KR20040068561A

KR20040068561A - 카르복시펩티다아제 ｇ2에서의 ｔ-세포 에피토프

Info

Publication number: KR20040068561A
Application number: KR10-2004-7008183A
Authority: KR
Inventors: 헬런도른코엔; 바커매슈; 윌리엄스스티븐; 카프랜시스제이
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2001-11-29
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2004-07-31
Also published as: AU2002352162A1; US20050074863A1; JP2005510227A; EP1501540A1; CA2468501A1; PL369735A1; CN1592633A; WO2003045426A1; BR0214567A; HUP0402160A3; HUP0402160A2; MXPA04004970A

Abstract

본 발명은 구체적으로, 생체내(in vivo)에서 사용될 경우 임의의 미(未)변형된 상응하는 단백질 보다 면역원성이 더 낮거나 실질적으로 비면역원성인 CPG2 단백질을 유도하는 박테리아 효소 카르복시펩티다아제 G2(CPG2)의 변형에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감소된 면역원성을 갖는 변형된 CPG2 이형체 생산이 가능한 수단에 의한 상기 미변형된 단백질로부터 유래된 T-세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드는 특히 인간에서 치료용으로 적합하다.

Description

카르복시펩티다아제 Ｇ2에서의 Ｔ-세포 에피토프{T-CELL EPITOPES IN CARBOXYPEPTIDASE G2}

치료용 단백질에 대한 원치 않는 면역 반응으로 인해서 치료용 단백질의 효능이 제한되는 많은 경우가 있다. 몇 몇의 마우스 모노클로날 항체는 많은 인간의 질병 환경에서 치료법으로서 희망을 보여주었지만, 어떤 경우에는 심각한 정도의 인간 항뮤린 항체 (HAMA) 반응이 유도되어 실패하였다 [Schroff, R. W. 등 (1985)Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D.L. 등(1985)J.Immunol.135: 1530-1535].모노클로날 항체의 경우, HAMA 반응을 감소시키고자 많은 기술이 개발되어 왔다 [WO89/09622; EP0239400; EP0438310; WO91/06667]. 이러한 재조합 DNA 접근법은 일반적으로 최종 항체 구축물(construct) 중에 마우스 유전 정보는 감소시키는 반면에 최종 구축물 중에 인간 유전 정보는 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 생성된 "인간화된" 항체는, 몇 몇의 경우에 있어서, 환자에게서 여전히 면역 반응을 유도하였다 [Issacs J.D. (1990)Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. 등(1999)Transplantation 68: 1417-1420].

항체가 면역반응을 상승시킬 수 있는 치료제로서 투여되는 폴리펩티드 분자의 유일한 부류는 아니다. 인간에게서 나타나는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 인간 기원의 단백질조차도 인간에게서 여전히 면역반응을 유도할 수 있다. 그 중에서도 주목할만한 예로는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 [Wadhwa, M. 등 (1999)Clin. Cancer Res.5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2 [Russo, D. 등 (1996)Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. 등 (1988)New Engl. J. Med. 318: 1409-1413]의 치료 용도를 포함한다. 이와 같이 인간 단백질이 면역원성을 갖는 경우에는, 면역관용(immunological tolerance)의 단절이 없었다면 이러한 개체에서 이러한 단백질들에 작용하였을, 추정되는 면역관용의 단절이 있다.

예를 들면 단백질의 체질적 결핍이 있는 유전병에서, 예컨대 A형 혈우병, 크리스마스병(Christmas disease), 고셔병 (Gauchers disease) 및 많은 다른 예와 같은 병의 경우에서처럼 인간 단백질이 대체요법으로서 투여되는 경우는 상황이 다르다. 상기 경우에는, 치료용 대체 단백질이 처음부터 외래(foreign)분자로서 면역적으로 기능을 할 수 있고, 치료제에 대한 면역반응이 상승될 수 있는 개인의 경우는 치료의 효능이 상당히 상쇄될 가능성이 많다.

단백질 치료제가 숙주의 면역시스템에 의해 외래분자로서 인식이 되는지에 관계없이, 또는 그 분자에 대해 존재하는 관용(tolerance)이 극복되었다면, 단백질에 대한 면역반응의 기전은 동일하다. 면역 반응 유도의 열쇠는, MHC 클래스 II 분자상의 제시를 통하여 T-세포의 활성을 자극할 수 있는, 단백질내의 펩티드, 소위 "T-세포 에피토프"의 존재이다. 상기 T-세포 에피토프는 통상적으로 MHC 클래스 II 분자에 결합 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 함축적으로, "T-세포 에피토프" 는, MHC 분자에 결합될 경우, T-세포 수용체 (TCR)에 의해 인식될 수 있으며, 적어도 원칙적으로는, TCR로 하여금 T-세포 반응을 촉진하는데 관여하게 하여 상기 T-세포의 활성을 유발할 수 있는 에피토프를 의미한다.

MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T-세포 선별 및 활성화에 있어 중심적인 역할을 하는 상당히 다형성(polymorphic)인 단백질의 군이다. 인간 백혈구 항원군 DR (HLA-DR)은 이러한 단백질군의 우세한 이소타입(isotype)이지만, 이소타입 HLA-DQ 및 HLA-DP 도 유사한 기능들을 수행한다. 인간 집단에서, 각 개인은 두 개 내지 네 개의 DR 대립유전자, 두 개의 DQ와 두 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 많은 DR 분자의 구조가 해석되었으며 이러한 구조는 펩티드의 소수성 잔기(포켓 잔기)가 관여하는 많은 소수성 포켓을 갖는 개방-말단형(open-ended)의 펩티드 결합 그루브인 것으로 보인다 [Brown 등Nature(1993)364: 33; Stern 등 (1994)Nature 368:215]. 클래스 II 분자의 상이한 알로타입을 규명하는 다형성은 펩티드 결합 그루브내의 펩티드에 대한 광범위한 다양성(diversity)의 상이한 결합 표면에 기여하고, 집단 수준에서 외래 단백질을 인식하며 병원성 유기체에 대한 면역반응을 상승시키는 능력과 관련해서 최대의 융통성을 보장한다.

치료용 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 통해 진행된다. 이 과정에서 외부 단백질은 삼켜지고 DR, DQ 또는 DP 유형의 MHC 클래스 II 분자와 연합하여 제시되기 위해 처리된다. MHC 클래스 II 분자는 전문적인 항원 제시 세포(APC), 그 중에서도 예컨대 대식세포 및 수지상세포(dendritic cell)에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 일정한 다른 공동수용체의 교차 결합과 함께, T-세포 표면상에 있는, 동종(cognate)의 T-세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 체결(engagement)은 T-세포 내의 활성화 상태를 유도할 수 있다. 활성화는 시토카인들의 방출로 이어지고 나아가 B-세포와 같은 다른 림프구의 항체 생산을 활성화시키거나 또는 전면적인 세포성 면역반응으로서 T-킬러 세포를 활성화시킨다.

T-세포 에피토프 규명은 에피토프 제거를 위한 첫 단계이지만, 당업계에서 에피토프 규명과 제거가 하나의 절차로 통합된 수 개의 명백한 경우가 있다. 요컨대 WO98/52976 및 WO00/34317은 인간 MHC 클래스 II DR 알로타입의 서브세트에 결합할 잠재성이 있는 폴리펩티드 서열을 규명하는 컴퓨터적 스레딩(threading) 접근법을 제시한다. 상기 제시에서는, 예측된 T-세포 에피토프가 관심 있는 단백질 내에서의 신중한 아미노산 치환을 사용하여 제거된다. 그러나 에피토프 규명을 위한상기 절차 및 컴퓨터에 기본을 둔 다른 방법[Godkin, A.J. 등(1998)J. Immunol.161: 850-858; Sturniolo, T. 등 (1999)Nat. Biotechnol.17: 555-561]들도, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 것으로 예측된 펩티드가 처리 경로 또는 다른 현상으로 인해, 모든 경우에, 특히, 생체내에서 T-세포 에피토프로 기능하지 않을 수도 있다. 추가하여, T-세포 에피토프 예측에 대한 컴퓨터적 접근법이 일반적으로 DP 또는 DQ 제한을 갖는 에피토프를 예측할 수 없었다.

동등하게, 합성 펩티드의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 능력을 측정하기 위한 시험관내(in vitro)방법도, 예를 들면 MHC 클래스 II 결합 면의 출처(source)로서 정의된 MHC 알로타입의 B-세포주를 사용하는 방법도 MHC 클래스 II 리간드 규명에 적용될 수 있다 [Marshall K.W. 등(1994)J. Immunol. 152:4946-4956; O'Sullivan 등 (1990)J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey C. 등 (1997)J. Immunol.159: 3238-3246]. 그러나 상기의 기술도 광범위한 다양성의 MHC 알로타입에 대한 다수의 잠재적 에피토프의 스크리닝에는 적합하지 않을 뿐만 아니라, 결합하는 펩티드가 T-세포 에피토프로서 기능할 수 있는 능력을 확인할 수 있는 것도 아니다.

