HRP20031054B1 - Novo proizveden superantigen za humanu terapiju - Google Patents

Novo proizveden superantigen za humanu terapiju Download PDF

Info

Publication number
HRP20031054B1
HRP20031054B1 HRP20031054AA HRP20031054A HRP20031054B1 HR P20031054 B1 HRP20031054 B1 HR P20031054B1 HR P20031054A A HRP20031054A A HR P20031054AA HR P20031054 A HRP20031054 A HR P20031054A HR P20031054 B1 HRP20031054 B1 HR P20031054B1
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
louse
sea
superantigen
image
amino acid
Prior art date
Application number
HRP20031054AA
Other languages
English (en)
Inventor
Göran Forsberg
Eva Erlandsson
Per Antonsson
Björn Walse
Original Assignee
Active Biotech Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Active Biotech Ab filed Critical Active Biotech Ab
Publication of HRP20031054A2 publication Critical patent/HRP20031054A2/xx
Publication of HRP20031054B1 publication Critical patent/HRP20031054B1/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
    • H04L51/00—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail
    • H04L51/06—Message adaptation to terminal or network requirements
    • H04L51/063—Content adaptation, e.g. replacement of unsuitable content
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04L—TRANSMISSION OF DIGITAL INFORMATION, e.g. TELEGRAPHIC COMMUNICATION
    • H04L51/00—User-to-user messaging in packet-switching networks, transmitted according to store-and-forward or real-time protocols, e.g. e-mail
    • H04L51/58—Message adaptation for wireless communication

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Computer Networks & Wireless Communication (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Sadašnji izum se odnosi na pripravke i načine korištenja, gdje pripravak obuhvaća konjugat bakterijskog superantigena i neko antitijelo. Još posebnije, bakterijski superantigen je bio modificiran radi smanjenja seroreaktivnosti uz zadržavanje aktivnosti superantigena.

