DE69733179T2

DE69733179T2 - Modifizierte chimäre superantigene und deren verwendung

Info

Publication number: DE69733179T2
Application number: DE69733179T
Authority: DE
Inventors: Per Antonsson; Johan Hansson; Per Björk; Mikael Dohlsten; Terje Kalland; Lars Abrahmsen; Göran Forsberg
Original assignee: Active Biotech AB
Current assignee: Active Biotech AB
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2017-03-27
Also published as: IL122211A; AU2525197A; NZ329145A; CZ294475B6; NO975435D0; ES2242222T3; HUP9903444A3; JP2002502363A; HU228185B1; HUP9903444A2; TW517061B; CA2222757C; BR9702179A; ID16512A; US20030092894A1; EP0835266B1; JP4114951B2; DE69733179D1; US7226595B2; NO975435L

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft funktionell aktive modifizierie Superantigene, die Wildtyp-Superantigene (SA I) sind, bei denen ein oder mehr Aminosäurereste unter Beibehaltung der Superantigenfunktion substituiert wurden. In dem Fall, dass einer oder mehrere der substituierten Reste (oder ein konservierter Aminosäurerest davon) in den korrespondierenden Positionen in einem anderen Wildtyp-Superantigen (SA II) vorkommt, wird das modifizierte Superantigen ein Chimäres (manchmal Hybrid) genannt. Chimäre Superantigene werden somit teilweise Sequenzen/Regionen enthalten, die aus mindestens zwei unterschiedlichen Wildtyp-Superantigenen abgeleitet sind.
Unter dem Begriff "konespondierend" ist zu verstehen, dass Reste, Teilsequenzen und Regionen, die sich gegenseitig ersetzen, funktionell die gleiche Position in den Superantigenen I und II aufweisen, so dass die Substitution zu einer chimären Form führen wird, die in der Lage ist, als ein Superantigen zu fungieren.
Die Terminologie gepfropft/Pfropfen/Pfropf wird in Verbindungen mit Teilen der Gesamtsequenz des Superantigens II verwendet, die durch korrespondierende Teile des Superantigens I ersetzt wurden, sogar wenn nur eine einzelne Aminosäure ersetzt wurde.
Modifizierte/chimäre Superantigene umfassen auch funktionelle Superantigene, die auf andere Arten modifiziert wurden, z. B. durch Aminosäureersetzungen in Regionen modifiziert wurden, die sich nicht auf diejenigen der Erfindung beziehen, die an einen Zielsuchenden Bereich konjugiert sind, einschließlich auch fusionierter Formen, wenn der Bereich ein Polypeptid/Protein ist. Die Reihenfolge der Durchführung der Modikationen kann variieren. Siehe unten.
Superantigene
Gemäß der allerersten Definition (um 1988 – 1993) sind Superantigene bakterielle oder virale Proteine, die in der Lage sind, an MHC Klasse II Antigene ohne vorherige intrazelluläre Prozessierung zu binden und T-Zellen durch Bindung an die β-Ketten variable Region (Vβ) des T-Zellrezeptors (TCR) zu aktivieren. Die Bindung führt zu einer auf die Vβ-Familie eingeschränkte Aktivierung eines relativ großen Anteils/Untergruppe von T-Zellen und zur Lyse von MHC Klasse II exprimierenden Zellen (Superantigen-abhängige Zell-vermittelte Zytolyse = SDCC).
Wohl bekannte Wildtyp-Superantigene gemäß der oben gegebenen Definition sind Staphylokokken-Enterotoxine (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SED, SEE und SEH). Weitere Beispiele sind das Toxische Schock Syndrom Toxin 1 (TSST-1, auch von Staphylokokkenursprung), "Exfoliating" (abblätternde) Toxine (EXft), pyrogene Streptokokkus Exotoxine A, B und C (SPE A, B und C), Maus-Mamma-Tumor-Virus-Proteine (MMTV), Streptokokken M-Proteine, Klostridien Perfringens Enterotoxin (CPET), Mykoplasma Arthritis Superantigene etc. Für einen Überblick der Superantigene und deren Eigenschaften siehe Kotzin et al., 1993.
Während der frühren Neunziger wurde entdeckt, dass die Aktivierung und anschließende Zelllyse in einer MHC Klasse II unabhängigen Weise in dem Fall vorkommen konnte, dass das Superantigen mit einem Ziel- suchenden Bereich konjugiert war, der in der Lage war, an eine Zelloberflächenstruktur zu binden (Dohlsten et al., WO 92 01470 und Abrahmsén et al., WO 96 01650). Nach Inkubation von Zielzellen (die die Zielstruktur für den Ziel- suchenden Bereich tragen) und Effektorzellen (T-Zellen) mit den Konjugaten werden die Zielzellen lysiert (Superantigen-Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytolyse = SADCC) ohne jegliche Notwendigkeit für eine Klasse II Epression. Gemäß dem Superantigenkonzept von heute und wie es im Kontext der vorliegenden Efindung verwendet wird, wenn es nicht anderweitig ausgedrückt wird, umfasst es jegliche Verbindung (vorzugsweise von Polypeptidstruktur), die in der Lage ist, an eine Zelloberflächenstruktur (Zielstruktur) zu binden und an eine oder mehrere polymorphe TCR-Ketten, insbesondere die Vβ-Kette, wodurch eine Untergruppe von T-Zellen aktiviert wird, die die spezifische TCR-Kette exprimiert, die in die Bindung involviert ist. Die T-Zellen werden dann für Zellen zytotoxisch, die die Oberflächenstruktur (Zielstruktur, Zielzellen) trägt. Normalerweise besteht die aktivierte Untergruppe der T-Zellen aus 1 – 20 % der Gesamtmenge an T-Zellen eines Individuums.
Technischer Hintergrund – Strukturelle und funktionelle Studien unter Verwendung mutierter und chimärer Superantigene
Chimäre Superantigene, einschließlich der Formen mit Punktmutationen wurden kürzlich beschrieben (Kappler et al., WO 93 14364, Kappler et al., 1992; Grossman et al., 1991; Hufnagle et al., 1991; Hartwig et al., 1993; Fraser et al., 1993; Mollick et al., 1993; Irwin et al., 1992; Hudson et al., 1993 und Blanco et al., 1990). Mollick et al. und Hudson et al. zeigen in Studien mit Chimären, dass die Vβ-Spezifität von SEA und SEE in bestimmten Aminosäuresequenzen vorliegt, die in der carboxyterminalen Region vorhanden sind (d. h. Aminosäurereste 200, 206 und 207). Zusätzlich zu der Vβ-Spezifität, die hauptsächlich von dieser Region abhängt, waren Mollik et al. auch in der Lage, zu zeigen, dass für eine vollständige Rekonstitution von SEE- ähnlicher Aktivität für SEA, das SEE-Pfropungen gegen Vβ8 enthält, ein Fragment, das die N-terminalen 70 Aminosäuresäuren aus SEE enthält, benötigt wurde. Dieses Fragment enthält Teile der SEE-ähnlichen MHC Klasse II α-Kette-bindenden Stelle und chimären SEA/SEE-Molekülen, die diesen Teil aus SEE enthalten, und hemmten die Bindung von SEA an MHC Klasse II DR1 in einer SEE-ähnlichen Weise.
Kürzlich wurden SEE-SEA-Chimäre, die einen Austausch der Regionen involvieren, die in die Bindung an TCRVβ involviert sind, beschrieben (Lamphaer et al., J. Immunol. 156 (15. März 1995) 2178 – 2185). Ein SEE-Superantigen Fab-Antikörperfusionsprotein, bei dem die SEE-Domänen, die in die Wechselwirkung mit T-Zellen involviert sind, mit den korrespondierenden nicht-homologen SEA-Domänen ersetzt wurden, wurde bei der ABRF'96: Biomolecular Techniques, Holiday Inn Golden Gateway, San Francisco, Californien, 30. März – 2. April 1996 (Björk et al., M45) diskutiert.
Technisches Gebiet – Therapeutische Verwendung von Superantigenen
Nicht-konjugierte Superantigene wurden zur Therapie mit heilender Wirkung vorgeschlagen, die angeblich durch eine allgemeine Aktivierung des Immunsystems erzielt wird (Kalland et al., WO 91 04053; Terman et al., WO 91 10680 und WO 93 24136; Newall et al., 1991).
Es wurde auch vorgeschlagen, modifizierte Superantigene zu verwenden, die an Zielsuchende Bereiche konjugiert sind (Dohlsten et al., WO 92 01470; Abrahmsén et al., WO 96 01650). Dies ermöglichte eine breitere therapeutische Verwendung der T-Zellaktivierung durch Vβ. Die bis jetzt untersuchten Konjugate hatten eine reduzierte Klasse II Affinität, was wiederum zu einer Verringerung in der schweren systemischen Toxizität geführt hat, die normalerweise mit Wildtyp-Superantigenen assoziiert ist.
Terman et al. (WO 91 10680; WO 93 24136) schlugen in Nebensätzen eine Krebstherapie mit modifizierten Superantigenen und Superantigenfragmenten vor.
Kappler et al. (WO 93 14634) schlugen die Verwendung von nicht-konjugierten Superantigenen (SEB) vor, die mutiert wurden, um ihre Vβ-Eindungs- oder MHC Klasse II-Bindungsfähigkeit zu verlieren (in dem Kontext von Vakzinen und zur Neutralisierung toxischer Wirkungen von Superantigenen). Abrahmsén et al. (WO 96 01650) schlugen eine Krebstherapie mit konjugierten Superantigenen mit einer modifizierten, vorzugsweise verringerten, Fähigkeit zur Bindung von Klasse II Antigenen vor. Die Modifikationen umfassten Einzelmutationen sowie die Herstellung von Chimären zwischen verschiedenen Superantigenen.