최근 합성 펩티드와 조합하여 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 이용한 기술이 사용되어오고 있다 [Kern, F. 등 (1998)Nature Medicine 4:975-978; Kwok, W.W. 등 (2001)TRENDS in Immunol.22:583-588]. 상기의 시약과 방법들은, 인간 또는 실험동물 대상체로부터 채취한 말초 혈액시료에서 유래된, 특정한 MHC-펩티드 복합체에 결합할 수 있는 T-세포 클론의 존재를 규명하는데 사용되나, 광범위한 다양성의 MHC 알로타입에 대한 다수의 잠재적 에피토프의 스크리닝에는 적합하지 않다.

T-세포 활성화의 생물학적인 분석법은, 시험 펩티드/단백질 서열이 면역반응을 유발할 수 있는 능력에 관한 판단의 제공에 대한 실질적인 대안을 제공한다. 이러한 종류의 접근의 예로는 박테리아 단백질인 스타필로키나제에 대한 T-세포 증식 분석법, 뒤이어 T-세포주를 자극하기 위해 합성펩티드를 이용한 에피토프 맵핑[Petra, A.M. 등 (2002)J. Immunol.168: 155-161]을 이용한 Petra 등의 연구를 포함한다. 유사하게, 파상풍 독소 단백질의 합성 펩티드를 이용한 T-세포 증식 분석법으로 상기 독소의 면역우세한 에피토프 부위를 정의하게 되었다[Reece J.C. 등 (1993)J. Immunol.151: 6175-6184]. WO99/53038에서는, 분리된 인간 면역세포의 서브 세트를 이용하고, 시험관내에서 이들 세포의 분화를 촉진하며 관심 있는 합성 펩티드의 존재 하에서 세포의 배양 및 배양된 T-세포에서 임의의 유발된 증식의 측정으로, 시험 단백질의 T-세포 에피토프를 결정할 수 있는 접근법에 대해 공개한다. 동일한 기술이 또한 Stickler 등 [Stickler, M.M. 등 (2000)J. Immunotherapy 23:654-660]에 의해서도 설명되는데, 양 경우 모두에 있어서 상기 방법은 박테리아의 서브틸리신 내의 T-세포 에피토프들의 검출에 적용된다. 이러한 기술은, 원하는 면역세포의 서브세트(수지상세포들 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포들)를 얻기 위해서 세포 분리 기술의 세심한 적용 및 다수의 시토카인 보충제를 넣은 세포배양이 요구되며, 다수의 제공된 시료를 이용한 신속한 처리를 요구하는 스크리닝에는 도움이 되지 않는다.

상기 기술한 바대로 그리고 이의 결과로서, 원칙적으로는 치료제로서 가치가 있으나 본래는 면역원성이 있는 주어진 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로부터 T-세포 에피토프들을 규명하고 제거하며 또는 적어도 감소시키는 것이 바람직하다. 이러한 치료제로서 가치 있는 분자들 중의 하나가 카르복시펩티다아제 G2(본원에서 CPG2로 약칭함)이다. CPG2는 쉐도모나스 종(Pseudomonas species) 균주 RS-16으로부터 분리된 박테리아 효소(EC 번호 3.4.17.11)이다. 상기 효소는 광범위한 기질 특이성을 가지며 상이한 범위의 N-아실기로부터 C-말단 글루타메이트 잔기의 방출을 촉매한다. 상기 효소를 코딩하는 유전자 [Minton, N.P. 등(1984)Gene 31:1-3]가 규명되었으며 그리고 상기 단백질의 결정구조도 밝혀졌다[Roswell, S. 등(1997)Structure 5:337-347]. 상기 효소는 종전에 암의 치료를 위해 항체-유도된 효소 전구약물 치료(ADEPT) 방법에 사용되어 왔으며 또한 실험적 유전자-유도된 효소 전구약물 치료(GDEPT)의 사용에도 적용되어 왔다. ADEPT 접근법에서, 효소 분자는 항체 또는 항원결합 특이성을 유지하는 항체의 단편과 같은 표적 모이어티에 연결된다[Napier, M.P.등 (2000)Clinical Cancer Res 6: 765-772]. 항체에의 연결은 화학적 교차 연결자를 통할 수 있으며 또는 항체 CPG2 효소는 E.coli같은 재조합 숙주 유기체로부터 발현된 융합 단백질로서 연결될 수 있다.

본 발명은 그러므로 효소 CPG2에 관련되며, 그리고 단일문자 코드로 나타낸 야생형 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같다:

치료적 양의 CPG2 융합 단백질이 이용 가능함에도 불구하고 인간 대상체에게 투여시 생체내 특성 향상을 위한 필요성이 있다. 이와 관련하여, 인간 대상체에서 면역반응을 유도하는데 있어 감소되거나 또는 결여된 잠재성을 갖는 CPG2를 제공하는 것이 매우 바람직하다. 이러한 단백질들은 인간 대상체내에서 증가된 순환시간을 나타낼 것으로 기대된다. 본 발명은 생체내에서 향상된 특성을 나타낼 것으로 기대되는 변형된 형태의 CPG2 단백질을 제공한다.

다른 연구자들도 변형된 CPG2 [US,6,004,550]를 포함하는 CPG2 분자[WO88/07378]를 제공하지만 그러나 이들 중 어느 교시도 단백질의 면역원성 특성에 있어서 T 세포 에피토프의 중요성을 인식하지 못하였을 뿐만 아니라, 본 발명의 절차에 따른 구체적이고 조절된 방식으로 상기 특성에 직접적으로 영향을 주는 것에 대해서는 생각해 내지 못하였다.

감소된 잠재적 T-세포 에피토프의 수를 수단으로 하여 면역 특성이 변형된, 변형된 CPG2 단백질을 제공하는 것이 본 발명의 구체적인 목적이다.

본 발명은 특히 인간에게, 구체적으로는 치료용으로 투여하기 위한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 폴리펩티드는 변형된 폴리펩티드로서 변형으로 인해서 인간 대상체에게 투여시 폴리펩티드가 유발하는 면역 반응이 감소된 경향을 갖는다. 본 발명은 구체적으로, 생체내(in vivo)에서 사용될 경우 임의의 미(未)변형된 상응하는 단백질 보다 면역원성이 더 낮거나 실질적으로 비(非)면역원성인 CPG2 단백질을 유도하는 박테리아 효소 카르복시펩티다아제 G2(CPG2)의 변형에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 감소된 면역원성을 갖는 변형된 CPG2 이형체 생산이 가능한 수단에 의한 상기 미변형된 단백질로부터 유래된 T-세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.

본 발명은 감소된 잠재적인 T-세포 에피토프의 수를 수단으로 하여 면역적 특성이 변형된, 변형된 형태의 CPG2를 제공한다. 본 발명은 MHC 클래스 II 결합잠재성의 특성에 의해 잠재적인 T-세포 에피토프로 결정된 CPG2의 일차 서열 내에서 규명된 서열을 개시한다. 본 개시는 구체적으로는 390개의 아미노산 잔기의 성숙한 CPG2 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 사람에게서 면역원성이 있는 CPG2 일차 서열내의 주요부분을 개시하며 따라서 이는 이러한 지점의 면역원성 효율을 감소시키거나 또는 제거하기 위하여 서열의 변형을 수행하는데 요구되는 중요한 정보를 제공한다.

한 가지 구현예로는, 전체 분자에 대한 면역허용원(tolerogenic) 반응을 촉진하기 위한 목적으로 면역원성 부위를 함유하는 합성 펩티드가 약제 조성물 중에 공급될 수 있다.

추가의 구현예로는 본 명세서에서 개시된 에피토프 부위 내에서 변형된 CPG2분자가 약제 조성물 중에 사용될 수 있다.

요약하자면 본 발명은 하기의 사항에 관한 것이다:

CPG2의 면역원성 부위(들)의 지도를 작성하기 위해 순수한(naive) T-세포 분석에서 합성 CPG2 펩티드 패널을 사용;

시험관내에서 최소의 면역원성을 나타내는 이형체를 선택하기 위해 순수한 T-세포 분석에서 CPG2 단백질 이형체 패널을 사용;

시험관내에서 최소의 면역원성을 나타내는 펩티드 서열을 선택하기 위해 순수한 T-세포 분석에서 합성 CPG2 펩티드 이형체 패널을 사용;

순수한 T-세포 분석에서 야생형 CPG2 분자에 대하여 기록된 지수보다 적은 그리고 바람직하게는 2.0미만의 자극지수를 나타내는 CPG2 단백질 이형체를 선택하기 위해 T-세포 자극의 생물학적 분석을 사용;

순수한 T-세포 분석에서 본래 1.8 초과의, 바람직하게는 2.0 초과의 자극 지수를 갖는 것으로 밝혀진 CPG2 유래 펩티드 서열로 여기에서 펩티드는 최소한도로 변형되고 순수한 T-세포 분석에서 시험되어 감소된 자극 지수를 갖는 것으로 밝혀짐;

야생형 단백질 서열과 100% 아미노산 동일성을 공유하는 CPG2 유래된 펩티드 서열로 순수한 T-세포 분석에서 1.8 이상 및 바람직하게는 2.0을 초과하는 자극 지수를 유발할 수 있는 CPG2 유래된 펩티드;

