ES2242222T3

ES2242222T3 - Superantigenos modificados/quimericos y su uso.

Info

Publication number: ES2242222T3
Application number: ES97916693T
Authority: ES
Inventors: Per Antonsson; Johan Hansson; Per Bjork; Mikael Dohlsten; Terje Kalland; Lars Abrahmsen; Goran Forsberg
Original assignee: Active Biotech AB
Current assignee: Active Biotech AB
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: JP2002502363A; CZ294475B6; DE69733179T2; WO1997036932A1; CZ371297A3; HUP9903444A3; TW517061B; ATE294818T1; HU228185B1; NO321984B1; IL122211A0; BR9702179A; EP0835266A1; PT835266E; DE69733179D1; ID16512A; HUP9903444A2; NZ329145A; MX9709265A; CA2222757A1

Abstract

UN CONJUGADO ENTRE UNA PORCION DIRIGIDA A DIANA Y UN SUPERANTIGENO MODIFICADO, CARACTERIZADO PORQUE EL SUPERANTIGENO ES UN SUPERANTIGENO DE TIPO SALVAJE (SA I), EN EL QUE EL RESIDUO AMINOACIDICO EN UNA REGION DE SUPERANTIGENO (REGION I) DETERMINA LA UNION A TCR, PREFERENTEMENTE TCR V BE}, Y LA ACTIVACION POR CELULAS T HA SIDO REEMPLAZADA POR OTRO RESIDUO AMINOACIDICO A LA VEZ QUE RETIENE LA CAPACIDAD PARA ACTIVAR UN SUBGRUPO DE CELULAS T. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, EL SUPERANTIGENO MODIFICADO ES UNA QUIMERA ENTRE AL MENOS DOS SUPERANTIGENOS DE TIPO SALVAJE (SA I, SA II, ETC.) CARACTERIZADA PORQUE UNO O MAS RESIDUOS AMINOACIDICOS EN UNA REGION QUE DETERMINA LA UNION A TCR Y LA ACTIVACION T HAN SIDO INTERCAMBIADOS ENTRE VARIOS SUPERANTIGENOS DE TIPO SALVAJE. UN METODO TERAPEUTICO QUE UTILIZA LOS SUPERANTIGENOS MODIFICADOS / QUIMERICOS COMO SE DEFINE ANTERIORMENTE. UNA PREPARACION DE ANTICUERPO EN LA QUE LOS RESIDUOS DE CISTEINA QUE PROPORCIONAN ENLACES DISULFURO INTERCATENARIOS HAN SIDO MUTADOS DE MODO QUE SE PROHIBEN LOS PUENTES DISULFURO ENTRE CADENAS, PREFERENTEMENTE A RESIDUOS DE SERINA, PARA SU USO COMO PRODUCTOS FARMACEUTICOS.

Description

Superantígenos modificados/quiméricos y su uso.

Esta solicitud reivindica como prioridad la Solicitud de Patente Sueca nº 9601245-5, que se presentó el 29 de marzo de 1996, y la solicitud de EE.UU. 08/695.692, que se presentó el 12 de agosto de 1996.

Campo del invento

El presente invento se refiere a superantígenos modificados, funcionalmente activos, que son superantígenos silvestres (SA I), en los cuales uno o más residuos aminoácidos se han sustituido mientras se mantiene la función del superantígeno. En el caso de que uno o más de los residuos sustituidos (o un residuo aminoácido de los mismos que se conserva) se encuentre en las posiciones correspondientes en otro superantígeno silvestre (SA II), el superantígeno modificado se denomina quimera (en ocasiones híbrido). De este modo, los superantígenos quiméricos contendrán partes de secuencias/regiones que derivan de por lo menos dos superantígenos silvestres diferentes.

Con el término "correspondiente" se quiere decir que los residuos, partes de secuencias o regiones que se reemplazan unas a otras tienen funcionalmente la misma posición en los superantígenos I y II, de modo que la sustitución conducirá a una forma quimérica que es capaz de funcionar como un superantígeno.

La terminología injertado/injertar/injerto se emplea con respecto a partes de la secuencia completa del superantígeno II que han reemplazado las partes correspondientes del superantígeno I, incluso si sólo se ha reemplazado un único aminoácido.

Los superantígenos modificados/quiméricos también abarcan superantígenos funcionales modificados de otras maneras, por ejemplo, modificados por sustituciones de aminoácidos en regiones distintas de aquellas relacionadas con el invento, conjugados con un resto busca dianas, que incluyen también formas fusionadas cuando el resto es un polipéptido/proteína. El orden para llevar a cabo las modificaciones puede variar. Véase abajo.

Superantígenos

De acuerdo con la primerísima definición (alrededor de 1988-1993), los superantígenos son proteínas bacterianas o virales capaces de unirse a los antígenos MHC de clase II sin procesamiento intracelular previo y activar las células T por unión a la región variable de la cadena \beta (V\beta) del receptor de células T (TCR). La unión conduce a una activación restringida a la familia V\beta de una proporción relativamente grande/subgrupo de células T y a la lisis de las células que expresan el MHC de clase II (citolisis mediada por células dependiente de superantígeno, SDCC).

Superantígenos silvestres bien conocidos de acuerdo con la definición anterior son las enterotoxinas estafilocócicas (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SED, SEE y SEH). Ejemplos adicionales son la toxina 1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1, también de origen estafilocócico), las toxinas exfoliativas (EXft), las exotoxinas pirógenas estreptocócicas A, B y C (SPE A, B y C), las proteínas del virus de tumor mamario de ratón (MMTV), las proteínas M estreptocócicas, la enterotoxina de Clostridium perfringens (CPET), los superantígenos del micoplasma de la artritis, etc. Para una revisión de los superantígenos y sus propiedades véase Kotzin et al., 1993.

Al principio de los años noventa se descubrió que la activación y la subsiguiente lisis celular podía ocurrir de manera independiente del MHC de clase II, en el caso de que un superantígeno se conjugase con un resto busca dianas capaz de unirse a una estructura de la superficie celular (Dohlsten et al., documento WO9201470 y Abrahmsén et al., documento WO9601650). Por incubación de las células diana (que portan la estructura diana para el resto busca dianas) y de las células efectoras (células T) con los conjugados, las células diana se lisan (citolisis mediada por células dependiente de anticuerpo de superantígeno, SADCC) sin ningún requerimiento de expresión de la clase II. En consecuencia, el concepto de superantígeno actual y empleado en el contexto del invento presente, a no ser que se especifique de otra manera, abarca cualquier compuesto (preferentemente de estructura polipeptídica) que es capaz de unirse a una estructura de la superficie celular (estructura diana) y a una o más cadenas polimórficas del TCR, en particular la cadena V\beta, activando así un subgrupo de células T que expresan la cadena específica del TCR implicada en la unión. Entonces, las células T se convierten en citotóxicas para las células que llevan la estructura de superficie (estructura diana, células diana). Normalmente el subgrupo activado de células T constituye alrededor del 1-20% del total de células T de un individuo.

Antecedentes de la técnica Estudios estructurales y funcionales que utilizan superantígenos mutados y quiméricos

Los superantígenos quiméricos que incluyen formas mutadas puntualmente se han descrito previamente (Kappler et al., documento WO 9314364, Kappler et al., 1992; Grossman et al., 1991; Hufnagle et al., 1991; Hartwig et al., 1993; Fraser et al., 1993; Mollick et al., 1993; Irwin et al., 1992; Hudson et al., 1993 y Blanco et al., 1990). Mollick et al. y Hudson et al. muestran, a partir de estudios de quimeras, que la especificidad V\beta de SEA y SEE reside en determinadas secuencias de aminoácidos presentes en la región carboxi terminal (es decir, los residuos de aminoacidos 200, 206, 207). Además de la especificidad V\beta, principalmente dependiendo de esta región, Mollik et al. pudieron demostrar también que para la reconstitución completa de la actividad similar a SEE de los injertos SEE que contenían SEA, frente a V\beta8 se necesitaba un fragmento que contenía los 70 aminoácidos del N-terminal de SEE. Este fragmento, que contiene partes del lugar de unión de la cadena \alpha del MHC de clase II similar a SEE y moléculas quiméricas SEA/SEE que contienen esta parte de SEE, inhibió la unión de SEA al DR1 del MHC de clase II de forma similar a SEE.

Recientemente se han descrito quimeras SEE-SEA que incluyen un intercambio de las regiones implicadas en la unión al TCRV\beta (Lamphaer et al, J. Immunol. 156: 2178-2185, 1996). Una proteína de fusión de un anticuerpo Fab del superantígeno SEE, en el que los dominios SEE implicados en la interacción con las células T se han reemplazado con los correspondientes dominios no homólogos de SEA, se ha discutido en ABRF'96: Biomolecular Techniques, Holiday Inn Golden Gateway, San Francisco, Califonia, 30 de marzo - 2 de abril de 1996 (Björk et al, M45).