Die Probleme, die mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden
Die Seren von menschlichen Populationen enthalten normalerweise hohe Titer an Antikörpern gegen Superantigene. Für die Staphylokokkus Superantigene sind beispielsweise die relativen Titer TSST-1 > SEB > SEC1 > SE3 > SEC2 > SEA > SED > SEE. Diese relativen Titer zeigen Immunogenitätsprobleme auf und Probleme mit neutralisierenden Antikörpern in dem Fall, dass SEs parenteral verabreicht werden. Ausschließlich basierend auf diesen Problemen sollte SEE das bevorzugte Staphylokokkus Superantigen sein. In dem Kontext von Arbeiten mit Fusionsproteinen haben wir jedoch herausgefunden, dass die Fähigkeit zur T-Zell MHC Klasse II unabhängigen Zytotoxität, Su perantigen-Antikörper-abhängigen Zellzytotoxizität (SADCC) von SEE-Konjugaten schlecht ist. Die Anti-SE-Titer zeigen auch an, dass es Vorteile bei der Modifizierung eines "Hochtiter"-Superantigens zu einem eher "Niedrigtiter"-Superantigen geben könnte.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung
Eine erste Aufgabe ist es, die zuvor bekannten Superantigene bezüglich einer Verringerung ihrer Immunogenität und der Reaktion mit neutralisierenden Antikörpern zu verbessern.
Eine zweite Aufgabe ist es, Superantigene mit weniger Nebenwirkungen zur Verfügung zu stellen, wenn sie als ein Medikament verwendet werden.
Eine dritte Aufgabe ist es, verbesserte Superantigenen zur Verfügung zu stellen, die als das aktive Prinzip in der Behandlung von Säugetieren verwendet werden können, die an Krebsarten, Autoimmunerkrankungen, parasitischen Manifestationen, viralen Infektionen oder anderen Krankheiten leiden, die mit Zellen assoziiert sind, die auf deren Oberfläche MHC Klasse II-Antigene exprimieren und/oder Strukturen, die spezifisch für die jeweilige Erkrankung sind und an einen Ziel- suchenden Bereich binden, der in das Superantigen eingebaut ist.
Die Entdeckung, die in der vorliegenden Erfindung resultierte
Die Sequenzhomologieanalyse von SEA und SEE (2) offenbart, dass die nichtidentischen Aminosäurereste auf acht unterschiedliche Regionen konzentriert sind. Außerhalb dieser Regionen, die 34 % der Sequenz ausmachen, beträgt die Identität der zwei SEs 97 %, wobei konservative Aminosäuresubstitutionen für die verbleibenden Unterschiede verantwortlich sind. Vier von diesen Regionen sind zu den zwei MHC Klasse II-Bindungsstellen (B: AA 37 – 50, D: 71 – 78, E: 136 – 149 und G 189 – 195) strukturell ähnlich und es ist nicht wahrscheinlich, dass sie mit dem TCR wechselwirken. Die zusätzlichen vier Regionen (A: AA 20 – 27, C: 60 – 62, F: 161 – 176 und H: 200 – 207) sind an dem Ende des Moleküls lokalisiert, in der Nähe der wahrscheinlichen TCR-Bindungsstelle, von der postuliert wird, dass sie in der Furche zwischen den zwei Unterdomänen residiert. Durch Aufpfropfen der einzelnen Regionen (Ersatz von Amino säureresten, die sich unterscheiden) haben wir nun herausgefunden, dass die Eigenschaft der SEA-Konjugate zur Induktion einer zytotoxischen Reaktion sowie zur Potenzierung einer proliferativen Reaktion in der Abwesenheit von MHC Klasse II in einer Region in der TCR-Bindungsdomäne von SEA residiert. Diese Region (A) ist auf SEE übertragbar und hat einen großen Einfluss auf die Aktivität in der Abwesenheit von Klasse II, trotz eingeschränkter Wirkungen auf die Vβ-Spezifität des Superantigens (6, Tab. 2). Alle diese Regionen (A, C, F und H) scheinen direkt oder indirekt an der Wechselwirkung mit dem TCR zu partizipieren, die sich in einer veränderten stimulatorischen Wirkung auf murine T-Zell-Hybridomzellen manifestiert (Tab. 2).
Bedingt durch den analogen Modus der Wirkung ist es nun möglich, dass eine ähnliche strukturelle Trennung dieser TCRVβ-Bindungseigenschaften auch für zu SEA- und SEE-analoge Superantigene greifbar ist. Das gleiche kann sich auch auf andere Arten von Superantigenen übertragen lassen, bei denen die Bindungsstrukturen unterschiedlich organisiert sind. Unsere Entdeckung ermöglichte es uns, die Herstellung von chimären Superantigenen aufzuzeigen, die potentiell von extrem großem Wert als therapeutische Mittel sind.
Die Erfindung
Der erste Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung in einem Säugetier durch Aktivierung seines Immunsystems durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen (immunaktivierenden) Menge eines modifizierten, vorzugsweise chimären, Superantigens. Das Säugetier ist vorzugsweise ein Mensch. Die in Frage kommenden Erkrankungen sind hauptsächlich mit Zellen assoziiert, die auf deren Oberfläche eine Zielstruktur exprimieren, die an das Superantigen bindet. Die Zielstruktur unterscheidet sich in den meisten Fällen von dem TCR-Epitop, das normalerweise an Superantigene bindet. Die Bindung an die Zielstruktur ermöglichst auch die Bindung an TCR und T-Zell-Aktivierung. Illustrative Beispiele sind MHC Klasse II-Antigene und andere Zelloberflächenstrukturen, die auf Zellen exprimiert werden können, die mit dem Verlauf von Erkrankungen assoziiert sind. Illustrative Erkrankungen sind bösartige Tumore, einschließlich jeder Art von Krebs (wie Karzinome, Sarkome, Melanome, Lymphome etc.), virale Infektionen, parasitische Manifestationen und Autoimmunerkrankungen. Der zu behandelnde Krebs kann in dem Dickdarm, der Brust, Zervix, Niere, Magen, Dünndarm, Zwölffingerdarm, Prostata, Hoden, Haut, Lunge, Leber, Bauspeicheldrüse, Skelett etc. einschließlich auch in Metastasen in verschiedenen Positionen lokalisiert sein. Das erfindungsgemäße aktive Mittel ist auch auf sog. Mulimedikamenten-resistente Formen von Krebsarten anwendbar. Die Zellen, die die Zielstruktur exprimieren, können auch Zellen sein, die in irgendeiner Weise die Entwicklung der zu behandelnden Krankheit steuern oder regulieren.
Die charakteristische Eigenschaft des Verfahrens ist, dass man ein modifiziertes Superantigen einsetzt, bei dem ein oder mehrere Aminosäurereste in einer Region (Region I), die eine Bindung an eine Untergruppe von T-Zellen über eine polymorphe TCR-Kette zur Verfügung stellt, insbesondere TCRVß, in einem Wildtyp-Superantigen (SA I) mit einem jeweiligen Aminosäurerest ersetzt, das Superantigenaktivität in dem so modifizierten Superantigen beibehält. Die vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen beziehen sich auf ein chimäres Superantigen, bei dem eine oder mehrere Aminosäurereste in einer Region (Region I) eines ersten Wildtyp-Antigens (SA I) mit den korrespondierenden ein oder mehreren Aminosäureresten in einer korrespondierenden Region (Region II) eines zweiten Wildtyp-Superantigens (SA II) ersetzt wurden. Die Regionen I und II unterscheiden sich in Bezug auf die Aminosäuresequenzen. Die Superantigene I und II wurden der Art ausgewählt, dass die Regionen I und II einander ersetzen können, ohne die Superantigenfunktion abzutöten. In diesem Zusammenhang muss man die Tatsache berücksichtigen, dass eine bestimmte Region I allein gegebenenfalls nicht mit der korrespondierenden Region eines anderen Wildtyp-Superantigens austauschbar ist, obwohl, wenn sie zusammen mit anderen Regionen ausgetauscht werden, die die TCR-Bindung und T-Zell-Aktivierung bestimmen, das Ergebnis ein funktionelles aktives Superantigen sein wird. Die betroffenen Regionen umfassen normalerweise weniger als 20 Reste, insbesondere für Superantigene, die zu SEA analog sind. Der ersetzende Aminosäurerest unterscheidet sich somit von dem ersetzten Rest und umfasst möglicherweise auch konservative Substitutionen und andere Aminosäuresubstitutionen, die zu funktionell aktiven, modifizierten Superantigenen führen, die TCRVβ-Bindung und Aktivierung einer Untergruppe von T-Zellen ermöglichen. Das bedeutet, dass die erfindungsgemäß modifizierten Antigene in ihrem breitesten Sinne jegliches modfizierte Superantigen umfassen, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren in den zuvor genannten Regionen funktionell ersetzt wurden.
Der Begriff "konservative Substitution" bezieht sich auf das Ersetzen eines Aminosäurerestes durch einen chemisch ähnlichen Rest, z. B. ein hydrophober Rest für einen anderen hydrophoben Rest, ein geladener Rest für einen unterschiedlichen, aber ähnlich geladenen Rest, etc.
Als Superantigene I und II etc. waren die Staphylokokkus Enterotoxine, insbesondere solche, die Zink koordinieren, am Prioritätstag bevorzugt, d. h. SEA, SEE, SED und möglicherweise auch SEH.
Die involvierten Regionen haben beide der zuvor genannten Funktionen (siehe die Überschrift "Die Entdeckung, die in der Erfindung resultierte" und den experimentellen Teil):

1. Einen großen Einfluss auf die Superantigenaktivität als solche und eine eingeschränkte Wirkung auf die TCR-Speifität, insbesondere auf die Vβ-Spezifität. Für SEA-artige Superantigene bedeutet dieses Region A (Aminosäurepositionen 20 – 27).
2. Eine deutliche Wirkung auf die Spezifität in Bezug auf die Bindung an polymorphe TCR-Ketten wie die Vβ-Kette. Für den SEA-artige Superantigenen bedeutet dieses die Regionen C (Aminosäureposition 60 – 62), F (Aminosäureposition 110 – 126) und H (Aminosäureposition 200 – 207).