야생형 단백질 서열과 100% 미만의 아미노산 동일성을 포함하도록 변형되고 T-세포 분석에서 시험된 경우 2.0 미만의 자극 지수를 유발하는 상기 특정된 CPG2 펩티드 서열;

T-세포 분석에서 시험된 경우 미변형된 단백질 분자와 비교하여 감소된 자극 지수를 유발하는 변형을 포함하는 CPG2 분자;

T-세포 분석을 이용해 면역원성 부위의 지도가 작성되었으며 이어서 T-세포 분석에서 재시험한 경우 변형된 단백질이 모(미변형된)분자보다 적은 그리고 가장 바람직하게는 2.0 미만의 자극 지수를 유발하도록 변형된 CPG2 분자;

생체내에서 사용시 동일한 생물학적 활성을 갖는 임의의 미변형된 분자 보다 면역원성이 더 낮거나 실질적으로 비면역원성인 CPG2의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자;

상기 면역원성의 상실이 본래의 미변형된 분자에서 유래된 하나 이상의T-세포 에피토프를 제거하는 것에 의해 달성되는 상기 특정된 CPG2 분자;

상기 면역원성의 상실이 상기 분자에서 유래된 펩티드에 결합할 수 있는 MHC 알로타입 수의 감소에 의해 달성되는 상기 특정된 CPG2 분자;

하나의 T-세포 에피토프가 제거된 상기 특정된 CPG2 분자;

상기 본래 존재하는 T-세포 에피토프가 클래스 II 상의 제시를 통하여 T-세포에 결합하거나 또는 T-세포를 자극하는 능력을 나타내는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인 상기 특정된 CPG2 분자;

상기 펩티드 서열이 표 1 또는 표 2에 나타낸 군으로부터 선택되는, 상기 특정된 분자;

분자는 표 4 또는 표 5에 나타낸 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 상기 특정된 분자;

본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프내의 1 내지 9 개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나의 아미노산 잔기가 변경된, 상기 특정된 분자 ;

아미노산 잔기의 변경이 특정한 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의해 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 추가 또는 결실인 상기 특정된 분자 ;

필요한 경우, 분자의 생물학적 활성을 회복하기 위해 통상 특정 아미노산(들)의 치환, 추가 또는 결실에 의한 부가적인 추가의 변경이 수행되는 상기 특정된 분자 ;

변경이 하기의 서열 (A) -(K)의 연속된 잔기의 임의의 또는 모든스트링(string)에서 유래한 하나 이상의 잔기에서 수행되며, 여기에서 상기 서열은 단일 문자 코드를 사용하는 CPG2 야생형 서열에서 유래하는 상기 특정된 분자;

임의의 상기 서열 (A) - (K) 유래의 9개 이상의 연속적인 잔기를 함유하는 펩티드 분자;

(A) - (K)에서 유래한 임의의 펩티드 서열과 90%를 초과하는 아미노산 동일성을 공유하는 상기의 펩티드 분자;

상기 (A) - (K)에서 유래한 임의의 펩티드 서열과 80%를 초과하는 아미노산 동일성을 공유하는 상기의 펩티드 분자;

상기 (A) - (K)의 하나 이상의 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 상동성이 있는 서열요소(elements)를 포함하는 펩티드 분자;

MHC 클래스 II에 결합할 수 있는 상기의 펩티드 서열;

MHC 클래스 II에 결합하는 활성을 갖는 상기의 변형된 펩티드 또는 임의의 펩티드를 함유하는 약학 조성물;

상기 또는 하기에서 정의된 대로의 임의의 특정되고 변형된 분자를 코딩하는 DNA 서열 또는 분자;

CPG2의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자를 함유하는 약학 조성물;

임의적으로는 약학적으로 수용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 있는, 상기 및/또는 청구범위에서 정의된 대로의 약학 조성물;

하기의 단계를 포함하는 본원에서 정의된 대로의 CPG2의 생물학적 활성을 갖는 변형된 분자를 제조하는 방법 : (i) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계; (ii) 시험관내 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술 또는 생물학적 분석을 사용하여 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해서, 단백질의 아미노산 서열 내에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 규명하는 단계; (iii) 시험관내 또는 컴퓨터 이용 기술 또는 생물학적 분석을 사용하여 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합에 의해 결정된 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하는 방식으로 변형된, 규명된 잠재적인 T-세포 에피토프 내에서 하나 이상의 아미노산을 갖는 새로운 서열의 이형체를 디자인하는 단계; (iv) 재조합 DNA 기술에 의해 상기 서열 이형체를 구축하고, 바람직한 특성을 갖는 하나 이상의 이형체를 규명하기 위해 상기 이형체를 시험하는 단계; 및 (v) 임의적으로 단계 (ii) - (iv) 를 반복하는 단계;

상기 단계 (iii)은 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프 중, 1 - 9 개의 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실에 의해 수행되는 상기 특정된 방법;

변경이 상동 단백질 서열 및/또는 컴퓨터 이용 모델링기술을 참고로 하여 수행되는 상기 특정된 방법;

상기 특정된 13mer T-세포 에피토프 펩티드의 9개 이상의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 서열, 및 생체내에서 사용될 경우 CPG2의 생물학적 활성을 가지며 임의의 미변형된 분자보다 면역원성이 더 낮거나 실질적으로 비면역원성인 CPG2의 제조를 위한 이의 용도;

하기 구조의 CPG2 분자:

여기에서 X⁰은 임의적으로 예컨대 항체 영역과 같은 표적 모이어티임;

그리고 이에 의해 동시에

는 배제됨.

본 발명의 이해에 따르면, "T-세포 에피토프" 라는 용어는 MHC 클래스 II 에 결합할 수 있고, T-세포를 자극할 수 있고/있거나 MHC 클래스 II와 복합체로 T-세포에 결합(반드시 측정 가능하게 활성화시키지는 않음)할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다.

본원 및 첨부되는 특허청구범위에서 사용되는 "펩티드" 라는 용어는, 2 개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은 펩티드 결합(본원에서 하기에 정의됨)에 의해 서로 연결된다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 20가지의 상이한 자연적으로 존재하는 아미노산이 있으며, 이들의 임의의 수를 임의의 순서로 연결하여 펩티드 사슬 또는 고리를 형성할 수 있다. 펩티드의 생물학적 생산에 관여하는 자연적으로 존재하는 아미노산은 모두 L-배치를 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 2가지 상이한 배치의 아미노산의 다양한 조합을 이용한 통상적인 합성 방법을 적용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 단지 소수의 아미노산 단위만을 포함한다. 단 (short) 펩티드, 예를 들면 10개미만의 아미노산 단위를 갖는 펩티드는, 때로는 "올리고펩티드"로 불린다. 다른 펩티드는 다수의아미노산 잔기, 예컨대 100 개 이상을 포함하며, "폴리펩티드"로 불린다.

관습상, "폴리펩티드" 는 3 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 사슬로 간주될 수 있는 반면, "올리고펩티드" 는 보통 "단" 폴리펩티드의 특정 유형으로 간주된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 에 대한 임의의 언급은 또한 올리고펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 나아가, "펩티드" 에 대한 임의의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질을 포함한다. 각각의 상이한 아미노산 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수 -따라서 상이한 단백질의 수- 는 실제로 무한하다. "알파 탄소 (C)" 는, 펩티드 사슬 내에 있는 탄소-수소 (CH) 성분의 탄소 원자이다. "측쇄" 는 단순 또는 복합적인 기 또는 모이어티를 포함할 수 있고, 펩티드의 차원과 비교하여 현저하게 변할 수 있는 물리적 차원을 갖는, C에 대한 펜던트 기이다.

본 발명은 본원에서 개시된 것과 같은 실질적으로 동일한 일차 아미노산 서열을 가지는 임의의 CPG2 종류의 분자에 적용될 수 있으며 따라서 유전공학적 수단 또는 다른 방법에 의해 유래된 CPG2 분자를 포함하며 390개 아미노산 잔기를 포함하지 않을 수도 있다. 상이한 쉐도모나스 주 및 다른 유기체를 포함하는 다른 기원에서 규명된 것과 같은 CPG2 단백질은 본 개시의 많은 펩티드 서열을 공통으로 가지며 개시된 리스팅의 서열과 실질적으로 동일한 서열의 많은 펩티드 서열도 공통으로 갖는다. 이러한 단백질 서열은 그러므로 동등하게 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명은 치료의 의도로 사람에게 도입된 가용성 단백질이 면역 반응을 유발하여, 상기 가용성 단백질에 결합하는 숙주 항체의 발생을 초래하는 실제 현실을 극복하기 위해 착상되었다. 본 발명은 인간 숙주에 투여될 경우 면역 반응을 유도하는 성향이 변경된 CPG2 단백질을 제공함으로서 상기 문제를 해결하고자 한다. 본원에서 기술된 방법에 따라, 발명가들은 이러한 단백질에 대해 면역반응을 일으키는 결정적인 T-세포 에피토프들을 함유하는 CPG2 분자의 부위들을 발견하였다.

