CN116836260A - 一种识别mage-a4的t细胞受体及其编码序列和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种识别MAGE‑A4的T细胞受体及其编码序列和应用。本发明提供的识别MAGE‑A4的T细胞受体是一种能够特异性结合衍生自MAGE‑A4抗原的短肽GVYDGREHTV的TCR，所述抗原短肽GVYDGREHTV可与HLA A0201形成复合物并一起被呈递到细胞表面。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外，本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。

Description

一种识别MAGE-A4的T细胞受体及其编码序列和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种识别MAGE-A4的T细胞受体及其编码序列和应用。

背景技术

MAGE蛋白家族具有与其他MAGE蛋白的序列紧密匹配的同源区，并且包含在免疫识别中展现为HLA/肽复合物的肽。一些MAGE基因家族蛋白(MAGE-A至MAGE-C家族)仅在生殖细胞和癌症中表达；其他MAGE基因家族蛋白(MAGE-D至MAGE-H家族)在正常组织中广泛表达。MAGE-A4是MAGE A基因家族的CTA成员。虽然被认为可能在胚胎发育中起作用，但其功能未知。

T细胞过继免疫治疗是将对靶细胞抗原具有特异性的反应性T细胞转入病人体内，使其针对靶细胞发挥作用。在免疫系统中，通过抗原短肽特异性的TCR与短肽-主组织相容性复合体(pMHC复合物)的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells，APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，引起一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

因此，本领域技术人员致力于分离出对MAGE-A4抗原短肽具有特异性的TCR，以及将该TCR转导T细胞来获得对MAGE-A4抗原短肽具有特异性的T细胞，从而使他们在细胞免疫治疗中发挥作用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种识别MAGE-A4的T细胞受体及其编码序列和应用。所述T细胞受体能够与MAGE-A4抗原短肽复合物GVYDGREHTV-HLAA0201特异性结合，同时转导了本发明所述的T细胞受体的效应细胞能够被特异性激活。

本发明中所述MAGE-A4抗原短肽，SEQ ID NO.9：GVYDGREHTV。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种TCR，所述的TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，其特征在于，所述TCR能够与GVYDGREHTV-HLA A0201复合物结合；

并且所述TCRα链可变域的3个互补决定区为：

αCDR1-DSSSTY SEQ ID NO.10

αCDR2-IFSNMDM SEQ ID NO.11

αCDR3-AEQSFGNEKLT SEQ ID NO.12；

和/或所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为：

βCDR1-MNHEY SEQ ID NO.13

βCDR2-SVGEGT SEQ ID NO.14

βCDR3-ASSLGRAYEQY SEQ ID NO.15。

在另一优选例中，所述TCR包括TCRα链可变域和TCRβ链可变域；

所述TCRα链可变域的氨基酸序列为与SEQ ID NO.1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述TCRβ链可变域的氨基酸序列为与SEQ ID NO.5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

SEQ ID NO.1：

GEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEQSFGNEKLTFGTGTRLTIIP。

SEQ ID NO.5：

NAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASSLGRAYEQYFGPGTRLTVT。

在另一优选例中，所述TCR包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.1。

在另一优选例中，所述TCR包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.5。

在另一优选例中，所述TCR为αβ异质二聚体，所述TCR包含TCRα链恒定区TRAC*01，和TCRβ链恒定区TRBC1*01或TRBC2*01。

在另一优选例中，所述TCR的α链氨基酸序列为SEQ ID NO.3和/或所述TCR的β链氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

SEQ ID NO.3：

GEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEQSFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS。

SEQ ID NO.7：

NAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASSLGRAYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG。

在另一优选例中，所述TCR是人源的。

在另一优选例中，所述TCR是可溶的。

在另一优选例中，所述TCR是分离或纯化的。

在另一优选例中，所述TCR为单链。

在另一优选例中，所述TCR是由α链可变域与β链可变域通过肽连接序列连接而成。

在另一优选例中，所述TCR的α与β链的恒定区分别为鼠源的α与β链的恒定区。

在另一优选例中，所述TCRα链恒定区为鼠的恒定区和/或所述TCRβ链恒定区为鼠的恒定区。

在另一优选例中，所述TCR在α链可变区氨基酸第11、第13、第19、第21、第53、第76、第89、第91或第94位，和/或α链J基因短肽氨基酸倒数第3位、倒数第5位或倒数第7位中具有一个或多个突变；

和/或所述TCR在β链可变区氨基酸第11、第13、第19、第21、第53、第76、第89、第91或94位，和/或β链J基因短肽氨基酸倒数第2位、倒数第4位或倒数第6位中具有一个或多个突变，其中氨基酸位置编号按IMGT(国际免疫遗传学信息系统)中列出的位置编号。

在另一优选例中，所述TCR的α链可变域氨基酸序列包含SEQ ID NO.32和/或所述TCR的β链可变域氨基酸序列包含SEQ ID NO.34。

SEQ ID NO.32：

GEDVEQSLSLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADVQTGDSAIYFCAEQSFGNEKLTFGTGTRLTVTP。

SEQ ID NO.34：

NAGVTQTPKYLSVKTGQSVTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGQGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDRYNVSRLKKQNFLLGIESVTPSDTSVYFCASSLGRAYEQYFGPGTRLTVT。

在另一优选例中，所述TCR的氨基酸序列为SEQ ID NO.30。

在另一优选例中，所述TCR包括(a)除跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链；以及(b)除跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链；

并且(a)和(b)各自包含功能性可变结构域，或包含功能性可变结构域和所述TCR链恒定结构域的至少一部分。

在另一优选例中，半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域之间形成人工二硫键。

在另一优选例中，在所述TCR中形成人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：

TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57；

TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77；

TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17；

TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59；

TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15；

TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54；

TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19；或TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。

在另一优选例中，所述TCR的α链氨基酸序列为SEQ ID NO.26和/或所述TCR的β链氨基酸序列为SEQ ID NO.28。

SEQ ID NO.26：

GEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEQSFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFCSPESS。

SEQ ID NO.28：

NAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASSLGRAYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSECEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYALSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRAD。

在另一优选例中，所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫键。

在另一优选例中，在所述TCR中形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；

TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的等61位氨基酸；

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；

或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。

在另一优选例中，所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。

在另一优选例中，所述TCR的α链的C-或N-末端结合有偶联物，和/或所述TCR的β链的C-或N-末端结合有偶联物。

在另一优选例中，与所述TCR结合的偶联物包括可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分中任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述治疗剂为抗-CD3抗体。

第二方面，本发明提供一种多价TCR复合物，所述多价TCR复合物包括第一方面所述的TCR分子中的任意两种或至少三种的组合。

第三方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包括编码第一方面所述TCR的核苷酸序列和/或第一方面所述TCR的核苷酸序列的互补序列。

在另一优选例中，所述核酸分子是分离或纯化的。

在另一优选例中，所述核酸分子包含编码TCRα链可变域的核苷酸序列SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.33。

SEQ ID NO.2：

ggagaggatgtggagcagagtcttttcctgagtgtccgagagggagacagctccgttataaactgcacttacacagacagctcctccacctacttatactggtataagcaagaacctggagcaggtctccagttgctgacgtatattttttcaaatatggacatgaaacaagaccaaagactcactgttctattgaataaaaaggataaacatctgtctctgcgcattgcagacacccagactggggactcagctatctacttctgtgcagagcagagctttggaaatgagaaattaacctttgggactggaacaagactcaccatcataccc。

SEQ ID NO.33：

ggtgaagatgttgaacaaagcctgagcctgagcgtgcgcgaaggcgatagcgtggttattaattgcacctataccgatagtagcagtacctatctgtattggtataaacaggaaccgggcgcaggtctgcagctgctgacctatattttcagtaatatggatatgaagcaggatcagcgcctgaccgttctgctgaataagaaagataaacatctgagcctgcgtattgccgatgttcagaccggtgacagcgcaatctatttctgtgccgaacagagttttggcaatgaaaagctgacctttggtaccggtacccgtctgaccgttaccccg。

在另一优选例中，所述核酸分子包含编码TCRβ链可变域的核苷酸序列SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.35。

SEQ ID NO.6：

aatgctggtgtcactcagaccccaaaattccgggtcctgaagacaggacagagcatgacactgctgtgtgcccaggatatgaaccatgaatacatgtactggtatcgacaagacccaggcatggggctgaggctgattcattactcagttggtgagggtacaactgccaaaggagaggtccctgatggctacaatgtctccagattaaaaaaacagaatttcctgctggggttggagtcggctgctccctcccaaacatctgtgtacttctgtgccagcagtttgggcagagcgtacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcaca。

SEQ ID NO.35：

aatgccggtgttacccagaccccgaaatatctgagcgttaaaaccggccagagtgttaccctgctgtgcgcccaggatatgaatcatgaatatatgtattggtaccgccaggaccctggccagggtctgcgcttaattcattatagtgtgggtgaaggtaccaccgcaaaaggcgaagtgccggatcgttataatgtgagtcgcctgaagaaacagaattttctgctgggcattgaaagtgtgaccccgagtgataccagcgtgtatttctgtgcaagtagcctgggtcgtgcctatgaacagtattttggcccgggtacccgcctgaccgtgacc。