Description

Pozadina izuma
Polje izuma
Sadašnji izum se odnosi na polje imunologije i proliferativnih oboljenja, kao što je rak. Posebnije, on se odnosi na pripravke i načine korištenja, gdje pripravci obuhvaćaju superantigene koji su promijenjeni radi smanjenja seroreaktivnosti.
Odgovarajuća područja
Superantigeni (SAg-ovi) sačinjavaju skupinu bakterijskih i virusnih proteina koji su krajnje učinkoviti u aktiviranju velike frakcije populacije T-stanica. Superantigeni se vežu izravno na glavni histokompatibilni kompleks (MHC) bez da se procesiraju. U stvari se superantigeni vežu neprocesirano izvan izvan utora koji veže antigen na molekulama MHC II klase, tako uglavnom izbjegavajući polimorfizam u mjestu vezanja peptida. Mehanizam vezivanja ovisi o vezivanju superantigena na receptor T-stanica (TCR) u Vβ lancu, umjesto vezivanja na hipervarijabilne petlje receptora T-stanica (TCR).
Stafilokokni enterotoksini (SEs) su homologna skupina superantigena, s obzirom i na strukturu i na funkciju (Papageorgiou i ostali, 2000). Poznati su kao glavni uzrok trovanja hranom i sindroma toksičnog šoka kod ljudi.
Novi pristup tumorskoj terapiji temeljen na SAg-u je razvijen za adjuvantski tretman krutih tumora. On koristi obje glavne poluge imuno sustava ugrađujući Fab dio tumor-specifičnog monoklonskog antitijela i SAg koji aktivira T-stanice u jednom rekombinantnom fuzijskom proteinu. Fab-SAg proteini vezani na tumorske stanice mogu potaknuti SAg-om aktivirane citotoksične T-stanice da ubiju tumorske stanice izravno sa na superantigen antitijelo ovisno stanično posredovanom citotoksičnošću, SADCC. Dodatno, aktivirane T-stanice proizvode tumoricidalne i proinflamatorne citokine koji poništavaju probleme heterogenosti tumora, odnosno makromolekulsko uzimanje.
Tumorski terapeutici temeljeni na superantigenu su imali neki uspjeh, međutim, jedan klinički problem na koji treba ukazati je aktivacija sustavnog imunog sustava. Fuzijski proteini s divljom vrstom SEA su proučavani u kliničkim ispitivanjima raka debelog crijeva i gušterače (Alpaugh i ostali, 1998). Uočena su ograničenja unatoč dobivenih ohrabrujućih rezultata. Prvo je produkt bio jako otrovan. Drugo, prethodno pripravljena antitijela na superantigene kod pacijenata su načinila doziranje kompleksnim. Dodatno, produkt je bio imunogen. Stoga su ponovljeni ciklusi terapije bili mogući kod ograničenog broja pacijenata.
Do sadašnjeg izuma su na SAg temeljene terapije bile ograničene dozom. Sadašnji izum je prvi koji mijenja superantigen što rezultira smanjenjem seroreaktivnosti uz zadržavanje aktivnosti superantigena; stoga je sadašnji izum nov i nije očit.
Kratak sažetak izuma
Prije spomenuto je naglasilo dosta široko izvedbe i tehničke prednosti sadašnjeg izuma s ciljem da se detaljni opis izuma koji slijedi može bolje razumjeti. Dodatne izvedbe i prednosti izuma će se opisati ovdje kasnije što oblikuje subjekt zahtjeva izuma. Iskusni u području trebaju cijeniti što se koncepcija i specifična izvedba otkrivenog može lako iskoristiti kao temelj za izmjene i oblikovanje drugih struktura za provođenje istih svrha sadašnjeg izuma. Iskusni u području bi također trebali shvatiti da se takve jednakovrijedne konstrukcije ne odmiču od duha i raspona izuma kako je postavljen u dodanim zahtjevima. Nove izvedbe za koje se vjeruje da su karakteristika izuma, i kao njihove organizacije i kao način rada, skupa s daljnjim objektima i prednostima, će se bolje razumjeti iz slijedećeg opisa kada se razmatra s pratećim slikama. Očekuje se da će se brzo razumjeti, međutim, da je svaka slika načinjena samo u svrhu ilustracije i opisa i nije bila namjera kao definicija ograničenja sadašnjeg izuma.
U sadašnjem izumu je osiguran konjugat koji obuhvaća bakterijski superantigen i neko antitijelo, gdje je superantigen superantigen niskog titra koji obuhvaća područja A do E, koje područje A je mjesto vezivanja TCR, a područja B do E određuju vezivanje MHC molekule klase II; i DNK sekvenca koja kodira za superantigen je supstituirana tako da nije više od 15 aminokiselinskih ostataka u području A zamijenjeno s različitim aminokiselinama, tako da supstituirani superantigen ima smanjenu seroreaktivnost u usporedbi sa superantigenom iz kojeg je dobiven; i gdje je antitijelo antitijelo pune dužine ili bilo koja druga molekula koja veže aktivni fragment antitijela, koji je usmjeren prema strukturi površine stanice povezane s rakom. Primjeri superantigena uključuju, ali nisu ograničeni na stafilokokni enterotoksin (SE), Streptococcus pyogenes egzotoksin (SPE), Staphylococcus aureus toksin sindroma toksičnog šoka (TSST-1), streptokokni mitogeni egzotoksin (SME) i streptokokni superantigen (SSA). U specifičnim izvedbama, stafilokokni enterotoksin je stafilokokni enterotoksin A (SEA) ili stafilokokni enterotoksin E (SEE).
U specifičnim izvedbama, položaji aminokiselinskih ostataka u području A koji će se zamijeniti su odabrani iz skupine koja se sastoji od 20, 21, 24, 27, 173 i 204. Također se razmišljalo da područje C može obuhvatiti supstitucije u ne više od 15 aminokiselinskih ostataka. Ove supstitucije se mogu pojaviti na položajima aminokiselinskih ostataka 79, 81, 83 i 84. Još dalje, područje E može obuhvaćati supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka, u kojima se supstitucija može pojaviti na položaju aminokiselinskog ostatka 227.
U drugoj izvedbi sadašnjeg izuma, osiguran je konjugat koji obuhvaća bakterijski superantigen i neko antitijelo, gdje je superantigen superantigen niskog titra koji obuhvaća područja A do E, koje područje A je mjesto vezivanja TCR, a područja B do E određuju vezivanje MHC molekula klase II; aminokiselinska sekvenca superantigena je supstituirana tako da nije više od 15 aminokiselinskih ostataka u području B zamijenjeno s različitim aminokiselinama, tako da supstituirani superantigen ima smanjenu seroreaktivnost u usporedbi sa superantigenom iz kojeg je dobiven; i gdje je antitijelo antitijelo pune dužine ili bilo koja druga molekula koja veže aktivni fragment antitijela, koji je upućen prema strukturi površine stanice povezane s rakom. Specifično, položaji aminokiselinskih ostataka u području B koji će se zamijeniti mogu se odabrati iz skupine koja se sastoji od 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 i 49.
Jedna druga izvedba sadašnjeg izuma osigurava konjugat koji obuhvaća bakterijski superantigen i neko antitijelo, gdje je superantigen superantigen niskog titra koji obuhvaća područja A do E, koje područje A je mjesto vezivanja TCR, a područja B do E određuju vezivanje MHC molekula klase II; aminokiselinska sekvenca superantigena je supstituirana tako da nije više od 15 aminokiselinskih ostataka u području C zamijenjeno s različitim aminokiselinama, tako da supstituirani superantigen ima smanjenu seroreaktivnost u usporedbi sa superantigenom iz kojeg je dobiven; i gdje je antitijelo antitijelo pune dužine ili bilo koja druga molekula koja veže aktivni fragment antitijela, koji je upućen prema strukturi površine stanice povezane s rakom. U specifičnim izvedbama rak je odabran iz skupine koja se sastoji od raka pluća, dojke, debelog crijeva, bubrega, gušterače, jajnika, želuca, grlića maternice i prostate. Položaji aminokiselinskih ostataka u području C koje će se zamijeniti su odabrani iz skupine koja se sastoji iz 74, 75, 78, 79, 81, 83 i 84.
Primjeri superantigena uključuju, ali nisu ograničeni na stafilokokni enterotoksin (SE), Streptococcus pyogenes egzotoksin (SPE), Staphylococcus aureus toksin sindrom toksičog šoka (TSST-1), streptokokni mitogeni egzotoksin (SME) i streptokokni superantigen (SSA). U specifičnim izvedbama, stafilokokni enterotoksin je stafilokokni enterotoksin A (SEA) ili stafilokokni enterotoksin E (SEE).
U specifičnim izvedbama konjugat može dalje obuhvaćati supstitucije u ne više od 15 aminokiselinskih ostataka u području A. Položaji aminokiselinskih ostataka u području A koje će se zamijeniti mogu biti na položajima 20, 21, 24, 27, 173 ili 204. Još dalje, konjugat može obuhvaćati supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka u području E. Još posebnije, supstitucija područja E se može pojaviti kod položaja 227 aminokiselinskog ostatka.
U daljnjoj specifičnoj izvedbi, konjugat može obuhvaćati SEE aminokiselinsku sekvencu uključujući supstitucije R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227S ili SEE aminokiselinsku sekvencu uključujući supstitucije R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227S. Još dalje, konjugat može obuhvaćati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2.
U daljnjim izvedbama konjugat može obuhvaćati neko antitijelo, na primjer, ali nije ograničen na Fab fragment. Specifični Fab fragmenti mogu uključivati C215Fab ili 5T4Fab.
Još dalje konjugat može također obuhvaćati citokin, kao što je interleukin. U specifičnim izvedbama interleukin je IL2 ili njegov derivat koji ima bitno istu biološku aktivnost kao prirodni IL2.
Jedna druga izvedba obuhvaća konjugat koji obuhvaća bakterijski superantigen i neko antitijelo, gdje je superantigen superantigen niskog titra koji obuhvaća područja A do E, koje područje A je mjesto vezivanja TCR, a područja B do E određuju vezivanje MHC molekula klase II; aminokiselinska sekvenca superantigena je supstituirana tako da nije više od 15 aminokiselinskih ostataka u području D zamijenjeno s različitim aminokiselinama, tako da supstituirani superantigen ima smanjenu seroreaktivnost u usporedbi sa superantigenom iz kojeg je nastao; i gdje je antitijelo pune dužine ili bilo koja druga molekula koja veže aktivni fragment antitijela, koji je upućen prema strukturi površine stanice povezane s rakom. Položaji aminokiselinskih ostataka u području D koji će se zamijeniti su odabrani iz skupine koja se sastoji iz 187, 188, 189 i 190.
U jednoj drugoj izvedbi je osiguran konjugat koji obuhvaća bakterijski superantigen i neko antitijelo, gdje je superantigen superantigen niskog titra koji obuhvaća područja A do E, čije područje A je mjesto vezivanja TCR, a područja B do E određuju vezivanje MHC molekula klase II; aminokiselinska sekvenca superantigena je supstituirana tako da nije više od 15 aminokiselinskih ostataka u području E zamijenjeno s različitim aminokiselinama, tako da supstituirani superantigen ima smanjenu seroreaktivnost u usporedbi sa superantigenom iz kojeg je nastao; i gdje je antitijelo antitijelo pune dužine ili bilo koja druga molekula koja veže aktivni fragment antitijela, koji je upućen prema strukturi površine stanice povezane s rakom. U specifičnim izvedbama stafilokokni enterotoksin je stafilokokni enterotoksin A (SEA) ili stafilokokni enterotoksin E (SEE). Također, položaji aminokiselinskih ostataka u području E koji će se zamijeniti su odabrani iz skupine koja se sastoji iz 217, 220, 222, 223, 225 i 227.
U specifičnoj izvedbi, konjugat dalje obuhvaća supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka u području A. Specifično, supstitucije u području A se mogu pojaviti na položajima aminokiselinskih ostataka 20, 21, 24, 27, 173 i 204.
U jednoj drugoj specifičnoj izvedbi, konjugat dalje obuhvaća supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka u području B u kojem se supstitucije mogu pojaviti na položajima aminokiselinskih ostataka 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 i 49.
Još dalje konjugat može obuhvaćati supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka u području C. Specifično, supstitucije u području C se pojavljuju na položajima aminokiselinskih ostataka 74, 75, 78, 79, 81, 83 i 84. Konjugat također može dalje obuhvaćati supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka u području D, u kojem se supstitucije mogu pojaviti na položajima 187, 188, 189 i 190 aminokiselinskih ostataka.
U jednoj drugoj specifičnoj izvedbi je osiguran farmaceutski pripravak koji obuhvaća terapijsku količinu konjugata, gdje rečeni konjugat koji obuhvaća bakterijski superantigen i neko antitijelo, gdje je superantigen superantigen niskog titra koji obuhvaća područja A do E, koje područje A je mjesto vezivanja TCR, a područja B do E određuju vezivanje MHC molekula klase II; aminokiselinska sekvenca superantigena je supstituirana tako da nije više od 15 aminokiselinskih ostataka u području C zamijenjeno s različitim aminokiselinama, tako da supstituirani superantigen ima smanjenu seroreaktivnost u usporedbi sa superantigenom iz kojeg je dobiven; i gdje je antitijelo antitijelo pune dužine ili bilo koja druga molekula koja veže aktivni fragment antitijela, koji je upućen prema strukturi površine stanice povezane s rakom. Specifično su položaji aminokiselinskih ostataka u području C koje će se zamijeniti odabrani iz skupine koja se sastoji iz 74, 75, 78, 79, 81, 83 i 84.
U daljnjim izvedbama farmaceutski pripravak može obuhvatiti konjugat koji obuhvaća supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka u području A, koje se supstitucije pojavljuju u području A na položajima 20, 21, 24, 27, 173 i 204 aminokiselinskih ostataka. Još dalje, farmaceutski pripravak može također obuhvaćati supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka u području E. Specifično, supstitucija u području E može biti na položaju 227 aminokiselinskog ostatka.
U specifičnim izvedbama farmaceutski pripravak može obuhvaćati konjugat koji obuhvaća SEE aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO : 7) isto kao i dodatne supstitucije R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227S.
U jednoj drugoj specifičnoj izvedbi farmaceutski pripravak može obuhvaćati konjugat koji obuhvaća SEE aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO : 7) isto kao i dodatne supstitucije R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227S. Još dalje, farmaceutski pripravak obuhvaća konjugat koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1.
U daljnjim specifičnim izvedbama farmaceutski pripravak obuhvaća neko antitijelo, na primjer Fab fragment. Specifično je Fab fragment C215Fab ili 5T4Fab. Farmaceutski pripravak može nadalje obuhvaćati citokin, kao što je interleukin. Interleukin može biti IL2 ili njegov derivat koji ima bitno istu biološku aktivnost kao i prirodni IL2.
Jedna druga izvedba sadašnjeg izuma uključuje način tretiranja raka kod sisavaca aktiviranjem imunog sustava rečenih sisavaca što obuhvaća davanje rečenim sisavcima terapijski djelotvornu količinu konjugata, gdje rečeni konjugat obuhvaća bakterijski superantigen i neko antitijelo, gdje je superantigen superantigen niskog titra koji obuhvaća područja A do E, koje područje A je mjesto vezivanja TCR, a područja B do E određuju vezivanje MHC molekula klase II; aminokiselinska sekvenca superantigena je supstituirana tako da nije više od 15 aminokiselinskih ostataka u području C zamijenjeno s različitim aminokiselinama, tako da supstituirani superantigen ima smanjenu seroreaktivnost u usporedbi sa superantigenom iz kojeg je dobiven; i gdje je antitijelo antitijelo pune dužine ili bilo koja druga molekula koja veže aktivni fragment antitijela, koji je upućen prema strukturi površine stanice povezane s rakom. Primjeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, rak pluća, dojke, debelog crijeva, bubrega, gušterače, jajnika, želudac, grlića maternice i prostate. Specifično su položaji aminokiselinskih ostataka u području C koje će se zamijeniti odabrani iz skupine koja se sastoji iz 74, 75, 78, 79, 81, 83 i 84.
U daljnjim izvedbama, područje A može također obuhvaćati supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka, koje se supstitucije pojavljuju u području A na položajima 20, 21, 24, 27, 173 i 204 aminokiselinskih ostataka. Također, područje E može dalje obuhvaćati supstitucije od ne više od 15 aminokiselinskih ostataka. Specifično, supstitucija u području E može biti na položaju 227 aminokiselinskog ostatka. Konjugat može obuhvaćati SEE aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO : 7) isto kao i dodatne supstitucije R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227S ili supstitucije R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S i D227S. Još dalje, farmaceutski pripravak obuhvaća konjugat koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1.
Kratki opis crteža
Slijedeći crteži čine dio sadašnje specifikacije i uključeni su da dalje pokažu određene vidove sadašnjeg izuma. Izum može biti razumljiviji pozivanjem na jedan ili više ovih crteža skupa s detaljnim opisom specifičnih izvedbi predstavljenih ovdje.
SLIKA 1 pokazuje peptidne fragmente prepoznate od ljudskog anti-SEA koji su identificirani iz pepsinom obrađene SEA/E-18 eluirane s anti-SEA stupca. Fragmenti su identificirani i prije i nakon pročišćavanja uporabom reverzno faznog HPLC povezane s masenim spektrometrom (MS). Fragmenti nađeni u obrađenom uzorku kod istog retencijskog vremena i prije i nakon afinitnog pročišćavanja su smatrani kao pozitivni.
SLIKA 2 je sedam različitih identificiranih peptida, prikazanih kao crte iznad aminokiselinske sekvence za SEA/E-120. Slova u svijetlo sivom ukazuju koji ostaci su zamijenjeni u SEA/E-120 u usporedbi prema SEA/E-18.
SLIKA 3 je strukturno poravnanje sekvence SEA, SED i SEH korištenih kao predlošci za konstrukciju komparativnog računalnog modela SEA/E-18. Strukturno sačuvana područja su označena s crnim kutijama.
SLIKA 4 je multiplicirano poravnanje sekvence SEA, SEE, SEA/E-18 i SEA/E-120. Prikazano kao crte iznad poravnanja su pet različitih područja A-E unutar kojih se drže sve supstitucije kod SEA/E-120.
SLIKA 5 je SEA/E-18 model (u crnom) prenesen na SEA (1SXT u sivom).
SLIKA 6 su područja SEA/E-18 koja odgovaraju identificiranim seroreaktivnim peptidima.
SLIKA 7 je scintilacijski proksimitivni test (SPA) koji je izmjerio specifično vezivanje 125I humanog anti-SEA vezanog na C215FabSEA, C215Fab SEA/E-18, -65, -97, -109, -110, -113 ili -120 na biotin konjugiranom anti-mišjemF(ab)2 na streptavidin PVT podlogu.
SLIKA 8A I SLIKA 8B ilustriraju sposobnost utjecaja na citotoksičnost usmjerenu prema tumoru. SLIKA 8A pokazuje citotoksičnost kako je izmjerena u superantigen antitijelo ovisnom testu stanične citotoksičnosti, SADCC. SLIKA 8B pokazuje djelotvornost superantigena da utječe na ubijanje s T stanicama MHC ekspresirajućih stanica klase II što rezultira u sustavnoj citotoksičnosti koja može uzrokovati pokrajnje efekte izmjerene u superantigen ovisnom testu stanične citotoksičnosti, SDCC. Sve nove kimere su snizile njihov učinak u SDCC s najmanje 1log i s čak 3log za C215Fab SEA/E-120.
SLIKA 9 je vrpčasti dijagram modela SEA/E-120. Pokrajnji lanci ostataka G20, T21, G24 i K27 su označeni tamno sivo, pokrajnji lanci ostataka S34, S39, S40, E41, K42, A44, T49, T74, A75, S78, E79, E81, S83 i S84 su označeni sivo, pokrajnji lanci ostataka T217, S220, T222, S223, S225 su označeni crno i pokrajnji lanac ostatka 227 je označen svijetlo sivo.
SLIKA 10 je aminokiselinska sekvenca 5T4Fab SEA/E-120 (SEQ ID NO: 1) s promijenljivim dijelovima iz murinskog antitijela 5T4 i stalni dijelovi od murinskog antitijela C242. Položaji 1-458 je lanac A a položaji 459-672 su lanac B.
Detaljan opis izuma
Lako je uočljivo osobi iskusnoj u području da različite se izvedbe i modifikacije mogu načiniti u otkrivenom izumu u ovoj Prijavi bez napuštanja raspona i duha izuma.
Kako se ovdje koristi specifikacija "a" ili "an" (u engl. tekstu) može značiti jedan ili više. Kako se ovdje koristi u zahtjevu(ima), kada se koristi skupa s riječi "obuhvaća", riječi "a" ili "an" (u engl. tekstu) može značiti jedan ili više od jedan. Kako se ovdje koristi "neki drugi" može značiti najmanje drugi ili više.
Izraz "antitijelo" kako se ovdje koristi, odnosi se na neku imunoglobulinsku molekulu, koja je sposobna specifično se vezati na specifični epitop na nekom antigenu. Kako se ovdje koristi, za antitijelo je namjeravano da se odnosi široko na bilo koje imunologično vezivajuće sredstvo kao što je IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. Antitijela mogu biti netaknuti imunoglobulinski derivati iz prirodnih izvora ili iz rekombinantnih izvora i mogu biti imunoaktivni dijelovi netaknutih imunoglobulina. Antitijela u sadašnjem izumu mogu postojati u mnogim oblicima uključujući, na primjer, poliklonalna antitijela, monoklonalna antitijela, Fv, Fab i F(ab)2, kao i atitijela jednog lanca i humanizirana antitijela (Harlow i istali, 1988.; Bird i ostali, 1988.).