Antecedentes de la técnica Uso terapéutico de los superantígenos

Se han propuesto los superantígenos no conjugados para tratamiento, con un efecto curativo que presumiblemente se alcanza a través de la activación general del sistema inmune (Kalland et al., documento WO9104053; Terman et al., documentos WO9110680 y WO9324136; Newall et al., 1991).

También se ha sugerido el uso de superantígenos modificados conjugados a restos busca dianas (Dohlsten et al., documento WO9201470; Abrahmsén et al., documento WO9601650. Esto permitió un uso terapéutico más amplio de la activación de las células T a través del V\beta. Los conjugados estudiados hasta el momento han presentado una afinidad reducida de clase II, que a su vez ha conducido a un descenso en la toxicidad sistémica grave asociada normalmente con los superantígenos silvestres.

Las frases implícitas en Terman et al. (documento WO9110680; documento WO9324136) sugirieron terapia de cáncer con superantígenos modificados y fragmentos de superantígenos.

Kappler et al. (documento WO9314634) han propuesto el empleo de superantígenos no conjugados (SEB) mutados de forma que hayan perdido su capacidad de unión al V\beta o de unión al MHC de clase II (en el contexto de vacunas y para neutralizar los efectos tóxicos de los superantígenos). Abrahmsén et al. (documento WO9601650) han propuesto terapia de cáncer con superantígenos conjugados que tienen una capacidad modificada, preferiblemente reducida, para unirse a antígenos de clase II. Las modificaciones abarcan mutaciones únicas, así como la construcción de quimeras entre los diferentes superantígenos.

Problemas que han sido el objetivo que se resolverá con el presente invento

Los sueros de las poblaciones humanas contienen normalmente títulos elevados de anticuerpos contra los superantígenos. Para los superantígenos estafilocócicos, por ejemplo, los títulos relativos son TSST-1 > SEB > SEC1 > SE3 > SEC2 > SEA > SED > SEE. Estos títulos relativos indican problemas de inmunogenicidad y problemas con anticuerpos neutralizantes en caso de que los SEs se administren parenteralmente. Basados sólo en estos problemas, SEE debería ser el superantígeno estafilocócico preferido. En el contexto del trabajo con proteínas de fusión, sin embargo, los autores han encontrado que la capacidad de citotoxicidad independiente del MHC de clase II de las células T, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de superantígeno (SADCC), o conjugados de SEE es escasa. Los títulos anti-SE también indican que podría haber ventajas al modificar un superantígeno de "título alto" para que se parezca más a un superantígeno de "título bajo".

Objetivos del presente invento

Un primer objetivo es mejorar los superantígenos previamente conocidos, con respecto a disminuir su inmunogenicidad y su reacción con anticuerpos neutralizantes.

Un segundo objetivo es proporcionar superantígenos con menos efectos secundarios cuando se emplean como fármacos.

Un tercer objetivo es proporcionar superantígenos mejorados que puedan emplearse como el principio activo en el tratamiento de mamíferos que padecen cánceres, enfermedades autoinmunes, infestaciones parasitarias, infecciones virales u otras enfermedades asociadas con células que en su superficie expresan antígenos MHC de clase II y/o estructuras que sean específicas para la enfermedad respectiva y que se unan a un resto busca dianas incorporado en el superantígeno.

El descubrimiento que ha dado lugar al invento

Un análisis de homología de secuencia de SEA y SEE (Fig. 2) revela que los residuos aminoácidos no idénticos se concentran en ocho regiones precisas. Fuera de estas ocho regiones, que suponen hasta el 34% de la secuencia, la identidad de los dos SEs es del 97%, donde las sustituciones conservadas de aminoácidos dan cuenta del resto de las diferencias. Cuatro de estas regiones están estructuralmente próximas a los dos lugares de unión al MHC de clase II (B: AA 37-50, D: 71-78, E: 136-149 y G: 189-195) y no es probable que interaccionen con el TCR. Las otras cuatro regiones (A: AA 20-27, C: 60-62, F: 161-176 y H: 200-207) están situadas en el extremo de la molécula, en la vecindad del sitio putativo de unión al TCR, que se postula reside en el surco entre los dos subdominios. Al injertar las regiones individuales (reemplazo de los residuos aminoácidos que difieren), los autores han encontrado, que la propiedad de los conjugados-SEA de inducir una respuesta citotóxica al igual que potenciar una respuesta proliferativa en la ausencia del MHC de clase II, reside en una región del dominio de unión al TCR de SEA. Esta región (A) es transferible a SEE y tiene un gran impacto sobre la actividad en ausencia de clase II, aunque limitados efectos en la especificidad V\beta del superantígeno (Fig. 6, Tabla 2). Todas las regiones (A, C, F, y H) parecen participar, directa o indirectamente, en la interacción con el TCR, lo que se manifiesta por un efecto estimulador alterado en los hibridomas de células T murinas (Tabla 2).

Debido al modo de acción análogo es concebible que una separación estructural similar de estas propiedades de unión al TCRV\beta esté disponible también para los superantígenos análogos a SEA y SEE. Lo mismo puede aplicarse también dentro de otros tipos de superantígenos, en los que las estructuras de unión estén organizadas de forma diferente. El descubrimiento de los autores les ha permitido perfilar la construcción de superantígenos quiméricos que potencialmente son agentes terapéuticos de un valor extremadamente grande.

El invento

El primer aspecto del invento es un método para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero por activación de su sistema inmune mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz (inmunoactivadora) de un superantígeno modificado, preferiblemente quimérico. El mamífero es, preferiblemente, un ser humano. Las enfermedades en cuestión están en su mayor parte asociadas con células que expresan en su superficie una estructura diana que se une al superantígeno. La estructura diana es en la mayoría de los casos diferente del epítopo del TCR al que normalmente se unen los superantígenos. La unión de la estructura diana también permite la unión al TCR y la activación de la célula T. Ejemplos ilustrativos son los antígenos MHC de clase II y otras estructuras de la superficie celular que pueden expresarse en las células asociadas con los cursos de las enfermedades. Enfermedades ilustrativas son los tumores malignos, que incluyen cualquier tipo de cánceres (tales como el carcinoma, sarcoma, melanoma, linfoma, etc.), las infecciones virales, las infestaciones parasitarias y las enfermedades autoinmunes. El cáncer que se ha de tratar puede estar localizado en el colon, mama, cérvix, riñón, estómago, intestino delgado, duodeno, próstata, testículo, piel, pulmón, hígado, páncreas, esqueleto, etc., incluyendo también metástasis en diversos lugares. El agente activo del invento también se puede aplicar en las llamadas formas de cánceres resistentes a múltiples fármacos. Las células que expresan la estructura diana pueden también ser células que de alguna manera controlan o regulan el desarrollo de la enfermedad que se va a tratar.

La particularidad característica del método es que se utiliza un superantígeno modificado, en el que uno o más residuos aminoácidos en una región (región I) que proporciona unión a un subgrupo de células T vía una cadena polimórfica de TCR, en particular TCRV\beta, en un superantígeno silvestre (SA I), se ha reemplazado con un residuo aminoácido respectivo que retiene la actividad del superantígeno en el superantígeno así modificado. Las realizaciones actualmente preferidas se refieren a un superantígeno quimérico en el que uno o más residuos aminoácidos en una región (región I) de un primer superantígeno silvestre (SA I) se han reemplazado con uno o más residuos aminoácidos correspondientes en una región correspondiente (región II) de un segundo superantígeno silvestre (SA II). Las regiones I y II difieren con respecto a las secuencias de aminoácidos. Los superantígenos I y II se han seleccionado de manera que las regiones I y II puedan reemplazarse una a la otra sin destruir la función del superantígeno. En este contexto se debe tener en cuenta el hecho de que cierta región I sola puede no ser intercambiable con la correspondiente región de otro superantígeno silvestre, aunque cuando se intercambie con otras regiones que determinan la unión al TCR y la activación de células T, el resultado se convierte en un superantígeno activo funcional. Las regiones implicadas comprenden normalmente menos de 20 residuos, en particular para los superantígenos análogos a SEA. El aminoácido reemplazador es, por tanto, diferente del residuo reemplazado, y posiblemente incluye también sustituciones conservadas y otras sustituciones de aminoácidos que conducen a superantígenos modificados funcionalmente activos que permiten la unión al TCRV\beta y la activación de un subgrupo de células T. Esto significa que los superantígenos modificados de manera inventiva en su más amplio sentido abarcan cualquier superantígeno modificado en el que uno o más aminoácidos en las regiones susodichas han sido reemplazados funcionalmente.

El término "sustitución conservada" se refiere al reemplazamiento de un residuo aminoácido por un residuo químicamente similar, p. ej., un residuo hidrófobo por un residuo hidrófobo diferente, un residuo cargado por un residuo diferente, pero cargado de manera similar, etc.

Como superantígenos I, II, etc., las enterotoxinas estafilocócicas, en particular, las que coordinan zinc, se prefirieron en la fecha de la prioridad, es decir, SEA, SEE, SED y posiblemente también SEH.

