE26을 처리하였다. 단백질 처리 후 72시간에 CellTiter-Glo (G7571; Promega, Madison, WI) 시약을 첨가하고 Victor X3 분광기를 이용하여 발광을 측정하였다. 세포독성은 다음의 등식을 이용하여 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어로 계산하였다:
[식]
V = top - (top-bottom) / (1 + (IC50 / conc.) ^ HC)
여기서, V는 세포 생존율을 나타내고, top은 가장 높은 수준의 세포 생존율 나타내며, bottom은 가장 낮은 수준의 세포 생존율을 나타내고, conc는 단백질 농도를 나타내며, HC는 억제 Hill 계수이다. 용량 반응 곡선은 비선형 회귀 분석을 이용하여 표준화되었다.
MTT 어세이는 10 μg/mL의 CEA(scFv)-PE26으로 72 시간 동안 처리한 후 MKN45 위암 세포주에서 세포 생존력이 약 20%로 감소함을 나타냈다 (도 7). SNU-C4 및 HCT-116 세포주의 경우, 이 실험에서 세포 생존율이 각각 약 70% 및 90%였다. IC50 값을 측정하기 위해, MKN45 세포를 72 시간 동안 연속 농도 (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ng/mL)의 CEA(ScFv)-PE26으로 처리하였다. 이들 세포에서 이 RIT에 대한 IC50 값은 1.22 ± 0.56 ng/mL (n=3)였고, Hill 계수는 0.52 ± 0.07이였다 (도 8). CEA(scFv)-GFP 음성 대조군은 동일한 조건에서 MKN45 세포 생존율에 영향을 미치지 않았고, PE26은 제일 높은 농도에서 MKN45 세포에만 영향을 미쳐 세포 생존율이 70%를 나타내었다 (데이터 미도시).
유세포 분석
유세포 분석은 CEA(ScFv)가 MKN45, SNU-C4, HepG2 및 HCT-116 세포의 세포 표면에 결합할 수 있는지 결정하기 위해 수행하였다. 유세포 분석을 위해, 105 개의 세포를 10 ng/mL의 CEA(scFv)-GFP로 처리하고 1시간 동안 37 ℃로 배양하였다. PBS로 세척 후, 세포를 PBS 200 μL에 재현탁하고, FlowJo 소프트웨어 (Ashland, OR)와 함께 FACSCalibur 유세포 분석을 이용하여 형광을 측정하였다.
본 발명자들은 이 분석을 위해 CEA(scFv)-GFP를 사용하였고, MKN45 세포에 대해서는 양성 결과를 얻었다 (도 9).
CEA(scFv)-PE26의 페길레이션
여러 RIT 연구는 RIT에 한계가 있으며, 이의 짧은 반감기로 인해 효능이 감소한다는 것을 제시한 바 있다 (Wei J, Bera TK, Liu XF, Zhou Q, Onda M, Ho M, et al. Recombinant immunotoxins with albumin-binding domains have long half-lives and high antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A 2018;115(15):E3501-E8; Tsutsumi Y, Onda M, Nagata S, Lee B, Kreitman RJ, Pastan I. Site-specific chemical modification with polyethylene glycol of recombinant immunotoxin anti-Tac(Fv)-PE38 (LMB-2) improves antitumor activity and reduces animal toxicity and immunogenicity. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97(15):8548-53; Filpula D, Yang K, Basu A, Hassan R, Xiang L, Zhang Z, et al. Releasable PEGylation of mesothelin targeted immunotoxin SS1P achieves single dosage complete regression of a human carcinoma in mice. Bioconjug Chem 2007;18(3):773-84).
이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로, PEG (polyethylene glycol)로 단백질을 변형시키는 것이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 페길레이션 (PEGylation)은 단백질의 분자 크기와 입체 장애를 증가시켜 혈액-체류 (blood-residency)를 증가시킬 수 있다. 또한, 이는 단백질 분해 안정성과 혈장 반감기를 증가시킬 수 있고, 면역원성과 간 흡수를 감소시킬 수 있다. 따라서, CEA(scFv)-PE26의 페길레이션은 반감기를 향상시키는 다음 단계가 될 것이다.