변형된 CPG2를 유도하는 본 발명의 일반적인 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 폴리펩티드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 결정하는 단계;

(b) 시험관내 또는 컴퓨터 이용기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법에 의해 단백질의 아미노산 서열 내에서 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프를 규명하는 단계;

(c) 시험관내 또는 컴퓨터 이용기술 또는 생물학적 분석을 이용한 펩티드의 MHC 분자에 대한 결합에 의해 결정된 바대로, 규명된 잠재적인 T-세포 에피토프 내에서, T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거시키는 방식으로 변형된 하나 이상의 아미노산을 갖는 신규 서열 이형체를 고안하는 단계. 상기 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프가 다시 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 또는 제거하는 방식으로 변형되지 않는 한, 상기 서열 이형체는 서열 변이에 의한 새로운 잠재적인 T-세포 에피토프의 생성을 회피하는 방식으로 생성된다;

(d) 재조합 DNA 기술에 따라 상기의 서열 이형체를 구축하고 잘 공지된 재조합 기술에 따라 바람직한 특성을 갖는 하나 이상의 이형체를 규명하기 위해 상기 이형체를 시험하는 단계.

단계 (b) 에 따른 잠재적인 T-세포 에피토프의 규명은 종래의 선행 기술에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법은 WO98/59244; WO98/52976; WO 00/34317에 개시되어 있으며 CPG2-유래된 펩티드의 MHC 클래스 II 분자에의 결합 성향을 규명하기 위해 사용될 수 있다. 계산에 의해 T-세포 에피토프를 규명하는 매우 효율적인 또 다른 방법은, 본 발명에 따른 바람직한 구현예인 실시예 1에 기재되어 있다.

상기 절차의 단계(b)에 따른 분석의 결과 및 CPG2 단백질 서열에 관한 것이 표 1 에 있다.

T-세포 에피토프의 검출을 위한 추가의 중요한 기술적인 접근은 생물학적인 T-세포 증식 분석을 통하는 것이다. CPG2 분자내의 T-세포 에피토프의 검출을 위해, 특히 효과적인 방법은 전체의 CPG2 서열을 시험할 수 있도록 CPG2 서열로부터 유래된 중첩된 펩티드를 시험하거나, 또는 대안적으로는 CPG2 펩티드의 서브세트, 예컨대 표 1에 열거된 것의 전부 또는 일부를 시험하는 것이다. 합성 펩티드는 시험관내에서 배양된 인간 T-세포에서 증식반응을 유발하는 이들의 능력에 대하여 시험된다. 이러한 유형의 접근은 건강한 제공자로부터 채취된 순수한(naive) 인간 T-세포를 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명자들은 상기의 분석을 수행하면서, 2.0 이상인 자극 지수가 유도된 증식의 유용한 측정값이라는 것을 확립하였다. 자극지수는 통상적으로 시험 (폴리)펩티드에 대해 측정된 증식 값 (예를 들면,³H-티미딘 편입법을 사용하는 경우 분당 카운트)을 시험 (폴리)펩티드와 접촉하지 않은 세포에서 측정된 증식 값으로 나누는 것에 의해 유도된다. 이런 유형의 적절한 방법이 실시예 2에 기술된다. 상기 분석의 결과는 표 2 및 도 1에 있으며 여기에 실시예 2의 방법으로 인간 T-세포에서 증식반응을 유발하는 것으로 나타난 CPG2 유래 펩티드 서열이 열거되어 있다.

다수의 잠재적인 에피토프가 규명되었고 특히 많은 펩티드 서열이 생물학적 분석법에서 T-세포를 자극할 수 있는 것으로 밝혀진 경우에, 단백질의 구조적 특징이 MHC 클래스 II 제시 경로를 통해 면역 반응을 유발하는 이의 경향과 관련되어 또한 인지 될 수 있다. 예를 들면 관심 있는 단백질의 결정 구조가 알려진 경우에 단백질내의 구조적인 결함의 증거를 위해 생물학적으로 의미 있는 면역우세한 펩티드 에피토프와 근접하게 연관되어 있음을 제시하는 파라미터인 크리스탈로그래픽 B-펙터 값이 분석될 수 있다 [Dai G. 등 (2001)J. Biological Chem. 276. 41913-41920]. CPG2 결정구조에 대하여 수행된 경우 [PDB ID: lGG2, Rowsell, S 등 (1997)Structure 5:337] 이러한 분석은 CPG2 모델된 결정 구조의 네개의 개별적 사슬 중 세개 이상의 사슬에서 평균 B-펙터값을 넘는 영역의 중앙에 맵핑되는 11개 이상의 분리된 지역의 다수의 면역우세한 에피토프 대한 높은 가능성을 시사한다. 이들 11개의 영역 중에서, N-말단 경계의 펩티드에 맵핑되는 9개가 실시예2의 순수한 T-세포 분석에서 증식반응을 유발하는 것으로 나타났다.

이들 데이터는 특정 펩티드에 반응하는 다수의 순수한 제공자에 대한 데이터와 함께 분자의 가장 면역원성 부위의 순위 예측을 가능하게 한다. 그러나 실제에 있어서는 이들 각각의 부위는 인간에서 면역원성이 있는 것으로 간주되며 따라서 본 발명의 절차에 따른 변형을 요구한다. 따라서, 상기의 정의된 서열 스트링 (A)-(K)를 참조하여, 서열은 (A), {(B),(E)},{(D),(G),(F),(H)}, {(I),(J),(K)}의 순서로 순위매김 될 수 있다; 여기에서 (A)는 분자 내에서 가장 면역원성인 서열로 간주된다. 동일한 순위는 괄호 안에 있는 것이다. 이러한 부위는 주된 에피토프 부위 A-H 및 덜 주된 에피토프 부위 I 및 J 로서 표 3에 열거되어 있다. 상기 구분은 서열의 이 부위를 대표하는 합성 펩티드에 반응하는 것으로 나타난 패널의 한 제공자 유래의 T-세포, 순수한 T-세포 분석에서, 이에 의해 소위 "덜 주된 에피토프" 부위로 불리는 부위에 대하여 반응하는 제공자의 빈도를 근거로 도출되었다. 반면, 주된 에피토프 부위에 맵핑되는 펩티드는 다수의 제공자 유래의 T-세포에 대해 대부분 자극을 하였다. 사용된 제공자 패널은 광범위한 레퍼토리의 상이한 MHC 클래스 II 알로타입을 대표하는 것이다.

실제로는 많은 수의 이형체 CPG2 단백질이 생산될 것이며 바람직한 면역 및 기능적 특성에 대하여 시험될 것이다. 이형체 단백질은 CPG2 단편의 화학적 합성을 포함한 다른 절차도 생각해 낼 수 있지만 가장 바람직하게는 널리 알려진 재조합 DNA 기술 방법에 의해 생산될 것이다. 변형된 CPG2 단백질을 포함하는 CPG2 단백질의 구축 및 발현을 위한 적합한 방법이 실시예 3-5에 제공된다.

본 발명은 단백질로부터 하나 이상의 잠재적인 T-세포 에피토프의 제거 또는 활성의 실질적인 감소를 초래하는 지점에서 하나 이상의 아미노산의 치환이 이루어진 CPG2 유사체에 관한 것이다. 아미노산의 변형(예를 들면 치환)은 모 분자의 가장 면역원성이 높은 부위 내에서 수행된 CPG2 분자를 제공하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 주된 바람직한 구현예는 CPG2 분자를 함유하며 이에 대한 임의의 MHC 클래스 II 리간드가 변경되어 결합을 제거하거나 또는 그렇지 않다면 펩티드가 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 수를 감소하도록 한다. 발명자들은 인간에서 CPG2 분자의 면역원성 부위를 발견하였으며 본원에서 개시한다. 특정한 상황하에서, 예를 들면 본 경우의 서열과 유사한 서열을 갖는 단백질 또는 펩티드를 발현하는 병원균으로 감염된 경우에, 본원에서 개시된 것에 추가의 서열부위가 면역원성의 에피토프가 될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 어떤 경우에 있어서든, 서열 요소가 MHC 클래스 II 리간드로서 작용하는 것이 중요할 것이며, 그러므로 원칙적으로 표 1에 개시된 임의의 서열은 본 발명의 범위 하에서 면역원성 에피토프로 간주될 수 있다.

T-세포 에피토프들의 제거를 위해서, 아미노산 치환은 바람직하게는 T-세포 에피토프 활성의 제거 또는 실질적 감소가 성취될 것으로 예상되는 펩티드 서열내의 적당한 지점에서 수행된다. 실제로, 적당한 지점은 바람직하게는 MHC 클래스 II 결합 그루브 내의 제공된 포켓 중 하나에 결합하는 아미노산 잔기와 동등할 것이다.

펩티드의 소위 P1 또는 P1 고정자 (anchor)에 있는 클레프트의 제 1 포켓 내의 결합을 변경하는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정자 잔기와 MHC 클래스 II 결합 그루브의 제 1 의 포켓 사이의 결합 상호작용의 질은, 전(whole)펩티드에 대한 전반적인 결합 친화도의 주요 결정인자로서 인식된다. 이 위치에서의 펩티드의 적합한 치환은, 포켓 내에 덜 용이하게 수용되는 잔기에 대한 것으로, 예컨대 더욱 친수성인 잔기로의 치환에 대한 것일 것이다. MHC 결합 클레프트 내의 다른 포켓 부위 내에서의 결합과 동등한 위치에 있는 펩티드의 아미노산 잔기가 또한 고려되며, 이는 본 발명의 범위 내에 속한다.