在另一优选例中，所述核酸分子包含编码TCRα链的核苷酸序列SEQ ID NO.4和/或包含编码TCRβ链的核苷酸序列SEQ ID NO.8。

SEQ ID NO.4：

ggagaggatgtggagcagagtcttttcctgagtgtccgagagggagacagctccgttataaactgcacttacacagacagctcctccacctacttatactggtataagcaagaacctggagcaggtctccagttgctgacgtatattttttcaaatatggacatgaaacaagaccaaagactcactgttctattgaataaaaaggataaacatctgtctctgcgcattgcagacacccagactggggactcagctatctacttctgtgcagagcagagctttggaaatgagaaattaacctttgggactggaacaagactcaccatcatacccaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc。

SEQ ID NO.8：

aatgctggtgtcactcagaccccaaaattccgggtcctgaagacaggacagagcatgacactgctgtgtgcccaggatatgaaccatgaatacatgtactggtatcgacaagacccaggcatggggctgaggctgattcattactcagttggtgagggtacaactgccaaaggagaggtccctgatggctacaatgtctccagattaaaaaaacagaatttcctgctggggttggagtcggctgctccctcccaaacatctgtgtacttctgtgccagcagtttgggcagagcgtacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgctgatggccatggtcaagagaaaggattccagaggc。

第四方面，本发明提供一种载体，所述载体包括第三方面所述的核酸分子。

优选地，所述载体包括病毒载体。

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体。

第五方面，本发明提供一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞中包括第四方面所述的载体或染色体中整合有外源的第三方面所述的核酸分子。

第六方面，本发明提供一种细胞，所述细胞转导了第三方面所述的核酸分子或第四方面所述的载体。

优选地，所述细胞包括T细胞、NK细胞、NKT细胞或干细胞。

第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的TCR、第二方面所述的TCR复合物、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的载体或第六方面所述的细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

第八方面，本发明提供第一方面所述的TCR、第二方面所述的TCR复合物或第六方面所述的细胞的用途，所述用途包括用于制备治疗肿瘤和/或自身免疫疾病的药物。

优选地，所述肿瘤包括MAGE-A4阳性肿瘤。

第九方面，本发明提供第一方面所述的TCR、或本发明第二方面所述的TCR复合物、或第六方面所述的细胞用作治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物。

优选地，所述肿瘤包括MAGE-A4阳性肿瘤。

第十方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，所述治疗疾病的方法包括给需要治疗的对象施用适量的第一方面所述的TCR、第二方面所述的TCR复合物、第六方面所述的细胞或第七方面所述的药物组合物。

优选地，所述疾病包括肿瘤。

优选地，所述肿瘤包括MAGE-A4阳性肿瘤。

本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的TCR能够与MAGE-A4抗原短肽复合物GVYDGREHTV-HLA A0201特异性结合，同时转导了本发明所述TCR的效应细胞能够被特异性激活。

附图说明

图1是实施例1中单克隆细胞的CD8-APC及四聚体-PE双阳性染色结果。

图2是实施例1中T细胞克隆的ELISPOT激活功能验证结果。

图3是实施例3中可溶性TCR的SDS-PAGE检测结果图，图中，泳道1为还原胶，泳道2为非还原胶，泳道M1和泳道M2为分子量标记(marker)。

图4是实施例5中可溶性单链TCR的SDS-PAGE检测结果图，图中，泳道1为还原胶，泳道2为非还原胶，泳道M1和泳道M2为分子量标记(marker)。

图5是实施例6中可溶性的TCR分子与GVYDGREHTV-HLA A0201复合物结合的动力学图谱。

图6是实施例6中可溶性单链TCR分子与GVYDGREHTV-HLA A0201复合物结合的动力学图谱。

图7是实施例7中针对负载短肽的T2细胞，转染本发明TCR的效应细胞的ELISPOT激活功能验证结果。

图8是实施例8中针对肿瘤细胞系，转染本发明的TCR的效应细胞的ELISPOT激活功能验证结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

在本发明中，发明人经过广泛而深入的研究，找到了与MAGE-A4抗原短肽GVYDGREHTV能够特异性结合的TCR，所述抗原短肽GVYDGREHTV可与HLA A0201形成复合物并一起被呈递到细胞表面。

本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外，本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。

本发明中的相关术语：

(1)MHC分子与T细胞受体

MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白质，可以是Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子。因此，其对于抗原的呈递具有特异性，不同的个体有不同的MHC，能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC细胞表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。

T细胞受体(TCR)是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，从而引起一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异质二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在95％的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异质二聚TCR具有α链和β链，α链和β链构成αβ异源二聚TCR的亚单位。广义上讲，α和β各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但所述多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个CDR(互补决定区)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与pMHC复合物的结合，其中CDR3由可变区和连接区重组而成，被称为超变区。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域，可变域由连接的可变区和连接区构成。TCR恒定域的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的公开数据库中找到，如TCR分子α链的恒定域序列为“TRAC*01”，TCR分子β链的恒定域序列为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区，所述胞质区很短。

在本发明中，术语“本发明多肽”、“本发明的TCR”、“本发明所述TCR”、“本发明的T细胞受体”可互换使用。

(2)天然链间二硫键与人工链间二硫键

在天然TCR的近膜区Cα与Cβ链间存在一组二硫键，本发明中称为“天然链间二硫键”。在本发明中，将人工引入的，位置与天然链间二硫键的位置不同的链间共价二硫键称为“人工链间二硫键”。

为方便描述二硫键的位置，本发明中TRAC*01与TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序列的位置编号按从N端到C端依次的顺序进行位置编号，如TRBC1*01或TRBC2*01中，按从N端到C端依次的顺序第60个氨基酸为P(脯氨酸)，则本发明中可将其描述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Pro60，也可将其表述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸，又如TRBC1*01或TRBC2*01中，按从N端到C端依次的顺序第61个氨基酸为Q(谷氨酰胺)，则本发明中可将其描述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Gln61，也可将其表述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸，其他以此类推。本发明中，可变区TRAV与TRBV的氨基酸序列的位置编号，按照IMGT中列出的位置编号。如TRAV中的某个氨基酸，IMGT中列出的位置编号为46，则本发明中将其描述为TRAV第46位氨基酸，其他以此类推。本发明中，其他氨基酸的序列位置编号有特殊说明的，则按特殊说明。

本发明的发明详述：

本发明中的TCR分子：

在抗原加工过程中，抗原在细胞内被降解，然后通过MHC分子携带至细胞表面。T细胞受体能够识别抗原呈递细胞表面的肽-MHC复合物。因此，本发明的第一方面提供了一种能够结合GVYDGREHTV-HLA A0201复合物的TCR分子。

优选地，所述TCR分子是分离的或纯化的。所述TCR的α和β链各具有3个互补决定区(CDR)。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述TCR的α链包含具有以下氨基酸序列的CDR：

αCDR1-DSSSTY SEQ ID NO.10

αCDR2-IFSNMDM SEQ ID NO.11

αCDR3-AEQSFGNEKLT SEQ ID NO.12；和/或

所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为：

βCDR1-MNHEY SEQ ID NO.13

βCDR2-SVGEGT SEQ ID NO.14

βCDR3-ASSLGRAYEQY SEQ ID NO.15。

在本发明中，可以将所述CDR区的氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌合TCR。只要框架结构与本发明的TCR的CDR区兼容，本领域技术人员根据本发明公开的CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的TCR分子。因此，本发明TCR分子是指包含上述α和/或β链CDR区序列及任何适合的框架结构的TCR分子。

本发明TCRα链可变域为与SEQ ID NO.1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，优选为95％序列同一性的氨基酸序列，更进一步优选为98％序列同一性的氨基酸序列；

和/或本发明TCRβ链可变域为与SEQ ID NO.5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，优选为95％序列同一性的氨基酸序列，更进一步优选为98％序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的一个优选例中，所述TCR分子是由α与β链构成的异质二聚体。

具体地，一方面所述异质二聚TCR分子的α链包含可变域和恒定域，所述α链可变域氨基酸序列包含：

αCDR1-DSSSTY SEQ ID NO.10

αCDR2-IFSNMDM SEQ ID NO.11

αCDR3-AEQSFGNEKLT SEQ ID NO.12。

优选地，所述TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.1。

更优选地，所述TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

另一方面，所述异质二聚TCR分子的β链包含可变域和恒定域，所述β链可变域氨基酸序列包含：

βCDR1-MNHEY SEQ ID NO.13

βCDR2-SVGEGT SEQ ID NO.14

βCDR3-ASSLGRAYEQY SEQ ID NO.15。

优选地，所述TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.5。

更优选地，所述TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO.5。

在本发明的一个优选例中，所述TCR分子是由α链的部分或全部，和/或β链的部分或全部组成的单链TCR分子。有关单链TCR分子的描述可以参考文献(Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658)。根据文献中所述，本领域技术人员能够容易地构建包含本发明CDRs区的单链TCR分子。