Für SEA-artige Superantigene bedeutet dieses eine oder mehrere der Substitutionen (auf das Pfropfen von SEA auf SEE angewendet; SEE/A-Chimeren):
Region A: R20G, N21T, S24G, R27K
Region C: G60D, P62S
Region F: H111R, H114Q, G115Y, F117Y, G118N, S124V, G126D
Region H: D200G, P206S, D207N
An dem Prioritätstag war es bevorzugt, alle Substitutionen für jede Region durchzuführen. Für andere Superantigene könnten analoge Substitutionen zwischen korespondierenden Positionen/Regionen möglicherweise auch durchgeführt werden.
Typischerweise könnte man mit einem ersten Superantigen, wie SEE und SED, beginnen und dann eine oder mehrere seiner einzigartigen Vβ-Bindungsregionen mit der korrespondierenden Regionen) eines zweiten Superantigens (z. B. SEA) ersetzen, wobei die ersten und zweiten Superantigene vorzugsweise der Art ausgewählt sind, dass der Antikörpertiter in normalen menschlichen Seren für das erste Superantigen geringer als für das zweite Superantigen ist. Für SEA- und SEE-Chimäre korrespondieren die besten Verfahren mit den Chimären SEE/A-A, SEE/A-AH und SEA/E-BDEG, mit absoluter Präferenz von SEE/A-A. Siehe den experimentellen Teil und die Figuren.
Zusammen mit den Regionen A, C, F und H können auch Aminosäurereste von anderen Teilen ausgetauscht werden. Eine Art von Austausch ist es, die Klasse II-Bindungsfähigkeit zu verringern, da diese Eigenschaft mit üblichen Nebenwirkungen assoziiert wird, die in der Superantigentherapie (allgemeine Immunaktivierung mit gleichzeitiger systemischer Freisetzung von Tumor Nekrose Faktor (TNF) und Interferon-γ) beobachtet wird. Für Superantigene wie SEA, SED und SEE können Positionen, die für die Fähigkeit zur Koordinierung von Zinkionen wichtig sind, vorzugsweise geändert werden, d. h. Positionen 225 und 227, z. B. in der SEA-Mutation H225A und insbesondere D227A werden eine positive Auswirkung auf die Verringerung toxischer Nebenwirkungen aufweisen (siehe Abrahmsén et al., WO 96 01650 und Fraser et al., 1993).
Andere Substitutionen können im ganzen Molekül durchgeführt werden, solange sie nicht die Superantigenfunktion zerstören, z. B. konservative Substitutionen, insbesondere außerhalb von Regionen, die in die Bindung von Klasse II und TCR involviert sind. Eine Änderung in der DNA-Sequenz zur Änderung der MHC Klasse II Bindung oder eine jegliche andere Änderung auf der DNA-Ebene kann entweder vor oder nach der Änderung in Regionen ausgeführt werden, die die Bindung an TCR zur Verfügung stellen. Diese anderen Arten von Modifikationen können gleichwohl vor dem Aminosäureersatz in Region I eingeführt worden sein. In dem Kontext der vorliegenden Erfindung bezeichnet das Konzept der Verwendung eines "Wildtyp-Superantigens" zu Beginn der Modifikation gemäß den Ansprüchen somit hauptsächlich die Wildtyp-Aminosäuresequenz in Region I außerhalb der vorherige Modfikationen durchgeführt worden sein können.
Die Herstellung von Chimären und mutierten Superantigenen kann gemäß Techniken, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, durchgeführt werden. Der Austausch aus einer Region, die für ein Superantigen spezifisch ist, mit der korrespondierenden Region in einem anderen Superantigen wird auf der genomischen Ebene durchgeführt und kann durch das Ersetzen einer vollständigen Sequenz oder durch Punktmutationen von solchen spezifischen Basen durchgeführt werden, die benötigt werden, um mit der gewünschten Aminosäuresequenz zu enden. Siehe z. B. den experimentellen Teil und auch die oben zitierten Literaturstellen aus dem Stand der Technik. Der Begriff "Mutation" umfasst das Ersetzen, Einfügen oder Entfernen von einer oder mehreren Aminosäureresten durch Veränderung der DNA-Sequenz, die für das zu mutierende Protein kodiert.
Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Superantigen kann ein nicht-konjugiertes Superantigen sein, das wie oben beschrieben wird modifiziert ist, d. h., ein modifiziertes Superantigen, das eine spezifischen angefügten Ziel- suchenden Bereich vermissen lässt, aber mit einer deutlichen Fähigkeit zur Bindung an beides, MHC Klasse II Antigene und eine Untergruppe von T-Zellen über TCR. Mehr bevorzugt ist das modifizierte Superantigen vorzugsweise ein chimäres Superantigen, an einen Ziel- suchenden Bereich konjugiert. In dem letzteren Fall sind die bevorzugten Varianten Fusionen zwischen dem Ziel- suchenden Bereich und dem modfizierten Superantigen. Die Konjugate als solche sind neu und sind ein separater Aspekt der Erfindung.
Die Strukturen der erfindungsgemäßen Konjugate sind analog zu früher bekannten Antikörper-Superantigen-Konjugaten (Dohlsten et al., WO 92 01470; Abrahmsén et al., WO 96 01650), d. h. die Konjugate stimmen oft mit der Formel: T-B-SA(m) überein, worin T den Ziel- suchenden Bereich darstellt, SA(m) das modfizierte, vorzugsweise chimäre Superantigen, wie es oben definiert wird, und B ist eine kovalente Brücke, die T und SA(m) miteinander verbindet. T kann im Prinzip weitere Superantigenbereiche (SA(m)) enthalten und SA(m) weitere Ziel- suchenden Bereiche, obwohl es in den bevorzugten Konjugaten nur einen Ziel- suchenden Bereich und einen modfizierten Superantigenbereich, wie er oben definiert wird, gibt.
T kann im Prinzip jegliche Struktur sein, die in der Lage ist, an eine Zelloberflächenstruktur zu binden, vorzugsweise eine krankheitsspezifische Struktur. Die Struktur, gegen die T gerichtet ist, unterscheidet sich üblicherweise von (a) dem Vβ-Kettenepitop, an das SA(m) bindet, und (b) den MHC Klasse II Epitopen, an die Superantigene binden. Der zielsuchende Bereich wird hauptsächlich aus Interleukinen (z. B. Interleukin-2), Hormonen, Antikörpern, einschließlich Antigen-bindenden Fragmenten von Antikörpern, Wachstumsfaktoren etc. ausgewählt. Siehe z. B. Woodworth, Preclinical und Clinical development of Cytokine toxins presented at the conference "Molecular approaches to cancer Immunotherapy", Ashville, North Carolina, 7 – 11. November 1993.
An dem Prioritätstag war es bevorzugt, dass T ein Antikörper (Antikörper in Gesamtlänge, Fab, F(ab)₂, Fv, einzelkettiger Antikörper oder jegliches andere Antigen-bindende Antikörperfragment) war, mit besonderer Betonung auf Antikörper-aktive Fragmente (wie Fab), die gegen das sog. C242-Epitop (Lindholm et al., WO 93 01303) oder mehr bevorzugt gegen das bindende Epitop für den Lungenkrebs- spezifischen 5T4-Antikörper (Stern et al., WO 89 07947) gerichtet ist. Dieses schließt jedoch nicht aus, dass andere Krebs-spezifischen Antikörper genau so gut oder sogar besser funktionieren können. Der Begriff "Antikörper" umfasst monoklonale sowie polyklonale Varianten mit Präferenz für die monoklonalen Zubereitungen.
T kann auch auf einzigartige Strukturen auf mehr oder weniger gesunden Zelten gerichtet sein, die die Entwicklung einer Erkrankung steuern oder regulieren.
Die Brücke B kann wie zuvor beschrieben (Dohlsten et al., WO 92 01470; und Abrahmsen et al., WO 96 01650) ausgewählt werden, d. h. B sollte vorzugsweise hydrophil sein und eine oder mehrere Strukturen) aufzeigen, die aus Amid, Thioether, Disulfid etc. ausgewählt sind. Die prominentesten Brücken sind solche, die durch rekombinante Techniken erhalten werden, d. h., die Konjugation findet auf der genomischen Ebene statt. In solchen Fällen sind Oligopeptidbrücken, die hydrophile Aminosäurereste wie Gln, Ser, Gly, Glu, Pro, His und Arg enthalten, bevorzugt. Besonders bevorzugte Bs sind Peptidbrücken, die aus 1 – 10 Aminosäureresten bestehen, mit absoluten Präferenzen für 3 – 7 Aminosäurereste. Eine typische Brücke ist Tripeptid GlyGlyPro, SEQ ID Nr. 1.
Die Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Konjugate kann prinzipiell gemäß zwei Hauptrouten durchgeführt werden: 1. Rekombinante Techniken und 2. Chemische Bindung eines Ziel- suchenden Bereichs T an ein modifiziertes, vorzugsweise chimäres Superantigen (SA(m)), wie es oben definiert wird. Diese Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt und umfassen eine große Anzahl von Varianten.
Die chemische Verbindung eines modfizierten nicht-konjugierten Superantigens an einen Ziel- suchenden Bereich T verwendet oft funktionelle Gruppen (z. B. primäre Aminogruppen oder Carbonylgruppen), die in vielen Positionen in den Verbindungen vorhanden sind. Daraus folgt, dass das Endprodukt eine Mischung an Konjugatmolekülen enthalten wird, die sich in Verbindungspositionen unterscheiden, sowie Hetero- und Homokonjugate.
Für rekombinante Konjugate (Fusionsproteine) wird die hergestellte konjugierte Substanz einheitlich in Bezug auf die Bindungsposition sein. Es wird entweder der Aminoterminus des chimären Superantigens an den Carbonylterminus des Ziel- suchenden Bereiches gebunden oder vice versa. Für Antikörper wie intakte Antikörper und Antigenbindende Fragmente (Fab, Fv, einzelkettige Antikörper etc.) kann entweder die leichte oder die schwere Kette zur Fusion verwendet werden. Zur gegenwärtigen Zeit sind rekombinante Konjugate bevorzugt, mit äußerster Präferenz für Fab-Fragmente und das Verbinden des Aminoterminus des chimären Superantigens an die erste konstante Domäne der schweren Antikörperkette (CH1) ohne Ausschluss der analogen Bindung an die leichte Kette oder an die VH- und VL-Domäne, die auch recht gute Ergebnisse ergeben können.