Izraz "antigen" kako se ovdje koristi je definiran kao molekula koja izaziva imuni odgovor. Ovaj imuni odgovor može uključivati produkciju antitijela, aktiviranje specifičnih imunološki kompetentnih stanica, ili oboje. Neki antigen može biti izveden iz organizama, podjedinice proteina/antigena, ubijene ili inaktivirane cijele stanice ili lizata. Stoga, osoba iskusna u području shvaća da bilo koja makromolekula, virtualno uključujući sve proteine, može služiti kao antigeni. Nadalje, antigeni se mogu izvesti iz rekombinantne DNA.
Izraz "rak" kako se koristi ovdje je određen kao proliferalno oboljenje ili maligni neoplazam (tumor). Primjeri uključuju, ali nisu ograničeni na, rak dojke, rak prostate, rak jajnika, rak grlića maternice, rak kože, rak gušterače, rak debelog crijeva i rak pluća.
Izraz "konjugat" kako se koristi ovdje je određen kao fuzijski protein superantigena ili inačica superantigena spojenog ili konjugiranog na neko antitijelo ili dio antitijela.
Izraz "imunogenski" ili "imunogenost" kako se koristi ovdje je određen kao tvar ili molekula koja pobuđuje imuni odgovor.
Izraz "glavni (većinski) histokompatibilni kompleks", ili "MHC", kako se koristi ovdje je određen kao specifični grozd gena, mnogi od kojih kodiraju proteine stanične površine povezane s evolucijom koji su uključeni u prezentaciju antigena, koja je među najvažnijim determinantama (odrednicama) histokompatibilnosti. Klasa I MHC, ili MHC-I, funkcionira uglavnom kod antigen prezentacije u CD8 T limfocita. Klasa II MHC, ili MHC-2, funkcionira uglavnom u antigen prezentaciji u CD4 T limfocita.
Izraz "seroreaktivan", "seroreakcija" ili "seroreaktivnost" kako se koristi ovdje je određena kao reakcija ili akcija koja se pojavljuje kao rezultat seruma ili sere. Netko iskusan u području shvaća da serum ili sera pacijenta ili životinje sadržava neutralizirajuća antitijela ili ranije nastala antitijela ili endogena antitijela u mnoštvu antigena ili molekula. Stoga je seroreaktivnost povezana na reakciju neutralizirajućih antitijela u serumu.
Izraz "superantigen" kako se koristi ovdje je određen kao klasa molekula koje stimuliraju podskup T-stanica vezivanjem na MHC molekule klase II i na Vß domenu receptora T-stanica, stimulirajući aktiviranje T-stanica koje ekspresiraju određene Vß V genske segmente.
Izraz "receptor T-stanica" kako se koristi ovdje je određen kao receptor koji se sastoji od disulfidno vezanog heterodimera visoko odstupajećih α ili ß lanaca ekspresiranih na staničnoj membrani kao kompleks s nepromjenljivim CD3 lancima. T-stanice koje nose ovu vrstu receptora se često nazivaju α:ß T-stanice. Jedan alternativni receptor načinjen od varijabilnih γ i δ lanaca je ekspresirao CD3 na podskupu T-stanica.
Izraz "terapijski djelotvoran" kako se koristi ovdje je određen kao količina farmaceutskog pripravka koja je djelotvorna kod tretiranja oboljenja ili stanja.
Izraz "inačica" ili "inačice" kako se koristi ovdje odnosi se na proteine ili peptide koji se razlikuju od referentnih proteina, odnosno peptida. Inačice u ovom smislu su opisane niže i drugdje u sadašnjem otkriću mnogo podrobnije. Na primjer, promjene u sekvenci nukleinskih kiselina inačice mogu biti tihe, to jest, ne moraju promijeniti aminokiseline kodirane sa sekvencom nukleinskih kiselina. Gdje su promjene ograničene na tihu promjenu ove vrste inačica će kodirati peptid s istom sekvencom aminokiselina kao referentni peptid. Promjene u sekvenci nukleinskih kiselina inačice mogu promijeniti sekvencu aminokiselina peptida kodiranog referentnom sekvencom nukleinskih kiselina. Takve promjene sekvence nukleinskih kiselina mogu rezultirati u supstituciji aminokiselina, dodavanju, poništavanju, fuziji i kraćenju peptida kodiranog referentnom sekvencom, kako je raspravljeno niže. Općenito, razlike u aminokiselinskim sekvencama su ograničene tako da su sekvence referentne i inačice ukupno jako slične i, u mnogim područjima su iste.
Peptid inačice i referentni peptid se mogu razlikovati u aminokiselinskoj sekvenci u jednoj ili više supstitucija, dodataka, poništavanja, fuzija i skraćenja, koji mogu biti nazočni u bilo kojoj kombinaciji. Inačica također može biti fragment peptida iz izuma koji se razlikuje od referentne peptidne sekvence što je kraći od referentne sekvence, kao što je terminalno ili unutrašnje poništenje. Jedna druga inačica peptida iz izuma također uključuje peptid koji zadržava bitno istu funkciju ili aktivnost takvog peptida. Inačica može također biti (i) jedna u kojoj je jedan ili više aminokiselinskih ostataka supstituiran s konzerviranim ili nekonzerviranim aminokiselinskim ostatkom i tako supstituiran aminokiselinski ostatak može ili ne može biti kodiran genetičkim kodom ili (ii) jedna u kojoj jedan ili više aminokiselinskih ostataka uključuje supstituentsku skupinu ili (iii) jedna u kojoj je zreli peptid spojen s drugim spojem, kao što je spoj koji povećava poluživot peptida (na primjer, polietilenglikol) ili (iv) jedna u kojoj su dodatne aminokiseline spojene na zreli peptid kao što je vodeća ili izlučna sekvenca ili sekvenca koja je korištena za pročišćavanje zrelog peptida. Inačice se mogu načiniti tehnikama mutageneze, uključujući one primjenjene na nukleinske kiseline, aminokiseline, stanice ili organizme, ili mogu biti načinjene uz pomoć rekombinacije. Za sve ove inačice određene gore se smatra da su unutar raspona onima iskusnim u području od učenja ovdje i iz područja.
Izraz "biološka aktivnost" kako se koristi ovdje se odnosi na urođena svojstva specifične molekule, na primjer aktiviranja određenih stanica ili vezivanja na određene receptore. Definicija, kako je korištena ovdje, je prvenstveno kvalitativna rađe nego kvantitativna.
I. Modifikacije superantigena
Sadašnji izum je zamišljen tako da modificira superantigene snižavanjem njihove imunogenosti smanjivanjem njihove seroreaktivnosti. Netko iskusan u području prepoznaje da se seroreaktivnost odnosi na reakciju molekula ili antigena s neutralizirajućim antitijelima u serum. Specifično sadašnji izum je zamišljen da konjugat obuhvaća bakterijski superantigen i neko antitijelo, gdje je superantigen superantigen niskog titra koji obuhvaća područja A do E, koje područje A je mjesto vezivanja TCR, a područja B do E određuju vezivanje MHC molekula klase II; i aminokiselinska sekvenca superantigena je supstituirana tako da nije više od 15 aminokiselinskih ostataka u području A zamjenjeno s različitim aminokiselinama, tako da supstituirani superantigen ima smanjenu seroreaktivnost u usporedbi sa superantigenom iz kojeg je dobiven; i gdje je antitijelo antitijelo pune dužine ili bilo koja druga molekula koja veže aktivni fragment antitijela, koji je upućen prema strukturi površine stanice povezane s rakom.
A. Superantigeni
Bakterijski superantigeni koji su predviđeni za korištenje u sadašnjem izumu uključuju, ali nisu ograničeni na stafilokokni enterotoksin (SE), Streptococcus pyogenes egzotoksin (SPE), Staphylococcos aureus toksin povezan sa toksičnim šokom (TSST-1), streptokokni mitogenski egzotoksin (SME) i streptokokni superantigen (SSA). Netko iskusan u području shvaća da se trodimenzionalne strukture gore izlistanih superantigena mogu dobiti od Proteinske banke podataka (PDB, www.rcsb.org). Još dalje, netko iskusan u području može dobiti sekvence nukleinskih kiselina i sekvence aminokiselina gore izlistanih superantigena i ostalih superantigena od Banke gena (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html).
U specifičnim izvedbama, superantigen je superantigen niskog titra. Poznato je i razumljivo od onih iskusnih u području da serumi ljudi normalno sadržava visoki titar antitijela prema superantigenima. Za stafilokokne superantigene, na primjer, relativni titri su TSST-1 > SEB > SEC-1 > SEC-2 > SEA > SED > SEE. Netko iskusan u području shvaća da ovi relativni titri ukazuju na imunogenske probleme i probleme sa seroreaktivnosti ili probleme s neutralizirajućim antitijelima. Stoga sadašnji izum uzima korištenje superantigena niskog titra, kao što su SEA ili SEE radi izbjegavanja seroreaktivnosti parenteralno davanih superantigena.
Još dalje, jasno je poznato i shvaćeno da su sekvence proteina i imunološka krosreaktivnost superantigena ili stafilokoknih enterotoksina podijeljeni u dvije povezane skupine. Jedna skupina se sastoji od SEA, SEE, SED i SEH. Druga skupina je SPEA, SEC, SEB i SSA. Stoga sadašnji izum također razmatra korištenje superantigena s malim titrom za smanjenje ili uklanjanje kros reaktivnosti sadašnjeg izuma s visokim titrom ili endogenim antitijelima prema stafilokoknim enterotoksinima.
B. Inačice superantigena
Inačice aminokisleinske sekvence proteina superantigena mogu biti supstitucijske, umetajuće ili poništavajuće inačice. Ove inačice se mogu pročistiti prema poznatim načinima, kao što je taloženje (na primjer, amonijev sulfat), HPLC, kromatografija ionske izmjene, afinitetna kromatografija (uključujući imunoafinitetnu kromatografiju) ili različita odijeljivanja po veličini (taloženje, gel elektroforeza, gel filtriranje).
Inačice supstitucije ili inačice zamjenjivanja tipično sadržavaju izmjenu jedne aminokiseline za drugu kod jednog ili više mjesta unutar proteina. Supstitucija može biti konzervativna, što znači, jedna aminokiselina je zamijenjena s jednom sličnog oblika i naboja. Konzervativne supstitucije su dobro poznate u području i uključuju, na primjer, izmjene: alanina sa serinom; arginina s lizinom; asparagina s glutaminom ili histidinom; aspartat s glutamatom; cistein sa serinom; glutamin s asparaginom; glutamat s aspartatom; glicin s prolinom; histidin s asparaginom ili glutaminom; izoleucin s leucinom ili valinom; leucin s valinom ili izoleucinom; lizin s argininom; metionin s leucinom ili izoleucinom; fenilalanin s tirozinom, leucinom ili metioninom; serin s treoninom; treonin sa serinom; triptofan s tirozinom; tirozin s triptofanom ili fenilalaninom i valin s izoleucinom ili leucinom.
Stoga su izumitelji razmatrali da se različite promjene mogu načiniti u sekvencama DNK ili genima bez značajnog gubitka biološke korisnosti ili aktivnosti proteina, kako je raspravljeno niže. Aktivnost je indukcija odgovorima T-stanice koja rezultira u citotoksičnosti tumorskih stanica. Još dalje, afinitet superantigena za MHC molekule klase II je smanjen s minimalnim učinkom na citotoksičnost superantigena.
U činjenju takvih promjena, hidropatski indeks aminokiselina se može razmatrati. Važnost hidropatskog indeksa aminokiseline u doprinosu interaktivnoj biološkoj funkciji proteina je općenito razumljiv u području (Kyte i Doolittle, 1982.). Prihvaćeno je da relativni hidropatski karakter aminokiseline doprinosi sekundarnoj strukturi rezultirajućeg proteina, koji u okretu određuje međudjelovanje proteina s drugim molekulama, na primjer, enzimima, supstratima, receptore, DNK, antitijela, antigene i slično.
Svakoj aminokiselini je dodijeljen hidropatski indeks na temelju njene hidrofobnosti i naboju (Kyte i Doolittle, 1982.), koje su: izoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenilalanin (+2,8); cistein/cistin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glicin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); triptofan (-0,9); tirozin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lizin (-3,9) i arginin (-4,5).
Poznato je u području da određene aminokiseline mogu biti supstituirane s drugim aminokiselinama koje imaju slični hidropatski indeks ili omjer i još rezultiraju u proteinu sa sličnom biološkom aktivnošću, to jest, još dobivaju biološko funkcionalni ekvivalentni protein. Kada se rade takve promjene, supstitucija aminokiselina čije su hidropatske razlike unutar ±2 su poželjne, one čije su unutar ±1 su posebno poželjne, a one unutar ±0,5 su čak još poželjnije.
Također je raumljivo u području da se supstitucija sličnih aminokiselina može načiniti djelotvorno na temelju hidrofilnosti. U.S. Patent 4,554,101, uključen ovdje pozivanjem na njega, tvrdi da najveći lokalni prosjek hidrofilnosti proteina, uzrokovan s hidrofilnošću njegovih susjednih aminokiselina, korelira s biološkim vlasništvom proteina. Kako je detaljnije u US Patent 4,554,101, slijedeće vrijednosti hidrofilnosti su označene za aminokiselinske ostatke: arginin (+3,0); lizin (+3,0); aspartat (+3,0 ± 1); glutamat (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glicin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cistein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); izoleucin (-1,8); tirozin (-2,3); fenilalanin (-2,5); triptofan (-3,4).
[0064] Razumljivo je da aminokiselina može biti supstituirana za drugu koja ima sličnu hidrofilnu vrijednost i još uvijek dobivati biološki i imunološki ekvivalentan protein. Kod takvih promjena, supstitucija aminokiselina čija je hidrofilna vrijednost unutar ±2 je poželjna, one koje su unutar ±1 su posebno poželjne, a one unutar ±0,5 su čak još više poželjne.
C. Fuzijski proteini
Specijalizirana vrsta umetajuće inačice je fuzijski protein. Ova molekula općenito ima sve ili bitne dijelove prirodne molekule, vezane na N- ili C-kraj, na sve ili dio drugog polipeptida. Na primjer, fuzijski protein sadašnjeg izuma uključuje dodatak imunološki aktivne domene, kao što je fragment antitijela, na ciljane specifične tumorske stanice.
[0066] Još dalje, uključivanje mjesta cijepanja kod ili blizu mjesta fuzije će olakšati uklanjanje tuđeg polipeptida nakon pročišćavanja. Ostale korisne fuzije uključuju vezivanje funkcijskih domena, kao što su aktivna mjesta iz enzima, glikozilacijskih domena, ostalih staničnih ciljajućih signala ili transmembranskih područja.
D. Promjena domene
Zanimljiva serija inačica se može stvoriti supstituiranjem homolognih područja različitih proteina. To je poznato, u određenom kontekstu, kao "promjena domene".
Promjena domene uključuje generaciju kimernih molekula koristeći različite ali, u ovom slučaju, povezane polipeptide. Uspoređujući različite SAg proteine, netko može se pretpostaviti kao za funkcionalno značajna područja ovih molekula. Moguće je tada promjeniti povezane domene ovih molekula u pokušaj određivanja kritičnosti ovih područja prema SAg funkciji. Ove molekule mogu imati dodatne vrijednosti u tome što se ovi "kimeri" mogu razlikovati od prirodnih molekula s mogućnosti osiguranja iste funkcije.
E. Pročišćavanje proteina
Bit će poželjno pročistiti SAg ili njegove inačice. Tehnike pročišćavanja proteina su dobro poznate onima iskusnima u području. Ove tehnike uključuju, na jednoj razini, sirovo frakcioniranje staničnog okruženje u peptidne i nepeptidne frakcije. Nakon što imamo odijeljen protein od drugih proteina, protein koji nas zanima se može dalje čistiti kromatografijom i elektroforezom radi postizanja djelomičnog ili potpunog pročišćavanja (ili pročišćavanja do homogenosti). Analitičke metode posebno odgovarajuće za pripravu čistog peptida su kromatografija ionskom izmjenom, ekskluzijska kromatografija; poliakrilamidna elektroforeza; izoelektrično fokusiranje. Posebno djelotvoran način pročišćavanja peptida je brza proteinska tekuća kromatografija ili čak HPLC.
Određeni aspekti sadašnjeg izuma tiču se pročišćavanja, i u posebnim izvedbama, bitno pročišćavanje, nekog kodiranog proteina ili peptida. Izraz "pročišćeni protein ili peptid" kako se koristi ovdje, namjeravan je da se odnosi na smjesu, koja se može izolirati od ostalih komponenata, gdje je protein ili peptid pročišćen do bilo kojeg stupnja relativno prema svom stanju koje se prirodno može dobiti. Pročišćeni protein ili peptid se stoga također odnosi na protein ili peptid, slobodan od okruženja u kojem se prirodno pojavljuje.
Općenito, "pročišćen" će se odnositi na smjesu proteina ili peptida koja je bila podvrgnuta frakcioniranju radi uklanjanja različitih drugih komponenata, i koja smjesa bitno zadržava svoju ekspresiranu biološku aktivnost. Gdje se koristi izraz "bitno pročišćen", ova oznaka će se odnositi na smjesu u kojoj protein ili peptid čine većinu komponenti u smjesi, kao što je učešće oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95% ili više proteina u smjesi.
Razni načini za kvantificiranje stupnja čistoće proteina ili peptida će biti poznati onima iskusnim u području u svjetlu današnjeg otkrića. Oni uključuju, na primjer, određivanje specifične aktivnosti aktivne frakcije ili određivanje količine polipeptida unutar frakcije s SDS/PAGE analizom. Poželjan način utvrđivanja čistoće frakcije je izračunati specifičnu aktivnost frakcije, usporediti je sa specifičnom aktivnosti početnog ekstrakta i prema tome izračunati stupanj čistoće, ovdje određena s "umnožak broja pročišćavanja". Aktualne jedinice korištene za predstavljanje količine aktivnosti će naravno biti ovisne o pojedinačnoj tehnici odabranoj da slijedi pročišćavanje i da li ili ne ekspresirani protein ili peptid pokazuju aktivnost koja se može detektirati.
Različite tehnike pogodne za uporabu u pročišćavanju proteina bit će dobro poznate onima iskusnim u području. One uključuju, na primjer, taloženje s amonijevim sulfatom, PEG, antitijelima i sličnim ili denaturiranje zagrijavanjem, nakon čega slijedi centrifugiranje; kromatografski stupnjevi kao što je ionska izmjena, gel filtriranje, reverzna faza i afinitetna kromatografija; izoelektrično fokusiranje; gel elektroforeza; i kombinacije takvih i drugih tehnika. Kako je općenito poznato u području, vjeruje se da redoslijed vođenja različitih stunjeva pročišćavanja mogu promijeniti, ili da se neki stupnjevi mogu ispustiti, i još rezultirati u pogodnom načinu priprave bitno pročišćenog proteina ili peptida.
Poznato je da migracija polipeptida može odstupati, ponekad značajno, s različitim stanjima SDS/PAGE (Capaldi i ostali, 1977.). Stoga će se cijeniti da uz različita stanja elektroforeze, neke molekulske težine pročišćenih ili djelomično pročišćenih produkata ekspresije mogu odstupati.
Tekućinska kromatografija visokog učinka (HPLC) je karakterizirana s vrlo brzim odijeljivanjem s izvanrednom rezolucijom pikova. To je postignuto korištenjem vrlo finih čestica i visokim tlakom radi postizanja odgovarajuće brzine protoka. Odijeljivanje može biti okončano u minutama, ili najviše jedan sat. Štoviše, samo vrlo mali volumen uzorka je potreban, jer su čestice toliko male i gusto pakirane te je prazan volumen vrlo mala frakcija ukupnog volumena. Također nije potrebno da koncentracija uzorka bude jako visoka, jer su vrpce toliko uske tako da postoji vrlo malo razrijeđenje uzorka.
Gel kromatografija ili kromatografija molekularnih sita, je posebna vrsta particijske kromatografije koja je temeljena na veličini molekule. Teorija koja stoji iza gel kromatografije je ta da stupac, koji je pripravljen sa sićušnim česticama inertne tvari koja sadrži male pore, odvaja veće molekule od manjih molekula kako one prolaze kroz ili oko pora, ovisno o njihovoj veličini. Tako dugo dok tvar od kojeg su načinjene čestice ne apsorbira molekule, jedini čimbenik određivanja brzine protoka je veličina. Molekule se eluiraju sa stupca prema smanjujućoj velićini, tako dugo dok je oblik relativno stalan. Gel kromatografija je nezaobilazna za odijeljivanje molekula različitih veličina zato jer je odijeljivanje neovisno od svih ostalih čimbenila, kao što su pH, ionska jakost, temperatura itd. Također praktički nema apsorpcije, manje širenje zone i zapremnina eluacije je povezana samo s molekulskom masom.
Afinitetna kromatografija je kromatografski postupak koji počiva na posebnom afinitetu između tvari koja će se izolirati i molekule koja se može specifično vezati na nju. To je receptor-ligand tip međudjelovanja. Tvar za stupac je sintetizirana kovalentnim vezanjem jednog od vezivajućih partnera na netopivi nosač. Tvar za stupac je tada sposobna specifično apsorbirati tvar iz otopine. Eluiranje se pojavljuje promjenom uvjeta u one u kojima se vezivanje neće pojaviti (promjena pH, ionske jakosti, temperature itd.).
F. Mutageneza inačica