주어진 잠재적인 T-세포 에피토프 내에서의 단독 아미노산 치환은 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 경로인 것으로 이해된다. 단일 에피토프 내에서의 치환의 조합이 고려될 수 있으며 예를 들면 이는 개별적으로 정의된 에피토프가 서로 중첩되는 경우에 특히 적합할 수 있다. 또한, 주어진 에피토프 내에서 단독의 아미노산 치환 또는 단일 에피토프 내에서 조합된 아미노산 치환은, MHC 클래스 II 결합 그루브와 관련해서 "포켓 잔기"와 동등시되는 지점이 아니라, 펩티드 서열 중의 임의의 지점에서 수행될 수 있다. 치환은 당업계에서 공지된 컴퓨터적 기술을 이용하여 생산된 상동구조 또는 구조적 방법을 참조로 하여 만들 수 있으며 그리고 본 발명에 따른 공지된 분자의 구조적 특징에 근거할 수 있다. 이러한 모든 치환은 본 발명의 범위 내에 속한다.

상기 규명된 펩티드 내 이외의 아미노산 치환도 고려될 수 있으며 특히 열거된 펩티드 내에 만들어진 치환(들)과 조합하여 만들어질 경우에 특히 그러하다. 예를 들면 이형체 분자의 생물학적 활성 또는 구조를 회복하기 위해 변화가 고려될 수 있다. 상기의 보상적 변화 및 바람직한 활성의 이형체를 유도하는, CPG2 폴리펩티드 유래의 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 부가를 포함하는 변화 및 임의의개시된 펩티드 중의 변화와 조합한 변화는 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명의 절차 하에서 고려되는 CPG2 분자내의 특히 바람직한 돌연변이 세트가 표 4에 열거되어 있다. 상기의 치환은 실시예 1의 컴퓨터적 방법을 이용하여 선택된다. 각각의 치환은 본원의 상기에서 정의되고 또한 표 3으로서 열거된 에피토프 부위에 맵핑된다.

공지의 다른 방법이 적용될 수도 있으며 그리고 특정 대안적 치환의 정의를 초래할 수도 있다. 모든 경우에 있어서, 특히 바람직한 치환은, 하나 이상의 인간 MHC 클래스 II 분자에 대한 리간드로서 작용하는 부위 내에서의 펩티드 서열의 능력은 파괴시키며 그리고/또는 동종(cognate) T-세포 수용체를 자극하는 것은 중단하지만 분자의 기능적 활성 유지의 병행적 목적은 만족시킬 수 있는 것이 될 것이다. 하나의 공지되고 적용 가능한 절차는 본원에서 개시된 에피토프 부위의 무작위 돌연변이 및 효소적으로 기능하는 이형체의 선택을 포함 할 수도 있다. 선택된 이형체는 이어서 면역학적 분석을 위한 독립적인 두 번째 스크리닝을 거칠 수 있다. 예를 들면 편리한 면역학적 스크리닝은 이형체 서열의 합성 펩티드 및 시험관내에서 배양된 인간 T-세포 또는 T-세포주를 사용한 T-세포 증식분석일 것이다. 상기 개요된 병행 이중 목적에 양립하는 컴퓨터적 치환을 선택하기 위해 분자 모델링 기술을 이용할 수 있다. CPG2 분자의 구조적 모델은 임의의 적합한 소프트웨어 패키지를 이용하여 검사될 수 있으며 가장 바람직한 치환이 선택될 수 있다. 이러한 특히 바람직한 치환의 예는 표 5에 제공된다; 치환은 CPG2 구조 내에 넓게 수용되는 것으로 간주되며 이들의 임의의 열거된 치환을 포함하는 이형체 CPG2 분자는 본 발명의 바람직한 구현예로서 간주된다.

따라서, 특히 바람직한 변형된 CPG2 분자는 하기의 구조로서 주어진다:

여기에서 X⁰은 임의적으로 항체 영역과 같은 표적 모이어티이다;

및 이에 의해 동시에

는 배제된다.

상기 구조에 따른 변형된 CPG2 단백질들은 본 발명의 구현예이다. 변형된 CPG2 단백질은 생산되어 시험관내에서 배양된 인간 T-세포에서 증식 반응을 유발하는 능력의 감소가 증명되었다(실시예 6에 기술됨). 이러한 데이터는 생체내에서 감소된 면역원성 잠재성을 갖는 변형된 CPG2 단백질과 일치된다.

원(native) CPG2 효소는 동종이량체를 형성하며 활성을 위해 아연 이온을 필요로 한다. MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있거나 또는 MHC 클래스 II 분자와 연합하여 T-세포에 결합할 수 있는 감소된 수의 T-세포 에피토프 또는 서열을 포함하며 그리고 또한 바람직하게는 동종이량체를 형성하고 아연 이온에 결합할 수 있는 변형된 CPG2 분자를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

원CPG2 효소는 동종이량체를 형성하며 활성을 위해 아연 이온이 필요하다는 것은 인식된 반면, 인간 대상체에게 투여시 감소된 또는 결여된 면역반응 유발 잠재성이 있으며 그리고 이러한 바람직한 특징의 상기 변형된 CPG2 분자는 동종이량체 형성 및/또는 아연 이온에 결합 능력에 있어서는 타협될 수 있지만 그러나 전구약물을 활성약물로 전환하는 능력과 관련해서는 효소활성도는 유지하는 변형된 CPG2 분자를 제공하는 것이 가장 바람직하다. 이러한 분자도 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명의 변형된 CPG2 분자는 동종이량체를 형성하지 않을 수도 있으며, 원하는 효소 활성은 있지만 단량체 CPG2를 초래하는 서열 변형 및 MHC 클래스 II에 결합할 수 있거나 또는 MHC 클래스 II 분자와 연합하여 T-세포에 결합할 수 있는 결여된 또는 적어도 감소된 수의 T-세포 에피토프 또는 서열을 갖는 서열 변형도 또한 동등하게 본 발명의 바람직한 목적이다.

자체로는 동종이량체를 형성할 수 없으며 용액 중에 단량체로서는 원하는 효소 활성을 갖지 않을 수도 있는 변형된 CPG2 분자는 두개 이상의 변형된 CPG2 분자를 근접하게 한다면 그럼에도 불구하고 전적으로 또는 부분적으로 활성을 회복한다는 것이 인지된다. MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있거나 또는 MHC 클래스 II 분자와 연합하여 T-세포에 결합할 수 있는 감소된 수의 T-세포 에피토프 또는 서열을 갖는다면 상기의 분자가 또한 동등하게 본 발명의 범위 내에 속한다.

더욱 변형된 두개의 CPG2 분자를 이에 의해 효소 활성을 재건하기 위해 근접하게 하는 상황은 예를 들면 이량체 형성 또는 다른 결합성 상호작용에 관여하게 하거나 또는 수월하게 할 수 있는 두 번째 단백질 유래의 영역에 CPG2 분자를 융합하는 유전공학적 수단에 의해 달성될 수 있다. 이러한 영역의 예는 항체의 불변 부위 예컨대 IgG의 Fc 영역 또는 다른 면역글로불린 이소타입을 포함한다. 추가의 예는 항체 V-부위 영역 또는 FOS 및 JUN 과 같은 단백질로 예시되는 b-Zip 모티브를 포함한다. 다른 인식된 단백질 영역도 동등하게 고려될 수 있다. 하나의 재조합 융합 단백질로서 두개의 CPG2 모이어티를 연결하는 단백질 연결자 영역 또한 상기 CPG2 모이어티를 적절히 근접하게 하는 효과를 달성할 수 있다는 것이 또한 기대될 수 있다.

변형된 CPG2의 합성 수용성 폴리머 예컨대 히드록시프로필메트아크릴아미드 또는 폴리스티렌코말레산 또는 기타 등을 포함하는 비단백질 화합물과의 복합체 형성도 또한 고려될 수 있다. 동등하게 리포솜 또는 탄수화물 제제도 고려될 수 있으며 그리고 만약 상기 CPG2 모이어티가 가깝게 있거나 또는 근접하게 하지 않으면 존재하지 않을 효소활성도를 복합체에 제공하거나 회복시킬 목적으로 변형된 CPG2와 콘쥬케이트되는 것도 고려될 수 있다.

인간 숙주에게 투여시 감소된 또는 결여된 면역반응 유발 잠재성의 변형된CPG2 분자를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 목적 내에서 전구약물의 활성약물로의 전환을 촉매하는 이의 능력과 관련하여 분자의 기능적 활성을 유지하는 것이 또한 바람직하다. 활성약물은 적어도 원하는 표적 세포에 대하여 전구약물 보다 10배 더 독성이 있는 것이 바람직하며 그리고 활성약물이 10배 더 독성이 있는 것을 초과하는 것이 가장 바람직하다. 적합한 전구약물은 질소 머스타드 전구약물 및 하기에 기술된 다른 화합물을 포함한다: WO88/07378; WO89/10140; WO90/02729; WO91/03460; EP-A-540263; WO94/02450; WO95/02420; WO95/03830 또는 US,6,004,550으로 이들은 본원에 참조로 편입된다. 본 발명의 변형된 CPG2에 의해 전환될 수 있으며 그리고 적합한 독성 프로파일을 달성할 수 있는 임의의 다른 화합물도 본 발명의 변형된 CPG2와 조합한 사용이 고려될 수 있다.