Die hauptsächliche Wirtszelle für die rekombinante Herstellung der erfindungsgemäßen modfizierten Superantigene (fusionierte Formen sowie nicht-konjugierte Formen) in großem Maßstab ist E. coli. Dieser Wirt stellt im Prinzip zwei Routen zur Verfügung: die intrazelluläre Produktion und Sezernierung. Die letztere Variante ist bevorzugt, da sie die Aufreinigung von korrekt gefalteten Proteinen aus dem Periplasma und aus dem Kulturmedium bietet. Das oben Gesagte schließt nicht aus, dass es möglich ist, aktive Konjugate auch in anderen Wirtszellen, z. B. eukaryotischen Zellen wie Hefe- oder Säugetierzellen herzustellen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, Dosierung und Wege der Verabreichung
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen, modifizierten, vorzugsweise chimären Superantigene, wie sie oben definiert werden (sowohl konjugiert wie auch nicht-konjugierte Formen), enthalten. Die vorgeschlagenen Zusammensetzungen sind auf dem Gebiet bekannt, außer dass sie nun das vorliegende, erfindungsgemäße Superantigen enthalten. Somit können die Zusammensetzungen in der Form eines lyophilsierten, partikulären Materials, einer sterilen oder aseptisch hergestellten Lösung, einer Tablette, einer Ampulle etc. vorliegen. Trägermittel wie Wasser (vorzugsweise auf einen physiologisch verträglichen pH-Wert durch z. B. PBS gepuffert) oder anderes inertes festes oder flüssiges Material kann vorhanden sein. In allgemeinen Begriffen ausgedrückt werden die Zusammensetzungen dadurch hergestellt, dass das Konjugat mit einem oder mehreren wasserlöslichen oder wasserunlöslichen, wässrigen oder nicht-wässrigen Trägermitteln, falls notwendig zusammen mit geeigneten Hilfsmitteln und Adjuvanzien, vermischt, aufgelöst, gebunden oder anderweitig kombiniert wird. Es ist von besonderer Bedeutung, dass die Trägermittel und Bedingungen, die Aktivität des modifizierten Superantigens nicht nachteilig beeinträchtigen sollen.
Normalerweise wird das erfindungsgemäße Superantigen in vorgefertigten Dosierungen verkauft und verabreicht, wobei jede eine wirksame Menge des Konjugats enthält, von der angenommen wird, dass sie basierend auf dem nun vorgestellten Ergebnis, innerhalb des Bereichs von 10 ng – 50 mg sowie innerhalb von 10 ng – 1 mg oder innerhalb von 10 μg – 50 mg liegt. Die genaue Dosierung wird von Fall zu Fall abhängig von dem Gewicht und dem Alter des Patienten, dem Weg der Verabreichung, der Art der Erkrankung, dem Ziel- suchenden Bereich, dem Superantigen, der Bindung (-B-) etc. variieren.
Die Wege der Verabreichung werden solche sein, die üblicherweise auf dem Gebiet vorgeschlagen werden, d. h. eine Zielzellen-tötende wirksame Menge oder therapeutisch aktive Menge eines Superantigens, das gemäß der Erfindung modifiziert wurde, wird mit den Zielzellen in Kontakt gebracht. Für die oben spezifizierten Indikationen bedeutet dieses hauptsächlich eine parenterale Verabreichung wie eine Injektion oder Infusion (subkutan, intravenös, intraarteriell, intramuskulär, intraperitoneal) an ein Säuge tier wie an einen Menschen. Die modfizierten vorzugsweise chimären Superantigene, die vorgeschlagen wurden, können lokal oder systemisch verabreicht werden.
Unter dem Begriff "Ziel-tötende wirksame Menge" wird verstanden, dass die Menge zur Aktivierung und Zielgebung von T-Zellen zur Zerstörung von Zielzellen wirksam ist.
Der bevorzugte Weg der Verabreichung zum Prioritätstag ist der gleiche wie er für die Superantigenkonjugate gemäß Dohlsten et al., WO 92 01470 und Abrahmsén et al., WO 96 01650 vorgeschlagen wurde. Dies bedeutet eine 1–5-ständige intravenöse Infusion (vorzugsweise 4 Stunden) pro Tag in Verbindung mit einem Fieber-reduzierenden Mittel (Paracetamol). Die Verabreichung soll über einige Tage unter vorsichtiger Berücksichtigung des Risikos der Verstärkung von Antikörpern, die gegen das Konjugat gerichtet sind, wiederholt werden, z. B. 4 Tage.
Die erfindungsgemäßen Superantigene können entweder als Haupttherapie oder in bevorzugten Modi als Adjuvanztherapie in Verbindung mit Chirurgie oder anderen Medikamenten verabreicht werden.
In dem Kontext einer Therapie haben wir herausgefunden, dass Antikörperzubereitungen, die in Bezug auf nicht-kovalent assoziierte schwere und leichte Antikörperketten rein sind, Vorteile gegenüber Zubereitungen zur Verfügung stellen, die Antikörper enthalten, bei denen die Ketten über Cysteinbindungen miteinander verbunden sind. Dementsprechend ist ein vierter Aspekt der Erfindung die therapeutische Verwendung einer Antikörperzubereitung, insbesondere einer Fab-Zubereitung, in der die Cysteinreste, die die Ketten zusammenhalten, durch eine Aminosäure ersetzt wurden, die eine Disulfidbildung nicht erlaubt, z.B. Serin. Die am meisten bevorzugten Antikörperspezifitäten für diesen Aspekt der Erfindung waren zum Prioritätstag der C242 mab (Lindholm et al., WO 93 01302) und der 5T4 mab, wie sie in den oben zitierten Literaturstellen definiert werden. In den bevorzugten Varianten wird eine der Antikörperketten an ein Superantigen fusioniert, das in der Lage ist, eine Untergruppe von T-Zellen in einer Vβ-spezifischen Weise, wie sie oben beschrieben wird, zu aktivieren. Das Superantigen kann eine Wildtyp-, eine chimäre oder eine punktmutierte Version (und Kombinationen davon), wie sie oben oder durch Dohlsten et al., WO 92 01470 oder durch Abrahamsén et al., WO 96 01650 beschrieben werden, sein. Dieser Aspekt der Efindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen, wie sie oben beschrieben werden, die aber eine Antikörperzubereitung, wie sie für diesen Aspekt der Erfindung definiert wird, anstatt eines chimären Superantigens, enthalten.
An dem Prioritätstag war es bevorzugt, das Fab-Fragment des 5T4-Antikörpers (Stern et al., WO 89 07947) in Kombination mit dem SEE/A-A-Chimären mit der Mutation D227A zu verwenden. Das bevorzugte Fab-Fragment wurde in beiden Ketten in der Position mutiert, die die Disulfidbindung zwischen den Ketten (Cys bis Ser) zur Verfügung stellt. Um die Ausbeute des Antikörper/Fusions-Proteins zu erhöhen, wenn es in E. coli hergestellt wird, wurden auch Mutationen in der Vkappa-Kette an bestimmten Positionen durchgeführt. Siehe den experimentellen Teil.
MATERIALIEN UND METHODEN
Herstellung von SEA/SEE-chimären Genen
Die Herstellung von SEA/SEE-Chimären wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR)- basierenden Methode, Sequenz-überlappenden Verlängerung (Horton et al.) durchgeführt. Die PCR-Reaktionen wurden mit UITma (Perkin-Elmer) gemäß den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt. Durch PCR-hergestellte Fragmente wurden in PCR-Skript (Stratagene, USA) kloniert und sequenziert, um die korrekte Sequenz zu verifizieren. Die chimären Superantigene wurden dann in den Expressionsvektor pKP889 (Abrahmsén et al., 1995) subkloniert, wobei die SE-Konstrukte an den schweren Kettenanteil des Fab-Fragments des murinen monoklonalen Antikörpers C215 fusioniert wurde. Die rekombinanten SEA- und SEE- Fusionsproteine wurden als Polypeptide in Gesamtlänge mit der Konsensussequenz für die Signalpeptidspaltung (von Heijne, 1986) hergestellt.
Proteinexpression und Aufreinigung
Der Escherichia coli K12-Stamm UL635 wurde zur Expression der Fab-SE-Fusionsproteine und der SEA-Mutanten, wie sie zuvor beschrieben wurde (Abrahmsén et al., 1995), verwendet. Fab-SE-Fusionsproteine wurden durch Zentrifugation bei 5000 g geerntet und die Fraktionen des Überstandes wurden einer Aufreinigung auf Protein G Sepharose (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden), wie sie zuvor beschrieben wurde (Abrahmsén et al., 1995), ausgesetzt. Die Reinheit der Affinitäts-aufgereinigten Fab-SE-Varianten betrug > 90 % Reinheit, wenn sie durch SDS-PAGE analysiert wurden.