Sadašnji izum predviđa da modifikacija afiniteta superantigena za NHC molekule klasa II može smanjiti otrovnost superantigena. Stoga, smanjeni afinitet za MHC molekule klase II rezultira u smanjenoj seroreaktivnosti ili smanjenoj reakciji s neutralizirajućim antitijelima ili endogenim ili prije nastalim antitijelima.
U specifičnim izvedbama će se mutageneza koristiti za modifikaciju područja superantigena koje određuje vezivanje na MHC klase II molekula. Mutageneza će se provesti različitim standardnim mutagenim postupcima. Mutacija je postupak gdje se promjene pojavljuju u količini ili strukturi nekog organizma. Mutacija može uključivati modifikaciju sekvence nukleotida pojedinog gena, bloka gena ili cijelog kromosoma. Promjene u pojedinom genu mogu biti posljedica mutacije na određenom mjestu, što uključuje uklanjanje, dodavanje ili supstituciju jedne nukleotidne baze unutar DNK sekvence, ili one mogu biti posljedica promjena koje uključuju umetanje ili unuštavanje velikog broja nukleotida.
Jedna posebno korisna tehnika mutageneze je mutageneza skeniranja alanina u kojoj je određen broj ostataka supstituiran pojedinačno s aminokiselinom alaninom tako da mogu biti određeni učinci gubitka pokrajnjih lanaca i njihovih interakcija, istovremeno minimalizirajući rizik perturbacija proteinske konformacije na velikoj skali (Cunningham i ostali, 1989.).
Prethodnih godina su se razvile tehnike za utvrđivanje konstante ravnoteže za vezanje liganda korištenjem vrlo malih količina proteina (U.S. Patent 5,221,605 i 5,238,808). Sposobnost izvedbe funkcijskih testova s malim količinama materijala se može iskorištavati za razvoj visoko učinkovitih, in vitro metodologija za zasićenu mutagenezu antitijela. Izumitelji su preskočili stupnjeve kloniranja kombiniranjem PCR mutageneze sa sparenom in vitro transkripcijom/translatacijom za visoko učinkovitu generaciju proteinskih mutanata. Ovdje su PCR produkti korišteni izravno kao templati za in vitro transkripciju/translataciju mutanta jednolančanih antitijela. Radi visoke učinkovitosti s kojom svih 19 aminokiselinskih supstitucija može biti generirano i analizirano na ovaj način, sada je moguće izvesti mutagenezu zasićenja na brojnim ostacima koji nas zanimaju, postupak koji može biti opisan kao in vitro skenirajuća zasićena mutageneza (Burke i ostali, 1997.).
In vitro skenirajuća zasićenas mutageneza osigurava brzi način za dobivanje velike količine informacija o strukturi-funkciji koja uključuje: (i) identifikaciju ostataka koji moduliraju specifičnost vezivanja liganda, (ii) bolje razumijevanje vezivanja liganda temeljeno na identifikaciji onih aminokiselina koje zadržavaju aktivnost i onih koje odbacuju aktivnost na danoj lokaciji, (iii) evaluaciju potpune plastičnosti nekog aktivnog mjesta ili proteinske subdomene, (iv) identifikaciju aminokiselinskih supstitucija koje rezultiraju u povećanom vezivanju.
Strukturom vođena, po mjestu specifična, mutageneza predstavlja moćni alat za izrezivanje i inžinjerstvo interakcija protein-ligand (Wells, 1996., Braisted i ostali, 1996.). Tehnika osigurava pripravu i ispitivanje inačica sekvence uvođenjem jedne ili više promjena sekvence nukleotida u odabranu DNK.
Po mjestu specifična mutageneza koristi specifičnu oligonukleotidnu sekvencu koja kodira DNK sekvencu željene mutacije, kao i dovoljan broj susjednih, nemodificiranih nukleotida. Na taj način je osigurana sekvenca početnika s dovoljnom veličinom i kompleksnosti da načini stabilan dupleks na obje strane mjesta spajanja koje je premošteno. Početnik od oko 17 do 25 nukleotida u dužini je poželjan, s oko 5 do 10 ostataka na obje strane mjesta spajanja sekvence koja je zamjenjena.
Tehnika tipično koristi vektor bakteriofaga koji postoji i u jednolančanom i dvolančanom obliku. Vektori korisni u mutagenezi usmjerenoj na mjesto uključuju vektore kao što su M13 fag. Ovi fag vektori su trgovački dostupni i njihovo korištenje je općenito dobro poznato onima iskusnima u području. Dvolančani plazmidi se također rutinski koriste u mutagenezi usmjerenoj na mjesto, što isključuje stupanj prijenosa gena koji nas zanima od faga u plazmid.
Općenito se prvo dobiva jednolančani vektor, ili se rastale dva lanca dvolančanog vektora, koji uključuje unutar svoje sekvence DNK sekvencu koja kodira željeni protein ili genetski element. Neki oligonukleotidni početnik koji nosi željenu mutiranu sekvencu, sintetski pripravljenu, je tada staljen s jednolančanim DNK pripravkom, uzimajući u obzir stupanj neslaganja kada se odabiru uvjeti hibridizacije. Hibridizirani produkt je podvrgnut DNK polimerizirajućem enzimu kao što je E. coli polimeraza I (Klenov fragment) s ciljem upotpunjavanja sinteze lanca koja nosi mutaciju. Tako je nastao heterodupleks, gdje jedan lanac kodira originalnu nemutiranu sekvencu, a drugi lanac nosi željenu mutaciju. Ovaj heterodupleksni vektor je tada korišten za transformaciju odgovarajućih stanica domaćina, kao što su stanice E. coli, i klonovi su odabrani da uključuju rekombinantne vektore koji nose mutiranu sekvencu.
Opsežna obavijest o funkcionalnom značenju i sadržaj obavijesti danog ostatka proteina može se najbolje dobiti mutagenezom zasićenja u kojoj su ispitane supstitucije svih 19 animokiselina. Nedostatak ovog pristupa je taj što je podrška multiostataka mutageneze zasićenja obeshrabrujuća (Warren i ostali, 1996.; Brown i ostali, 1996.; Zeng i ostali, 1996.; Burton i Barbas, 1994.; Yelton i ostali, 1995.; Jackson i ostali, 1995.; Short i ostali, 1995.; Wong i ostali, 1996.; Hilton i ostali, 1996.). Moraju se proučiti stotine, a moguće i tisuće po mjestu specifičnih mutanata. Međutim, poboljšane tehnike čine produkciju i brzi pregled mutanata mnogo jednostavnijom. Vidi također U.S. patente 5,798,208 i 5,830,650, za opis šetnje (walk-through) mutagenezom.
Ostali načini mutageneze usmjerene na mjesto su otkriveni u U.S. patentima 5,220,007; 5,284,760; 5,354,670; 5,366,878; 5,389,514; 5,635,377 i 5,789,166.
Dodatno biološki funkcionalnim ekvivalentima koji su proizvedeni korištenjem tehnika mutageneze raspravljanih gore, sadašnji izumitelji razmatraju također da strukturno slični spojevi mogu nastati imitacijom ključnih dijelova superantigena ili konjugata sadašnjeg izuma. Takvi spojevi, koji mogu biti nazvani peptidomimetici, se mogu koristiti na iste načine kao konjugati iz izuma i, stoga su također funkcionalni ekvivalenti.
Neki mimetici koji imitiraju elemente proteinske sekundarne i tercijarne strukture su opisani kod Johnson i ostali (1993). Razlog uporabe peptidnih mimetika je to što peptidna okosnica proteina postoji uglavnom radi orijentiranja aminokiselinskih pokrajnjih lanaca na takav način da olakšaju molekulska međudjelovanja, kao što su ona antitijelo i/ili antigen. Mimetik peptida je stoga dizajniran da dozvoljava molekulska međudjelovanja slična prirodnoj molekuli.
Neke uspješne primjene koncepta peptidnih mimetika su se usredotočile na mimetiku ß-okreta unutar proteina, koji je poznat kao jako antigenski. Vjerovatno se struktura ß-okreta unutar polipeptida može predvidjeti algoritmima temeljenim na računalu, kako je raspravljeno ovdje. Jedanput kada je određena komponenta okreta aminokiselina, mimetici se mogu konstruirati da postignu sličnu prostornu orijentaciju bitnih elemenata aminokiselinskih pokrajnjih lanaca.
Ostali pristupi su se usredotočili na korištenje malih proteina koji sadržavaju više disulfida, kao privlačnog strukturnog predloška za produkciju biološki aktivnih konformacija koji imitiraju vezajuća mjesta velikih proteina. Vita i ostali (1998.). Strukturni motiv koji je evolucijski konzerviran u određenim otrovima je mali (30-40 aminokiselina), stabilan i visoko dopuštajući za mutaciju. Ovaj motiv je sastavljen od beta površine i nekog alfa heliksa premoštenog u unutrašnjoj jezgri s tri disulfida.
Beta II okreti su mimicirani uspješno uporabom cikličkog L-pentapeptida i onih s D-aminokiselinama (Weisshoff i ostali, 1999.). Također su Johannesson i ostali (1999.) izvjestili o bicikličkim tripeptidima sa svojstvom induciranja obrnutog okreta.
Načini generiranja specifičih struktura su otkriveni u području. Na primjer, mimetici alfa-heliksa su otriveni u U.S. patentima 5,446,128; 5,710,245; 5,840,833 i 5,859,184. Ove strukture zadržavaju peptid ili protein više termalno stabilnim, također povećavaju otpornost na proteolitičku razgradnju. Otkrivene su šest-, sedam-, jedanaest-, dvanaest-, trinajest- i četrnaest-eročlane prstenaste strukture.
Načini generiranja konformacijski ograničenih beta okreta i beta izbočina su opisani, na primjer, u U.S. patentima 5,440,013; 5,618,914 i 5,670,155. Beta okreti dozvoljavaju promjene pokrajnjih supstituenata bez promjena u odgovarajućim konformacijama okosnice, i imaju odgovarajući kraj za ugradnju u peptide standardnim sintetskim postupcima. Ostale vrste mimetičkih okreta uključuju obrnute i gama okrete. Obrnuti okreti su otkriveni u U.S. patentima 5,475,085 i 5,929,237, a mimetici gama okreta su opisani u US patentima 5,672,681 i 5,674,976.
G. Ekspresija superantigena
Sadašnji izum također uključuje korištenje vektora ekspresije i stanice domaćina. Ovi vektori ekspresije, koji su genetskim inžinjeringom načinjeni da sadrže sekvencu nukleinskih kiselina konjugata, su uvedeni ili transformirani u stanice domaćina radi produkcije konjugata iz sadašnjeg izuma.
Stanice domaćina mogu genetskim inženjeringom ugrađivati sekvence nukleinskih kiselina i ekspresirati peptide iz sadašnjeg izuma. Uvođenje sekvence nukleinskih kiselina u stanicu domaćina može se postići s transfekcijom s kalcijevim fosfatom, DEAE-dekstran uzrokovanom transfekcijom, transvekcijom, mikroinjektiranjem, transfekcijom uzrokovanom kationskim lipidima, elektroporacijom, transdukcijom, tankim namazivanjem, balističkim uvođenjem, zarazom ili na ostale načine. Takvi načini su opisani u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što je Davis i ostali, TEMELJNI NAČINI U MOLEKULSKOJ BIOLOGIJI (1986) i Sambrook i ostali, MOLEKULSKO KLONIRANJE: LABORATORIJSKI PRIRUČNIK, drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
Reprezentativni primjeri odgovarajućih stanica domaćina uključuju bakterijske stanice, kao što su stanice streptokoka, stafilokoka, E. coli, streptomiceta i stanice Bacillus subtilis; gljivične stanice, kao što su stanice kvasca i stanice aspergillusa; stanice kukaca kao što su stanice Drosophila S2 i Spodoptera Sf9; životinjske stanice kao što su CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 i Bowes melanoma stanice.
II. Tretiranje raka
U sadašnjem izumu, superantigen je konjugiran na antitijelo ili fragment antitijela zbog lociranja i uništavanja stanica raka. Primjeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, rak pluća, dojke, debelog crijeva, bubrega, gušterače, jajnika, želuca, grlića maternice i prostate.
U jednom aspektu sadašnjeg izuma, tumorske stanice moraju nositi neki marker koji je odgovoran za ciljanje, to jest, nije nazočan na većini ostalih stanica. Mnogi tumorski markeri postoje i bilo koji od njih može biti pogodan za ciljanje u kontekstu sadašnjeg izuma. Specifični ciljevi sadašnjeg izuma uključuju antitijela. Antitijela koja se razmatraju u sadašnjem izumu uključuju, ali nisu ograničena na, Fab fragment. Primjeri Fab fragmenta uključuju C215Fab ili 5T4Fab. Kao dodatak Fab-u, drugi uobičajeni tumorski markeri uključuju karcinoembrionski antigen, specifični antigen prostate, antigen povezan s urinarnim tumorom, fetalni antigen, tirozinazu (p97), gp68, TAG-72, HMFG, sialični Lewisov antigen, MucA, MucB, PLAP, receptor estrogena, receptor laminina, erb B i p155.
Jedan drugi aspekt sadašnjeg izuma je korištenje neke imunostimulirajuće molekule kao sredstva, ili još poželjnije u konjukciji s drugim sredstvom, kao što su na primjer, citokini kao na primjer IL-2, IL-4, IL-12. GM-CSF, tumorski nekrozni faktor; interferoni alfa, beta i gama; F42K i ostali analozi citokina; kemokin kao što je na primjer MIP-1, MIP-1beta, MCP-1, RANTES, IL-8; ili faktor rasta kao što je na primjer FLT3 ligand. Stimulirajuća molekula može biti konjugirana na konjugat sadašnjeg izuma ili davana kao neki adjuvant u kombinaciji s konjugatom sadašnjeg izuma.
Jedan određeni citokin razmatran za korištenje u sadašnjem izumu je IL2 ili njegov derivat koji ima bitno istu biološku aktivnost prirodnog Il2. Interleukin-2 (IL-2), originalno označen faktor I rasta T-stanice, je visoko učinkovit u indukciji proliferacije T-stanica i faktor rasta za sve suppopulacije T-limfocita. Il-2 je antigen neovisni faktor proliferacije koji inducira napredak staničnog ciklusa u odmarajućim stanicama i stoga dozvoljava klonalnu ekspanziju aktiviranih T-limfocita. S obzirom da svježe izolirane stanice leukemije također izlučuju IL2 i odgovor na na njega, IL2 može djelovati kao neki autokrini modulator rasta za te stanice sposobne pogoršati ATL. IL2 također potiče proliferaciju aktiviranih B-stanica iako to zahtjeva nazočnost dodatnih čimbenika, na primjer, IL4. In vitro IL2 također stimulira rast oligodendroglijalnih stanica. Radi svojih učinaka na T-stanice i B-stanice IL2 je središnji regulator imunih odgovora. On također igra ulogu u protuupalnim reakcijama, kod hematopoeze i kod tumora. IL-2 stimulira sintezu IFN-γ kod perifernih leukocita i također inducira izlučivanje IL-1, TNF-α i TNF-β. Poticanje izlučivanja tumoricidalnih citokina, neovisno o aktivnosti u ekspresiji LAK stanica, (limfokin-aktivirane stanice ubojice) su vjerovatno glavni čimbenici odgovorni za antitumorsku aktivnost IL2.
Razmatrano je da se sadašnji izum može davati pacijentu koji pati od raka ili proliferativnog oboljenja. Količina koja se daje pacijentu je terapijski učinkovita količina ili neka količina koja rezultira u tretiranju raka ili oboljenja. Davanje konjugata može biti posebno alimentirano. Primjerno alimentarno davanje uključuje, ali nije ograničeno na, oralno, rektalno, podjezično ili kroz usta. Primjerno parenteralno davanje uključuje, ali nije ograničeno na, u potrbušnicu, u venu, potkožno, u mišić, u kožu, u tumor i u žilu.
III. Farmaceutski pripravci
Spojevi iz sadašnjeg izuma se mogu koristiti sami ili konjugirano s ostalim spojevima, kao što su terapijski spojevi.
Farmaceutski oblici pogodni za injektiranje uključuju sterilne vodene otopine i/ili disperzije; pripravci uključuju sezamovo ulje, kikirikijevo ulje i/ili vodeni propilen glikol; i/ili sterilne praške za nepripremljeni pripravak sterilne injektibilne otopine i/ili disperzije. U svim slučajevima oblik mora biti sterilan i/ili mora biti tekući tako da se lako uvuče u špricu. Mora biti stabilan pod uvjetima proizvodnje i/ili skladištenja i/ili mora biti konzerviran protiv zagađenja mikroorganizmima, kao što su bakterije i/ili gljivice.
Otopine aktivnih komponenata kao slobodne baze i/ili farmakološki prihvatljivih soli se mogu pripraviti u vodi pogodno pomiješanoj sa površinski aktivnom tvari, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije se također mogu pripraviti u glicerolu, tekućim polietilen glikolima, ili njihovim smjesama i/ili u uljima. Pod uobičajenim uvjetima skladištenje i/ili uporabe, ovi pripravci sadrže konzervans radi sprječavanja rasta mikroorganizama.
Konjugat sadašnjeg izuma može biti pripravljen u smjesu u neutralnom obliku i/ili kao sol. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kiselinske adicijske soli ( nastale sa slobodnim amino skupinama proteina) i/ili koje su nastale s anorganskim solima kao što su, na primjer, kloridna i/ili fosforna kiselina, i/ili takve organske kiseline kao što su octena, oksalna, vinska, bademova i/ili slične. Soli nastale sa slobodnim karboksilnim skupinama se također mogu dobiti iz anorganskih baza kao što su, na primjer, natrijev, kalijev, amonijev, kalcijev i/ili željezo hidroksid, i/ili takvih organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i/ili slične. U uvjetima korištenja peptidnih terapeutika kao aktivnih sastojaka, mogu se koristiti tehnologije U.S. patenata 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792 i/ili 4,578,770, svaki od njih je uključen ovdje pozivanjem na njega.
Nosač također može biti otapalo i/ili disperzijski medij koji sadržava, na primjer, vodu, etanol, poliol (na primjer, glicerol, propilen glikol i/ili tekući polietilen glikol i/ili slično), njihove pogodne mješavine i/ili biljna ulja. Odgovarajuća žitkost se može održavati, na primjer, korištenjem prevlakača, kao što je lecitin, održavanjem tražene veličine čestice u slučaju disperzije i/ili korištenjem površinski aktivnih tvari. Spriječavanje djelovanja mikroorganizama se može postići različitim antibakterijskim i/ili antigljivičnim sredstvima, na primjer, parabenima, klorbutanolom, fenolom, sorbičnom kiselinom, timerosalom i/ili sličnim. U mnogo slučajeva će biti poželjno uključiti izotonična sredstva, na primjer, šećere i/ili natrijev klorid. Produžena apsorpcija injektibilnih pripravaka se može dobiti korištenjem u pripravcima sredstava koja odgađaju apsorpciju, na primjer, aluminij monostearat i/ili želatina.
Sterilne injektivne otopine su pripravljene ugrađivanjem aktivnih spojeva u traženoj količini u odgovarajuće otapalo s raznim drugim sastojcima nabrojenim gore, kako se traži, nakon čega slijedi sterilizacija filtriranjem. Općenito, disperzije su pripravljene ugrađivanjem raznih steriliziranih aktivnih sastojaka u sterilno sredstvo koje sadrži temeljni disperzijski medij i/ili tražene ostale sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih prašaka za pripravu sterilnih injektibilnih otopina, poželjni načini priprave su sušenje u vakuumu i/ili liofilizacija koja daje prah aktivnog sastojka i bilo koji dodatni sastojak od njihovih prije sterilno filtriranih otopina. Također je razmatrana priprava više i/ili visoko koncentriranih otopina za izravno injektiranje, gdje je uporaba DMSO kao otapala vidljivo rezultirala u krajnje brzom prodiranju, isporučujući visoku koncentraciju aktivnih sredstava na malu površinu.
Nakon priprave će se otopine davati na način kompatibilan s dozom pripravka i/ili u takvoj količini koja je terapijski učinkovita. Pripravci su lako davani u različitim oblicima doza, kao što su vrste injektibilnih otopina opisanih gore, ali se također mogu primjeniti i kapsule koje otpuštaju lijek i/ili slično.
Za parenteralno davanje u vodenoj otopini, na primjer, otopina treba biti pogodno puferirana ukoliko je neophodno i/ili razrjeđenoj tekućini prvo zadržati izotoničnost s dovoljno zasićene otopine soli i/ili glukoze. Ove posebne vodene otopine su osobito pogodne za davanje u venu, u mišić, potkožno i/ili u trbuh. Povezano s tim, sterilni vodeni medij koji se može primjeniti bit će poznat onima iskusnim u području u svjetlu sadašnjeg otkrića. Na primjer, jedna doza može biti otopljena u 1 mL izotonične NaCl otopine i/ili dodana u 1000 mL u hipodermoklzične tekućine i/ili injektirana na predloženo mjesto infuzije (vidi na primjer, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. izdanje, str. 1035-1038 i/ili 1570-1580). Neke inačice u doziranju će se neophodno pojaviti ovisno o stanju subjekta koji se tretira. Osoba odgovorna za davanje će, u svakom slučaju, odrediti odgovarajuću dozu za pojedinca.
Aktivni konjugat i/ili sredstva mogu se pripraviti unutar terapijske smjese da obuhvaćaju oko 0,0001 do 1,0 miligrama i/ili oko 0,001 do 0,1 miligrama i/ili oko 0,1 do 1,0 i/ili čak oko 10 miligrama po dozi i/ili tako. Mogu se također davati umnožene doze.
Dodatno spojevima pripravljenim za izvorno davanje, kao što je injektiranje u venu, u zglob i/ili u mišić, ostali farmaceutski prihvatljivi oblici uključuju, na primjer tablete i/ili ostale krutine za davanje kroz usta; liposomalne pripravke; kapsule koje s vremenom otpuštaju i/ili bilo koji oblik trenutno u uporabi, uključujući kreme.
Netko također može koristiti nazalne otopine i/ili raspršivače, aerosole i/ili inhalatore u sadašnjem izumu. Nazalne otopine su obično vodene otopine predviđene za davanje kroz nazalne prolaze u kapljicama i/ili raspršivačima. Nazalne otopine su pripravljene tako da su slične u mnogim pogledima nazalnim izlučevinama, tako da se održava normalno cilijarno djelovanje. Stoga su vodene nazalne otopine obično izotonične i/ili lagano puferirane radi održavanja pH od 5,5 do 6,5. Dodatno se u pripravak mogu uključiti antimikrobijski prezervativi, slični onima koji se koriste u očnim pripravcima i/ili odgovarajući stabilizatori lijekova, ukoliko se traži. Poznati su različiti trgovački nazalni pripravci i/ili uključuju, na primjer, antibiotike i/ili antihistamine i/ili se koriste za profilaksu astme.