Las regiones implicadas pueden tener cualquiera de las funciones mencionadas anteriormente (véase el epígrafe "El descubrimiento que ha dado lugar al invento" y la parte experimental):

1.: Un gran impacto en la actividad del superantígeno como tal y un efecto limitado en la especificidad TCR, en particular en la especificidad V\beta. Para los superantígenos del tipo SEA esto significa la región A (aminoácidos en las posiciones 20-27).

2.: Un efecto profundo sobre la especificidad con respecto a la unión a las cadenas polimórficas de TCR, tal como la cadena V\beta. Para los superantígenos del tipo SEA esto significa las regiones C (aminoácidos en las posiciones 60-62), F (aminoácidos en las posiciones 110-126) y H (aminoácidos en las posiciones 200-207).

Para los superantígenos similares a SEA esto significa una o más de las sustituciones (aplicadas a injertos de SEA a SEE; quimeras SEE/A):

Región A: R20G, N21T, S24G, R27K

Región C; G60D, P62S

Región F: H111R, H114Q, G115Y, F117Y, G118N, S124V, G126D

Región H: D200G, P206S, D207N

En la fecha de prioridad se prefirió llevar a cabo todas las sustituciones para cada región. Para otros superantígenos, sustituciones análogas entre posiciones/regiones correspondientes podrían también llevarse a cabo de un modo plausible.

Típicamente se podría empezar a partir de un primer supeantígeno, como SEE y SED, y entonces reemplazar una o más de sus regiones originales de unión al V\beta con la(s) correspondiente(s) región(es) de un segundo superantígeno (p. ej., SEA); el primer y segundo superantígenos se seleccionan preferiblemente de modo que el título de anticuerpo en sueros humanos normales para el primer superantígeno sea menor que para el segundo superantígeno. Para las quimeras SEA y SEE, las mejores disposiciones se corresponden con las quimeras SEE/A-A, SEE/A-AH y SEA/E-BDEG, con preferencia absoluta por SEE/A-A. Véanse la parte experimental y las figuras.

Junto con las regiones A, C, F y H también los residuos aminoácidos de otras partes pueden intercambiarse. Un tipo de intercambio es para reducir la capacidad de unión a clase II, dado que esta propiedad está asociada con los efectos secundarios comunes encontrados en la terapia con superantígenos (activación del sistema inmune general con liberación sistemática concomitante del factor de necrosis tumoral (TNF) y de interferón \gamma). Para los superantígenos tales como SEA, SED y SEE, las posiciones que son importantes por su capacidad para coordinar iones de zinc pueden cambiarse preferiblemente, es decir, las posiciones 225 y 227, por ejemplo, en la mutación de SEA H225A y, en particular en D227A, tendrá un impacto positivo en la reducción de los efectos secundarios tóxicos (véase Abrahmsén et al., documento WO9601650 y Fraser et al., 1993).

Otras sustituciones pueden llevarse a cabo a través de toda la molécula siempre y cuando no destruyan la función del superantígeno, por ejemplo, sustituciones conservadas, en regiones externas particulares implicadas en la unión a clase II y TCR. Un cambio en la secuencia de ADN para alterar la unión al MHC de clase II o cualquier otro cambio a nivel del ADN puede llevarse a cabo tanto antes como después del cambio en las regiones encargadas de la unión a TCR. Estos otros tipos de modificaciones pueden igualmente bien introducirse previamente al reemplazamiento de aminoácidos en la Región I. En el contexto del presente invento, el concepto de emplear un "superantígeno silvestre" al inicio de la modificación de acuerdo a las reivindicaciones se refiere principalmente a la secuencia de aminoácidos silvestre en la región I, fuera de la cual se hayan podido llevar a cabo modificaciones previas.

La construcción de superantígenos quiméricos y mutados puede llevarse a cabo de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. La transferencia desde una región específica para un superantígeno hasta la región correspondiente en otro superantígeno se realiza a nivel genómico y puede efectuarse reemplazando una secuencia completa o mediante mutaciones puntuales de aquellas bases específicas que se precisan para terminar en la secuencia de aminoácidos deseada. Véase como ejemplo la parte experimental y también las referencias de los antecedentes de la técnica citadas anteriormente. El término "mutación" comprende reemplazar, insertar o eliminar uno o más residuos aminoácidos al modificar la secuencia de ADN que codifica para la proteína que se va a mutar.

El superantígeno que va a emplearse en el método inventivo puede ser un superantígeno no conjugado modificado, según se describió anteriormente, es decir, un superantígeno modificado que carece de un resto busca dianas específicamente unido, pero con una capacidad notable para unirse tanto a antígenos del MHC de clase II como a un subgrupo de células T, vía el TCR. Más preferiblemente, el superantígeno modificado, preferiblemente un superantígeno quimérico, se conjuga con un resto busca dianas. En el último caso, las variantes preferidas son fusiones entre el resto busca dianas y el superantígeno modificado. Los conjugados como tales son nuevos y constituyen un aspecto aparte del invento.

Las estructuras de los conjugados inventivos son análogas a los conjugados de anticuerpo-superantígeno anteriormente conocidos (Dohlsten et al., documento WO9201470; Abrahmsén et al., documento WO9601650), es decir, los conjugados a menudo cumplen con la fórmula:

T - B - SA(m)

donde T representa el resto busca dianas, SA(m), el superantígeno modificado, preferiblemente quimérico, según se definió anteriormente y B es un puente covalente que enlaza T y SA(m) juntos. T puede contener, en principio, restos adicionales de superantígeno (SA(m)) y SA(m), restos adicionales busca dianas, aunque en los conjugados preferidos hay sólo un resto busca diana y un resto de superantígeno modificado, según se definió anteriormente.

T puede, en principio, ser cualquier estructura que sea capaz de unirse a una estructura de la superficie celular, preferiblemente una estructura específica de la enfermedad. La estructura frente a la que T se dirige es normalmente diferente (a) del epítopo de la cadena V\beta al cual SA(m) se une y (b) de los epítopos del MHC de clase II a los que los superantígenos se unen. El resto busca dianas se selecciona primariamente de entre interleuquinas (p. ej., interleuquina-2), hormonas, anticuerpos, que incluyen fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos, factores de crecimiento, etc. Véase por ejemplo Woodworth, Preclinical and Clinical development of Cytokine toxins presentado en la conferencia "Molecular approaches to cancer Immunotherapy", en Ashville, Carolina del Norte, 7-11 de noviembre, 1993.

En la fecha de prioridad, se prefería que T fuese un anticuerpo (un anticuerpo completo, Fab, F(ab)_{2}, Fv, un anticuerpo de cadena única y cualquier otro fragmento de anticuerpo que se una al antígeno), con énfasis particular en los fragmentos activos del anticuerpo (tales como Fab), dirigidos hacia el así llamado epítopoe C242 (Lindholm et al., documento WO9301303) o más preferiblemente hacia el epítopo de unión para el anticuerpo 5T4 específico del cáncer de pulmón (Stern et al., documento WO8907947). Esto, sin embargo, no excluye que otros anticuerpos específicos de cáncer puedan funcionar igualmente bien o incluso mejor. El término "anticuerpo" incluye variantes monoclonales, así como policlonales, con preferencia por las preparaciones monoclonales.

T puede también dirigirse hacia estructuras únicas sobre células más o menos sanas que regulan o controlan el desarrollo de una enfermedad.

El puente B puede seleccionarse según se describió previamente (Dohlsten et al., documento WO9201470 y Abrahmsén et al., documento WO9601650), es decir, B deberá ser preferiblemente hidrofílico y exhibir una o más estructuras seleccionadas de entre amida, tioéter, disulfuro, etc. Los puentes más prominentes son los obtenidos por técnicas recombinantes, es decir, la conjugación tiene lugar a nivel genómico. En tales casos los puentes oligopeptídicos que contienen aminoácidos hidrófilos, tales como Gln, Ser, Gly, Glu, Pro, His y Arg son los preferidos. Las Bs preferidas particularmente son los puentes peptídicos constituidos por 1-10 residuos aminoácidos, con preferencia absoluta por 3-7 residuos aminoácidos. Un puente típico es el tripéptido GlyGlyPro, SEQ ID nº 1.

La fabricación de los nuevos conjugados inventivos, en principio, puede llevarse a cabo de acuerdo con dos vías principales: 1) técnicas recombinantes y 2) acoplamiento químico de un resto busca dianas T a un superantígeno modificado, preferiblemente quimérico, (SA(m)), como se definió anteriormente. Estos métodos se reconocen bien por el trabajador especialista ordinario y comprenden un gran número de variantes.

El acoplamiento químico de un superantígeno no conjugado modificado a un resto busca dianas T utiliza, a menudo, grupos funcionales (p. ej., grupos amino o grupos carboxi primarios) que están presentes en muchas posiciones en los compuestos. Por lo tanto, el producto final contendrá una mezcla de moléculas de conjugado que difieren en las posiciones de acoplamiento, así como hetero y homoconjugados.