Zellen
Die menschliche B-Zelllymphomzelllinie Raji und menschliche Dickdammkarzinomzelllinie Colo 205 wurden in vollständigem R-Medium (RPMI-1640, supplementiert mit 10 % fötalem Kälberserum (Gibco BRL, Life Technologies, Ltd., Paisley, Schottland), 1 mM Glutamin; HyClone Europe, Ltd., Cramlington, 5 × 10^–5 M β-Mercaptoethanol; ICN Biomedicals Inc., Costa Mesa CA, 0,1 M NaHCO₃; Seromed Biochrome, 1 × 10^–2 M Hepes-Puffer; HyClone Europe, Ltd., Cramlington, 0,1 mg/ml Gentamycin; Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel, 1 × 10^–3 M Natriumpyruvat; HyClone Europe, Ltd., Cramlington) kultiviert. CHO-Zellen, die mit menschlichen C215- und CD80-Molekülen transfiziert worden waren, wurden in vollständigem R-Medium kultiviert, das mit 0,5 mg/ml Geniticin (G418) Gibco BRL, Life Technologies, Ltd., Paisly, Schottland) supplementiert worden war. Periphere Blutmononukleare Zellen (PBM) wurden aus heparinisiertem Blut von normalen Spendern hergestellt. Die Zellen wurden durch Dichtezentrifugation über Ficoll-Paque wie zuvor beschrieben isoliert (Dohlsten et al., 1991). Menschliche T-Lymphozyten wurden zur Homogenität durch positive Selektion unter Verwendung von MiniMACS-Säulen in Verbindung mit magnetischen Kügelchen, die mit monoklonalen Antikörpern beschichtet worden waren, die spezifisch für menschliches CD4 und CD8 (Miltenyi Biotec GmbH, Germany) sind, gemäß den Spezifikationen der Hersteller aufgereinigt. Menschliche SEA- und SEE-reaktive Zelllinien wurden wie zuvor beschrieben generiert (Dohlsten et al., 1994). Eine menschliche TCR Vβ22-exprimierende Zelllinie wurde aus einer primär stimulierten SEA-reaktiven Zelllinie unter Verwendung positiver Selektion mit magnetischen Dynabeads (Dynal A.S., Norwegen) die mit TCR Vβ22-spezifischen monoklonalen Antikörpern (Immunotech, Frankreich) beschichtet waren, generiert. Angereicherte Zellen enthielten > 95 % TCR Vβ22⁺ T-Zellen, wie durch Flusszytometrie (Daten werden nicht gezeigt) bestimmt wurde. Murine T-Zellhybridomzellen (I1B3, 2B4 und 11.40) wurden wie beschrieben generiert (Fleury et al., 1991).
Zytotoxizitätsassay
Zytotoxizität wurde in einem Standard ⁵¹Cr-Freisetzungsassay nach 4 oder 6 Stunden wie zuvor beschrieben gemessen (Dohlsten et al., 1991). Es wurden menschliche Colo205- oder Raji-Zellen als Zielzellen verwendet. Die Effektorzellen, entweder SEA- oder SEE-reaktive menschliche T-Zelllinien oder TCR Vβ22-Zelllinien wurden bei einem Effektor-zu-Zielverhältnis von 30 : 1 hinzugefügt. Es wurden ⁵¹Cr-markierte Zielzellen in den Zytotoxizitätsassays bei 2500 Zellen/200 ml vollständigem Medium in V-Boden-Mikrotiterwells verwendet. C215Fab-SEA/E-Hybride wurden bei verschiedenen Konzentrationen wie angezeigt hinzugefügt und die ⁵¹Cr-Freisetzung wurde in einem g-Zähler gemessen. Der Prozentanteil spezifischer Zytotoxizität wurde als 100 × [(ZpM experimentelle Freisetzung – ZpM Hintergrundfreisetzung)/(ZpM Gesamtfreisetzung – ZpM Hintergrundfreisetzung)] berechnet.
Lymphozytenproliferationsassays
Zur Messung der Proliferation wurden 10⁵ menschliche T-Zell-reaktive Zellen bei 37°C mit 10⁴ bestrahlten (20000 Rad) Stimulatorzellen in 200 ml vollständigem Medium in U-geformten 96-Well-Mikrotiterplatten mit verschiedenen Mengen an C215Fab-SEA/E-Hybriden für 72 Stunden inkubiert. Die Proliferation wurde durch Aufnahme von [³H]-Thymidin wie beschrieben abgeschätzt (Dohlsten et al., 1988).
Analyse der Fab-SAg-induzierten IL-2-Produktion
Murine T-T-Hybridomzellen (10⁵) wurden in 200 ml vollständigem R-Medium mit C215Fab-SEA/E-chimären Poteinen in der Gegenwart von 2 × 10⁴ Raji-Stimulatorzellen inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die Überstände geerntet und auf die Gegenwart von murinem IL-2 analysiert. Kurz gefasst, der Zytokingehalt wurde unter Verwendung eines Ratte-anti-Maus-Zytokin-mAb als Fängerantikörper analysiert. Aufgereiniges Ratte-anti-Maus IL-2, Biotin-markiertes Ratte-anti-Maus IL-2, rIL-2 wurde von PharMingen (San Diego, CA) käuflich erworben. Biotin-markierte Antizytokin mAb, Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories, CA) und Peroxidasesubstratkitt (Bio-Rad Laboratories, CA) wurden zum Nachweis der Zytokine verwendet. Die Absorption wurde in einem Immuno-Reader NJ2000 (InterMed Roskilde, Dänemark) bei 405 oder 450 nm gemessen.
Mutation von 5T4 Fab
Herstellung eine Vektors zur Expression von 5T4Fab-SEA in E. coli.
Die Fv-kodierenden Anteile von 5T4 wurden aus der 5T4-Hybridomzelle kloniert, die von Dr. Peter Stern (Stern et al., WO 89 07947) erhalten wurde. In mehr Detall: cDNA wurde aus der mRNA hergestellt; Regionen der gesamten variablen Domänen und Teile der Signalsequenzen sowie die erste konstante Domäne der schweren Kette und die konstante Domäne der leichten Kette wurden durch PCR amplifiziert. Die Oligonukleotide
wurden für die schwere Kette verwendet, und resultierten in einem 553 Bp-Fragment, während die Oligonukleotide
für die leichte Kette verwendet wurden, was ein 724 Bp-Fragment ergab. Für jede Kette wurden drei getrennte Klone sequenziert und als identisch befunden. DNA-Fragmente, die zur Insertion in den Expressionsvektor (ref) geeignet waren, wurden in einem zweiten PCR-Schritt erhalten. Um ein Fab-Expressionsplasmid zusammenzubauen, wurden die variablen Regionen von 5T4 an Sequenzen fusioniert, die für konstante Regionen aus dem murinen IgG1/k-Antikörper C242 Mab (Lindholm et al., WO 93 01302) kodieren. Eine Region, die für ein Superantigen kodiert, das aus dem Staphylokokkus Enterotoxin A (SEA) abgeleitet wurde, wurde hinter die schwere Kette fusioniert. Die verifizierte Sequenz für das Vkappa-Kettenantikörpergerüst für den 5T4-Antikörper wird in den Ergebnissen aufgeführt.
Mutagenese von 5T4
Sieben Aminosäureersetzungen wurden in die Regionen eingeführt, die für das Antikörpergerüst kodieren. Diese waren Phe10Ser, Thr45Lys, IIe63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser und Leu78Val. In ähnlicher Weise wurden die Cys-Reste in jeder Kette, die in die Disulfidbindung zwischen Domänen involviert sind, durch Serienreste ersetzt, was in den Mutationen Cys458Ser in der schweren Kette und Cys214Serin der leichten Kette resultierte. Die Mutationen wurden unter Verwendung PCR-basierender Mutagenese eingeführt und die erhaltene DNA-Sequenz wurde unter Verwendung einer Sequenzierung bestätigt.
Fermenterexpression und Aufreinigung von 5T4Fab-SEA
Das Expressionsplasmid enthält das Kanamycin-Resistenzgen und einen IacUV5-Promotor, der mit IPTG induziert werden kann. Die Fusionsproteine wurden aus dem geklärten Kulturmedium unter Verwendung von Protein G Sepharose und SP-Sepharose (Pharmacia Biotec, Uppsala, Schweden) aufgereinigt und in Zitratpuffer unter Verwendung von Sephadex G-25 im Wesentlichen wie es beschrieben wurde formuliert. Die Charakterisierung unter Verwendung von SDS-PAGE, Umkehrphasen-HPLC und Massenspektrometrie zeigte, dass das aufgereinigte Fusionsprotein mehr als 95 % rein war und die korrekte molekulare Masse aufwies.
ERGEBNISSE: Superantigenmodifikationen
Die Superantigen-abhängige zelluläre Zytotoxizität (SDCC) von C215Fab-SEA und von C215Fab-SEE gegen MHC Klasse II⁺ Raji-Zellen wurde unter Verwendung von SEA- und SEE-reaktiven menschlichen T-Zellen als Effektorzelllinien analysiert. Trotz des Unterschieds in Vβ-Spezifität zwischen SEA und SEE zeigten beide Superantigene eine Induktion von vergleichbarem Grad an Zytotoxizität mit beiden Effektorzelllinien (1). Zur Diskriminierung zwischen Wirkungen der MHC Klasse II Präsentation und direkten Wirkungen von SEA und SEE bei der TCR-Erkennung wurden sie in der Superantigen-Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (SADCC) gegen C215-exprimierende Colo205-Zellen untersucht. In diesem Assay dirigiert der Fab-Bereich das Fusionsprotein an die C215-exprimierenden Zielzellen und resultiert in der Präsentation von fusionierten SE-Molekülen an zytotoxische T-Zellen (CTL) unabhängig von MHC Klasse II Molekülen (Dohlsten et al., 1994). Trotz > 80 % Aminosäuresequenzidentität zwischen SEA und SEE zeigt die TCR-Wechselwirkung von SEA und SEE qualitative Unterschiede in dieser Art von Assay. Das C215Fab-SEA-Fusionsprotein behält seine Fähigkeit zum Dirigieren von SEA- und SEE- reaktiver CTL gegen die MHC Klasse II^–-Zielzellen (1) während C215Fab-SEE dahingehend versagt, eine Zytotoxizität der MHC Klasse II^–-Zielzellen zu induzieren, weder mit SEA- noch mit SEE-reaktiven CTL (1).
Es wurde kürzlich durch andere Forscher berichtet, dass die Unterschiede in Vβ-Spezifität zwischen SEA und SEE sich hauptsächlich auf einen Unterschied von drei Aminosäuren in der Schleife beziehen, die vor und in der unregelmäßigen a5 Helix vorkommen (Irwin et al., 1992, Hudson et al., 1993, Fraser et al., 1993 und Mollick et al., 1993). Der Unterschied in Bezug auf die TCR-Wechselwirkung, von der in dieser Untersuchung berichtet wird, ist nicht auf die geänderte TCR Vβ-Spezifität zurückzuführen, da die Fähigkeit von C215Fab-SEA zur Induzierung einer MHC Klasse II unabhängigen Zytotoxizität nicht auf SEA-reaktive CTL eingeschränkt ist, sondern auch mit SEE-reaktiven CTL zu sehen ist.