Dodatni pripravci koji su pogodni za druge načine davanja uključuju vaginalne supozitorije (čepiće) i/ili pesare. Također se mogu koristiti rektalni pesari i/ili čepići. Čepići su kruti oblici doze različitih težina i/ili oblika, obično namjenjeni za umetanje u rektum, vaginu i/ili mokračni kanal. Nakon ulaganja, čepići omekšaju, rastope se i/ili otope u tekućinama otvora. Općenito, za čepiće, tradicionalna veziva i/ii nosači mogu uključiti, na primjer, polialkilen glikole i/ili trigliceride; takvi čepići se mogu načiniti iz mješavina koje sadrže aktivni sastojak u rasponu od 0,5% do 10%, poželjno 1%-2%.
Oralni pripravci uključuju takve normalno korištene dodatke kao što su, na primjer, farmaceutski stupnjevi manitola, laktoze, škroba, magnezijevog stearata, natrijevog saharina, celuloze, magnezijevog karbonata i/ili slično. Ove smjese uzimaju oblik otopina, suspenzija, tableta, pilula, kapsula, pripravaka sa zadržanim otpuštanjem i/ili praškove. U nekim određenim izvedbama, oralne farmaceutske smjese će obuhvaćati neki inertni razrjeđivač i/ili asimilirajući nosač pogodan za jelo i/ili one mogu biti zatvorene u čvrste i/ili mekane kapsule želatine i/ili mogu biti stlačene u tablete i/ili mogu biti izravno ugrađene s hranom u prehrani. Za oralno terapijsko davanje, aktivni spojevi mogu biti ugrađeni s dodacima i/ili korišteni u obliku probavljivih tableta, tableta za usta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, hostija i/ili slično. Takve smjese i/ili pripravci trebaju sadržavati najmanje 0,1% aktivnog spoja. Postotak smjesa i/ili pripravaka može, naravno, odstupati i/ili može uobičajeno biti između oko 2 do oko 75% težine jedinice i/ili poželjno između 25-60%. Količina aktivnih spojeva u takvim terapijski korisnim smjesama je takva da će se dobiti pogodna doza.
Tablete, pastile, pilule, kapsule i/ili slično također mogu sadržavati: vezivo, kao guma tragakant, akacija, kukuruzni škrob i/ili želatina; dodatke, kao što je dikalcijev fosfat; sredstvo za raspadanje, kao što je kukuruzni škrob, krumpirov škrob, alginska kiselina i/ili slično; podmazivač, kao što je magnezijev stearat i/ili sredstvo za slađenje, kao što je saharoza, laktoza i/ili saharin mogu se dodati i/ili sredstvo za aromu, kao što je pepermint, ulje zimzelena i/ili aromu po višnji. Kada je oblik jedinične doze kapsula, ona može sadržavati, dodatno tvarima gornje vrste, tekući nosač. Različiti drugi materijali mogu biti nazočni kao prevlakači/ili drugačije modificirani fizikalni oblik jedinične doze. Na primjer, tablete, pilule i/ili kapsule mogu biti prevučene sa šelakom, šećerom i/ili s oboje. Sirup eliksira može sadržavati aktivne spojeve kao što je saharoza kao sladilo, metil i/ili propilparabene kao prezervative, boju i/ili aromat, kao što je aroma višnje ili naranče.
U nekim izvedbama je razmatrana uporaba lipidnih pripravaka i/ili nanokapsula za uvođenje konjugata i/ili sredstava, i/ili vektora genske terapije, uključujući oba, i divlju vrstu i/ili antisens vektore, u stanice domaćina.
Nanokapsule mogu općenito uhvatiti spojeve na stabilan i/ili reproducibalan način. Radi sprječavanja pokrajnjih učinaka zbog intracelularnog polimernog prepunjenja, takve ultrafine čestice (veličine oko 0,1 μm) bi trebale biti načinjene korištenjem polimera sposobnog da se raspadne in vivo. Bioraspadajuće polialkil-cijanoakrilatne nanočestice koje zadovoljavaju ove zahtjeva su razmatrane za uporabu u sadašnjem izumu, i/ili takve se čestice mogu lako načiniti.
U nekoj izvedbi izuma, konjugat može biti povezan s lipidom. Konjugat povezan s lipidom može biti kapsuliran u vodenoj unutrašnjosti liposoma, razasut unutar lipidnog dvosloja liposoma, prikvačen na liposom peko vezajuće molekule koja je povezana s oboje, i liposomom i oligonukleotidom, uhvaćen u liposom, kompleksiran s liposomom, disperziran u otopini koja sadrži lipid, smješan skupa s lipidom, kombiniran s lipidom, sadržan kao suspenzija u lipidu, sadržan ili kompleksiran s micelom, ili na drugi način povezan s lipidom. Lipid ili lipid/konjugat povezane smjese sadašnjeg izuma nisu ograničene na bilo koju pojedinačnu strukturu u otopini. Na primjer, oni mogu biti nazočni u dvoslojnoj strukturi, kao što su micele, ili s urušenom strukturom. Oni također mogu jednostavno biti razasuti u otopini, moguće oblikovati agregate koji nisu jednoliki bilo po veličini, bilo po obliku.
Lipidi su masne tvari koje mogu prirodni ili sintetski lipidi. Na primjer, lipidi uključuju masne kapljice koje se prirodno pojavljuju u citoplazmi isto tako kao i klasa spojeva koji su dobro poznati onima iskusnim u području, koji sadrže alifatske ugljikovodike i njihove derivate, kao što su masne kiseline, alkoholi, amini, amino alkoholi i aldehidi.
Fosfolipidi se mogu koristiti za pripravu liposoma prema sadašnjem izumu i mogu nositi pozitivni, negativni ili neutralni naboj. Diacetil fosfat se može koristiti da doprinese negativnom naboju na liposomima, a stearilamin se može koristiti da doprinese pozitivnog naboja na liposomima. Liposomi mogu biti načinjeni od jednog ili više fosfolipida.
Neutralno nabijeni lipidi mogu obuhvatiti lipid bez naboja, bitno nenabijeni lipid, ili smjesu lipida s jednakim brojem pozitivnih i negativnih naboja. Pogodni fosfolipidi uključuju fosfatidil koline i ostale koji su dobro poznati onima iskusnim u području.
Lipidi koji su pogodni za korištenje prema sadašnjem izumu mogu se dobiti iz trgovačkih izvora. Na primjer, dimiristil fosfatidilkolin ("DMPC") se može dobiti od Sigma Chemical Co., diacetil fosfat ("DCP") je dobiven iz K & K Laboratories (Plainview, NY); kolesterol ("Chol") je dobiven od Calbiochem-Behring; dimiristil fosfatidilglicerol ("DMPG") i ostali lipidi se mogu dobiti od Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.). Standardna otopina lipida u kloroformu ili kloroform/metanolu se može skladištiti kod oko -20°C. Poželjno, kloroform se koristi kao jedino otapalo jer se puno lakše uparava od metanola.
Fosfolipidi iz prirodnih izvora, kao što su fosfatidilkolin iz jaja ili soje, fosfatidična kiselina iz mozga, fosfatidilinosite iz mozga ili biljke, kardiolipin iz srca i biljni ili bakterijski fosfatidiletanolamin se poželjno ne koriste kao primarni fosfatidi, to jest, čineći 50% ili više od ukupne fosfatidne smjese, zbog nestabilnosti i curenja rezultirajućih liposoma.
Fosfolipidi mogu oblikovati brojne strukture različite od liposoma kada se dispergiraju u vodi, ovisno o molarnom odnosu lipida prema vodi. Kod niskih odnosa je liposom poželjna struktura. Fizikalne osobine liposoma ovise o pH, ionskoj jakosti i/ili nazočnosti divalentnih kationa. Liposomi mogu pokazivati nisku propusnost prema ionskim i/ili polarnim tvarima, ali kod povišenih temperatura prolaze fazni prijelaz koji značajno mijenja njihovu propusnost. Fazni prijelaz uključuje promjenu od blisko pakiranih, uređenih struktura, poznatih kao stanje gela, do slabo pakirane, manje uređene strukture, poznate kao tekuće stanje. To se pojavljuje kod karakteristične temperature faznog prijelaza i/ili rezultira u povećanju propusnosti prema ionima, šećerima i lijekovima.
Liposomi međusobno djeluju sa stanicama preko četiri različita mehanizma: Endocitozom fagocitičnih stanica retikuloendotelijalnih stanica kao što su makrofagi i/ili neutrofili; apsorpcijom na staničnu površinu, bilo nespecifičnim slabim hidrofobnim i/ili elektrostatskim silama, i/ili specifičnim međudjelovanjima s komponentama površine stanice; fuzijom s plazmom stanične membrane umetanjem lipidnog dvosloja liposoma u plazmatsku memranu, s istovremenim otpuštanjem liposomalnog sadržaja u citoplazmu; i/ili prijenosom liposomalnih lipida u stanične i/ili podstanične membrane, i/ili obrnuto, bez bilo kakve asocijacije sadržaja liposoma. Mijenjajući pripravak liposoma može se promijeniti mehanizam koji djeluje, premda više od jednog može djelovati u isto vrijeme.
S liposomom povezana dostava oligonukleotida i ekspresija strane DNK u vitro je bila jako uspješna. Wong i ostali (1980.) su pokazali isplativost s liposomom povezane dostave i ekspresiju strane DNK u uzgojenom pilećem embriju, HeLa i hepatomskim stanicama. Nicolau i ostali (1987.) su postigli uspješan s liposom povezan prijelaz gena kod štakora nakon intravenoznog injektiranja.
Kod nekih izvedbi izuma, lipid može biti povezan s hemaglutinirajućim virusom (HVJ). Pokazano je da to olakšava fuziju sa staničnom membranom i promovira stanični ulaz u liposomu kapsulirane DNK (Kaneda i ostali, 1989.). U ostalim izvedbama, lipid može biti kompleksiran ili uključen u konjukciju s nuklearnim ne histonskim kromosomalnim proteinima (HMG-1) (Kato i ostali, 1991.). U još daljim izvedbama, lipid može biti kompleksiran ili uključen u konjukciju s oba i HVJ i HMG-1. U tome takvi vektori ekspresije su uspješno korišteni u prijenosu i ekspresiji oligonukleotida in vitro i in vivo, tada su oni primjenjljivi za sadašnji izum. Kada je uključen bakterijski promotor u DNK konstrukciji, također će biti poželjno uključiti unutar liposoma odgovarajuću bakterijsku polimerazu.
Liposomi korišteni prema sadašnjem izumu m ogu se načiniti na različite načine. Veličine liposoma odstupaju ovisno o načinu sinteze. Liposom suspendiran u vodenoj otopini je općenito u obliku sferične čestice, i ima jedan ili više koncentričnih slojeva lipidnih dvoslojnih molekula. Svaki sloj se sastoji od usporednih molekula predstavljenih formulom XY, gdje je X hidrofilna skupina i Y je hidrofobna skupina. U vodenoj suspenziji, koncentrični slojevi su postavljeni tako da hidrofilni dijelovi nastoje ostati u dodiru s vodenim slojem, a hidrofobna područja se nastoje sama povezati. Na primjer, kada je nazočan vodeni dio unutar kao i bez liposoma, lipidne molekule mogu oblikovati dvosloj, poznat kao lamela uređenja XY-YX. Agregati lipida mogu nastati kada hidrofilni i hidrofobni dijelovi više nego jedne lipidne molekule postanu povezani jedni sa drugima. Veličina i oblik ovih agregata će ovisiti o mnogo različitih varijabli, kao što su priroda otapala i nazočnost drugih spojeva u otopini.
Liposomi unutar raspona sadašnjeg izuma se mogu pripraviti u skladu s poznatim laboratorijskim tehnikama. U jednoj poželjnoj izvedbi, liposomi su pripravljeni miješanjem liposomalnih lipida, u otapalu u spremniku, na primjer, staklenoj, kruškolikoj tikvici. Spremnik bi trebao imati zapremninu deset puta veću od zapremnine očekivane suspenzije liposoma. Korištenjem rotacijskog uparivača, otapalo je uklonjeno kod približno 40°C uz negativni tlak. Otapalo je normalno uklonjeno unutar oko 5 minuta do 2 sata, ovisno o željenomj zapremnini liposoma. Smjesa se može dalje sušiti u eksikatoru pod vakuumom. Osušeni lipidi se općenito bacaju nakon oko 1 tjedan radi sklonosti deterioracije s vremenom.
Sušeni lipidi se mogu hidratirati kod približno 25-50 mM fosfolipida u sterilnoj, apirogenoj vodi treskanjem dok se sav lipidni film ne resuspendira. Vodeni liposomi se tada mogu odijeliti u alikvote, od kojih se svaki smješta u bočicu, liofilizira i začepi uz vakuum.
U drugom načinu, liposomi se mogu pripraviti u skladu s drugim poznatim laboratorijskim postupcima: način Bangham i ostalih, (1965), čiji načini su ovdje uključeni pozivanjem na njih, način Gregoriadisa, kako je opisan u NOSAČI LIJEKOVA U BIOLOGIJI I MEDICINI, G. Gregoriadis izdavač (1979) str. 287-341, sadržaj kojeg je ovdje uključen pozivanjem na njega; i način uparavanja reverznom fazom kako su opisali Szoka i Papahadjopoulos (1978). Ranije spomenuti načini se razlikuju u njihovim sposobnostima hvatanja vodene tvari i njihovih odnosa vodenih prostora prema lipidu.
Sušeni lipidi ili liofilizirani liposomi pripravljeni kako je gore opisano mogu se dehidrirati ili rekonstruirati u otopini inhibitornog peptida i razrjediti na odgovarajuću koncentraciju s pogodnim otapalom, na primjer, DPBS. Miješavina se tada jako treska u vortex mikseru. Nekapsulirane nukleinske kiseline se uklone centrifugiranjem kod 29,000 x g i liposomalni peleti se isperu. Isprani liposomi su ponovno suspendirani kod neke odgovarajuće ukupne koncentracije fosfolipida, na primjer, oko 50-200 mM. Količina kapsuliranih nukleinskih kiselina se može odrediti u skladu sa standardnim načinima. Nakon određivanja količine kapsuliranih nukleinskih kiselina u pripravku liposoma, liposomi se mogu razrijediti do odgovarajuće koncentracije i držati kod 4°C do korištenja.
Farmaceutski pripravak koji obuhvaća liposome će uobičajeno uključivati sterilni, farmaceutski prihvatljiv nosač ili razrjeđivač, kao što je voda ili zasićena otopina soli.
IV PRIMJERI
[0136] Slijedeći primjeri su uključeni da bi pokazali poželjne izvedbe izuma. Netko iskusan u području bi trebao cijeniti što otkrivene tehnike u primjerima koji slijede predstavljaju tehnike otkrivene od izumitelja, koje funkcioniraju dobro u primjeni izuma i stoga se mogu smatrati da čine poželjni način za njegovu primjenu. Međutim, oni iskusni u području, u svjetlu sadašnjeg otkrića, cijene što mnoge promjene mogu biti načinjene u specifičnim izvedbama koje su otkrivene i još dobiti rezultat sličan ili nalik bez udaljavanja od duha i raspona izuma.
Primjer 1
Mutageneza in vitro
Različite inačice superantigena su načinjene korištenjem načina temeljenog na lančanoj reakciji polimeraze (PCR).
Ukratko, PCR produkti sadržavaju dva jedinstvena mjesta restriktivnog enzima, jedno na svakom kraju. Za postupke podkloniranja je korišten pUC19, (GIBCO BRL Life Technologies, Midllesex, U.K.), pripravljen prema QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol-u (QIAGEN, Hilden, Njemačka). Točkaste mutacije koje ne djeluju na aminokiselinsku sekvencu su bile uključene za olakšavanje daljnjih analiza. PCR reakcija je izvedena na Perkin Elmer Gene Amp PCR sustavu 2400 s Taq DNK polimerazom i odgovarajućim PCR puferom koji je sadržavao 15 mM MgCl2 (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Švicarska). PCR produkti i vektori su cijepani preko noći s odgovarajućim restrikcijskim enzimima. Oni su pročišćeni korištenjem elektroforeze u 1%-tnom agaroznom gelu (GIBCO BRL Life Technologies) koji je sadržavao 0,5 μg/mL etidijum-bromida (Sigma-Aldrich, Steinheim, Njemačka) u TAE puferu (Sigma-Aldrich). Fragment koji je sadržavao DNK je izrezan iz gela i ekstrahiran korištenjem CONSERT™ Rapid Gel Extraction sustava (GIBCO BRL Life Technologies). Vektor i umetak su ligatirani (T4 DNK ligaza, Roche Molecular Biochemicals) kod sobne temperature kroz 3-4 sata. Ligacijska smjesa je transformirana u DH5α lanac Echerichia coli (GIBCO BRL Life Technologies), prema priloženim uputstvima, uz stanice. Pozitivni klonovi su potvrđeni korištenjem DNK sekvencioniranja. Ispravne sekvence su skinute s RsrII/HindIII kod 37°C preko noći i ligatirani u ekspresijskom vektoru (Dohlsten i ostali, 1994.). Razni dijelovi Faba su promijenjeni za C215 da pristaju kućnim životinjskim modelima. Konstrukcija je konačno elektroporirana u Echerichia coli K12 spoj UL635 (xyl-7, ara-14, T4R, Δοmpt).
Primjer 2
Identifikacija humanih anti-SEA vezivajućih područja
Područja koja je prepoznao humani anti-SEA su identificirana iz pepsinom obrađenog SEA ili kimeričnom inačinom SEA ili SEE, SEA/E-18, ranije opisanom kao SEE/A-A (Antonsson i ostali, 1997.) sa supstitucijom D227A.
Svaki superantigen je inkubiran s 0,5%-tnim pepsinom 10 mM HCl, 150 mM NaCl (težinski) kroz 60 minuta kod 37°C. Peptidna smjesa je neutralizirana s 2M Tris-HCl pH 8,0 i nanešena na 1 mL HiTrap stupac (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Švedska) s imobiliziranom ljudskom SEA. PBS, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,3 su korišteni kao pufer za ispiranje i fragmenti koji vežu antitijela su eluirani korištenjem 0,1 M octene kiseline pH 3,0. Fragmenti su identificirani i prije i nakon pročišćavanja s HPLC povezanim s masenim spektrometru (MS) (Sl. 1). Kromatografija je provedena na C18 stupcu (2 x 250 mm) (VYDAC™, Hesperia, California, USA) korištenjem linearnog gradijenta od 10 do 60% acetonitrila u 0,1%-tnoj trifluoroctenoj kiselini kroz 30 minuta kod 40°C. Masena detekcija je provedena korištenjem MS (Finnigan LCQ, Termoquest, San Jose, California, USA). Fragmenti nađeni u enzimskom hidrolizatu kod istog retencijskog vremena i prije i nakon afinitetnog pročišćavanja su se smatrali pozitivnima (Sl. 2).
Primjer 3
Molekulsko modeliranje
Kimerični superantigen SEA/E-18 je temeljen na SEE sekvenci osim za četiri aminokiselinska ostatka blizu N-kraja koje su bile od SEA i supstituciju u dijelu D227A C-kraja (Sl. 3 i Sl. 4)(Antonsson i ostali, 1997.).
Ukratko, trodimenzionalne strukture superantigena s mnogo višom identičnošću sekvence prema SEE koje su bile dostupne od PBD, su korištene kao templati za konstrukciju homolognog modela SEAE-18, to jest, SEA (1ESF, Shard i ostali, 1SXT, Sundstrom i ostali, 1996. A), SED (Sundstrom i ostali, 1996. B) i SEH (1ENF) (Hakansson i ostali, 2000.). SEA je bila najsličnija prema SEE sa identičnošću sekvence od 80%. SED je imala identičnost sekvence od 60% i SEH 50% prema SEE.
Konstrukcija modela je provedena korištenjem HOMOLOGNY modula i INSIGHTII softveru (MSI, San Diego). Strukture za tri superantigena SEA, SED i SEH su poravnate i određena su strukturno konzervirana područja (SCRs) (Sl. 3). Ova područja su tipično ucrtana u regularnoj sekundarnoj strukturi u molekulama. Sirova sekvenca za SEA/E-18 je upisana i proučen preko SCR od strukture SEA (Sl. 5) 1SXT koordinate za SEA su bile korištene osim za prvih devet ostataka na N-kraju gdje je korišten 1ESF. Područja između SCR su bila u najvećem broju slučajeva područja fleksibilne petlje i bile su ugrađene od SEA i SED. Najveći broj petlji su izgrađene od SEA osim za ostatke Gln19, Ile140, Asp141, Lys142, Ser189, Gly191, Asp200, Pro206, Asp207 i Leu224, koje su ugrađene od SED. Neke površine unutar SCR su pokazale veću sličnost sekvenci sa SED i stoga su bile ugrađene korištenjem SED kao strukturalnog templata (Ile37, Glu49, Asn50, Thr51, Leu52, Ser195 i Thr218)(Sl. 3).
Zahvaljujući činjenici da je SEA korišten kao strukturalni templat za većinu ostataka u SEA/E-18, nisu se pojavili problemi vezani s preklapanjem pokrajnjih lanaca. Povezne točke prije i poslije SCR su popravljene. Najprije su supstituirani pokrajnji lanci relaksirani i tada su minimalizacijom energija i molekularno dinamičkom simulacijom relaksiran svi pokrajnji lanci unutar SCR korištenjem standardnih protokola u HOMOLOGY. Područja petlji su relaksirana jedna po jedna koristeći prvih 1000 stupnjeva minimalizacije energije nakon čega slijedi 1000 stupnjeva molekularne dinamike. Ovaj oplemenjeni protokol je primjenjen prvo na petlju pokrajnjih lanaca i tada na sve atome u petlji. Za sve simulacije je korišteno CVFF polje sile s konstantom sile od 100 kcal/Å2 uporabom vremenskog razmaka od 2 fs.
Konačni model je testiran na loša područja korištenjem PROSTAT modula u INSIGHTTI. Nisu otkrivena loša područja. Unutrašnjost proteina je pakirana u redu bez značajne razlike u usporedbi sa SEA. Svi ostaci su bili u dozvoljenim područjima u ramachandran dijagramu. Preklapanje 1SXT s modelom je rezultiralo s RMSD od 0,4Å kada su uspoređeni Cα atomi. Glavna razlika između dviju struktura je viđena u petlji β9-β10 (ostaci His187-Thr193)(Sl. 5).
Novi modeli novih inačica superantigena su konstruirani korištenjem SEA/E-18 modela kao templata. Specifični aminokiselinski ostaci su izmjenjeni izravno na modelu. Najpoželjnija konformacija pokrajnog lanca je odabrana korištenjem jednostavnim pretraživanjem steričke smetnje i nakon toga kratkom minimizacijom energije.
Primjer 4
Uzgajanje i pročišćavanje
C215FabSEA/E kimere su ekspresirane kao fuzijski proteini u E. coli K12 lancu UL635 korištenjem plazmida s IPTG induciranim Lac UV-5 promotorom i genom otpornim na kanamicin.