Para los conjugados recombinantes (proteínas de fusión), la sustancia conjugada obtenida será uniforme con respecto a la posición de acoplamiento. Bien el amino terminal del superantígeno quimérico está acoplado al carboxi terminal del resto busca dianas o viceversa. Para anticuerpos, tales como anticuerpos intactos y fragmentos de unión a antígeno (Fab, Fv, anticuerpos de cadena única, etc.), tanto la cadena ligera como la pesada pueden utilizarse para la fusión. En el momento actual se prefieren los conjugados recombinantes, con máxima preferencia por los fragmentos Fab y el acoplamiento del amino terminal del superantígeno quimérico al primer dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo (CH1), sin exclusión de los acoplamientos análogos a la cadena ligera o a los dominios VH y VL que también pueden proporcionar resultados bastante buenos.

La célula hospedante principal para la producción recombinante a gran escala de los superantígenos inventivos modificados (formas fusionadas, así como formas no conjugadas) es E. coli. Este hospedante se encarga en principio de dos vías: producción intracelular y secreción. La última variante se prefiere porque ofrece la purificación de proteínas plegadas correctamente a partir del periplasma y a partir del medio de cultivo. Lo anterior no excluye el que sea posible producir conjugados activos también en otras células hospedantes, p. ej., células eucariotas, tales como células de levadura o de mamífero.

Composiciones farmacéuticas, dosis y vías de administración

Un tercer aspecto del invento presente son las composiciones farmacéuticas que contienen los superantígenos inventivos modificados, preferiblemente quiméricos, según se definieron anteriormente (tanto formas conjugadas como no conjugadas). Las composiciones contempladas se conocen en el campo, salvo que ahora contienen el superantígeno inventivo presente. Así, las composiciones pueden estar en forma de un material en forma de partículas liofilizado, de una solución estéril o producida asépticamente, de un comprimido, de una ampolla, etc. Vehículos tales como agua (preferiblemente tamponada hasta un valor de pH fisiológicamente aceptable por, por ejemplo, PBS) u otro material sólido o líquido inerte pueden estar presentes. En términos generales, las composiciones se preparan cuando el conjugado se mezcla con, se disuelve en, se une a, o de otro modo se combina con uno o más vehículos acuosos o no acuosos, solubles o insolubles en agua, y si es necesario junto con aditivos y adyuvantes apropiados. Es imperativo que los vehículos y las condiciones no afecten de manera adversa la actividad del superantígeno modificado.

Normalmente el superantígeno inventivo se venderá y se administrará en dosis dispensadas previamente, cada una contendrá una cantidad eficaz del conjugado que, basado en los resultados presentados ahora, se cree que estará dentro del intervalo de 10 ng a 50 mg, tal como dentro de 10 ng - 1 mg o dentro de 10 \mug - 50 mg. La dosis exacta variará de un caso a otro dependiendo del peso y edad del paciente, de la vía de administración, del tipo de enfermedad, del resto busca diana, del superantígeno, del enlazador (-B-), etc.

Las vías de administración serán las contempladas normalmente en el campo, es decir, una cantidad eficaz para matar células diana o una cantidad terapéuticamente activa de un superantígeno modificado de acuerdo con el invento se pone en contacto con las células diana. Para las indicaciones especificadas anteriormente esto significa mayoritariamente una administración parenteral, tal como inyección o infusión (subcutáneamente, intravenosamente, intraarterial, intramuscularmente, intraperitoneal) a un mamífero, tal como un ser humano. Los superantígenos modificados, preferiblemente quiméricos, contemplados pueden administrarse local o sistémicamente.

Con el término "cantidad eficaz para matar la diana" se contempla que la cantidad es eficaz en activar y dirigir las células T para destruir las células diana.

La vía de administración preferida en la fecha de la prioridad es la misma que la contemplada para los superantígenos conjugados de acuerdo con Dolsthen et al., documento WO9201470 y Abrahmsén et al., documento WO9601650. Esto significa una infusión intravenosa de 1-5 horas (preferiblemente 4 horas) al día combinada con un agente reductor de fiebre (paracetamol). La administración debe repetirse durante algunos días, por ejemplo 4 días, teniendo consideración especial por el riesgo de inyectar los anticuerpos directamente hacia el conjugado.

Los superantígenos inventivos pueden administrarse bien como la terapia principal o, de modos preferentes, como terapia coadyuvante con respecto a cirugía u otros fármacos.

En el contexto de la terapia, los autores han encontrado que las preparaciones de anticuerpos que son puros con respecto a cadenas de anticuerpo pesadas y ligeras que no están covalentemente asociadas proporcionan ventajas por encima de las preparaciones que contienen anticuerpos en los que las cadenas están enlazadas entre sí vía enlaces de cistina. En consecuencia, un cuarto aspecto del invento es el empleo terapéutico de una preparación de anticuerpos, en particular una preparación de Fab, en la que los residuos de cisteína que enlazan las cadenas entre sí se han reemplazado por un aminoácido que no permite la formación del disulfuro, por ejemplo, la serina. Las especificidades más preferidas del anticuerpo para este aspecto del invento fueron, en la fecha de la prioridad, los anticuerpos monoclonales C242 (Lindholm et al., documento WO9301302) y los anticuerpos monoclonales 5T4, según se definieron en las referencias citadas anteriormente. En las variantes preferidas una de las cadenas del anticuerpo se fusiona con un superantígeno que es capaz de activar un subgrupo de células T de una manera específica a V\beta según se describió anteriormente. El superantígeno puede ser silvestre, una quimera o una versión mutada puntualmente (y sus combinaciones), según se describió anteriormente o por Dohlsten et al., en el documento WO9201470 o por Abrahmsén et al., en el documento WO9601650. Este aspecto del invento comprende también composiciones farmacéuticas como las descritas anteriormente, pero que contienen una preparación de anticuerpo según se definió para este aspecto del invento en lugar de un superantígeno quimérico.

En la fecha de la prioridad, se prefirió emplear el fragmento Fab del anticuerpo 5T4 (Stern et al., documento WO8907947) en combinación con la quimera SEE/A-A con la mutación D227A. El fragmento Fab preferido se mutó en ambas cadenas en la posición que proporcionaba la unión disulfuro entre cadenas (cys a ser). A fin de aumentar el rendimiento del anticuerpo/proteína de fusión cuando se producía en E. coli, también se llevaron a cabo mutaciones en ciertas posiciones de la cadena Vkappa. Véase la parte experimental.

Materiales y métodos Construcción de los genes quiméricos SEA/SEE

La construcción de las quimeras SEA/SEE se realizó empleando el método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), extensión solapante de secuencia (Horton et al.). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con UlTma (Perkin-Elmer), de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes. Los fragmentos producidos por PCR se clonaron en PCR-script (Stratagene, EE. UU.) y se secuenciaron para verificar la secuencia correcta. Los genes del superantígeno quimérico se subclonaron después en el vector de expresión pKP889 (Abrahmsén et al., 1995), fusionando los constructos SE con la porción de cadena pesada del fragmento Fab del anticuerpo monoclonal murino C215. Las proteínas recombinantes de fusión SEA y SEE se produjeron como polipéptidos de cadena completa de acuerdo con la secuencia consenso para la escisión del péptido señal (von Heijne, 1986).

Expresión y purificación de proteínas

La cepa UL635 de Escherichia coli K12 se empleó para la expresión de las proteínas de fusión Fab-SE y de los mutantes SEA según se describió con anterioridad (Abrahmsén et al., 1995). Las proteínas de fusión Fab-SE se recogieron mediante centrifugación a 5.000 g y las fracciones de sobrenadante se sometieron a purificación en proteína G Sepharose (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia), según se describió con anterioridad (Abrahmsén et al., 1995). La pureza de las variantes de Fab-SE purificadas por afinidad fue > 90% de pureza cuando se analizó por SDS-PAGE.

Células

La línea celular humana Raji de linfoma de células B y el carcinoma de colon humano Colo 205 se cultivaron en medio completo R (RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero de ternera fetal Gibco BRL, Life Technologies, Ltd. Paisley, Escocia; 1 mM de glutamina, HyClone Europe, Ltd. Cramlington; 5 x 10^{-5} M de \beta-mercaptoetanol, ICN Biomedicals INC. Costa Mesa CA; 0,1 M de NaHCO_{3}, Seromed Biochrome; 1 x 10^{-2} M de tampón Hepes, Hyclone Europe, Ltd. Cramlington; 0,1 mg/ml de gentamicina, Biological Industries Kibbutz Beit Haemek, Israel; 1 x 10^{-3} M de piruvato sódico, HyClone Europa, Ltd. Cramlington). Las células CHO transfectadas con moléculas humanas C215 y CD80 se cultivaron en medio R completo suplementado con 0,5 mg/ml de geniticina (G418, Gibco BRL, Life Technologies, Ltd. Paisly, Escocia). Las células mononucleares de sangre periférica (PBM, peripheral blood mononuclear cells) se prepararon a partir de sangre heparinizada de donantes sanos. Las células se aislaron por centrifugación de densidad sobre Ficoll-Paque, según se describió previamente (Dohlsten et al., 1991). Los linfocitos T humanos se purificaron hasta homogeneidad mediante selección positiva empleando columnas MiniMACS junto con bolas magnéticas recubiertas con anticuerpos monoclonales específicos para los CD4 y CD8 humanos (Miltenyi Biotec GmbH, Alemania) de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. Las líneas celulares humanas reactivas a SEA y SEE se generaron según se describió previamente (Dohlsten et al., 1994). La línea celular que expresa el TCR V\beta22 humano se generó a partir de una línea celular primaria reactiva a SEA estimulada empleando selección positiva con bolas magnéticas Dynabeads (Dynal A. S., Noruega) recubiertas con el anticuerpo monoclonal TCR V\beta22 específico (Immunotech, Francia). Las células enriquecidas contenían > 95% de células T TCR V\beta22^{+}, según se determinó por citometría de flujo (datos no mostrados). Los hibridomas de células T murinos (I1B3, 2B4 y 11.40) se generaron según se describió (Fleury et al., 1991).