Die Sequenzhomologieanalyse von SEA und SEE (2) offenbart, dass nichtidentische Aminosäurereste in acht unterschiedlichen Regionen konzentriert sind. Außerhalb dieser acht Regionen, die bis zu 34 % der Sequenz ausmachen, beträgt die Identität der zwei SE's 97 %, wobei konservierte Aminosäuresubstitutionen für die verbleibenden Unterschiede aufkommen. Vier der nicht-homologen Regionen sind strukturell nahe mit den zwei MHC Klasse II Bindungsstellen verwandt (B, D, E und G) und es ist nicht wahrscheinlich, dass sie mit dem TCR wechselwirken (3). Die zusätzlichen vier Regionen (A: AA 20 – 27, C: 60 – 62, F: 161 – 176 und H: 200 – 207) sind an dem Rand des Moleküls lokalisiert (3), in der Nähe der TCR-Bindungsstelle, in der Furche zwischen den zwei Unterdomänen lokalisiert (Kappler et al., 1992). Um den qualitativen Unterschied in der TCR-Erkennung zwischen SEA und SEE zu untersuchen, stellten wir Hybridproteine durch das Aufpfropfen der Regionen aus SEA auf SEE als Einzelregionenchimäre (SEE/A-A, -C, -F, H), als Doppelregionenhybride (SEE/A-AH) und durch Aufpfropfen der Regionen, die in der Nähe der MHC Klasse II Bindungsstellen von SEE lokalisiert sind, auf SEA (SEA/E-BDEG) (4) her. Alle der chimären SEs wurden als C215Fab-Fusionsproteine exprimiert, um in der Lage zu sein, Unterschiede in Bezug auf deren Aktivität in der Abwesenheit von MHC Klasse II nachzuweisen.
Die SEA/E-Hybridproteine in Fusion mit dem C215 Fab-Bereich zeigen einen Unterschied in Fab-gerichteten zytotoxischen Assays
Die SDCC-Aktivität von C215 Fab-SEE/A-Hybridproteinen gegen MHC Klasse II⁺ Raji-Zellen wurde unter Verwendung von SEA-reaktiven menschlichen T-Zellen als Effektoren analysiert. Die EC₅₀-Werte von allen C215Fab-SE-Hybriden sowie den C215Fab-SEAwt und -SEEwt fallen in der Bereich der Fehlerwerte (z. B. 10^–12 – 10^–11 M, 5). Der einzige nachweisbare Unterschied ist das leicht verringerte Plateau für das C215Fab-SEE/A-AN-Hybrid, was einen Verlust reaktiver T-Zellen anzeigt. Auf der anderen Seite induzierten in SADCC-Experimenten, in denen die Zytotoxizität gegen die MHC Klasse II^–/C215⁺ Colo 205-Zelllinie gerichtet waren, nur C215 Fab-SEE/A-A, C215 Fab-SEE/A-AH und C215 Fab-SEA/E-BDEG eine vergleichbare Zytotoxizität wie das C215 Fab-SEAwt (5). Das C215 Fab-SEE/A-F-Hybrid ist in der Lage, C215 gerichtete Zytotoxizität bei höheren Konzentrationen (EC₅₀ > 10^–10 M) zu induzieren. Obwohl das C215 Fab-SEE/A-H-Hybrid in der Lage ist, C215 gerichtete Zytotoxizität mit ähnlicher halbmaximaler Konzentration wie C215 Fab-SEAwt (z. B. EC₅₀ > 10^–13 M) zu induzieren, ist die absolute Menge an Zytotoxizität deutlich reduziert (5). Dieser Unterschied könnte eine Konsequenz einer eingeschränkten Vβ-Spezifität des C215 Fab-SEE/A-H sein, während die Fähigkeit zur Induzierung einer C215 gerichteten Zytotoxizität in der reagierenden T-Zell-Subpopulation verbleibt. Um diesen Gedanken weiter zu untersuchen, stellten wir eine menschliche Vβ22 oligoklonale CTL-Linie her. Menschliche Vβ22 sind analog zu murinen Vβ3 in dem Aspekt, dass es eine SEA- nicht SEE-spezfische Vβ-Familie ist. Es wurde zuvor gezeigt (Mollick et al., 1993), dass der hauptsächliche Beitrag von SEA und SEE Vβ hauptsächlich in dem Unterschied von drei Aminosäuren zwischen SEA und SEE in der Region H (AA: 200 – 207) liegt. In SDCC-Assays gegen MHC Klasse II⁺ Raji Zielzellen unter Verwendung der Vβ22 oligoklonalen CTL-Linie als Effektoren sind nur Hybride, die die SEA-H-Region enthalten, in der Lage, eine C215 Fab-SEAwt-ähnliche Reaktion (z. B. C215 Fab-SEE/A-H, C215 Fab-SEE/-AH und C215 Fab-SEA/E-BDEG, 6) zu ergeben. Das C215 Fab-SEE/A-A-Hybrid, das in der Lage war, eine vollständige SDCC-Reaktion mit vollständigen CTL-Populationen als Effektorzellen zu induzieren, ist in diesem Assay sowohl in der halbmaximalen Konzentration wie auch in dem Plateau (6) deutlich reduziert. Wenn die Zytotoxizität der Vβ22 CTL gegen die MHC Klasse II^–/C215⁺ Colo 205-Zelllinie gerichtet ist, sind nur Hybride, die sowohl SEA-A wie auch SEA-H (z. B. 215 Fab-SEE/A-AH und C215 Fab-SEA/E-BDEG) -Regionen enthalten, in der Lage, eine zytotoxische Reaktion zu induzieren, die mit einem C215 Fab-SEAwt (6) vergleichbar ist. Das Hybrid, das nur die SEA-Region A (C215 Fab-SEE/A-A) enthält, induziert eine geringere Menge an Zytotoxizität mit einem vergleichbaren EC₅₀-Wert. Dieses zeigt an, dass die verbleibende Aktivität, die mit dem C215 Fab-SEE/A-A-Hybrid in SADCC mit der gesamten T-Zellpopulation als Effektoren zu sehen ist, nicht eine Konsequenz der Hybrid-induzierten Reaktion in einer eingeschränkten Population von T-Zellen ist. Eine wahrscheinlichere Erklärung für die Beobachtung ist, dass die Fähigkeit zur Induzierung einer SADCC-Reaktion der C215 Fab SE-Hybridproteine hauptsächlich in der SEA-A-Region liegt, mit einem geringeren Beitrag aus den SEA-H- und -F-Regionen liegt. Es gibt keinen Beweise dafür, dass diese Qualität auf eine Untergruppe von T-Zellen in der kombinierten SEA-SEE-reaktiven T-Zellpopulation eingeschränkt ist, da C215 Fab-SEA in der Lage ist, die gleiche Reaktion mit SEE-reaktiven CTLs zu induzieren und C215 Fab-SEE/A-A ist in der Lage, die mit C215 Fab-SEA zu sehende Reaktion vollständig zu rekonstituieren.
Die SEA/E-Hybridproteine in Fusion mit dem C215Fab-Bereich zeigen einen Unterschied in Fab-gerichteten Proliferationsassays
Es wurde zuvor gezeigt, dass aufgereinigte, ruhende, menschliche T-Zellen durch Präsentation von C215 Fab-SEA auf einer MHC Klasse II^–/C215⁺/CD80⁺-Zelllinie (Lando et al., 1993) zur Proliferation induziert werden. Die Fähigkeit von C215 Fab-SEA zur Induktion einer MHC II-unabhängigen Proliferation ist mit C215 Fab-SEE (Tab. 1) jedoch deutlich reduziert. Zur Untersuchung, ob dieser Unterschied in der Qualität die gleiche Beschränkung auf die SEA-Region A aufzeigt, wie sie mit SADCC zu sehen war, untersuchten wir die proliferative Kapazität von C215 Fab-SE-Hybriden, die durch entweder CHO-DR1⁺/CD80⁺ oder CHO-C215⁺/CD80⁺ transfizierte Zelllinien auf aufgereinigten ruhenden menschlichen T-Zellen präsentiert wurden. Wenn die Fab-SE-Konjugate auf CHO-DR1⁺/CD80⁺ präsentiert wurden, wurden keine Unterschieden zwischen den unterschiedlichen SE-Proteinen beobachtet (die Daten werden nicht gezeigt). Jedoch potenzieren Pfropfungen der SEA-Region A, C und H in SEE die proliferative Aktivität im Vergleich zu C215 Fab-SEE. Die besten Ergebnisse wurden durch das Aufpfropfen der SEA-Regionen A und H erhalten, was eine wichtige Rolle für die Region A anzeigt, wie für die MHC Klasse II unabhängige Zytotoxizität zu erkennen war. Unter Verwendung einer negativen Selektion ist es möglich, dass die Unterschiede zwischen Fab-SEA und -SEE prominenter sein würden.
Vβ-Spezifität von SE-Hybriden
Zur weiteren Untersuchung, ob die C215 Fab-SEA/SEE-Hybridfusionsproteine mit einer bestimmten Vβ-Spezifität assoziiert waren, verwendeten wir SEA-reaktive murine T-Zellhybridomzellen, die Vβ1, Vβ3 und Vβ11 exprimieren. Es war von den erhaltenen Daten her offensichtlich, dass alle der untersuchten Regionen, direkt oder indirekt, die Wechselwirkung mit dem TCR betreffen. Durch das Pfropfen von SEA-Regionen C und F in C215 Fab-SEE wird die Aktivität gegen die SEA- und SEE-kreuzreaktive Vβ1-Hybridomzelle I1B3 vernichtet. Die gleichen Chimären scheinen keine oder geringe Wirkungen auf die Aktivität von Vβ3- und Vβ11-Hybridomzellen (2.B4 und 11.40) im Vergleich zu C215 Fab-SEE zu haben. Durch Aufpfropfen der SEA-Region A in C215 Fab-SEE wird die Aktivität gegen Vβ3 (2.B4) durch mindestens einen Faktor 100 verstärkt im Vergleich zu C215 Fab-SEE. Deutlichere Wirkungen sind mit der gleichen Zelllinie durch das Aufpfropfen der SEA-Region in C215 Fab-SEE zu sehen. Diese deutliche Wirkung auf den Einfluss der Vβ3-Spezifität durch die SEA-Region N wurde auch in früheren Untersuchungen festgestellt (Mollick et al., 1993). Das gleiche Chimäre (C215 Fab-SEE/A-H) scheint jedoch die Aktivität gegen SEA/SEE-kreuzreaktive Vβ1- und VB11-Nybridomzellen (I1B3 und 11.40) um einen Faktor 10 zu verringern. Zusammenfassend wird festgestellt, dass die TCR-Wechselwirkung von SEA alle der SEA-SEE-variablen Regionen A, C, F und H zu involvieren scheint.