Ukratko, bakterije iz smrznutih (-70°C) prethodno pripravljenih, 20%-tnih otopina u glicerolu su inkubirane kod 25°C kroz 22-24 sata u tikvici za trešenje koja je sadržavala (po litri) 2,5 g (NH4)2SO4, 3 g KH2PO4, 2 g K2HPO4, 0,5 g natrijevog citrata, 1 g MgSO4 x H2O, 0,05 g kanamicina, 12 g glukoza monohidrata i 1 mL otopine elemenata u tragovima, međutim bez Na2MoO4 x 2H2O. Stanice su rasle do Abs620 2-3 i 10 mL uzgojnog medija je korišteno za inokulaciju fermentera od 1 L (Belach Bioteknik, Švedska) s početnom zapremninom od 800 mL. Medij u fermentoru je sadržavao (po litri) 2,5 g (NH4)2SO4, 9 g KH2PO4, 6 g K2HPO4, 0,5 g natrijevog citrata, 1 g MgSO4 x 7H2O, 0,05 g kanamicina, 23,1 g glukoza monohidrata i 1 mL otopine elemenata u tragovima kao gore. pH je držan stalnim kod 7,0 titriranjem s 25%-tnim NH3, aeracija je bila 1 litra/minuti i temperatura 25°C. Tijekom šaržne faze otopljeni O2 je održavan kod 30% reguliranjem okretanja od 400 okretaja u minuti do 2000 okretaja u minuti i tijekom šarže dodavanja reguliranjem dodavanja glukoze (60% težine/zapremnini). Nastajanje produkta je inducirano kada je Apsorbancija kod 620 nm bila 45 dodavanjem 0,1 mM izopropil-β-D-tiogalaktopiranozida (IPTG). Nakon fermentacije su stanice uklonjene centrifugiranjem kod -20°C prije pročišćavanja.
Postupak pročišćavanja je podijeljen u tri stupnja. Prvo je uklonjena DNK iz supernatanta uzgoja s 0,19%-tnim polietileniminom (težinski/zapremnina) u 0,2 M NaCl, pH 7,4, korištenjem peristaltičke crpke s brzinom protoka od 12 mL/minuti. Nakon centrifugiranja kod 7500 x g kroz 30 minuta, supernatant je ohlađen.
Nanešen je na 60 mL protein-G Sepharose 4, stupac s brzim protokom (Amersham Pharmacia Biotech) s brzinom protoka od 14 mL/minuti. Stupac je ispran korištenjem PBS i eluiranje je provedeno s 100 mM octenom kiselinom, 0,025% Tween 20, pH 3,0. Eluirani produkt je skupljen i pH je podešen na 1,5 jedinica ispod teorijske izoelektrične točke s 1 M NaOH, filtriran (0,2 μm) i razrjeđen četiri puta s 0,025%-tnim Tween 20. Raspadnute inačice su uklonjene korištenjem ionsko-izmjenjivačke kromatografije. Ionska jakost uzorka je podešena na 2 mS/cm i korišteni stupac je bio SP-Sepharose-HP, Hiload 16/10 (Amersham Pharmacia Biotech). Eluiranje je provedeno s protokom 4,0 mL/minuti kroz 50 minuta korištenjem linearnog gradijenta od 0-55% pufera B, 100 mM NaAc, 400 mM NaCl, 0,025% Tween 20, pH 5,0 u puferu A, 10 mM NaAc, 0,025% Tween 20, pH 5,0.
Primjer 5
Seroreaktivnost
Reaktivnost između inačica superantigena i humanog anti-SEA je izmjerena u scintilacijskom testu srodstva (engl. Scintillation Proximity Assay) (SPA).
U mikrotitarskoj ploči (OptiPlate, Packard Instruments) su inkubirane streptavidinom prevučena PVT zrnca, 150 μg zrnaca/jažici (Amersham Pharmacia Biotech) sa biotin konjugiranim F(ab)2 fragmentima anti-mišjeg IgG, 3 μg/mg zrnaca kroz 30 minuta kod sobne temperature. Zrnca su predinkubirana s C215Fab konjugiranim superantigenima u 1:2 razrjeđenoj seriji, gdje je najveća konačna koncentracija u jažicama bila 40 nM. Konačno su inkubirani s 1 nM 125I konjugiranim, afinitetno pročišćenim, humanim anti-SEA antitijelima i količina -scintilacije je izmjerena u Top-Counteru (Packard Instruments).
Reaktivnost humane anti-SEA za inačice superantigena je također izmjerena u enzim-povezanom imunosorbentskom testu, ELISA (Cavallin i ostali, 2000.). Rezultati su bili slični onima dobivenima u SPA.
Primjer 6
Biološka funkcija
Sposobnost induciranja o superantigen antitijelu ovisne stanične citotoksičnosti, SADCC i o superantigen ovisne o stanične citotoksičnosti, SDCC je uspoređen u standardnom 4h 51Cr-oslobađajućim testom.
Ukratko, ciljevi koji su korišteni za SDCC su bile humane B-stanice limfoma Raji stanice i ciljevi za SADCC su bile humane stanice karcinoma debelog crijeva Colo205. Stanice su označene s 51Cr i razrjeđene na koncentraciju od 50000 stanica/mL u mikrotitarske jažice V-oblika. Kao efektorske stanice je korištena SEA reaktivna humana T-stanična linija kod nekog efektora prema omjeru ciljanja od 45:1 za SADCC i 30:1 za SDCC. Sag inačice su dodane u koncentraciji od 10-9 – 10-16 M za SADCC i od 10-7 – 10-14 M za SDCC. Supernatanti su skupljeni i oslobođeni od 51Cr je izmjeren u TopCount-u (Packard Instruments). Postotak specifične citotoksičnosti je izračunat kao 100 x [(cpm eksperimentalno oslobađanje – cpm pozadinsko oslobađanje)/(cpm ukupno oslobađanje – cpm pozadinsko oslobađanje)].
Primjer 7
Identifikacija epitopa antitijela
Kod pacijenata, ranije postojeća tijela prema superantigenima s zakomplicirala njihovu kliničku primjenu, zahtjevajući podešavanje njihovog doziranja u terapiji (Alpaugh i ostali, 1998.). Drugi pristup ograničenja utjecaja ranije nastalih antitijela je bio modificirati područje superantigena odgovornog za vezivanje T-staničnog receptora (Antonsson i ostali, 1997.). Međutim, sadašnji izum je dalje poboljšao terapijske mogućnosti superantigena korištenjem genetskog inženjeringa za uklanjanje epitopa antitijela superantigena.
Nađeno je da SEE pokazuje jako smanjenje reaktivnosti antitijela u usporedbi prema SEA (Antonsson i ostali, 1997.). Na nesreću, s ovim smanjenjem je bilo i značajno smanjenje svojstva ubijanja tumora kada se spoji na tumor reaktivni Fab (Antonsson i ostali, 1997.). Stoga su proučene kimerične konstrukcije SEA i SEE. Kada su se uvodile odgovarajuće aminokiseline iz SEA u četiri položaja u TCR-vezajućem području SEE, dobivene su željene osobine. Ove supstitucije; Arg20Gly, Asn21Thr, Ser42Gly i Arg27Lys (područje A) kod SEE, rezultiralo je u kimeri SEA/E-18 (Sl. 4) (Antonsson i ostali, 1997.). Ova kimera je pokazivala više od 50% smanjenja reaktivnosti antitijela, kao kod SEE, dok je zadržavala djelotvornu razinu citotoksičnosti, kao kod SEA. Dodatno, radi smanjenja afiniteta između superantigena i MHC klase II, koja smanjuje SDCC i stoga poboljšava terapijski prozor, SEA/E-18 također sadrži supstituciju Asp227Ala (Abrahmsén i ostali, 1995.).
Za daljnje smanjenje sposobnosti humanog anti-SEA da prepozna SEA/E-18, određena su antitijela koja vežu epitope unutar superantigena. Peptidni fragmenti od djelomičnog pepsinskog hidrolizata bilo SEAwt ili SEA/E-18 su uhvaćeni korištenjem imobiliziranih anti-SEA antitijela. Nakon pročišćavanja, peptidna sekvenca je identificirana korištenjem LC-MS (Sl. 1). Stoga su moguća područja uključena u prepoznavanje antitijela lokalizirana u aminokiselinskoj sekvenci. Za zabilježiti je da je većina izoliranih peptida bila smještena oko područja poznatih da međudjeluju s MHC klasom II (Abrahmsén i ostali, 1995.) (Sl. 2 i Sl. 6). Trodimenzionalna struktura SEA (Schad i ostali, 1995.; Sundström i ostali, 1996.) i kompjutorski model SEA/E-18 (Sl. 5), temeljena na kristalnoj strukturi SEA (Schad i ostali, 1995.; Sundström i ostali, 1996. A) je korištena za lociranje na površinu izloženih ostataka unutar identificiranih peptida. Slijedeći ostaci su identificirani kao izloženi i mogući kandidati za epitope koji vežu antitijela: Glu34, Lys35, Glu39, Asn40, Lys41, Glu42, Asp44, Asp45, Glu 49, Lys74, Asp75, Asn78, Lys79, Lys81, Lys83, Lys84, Asp173, His187, Ser189, Glu190, Gln204, Lys217, Asn220, Glu222, Asn223, His225 i Asp227 (Tablica 1).
Ovi ostaci su nakon toga supstituirani da smanje vezanje na antitijela. Novi računalni modeli s daljnjim poboljšanjem Sag inačica su neprekidno rađeni da potvrde i usporede tražene rezultate s novijim. Specifični utjecaj pokrajnjih lanaca je proučavan i identificirane su promjene koje djeluju na stabilnost proteina.
Primjer 8
Modifikacija superantigena radi smanjenja seroreaktivnosti
Razine vezanja antitijela identificiranih ostataka su početno karakterizirane s dvije do šest istovremenih supstitucija kod SEA/E-18. Stoga su dobivene Sag inačice SEA/E-62 (Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala) (područje E), SEA/E-63 (Ser189Asp, Glu190Ala) (područje D), SEA/E-64 (Glu34Lys, Glu35Lys, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys) (područje B), SEA/E-65 (Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Glu, Lys84Glu) (područje C), SEA/E-74 (Asp44Ala, Asp45Ala, Glu49Thr) (područje B) i SEA/E-75 (Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser) (područje C) (Tablica 1, Sl. 4).
Razvijen je scintilacijski test srodstva (SPA) za istraživanje da li anti-SEA antitijela iz humane IgG rezerve (izvora) mogu prepoznati različite Sag inačice. Modificirane inačice su sve prepoznate u manjem obimu u usporedbi prema SEA/E-18 (Tablica 1). Najbitnije smanjenje u vezivanju je uzrokovano supstitucijama načinjenim u SEA/E-65. U SPA analizi je opaženo smanjenje od više od 40% (Sl. 7). Međutim, mnoge zamjene također generiraju smanjenje u razini produkcije E. coli i dodatno, biološka aktivnost je isto tako povremeno smanjena. Pregledavanjem zamjena mi možemo identificirati odgovorne ostatke unutar svake inačice i isključiti ih ili modificirati da bi dobili bolja svojstva. Općenito, razina produkcije je povećana hidrofilnim zamjenama u usporedbi s onima više hidrofobnim.
Smanjenje vezanja antitijela je sinergistički povećano kada su inačice kombinirane, kao kod SEA/E-91 koju čini SEA/E-63, SEA/E-65 i modificirani SEA/E-74 (s divljom vrstom Asp45) (Tablica 1). Inačica s najboljim rezultatom u SPA analizi sa smanjenjem vezivanja blizu 70% u usporedbi prema SEA/E-18 je bila SEA/E-110, kombinacija SEA/E-63, SEA/E-75 i modificiranog SEA/E-62 (SEA/E-97), SEA/E-64 (SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) i SEA/E-74 (wt Asp45) (Sl. 7, Tablica 1). Modifikacije odgovorne za najviše smanjenja u vezivanju antitijela su bile unutar SEA/E-109 (Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49Thr, Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser, Lys84Ser) kombinacije SEA/E-75 i modificirane SEA/E-64 (SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) i SEA/E-74 (wt Asp45). To je zbog toga što inačice superantigena koje sadrže ove supstitucije, sve pokazuju dobro smanjenje u SPA analizi.
Stoga su ostaci supstituirani u SEA/E-62, SEA/E-64, SEA/E-65 i SEA/E-74 rezultirali u između 20 i 40% smanjenja vezivanja antitijela u usporedbi s SEA/E-18 (Tablica 1).
Primjer 9
Zamjene koje utječu na razine produkcije
Kako je naznačeno gore, neke od supstitucija na površini superantigena su rezultirale u smanjenju razina produkcije kod E. coli. Mnoge kombinacije takvih zamjena nije čak bilo moguće proizvesti. Stoga je odlučeno istražiti alternativne modifikacije onih ostataka koji očito uzrokuju smanjenje u iskorištenju. Supstitucije koje djeluju na iskorištenje bez smanjenja vezivanja na antitijela nisu dalje istraživane. Umjesto toga su korišteni ostaci divlje vrste.
U početnom paketu inačica superantigena, ostatak Lys35 u SEA/E-64 je djelovao na razinu ekspresije negativno. Kada se koristio ostatak divlje vrste na položaju 35 skupa sa serinskim supstitucijama Glu34 i Glu39, koji je rezultirao u SAg inačici SEA/E-108, nađeno je povećanje u iskorištenju od 23 mg/L na 30 mg/L. Smanjenje reaktivnosti antitijela je međutim zadržano. Kada su se uvodile supstitucije glutaminske kiseline ostataka Lys79, Lys81, Lys83 i Lys84 u SEA/E-65, to je rezultiralo u razini produkcije od samo 1,5 mg/L. Radi činjenice što je učinak kod reaktivnosti antitijela smanjen s 43% u usporedbi prema SEA/E-18, načinjen je napor za identifikacijom boljih zamjena. Najbolja kombinacija, s obzirom i na iskorištenje i na smanjenu reaktivnost antitijela, koja je nađena je bila SEA/E-84 sa serinskim ostacima na položaju 83 i 84 i sačuvanom glutaminskom kiselinom na položaju 79 i 81 (Tablica 1). Razina produkcije je povećana deset puta i reaktivnost antitijela je smanjena s 41% u usporedbi prema SEA/E-18 (Tablica 1). Razina produkcije je također smanjena više od deset puta sa zamjenama Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala i Asp227Ala u SEA/E-62, na 0,1 mg/L. Međutim, zamjenjujući alaninske supstitucije za serinske ostatke, rezultirajući u SEA/E-97, dobiveno je iskorištenje produkcije od 48 mg/L (Tablica 1).
Zanimljivo, kada se kombinira SEA/E-65 s više inačica, kao što su SEA/E-63 i modificiran SEA/E-74, kao kod SEA/E-91, niska razina produkcije je preokrenuta na 12 mg/L (Tablica 1). U drugu ruku postoji samo razina ekspresije inačice superantigena SEA/E-110 od 0,5 mg/L, odnosno 14 mg/L. Razina produkcije SEA/E-110 je međutim povećana na 30 mg/L kada su se uklonile supstitucije Asp174Ala, His87Ala, Ser188Thr, Ser189Asp, Glu190Ala i Gln 204Thr stvarajući SEA/E-120 (Tablica 1).
Uvođenje velikog broja supstitucija unutar superantigena može dovesti do problema s ekspresijom E. coli. Postoje najmanje tri različita mehanizma za to; smanjena termodinamičnost, uništen prirodni ciklus savijanja ili novo uvedena proteolitička mjesta. Premda je cilj ovog proučavanja bio ukloniti antigenske epitope na površini, koji najvjerovatnije ne bi interferirali s bilo kojom strukturalnom okosnicom, postoji uvijek mogućnost da su nove strukture bile ovisne o drugim ostacima osim konstrukcije divlje vrste, za zadržavanje njihove stabilnosti. Stoga su novi računalni modeli stalno rađeni radi predviđanja ili potvrđivanja lokacije supstituiranih ostataka unutar nove strukture. Na taj način možemo identificirati odgovorne ostatke unutar ranih inačica superantigena koji uzrokuju probleme s, na primjer, razinama ekspresije i dobiti poboljšane inačice bilo s ostacima divlje vrste ili boljim supstitucijama (Tablica 1).
U zaključku, radi dovršenja bolje razine produkcije, slijedeći ostaci, Lys83, Lys84, Asn220, Asn223, His225 i Asp227, bi trebali biti supstituirani u serin, ne alanin. Dodatno, radi sprječavanja smanjenja u razinama ekspresije, ostaci Lys35, Asp173, His 187, Ser188, Ser189, Glu190 i Gln204 bi trebali biti sačuvani.
Primjer 10
Evaluacija biološke funkcije unutar različitih Sac inačica
Zbog toga što su superantigeni primarno bili određeni za terapiju tumora (Dohlsten i ostali, 1994.), bilo je važno spriječiti zamjene koje smanjuju na tumor usmjerenu citotoksičnost unutar novih inačica superantigena. Sposobnost utjecanja na tumor usmjerene citotoksičnosti je stoga bila mjerena za sve nove inačice superantigena SADCC testom (Sl. 3). Dodatno, učinkovitost superantigena da posreduju ubijanje T stanicama MHC klase II ekspresirajućih stanica je rezultiralo u sustavnoj citotoksičnosti koja može uzrokovati pokrajnje učinke mjerene u SDCC testu (Sl. 3). Za kliničku uporabu SDCC bi morao biti nizak da poveća terapijski prozor.
Većina od početnog paketa SAg inačica ima istu razinu specifične citotoksične potencije kao SEA/E-18 (Tablica 1). Iznimke su SEA/E-75 sa zamjenama Lys74Thr, Asp75Ala i Asn78Ser koji je bio smanjen deset puta i SEA/E-64 sa zamjenama Glu34Lys, Lys35Glu, Gly39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu i Glu42Lys, koji je smanjen pet puta u usporedbi prema SEA/E-18 (Tablica 1). Zanimljivo, smanjena aktivnost kod SEA/E-75 je opažena samo u ovoj inačici, u kombinaciji s daljnjim supstitucijama, na primjer, u SEA/E-109 detektirana je puna aktivnost (Tablica 1). Dodatno je SDCC aktivnost bila nepromijenjena u SEA/E-75 u usporedbi prema SEA/E-18. Supstitucije Lys74Thr, Asp75Ala i Asn78Ser su stoga vjerovatno poremetile interreakcije važne za samu citotoksičnost ovisnu o antitijelu.
SEA/E-ećina inačica superantigena opisanih ovdje je pokazala jasno smanjenje kod SDCC. Slabo smanjenje u SDCC je opaženo za početne inačice SEA/E-62, SEA/E-63, SEA/E-64, SEA/E-65 i SEA/E-74 u usporedbi sa SEA/E-18.
Sve su inačice superantigena sadržavale supstituirani ostatak Asp227Ala ili Ser. Ova supstitucija je bila poznata da smanjuje afinitet prema MHC klase II 100 puta i stoga i SDCC aktivnost (Abrahmsén i ostali, 1995.).
Međutim, zbog toga što je inačica SAg SEA/E-109, s N-terminalnim supstitucijama, pokazala veće smanjenje u usporedbi sa SEA/E-18 nego SEA/E-113, s C-terminalnim supstitucijama, to je ukazivalo da su se unutar SEA/E-109 dodatni ostaci promijenili što je važno za SDCC i najvjerovatnije vezanje na MHC klasu II (Sl. 8).
Stoga su ostaci koji su uzrokovali najveće smanjenje bili Lys79Ser i Lys81Ser kod SEA/E-83 i supstitucija Asp45Ala kod SEA/E-74. Većina ovih supstitucija je locirana oko ostataka za koje je ranije pokazano da međusobno djeluju s MHC klase II (Abrahmsén i ostali, 1995.).
Primjer 11
Dizajniranje nove inačice superantigena
S ciljem dizajniranja optimalne inačice superantigena, kombinirane su sve poželjne supstitucije vodeći prema superiornom SEA/E-120 (Sl.4 i Sl. 9).
Prvo, sve poželjne modifikacije na C-kraju, to jest, Asp173Ala, Ser189Thr, Glu190Ala, Lys217Thr, Asn220Ser, Glu222Thr,Asn223Ser, His225Ser i Asp227Ser skupa s Gln204Thr su sastavljene čineći SAg inačicu SEA/E-113. Ova inačica pokazuje očekivano smanjenje u anti-SEA reaktivnosti i prihvatljive razine ekspresije ali s nešto smanjenom biološkom aktivnosti (Tablica 1, Sl. 7 i Sl. 8A i Sl. 8B). Sve poželjne supstitucije na N-kraju, to jest, ostaci Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49Thr, Lys74Thr, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser i Lys84Ser su sastavljene u SEA/E-109. Značajno smanjenje anti-SEA reaktivnosti je opaženo za ovu inačicu superantigena skupa s visokom razinom ekspresije i čak poboljšanim biološkim profilom (Tablica 1, Sl. 7 i Sl. 8A i Sl. 8B). Međutim, kod stvaranja kombinacije ovih dviju inačica SEA/E-113 i SEA/E-109 u SEA/E-110, dogodio se dramatični gubitak i iskorištenja i biološke funkcije (Tablica 1). Biološka potencija je potpuno vraćena kada su ostaci divlje vrste Ser189, Glu190 i Gln204 ponovno korišteni u SEA/E-115 (Tablica 1), ali razine produkcije su još bile na niskoj razini. Molekulsko modeliranje ove inačice je sugeriralo da bi ostaci Asp173, His187 i Ser188 mogli biti važni za stabilizaciju savijanja i stoga rezultirajući u višim iskorištenjima.
Nekoliko različitih kombinacija je načinjeno radi evaluacije ovih ostataka, rezultirajući u SEA/E-118, SEA/E-119, SEA/E-120, SEA/E-121 i SEA/E-122 (Tablica 1). Najbolja produkcija je dobivena s SEA/E-120 s ostacima divlje vrste na sva tri položaja. Skupa s ranije načinjenim SEA/E-21, SEA/E-74, SEA/E-97, SEA/E-108 i SEA/E-109, to su bile jedine SAg inačice koje su dostigle razine ekspresije više od 20 mg/L (Tablica 1). Nisu opažene nikakve bitne razlike s obzirom na biološku aktivnost ili reaktivnost antitijela između inačica.
Dizajn novog konjugata
SEA/E-120 je genetski fuzirana na Fab dio tumor reaktivnog antitijela, što je 5T4 (Dohlsten i ostali, 1994.). (Sl. 10).
5T4 antigen je ekspresiran na mnoštvu različitih tumora, kao što su ne-male stanice raka pluća, raka dojke, renalnih stanica raka, raka gušterače, raka jajovoda i raka debelog crijeva. Supstitucije u sekvenci divlje vrste 5T4 su također načinjene radi postizanja viših iskorištenja. U teškom lancu; His41Pro, Ser44Gly, Ile69Thr i Val113Gly i u lakom lancu; Phe10Ser, Thr45Lys, Ile63Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val i Leu83Ala.
Premda su sadašnji izum i njegove prednosti opisani detaljno, treba biti razumljivo da različite promjene, supstitucije i alteracije mogu biti načinjene bez napuštanja duha i raspona izuma kako je određen u pridodanim zahtjevima. Štoviše, namjera raspona sadašnje prijave nije da bude ograničena na pojedinačne izvedbe postupka, stroja, proizvodnje, smjese tvari, sredstava, načina i stupnjeva opisanih u specifikaciji. Kao netko uobičajeno iskusan u području će lako procijeniti iz otkrića sadašnjeg izuma, postupke, strojeve, proizvodnju, smjesu tvari, sredstva, načine ili stupnjeve, sada postojeće ili koji će se kasnije otkriti da provode bitno istu funkciju ili postižu bitno isti rezultat kao odgovarajuće izvedbe ovdje opisane, mogu biti iskorištene prema sadašnjem izumu. Prema tome, pridodanim zahtjevima je namjera uključiti unutar njihovog raspona takve postupke, strojeve, proizvodnju, smjesu tvari, sredstva, načine ili stupnjeve.
Netko iskusan u području odmah cijeni što je sadašnji izum dobro podešen za provedbu spomenutih ciljeva i dobivenih krajeva i prednosti kao i onih tamo svojstvenih. Pripravci, načini, postupci i tehnike opisane ovdje su sadašnji predstavnici poželjnih izvedbi i namjera im je da budu primjeri i nije im namjera da budu ograničenja raspona. Promjene u njima i ostala korištenja će se pojaviti onima iskusnima u području koja su okružena unutar duha izuma ili određena s rasponom pridodanih zahtjeva.
[image]