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad se midió en un ensayo convencional de liberación de ^{51}Cr después de 4 ó 6 horas, según se describió previamente (Dohlsten et al., 1991). Las células humanas Colo205 o Raji se emplearon como células diana. Las células efectoras, bien líneas celulares T humanas reactivas a SEA o SEE o líneas celulares TCR V\beta22 se añadieron en la proporción efector a diana de 30:1. Las células diana marcadas con ^{51}Cr se emplearon en los ensayos de citotoxicidad a 2.500 células/200 ml de medio completo en pocillos microtitrados de fondo en V. Los híbridos C215Fab-SEA/E se añadieron a varias concentraciones según se indicó y la liberación de ^{51}Cr se midió en un contador g. El porcentaje de la citotoxicidad específica se calculó como 100 x [(liberación experimental de c.p.m - liberación de fondo de c.p.m.)/(liberación total de c.p.m. - liberación de fondo de c.p.m.)].

Ensayos de proliferación de linfocitos

Para medir la proliferación se incubaron a 37ºC 10^{5} células T respondedoras humanas con 10^{4} células estimuladoras irradiadas (20.000 Rad) en 200 ml de medio completo en placas de microtitración en U de 96 pocillos con diversas cantidades de los híbridos C215Fab-SEA/E durante 72 horas. La proliferación se estimó por incorporación de [^{3}H]-timidina, según se describió (Dohlsten et al., 1988).

Análisis de la producción de IL-2 inducida por Fab-SAg

Las células de hibridoma murino T-T (10^{5}) se incubaron en 200 ml de medio R completo con las proteínas quiméricas C215Fab-SEA/E en presencia de 2 x 10^{4} células estimuladoras Raji. Después de 48 horas, los sobrenadantes se recogieron y se analizaron en relación con la presencia de IL-2 murina. Brevemente, el contenido de citoquinas se analizó empleando el anticuerpo monoclonal de citoquina de rata anti-ratón como anticuerpos receptores. La IL-2 anti-ratón purificada de rata, la IL-2 anti-ratón de rata marcada con biotina, la rIL-2 se compraron de PharMingen (San Diego, CA). El anticuerpo monoclonal (mAb) anti-citoquina marcada con biotina, Vectastain ABC kit (Vector Laboratories, CA) y el kit del sustrato de peroxidasa (Bio-Rad Laboratories, CA) se emplearon para detectar las citoquinas. La absorbancia se determinó en un ImmunoReader NJ2000 (InterMed Roskilde, Dinamarca) a 405 o 450
nm.

Mutación de 5T4 Fab Construcción de un vector para expresar 5T4Fab-SEA en E. coli

Las partes que codifican para Fv de 5T4 se clonaron a partir del hibridoma 5T4, obtenido del Dr. Peter Stern (Stern et al., documento WO8907947). Con más detalle: el ADNc se fabricó a partir del ARNm; las regiones de los dominios variables enteros y partes de las secuencias señal, así como el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio constante de la cadena ligera se amplificaron por PCR. Los oligonucleótidos

: 5'-CAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC-3' (SEQ ID nº: 2) y

: 5'-ACTAGTCGACATGGATGGAGCTITATCATIyTCTT-3' (SEQ ID nº: 3)

se emplearon para la cadena pesada, lo que dio como resultado un fragmento de 553 pb, mientras que los oligonucleótidos

: 5'-ACTAGTCGACATGGGCITCAAGATGGAGTCACAkwyyCwGG-3' (SEQ ID nº: 4) y

: 5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3' (SEQ ID nº: 5)

se emplearon para la cadena ligera, lo que rindió un fragmento de 724 pb. Para cada cadena se secuenciaron tres clones separados y se encontró que eran idénticos. Los fragmentos de ADN apropiados para insertar en el vector de expresión (ref) se obtuvieron en una segunda etapa de PCR. A fin de ensamblar un plásmido de expresión Fab, las regiones variables de 5T4 se fusionaron a las secuencias que codifican para las regiones constantes a partir del anticuerpo IgG1/k del anticuerpo monoclonal C242 murino (Lindholm et al., documento WO9301302). Una región que codifica para un superantígeno derivado de la enterotoxina A estafilocócica (SEA) se fusionó tras la cadena pesada. La secuencia verificada para el entramado del anticuerpo de la cadena Vkappa del anticuerpo 5T4 se proporciona en los resultados.

Mutagénesis de 5T4

Siete reemplazamientos de aminoácidos se introdujeron en las regiones codificantes para el entramado del anticuerpo. Éstos fueron: Phe10Ser, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser y Leu78Val. De forma similar, los residuos Cys en cada cadena implicados en la unión disulfuro entre dominios se reemplazaron por residuos de serina, lo que dió como resultado las mutaciones Cys458Ser en la cadena pesada y Cys214Ser en la cadena ligera. Las mutaciones se introdujeron empleando mutagénesis basada en PCR y la secuencia de ADN obtenida se confirmó mediante secuenciación.

Expresión en el fermentador y purificación de 5T4Fab-SEA

El plásmido de expresión contiene el gen de resistencia a kanamicina y un promotor lacUV5 que puede inducirse con IPTG. Las proteínas de fusión se purificaron a partir del medio de cultivo aclarado, empleando proteína G Sepharose y SP-Sepharose (Pharmacia Biotec, Uppsala, Suecia), y se formularon en tampón citrato empleando Sephadex G-25, esencialmente como se describió. La caracterización, empleando SDS-PAGE, el HPLC de fase reversa y la espectrometría de masas, mostró que la proteína de fusión purificada fue de una pureza superior al 95% y tuvo la masa molecular correcta.

Resultados Modificaciones del superantígeno

La citotoxicidad celular dependiente de superantígeno (SDCC) de C215Fab-SEA y de C215Fab-SEE frente a las células Raji de MHC de clase II^{+} se analizó empleando células T humanas reactivas a SEA y SEE como líneas celulares efectoras. A pesar de la diferencia en especificidad V\beta entre SEA y SEE ambos superantígenos mostraron una inducción de nivel similar de la citotoxicidad con ambas líneas celulares efectoras (Fig. 1). Para discriminar entre los efectos de la presentación del MHC de clase II y los efectos directos de SEA y SEE en el reconocimiento del TCR, se examinaron en cuanto a la citotoxicidad celular dependiente del superantígeno-anticuerpo (SADCC) frente a las células Colo205 que expresan C215. En este ensayo, el resto Fab dirige la proteína de fusión hacia las células diana que expresan C215 y da como resultado la presentación de moléculas SE de fusión a las células T citotóxicas (CTL) independientes de las moléculas de MHC de clase II (Dohlstein et al., 1994). A pesar de que la identidad en la secuencia de aminoácidos entre SEA y SEE > 80%, la interacción TCR de SEA y SEE exhibe diferencias cualitativas en este tipo de ensayo. La proteína de fusión C215Fab-SEA retiene su capacidad para dirigir los CTL reactivos de SEA y SEE frente a las células diana de MHC de clase II^{-} (Fig. 1), mientras que C215Fab-SEE no induce la citotoxicidad de las células diana del MHC de clase II^{-}, ni con CTL reactivos a SEA ni a SEE (Fig. 1).

Se ha descrito previamente por otros investigadores que las diferencias en especificidad V\beta entre SEA y SEE se refieren principalmente a la diferencia en tres aminoácidos en el lazo precedente y en la hélice irregular a5 (Irwin et al., 1992, Hudson et al., 1993, Fraser et al., 1993 y Mollick et al., 1993). La diferencia con respecto a la interacción TCR descrita en esta investigación no está relacionada con una especificidad V\beta de TCR alterada, dado que la capacidad de C215Fab-SEA para inducir la citotoxicidad independiente de MHC de clase II no está restringida al CTL reactivo a SEA, sino que también se observa con el CTL reactivo a SEE.