Serumreaktivität
Die Serumreaktivität in menschlichen Serumproben gegen die chimären SEs wurde sowohl in Sammelproben aus verschiedenen Teilen der Welt sowie in einzelnen Serumproben untersucht. Durch Aufpfropfen von sowohl den SEA-Regionen A und H in SEE erhielten wird eine mittlere Serumreaktivität (8). Eine ähnliche Serumreaktivität wurde auch gegen das chimäre C215 Fab-SEE/A gesehen. Jedoch ergaben einzelne Pfropfungen der SEA-Region A in SEE (C215 Fab-SEE/A-A) eine C-215 Fab-SEE-ähnliche Serumreaktivität, was andeutet, dass die SEA-Region H für die verbleibende Serumreaktivität gegen C215 Fab-SEE/A-AH verantwortlich ist. Dieses zeigt an, dass die SEA-Region H Teil des dominierenden antigenen Epitops in SEA ist. Die Serumreaktivität aus gesammelten Serumproben aus anderen Teilen der Welt (Japan und USA) sowie 14 einzelne Proben aus Schweden bestätigen alle das gleiche allgemeine Muster (die Daten werden nicht gezeigt).
Ergebnisse: Mutationen des Fab-Anteils der Fusionsproteine
Expression von 5T4 Fab SEA-Konstrukten
Die Herstellungsmenge an 5T4Fab-SEA in E. coli in dem Fermenter wurde als signifikant geringer gefunden als für andere FAB-Superantigenkonstrukte, die zuvor in unserem Labor untersucht wurden. Zwei Arten von Modifikationen wurden daher eingeführt, um die Herstellungsmenge zu erhöhen. Zuerst wurden sieben unterschiedliche Punktmutationen in die Gerüstregion der leichten Kette eingeführt. Dieses waren Phe10Ser, Thr45Lys, IIe63Ser, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser und Leu78Val. Als zweites wurden die Cysteinreste, die die Disulfidbindung ergeben, die die schweren und die leichten Ketten verbinden, durch Serinreste ersetzt. Die letztere Modifikation resultierte in einer dreifachen Erhöhung und die 7-Punkt-Mutationen in einer zusätzlichen 12fachen Erhöhung in der Produktionsmenge. Zusätzlich zu der signifikant erhöhten Produktionsmenge ergibt das Entfernen der Disulfidbindung ein homogeneres Produkt, da die Möglichkeit dieser reaktiven Thiolgruppen, mit andern Thiolgruppen zu reagieren, ausgeschlossen ist.
Das modifizierte 5T4-Molekül wurde auf Affinität zu seinem Antigen sowie auf biologische Aktivität in SADCC hin untersucht. Es konnten keine Unterschiede zwischen der mutierten Form und der Wildtyp-Form in diesen Assays nachgewiesen werden.
Die Cys/Ser-Mutation wurde auch in den schweren und leichten Ketten der Fab-Fragmente von verschiedenen anderen monoklonalen Antikörpern durchgeführt. Die Produkte wurden homogen und behielten vollständig die Antigenbindungsfähigkeit.
Sequenz der Region der Antikörpergerüstregion für die 5T4 Vkappa-Kette:
DAVMTQTPTF LLVSAGDRVT ITCKASOSVS NDVAWYQQKP GQSPTLLISY 50 TSSRYAGVPD RFIGSGYGTD FTFTISTLQA EDLAVYFCOO DYNSPPTFGG 100 GTKLEIK (SEQ ID NO: 6)
Unterstrichene Sequenzen sind CDRs. Fett gedruckte Positionen waren mutiert: Phe10Ser, Thr45Lys, IIe63Ser, IIe63Thr, Tyr67Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val. Tabelle 1
Tabelle 2
Legenden der Figuren
1. MHC Klasse II-abhängige und unabhängige Zytotoxidzität mit menschlichen SEE- und SEA-CTL
HC Klasse II-abhängige zelluläre Zytotoxizität (A und B) und C215-abhängige zelluläre Zytotoxizität (C und D) mit C215 Fab-SEA
und C215Fab-SEE (♢) als Effektormo leküle. Die Zytotoxizität wurde in einem Standard 4 Std. ⁵¹Cr-Freisetzungsassay unter Verwendung einer SEE-reaktiven menschlichen T-Zelllinie (A und C) und einer SEA-reaktiven menschlichen T-Zelllinie (B und D) analysiert. Die Zielzelllinien waren MHC Klasse II⁺/C215^– Raji (A und B) und MHC Klasse II^–/C215⁺ Colo 205 (C und D). Die Daten kommen aus Einzelassays, die für zwei (A und C) bis fünf (B und D) unabhängige Experimente repräsentativ sind.
2. Homologieanordnung von SEA und SEE
SEA/SEE-variable Regionen nahe der TCR-Bindungsstelle (A, C, F und H) und variable Regionen nahe der zwei MHC Klasse II-Bindungsstellen.
3. Cartoonmodell von SEA
Molscript-Modell (Kraulis, 1991) des SEA-Kristalls (Schad et al., 1995). SEA/SEE-variable Regionen in der Nähe der TCR-Bindungsstelle (A, C, F und H) und variable Regionen in der Nähe der zwei MHC-Klasse II-Bindungsstellen. Das Zinkion ist ein runder Ball.
4. Schematische Darstellung von chimären SE-Molekülen
Bereiche der SEA-Sequenz sind herabgesetzt. SEA/SEE-variable Regionen werden durch A, B, C, D, E, F, G und H dargestellt.
5. MHC Klasse II-abhängige und unabhängige Zytotoxizität mit menschlichen SEA-reaktiven CTL
(A) MHC Klasse II-abhängige zelluläre Zytotoxizität und (B) C215-abhängige zelluläre Zytotoxizität von C215 Fab-SEE/A-A (♢, filled), C215 Fab-SEE/A-C (⎕), C215 Fab-SEE/A-F (♢), C215 Fab-SEE/A-H (•), C215 Fab-SEE/A-AH (Δ) und C215 Fab-SEA-/E-BDEG (O). Die Zytotoxizität wurde in einem Standard 4 Std. ⁵¹Cr-Freisetzungsassay unter Verwendung einer SEA-reaktiven menschlichen T-Zelllinie untersucht. Die Zielzelllinien waren MHC Klasse II+/C215^– Raji (A) und MHC Klasse II^–/C215⁺ Colo 205 (B). Die Daten stammen aus Einzelassays, die für fünf unabhängige Experimente repräsentativ sind.
6. MHC Klasse II-abhängige und unabhängige Zytotoxizität mit menschlichen Vβ22⁺ CTL
(A) MHC Klasse II-abhängige zelluläre Zytotoxizität und (B) C215-abhängige zelluläre Zytotoxizität mit C215 Fab-SEA/A
, C215 Fab-SEE (♢, filled), C215 Fab-SEE/A-A ((♢, filled), C215Fab-SEE/A-C (⎕), C215 Fab-SEE/A-F (♢), C215 Fab-SEE/A-H (•), C215 Fab-SEE/A-AH (Δ) und C215 Fab-SEA/E-BDEG (O) als Effektormoleküle. Die Zytotoxizität wurde in einem Standard 4 Std. ⁵¹Cr-Freisetzungsassay unter Verwendung einer Vβ22- ausgewählten SEA-reaktiven menschlichen T-Zelllinie analysiert. Die T-Zelllinien waren MHC Klasse II⁺/C215^– Raji ((A) und MHC Klasse II^–/C215⁺ Colo 205 (B). Die Daten kommen aus Einzelassays, die für zwei unabhängige Experimente repräsentativ sind.
7. MHC Klasse II-abhängige und unabhängige Proliferation (nicht in den Prioritätsanmeldungen)
Wirkungen von Fab-SE-Hybriden auf MHC Klasse II – abhängige (A) und unabhängige (B) T-Zellprliferation. Aufgereinigte menschliche T-Zellen wurden für 96 Std. mit C215 Fab-SEE/A
, C215 Fab-SEE (♢, filled), C215 Fab-SEE/A-A (♢, filled), C215 Fab-SEE/A-C (⎕), C215 Fab-SEE/A-F (♢), C215 Fab-SEE/A-H (•), C215 Fab-SEE/A-AH (Δ) und C215 Fab-SEA/E-BDEG (O) stimuliert, die auf MHC Klasse II⁺/C215^– CHO-CR4/C215 Transfektanten (A) und auf MHC Klasse II^–/C215⁺ CHO-CD80/C215 transfektanten (B) präsentiert wurden. Nach 72 Std. wurden die Zellen mit [³H]-Thymidin für 24 Std. pulsartig behandelt und der aufgenommene Marker wurde gemessen und stellte die halbmaximale Konzentration (EC₅₀) dar. Die Daten kommen aus Einzelassays, die für zwei unabhängige Experimente repräsentativ sind.
8. Serumreaktivität in einer menschlichen Ig-Sammelprobe
Eine Sammelprobe von > 5000 Seren von menschlichen Spendern in Südeuropa gegen C215Fab-SE-Fusionsproteine. Seriell verdünntes menschliches Ig wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit C215 Fab-SEAwt, C215 Fab-SEEwt, C215 Fab-SEE/A-A, C215 Fab-SEE/A-H und Fab-SEE/A-AH wechselwirken gelassen. Immobilisiert auf den Mikrotiterplatten bei einer Konzentration von 1 ng/Well. Die Korrektur für C215Fab-Bindung an Serumproteine wurde durch das Abziehen des OD-Werts für C215Fab an jedem Punkt durchgeführt. Jeder Punkt stellt das Mittel von Doppelproben dar. Für weitere Detalls siehe Material und Methoden.