Claims (11)

1. Konjugat koji obuhvaća bakterijski superantigen i dio antitijela, u kojem je superantigen Stafilokokni enterotoksin E (SEE), u kojem aminokiselinska sekvenca superantigena obuhvaća područja A do E, koje je područje A unutar TCR vezujućeg mjesta i određuje vezivanje na TCR, a područja B do E određuju vezivanje na MHC molekule klase II, naznačen time, što su sljedeće zamjene aminokiselinskih ostataka uvedene u područje C: K79E, K81E, K83S, K84S, i što su sljedeće zamjene aminokiselinskih ostataka uvedene u područje A: R20G, N21T, S24G, R27K, i što su po izboru aminokiseline na položaju 173 i/ili na položaju 204 unutar područja A također bile zamijenjene, i što je unutar područja E uvedena zamjena D227S (ili A), i što su najmanje jedan ili više aminokiselinskih ostataka na položajima 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 i 49 unutar područja B i/ili na položajima 74, 75, 78 unutar područja C i/ili na položajima 187, 188, 189, 190 unutar područja D, i/ili na položajima 217, 220, 222, 223, 225 unutar područja E zamijenjeni, tako da je supstituirani superantigen smanjio seroreaktivnost u usporedbi sa superantigenom iz kojeg je dobiven, i u kojem je antitijelo pune dužine, ili bilo koji drugi aktivni dio antitijela koji vezuje antigen, koji je usmjeren prema strukturi na površini stanica raka.
2. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time, što superantigen ima aminokiselinsku sekvencu opisanu u SEQ ID NO: 2 (SEA/E-120).
3. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačen time, što je antitijelo fragment Fab-a.
4. Konjugat prema zahtjevu 3, naznačen time, što je antitijelo C215Fab.
5. Konjugat prema zahtjevu 3, naznačen time, što je antitijelo 5T4Fab.
6. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time, što ima aminokiselinsku sekvencu opisanu u SEQ ID NO: 1.
7. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačen time, što se koristi u tretiranju raka.
8. Konjugat kako je zahtjevan u zahtjevu 7, naznačen time, što je rak odabran od skupine koja se sastoji od raka pluća, dojke, debelog crijeva, bubrega, gušterače, jajnika, želuca, grlića maternice i prostate.
9. Konjugat prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačen time, što se koristi za proizvodnju medikamenata za tretiranje raka.
10. Medikament prema zahtjevu 9, naznačen time, što se koristi za intravenozno davanje.
11. Farmaceutski pripravak, naznačen time, što obuhvaća kao aktivni sastojak, terapijski učinkovitu količinu konjugata prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6. CITIRANE REFERENCE [0181] Svi patenti i publikacije spomenute u specifikacijama su indikativna razina onima iskusnima u području i kojima izum pripada. Svi patenti i publikacije su ovdje uključeni pozivanjem na njih u istom opsegu kao i ako je svaka pojedinačna publikacija bila specifično i pojedinačno naznačena da će biti uključena pozivanjem na nju. U.S. patent 4,554,101 U.S. patent 5,221,605 U.S. patent 5,238,808 U.S. patent 5,798,208 U.S. patent 5,830,650 U.S. patent 5,220,007 U.S. patent 5,284,760 U.S. patent 5,354,670 U.S. patent 5,366,878 U.S. patent 5,389,514 U.S. patent 5,635,377 U.S. patent 5,789,166 U.S. patent 5,446,128 U.S. patent 5,710,245 U.S. patent 5,840,833 U.S. patent 5,859,184 U.S. patenti 5,440,013 U.S. patent 5,618,914 U.S. patent 5,670,155 U.S. patent 5,475,085 U.S. patent 5,929,237 U.S. patent 5,672,681 U.S. patent 5,674,976 U.S. patenti 4,608,251 U.S. patent 4,601,903 U.S. patent 4,599,231 U.S. patent 4,599,230 U.S. patent 4,596,792 U.S. patent 4,578,770 Abrahmsén L., i ostali, EMBO J. 14:2978-86, 1995. Alpaugh R.K., i ostali, Clin. Cancer Res. 4:1903-14, 1998. Antonsson P., i ostali, J. Immunol 158:4245-51, 1997. Bangham i ostali, J. Mol. Biol., 13:238-252, 1965. Bird i ostali, Science. 242:423-6, 1988. Braisted i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93(12) : 5688-92, 1996. Burks i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94 (2) : 412-7, 1997. Capaldi i ostali, Biochem. Biophys. Res. Comm., 76:425, 1977. Cavallin A., i ostali, J. Biol. Chem., 275:1665-72, 2000. Cunningham i ostali, Science. 244 (4908) : 1081-5, 1989. Davis i ostali, Basic Methods in Molecular Biology, 1986. Dohlsten M., i ostali, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 91:8945-9, 1994. DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis izdavač (1979) str. 287-341. Hakansson, M. i ostali, J. Mol. Biol., 302:527-37, 2000. Harlow i ostali, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988. Johannesson i ostali, J. Med. Chem., 42:601-608, 1999. Kaneda i ostali, J. Biol. Chem., 264(21) : 12126-12129, 1989. Kato i ostali, J. Biol. Chem., 266(6) :3361-3364, 1991. Nicolau i ostali, Methods Enzymol., 149:157-176, 1987. Papageorgiou A. C. i ostali, Trends in Microbiology, 8: 369-375, 2000. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. izdanje, poglavlje 61, str. 1035-1038 i 1570-1580. Sambrook i ostali, u: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje, 1989. Shad E. M., i ostali EMBO J., 14:3292-3301, 1995. Short i ostali, J. Biol. Chem., 270(48) : 28541-50, 1995. Sundstrom M., i ostali EMBO J.,15:6832-40, 1996 A. Sundstrom M., i ostali, J. Biol. Chem., 271: 32212-16, 1996 B. Szoka i Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., 75:4194-4198, 1978. Vita i ostali, Biopolymers, 47:93-100, 1998. Warren i ostali, Biochemistry 35(27) :8855-62, 1996. Weisshoff i ostali, Eur. J. Biochem., 259:776-788, 1999. Wells i ostali, Methods. 10(1) :126-34, 1996. Wong i ostali, Gene, 10:87-94, 1980. Yelton i ostali, J. Immunol., 155(4) :1994-2004, 1995. IZLIST SEKVENCI [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] SLIKA 1 [image] SLIKA 2 [image] SLIKA 3 [image] [image] SLIKA 5 [image] SLIKA 6 [image] SLIKA 7 [image] SLIKA 8A [image] [image] SLIKA 9 [image] SLIKA 10 [image]
HRP20031054AA 2001-06-28 2003-12-17 Novo proizveden superantigen za humanu terapiju HRP20031054B1 (hr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0102327A SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 A novel engineered superantigen for human therapy
PCT/SE2002/001188 WO2003002143A1 (en) 2001-06-28 2002-06-19 A novel engineered superantigen for human therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HRP20031054A2 HRP20031054A2 (en) 2004-04-30
HRP20031054B1 true HRP20031054B1 (hr) 2016-12-30