El análisis de homología de secuencia de SEA y SEE (Fig. 2) revela que los residuos aminoácidos que no son idénticos están concentrados en ocho regiones precisas. Fuera de estas ocho regiones, lo que constituye hasta el 34% de la secuencia, la identidad de los dos SEs es del 97%, con sustituciones de aminoácidos conservadas dando razón del resto de las diferencias. Cuatro de las regiones no homólogas están estructuralmente próximas a los dos sitios de unión al MHC de clase II (B, D, E y G) y no es probable que interaccionen con el TCR (Fig. 3). Las otras cuatro regiones (A: AA 20-27, C: 60-62, F: 161-176 y H: 200-207) se localizan en el extremo de la molécula (Fig. 3), en la vecindad del sitio de unión a TCR, localizado en el surco entre los dos subdominios (Kappler et al., 1992). Para investigar la diferencia cualitativa en el reconocimiento del TCR entre SEA y SEE se construyeron proteínas híbridas
mediante injerto de las regiones desde SEA hasta SEE como quimeras de región individuales (SEE/A-A, -C, -F, H), como híbridos de región doble (SEE/A-AH) y por injerto de las regiones localizadas en la vecindad de los sitios de unión al MHC de clase II en SEE hasta SEA (SEA/E-BDEG) (Fig. 4). Todos los SE quiméricos se expresaron como pro-
teínas de fusión C215Fab para poder detectar diferencias con respecto a su actividad en ausencia del MHC de clase II.

Las proteínas híbridas SEA/E, en fusión con el resto C215Fab, muestran diferencias en los ensayos de citotoxicidad dirigidos a Fab

La actividad SDCC de las proteínas híbridas C215Fab-SEE/A frente a las células Raji del MHC de clase II^{+} se analizaron empleando células T humanas reactivas a SEA como efectores. Los valores EC_{50} de todos los híbridos C215Fab-SE, así como los de C215Fab-SEAwt y -SEEwt, caen dentro del margen de errores (p. ej., 10^{-12} - 10^{-11} M, Fig. 5). La única diferencia detectable es un plateau ligeramente reducido para los híbridos C215Fab-SEE/A-AH, lo que indica una pérdida de células T que responden. Por otro lado, en los experimentos SADCC donde la citotoxicidad se dirige hacia la línea celular Colo205, MHC de clase II^{-}/C215^{+}, sólo C215Fab-SEE/A-A, C215Fab-SEE/A-AH y C215Fab-SEA/E-BDEG indujeron una citotoxicidad comparable a C215Fab-SEAwt (Fig. 5). El híbrido C215Fab-SEE/A-F es capaz de inducir una citotoxicidad dirigida frente a C215 a concentraciones mayores (EC_{50} > 10^{-10} M). Aunque el híbrido C215Fab-SEE/A-H es capaz de inducir citotoxicidad dirigida frente a C215 con una mitad de la concentración máxima similar a la de C215Fab-SEAwt (p. ej., EC_{50} 10^{-13} M), el nivel absoluto de citotoxicidad se encuentra fuertemente reducido (Fig. 5). Esta diferencia podría ser una consecuencia de una especificidad V\beta del C215Fab-SEE/A-H restringida, mientras que la capacidad de inducir citotoxicidad dirigida frente a C215 se mantiene en la subpoblación de células T respondedoras. Para investigar aún más esta idea los autores prepararon la línea CTL oligoclonal V\beta22 humana. Los V\beta22 humanos son análogos a los V\beta3 murinos con respecto a que es una familia V\beta específica de SEA y no de SEE. Se ha mostrado previamente (Mollick et al., 1993) que la mayor contribución del V\beta de SEA y de SEE reside primariamente en la diferencia de los tres aminoácidos en la región H (AA 200-207) entre SEA y SEE. En los ensayos SDCC frente a dianas del MHC de clase II^{+} Raji, empleando la línea CTL V\beta22 oligoclonal como efectora, sólo los híbridos que contienen la región SEA-H son capaces de proporcionar una respuesta similar a la de C215Fab-SEAwt (p. ej., C215Fab-SEE/A-H, C215Fab-SEE/-AH y C215Fab-SEA/E-BDEG, Fig. 6). El híbrido C215Fab-SEE/A-A, que fue capaz de inducir una respuesta completa SDCC con poblaciones totales de CTL como efectores, en este ensayo se encuentra fuertemente reducido tanto en la mitad de la concentración máxima como en el plateau (Fig. 6). Cuando la citotoxicidad de CTL V\beta22 está dirigida frente a la línea celular Colo 205 de MHC clase II^{-}/C215^{+}, sólo los híbridos que contienen ambas regiones SEA-A y SEA-H (p. ej., C215Fab-SEE/A-AH y C215Fab-SEA/E-BDEG) son capaces de inducir una respuesta citotóxica comparable a la de C215Fab-SEAwt (Fig. 6). El híbrido que contiene sólo la región A de SEA (C215Fab-SEE/A-A) induce un nivel menor de citotoxicidad con un valor EC_{50} comparable. Esto indica que la actividad restante observada con el híbrido C215Fab-SEE/A-H en SADCC con la población de células T totales como efectora no es una consecuencia de la respuesta inducida por el híbrido en la población restringida de células T. Una explicación más probable para la observación es que la capacidad de inducir una respuesta SADCC por parte de las proteínas híbridas C215Fab SE reside primariamente en la región SEA-A con una contribución menor para las regiones SEA-H y -F. No hay evidencia acerca de que esta cualidad esté restringida a algún subgrupo de células T en la población combinada de células T respondedoras a SEA-SEE, dado que C215Fab SEA es capaz de inducir la misma respuesta así como con CTL reactivos a SEE y C215Fab-SEE/A-A es capaz de reconstituir completamente la respuesta observada con C215Fab-SEA.

Las proteínas híbridas SEA/E, en fusión con el resto C215Fab, muestran diferencias en los ensayos de proliferación dirigidos frente a C215

Se ha mostrado previamente que las células T humanas en reposo purificadas son inducidas a proliferar por la presentación de C215Fab-SEA sobre una línea celular MHC de clase II^{-}/C215^{+}/CD80^{+} (Lando et al., 1993). Sin embargo, la capacidad de C215Fab-SEA de inducir la proliferación independiente de MHC II está marcadamente reducida con C215Fab-SEE (Tabla 1). Para investigar si esta diferencia en calidad muestra la misma restricción a la región A de SEA, como se ha comprobado con SADCC, los autores investigaron la capacidad proliferativa de los híbridos C215Fab-SE, presentados bien por las líneas celulares transfectadas CHO-DR1^{+}/CD80^{+} o por CHO-C215^{+}/CD80^{+} sobre las células T humanas en reposo purificadas. Cuando se presentaron los conjugados Fab-SE sobre CHO-DR1^{+}/CD80^{+} no se detectaron diferencias entre las distintas proteínas SE (datos no mostrados). Sin embargo, los injertos de la región A, C, y H de SEA en SEE potencian la actividad proliferativa comparada con la de C215Fab-SEE. Los mejores resultados se obtuvieron mediante injertos de las regiones A y H de SEA, lo que indica un papel importante para la región A, según se observó por la citotoxicidad independiente del MHC de clase II. Mediante el empleo de una selección negativa es posible que las diferencias entre Fab-SEA y SEE sean más destacadas.

Especificidad v\beta de los híbridos SE

Para investigar adicionalmente si las proteínas de fusión híbridas C215Fab-SEA/SEE se asociaban con una cierta especificidad v\beta, los autores emplearon los hibridomas de células T murinas reactivas a SEA que expresaban V\beta1, V\beta3 y V\beta11. Es obvio a partir de los datos obtenidos que todas las regiones investigadas, directa o indirectamente, afectan la interacción con el TCR. Al injertar las regiones C y F de SEA en C215Fab-SEE la actividad hacia el hibridoma V\beta1 I1B3 con reacción cruzada a SEA y SEE se destruyó. Las mismas quimeras parecen no tener efectos, o tenerlos mínimos, sobre la actividad de los hibridomas V\beta3 y V\beta11 (2.B4 y 11.40) en comparación con C215Fab-SEE. Al injertar la región A de SEA en C215Fab-SEE la actividad hacia V\beta3 (2.B4) se incrementa en al menos un factor de 100, en comparación con C215Fab-SEE. Efectos más pronunciados se observan con la misma línea celular al injertar la región H de SEA en C215Fab-SEE. Este efecto pronunciado en la influencia sobre la especificidad V\beta3 por la región H de SEA también se había advertido en las investigaciones previas (Mollick et al., 1993). Sin embargo, la misma quimera (C215Fab-SEE/A-H) parece reducir la actividad hacia los hibridomas V\beta1 y V\beta11 (I1B3 y 11.40) con reacción cruzada a SEA/SEE por un factor de 10. En conclusión, la interacción TCR de SEA parece involucrar todas las regiones variables A, C, F y H de SEA-SEE.