具体地，所述单链TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ，优选地按照从N端到C端的顺序连接。

所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列包含：

αCDR1-DSSSTY SEQ ID NO.10

αCDR2-IFSNMDM SEQ ID NO.11

αCDR3-AEQSFGNEKLT SEQ ID NO.12。

优选地，所述单链TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.1。

更优选地，所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列包含：

βCDR1-MNHEY SEQ ID NO.13

βCDR2-SVGEGT SEQ ID NO.14

βCDR3-ASSLGRAYEQY SEQ ID NO.15。

优选地，所述单链TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO.5。

更优选地，所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO.5。

在本发明的一个优选例中，所述TCR分子的恒定域是人的恒定域。本领域技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库来获得人的恒定域氨基酸序列。例如，本发明TCR分子α链的恒定域序列可以为“TRAC*01”，TCR分子β链的恒定域序列可以为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中给出的氨基酸序列的第53位为Arg，在此表示为：TRAC*01外显子1的Arg53，其他以此类推。优选地，本发明TCR分子α链的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，和/或β链的氨基酸序列为SEQ ID NO.7。

天然存在的TCR是一种膜蛋白，通过其跨膜区得以稳定。如同免疫球蛋白(抗体)作为抗原识别分子一样，TCR也可以被开发应用于诊断和治疗，这时需要获得可溶性的TCR分子。可溶性的TCR分子不包括其跨膜区。可溶性TCR有很广泛的用途，它不仅可用于研究TCR与pMHC的相互作用，也可用作检测感染的诊断工具或作为自身免疫病的标志物。类似地，可溶性TCR可以被用来将治疗剂(如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)输送到呈递特异性抗原的细胞中，另外，可溶性TCR还可与其他分子(如，抗-CD3抗体)结合来重新定向T细胞，从而使其靶向呈递特定抗原的细胞。本发明也获得了对MAGE-A4抗原短肽具有特异性的可溶性TCR。

为获得可溶性TCR，一方面，本发明所述TCR可以是在其α和β链恒定域的残基之间引入人工二硫键的TCR。半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域间形成人工链间二硫键。半胱氨酸残基可以取代在天然TCR中合适位点的其他氨基酸残基以形成人工链间二硫键。例如，取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57的半胱氨酸残基来形成二硫键。

引入半胱氨酸残基以形成二硫键的其他位点还可以是：

TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77；

TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17；

TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59；

TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15；

TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54；

TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19；

或TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。

即半胱氨酸残基取代了上述α与β链恒定域中任意一组位点。可在本发明TCR恒定域的一个或多个C末端截短最多50个、或最多30个、或最多15个、或最多10个、或最多8个或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨酸残基来达到缺失天然二硫键的目的，也可通过将形成天然二硫键的半胱氨酸残基突变为另一氨基酸来达到上述目的。

如上所述，本发明所述的TCR可以包含在其α和β链恒定域的残基间引入的人工二硫键。应注意，恒定域间含或不含上文所述的引入的人工二硫键，本发明所述的TCR均可含有TRAC恒定域序列，和TRBC1或TRBC2恒定域序列。所述TCR的TRAC恒定域序列，和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通过存在于TCR中的天然二硫键连接。

为获得可溶性TCR，另一方面，本发明所述的TCR还包括在所述TCR的疏水芯区域发生突变的TCR，这些疏水芯区域的突变优选为能够使本发明可溶性TCR的稳定性提高的突变，如在公开号为WO2014/206304的专利文献中所述。

所述TCR可在其下列可变域疏水芯位置发生突变：

(α和/或β链)可变区氨基酸第11、第13、第19、第21、第53、第76、第89、第91、第94位，和/或α链J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒数第3、倒数第5、倒数第7位，和/或β链J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒数第2、倒数第4、倒数第6位，其中氨基酸序列的位置编号按国际免疫遗传学信息系统(IMGT)中列出的位置编号。本领域技术人员知晓上述国际免疫遗传学信息系统，并可根据该数据库得到不同TCR的氨基酸残基在IMGT中的位置编号。

本发明中疏水芯区域发生突变的TCR可以是由一柔性肽链连接TCR的α与β链的可变域而构成的稳定性可溶单链TCR。应注意，本发明中柔性肽链可以是任何适合连接TCRα与β链可变域的肽链。

另外，对于稳定性而言，专利文献201680003540.2还公开了在TCR的α链可变区与β链恒定区之间引入人工链间二硫键能够使TCR的稳定性显著提高。因此，本发明所述的TCR的α链可变区与β链恒定区之间还可以含有人工链间二硫键。

具体地，在所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了：

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸；

TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸；

TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸；

或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。

优选地，所述的TCR可以包含：

(ⅰ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链，和(ⅱ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链，其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR链的可变域和至少一部分恒定域，α链与β链形成异质二聚体。

更优选地，所述TCR可以包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但所述TCR不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。

本发明所述的TCR也可以以多价复合体的形式提供。本发明所述的多价TCR复合体包含至少2个以上所述TCR相结合而形成的多聚物。例如，可以用p53的四聚结构域来产生四聚体，或多个本发明所述的TCR与另一分子结合而形成的复合物。本发明所述的TCR复合物可用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也可用于产生具有此类应用的其他多价TCR复合物的中间体。

本发明所述的TCR可以单独使用，也可与偶联物以共价或其他方式结合，优选为以共价方式结合。

所述偶联物包括可检测标记物(所述可检测标记物用于诊断目的，其中所述TCR用于检测呈递GVYDGREHTV-HLA A0201复合物的细胞的存在)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分中任意一种或至少两种的组合。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)、CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明所述TCR结合或偶联的治疗剂包括但不限于：

(1)放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；

(2)生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy)51，565)；

(3)细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；

(4)抗体Fc片段(Mosquera等，2005，免疫学杂志(The Journal Of Immunology)174，4381)；

(5)抗体scFv片段(Zhu等，1995，癌症国际期刊(International Journal ofCancer)62,319)；

(6)金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；

(7)病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；

(8)脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancer research)65，11631)；

(9)纳米磁粒；

(10)前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；

(11)化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

另外，本发明所述的TCR还可以是包含衍生自超过一种物种序列的杂合TCR。例如，有研究显示鼠科TCR在人T细胞中比人TCR能够更有效地表达。因此，本发明所述TCR可包含人可变域和鼠的恒定域。这一方法的缺陷是可能引发免疫应答。因此，在其用于过继性T细胞治疗时应当有调节方案来进行免疫抑制，以允许表达鼠科的T细胞的植入。

应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示，氨基酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。

本发明中的核酸分子：

本发明的第二方面提供了编码本发明第一方面所述TCR或所述TCR部分的核酸分子，所述部分可以是一个或多个CDR，α和/或β链的可变域，以及α链和/或β链。

编码本发明第一方面所述TCR分子α链CDR区的核苷酸序列如下：

CDR1α-gacagctcctccacctac SEQ ID NO.16

CDR2α-attttttcaaatatggacatg SEQ ID NO.17

CDR3α-gcagagcagagctttggaaatgagaaattaacc SEQ ID NO.18；

编码本发明第一方面所述TCR分子β链CDR区的核苷酸序列如下：

CDR1β-atgaaccatgaatac SEQ ID NO.19

CDR2β-tcagttggtgagggtaca SEQ ID NO.20

CDR3β-gccagcagtttgggcagagcgtacgagcagtac SEQ ID NO.21。

因此，编码本发明所述TCRα链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，和/或编码本发明TCRβ链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21。

本发明所述核酸分子的核苷酸序列可以是单链或双链的，所述核酸分子可以是RNA或DNA，并且可以包含或不包含内含子。优选地，本发明所述核酸分子的核苷酸序列不包含内含子但能够编码本发明多肽，例如编码本发明TCRα链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2和/或编码本发明TCRβ链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO.6。或者，编码本发明TCRα链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEG ID NO.33和/或编码本发明TCRβ链可变域的发明核酸分子的核苷酸序列包括SEG IDNO.35。更优选地，本发明所述核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.8。或者，本发明所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.31。

应理解，由于遗传密码的简并，不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽。因此，编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。以本发明中的其中一个例子来说明，“简并的变异体”是指编码具有SEQ ID NO.1的蛋白序列，但与SEQ ID NO.2的序列有差别的核酸序列。

核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的，可以根据细胞的类型，改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。

本发明所述的核酸分子全长序列或片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明所述TCR、所述TCR的片段或所述TCR的衍生物的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明中所述的载体：

本发明还涉及包含本发明所述的核酸分子的载体，包括表达载体，即能够在体内或体外表达的构建体。常用的载体包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。

病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体或杆状病毒载体。

优选地，所述载体可以将本发明的核苷酸转移至细胞中，例如T细胞中，使得所述细胞表达MAGE-A4抗原特异性的TCR。理想的情况下，所述载体应当能够在T细胞中持续高水平地表达。