Tabelle 1. Aufgereinigte menschliche T-Zellen wurden für 96 Std. mit den jeweiligen C215Fab-SE stimuliert, die auf MHC Klasse II negativen CHO-CD80/C215-Trasfektanten präsentiert wurden. Nach 72 Std. wurden die Zellen mit [³H]-Thymidin für 24 Std. pulsartig behandelt und aufgenommener Marker wurde gemessen und als halbmaximale Konzentration (EC₅₀) dargestellt.
Tabelle 2. Murine T-Zellhybridomzellen wurden für 48 Std. mit nativem oder chimärem Fab-konjugierten Superantigen stimuliert. Die Aktivität wurde als IL-2-Produktion gemessen und als halbmaximale Konzentration (EC₅₀) dargestellt.
Arbeit während des Prioritätsjahres
In einem Versuch, die Toxizität der Superantigen-Chimären-Antikörperfusion C242 Fab-SEE/A-A zu minimieren wurde das Chimär SEE/A-A in Klasse II-Bindungsstellen wie in der WO 96 01650 beschrieben mutiert und an C215Fab fusioniert. Die Konstruktionen sind C215 Fab-SEE/A-A-D227A, C215 Fab-SEE/A-A-F47A/D227A, C215 Fab-SEE/A-A-H187A/D227A, C215 Fab-SEE/A-A-W130A/D227A, C215 Fab-SEE/A-A-D70A/D227A, C215 Fab-SEE/A-A-N50S/D227A, C215 Fab-SEE/A-A-N50S/D70A/D227A, C215 Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A und C215 Fab-SEE/A-AD70R/D22/A. Alle Fusionen wurden auf deren Fähigkeit getestet, eine Proliferation von menschlichen PBMC zu induzieren, um Mutanten mit einer verringerten Aktivität im Vergleich zu C215 Fab-SEE/A-A-D227A zu identifizieren. Eine verringerte proliferative Aktivität wurde für C215 Fab-SEE/A-A-F47A/D227A, C215 Fab-SEE/A-A-F47Y/D227A und C215 Fab-SEE/A-A-D70R/D227A beobachtet. Einige der chimären Fusionen wurden auch auf Antikörpertiter in normalem menschlichen Serum untersucht (C215 Fab-SEE/A-A-D227/A, C215 Fab-SEE/A-A-D70A/D227A und C215 Fab-SEE/A-A-D70R/D227A). Ein Vergleich wurde mit C215 Fab-SEA-D227A und C215 Fab-SEE-D227A durchgeführt.
Relativ zu C215 Fab-SEA-D227A war der Titer viel geringer als für jedes getestete Chimäres. Relativ zu C215 Fab-SEE-D227A war der Titer etwas höher für jedes getestete Chimäres.
Dieses bedeutet Ersetzungen in Positionen, die mit einer oder mehreren, vorzugsweise zwei, der Positionen 47, 50, 70, 130, 187, 227, wie sie in den Sequenz-ID NO: 7 und 8 in 2 definiert werden, korrespondieren.
Weil viele variierende und unterschiedliche Ausführungsformen innerhalb des Umfangs des erfindungsgemäßen Konzepts, das hierin gelehrt wird, durchgeführt werden können, ist es zu verstehen, dass die hierin angegebenen Detalls als illustrativ und nicht in einer einschränkenden Weise zu interpretieren sind.
Literaturstellen

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SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ein Konjugat zwischen a) einem Wildtyp-Superantigen, das modifiziert wurde, und b) einem zielgebenden Bereich; dadurch gekennzeichnet, dass besagtes modifiziertes Superantigen SEE ist, bei dem ein oder mehrere Aminosäurereste in einer Region I, wobei sich diese Region I innerhalb der T-Zellrezeptor (TCR) Bindungsstelle befindet und die Bindung an die TCR Vβ - Kette und die T-Zellaktivierung bestimmt, durch einen oder mehrere Aminosäurereste aus einer korrespondierenden Position in SEA ersetzt wurden, so dass besagtes modifiziertes Superantigen eine verbesserte Fähigkeit zur Induzierung von T-Zellcytotoxizität im Vergleich zu SEE aufweist und eine verringerte Seroreaktivität im Vergleich zu SEA aufweist, und das modifizierte Superantigen umfasst zusätzlich eine Mutation, die seine Fähigkeit zur Bindung an MHC Klasse II Antigene im Vergleich zu jedem der besagten Wildtyp-Superantigene verringert.
Das Konjugat von Anspruch 1, worin besagte Region I Region A von 2 ist, die aus den Aminosäureresten 20 bis 27 von SEQ ID NO: 7 besteht.
Das Konjugat von Anspruch 1, worin besagte Region I Region C von 2 ist, die aus den Aminosäureresten 60 bis 62 von SEQ ID NO: 7 besteht.
Das Konjugat von Anspruch 1, worin besagte Region I Region F von 2 ist, die aus den Aminosäureresten 161 bis 176 von SEQ ID NO: 7 besteht.
Das Konjugat von Anspruch 1, worin besagte Region I Region H von 2 ist, die aus den Aminosäureresten 200 bis 207 von SEQ ID NO: 7 besteht.
Das Konjugat von Anspruch 2, bei dem die folgenden Aminosäuresubstitutionen durchgeführt wurden: R20G, N21T, S24G und R27K, wobei die Positionen wie in SEQ ID NO: 7 definiert sind.
Das Konjugat von Anspruch 6, das zusätzlich eine Mutation in Position 227 wie in SEQ ID NO:7 definiert umfasst.
Das Konjugat von Anspruch 7, worin die Mutation D227A ist.
Das Konjugat von einem der Ansprüche 1 – 8, worin besagter zielgebender Bereich aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem aktiven Antigen-bindenden Antikörperfragment, einem Antigen-bindenen Antikörper, einem einzelkettigen Antikörper, Fab, F(ab)₂ und Fv besteht.
Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Konjugats zwischen a) einem Wildtyp-Superantigen, das modifiziert wurde, und b) einem zielgebenden Bereich; zur Verwendung in der Behandlung einer Krankheit in einem Säugetier durch Aktivierung des Immunsystems von besagtem Säugetier umfasst, wobei besagtes Konjugat dadurch gekennzeichnet ist, dass besagtes modifiziertes Superantigen SEE ist, bei dem ein oder mehrere Aminosäurereste in einer Region I, wobei sich diese Region I innerhalb der T-Zellrezeptor (TCR) Bindungsstelle befindet und die Bindung an die TCR Vβ – Kette und die T-Zellaktivierung bestimmt, durch einen oder mehrere Aminosäurereste aus einer korrespondierenden Position in SEA ersetzt wurden, so dass besagtes modifiziertes Superantigen eine verbesserte Fähigkeit zur Induzierung von T-Zellcytotoxizität im Vergleich zu SEE aufweist und eine verringerte Seroreaktivität im Vergleich zu SEA aufweist, und das modifizierte Superantigen umfasst zusätzlich eine Mutation, die seine Fähigkeit zur Bindung an MHC Klasse II Antigene im Vergleich zu jedem der besagten Wildtyp-Superantigene verringert.
Die Zusammensetzung von Anspruch 10, worin die Krankheit mit Zellen assoziiert ist, die eine Oberflächenzielstruktur exprimieren, die an die Superantigenfusion an einem Superantigenepitop bindet, das sich strukturell von dem TCR Bindungsepitop unterscheidet und dessen Bindung die Bindung an TCR und T-Zellaktivierung des Superantigens ermöglicht.
Die Zusammensetzung von Anspruch 10 oder 11, worin die Krankheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Krebsarten, viralen Infektionen, parasitärem Befall und Autoimmunerkrankungen besteht.
Die Zusammensetzung von Anspruch 12, worin die Krankheit Krebs ist.
Die Zusammensetzung von Anspruch 10, worin besagte Region I Region A von 2 ist, die aus den Aminosäureresten 20 bis 27 von SEQ ID NO: 7 besteht.
Die Zusammensetzung von Anspruch 10, worin besagte Region I Region C von 2 ist, die aus den Aminosäureresten 60 bis 62 von SEQ ID NO: 7 besteht.
Die Zusammensetzung von Anspruch 10, worin besagte Region I Region F von 2 ist, die aus den Aminosäureresten 161 bis 176 von SEQ ID NO: 7 besteht.
Die Zusammensetzung von Anspruch 10, worin besagte Region I Region N von 2 ist, die aus den Amniosäureresten 200 bis 207 von SEQ ID NO: 7 besteht.
Die Zusammensetzung von Anspruch 14, bei der die folgenden Aminosäuresubstitutionen durchgeführt wurden: R20G, N21 T, S24G und R27K, wobei die Positionen wie in SEQ ID NO: 7 definiert sind.
Die Zusammensetzung von Anspruch 18, die zusätzlich eine Mutation in Position 227 wie in SEQ ID NO:7 definiert umfasst.
Die Zusammensetzung von Anspruch 19, worin die Mutation D227A ist.
Die Zusammensetzungen der Ansprüche 10 – 20, worin besagter zielgebender Bereich aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem aktiven Antigen-bindenden Antikörperfragment, einem Antigen-bindenden Antikörper, einem einzelkettigen Antikörper, Fab, F(ab)₂ und Fv besteht.
Ein Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 – 9 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines Konjugats gemäß einem der Ansprüche 1 – 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit in einem Säugetier durch Aktivierung des Immunsystems.
Verwendung gemäß Anspruch 23, worin die Krankheit mit Zellen assoziiert ist, die eine Oberflächenzielstruktur exprimieren, die an die Superantigenfusion an einem Superantigenepitop bindet, das sich strukturell von dem TCR Bindungsepitop unterscheidet und dessen Bindung die Bindung an TCR und T-Zellaktivierung des Superantigens ermöglicht.
Verwendung gemäß Anspruch 23 oder 24, worin die Krankheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Krebsarten, viralen Infektionen, parasitärem Befall und Autoimmunerkrankungen besteht.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 23 – 25, worin die Krankheit Krebs ist.