본 실시예에서는, CEA(scFv)-PE26의 N-말단에 PEG를 접합시켰다. 이것은 낮은 pH에서 20 kDa mPEG 알데하이드와 함께 환원성 알킬레이션 방법으로 사용되었다. pH 6.0에서, Ni 컬럼으로 정제된 CEA(scFv)-PE26을 PBS 버퍼로 투석에 의해 0.1 M Na2HPO4로 변경되었다. 더 낮은 pH에서 단백질은 응집되므로, pH 6.0 조건이 선택되었다. 그 후, 메톡시 PEG-알데하이드는 1:6 비율로 단백질에 처리하고 볼텍싱으로 완전히 혼합하였다. 암흑 조건에서 반전 조건 (inverting condition)으로 18 시간 동안 4 ℃로 배양하였다. 비-페길레이션 단백질을 제거하기 위해, 양이온 교환 컬럼과 겔 여과 컬럼에 적용하였으나 분리하기 어려웠다. 따라서 더 많은 페길레이션 단백질을 수득하기 위해 더 많은 mPEG 처리를 발생시켰다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> Recombinant immunotoxin targeting carcinoembryonic antigen and pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same <130> 1064672 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA scFv <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr 130 135 140 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 145 150 155 160 Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr 180 185 190 Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PE26 <400> 2 Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Ala Ile Ser Phe Ser 1 5 10 15 Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His 20 25 30 Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr 35 40 45 Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg 50 55 60 Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp 65 70 75 80 Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala 85 90 95 Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser 100 105 110 Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu 115 120 125 Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg 130 135 140 Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ala Gly Gly Arg Leu Glu Thr 145 150 155 160 Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala 165 170 175 Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser 180 185 190 Ile Pro Asp Ala Glu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser 195 200 205 Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 210 215 <210> 3 <211> 479 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Immunotoxin CEA(scFv)-PE26 <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr 130 135 140 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 145 150 155 160 Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr 180 185 190 Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Lys Val Glu Ile Lys Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu 245 250 255 Gly Gly Ser Gly Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Ala 260 265 270 Ile Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu 275 280 285 Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly 290 295 300 Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly 305 310 315 320 Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr 325 330 335 Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu 340 345 350 Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr 355 360 365 Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Gly Leu Thr Leu 370 375 380 Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro 385 390 395 400 Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ala Gly Gly 405 410 415 Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val 420 425 430 Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu 435 440 445 Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ala Glu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro 450 455 460 Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 465 470 475 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin cleavage site <400> 4 Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 5 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 6 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEVrs <400> 7 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 8 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Construction of CEV(scFv)-PE26 <400> 8 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser 20 25 30 Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 35 40 45 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr 50 55 60 Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 65 70 75 80 Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu 85 90 95 Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp 100 105 110 Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 145 150 155 160 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly 165 170 175 Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 180 185 190 Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu 210 215 220 Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Leu Tyr 225 230 235 240 Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg His Arg Gln 245 250 255 Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Gly Gly Ser Gly Pro Thr Gly Ala Glu 260 265 270 Phe Leu Gly Asp Gly Gly Ala Ile Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln 275 280 285 Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu 290 295 300 Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala 305 310 315 320 Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp 325 330 335 Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr 340 345 350 Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn 355 360 365 Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe 370 375 380 Tyr Ala Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val 385 390 395 400 Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr 405 410 415 Gly Pro Glu Glu Ala Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro 420 425 430 Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro 435 440 445 Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ala Glu 450 455 460 Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro 465 470 475 480 Pro Arg Glu Asp Leu Lys 485 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM5 forward primer <400> 9 aagaaatgac gcaagagcct atgac 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM5 reverse primer <400> 10 cccgaaaggt aagacgagtc tgac 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S18 forward primer <400> 11 tttgcgagta ctcaacacca aca 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S18 reverse primer <400> 12 cctcttggtg aggtcaatgt ctg 23

Claims (18)

  1. 암배항원 (CEA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 염기서열;
    퓨린 (furin) 절단 부위를 코딩하는 염기서열;
    링커를 코딩하는 염기서열; 및
    슈도모나스 외독소 A (PEA)를 코딩하는 염기서열;이 작동가능하게 연결된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 미니바디, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), scFv, dsFv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 scFv인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 퓨린 절단 부위는 RHRQPR/GWEQL (서열번호 4)인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 링커는 GGSG (서열번호 5) 또는 GGGS (서열번호 6)인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 슈도모나스 외독소 A는 B 세포 및 T 세포가 결여된 26 kDa의 절단된 형태인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 슈도모나스 외독소 A는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  9. 제8항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  10. 제8항의 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계;
    형질전환된 숙주세포를 배양한 후, 단일 콜로니를 암피실린이 포함된 배지에서 종자배양하는 단계;
    상기 종자 배양물을 성장시킨 후 암피실린과 테트라사이클린이 첨가된 배지에 옮겨 배양하는 단계;
    IPTG를 첨가하여 과발현을 유도하는 단계; 및
    2 내지 20 시간 동안 15 내지 40 ℃를 유지하는 단계;를 포함하는, 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 슈도모나스 외독소 A가 결합된 재조합 면역독소의 생산방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 숙주세포는 E. Coli BL21(DE3) 또는 Shuffle인 것을 특징으로 하는 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 슈도모나스 외독소 A가 결합된 재조합 면역독소의 생산방법.
  12. 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편; 및
    슈도모나스 외독소 A;를 포함하는, 암배항원을 과발현하는 암세포를 사멸시키기 위한 재조합 면역독소.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암배항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 미니바디, 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), scFv, dsFv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2인 것을 특징으로 하는 재조합 면역독소.
  14. 제12항에 있어서, 상기 슈도모나스 외독소 A는 B 세포 및 T 세포가 결여된 26 kDa의 절단된 형태인 것을 특징으로 재조합 면역독소.
  15. 제12항에 있어서, 상기 재조합 면역독소는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 면역독소.
  16. 제12항에 있어서, 상기 암배항원을 과발현하는 암세포는 위암, 췌장암, 폐암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 재조합 면역독소.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 재조합 면역독소를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 암은 위암, 췌장암, 폐암, 유방암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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