本发明中所述的细胞：

本发明还涉及用本发明所述的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞中含有所述载体或染色体中整合有所述核酸分子。宿主细胞选自：原核细胞和真核细胞，例如大肠杆菌、酵母细胞或CHO细胞。

另外，本发明还包括表达本发明所述的TCR的分离的细胞，可以但不仅限为T细胞、NK细胞、NKT细胞或干细胞中任意一种或至少两种的组合，特别是T细胞。所述T细胞可衍生自从受试对象分离的T细胞，或者可以是从受试对象中分离的混合细胞群，诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。例如，所述细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC)，可以是CD4⁺辅助T细胞或CD8⁺细胞毒性T细胞。所述细胞可在CD4⁺辅助T细胞/CD8⁺细胞毒性T细胞的混合群中。一般地，所述细胞可以用抗体(例如，抗-CD3或抗-CD28的抗体)活化，以便使它们能够更容易接受转染，例如用包含编码本发明所述TCR的核苷酸序列的载体进行转染。

备选地，本发明所述的细胞还可以是或衍生自干细胞，如造血干细胞(HSC)。将基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR，因为干细胞表面不表达CD3分子。然而，当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时，CD3分子的表达将启动在胸腺细胞的表面表达所述引入的TCR分子。

有许多方法适合于用编码本发明所述TCR的DNA或RNA进行T细胞转染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表达本发明所述TCR的T细胞可以用于过继免疫治疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如，Rosenberg等.，(2008)Nat Rev Cancer8(4)：299-308)。

本发明中MAGE-A4抗原相关疾病：

本发明还涉及在受试对象中治疗和/或预防与MAGE-A4相关疾病的方法，包括过继性转移MAGE-A4特异性T细胞至该受试对象的步骤。所述MAGE-A4特异性T细胞可识别GVYDGREHTV-HLA A0201复合物。

本发明所述的MAGE特异性的T细胞可用于治疗任何呈递MAGE-A4抗原短肽GVYDGREHTV-HLA A0201复合物的MAGE-A4相关疾病，包括但不限于肿瘤，如黑色素瘤以及其他固体肿瘤，固体肿瘤例如胃癌、肺癌、食道癌、膀胱癌或头颈部鳞状细胞癌等。

本发明中的治疗方法：

可以通过分离患有与MAGE-A4抗原相关疾病的受试对象的T细胞，并将本发明所述的TCR导入上述T细胞中，随后将这些基因工程修饰的细胞回输到受试对象体内来进行治疗。因此，本发明提供了一种治疗MAGE-A4相关疾病的方法，包括将分离的表达本发明TCR的T细胞输入到受试对象体内。优选地，所述T细胞来源于受试对象本身。一般地，所述治疗MAGE-A4相关疾病的方法包括：(1)分离受试对象的T细胞；(2)用本发明所述核酸分子或能够编码本发明所述TCR分子的核酸分子体外转导T细胞；(3)将基因工程修饰的T细胞输入到受试对象体内。分离、转染及回输的细胞的数量可以由医师决定。

本发明的主要优点在于：

本发明的TCR能够与MAGE-A4抗原短肽复合物GVYDGREHTV-HLA A0201特异性结合，同时转导了本发明TCR的效应细胞能够被特异性激活。

实施例1

克隆MAGE-A4抗原短肽特异性T细胞

利用合成短肽(所述合成短肽的氨基酸序列为GVYDGREHTV，由江苏金斯瑞生物科技有限公司合成)刺激来自于基因型为HLA-A0201的健康受试对象的外周血淋巴细胞(PBL)。将GVYDGREHTV短肽与带有生物素标记的HLA-A0201复性，制备pMHC单倍体。这些单倍体与用PE标记的链霉亲和素(BD公司)组合成PE标记的四聚体，分选该四聚体及抗-CD8-APC双阳性细胞。扩增分选的细胞，并按以上方法进行二次分选，随后用有限稀释法进行单克隆。单克隆细胞用四聚体染色，筛选到的双阳性克隆如图1所示。经过层层筛选得到的双阳性克隆，还需要满足进一步的功能测试。

IFN-γ是活化T淋巴细胞产生的一种强有力的免疫调节因子，因此本实施例通过本领域技术人员熟知的ELISPOT实验检测IFN-γ数以验证转染TCR的细胞的激活功能及抗原特异性。通过ELISPOT实验进一步检测所述T细胞克隆的功能及特异性。本实施例IFN-γELISPOT实验中所用的效应细胞为所得T细胞克隆，靶细胞为负载了GVYDGREHTV短肽的T2细胞、H1299-A2(指转染HLA-A0201的H1299细胞)和U266B1，对照组为负载了其他抗原短肽的T2细胞和MCF-7。其中，T2细胞、U266B1细胞和MCF-7均购自ATCC，H1299细胞购自中国科学院细胞库。

首先准备ELISPOT平板，ELISPOT实验步骤如下：按以下顺序将试验的各个组分加入ELISPOT平板：靶细胞20000个/孔、效应细胞2000个/孔，在实验组和对照组加入20μL相应的短肽，T2负载的短肽终浓度为10～5M，空白组加入20μL培养基(试验培养基)，并设置2复孔。然后温育过夜(37℃，5％CO₂)。随后洗涤平板并进行二级检测和显色，干燥平板1h，再利用免疫斑点平板读数计(ELISPOT READER system；AID公司)计数膜上形成的斑点。

T细胞克隆的ELISPOT激活功能验证结果如图2所示，得到的T细胞克隆对负载了GVYDGREHTV短肽的T2细胞、H1299-A2和U266B1高释放IFN-γ，而对负载了其他抗原短肽的T2细胞及MCF-7基本无反应。

实施例2

获取MAGE-A4抗原短肽特异性T细胞的TCR基因

用Quick-RNA^TMMiniPrep(ZYMO research)抽提实施例1中筛选到的抗原短肽GVYDGREHTV特异性、HLA-A0201限制性的T细胞克隆的总RNA。cDNA的合成采用clontech的SMART RACE cDNA扩增试剂盒，采用的引物是设计在人类TCR基因的C端保守区。将序列克隆至T载体(TAKARA)上进行测序。应注意，所述序列为互补序列，不包含内含子。

经测序，所述双阳性克隆表达的TCR中：

TCRα链可变域氨基酸序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，TCRα链可变域核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，TCRα链氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，TCRα链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具有前导序列的TCRα链氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，具有前导序列的TCRα链核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；

TCRβ链可变域氨基酸序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，TCRβ链可变域核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，TCRβ链氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，TCRβ链核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具有前导序列的TCRβ链氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，具有前导序列的TCRβ链核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

经鉴定，α链包含具有以下氨基酸序列的CDR：

αCDR1-DSSSTY SEQ ID NO.10

αCDR2-IFSNMDM SEQ ID NO.11

αCDR3-AEQSFGNEKLT SEQ ID NO.12；

β链包含具有以下氨基酸序列的CDR：

βCDR1-MNHEY SEQ ID NO.13

βCDR2-SVGEGT SEQ ID NO.14

βCDR3-ASSLGRAYEQY SEQ ID NO.15。

SEQ ID NO.22：

KTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEQSFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS。

SEQ ID NO.23：

aagacatttgctggattttcgttcctgtttttgtggctgcagctggactgtatgagtagaggagaggatgtggagcagagtcttttcctgagtgtccgagagggagacagctccgttataaactgcacttacacagacagctcctccacctacttatactggtataagcaagaacctggagcaggtctccagttgctgacgtatattttttcaaatatggacatgaaacaagaccaaagactcactgttctattgaataaaaaggataaacatctgtctctgcgcattgcagacacccagactggggactcagctatctacttctgtgcagagcagagctttggaaatgagaaattaacctttgggactggaacaagactcaccatcatacccaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc。

SEQ ID NO.24：

SLGLLCCGAFSLLWAGPVNAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASSLGRAYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG。

SEQ ID NO.25：

agcctcgggctcctgtgctgtggggccttttctctcctgtgggcaggtccagtgaatgctggtgtcactcagaccccaaaattccgggtcctgaagacaggacagagcatgacactgctgtgtgcccaggatatgaaccatgaatacatgtactggtatcgacaagacccaggcatggggctgaggctgattcattactcagttggtgagggtacaactgccaaaggagaggtccctgatggctacaatgtctccagattaaaaaaacagaatttcctgctggggttggagtcggctgctccctcccaaacatctgtgtacttctgtgccagcagtttgggcagagcgtacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgctgatggccatggtcaagagaaaggattccagaggc。

实施例3

MAGE-A4抗原短肽特异性可溶TCR的表达、重折叠和纯化

为获得可溶的TCR分子，本发明的TCR分子的α和β链可以分别只包含其可变域及部分恒定域，并且α和β链的恒定域中分别引入了一个半胱氨酸残基以形成人工链间二硫键。所述α链的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述述α链的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；所述β链的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述β链的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。通过《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的标准方法将上述TCRα和β链的目的基因序列经合成后分别插入到表达载体pET28a⁺(Novagene)，上下游的克隆位点分别是Nco I和Not I。插入片段经过测序确认无误。