본 발명이 변형된 CPG2에 관한 것인 한, 이러한 변형된 CPG2 단백질 또는 변형된 CPG2 단백질의 단편을 포함하는 조성물 및 관련된 조성물도 본 발명의 범위 내로 고려되어야만 한다. 다른 측면에서 본 발명은 변형된 CPG2 엔터티를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 더 나아간 측면에서 본 발명은 변형된 CPG2 단백질을 이용하여 인간의 치료적 처리 방법에 관한 것이다. 이러한 측면에서 변형된 CPG2 단백질은 항체분자와 또는 항체분자의 단편과 연결될 수 있다. 상기 연결은 화학적 교차-연결자를 수단으로 할 수 있으며 또는 CPG2-항체가 재조합의 융합 단백질로서 생산될 수도 있다. 상기 융합 분자는 반대쪽 방향도 고려될 수 있지만 항체 영역이 융합 분자의 N-말단쪽을 향하는 변형된 CPG2 영역을 포함할 수 있다.

본 발명의 변형된 CPG2 분자에 연결을 위한 바람직한 항체 특이성은 MFE23[Chester, K.A. 등 (1994)Lancet 343: 455], A5B7 [WO92/010159], T84.66 [US 25,081,235] MN-14 [Hansen, H.J. 등 (1993)Cancer 71:3478-3485], COL-1 [US,5,472,693] 기타 등을 포함하는 많은 항체에 의해 예시된 것과 같이 암종태아성 항원에 대해 유도된 것을 포함한다. 다른 바람직한 특이성은 비-내화성 항원에 대해 유도된 항체를 포함하며 이는 예컨대 항체 KS1/4[Spearman 등 (1987)J. Pharmacol. Exp. Therapeutics 241: 695-703] 및 다른 항체에 의해 인식되는 40kDa 글리코단백질 항원을 포함할 수 있다. 다른 항원 예컨대 표피 성장 인자 수용체(HER1) 또는 관련 수용체 예컨대 HER2가 항-GD2 항체 예컨대 항체 14.18[US,4,675,287; EP0192 657]를 포함하게 선택될 수 있으며, 또는 정관 특이적 막 항원에 대한 항체 [US,6,107,090], IL-2 수용체 [US,6,013,256], A33 항원 [Heath, J.K. 등 (1997)Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 94: 469-474], Lewis Y 결정체, 뮤신 글리코단백질 또는 기타 등도 고려될 수 있다.

변형된 CPG2 단백질이 항체 서열과 융합하여 만들어지는 모든 경우에, MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있거나 또는 T-세포를 자극할 수 있거나 또는 MHC 클래스 II 분자와 연합하여 T-세포에 결합할 수 있는 T-세포 에피토프 또는 서열이 제거된 항체 서열을 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 추가의 구현예로, 변형된 CPG2 단백질은 비-항체 단백질이지만 특정 표적 세포에 대하여 특이적 결합성 상호작용을 유도할 수 있는 단백질에 연결될 수 있다. 상기의 단백질 모이어티는 이들에 대한 특이적 세포 표면 수용체가 있는 다양한 폴리펩티드 리간드를 포함하며 따라서 수많은 시토카인 펩티드 및 폴리펩티드 호르몬 및 다른 생물학적 반응 조정제를 포함한다. 명백한 예는 혈관상피성장인자, 표피성장인자, 헤레굴린, 인터루킨류, 인터페론류, 종양괴사인자 등등 및 글리코단백질 분자와 같은 단백질을 포함한다. 본 발명의 CPG2와 상기 및 다른 단백질의 융합 단백질도 고려될 수 있으며 단백질 리간드 영역과 관련하여 N-말단 또는 C-말단 방향에 변형된 CPG2 모이어티를 포함할 수 있다. 동등하게, 정제된 리간드의 변형된 CPG2 단백질에의 화학적 교차-연결도 고려될 수 있으며 본 발명의 범위 내에 속한다.

추가의 구현예에서 본 발명의 변형된 CPG2 단백질은 수용성 폴리머 예컨대 히드록시프로필메트아크릴아미드 또는 다른 폴리머를 포함하는 복합체로서 사용될 수 있으며 여기에서 변형된 CPG2 단백질은 폴리머에 공유적으로 부착되어 있거나 또는 폴리머와 비-공유적 결합 상호작용으로 있다. 이러한 구현예는 부가적으로 항원 결합 영역 예컨대 폴리머 CPG2 복합체와 조합으로 항체 또는 항체의 단편을 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 구현예에서, 변형된 CPG2 효소의 유전자가 그 자체로 치료물로 예컨대 유전자 유도된 효소 전구약물 방법에 사용될 수 있으며 벡터 내에서 조직 특이적 프로모터 서열에의 연결을 포함 할 수 있고 또는 벡터내의 바이러스 유래의 프로모터로부터 발현될 수 있고 또는 벡터 자체가 바이러스 유래일 수 있거나 또는 세포를 감염할 수 있는 바이러스 입자 내로 포장될 수도 있다. 본 발명은 이제 하기의 실시예에서 설명될 것이나 이에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예는 다음의 도를 참조한다.

도 1은 본 발명의 실시예 2의 방법에 따른 순수한 T-세포 증식 분석에 사용된 합성 펩티드의 리스트를 제공한다. ID#= 시험된 각 펩티드의 식별번호임; 제공자# = 특정 펩티드에 대하여 자극지수가 >1.95 로 기록된 제공자 PBMC 배양을 식별함; 서열=단일문자 코드의 펩티드 서열임.

도 2는 상이한 농도의 야생형 또는 변형된 CPG2 단백질의 존재 하에 배양된 순수한 인간 PBMC를 사용한 면역원성 분석의 결과를 나타내는 플롯을 제공한다. 상기 그래프는 둘의 반응성 있는 제공자 PBMC 시료 유래의 결과를 나타낸다. 패널A = 제공자 #1. 패널 B = 제공자 #16. SI = 자극지수.

실시예 1

컴퓨터적 방법에 의한 CPG2 단백질 서열 내의 잠재적 MHC 클래스 II 리간드의 규명

MHC 클래스 II 결합 리간드로서 작용할 잠재성을 갖는 펩티드 서열의 분석 절차는 종전에 [WO 02/069232]에 자세히 기술되어 있다. 이 방법을 이용한 소프트웨어 도구가 개발되어 왔으며 CPG2 단백질 서열의 분석에 적용되었다. 간단히 말하면, 소프트웨어는 모델 MHC 클래스 II 분자의 라이브러리를 포함하는 다수의 요소로부터 만들어졌고, 인간 집단에서 현존하는 광범위한 다수의 알로타입 이형체 및 펩티드 골격 구조의 라이브러리를 포괄하도록 만들어졌고, 이론적인 그리고 공지의 골격 배치를 포괄하도록 만들어졌다. 이러한 요소들을 이용하여, 각각의 모델 MHC 알로타입 결합 그루브 내에 각각의 골격 배치 도킹(docking)의 결과에 기본을 둔 방대한 데이터 세트가 생성되었다. 데이터 세트는 또한 주어진 위치에서 모든 가능한아미노산에 대한 가장 좋은 측쇄 배치를 포괄한다. 펩티드 측쇄(최적의 배치에서) 및 MHC 단백질 사이의 원자간 거리가 상기 데이터세트에 저장되어 있다. 관심 있는 단백질 유래의 시험 펩티드는, 이의 측쇄의 서열을 모든 골격에 추가한 후 최적의 측쇄 배치에 대한 데이터세트를 검색하여 각각의 골격에 대한 "펩티드 스코어"를 계산하여 분석된다. 가장 좋은 스코어가 디스플레이용으로 선택되며 상기 절차는 각각의 이용 가능한 MHC 모델 구조에 대해 반복된다. 알고리즘이 전체 CPG2 단백질 서열의 분석에 적용되어 왔다. 상기의 분석은 하나 이상의 알로타입에 대하여 이들이 MHC 클래스 II 리간드로 예측된 것에 의해 잠재적 T-세포 에피토프인 다수의 13mer 펩티드 서열을 규명한다. 이러한 펩티드는 표 1에 나타나 있으며 여기에서 펩티드 서열은 단일문자 코드로 나타낸다.