Serorreactividad

La serorreactividad en muestras de suero humanas hacia las SEs quiméricas se investigó tanto en muestras agrupadas de diferentes partes del mundo como en muestras de suero individuales. Al injertar ambas regiones A y H de SEA en SEE los autores obtuvieron una serorreactividad intermedia (Fig. 8). Una serorreactividad similar se observó frente a la quimera C215Fab-SEE/A. Sin embargo, injertos individuales de la región A de SEA en SEE (C215Fab-SEE/A-A) proporcionaron una serorreactividad similar a la de C215Fab-SEE, lo que indica que la región H de SEA es la responsable de la serorreactividad restante frente a C215Fab-SEE/A-AH. Esto indica que la región H de SEA es parte del epítopo antigénico dominante en SEA. La serorreactividad a partir de muestras de suero agrupadas de otras partes del mundo (Japón y EE.UU.), así como de 14 muestras individuales de Suecia, confirma que todos tienen el mismo patrón general (datos no mostrados).

Resultados Mutaciones de la parte Fab de las proteínas de fusión Expresión de los constructos 5T4FabSEA

El nivel de producción en E. coli de 5T4Fab-SEA en el fermentador se encontró significativamente menor que el de otros constructos de superantígeno Fab previamente estudiados en el laboratorio de los autores. Por tanto, se introdujeron dos tipos de modificaciones para aumentar el nivel de producción. Primeramente, se introdujeron siete mutaciones puntuales diferentes en la región de entramado de la cadena ligera. Éstas fueron Phe10Ser, Thr45Lys, Ile63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser y Leu78Val. En segundo lugar, los residuos de cisteína que establecen los enlaces disulfuro que conectan las cadenas pesada y ligera se reemplazaron por residuos de serina. Esta última modificación dio como resultado en un aumento de tres veces en el nivel de producción y las 7 mutaciones puntuales un incremento adicional de 12 veces. Además del aumento significativo en el nivel de producción, la eliminación de los enlaces disulfuro proporciona también un producto más homogéneo dado que se excluye la posibilidad de que esos grupos tioles reactivos reaccionen con otros agentes con tioles.

La molécula 5T4 modificada se analizó en cuanto a su afinidad por su antígeno, así como en cuanto a su actividad biológica en SADCC. No se pudieron detectar diferencias entre la forma mutante y la forma silvestre en estos ensayos.

La mutación Cys/Ser se llevó a cabo también en las cadenas pesada y ligera de los fragmentos Fab de otros anticuerpos monoclonales diversos. Los productos se hicieron homogéneos y retuvieron completamente la capacidad de unión al antígeno.

Secuencia de la región de entramado del anticuerpo para la cadena Vkappa de 5T4:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ DAVMTQTPT F     LLVSAGDRVT   
ITC KASOSVS \hskip0,2cm NDVAW YQQKP GQSP T LLIS Y 
 \hskip0,48cm 50\cr  \+  TSSRYAG VPD  \; 
RF I GSG Y GTD  \,  FT F TIS TL QA
   EDLAVYFC QQ \hskip0,27cm DYNSPPTF GG  \hskip0,1cm 
100\cr  \+ GTKLEIK (SEQ ID nº
6);\cr}

las secuencias subrayadas son CDRs. Las posiciones en negrita se mutaron:

: Phe10Ser, Thr45Lys, Ile63Ser, Ile63Thr, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val.

TABLA 1

	Proliferación, EC_{50} (pM)
C215Fab-SEAwt	2,2
C215Fab-SEEwt	6,9
C2I5Fab-SEE/A-A	0,9
C215Fab-SEE/A-C	2,8
C215Fab-SEE/A-F	5,7

TABLA 1 (continuación)

	Proliferación, EC_{50} (pM)
C215Fab-SEE/A-H	1,0
C215Fab-SEE/A-AH	0,3
C215Fab-SEA/E-BDEG	1,6

TABLA 2

	I1B3 (MuV\beta 1)	2.B4 (MuV\beta 3)	11.40(MuV\beta 11)
	EC_{50} (nM)	EC_{50} (nM)	EC_{50} (nM)
C215Fab-SEA	10	3	0,05
C215Fab-SEE	10	> 1.000	0,05
C215Fab-SEE/A-A	10	10	0,05
C215Fab-SEE/A-C	> 1.000	> 1.000	0,05
C215Fab-SEE/A-F	> 300	> 300	0,05
C215Fab-SEE/A-H	100	3	0,3
C215Fab-SEE/A-AH	10	3	0,3

Leyendas de las figuras Figura 1 Citotoxicidad dependiente e independiente del MHC de clase II con CTL humanos de SEE y SEA

La citotoxicidad celular dependiente del MHC de clase II (A y B) y la citotoxicidad celular dependiente de C215 (C y D) con C215Fab-SEA (\blacksquare) y C215Fab-SEE (\ding{169}) como moléculas efectoras. La citotoxicidad se analizó en un ensayo convencional de liberación de ^{51}Cr de 4 h, empleando una línea de células T humanas reactiva a SEE (A y C) y una línea de células T humanas reactiva a SEA (B y D). Las líneas celulares diana fueron Raji, MHC clase II^{+}/C15^{-}, (A y B) y Colo 205, MHC^{-}/C215^{+}, (C y D). Los datos son de ensayos individuales que son representativos de dos (A y C) a cinco (B y D) experimentos independientes.

Figura 2 Alineamiento de homología de SEA y SEE

Las regiones variables SEA/SEE cercanas al sitio de unión al TCR (A, C, F y H) y las regiones variables cercanas a los dos sitios de unión al MHC de clase II.

Figura 3 Modelo animado de SEA

Modelo Molscript (Kraulis, 1991) del cristal SEA (Schad et al., 1995). Las regiones variables de SEA/SEE cercanas a los sitios de unión a TCR (A, C, F y H) y las regiones variables cercanas a los dos sitios de unión al MHC de clase II. El ión de zinc es una bola redonda.

Figura 4 Representación esquemática de las moléculas quiméricas SE

Los tramos de la secuencia SEA están rebajados. Las regiones variables de SEA/SEE están representadas por A, B, C, D, E, F, G y H.

Figura 5 Citotoxicidad dependiente e independiente del MHC de clase II con CTL humano reactivo a SEA

(A) Citotoxicidad celular dependiente del MHC de clase II y (B) citotoxicidad celular dependiente del C215 de C215Fab-SEE/A-A (\ding{169}), C215Fab-SEE/A-C (\boxempty), C215Fab/A-F (\lozenge), C215Fab-SEE/A-H (\bullet), C215Fab-SEE/A-AH (\Delta) y C215Fab-SEA/E-BDEG (\circ). La citotoxicidad se analizó en un ensayo convencional de liberación de ^{51}Cr de 4 h, empleando una línea celular humana T reactiva a SEA. Las líneas celulares diana fueron Raji, MHC clase II^{+}/C15^{-}, (A) y Colo 205, MHC^{-}/C215^{+}, (B). Los datos se tomaron de ensayos individuales que son representativos de cinco experimentos independientes.

Figura 6 Citotoxicidad dependiente e independiente del MHC de clase II con CTL Vb22^{+} humano

(A) Citotoxicidad celular dependiente del MHC de clase II y (B) citotoxicidad celular dependiente del C215 de C215Fab-SEA (\blacksquare), C215Fab-SEE (\blacklozenge), C215Fab-SEE/A-A (\ding{115}), C215Fab-SEE/A-C (\boxempty), C215Fab-SEE/A-F (\lozenge), C215Fab-SEE/A-H (\bullet), C215Fab-SEE/A-AH (\Delta) y C215Fab-SEA/E-BDEG (\circ) como moléculas efectoras. La citotoxicidad se analizó en un ensayo convencional de liberación de ^{51}Cr de 4 h empleando una línea de células T humana seleccionada Vb22 reactiva a SEA. Las líneas celulares diana fueron Raji, MHC clase II^{+}/C15^{-}, (A) y Colo 205, MHC^{-}/C215^{+}, (B). Los datos son de ensayos individuales que son representativos de dos experimentos independientes.

Figura 7 Proliferación dependiente e independiente del MHC de clase II (no en las aplicaciones prioritarias)

Efectos de los híbridos Fab-SE sobre la proliferación de las células T dependiente (A) e independiente del MHC de clase II. Las células T humanas purificadas se estimularon durante 96 h con C215Fab-SEA (\blacksquare), C215Fab-SEE (\blacklozenge), C215Fab-SEE/A-A (\ding{115}), C215Fab-SEE/A-C (\boxempty), C215Fab-SEE/A-F (\lozenge), C215Fab-SEE/A-H (\bullet), C215Fab-SEE/A-AH (\Delta) y C215Fab-SEA/E-BDEG (\circ) presentadas sobre transfectantes CHO-DR4/C215, MHC de clase II^{+}/C215^{-} (A) y sobre transfectantes CHO-CD80/C215, MHC de clase II^{-}/C215^{+}(B). Después de 72 h las células recibieron un pulso de [^{3}H]-timidina durante 24 h y el marcaje incorporado se midió y se representó como mitad de la concentración máxima (EC_{50}). Los datos son de ensayos individuales que son representativos de dos experimentos independientes.