将TCRα链和TCRβ链的表达载体分别通过化学转化法转化进入表达细菌BL21(DE3)，细菌用LB培养液生长，于OD₆₀₀＝0.6时，用终浓度0.5mM IPTG诱导，TCR的α和β链表达后形成的包涵体通过BugBuster Mix(Novagene)进行提取，并且经BugBuster溶液反复多次洗涤，包涵体最后溶解于缓冲溶液中，所述缓冲溶液包含6M盐酸胍、10mM二硫苏糖醇(DTT)、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)和20mM Tris(pH8.1)。

溶解后的TCRα链和TCRβ链以1:1的质量比快速混合于5M尿素、0.4M精氨酸、20mMTris(pH 8.1)、3.7mM cystamine和6.6mMβ-mercapoethylamine(4℃)中，终浓度为60mg/mL。混合后将溶液置于10倍体积的去离子水中透析(4℃)，12h后将去离子水换成缓冲液(20mM Tris，pH8.0)继续于4℃透析12h。透析完成后的溶液经0.45μM的滤膜过滤后，通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP，5ml，GE Healthcare)纯化。洗脱峰含有复性成功的α和β二聚体的TCR，通过SDS-PAGE胶确认。TCR随后通过凝胶过滤层析(HiPrep 16/60，Sephacryl S-100HR，GE Healthcare)进一步纯化。纯化后的TCR纯度经过SDS-PAGE测定大于90％，浓度由BCA法确定。本发明得到的可溶性TCR的SDS-PAGE检测结果图如图3所示，泳道1为还原胶，泳道2为非还原胶，泳道M1和泳道M2为分子量标记(marker)。

SEQ ID NO.27：

ggtgaagatgttgaacagagtcttttcctgagtgtccgagagggagacagctccgttataaactgcacttacacagacagctcctccacctacttatactggtataagcaagaacctggagcaggtctccagttgctgacgtatattttttcaaatatggacatgaaacaagaccaaagactcactgttctattgaataaaaaggataaacatctgtctctgcgcattgcagacacccagactggggactcagctatctacttctgtgcagagcagagctttggaaatgagaaattaacctttgggactggaacaagactcaccatcatacccaatatccagaaccctgaccctgccgtttatcagctgcgtgatagcaaaagcagcgataaaagcgtgtgcctgttcaccgattttgatagccagaccaacgtgagccagagcaaagatagcgatgtgtacatcaccgataaaaccgtgctggatatgcgcagcatggatttcaaaagcaatagcgcggttgcgtggagcaacaaaagcgattttgcgtgcgcgaacgcgtttaacaacagcatcatcccggaagatacgttcttctgcagcccagaaagttcc。

SEQ ID NO.29：

aacgcgggcgtgacccagaccccaaaattccgggtcctgaagacaggacagagcatgacactgctgtgtgcccaggatatgaaccatgaatacatgtactggtatcgacaagacccaggcatggggctgaggctgattcattactcagttggtgagggtacaactgccaaaggagaggtccctgatggctacaatgtctccagattaaaaaaacagaatttcctgctggggttggagtcggctgctccctcccaaacatctgtgtacttctgtgccagcagtttgggcagagcgtacgagcagtacttcgggccgggcaccaggctcacggtcacagaggacctgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaatgcgaaattagccatacccagaaagcgaccctggtttgtctggcgaccggtttttatccggatcatgtggaactgtcttggtgggtgaacggcaaagaagtgcatagcggtgtttctaccgatccgcagccgctgaaagaacagccggcgctgaatgatagccgttatgcgctgtctagccgtctgcgtgttagcgcgaccttttggcaaaatccgcgtaaccattttcgttgccaggtgcagttttatggcctgagcgaaaacgatgaatggacccaggatcgtgcgaagccggttacccagattgttagcgcggaagcctggggccgcgcagat。

实施例4

MAGE-A4抗原短肽特异性的可溶性单链TCR的产生

根据专利文献WO2014/206304中所述，利用定点突变的方法将实施例2中TCRα与β链的可变域构建成了一个以柔性短肽(linker)连接的稳定的可溶性单链TCR分子。所述单链TCR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述单链TCR分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.31所示。所述linker的氨基酸序列及核苷酸序列以下划线标出。所述单链TCR分子的α链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；所述单链TCR分子的β链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。

SEQ ID NO.30：

GEDVEQSLSLSVREGDSVVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADVQTGDSAIYFCAEQSFGNEKLTFGTGTRLTVTPGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGTGNAGVTQTPKYLSVKTGQSVTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGQGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDRYNVSRLKKQNFLLGIESVTPSDTSVYFCASSLGRAYEQYFGPGTRLTVT。

SEQ ID NO.31：

ggtgaagatgttgaacaaagcctgagcctgagcgtgcgcgaaggcgatagcgtggttattaattgcacctataccgatagtagcagtacctatctgtattggtataaacaggaaccgggcgcaggtctgcagctgctgacctatattttcagtaatatggatatgaagcaggatcagcgcctgaccgttctgctgaataagaaagataaacatctgagcctgcgtattgccgatgttcagaccggtgacagcgcaatctatttctgtgccgaacagagttttggcaatgaaaagctgacctttggtaccggtacccgtctgaccgttaccccgggtggcggcagtgaaggcggtggtagcgaaggcggcggc agcgaaggtggtggtagtgaaggtggtaccggcaatgccggtgttacccagaccccgaaatatctgagcgttaaaaccggccagagtgttaccctgctgtgcgcccaggatatgaatcatgaatatatgtattggtaccgccaggaccctggccagggtctgcgcttaattcattatagtgtgggtgaaggtaccaccgcaaaaggcgaagtgccggatcgttataatgtgagtcgcctgaagaaacagaattttctgctgggcattgaaagtgtgaccccgagtgataccagcgtgtatttctgtgcaagtagcctgggtcgtgcctatgaacagtattttggcccgggtacccgcctgaccgtgacc。

将目的基因经Nco I和Not I双酶切，与经过Nco I和Not I双酶切的pET28a载体连接。连接产物转化至E.coli DH5α，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆进行PCR筛选，对阳性重组子进行测序，确定序列正确后抽提重组质粒转化至E.coliBL21(DE3)，用于表达。

实施例5

MAGE-A4抗原短肽特异性的可溶性单链TCR的表达、复性和纯化

将实施例4中制备的含有重组质粒pET28a-模板链的BL21(DE3)菌落全部接种于含有卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃继续培养4h。5000rpm离心15min收获细胞沉淀物，用Bugbuster Master Mix(Merck)裂解细胞沉淀物，6000rpm离心15min回收包涵体，再用Bugbuster(Merck)进行洗涤以除去细胞碎片和膜组分，6000rpm离心15min，收集包涵体。将包涵体溶解在缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，8M尿素)中，高速离心去除不溶物，上清液用BCA法定量后进行分装，于-80℃保存备用。

向5mg溶解的单链TCR包涵体蛋白中，加入2.5mL缓冲液(6M Gua-HCl，50mM Tris-HCl pH8.1、100mM NaCl和10mM EDTA)，再加入DTT至终浓度为10mM，37℃处理30min。用注射器向125mL复性缓冲液中滴加处理后的单链TCR，4℃搅拌10min，得到复性液，所述复性缓冲液由100mM Tris-HCl pH8.1、0.4M L-精氨酸、5M尿素、2mM EDTA、6.5mM EDTA、6.5mMβ-mercapthoethylamine和1.87mM Cystamine组成。然后将所述复性液装入截留量为4kDa的纤维素膜透析袋，透析袋置于1L预冷的水中，4℃缓慢搅拌过夜。

17h后，将透析液换成1L预冷的缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0)，4℃继续透析8h，然后将透析液换成相同的新鲜缓冲液继续透析过夜。

17h后，样品经0.45μm滤膜过滤，真空脱气后通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP,GEHealthcare)，用20mM Tris-HCl pH8.0配制的0～1M NaCl线性梯度洗脱液纯化蛋白，收集的洗脱组分进行SDS-PAGE分析，包含单链TCR的组分浓缩后采用凝胶过滤柱(Superdex7510/300,GE Healthcare)进行纯化，目标组分也进行SDS-PAGE分析。

用于BIAcore分析的洗脱组分采用凝胶过滤法测试其纯度。条件为：色谱柱Agilent Bio SEC-3(300A，Ф7.8×300mm)，流动相为150mM磷酸盐缓冲液，流速0.5mL/min，柱温25℃，紫外检测波长214nm。获得的可溶性单链TCR的SDS-PAGE检测结果图如图4所示，泳道1为还原胶，泳道2为非还原胶，泳道M1和泳道M2为分子量标记(marker)。

实施例6

本实施例通过BIAcore分析证明了可溶性的TCR分子能够与GVYDGREHTV-HLAA0201复合物特异性结合。

使用BIAcore T200实时分析系统检测实施例3中纯化的TCR分子与GVYDGREHTV-HLA A0201复合物的结合活性。将抗链霉亲和素的抗体(GenScript)加入偶联缓冲液(10mM醋酸钠缓冲液，pH4.77)，然后将抗体流过预先用EDC和NHS活化过的CM5芯片，使抗体固定在芯片表面，最后用乙醇胺的盐酸溶液封闭未反应的活化表面，完成偶联过程，偶联水平约为15000RU。