실시예 2

합성펩티드 및 순수한 (naive) 인간 PBMC를 이용한 시험관내 증식 분석에서 T-세포 에피토프의 규명

MHC, 펩티드 및 T-세포 수용체(TCR) 사이의 상호작용은 T-세포 인식의 항원 특이성에 대한 구조적인 근간을 제공한다. T-세포 증식 분석은 MHC에 대한 펩티드의 결합 및 TCR에 의한 MHC/펩티드 복합체의 인식을 시험한다. 본 실시예의 시험관내 T-세포 증식 분석은 항원제시세포(APC) 및 T-세포를 포함하는, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 자극을 포함한다. 자극은 시험관내에서 합성 펩티드 항원을 사용하고, 그리고 일부 실험에서는 전체 단백질 항원을 사용해서 수행된다. 자극된 T-세포 증식은³H-티미딘 (³H-Thy)을 이용하여 측정되며, 편입된³H-Thy의 존재는 세척되고, 고정되어진 세포의 섬광계측을 이용하여 평가된다.

제공된 세포는 National Blood Service (Addenbrooks Hospital, Cambridge, UK)로부터 수득되었다. Ficoll-paque는 Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, UK)으로부터 수득되었다. 초기(primary) 인간 림프구의 배양을 위한 무혈청의 AIM V 배지 및 L-글루타민, 50μg/ml 스트렙토마이신, 10μg/ml 겐토마이신 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 포함하는 것은 Gibco-BRL (Paisley, UK)로부터 수득되었다. 합성 펩티드는 Eurosequence (Groningen,The Netherlands) 및 Babraham Technix (Cambridge, UK)로부터 수득되었다.

적혈구 및 백혈구는 백혈구연층의 부드러운 원심분리로 혈장 및 혈소판으로부터 분리되었다. 윗 상(top phase)(혈장과 혈소판을 포함)은 제거하여 폐기되었다. 적혈구 및 백혈구는 인산완충식염수(PBS)에 1:1로 희석된 후 15ml의 ficoll-paque (Amersham Pharmacia, Amersham UK) 위에 층을 이루어 올려졌다. 원심분리는 제조자의 권고 조건대로 수행되었으며, PBMC는 혈장+PBS /ficoll paque 경계면으로부터 채취되었다. PBMC는 PBS(1:1)와 혼합하고 원심분리를 하여 수집되었다. 상층액은 제거하여 폐기하였으며 그리고 PBMC 펠렛(pellet)은 50ml PBS로 재현탁되었다. 세포는 다시 원심분리를 통하여 침전되었고, PBS 상층액은 폐기되었다. 세포는 50ml AIM V 배지로 재현탁되고 그리고 이 시점에서 세포의 수를 세고 트리판 블루 염색약 배제법을 사용하여 생존도(viability)를 평가하였다. 세포는 다시 원심분리로 수집되고 그리고 상층액은 폐기되었다. 세포는 ml 당 3x10⁷의 밀도로 액체질소 보관을 위해 재현탁되었다. 보관용 배지는 90%(v/v)의 열로 불활성화된 AB 인간 혈청(Sigma, Poole, UK)및 10%(v/v)의 DMSO(Sigma, Poole, LTK)이었다. 세포는 조절되는 냉동 용기(Sigma)로 옮겨지고 그리고 -70℃에서 하룻밤을 두었다. 사용을 위해 필요할 경우는, 세포를 37℃의 수조에서 빠르게 해동시킨 후에 미리 데워진 10ml의 AIM V 배지로 옮겼다.

모든 PBMC 시료에 대한 조직 유형은 시중의 시약 시스템(Dynal, Wirral, UK)을 사용하여 분석되었다. 분석은 공급자의 권고 프로토콜 및 표준 부수적 시약 및 아가로스 전기영동 시스템으로 수행되었다. CPG2 에피토프 분석을 위해 선택된 20개의 제공자 PBMC 시료 패널의 조직 유형은 표 6(하기)에서 확인 할 수 있고 광범위한 스펙트럼의 알로타입을 제공하도록 선택되었다.

PBMC는 웰당 2xl0⁵PBMC의 밀도로 평평한 바닥의 96웰 플레이트에서 단백질 및 펩티드 항원으로 자극되었다. PBMC를 37℃에서 7일 동안 배양한 후³H-Thy(Amersham-Pharmacia, Amersham, UK)를 넣고 펄스(pulse)하였다. 본 연구를 위해서, CPG2 서열 전체에 걸치며 추가의 C-말단 6-His Tag를 포함하는 합성 펩티드(15mer)가 만들어졌다. 각각의 펩티드는 서열내의 뒤이어 있는 각각의 펩티드와 12 개 잔기가 중첩되는데, 즉, 각각의 펩티드는 서열내의 다음에 오는 펩티드에서 3개의 잔기가 증가한 것이다. 펩티드 서열 및 식별번호는 도 1에 있다. 각 펩티드는 20명의 순수한 제공자로부터 분리된 PBMC에 대하여 개별적으로 스크리닝 되었다. 종전에 면역원성이 있는 것으로 밝혀지고 강력한 비회상 항원 KLH인 두개의 대조군 펩티드 C32 (PKYVKQNTLKLAT) 및 C49(KVVDQIKKISKPVQH)가 각각의 제공자 분석에 사용되었다. 펩티드를 10mM의 최종 농도로 DMSO에 녹이고, 상기 원액은 그 후 AIM V배지로 1/500으로 희석하였다 (최종 농도 20μM). 펩티드는 100㎕ 중에 최종 농도 2 및 10μM이 되도록 평평한 바닥의 96웰 플레이트에 추가되었다. 해동된 PBMC의 생존도(viability)는 트리판 블루 염색약 배제법으로 평가되었고, 그 후 세포는 2xl0⁶세포/ml의 밀도로 재현탁되었고, 100㎕(2xl0⁵PBMC/웰)가 펩티드를 포함하는 각 웰에 전달되었다. 삼중의 웰 배양물은 각각의 펩티드 농도에서 분석되었다. 플레이트는 37℃의 5% CO₂의 습한 대기 하에서 7일 동안 배양되었다. 세포에 웰당 1μCi³H-티미딘을 넣고 18-21시간 펄스(pulse)한 후 필터 매트(mat)위로 채취하였다. CPM 값은 Wallac 마이크로 플레이트 베타 탑 플레이트 계수기 (Perkin Elmer)를 이용하여 결정하였다. 결과는 자극지수 (SI)로서 표현되며, 여기에서 SI = CPM 시험 펩티드 / CPM 처리되지 않은 대조군이다.

순수한 T 세포 증식 분석을 사용한 CPG2 서열 중의 T-세포 에피토프의 지도작성으로 수 개의 면역원성 부위를 규명하였다. 제공자 개인에게서 상당한 자극지수를 갖는 펩티드는 도 1에 열거된다. 순수한 T-세포 증식 분석의 결과는 CPG2 단백질의 에피토프 지도를 편집하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 지도의 편집에 있어서, SI>1.95는 양성 반응으로 간주된다.

실시예 3

CPG2 유전자의 생산

CPG2의 본래 서열은 쉐도모나스 sp. RS-16주(gene bank accession no. AE002078)로부터 수득되었다. 390개 아미노산의 단백질 서열은 1170 뉴클레오티드의 DNA 서열로 역-번역되었다. 역-번역은 시중의 소프트웨어(DNAstar, Madison, WI, USA)를 사용하여 수행되었으며 서열은 E.coli에서 가장 흔히 사용되는 코돈을 근거로 작성되었다. 서열은 24개 합성 올리고뉴클레오티드 세트를 고안하는데 사용되었다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 50 내지 83 뉴클레오티드인 크기의 범위이며 19 내지 25 개 뉴클레오티드의 중첩된 말단을 갖도록 고안되었다. 유전자는 또한 플라스미드 벡터에 클로닝을 위해 5' 말단에는 AscI 부위 및 3' 말단에는 SacI 부위를 갖도록 고안되었다. 올리고뉴클레오티드는 표 7에 열거된다.

유전자는 중합효소연쇄반응(PCR)으로 조합되었다. 하기에 나타난 대로 상이한 세트의 올리고뉴클레오티드로 특징되는 4개의 상이한 PCR 혼합(A,B,C,D)이 만들어졌다. 모든 경우에 반응을 유도하는 프라이머는 각각의 혼합 내에 더 높은 농도로 존재하였고(50pmol), 밑줄을 그어 나타냈다:

완전한 CPG2 유전자는 상기 반응의 정제 산물을 사용한 연결 반응에서 형성되었으며 클로닝 부위를 도입하기 위해 플랭킹 프라이머인 OL571 및 OL572로 반응되었다. PCR은 높은 정확도 중합효소(Promega, Southampton, UK) 및 효소와 공급된 반응 완충액을 사용하여 수행되었다. 반응은 하기에 기술된 프로그램이 작동되는 써말 싸이클러로 수행되었다.

PCR 주기 조건:

조합된 CPG2 유전자는 pGEM으로 서브클로닝되었고 서열은 서열분석으로 확인되었다. CPG2의 활성을 시험하기 위해, CPG2 유전자를 포함하는 세포를 0.1% 엽산(엽산은 10% 원액을 만들기 위해 1M NaOH 중에 용해됨)을 포함하는 LB 아가에 도말하였다. 이는 이어서 37℃에서 배양되었고, CPG2 활성이 있는 콜로니는 황색원광에 의해 규명되었다. 원광은 엽산이 가수분해되면서 침전된 프테로(pteroic)산이다.