Family

ID=20284677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HRP20031054AA HRP20031054B1 (hr) 2001-06-28 2003-12-17 Novo proizveden superantigen za humanu terapiju

Country Status (28)

Country Link
US (3) US7125554B2 (hr)
EP (1) EP1406657B1 (hr)
JP (1) JP4523773B2 (hr)
KR (1) KR100961054B1 (hr)
CN (1) CN1522156B (hr)
BG (1) BG66321B1 (hr)
BR (1) BRPI0210568B8 (hr)
CA (1) CA2451847C (hr)
CZ (1) CZ307180B6 (hr)
DK (1) DK1406657T3 (hr)
EE (1) EE05475B1 (hr)
ES (1) ES2564041T3 (hr)
HK (1) HK1067980A1 (hr)
HR (1) HRP20031054B1 (hr)
HU (1) HUP0400313A3 (hr)
IL (2) IL159562A0 (hr)
IS (1) IS2986B (hr)
MX (1) MXPA03011761A (hr)
NO (1) NO333676B1 (hr)
NZ (1) NZ529827A (hr)
PL (1) PL216516B1 (hr)
RS (1) RS52581B (hr)
RU (1) RU2307837C2 (hr)
SE (1) SE0102327D0 (hr)
SK (1) SK16112003A3 (hr)
UA (1) UA85993C2 (hr)
WO (1) WO2003002143A1 (hr)
ZA (1) ZA200309150B (hr)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9402430L (sv) * 1994-07-11 1996-01-12 Pharmacia Ab Konjugat mellan modifierat superantigen och en målsökande förening samt användning av konjugaten
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
ES2284209T3 (es) * 1997-07-21 2007-11-01 Active Biotech Ab Citolisis de celulas diana por conjugados de superantigenos que inducen la activacion de celulas t.
US7491402B2 (en) * 1998-12-24 2009-02-17 Auckland Uniservices Limited Superantigens SMEZ-2, SPE-G, SPE-H and SPE-J and uses thereof
US20040214783A1 (en) * 2002-05-08 2004-10-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
GB0126378D0 (en) * 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
MXPA05001933A (es) * 2002-08-19 2005-04-28 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores.
DE602004026039D1 (de) * 2003-03-28 2010-04-29 Kowa Co Seb-modifikation und diese enthaltendes vorbeugendes mittel/heilmittel gegen krankheiten mit einer immunanomalität
SE0402025D0 (sv) * 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
US20080274133A1 (en) * 2004-11-18 2008-11-06 Avidex Ltd. Soluble Bifunctional Proteins
GB0427585D0 (en) * 2004-12-16 2005-01-19 Avidex Ltd Assay
CA2676143A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Modification of exosomal components for use as a vaccine
GB0822836D0 (en) * 2008-12-15 2009-01-21 Oxford Biomedica Ltd Method
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE19177059T1 (de) 2010-10-01 2021-10-07 Modernatx, Inc. N1-methyl-pseudouracile enthältendes ribonucleinsäuren sowie ihre verwendungen
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013041687A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific binding molecules for 5t4 and cd3
JP6113737B2 (ja) 2011-10-03 2017-04-12 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 修飾型のヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸、ならびにそれらの使用方法
CN102516392B (zh) * 2011-11-25 2014-05-28 孙嘉琳 一种癌靶向超抗原融合蛋白及制备方法及用途
MX2014007233A (es) 2011-12-16 2015-02-04 Moderna Therapeutics Inc Composiciones de nucleosidos, nucleotidos y acidos nucleicos modificados.
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
EP2834259A4 (en) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
CA2892529C (en) 2012-11-26 2023-04-25 Moderna Therapeutics, Inc. Terminally modified rna
CN103965302B (zh) * 2013-01-29 2019-05-28 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 一种重组超抗原seb突变体，其制备方法及应用
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
AU2017206656B2 (en) 2016-01-10 2024-02-01 Neotx Therapeutics Ltd. Immunopotentiator enhanced superantigen mediated cancer immunotherapy
JP7303791B2 (ja) * 2017-07-27 2023-07-05 アブヴァク インコーポレイテッド スーパー抗原トキソイドに由来する融合ペプチドを含む免疫原性組成物
MX2021013908A (es) 2019-05-15 2022-03-11 Neotx Therapeutics Ltd Tratamiento para el cáncer.
CN115484978A (zh) 2020-03-05 2022-12-16 尼奥克斯医疗有限公司 使用免疫细胞治疗癌症的方法和组合物
MX2023003581A (es) * 2020-09-28 2023-06-21 Janssen Pharmaceuticals Inc Polipeptidos variantes de luka y lukb de staphylococcus aureus y composiciones de vacuna.
WO2023240135A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Actinium Pharmaceuticals, Inc. Bifunctional chelators and conjugates

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996001650A1 (en) * 1994-07-11 1996-01-25 Pharmacia Ab A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate
WO1997036932A1 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 Pharmacia & Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
WO1999004820A2 (en) * 1997-07-21 1999-02-04 Pharmacia & Upjohn Ab Cytolysis of target cells by superantigen conjugates inducing t-cell activation
WO2001030854A2 (en) * 1999-10-28 2001-05-03 Active Biotech Ab Antibody to human gastrointestinal epithelial tumor antigen related to alpha 6 beta 4 integrin
WO2001036486A2 (en) * 1999-11-18 2001-05-25 Oxford Biomedica (Uk) Limited Scfv antibodies against disease associated molecules

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4596792A (en) 1981-09-04 1986-06-24 The Regents Of The University Of California Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin
JPS5938877A (ja) 1982-08-30 1984-03-02 Musashi Eng Kk 紙葉判別方法
US4599231A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US4599230A (en) 1984-03-09 1986-07-08 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic hepatitis B virus vaccine including both T cell and B cell determinants
US5238808A (en) 1984-10-31 1993-08-24 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US5221605A (en) 1984-10-31 1993-06-22 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US4608251A (en) 1984-11-09 1986-08-26 Pitman-Moore, Inc. LHRH analogues useful in stimulating anti-LHRH antibodies and vaccines containing such analogues
US4601903A (en) 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US5284760A (en) 1989-04-03 1994-02-08 Feinstone Stephen M Techniques for producing site-directed mutagenesis of cloned DNA
US6042837A (en) 1989-09-20 2000-03-28 Kalland; Terje Methods of staphylococcal enterotoxin directed cell-mediated cytotoxicity (SDCC)
US5728388A (en) 1989-10-03 1998-03-17 Terman; David S. Method of cancer treatment
US6126945A (en) 1989-10-03 2000-10-03 Pharmacia Ab Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
EP0511306B1 (en) * 1990-01-17 2002-07-17 TERMAN, David S. Tumor killing effects of enterotoxins and related compounds
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
EP0527809B1 (en) 1990-04-05 1995-08-16 CREA, Roberto Walk-through mutagenesis
US5858363A (en) 1990-07-20 1999-01-12 Pharmacia & Upjohn Ab Target specific antibody-superantigen conjugates and their preparation
US6197299B1 (en) 1990-07-20 2001-03-06 Pharmacia & Upjohn Ab Antibody conjugates
WO1993024136A1 (en) 1991-01-17 1993-12-09 Terman David S Tumor killing effects of enterotoxins, superantigens, and related compounds
US5475085A (en) 1991-02-07 1995-12-12 Molecumetics, Ltd. Conformationally restricted mimetics of beta turns and beta bulges and peptides containing the same
JPH06505486A (ja) 1991-02-07 1994-06-23 モレキュメティクス，リミティド βターンおよびβバルジのコンフォメーション的に制限された模倣物およびそれらを含有するペプチド
ATE239089T1 (de) 1991-12-24 2003-05-15 Harvard College Gezielte punkt-mutagenese von dna
US5389514A (en) 1992-08-28 1995-02-14 Fox Chase Cancer Center Method for specifically altering the nucleotide sequence of RNA
US5545716A (en) 1992-09-08 1996-08-13 University Of Florida Superantigen agonist and antagonist peptides
US5446128A (en) 1993-06-18 1995-08-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Alpha-helix mimetics and methods relating thereto
US5519114A (en) 1993-10-29 1996-05-21 University Of Florida Research Foundation, Inc. Retroviral superantigens, superantigen peptides, and methods of use
US5935568A (en) 1995-05-18 1999-08-10 National Jewish Medical & Research Center Gene therapy for effector cell regulation
PT832241E (pt) 1995-06-07 2005-08-31 Univ Minnesota Mutantes de toxina a estreptococica e metodos de utilizacao
US5929237A (en) 1995-10-27 1999-07-27 Molecumetics Ltd. Reverse-turn mimetics and methods relating thereto
US5840833A (en) 1995-10-27 1998-11-24 Molecumetics, Ltd Alpha-helix mimetics and methods relating thereto
US5789166A (en) 1995-12-08 1998-08-04 Stratagene Circular site-directed mutagenesis
SE9601245D0 (sv) * 1996-03-29 1996-03-29 Pharmacia Ab Chimeric superantigens and their use
EP0891436B1 (de) 1996-03-27 2001-11-28 Zellweger Luwa Ag Verfahren und vorrichtung zur qualitätsüberwachung von garnen
AU2429397A (en) 1996-03-29 1997-10-22 David S. Terman Polymerized staphylococcal protein a for treatment of diseases
DK0946730T3 (da) 1996-12-06 2006-07-10 Univ Minnesota Mutanter af streptokok-toksin C og fremgangsmåder til anvendelse
US6774218B2 (en) 1996-12-06 2004-08-10 Regents Of The University Of Minnesota Mutants of streptococcal toxin C and methods of use
CN1211487C (zh) 1996-12-06 2005-07-20 明尼苏达大学董事会 链球菌毒素a突变体及其使用方法
US6340461B1 (en) 1996-12-17 2002-01-22 David Stephen Terman Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
IL119938A (en) 1996-12-30 2005-08-31 Yissum Res Dev Co Peptides capable of eliciting protective immunity against toxic shock induced by pyrogenic exotoxins or of antagonizing toxin-mediated activation of t cells
US7087235B2 (en) 1997-06-25 2006-08-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Fusion protein of streptococcal pyrogenic exotoxins
US6713284B2 (en) 1997-06-25 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Bacterial superantigen vaccines
WO1999036433A2 (en) 1998-01-14 1999-07-22 Morphogenesis, Inc. Materials and methods for treating oncological disease
WO2000002522A2 (en) 1998-07-10 2000-01-20 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases Anthrax vaccine
US20050112141A1 (en) * 2000-08-30 2005-05-26 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20020177551A1 (en) 2000-05-31 2002-11-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20040214783A1 (en) * 2002-05-08 2004-10-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20030157113A1 (en) 1999-12-28 2003-08-21 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US20010046501A1 (en) 2000-03-14 2001-11-29 Johnson Howard M. Superantigen enhancement of specific immune responses
JP4283430B2 (ja) 2000-09-26 2009-06-24 株式会社カネカ エンテロトキシンの吸着材、吸着除去方法および吸着器
DE60139954D1 (de) 2000-12-04 2009-10-29 Auckland Uniservices Ltd Immunmodulatorische konstruktionen und ihre verwendung
CN1369550A (zh) 2001-02-16 2002-09-18 沈阳协合集团有限公司 一种金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
AU2003266289A1 (en) * 2002-08-21 2004-03-11 Merck Patent Gmbh T-cell epitopes in staphylococcal enterotoxin b
WO2006004620A2 (en) * 2004-06-29 2006-01-12 Terman David S Enterotoxin gene cluster (egc) superantigens to treat malignant disease
US20060005711A1 (en) 2004-07-07 2006-01-12 Andrew Olefson Replaceable filter for a vehicle air conditioning system adapted to scent air
SE0402025D0 (sv) 2004-08-13 2004-08-13 Active Biotech Ab Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
US20070280905A1 (en) * 2006-06-01 2007-12-06 Shulin Li Prognosis and Systemic Therapy for Treating Malignancy

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996001650A1 (en) * 1994-07-11 1996-01-25 Pharmacia Ab A conjugate between a modified superantigen and a target-seeking compound and the use of the conjugate
WO1997036932A1 (en) * 1996-03-29 1997-10-09 Pharmacia & Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
WO1999004820A2 (en) * 1997-07-21 1999-02-04 Pharmacia & Upjohn Ab Cytolysis of target cells by superantigen conjugates inducing t-cell activation
WO2001030854A2 (en) * 1999-10-28 2001-05-03 Active Biotech Ab Antibody to human gastrointestinal epithelial tumor antigen related to alpha 6 beta 4 integrin
WO2001036486A2 (en) * 1999-11-18 2001-05-25 Oxford Biomedica (Uk) Limited Scfv antibodies against disease associated molecules

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOLOGICAL ABSTRACTS, 1 January 1900, Philadelphia, PA, US; abstract no. PREV199294019051, GRIGGS N.D, ET AL: "Mapping of multiple binding domains of the superantigen staphylococcal enterotoxin A for HLA" XP002956584 *
HANSSON J ET AL: "Genetically engineered superantigens as tolerable antitumor agents.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol. 94., 18 March 1997 (1997-03-18), US, pages 2489 - 2494., XP002092807, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.94.6.2489 *
ROSENDAHL A, ET AL: "Long-term survival and complete cures of B16 melanoma-carrying animals after therapy with tumor-targeted IL-2 and sea", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, JOHN WILEY & SONS, INC., US, vol. 81, 1 January 1999 (1999-01-01), US, pages 156 - 163, XP002956585, ISSN: 0020-7136, DOI: 10.1002/(SICI)1097-0215(19990331)81:1<156::AID-IJC25>3.0.CO;2-H *
SOGAARD M, ET AL: "Antibody-targeted superantigens in cancer immunotherapy", IMMUNOTECHNOLOGY., ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS BV., NL, vol. 2, 1 January 1996 (1996-01-01), NL, pages 151 - 162, XP002956583, ISSN: 1380-2933, DOI: 10.1016/S1380-2933(96)00047-4 *

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20031054A2 (en) 2004-04-30
DK1406657T3 (en) 2016-03-07
EP1406657B1 (en) 2015-12-30
EE05475B1 (et) 2011-10-17
HUP0400313A2 (hu) 2004-09-28
JP2005503362A (ja) 2005-02-03
US20070082001A1 (en) 2007-04-12
RU2307837C2 (ru) 2007-10-10
US20030039655A1 (en) 2003-02-27
IS2986B (is) 2017-09-15
PL216516B1 (pl) 2014-04-30
US7125554B2 (en) 2006-10-24
IL159562A0 (en) 2004-06-01
ZA200309150B (en) 2005-01-26
EP1406657A1 (en) 2004-04-14
EE200400037A (et) 2004-04-15
NZ529827A (en) 2005-06-24
CZ20033559A3 (en) 2004-06-16
YU101503A (en) 2006-05-25
US7615225B2 (en) 2009-11-10
HK1067980A1 (en) 2005-04-22
RS52581B (en) 2013-04-30
BRPI0210568B1 (pt) 2020-10-13
CN1522156A (zh) 2004-08-18
IL159562A (en) 2010-12-30
RU2004102199A (ru) 2005-05-20
IS7083A (is) 2003-12-18
NO333676B1 (no) 2013-08-05
CZ307180B6 (cs) 2018-02-28
PL368048A1 (en) 2005-03-21
KR20040015264A (ko) 2004-02-18
JP4523773B2 (ja) 2010-08-11
BG108499A (en) 2005-03-31
BG66321B1 (bg) 2013-05-31
BRPI0210568B8 (pt) 2021-05-25
UA85993C2 (ru) 2009-03-25
US20100111978A1 (en) 2010-05-06
BR0210568A (pt) 2004-08-03
CA2451847C (en) 2012-10-16
WO2003002143A1 (en) 2003-01-09
NO20035773L (no) 2004-02-27
CN1522156B (zh) 2012-10-10
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28
CA2451847A1 (en) 2003-01-09
HUP0400313A3 (en) 2006-02-28
SK16112003A3 (en) 2004-11-03
KR100961054B1 (ko) 2010-06-01
MXPA03011761A (es) 2004-04-02
ES2564041T3 (es) 2016-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HRP20031054B1 (hr) Novo proizveden superantigen za humanu terapiju
ES2242222T3 (es) Superantigenos modificados/quimericos y su uso.
ES2284209T3 (es) Citolisis de celulas diana por conjugados de superantigenos que inducen la activacion de celulas t.
AU2005270336B2 (en) Treatment of hyperproliferative disease with superantigens in combination with another anticancer agent
Hsu et al. Vaccination against gonadotropin-releasing hormone (GnRH) using toxin receptor-binding domain-conjugated GnRH repeats
Erlandsson et al. Identification of the antigenic epitopes in staphylococcal enterotoxins A and E and design of a superantigen for human cancer therapy
KR20140033391A (ko) 면역원성이 보다 낮은 t 세포 및/또는 b 세포 에피토프를 갖는 슈도모나스 외독소 a
JP2003524587A (ja) 多発性骨髄腫を処置するための、ｃｄ３８に対する、遺伝子操作した抗体の使用
US20070003514A1 (en) Mono-and bi-functional antibody conjugates as effective adjuvants of protein vaccination
CA2215122A1 (en) Il-13 receptor specific chimeric proteins and uses thereof
US6238667B1 (en) Method of affinity cross-linking biologically active immunogenic peptides to antibodies
EP2790730A1 (en) Methods and compositions for cancer therapy using mutant light molecules with increased affinity to receptors
EP3601363B1 (en) Alt-803 in combination with anti-cd38 antibody for cancer therapies
WO1993004191A1 (en) Noncytolytic toxin conjugates
Fang et al. Antitumor effects of an engineered and energized fusion protein consisting of an anti-CD20 scFv fragment and lidamycin
AU2002315979B2 (en) A novel engineered superantigen for human therapy
Mortensen et al. Targeting an engineered cytokine with interleukin-2 and interleukin-15 activity to the neovasculature of solid tumors
AU2002315979A1 (en) A novel engineered superantigen for human therapy
DA SILVA et al. Patent 2967595 Summary
DA SILVA et al. Sommaire du brevet 2967595
Sadowski et al. Ligand-Mediated Modulation of the Type III Tyrosine-Kinase Receptor c-kit is a possible specific Entrance Mechanism for Immunotoxins in c-kit+ Leukemia

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
AIPI Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application
B1PR Patent granted
ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20170522

Year of fee payment: 16

PBON Lapse due to non-payment of renewal fee

Effective date: 20180619