使低浓度的链霉亲和素流过已包被抗体的芯片表面，然后将GVYDGREHTV-HLAA0201复合物流过检测通道，另一通道作为参比通道，再将0.05mM的生物素以10μL/min的流速流过芯片2min，封闭链霉亲和素剩余的结合位点。

所述GVYDGREHTV-HLA A0201复合物的制备过程如下：

a.纯化

收集100mL诱导表达重链或轻链的E.coli菌液，于4℃、8000g离心10min后用10mLPBS洗涤菌体一次，之后用5mL BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)剧烈震荡重悬菌体，并于室温旋转孵育20min，之后于4℃、6000g离心15min，弃去上清，收集包涵体。

将所述包涵体重悬于5mL BugBuster Master Mix中，室温旋转孵育5min；加30mL稀释10倍的BugBuster，混匀，4℃、6000g离心15min；弃去上清，加30mL稀释10倍的BugBuster重悬包涵体，混匀，4℃、6000g离心15min，重复两次，加30mL 20mM Tris-HClpH8.0重悬包涵体，混匀，4℃、6000g离心15min，最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵体，SDS-PAGE检测包涵体纯度，BCA试剂盒测浓度。

b.复性

将合成的短肽GVYDGREHTV溶解于DMSO至20mg/mL的浓度。将轻链和重链的包涵体溶解(用8M尿素、20mM Tris pH8.0、10mM DTT来溶解)，复性前加入3M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA进一步变性。将GVYDGREHTV肽以25mg/L(终浓度)加入复性缓冲液(0.4M L-精氨酸、100mM Tris pH8.3、2mM EDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM还原型谷胱甘肽和0.2mMPMSF，冷却至4℃)，然后依次加入20mg/L的轻链(终浓度)和90mg/L的重链(终浓度)，重链分三次加入，8h/次，复性在4℃进行至少3天至完成，SDS-PAGE检测能否复性成功。

c.复性后纯化

用10体积的20mM Tris pH8.0作透析来更换复性缓冲液，至少更换缓冲液两次来充分降低溶液的离子强度。透析后用0.45μm醋酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液，然后加载到HiTrap Q HP(GE通用电气公司)阴离子交换柱上(5mL床体积)。利用Akta纯化仪(GE通用电气公司)，20mM Tris pH8.0配制的0-400mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白，pMHC约在250mMNaCl处洗脱，收集主峰组分，SDS-PAGE检测纯度。

d.生物素化

用Millipore超滤管将纯化的pMHC分子浓缩，同时将缓冲液置换为20mM TrispH8.0，然后加入生物素化试剂0.05M Bicine pH8.3、10mM ATP、10mM MgOAc、50μM D-Biotin和100μg/mL BirA酶(GST-BirA)，室温孵育混合物过夜，SDS-PAGE检测生物素化是否完全。

e.纯化生物素化后的复合物

用Millipore超滤管将生物素化标记后的pMHC分子浓缩至1mL，采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pMHC，利用Akta纯化仪(GE通用电气公司)，用过滤过的PBS预平衡HiPrep^TM16/60S200 HR柱(GE通用电气公司)，加载1mL浓缩过的生物素化pMHC分子，然后用PBS以1mL/min流速洗脱。生物素化的pMHC分子在55mL时作为单峰洗脱出现。合并含有蛋白质的组分，用Millipore超滤管浓缩，BCA法(Thermo)测定蛋白质浓度，加入蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)将生物素化的pMHC分子分装保存在-80℃。

对实施例5中纯化的可溶性单链TCR分子采用一致的方法进行计算动力学参数。

利用BIAcore Evaluation软件计算动力学参数，得到可溶性的TCR分子以及可溶性单链TCR分子与GVYDGREHTV-HLA A0201复合物结合的动力学图谱分别如图5和图6所示。图谱显示，本发明得到的可溶性TCR分子能够与GVYDGREHTV-HLA A0201复合物结合。同时，还利用以上方法检测了本发明可溶性的TCR分子与其他几种无关抗原短肽与HLA复合物的结合活性，结果显示本发明TCR分子与其他无关抗原均无结合。

实施例7

以负载短肽的T2细胞为靶细胞对转染TCR的效应细胞进行激活功能实验

本实验中所用的效应细胞是转染本发明TCR的CD3⁺T细胞，并以同一志愿者转染其他TCR(A6)的CD3⁺T细胞作为对照组。所用的靶细胞为负载了MAGE抗原短肽GVYDGREHTV的T2细胞，并以负载其他抗原短肽的以及空载的T2细胞作为对照。将试验的各组分加入ELISPOT孔板：靶细胞1×10⁴个/孔、效应细胞2×10³个/孔(按转染阳性率计算)，并设置两个复孔。然后在相应孔加入GVYDGREHTV短肽，使短肽在ELISPOT孔板中的终浓度为10^-6M。

ELISPOT平板乙醇活化包被，4℃过夜。实验第1天，去掉包被液，洗涤封闭，室温下孵育两个小时，去除封闭液，将试验的各个组分加入ELISPOT平板：靶细胞为1×10⁴个/孔，效应细胞为2×10³个/孔(按转染阳性率计算)，并设置二个复孔。温育过夜(37℃，5％CO₂)。实验第2天，洗涤平板并进行二级检测和显色，干燥平板，再利用免疫斑点平板读数计(ELISPOT READER system；AID20公司)计数膜上形成的斑点。

实验结果如图7所示，对负载GVYDGREHTV短肽的T2细胞，转染本发明TCR的T细胞有明显的激活效应，而负载其他短肽或空载的T2细胞，转染本发明TCR的T细胞基本无激活效应。

实施例8

以肿瘤细胞系为靶细胞对转染本发明TCR的效应细胞进行激活功能实验

本实施例同样通过ELISPOT实验检测本发明TCR在细胞中的功能及特异性。所用的效应细胞是表达本发明MAGE-A4抗原短肽特异性TCR的CD3⁺T细胞，并以同一志愿者转染其他TCR(A6)的CD3⁺T细胞作为对照组。所用阳性肿瘤细胞系为NCI-H1299-A0201(转染了HLA-A0201的NCI-H1299细胞)、A375、U-2OS、293T-MAGE-A4(转染了MAGE-A4的293T细胞)；所用阴性肿瘤细胞系为293T、HT1080，作为对照组。其中，A375、293T、HT1080均购自ATCC，U-2OS购自广州赛库生物技术有限公司，NCI-H1299购自中国科学院细胞库。

首先准备ELISPOT平板。ELISPOT平板乙醇活化包被，4℃过夜。实验第1天，去掉包被液，洗涤封闭，室温下孵育两个小时，去除封闭液，将试验的各个组分加入ELISPOT平板：靶细胞为2×10⁴个/孔，效应细胞为2×10³个/孔(按转染阳性率计算)，并设置二个复孔。温育过夜(37℃，5％CO₂)。实验第2天，洗涤平板并进行二级检测和显色，干燥平板，再利用免疫斑点平板读数计(ELISPOT READER system；AID20公司)计数膜上形成的斑点。

实验结果如图8所示，转染其他TCR的效应细胞对所有细胞系基本无活性；转染本发明TCR的效应细胞被阳性肿瘤细胞系特异性激活，而对阴性肿瘤细胞系基本无活性。

综上，本发明提供的识别MAGE-A4的T细胞受体能够与MAGE-A4抗原短肽复合物GVYDGREHTV-HLA A0201特异性结合，同时转导了本发明所述的T细胞受体的效应细胞能够被特异性激活。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 香雪生命科学技术（广东）有限公司

<120> 一种识别MAGE-A4的T细胞受体及其编码序列和应用

<130> 2022

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser Val Arg Glu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg Leu Thr Val Leu

50 55 60

Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile Ala Asp Thr Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Gln Ser Phe Gly Asn

85 90 95

Glu Lys Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Ile Ile Pro

100 105 110

<210> 2

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggagaggatg tggagcagag tcttttcctg agtgtccgag agggagacag ctccgttata 60

aactgcactt acacagacag ctcctccacc tacttatact ggtataagca agaacctgga 120

gcaggtctcc agttgctgac gtatattttt tcaaatatgg acatgaaaca agaccaaaga 180

ctcactgttc tattgaataa aaaggataaa catctgtctc tgcgcattgc agacacccag 240

actggggact cagctatcta cttctgtgca gagcagagct ttggaaatga gaaattaacc 300

tttgggactg gaacaagact caccatcata ccc 333

<210> 3

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser Val Arg Glu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg Leu Thr Val Leu

50 55 60

Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile Ala Asp Thr Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Gln Ser Phe Gly Asn