Figura 8 Serorreactividad en una agrupación de Ig humana

Una agrupación de > 5.000 sueros de donantes sanos en el Sur de Europa frente a las proteínas de fusión C215Fab-SE. La Ig humana diluida en serie se dejó interaccionar durante 1 h a temperatura ambiente con C215Fab-SEAwt, C215Fab-SEEwt, C215Fab-SEE/A-A, C215Fab-SEE/A-H, FabSEE/A-AH. Se inmovilizó en las placas de microtitración a una concentración de 1 ng/pocillo. La corrección de la unión de C215Fab a las proteínas del suero se llevó a cabo por sustracción del valor OD para C215Fab en cada punto. Cada punto representa la media de muestras duplicadas. Para detalles adicionales véase Materiales y Métodos.

TABLA 1

Las células T humanas purificadas se estimularon durante 96 h con los respectivos C215Fab-SE presentados sobre los transfectantes CHO-DD80/C215 negativos para MHC de clase II. Después de 72 h las células recibieron un pulso de ^{3}H-timidina durante 24 h y el marcaje incorporado se midió y se representó como mitad de la concentración máxima (EC_{50}).

TABLA 2

Los hibridomas de células T murinas fueron estimulados durante 48 h con superantígenos conjugados con Fab nativo o quimérico. La actividad se midió como producción de IL-2 y se representó como mitad de la concentración máxima (EC_{50}).

Trabajo durante el año de prioridad

En un intento de minimizar la toxicidad de la fusión del anticuerpo C242Fab-SEE/A-A con el superantígeno quimérico, la quimera SEE/A-A se mutó en los sitios de unión a clase II según se describió en el documento WO9601650 y se fusionó a C215Fab. Las construcciones son C215Fab-SEE/A-A-D227A, C215Fab-SEE/A-A-F47A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-H187A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-W130A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-D70A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-N50S/D227A, C215Fab-SEE/A-A-N50S/D70A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A och C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A. Todas las fusiones se han sometido a ensayo en cuanto a su capacidad de inducir la proliferación de PBMC humanas para identificar los mutantes que tienen una actividad disminuida comparada con C215Fab-SEE/A-A-D227A. Se ha observado una actividad proliferativa disminuida para C215Fab-SEE/A-A-F47A/D227A, C215Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A och C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A. Algunas de las fusiones quiméricas también se han sometido a ensayo en cuanto al título de anticuerpos en suero humano normal (C215Fab-SEE/A-A-D227/A, C215-FabSEE/A-A-D70A/D227A y C215Fab-SEE/A-A-D70R/D227A). Se llevó a cabo una comparación con C215Fab-SEA-D227A y C215Fab-SEE-D227A. Relativo a C215Fab-SEA-D227A, el título fue mucho más bajo para cada quimera analizada. Relativo a C215Fab-SEE-D227A, el título fue ligeramente superior para cada quimera analizada.

Esto indica reemplazamientos en las posiciones que se corresponden a uno o más, preferiblemente dos, de las posiciones 47, 50, 70, 130 187, 227, según se definieron en las secuencias ID Nos 7 y 8 en la Figura 2.

Dado que diversas y diferentes realizaciones pueden realizarse dentro del alcance del concepto inventivo enseñado en esta memoria, y dado que las modificaciones pueden llevarse a cabo en las realizaciones detalladas en esta memoria de acuerdo con los requerimientos descriptivos de la ley, se entiende que los detalles de esta memoria deben interpretarse como ilustrativos y no en un sentido limitante.

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(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAATTTTCTT GTCCACCTTG GTGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTAGTCGAC ATGGATGGAG CTITATCATI YTCTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTAGTCGAC ATGGGCITCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCATTCCTGT TGAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(8) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 233 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

4

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(9) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 233 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:

5

6

Claims

1. Un conjugado entre:

(a): un superantígeno silvestre que se ha modificado, y

(b): un resto busca dianas

caracterizado porque dicho superantígeno modificado es SEE, en el que uno o más residuos aminoácidos en una región I, tal región I está dentro del sitio de unión al receptor de la célula T (TCR) y determina la unión a la cadena V\beta del TCR y la activación de la célula T, se ha reemplazado por uno o más residuos aminoácidos de la correspondiente posición en SEA, de modo que dicho superantígeno modificado ha mejorado su capacidad para inducir la citotoxicidad de las células T comparado con SEE y ha reducido la serorreactividad comparado con SEA, y

el superantígeno modificado, además, comprende una mutación que disminuye su capacidad para unirse a antígenos del MHC de clase II comparado con cualquiera de dichos superantígenos silvestres.

2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicha región I es la región A de la figura 2, que consiste en los residuos aminoácidos 20 a 27 de la SEQ ID Nº 7.

3. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicha región I es la región C de la figura 2, que consiste en los residuos aminoácidos 60 a 62 de la SEQ ID Nº 7.

4. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicha región I es la región F de la figura 2, que consiste en los residuos aminoácidos 161 a 176 de la SEQ ID Nº 7.

5. El conjugado de la reivindicación 1, en el que dicha región I es la región H de la figura 2, que consiste en los residuos aminoácidos 200 a 207 de la SEQ ID Nº 7.

6. El conjugado de la reivindicación 2, en el que se han hecho las siguientes sustituciones de aminoácidos: R20G, N21T, S24G y R27K, donde las posiciones son según se definieron en la SEQ ID Nº 7.

7. El conjugado de la reivindicación 6, que comprende además una mutación en la posición 227, según se definió en la SEQ ID Nº 7.

8. El conjugado de la reivindicación 7, en el que la mutación es D227A.

9. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que dicho resto busca dianas se selecciona de entre el grupo que consiste en un fragmento activo de la unión a antígeno del anticuerpo, un anticuerpo de unión al antígeno, una cadena sencilla de anticuerpo, Fab, F(ab)2 y Fv.

10. La composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado entre

(a): un superantígeno silvestre que se ha modificado y

(b): un resto busca dianas;

para uso en el tratamiento de una enfermedad en un mamífero por activación del sistema inmune de dicho mamífero; dicho conjugado se caracteriza porque dicho superantígeno modificado es SEE, en el que uno o más residuos aminoácidos en una región I, tal región I está dentro del sitio de unión al receptor de células T (TCR) y determina la unión a la cadena V\beta del TCR y la activación de la célula T, se han reemplazado por uno o más residuos aminoácidos a partir de la correspondiente posición en SEA, de modo que dicho superantígeno modificado ha mejorado la capacidad para inducir la citotoxicidad de la célula T comparado con SEE y ha reducido la serorreactividad comparado con SEA, y

11. La composición de la reivindicación 10, en la que la enfermedad se asocia con las células que expresan una estructura diana en la superficie, la cual se une al superantígeno de fusión en un epítopo del superantígeno estructuralmente diferente del epítopo de unión a TCR y que tal unión permite la unión a TCR del superantígeno y la activación de la célula T.

12. La composición de la reivindicación 10 u 11, en la que la enfermedad se selecciona de entre el grupo que consiste en cánceres, infecciones virales, infestaciones parasitarias y enfermedades autoinmunes.

13. La composición de la reivindicación 12, en la que la enfermedad es cáncer.

14. La composición de la reivindicación 10, en la que dicha región I es la región A de la figura 2, que consiste en los residuos aminoácidos 20 a 27 de la SEQ ID Nº 7.

15. La composición de la reivindicación 10, en la que dicha región I es la región C de la figura 2, que consiste en los residuos aminoácidos 60 a 62 de la SEQ ID Nº 7.

16. La composición de la reivindicación 10, en la que dicha región I es la región F de la figura 2, que consiste en los residuos aminoácidos 161 a 176 de la SEQ ID Nº 7.

17. La composición de la reivindicación 10, en la que dicha región I es la región H de la figura 2, que consiste en los residuos aminoácidos 200 a 207 de la SEQ ID Nº 7.

18. La composición de la reivindicación 14, en la que se han hecho las siguientes sustituciones de aminoácidos: R20G, N21T, S24G y R27K, donde las posiciones son como se definieron en la SEQ ID Nº 7.

19. La composición de la reivindicación 18 que, además, contiene una mutación en la posición 227, según se definió en la SEQ ID Nº 7.

20. La composición de la reivindicación 19, en la que la mutación es D227A.

21. La composición de las reivindicaciones 10-20, en la que dicho resto busca dianas se selecciona de entre el grupo que consiste en un fragmento activo de la unión a antígeno del anticuerpo, un anticuerpo de unión a antígeno, una cadena sencilla de anticuerpo, Fab, F(ab)2 y Fv.

22. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para uso como un medicamento.

23. Uso de un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero por activación del sistema inmune.

24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la enfermedad está asociada con células que expresan una estructura diana de superficie que se une al superantígeno de fusión en un epítopo del superantígeno, estructuralmente diferente del epítopo de unión a TCR, y tal unión permite la unión a TCR y la activación de la célula T del superantígeno.

25. Uso de acuerdo a la reivindicación 23 ó 24, en el que la enfermedad se selecciona entre el grupo que comprende cánceres, infecciones virales, infestaciones parasitarias y enfermedades autoinmunes.

26. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23-25, en el que la enfermedad es cáncer.