실시예 4

CPG2 유전자의 부위유도 돌연변이화

클로닝된 활성이 있는 CPG2 유전자를 QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, LaJolla, CA)을 사용하여 유전자의 돌연변이화된 이형체의 개발을 위한 주형으로 사용하였다. 고정확도의 열적으로 안정한 중합효소를 올리고뉴클레오티드 프라이머의 쌍으로부터의 신장을 위해 사용하였으며, 프라이머는 벡터의 반대쪽 스트랜드에 상보적이며, 목적하는 돌연변이를 포함한다. 합성을 위해 사용되었다. 프라이머의 편입으로 스태거드 닉(staggered nick)을 포함하는 돌연변이 벡터가 초래된다. 모 DNA는 메틸화 및 반메틸화된 DNA에 특이적인 DpnI 엔도뉴클레아제로 절단되며 그리고 원하는 돌연변이가 편입된 닉이 생긴 상기 벡터 DNA로 컴피턴트 E.coli 세포를 형질전환한다. 주형에 각각의 점 돌연변이를 도입하기 위해 고안된 16 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 서열은 표 8에 있다.

실시예 5

재조합 CPG2의 발현 및 정제

돌연변이 CPG2 유전자는 코딩 영역을 플랭킹하는 AscI/SacI 제한효소 부위를 사용하여 발현벡터로 클로닝되었다. 라이게이션 혼합물은 E.coli 세포를 형질전환하기 위해 사용되었다. 50-100㎍/ml 암피실린을 포함하는 LB 플레이트 상에서 수개의 암피실린 저항 클론이 선택되었다. 이들은 재조합 삽입물의 존재 및 방향에 대하여 분석되었으며 His-tag와 인프레임(in-frame)으로 있다는 것을 확인하였다. 정확한 방향임을 확인한 후에, 세포를 37℃에서 배양하고, 발현을 유도하고 원심분리로 수득하였다. 발현은 용해된(lyzed) 시료를 SDS-PAGE 겔 및 Coomassie Blue로 염색하여 분석하였다. 뒤이은 재조합 단백질의 정제를 위해 50ml까지 세포 배양 발현 용량을 늘렸다.

6xHis tagged CPG2 단백질을 ProBond^TMPurification System(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 공급자가 권고한 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 요약하면, 원심분리로 50ml 배양물에서 세포를 채취하여, 이를 결합 완충액에서 재현탁되고 용해(lyzed)되었다. 용해물(lysate)은 가볍게 흔들면서 정제 컬럼 레진에 결합하도록 60분간 방치한다. 레진을 세척하고 재조합 단백질을 용출 완충액으로 용출하였다. 시료를 종전과 같이 SDS-PAGE 및 Coomassie 염색으로 분석하였다. 정제된 단백질의 농도는 분광광도법으로 결정하였다.

실시예 6

인간 PBMC를 사용한 시험관내 증식분석에서 변형된 CPG2 단백질의 감소된 면역원성 잠재성의 증명

변형된 단백질은 실시예3- 5의 방법에 따라 제조되었다. 변형된 단백질은 야생형 서열에 다수의 치환을 포함하였다. 양성 대조군 단백질은 야생형 CPG2 이었다.

T 세포 증식분석을 위해 건강한 제공자 유래의 4x10⁶PBMC(웰당)를 2ml의 벌크 배양(24 웰 플레이트에서)에서 미변형된 항체 및 변형된 항체와 배양하였다. 각각의 제공 배양물은 5 및 50㎍/ml의 변형된 및 미변형된 CPG2로 처리하였다. 추가로 처리되지 않은 대조군 벌크배양은 자극지수를 결정할 수 있도록 계속 배양되었다. 5, 6, 7 및 8일에 각 벌크배양 세포를 부드럽게 휘저은 후에 증식지수의 결정을 위해 50㎕의 시료를 삼중으로 제거하였다. 상기 50㎕ 시료 분취물을 각각 U-바닥의 96웰 플레이트의 3개의 웰에 전달하였다. 새로 준비한 AIM V 배지(130㎕)를 각각의 96웰에 첨가하였다. 세포는 총 부피 20㎕ AIM V 배지로 희석된 웰당 1μCi[³H] 티미딘으로 펄스(18-21 시간)되었다. 각각의 배양물의 총 부피는 200㎕이었다. CPM 값은 베타 플레이트 판독기를 사용하여 수집하고 각 시점에 대한 자극지수는 상기 실시예 2와 같이 결정되었다.

SI는 각 시점 및 처리에 대하여 플롯 되었다. 반응이 있는 제공자에서, 야생형 CPG2로의 처리는 7일 째에 피크가 있는 상당한 증식 반응으로 이어진다. 동일한 제공자에서, 본 발명의 변형된 CPG2로 한 처리는 상당한 증식반응을 초래하지 않는다. 상기 결과는 변형된 CPG2 단백질에서의 감소된 면역원성 잠재성을 나타낸다. 반응이 있는 제공자 #1 및 #16으로부터의 플롯은 도 2에 제공된다.

Claims

생체내(in vivo)에서 사용될 경우 본질적으로 동일한 생물학적 특이성을 가지며 임의의 미(未)변형된 CPG2 보다 면역원성이 더 낮거나 또는 실질적으로 비(非)면역원성이며, 미변형된 모(parental) 효소와 비교하여 변경을 갖는 특정 아미노산 잔기를 함유하며, 상기 변경이, 모효소에서 MHC 클래스 II 결합 리간드로서 작용하며 그리고 T-세포를 자극하는 하나 이상의 T-세포 에피토프 서열의 감소 또는 제거를 유발하는, 변형된 박테리아 효소 카르복시펩티다아제 G2(CPG2).
제 1 항에 있어서, 상기 변경이 CPG2 야생형 서열 유래의 하기의 연속적인 아미노산 잔기의 스트링내의 하나 이상의 위치에서 만들어진 변형된 CPG2 분자:
제 1 항에 있어서, 상기 T-세포 에피토프 서열은 13mer 또는 15mer 펩티드이며 표 1 또는 표 2의 임의의 것으로부터 선택되는 변형된 CPG2 분자.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변경은 1-9 아미노산 잔기의 치환인 변형된 CPG2 분자.
제 3 항에 있어서, 상기 치환은 표 4 또는 표 5의 임의의 것으로부터 선택되는 변형된 CPG2 분자.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기의 변경을 포함하며, 상기 변경은 분자의 생물학적 활성을 회복하기 위해 수행되는 변형된 CPG2 분자.
박테리아 효소 카르복시펩티다아제 G2(CPG2)의 생물학적 활성 및 하기의 아미노산 서열을 갖는 분자:

여기에서 X⁰은 임의적으로 예컨대 항체 영역과 같은 표적 모이어티이며

그리고 이에 의해 동시에

는 배제됨.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 T-세포의 유도된 세포 증식의 생물학적 분석에서 전단백질로서 시험된 경우, 동일한 제공자 유래의 세포를 사용하여 병행 시험된 모효소보다 더 적은 자극지수를 나타내며, 상기 지수는 단백질로 자극 후에 측정된 세포 증식 값으로 단백질을 받지 않은 대조군 세포에서 측정된 세포 증식 값으로 나누어지며, 상기 세포 증식이 임의의 적당한 수단으로 측정되는 변형된 CPG2 효소.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에서 정의된 대로의 CPG2 분자를 코딩하는 DNA 서열.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 변형된 CPG2 분자를, 임의적으로는 약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 함유하는 약학 조성물.
잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 가지며 미변형된 CPG2 효소의 일차 서열로부터 생성되며, 그럼으로써 상기 펩티드 분자는 세포증식의 생물학적 분석에서 적어도 1.8 내지 2의 자극지수를 가지며, 상기 지수는 펩티드로 자극 후에 측정된 세포 증식 값으로 펩티드를 받지 않은 대조군 세포에서 측정된 세포 증식값으로 나누어지며, 상기 세포 증식은 임의의 적당한 수단으로 측정되는 9-15 개의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드 분자.
제 11 항에 있어서, 상기 자극지수가 2를 초과하는 펩티드 분자.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 표 1 또는 표 2 에 나타낸 대로의 연속적인 T-세포 에피토프 서열의 군으로부터 선택된 펩티드 분자.
2 미만의 자극지수로 표현되는 감소되거나 또는 결여된 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 활성을 가지며, 상기 지수는 펩티드로 자극 후에 측정된 세포성 증식 값으로 펩티드를 받지 않은 대조군 세포에서 측정된 세포 증식 값으로 나누어지며, 상기 세포 증식은 임의의 적당한 수단으로 측정되는, 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 펩티드 분자로부터 유래하는 아미노산 치환에 의해 변형된 펩티드 분자.
제 14 항에 있어서, 상기 자극지수가 2 미만인 변형된 펩티드 분자.
생체내에서 사용될 경우 임의의 미변형된 모효소보다 더 낮은 면역원성을 갖거나 실질적으로 비(非)면역원성인 변형된 CPG2 효소의 제조를 위한 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 용도.
생체내에서 CPG2에 대한 면역원성을 감소시키기 위한 환자의 예방접종 목적용의 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 용도.
제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 펩티드를 코딩하는 DNA 서열.
제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 펩티드를, 임의적으로는 약학적으로 수용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 함유하는 약학 조성물.