85 90 95

Glu Lys Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Ile Ile Pro Asn

100 105 110

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

115 120 125

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

130 135 140

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val

145 150 155 160

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

165 170 175

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

180 185 190

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val

195 200 205

Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln

210 215 220

Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly

225 230 235 240

Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

245 250

<210> 4

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggagaggatg tggagcagag tcttttcctg agtgtccgag agggagacag ctccgttata 60

aactgcactt acacagacag ctcctccacc tacttatact ggtataagca agaacctgga 120

gcaggtctcc agttgctgac gtatattttt tcaaatatgg acatgaaaca agaccaaaga 180

ctcactgttc tattgaataa aaaggataaa catctgtctc tgcgcattgc agacacccag 240

actggggact cagctatcta cttctgtgca gagcagagct ttggaaatga gaaattaacc 300

tttgggactg gaacaagact caccatcata cccaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 360

taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 420

tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 480

ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 540

gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 600

agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 660

ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 720

tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagc 756

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Arg Val Leu Lys Thr Gly

1 5 10 15

Gln Ser Met Thr Leu Leu Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Val Gly Glu Gly Thr Thr Ala Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Asn Val Ser Arg Leu Lys Lys Gln Asn Phe Leu Leu Gly Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly

85 90 95

Arg Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr

100 105 110

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aatgctggtg tcactcagac cccaaaattc cgggtcctga agacaggaca gagcatgaca 60

ctgctgtgtg cccaggatat gaaccatgaa tacatgtact ggtatcgaca agacccaggc 120

atggggctga ggctgattca ttactcagtt ggtgagggta caactgccaa aggagaggtc 180

cctgatggct acaatgtctc cagattaaaa aaacagaatt tcctgctggg gttggagtcg 240

gctgctccct cccaaacatc tgtgtacttc tgtgccagca gtttgggcag agcgtacgag 300

cagtacttcg ggccgggcac caggctcacg gtcaca 336

<210> 7

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Arg Val Leu Lys Thr Gly

1 5 10 15

Gln Ser Met Thr Leu Leu Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Val Gly Glu Gly Thr Thr Ala Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Asn Val Ser Arg Leu Lys Lys Gln Asn Phe Leu Leu Gly Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly

85 90 95

Arg Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr

100 105 110

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

115 120 125

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

130 135 140

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

145 150 155 160

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

180 185 190

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

195 200 205

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

210 215 220

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

225 230 235 240

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

245 250 255

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

260 265 270

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

275 280 285

Ser Arg Gly

290

<210> 8

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aatgctggtg tcactcagac cccaaaattc cgggtcctga agacaggaca gagcatgaca 60

ctgctgtgtg cccaggatat gaaccatgaa tacatgtact ggtatcgaca agacccaggc 120

atggggctga ggctgattca ttactcagtt ggtgagggta caactgccaa aggagaggtc 180

cctgatggct acaatgtctc cagattaaaa aaacagaatt tcctgctggg gttggagtcg 240

gctgctccct cccaaacatc tgtgtacttc tgtgccagca gtttgggcag agcgtacgag 300

cagtacttcg ggccgggcac caggctcacg gtcacagagg acctgaaaaa cgtgttccca 360

cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca 420

ctggtgtgcc tggccacagg cttctacccc gaccacgtgg agctgagctg gtgggtgaat 480

gggaaggagg tgcacagtgg ggtcagcaca gacccgcagc ccctcaagga gcagcccgcc 540

ctcaatgact ccagatactg cctgagcagc cgcctgaggg tctcggccac cttctggcag 600

aacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag 660

tggacccagg atagggccaa acctgtcacc cagatcgtca gcgccgaggc ctggggtaga 720

gcagactgtg gcttcacctc cgagtcttac cagcaagggg tcctgtctgc caccatcctc 780

tatgagatct tgctagggaa ggccaccttg tatgccgtgc tggtcagtgc cctcgtgctg 840

atggccatgg tcaagagaaa ggattccaga ggc 873

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val

1 5 10

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Ser Ser Ser Thr Tyr

1 5

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Ile Phe Ser Asn Met Asp Met

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Ala Glu Gln Ser Phe Gly Asn Glu Lys Leu Thr

1 5 10

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Asn His Glu Tyr

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Ser Val Gly Glu Gly Thr

1 5

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Ala Ser Ser Leu Gly Arg Ala Tyr Glu Gln Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gacagctcct ccacctac 18

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

attttttcaa atatggacat g 21

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcagagcaga gctttggaaa tgagaaatta acc 33

<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgaaccatg aatac 15

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcagttggtg agggtaca 18

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gccagcagtt tgggcagagc gtacgagcag tac 33

<210> 22

<211> 272

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Lys Thr Phe Ala Gly Phe Ser Phe Leu Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp

1 5 10 15

Cys Met Ser Arg Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser Val

20 25 30

Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser

35 40 45

Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln

50 55 60

Leu Leu Thr Tyr Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg

65 70 75 80

Leu Thr Val Leu Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile

85 90 95

Ala Asp Thr Gln Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Gln

100 105 110

Ser Phe Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr

115 120 125

Ile Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg

130 135 140

Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp

145 150 155 160

Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr

165 170 175

Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser

180 185 190

Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe

195 200 205

Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser

210 215 220

Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn

225 230 235 240

Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu

245 250 255

Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

260 265 270

<210> 23

<211> 816

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aagacatttg ctggattttc gttcctgttt ttgtggctgc agctggactg tatgagtaga 60

ggagaggatg tggagcagag tcttttcctg agtgtccgag agggagacag ctccgttata 120

aactgcactt acacagacag ctcctccacc tacttatact ggtataagca agaacctgga 180

gcaggtctcc agttgctgac gtatattttt tcaaatatgg acatgaaaca agaccaaaga 240

ctcactgttc tattgaataa aaaggataaa catctgtctc tgcgcattgc agacacccag 300

actggggact cagctatcta cttctgtgca gagcagagct ttggaaatga gaaattaacc 360

tttgggactg gaacaagact caccatcata cccaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420

taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480

tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 540

ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600

gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660

agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720

ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780

tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagc 816

<210> 24

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Ser Leu Gly Leu Leu Cys Cys Gly Ala Phe Ser Leu Leu Trp Ala Gly

1 5 10 15

Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Arg Val Leu Lys

20 25 30

Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Leu Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu

35 40 45

Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile

50 55 60

His Tyr Ser Val Gly Glu Gly Thr Thr Ala Lys Gly Glu Val Pro Asp

65 70 75 80

Gly Tyr Asn Val Ser Arg Leu Lys Lys Gln Asn Phe Leu Leu Gly Leu

85 90 95

Glu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser

100 105 110

Leu Gly Arg Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr

115 120 125

Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

130 135 140

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

145 150 155 160

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

165 170 175

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro

180 185 190

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser

195 200 205

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe

210 215 220

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

225 230 235 240

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

245 250 255

Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val

260 265 270

Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu

275 280 285

Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg

290 295 300

Lys Asp Ser Arg Gly

305

<210> 25

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agcctcgggc tcctgtgctg tggggccttt tctctcctgt gggcaggtcc agtgaatgct 60

ggtgtcactc agaccccaaa attccgggtc ctgaagacag gacagagcat gacactgctg 120

tgtgcccagg atatgaacca tgaatacatg tactggtatc gacaagaccc aggcatgggg 180

ctgaggctga ttcattactc agttggtgag ggtacaactg ccaaaggaga ggtccctgat 240

ggctacaatg tctccagatt aaaaaaacag aatttcctgc tggggttgga gtcggctgct 300

ccctcccaaa catctgtgta cttctgtgcc agcagtttgg gcagagcgta cgagcagtac 360

ttcgggccgg gcaccaggct cacggtcaca gaggacctga aaaacgtgtt cccacccgag 420

gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag atctcccaca cccaaaaggc cacactggtg 480

tgcctggcca caggcttcta ccccgaccac gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag 540

gaggtgcaca gtggggtcag cacagacccg cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat 600

gactccagat actgcctgag cagccgcctg agggtctcgg ccaccttctg gcagaacccc 660

cgcaaccact tccgctgtca agtccagttc tacgggctct cggagaatga cgagtggacc 720

caggataggg ccaaacctgt cacccagatc gtcagcgccg aggcctgggg tagagcagac 780

tgtggcttca cctccgagtc ttaccagcaa ggggtcctgt ctgccaccat cctctatgag 840

atcttgctag ggaaggccac cttgtatgcc gtgctggtca gtgccctcgt gctgatggcc 900

atggtcaaga gaaaggattc cagaggc 927

<210> 26

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser Val Arg Glu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg Leu Thr Val Leu

50 55 60

Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile Ala Asp Thr Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Gln Ser Phe Gly Asn

85 90 95

Glu Lys Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Ile Ile Pro Asn

100 105 110

Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser

115 120 125

Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn

130 135 140

Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val

145 150 155 160

Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp

165 170 175

Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile

180 185 190

Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Cys Ser Pro Glu Ser Ser

195 200 205

<210> 27

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggtgaagatg ttgaacagag tcttttcctg agtgtccgag agggagacag ctccgttata 60

aactgcactt acacagacag ctcctccacc tacttatact ggtataagca agaacctgga 120

gcaggtctcc agttgctgac gtatattttt tcaaatatgg acatgaaaca agaccaaaga 180

ctcactgttc tattgaataa aaaggataaa catctgtctc tgcgcattgc agacacccag 240

actggggact cagctatcta cttctgtgca gagcagagct ttggaaatga gaaattaacc 300

tttgggactg gaacaagact caccatcata cccaatatcc agaaccctga ccctgccgtt 360

tatcagctgc gtgatagcaa aagcagcgat aaaagcgtgt gcctgttcac cgattttgat 420

agccagacca acgtgagcca gagcaaagat agcgatgtgt acatcaccga taaaaccgtg 480

ctggatatgc gcagcatgga tttcaaaagc aatagcgcgg ttgcgtggag caacaaaagc 540

gattttgcgt gcgcgaacgc gtttaacaac agcatcatcc cggaagatac gttcttctgc 600

agcccagaaa gttcc 615

<210> 28

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Arg Val Leu Lys Thr Gly

1 5 10 15

Gln Ser Met Thr Leu Leu Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Val Gly Glu Gly Thr Thr Ala Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Asn Val Ser Arg Leu Lys Lys Gln Asn Phe Leu Leu Gly Leu Glu Ser

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly

85 90 95

Arg Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr

100 105 110

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

115 120 125

Ser Glu Cys Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

130 135 140

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

145 150 155 160

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu

180 185 190

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

195 200 205

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

210 215 220

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

225 230 235 240

Ala Asp

<210> 29

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

aacgcgggcg tgacccagac cccaaaattc cgggtcctga agacaggaca gagcatgaca 60

ctgctgtgtg cccaggatat gaaccatgaa tacatgtact ggtatcgaca agacccaggc 120

atggggctga ggctgattca ttactcagtt ggtgagggta caactgccaa aggagaggtc 180

cctgatggct acaatgtctc cagattaaaa aaacagaatt tcctgctggg gttggagtcg 240

gctgctccct cccaaacatc tgtgtacttc tgtgccagca gtttgggcag agcgtacgag 300

cagtacttcg ggccgggcac caggctcacg gtcacagagg acctgaaaaa cgtgttccca 360

cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa tgcgaaatta gccataccca gaaagcgacc 420

ctggtttgtc tggcgaccgg tttttatccg gatcatgtgg aactgtcttg gtgggtgaac 480

ggcaaagaag tgcatagcgg tgtttctacc gatccgcagc cgctgaaaga acagccggcg 540

ctgaatgata gccgttatgc gctgtctagc cgtctgcgtg ttagcgcgac cttttggcaa 600

aatccgcgta accattttcg ttgccaggtg cagttttatg gcctgagcga aaacgatgaa 660

tggacccagg atcgtgcgaa gccggttacc cagattgtta gcgcggaagc ctggggccgc 720

gcagat 726

<210> 30

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Ser Leu Ser Val Arg Glu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg Leu Thr Val Leu

50 55 60

Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile Ala Asp Val Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Gln Ser Phe Gly Asn

85 90 95

Glu Lys Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Pro Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Glu Gly Gly Thr Gly Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys

130 135 140

Tyr Leu Ser Val Lys Thr Gly Gln Ser Val Thr Leu Leu Cys Ala Gln

145 150 155 160

Asp Met Asn His Glu Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln

165 170 175

Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Glu Gly Thr Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Glu Val Pro Asp Arg Tyr Asn Val Ser Arg Leu Lys Lys Gln Asn

195 200 205

Phe Leu Leu Gly Ile Glu Ser Val Thr Pro Ser Asp Thr Ser Val Tyr

210 215 220

Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly Arg Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro

225 230 235 240

Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr

245

<210> 31

<211> 741

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggtgaagatg ttgaacaaag cctgagcctg agcgtgcgcg aaggcgatag cgtggttatt 60

aattgcacct ataccgatag tagcagtacc tatctgtatt ggtataaaca ggaaccgggc 120

gcaggtctgc agctgctgac ctatattttc agtaatatgg atatgaagca ggatcagcgc 180

ctgaccgttc tgctgaataa gaaagataaa catctgagcc tgcgtattgc cgatgttcag 240

accggtgaca gcgcaatcta tttctgtgcc gaacagagtt ttggcaatga aaagctgacc 300

tttggtaccg gtacccgtct gaccgttacc ccgggtggcg gcagtgaagg cggtggtagc 360

gaaggcggcg gcagcgaagg tggtggtagt gaaggtggta ccggcaatgc cggtgttacc 420

cagaccccga aatatctgag cgttaaaacc ggccagagtg ttaccctgct gtgcgcccag 480

gatatgaatc atgaatatat gtattggtac cgccaggacc ctggccaggg tctgcgctta 540

attcattata gtgtgggtga aggtaccacc gcaaaaggcg aagtgccgga tcgttataat 600

gtgagtcgcc tgaagaaaca gaattttctg ctgggcattg aaagtgtgac cccgagtgat 660

accagcgtgt atttctgtgc aagtagcctg ggtcgtgcct atgaacagta ttttggcccg 720

ggtacccgcc tgaccgtgac c 741

<210> 32

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 32

Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Ser Leu Ser Val Arg Glu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg Leu Thr Val Leu

50 55 60

Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile Ala Asp Val Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Gln Ser Phe Gly Asn

85 90 95

Glu Lys Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Pro

100 105 110

<210> 33

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ggtgaagatg ttgaacaaag cctgagcctg agcgtgcgcg aaggcgatag cgtggttatt 60

aattgcacct ataccgatag tagcagtacc tatctgtatt ggtataaaca ggaaccgggc 120

gcaggtctgc agctgctgac ctatattttc agtaatatgg atatgaagca ggatcagcgc 180

ctgaccgttc tgctgaataa gaaagataaa catctgagcc tgcgtattgc cgatgttcag 240

accggtgaca gcgcaatcta tttctgtgcc gaacagagtt ttggcaatga aaagctgacc 300

tttggtaccg gtacccgtct gaccgttacc ccg 333

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 34

Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Ser Val Lys Thr Gly

1 5 10 15

Gln Ser Val Thr Leu Leu Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Val Gly Glu Gly Thr Thr Ala Lys Gly Glu Val Pro Asp Arg Tyr

50 55 60

Asn Val Ser Arg Leu Lys Lys Gln Asn Phe Leu Leu Gly Ile Glu Ser

65 70 75 80

Val Thr Pro Ser Asp Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Gly

85 90 95

Arg Ala Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr

100 105 110

<210> 35

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aatgccggtg ttacccagac cccgaaatat ctgagcgtta aaaccggcca gagtgttacc 60

ctgctgtgcg cccaggatat gaatcatgaa tatatgtatt ggtaccgcca ggaccctggc 120

cagggtctgc gcttaattca ttatagtgtg ggtgaaggta ccaccgcaaa aggcgaagtg 180

ccggatcgtt ataatgtgag tcgcctgaag aaacagaatt ttctgctggg cattgaaagt 240

gtgaccccga gtgataccag cgtgtatttc tgtgcaagta gcctgggtcg tgcctatgaa 300

cagtattttg gcccgggtac ccgcctgacc gtgacc 336

Claims (10)

1.一种TCR，所述的TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，其特征在于，所述TCR能够与GVYDGREHTV-HLA A0201复合物结合；

并且所述TCRα链可变域的3个互补决定区为：

和/或所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为：

2.根据权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCRα链可变域的氨基酸序列为与SEQID NO.1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述TCRβ链可变域的氨基酸序列为与SEQ ID NO.5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述TCR的α链的C-或N-末端结合有偶联物，和/或所述TCR的β链的C-或N-末端结合有偶联物；

优选地，与所述TCR结合的偶联物包括检测标记物、治疗剂或PK修饰部分中任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述治疗剂为抗-CD3抗体。

4.一种多价TCR复合物，其特征在于，所述多价TCR复合物包括权利要求1～3中任一项所述的TCR中的任意两种或至少三种的组合。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求1～3中任一项所述的TCR的核苷酸序列和/或权利要求1～3中任一项所述的TCR的核苷酸序列的互补序列；

优选地，所述的核酸分子包含编码TCRα链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.33；和/或所述的核酸分子包含编码TCRβ链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.35。

6.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求5所述的核酸分子；

优选地，所述载体包括病毒载体；

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体。

7.一种分离的宿主细胞，其特征在于，所述分离的宿主细胞中包括权利要求6所述的载体，或所述分离的宿主细胞的染色体中整合有外源的权利要求5所述的核酸分子。

8.一种细胞，其特征在于，所述细胞转导了权利要求5所述的核酸分子和/或权利要求6中所述载体；

优选地，所述细胞包括T细胞或干细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1～3中任一项所述的TCR、权利要求4所述的多价TCR复合物、权利要求5所述的核酸分子或权利要求8所述的细胞；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

10.权利要求1～3中任一项所述的TCR、权利要求4所述的多价TCR复合物或权利要求8所述的细胞的用途，其特征在于，所述用途包括制备治疗肿瘤和/或自身免疫疾病的药物。